ES2314152T3

ES2314152T3 - Fracciones de leche y preparaciones de leche para el tratamiento y/o prevencion de enfermedades inducidas por la cox-2.

Info

Publication number: ES2314152T3
Application number: ES03020739T
Authority: ES
Inventors: Lionel Bovetto; Joerg Hau; Catherine Mace
Original assignee: Nestec SA
Current assignee: Nestec SA
Priority date: 2003-09-12
Filing date: 2003-09-12
Publication date: 2009-03-16
Anticipated expiration: 2023-09-12
Also published as: US20070110818A1; JP4824560B2; CA2537544C; US8012509B2; TW200524545A; AU2004271722B2; AU2004271722A1; CA2537544A1; EP1955602B1; BRPI0413714A; PT1514482E; EP1955602A1; DE60323489D1; JP2007505078A; CN1849076B; EP1514482B1; EP1514482A1; ATE407574T2; CN1849076A; EP1514482B2

Abstract

Empleo de una o más fracciones de proteína de la leche, que presentan una actividad inhibidora de la ciclooxigenasa-2, para la preparación de una composición nutritiva y/o farmacéutica para el tratamiento y/o prevención de las enfermedades inducidas por la ciclooxigenasa-2, en donde dichas fracciones de proteínas de la leche, se seleccionan a partir de la caseína dulce de la leche de vaca de suero dulce de la leche de vaca y suero dulce de la leche humana.

Description

Fracciones de leche y preparaciones de leche para el tratamiento y/o prevención de enfermedades inducidas por la COX-2.

La presente invención se refiere a composiciones nutritivas y farmacéuticas para el tratamiento y/o prevención de enfermedades inducidas por la ciclooxigenasa-2, y a un proceso para aumentar la actividad inhibidora de la ciclooxigenasa-2, de un producto. En particular, la presente invención se refiere también al empleo de una o más fracciones de la proteína de la leche y/o una o más preparaciones de la proteína de la leche para inhibir la actividad de la ciclooxigenasa-2, específicamente para la preparación de un producto alimenticio o un medicamento para el tratamiento y/o prevención de las enfermedades inducidas por la ciclooxigenasa-2.

Las enzimas de la ciclooxigenasa (COX) son enzimas clave necesarias para la conversión del ácido araquidónico en prostaglandinas (PGs). Han sido identificadas dos isoformas de la COX hasta la fecha, la COX-1 y la COX-2, las cuales difieren en muchos aspectos: la COX-1 se expresa constitutivamente en muchos tejidos y se presume que es la responsable de la producción de las prostaglandinas que controlan las funciones fisiológicas normales, tales como el mantenimiento de la mucosa gástrica y la regulación del flujo de sangre renal. La segunda isoforma, la COX-2, no parece que sea expresada constitutivamente en la mayor parte de los tejidos normales pero es altamente inducible y puede encontrarse solamente en lugares particulares, por ejemplo en sitios inflamados o en celulas cancerígenas.

Aunque se ha descubierto que las enzimas COX están unidas a la membrana, no tienen una región convencional transmembránica. En su lugar contienen cuatro hélices anfipáticas yuxtapuestas para formar una región de hidrofobicidad. Esta región de hidrofobicidad ancla la porción "inferior" de la enzima en la membrana. El sitio activo de la ciclooxigenasa está situado en el área de hidrofobicidad cerca de las hélices anfipáticas. El substrato y los inhibidores de la enzima se considera que alcanzan el sitio activo por medio de un canal incorporado en la doble capa lípida (W. Krause, R.N. Dubois, Prostaglandins & other Lipid Mediators ("Prostaglandinas y otros mediadores lípidos") 61 (2000), 145-161).

Los inhibidores de las COX, y en particular los inhibidores de la COX-2, se emplean para tratar una gran variedad de diferentes enfermedades, tales como enfermedades inflamatorias, y también se emplean como analgésicos. Además se ha descubierto que la COX-2 se sobreexpresa habitualmente en tejidos premalignos y malignos, y ha sido presentada como un tratamiento con inhibidores de la COX-2 para reducir la formación de tumores intestinales, esofágicos, en la lengua, pecho, piel, pulmón y vejiga, en animales (K. Subbaramalah, A.J. Dannenberg, TRENDS in Pharmacological Sciences ("Tendencias en las ciencias farmacológicas") 24 (2003), 96-102).

Varios fármacos no-esteroidales antiinflamatorios bien conocidos (llamados NSAIDs), tales como por ejemplo la aspirina y el ibuprofeno, inhiben la COX-1 y COX-2. Recientemente se ha descrito una nueva clase de inhibidores (COXIBs) los cuales inhiben específicamente solamente la enzima COX-2 (M. E. Turini, R. N. Dubois, Physiology And Diseases ("Fisiología y enfermedades"). Annu. Rev. Med. 53 (2002), 35-57). Sin embargo, los NSAIDs son conocidos por causar serios efectos colaterales, por ejemplo problemas renales y ulceración duodenal y estomacal.

La patente WO 01/11990 describe composiciones nutritivas y farmacéuticas con un reducido contenido de treonina. Dichas composiciones pueden comprender como ingrediente principal la proteína ácida de suero de leche, o proteína dulce de suero de leche, de la cual ha sido eliminado el caseino-glico-macropéptido. La eliminación de dicha proteína de caseína se obtiene mediante el contacto del concentrado de proteína dulce de suero de leche de vaca, con una resina de intercambio catiónico, seguido de un tratamiento con una resina débilmente aniónica. Una preparación combinada dirigida a disminuir el riesgo de enfermedades de la civilización, se describe en la patente DE 44 13 839. Dicha preparación comprende entre otros, la proteína dulce de suero de leche, la cual se informa que interactúa con otros constituyentes, magnesio, vitamina C, vitamina E, pro- vitamina A, vitamina B1 y selenio, con el fin de proporcionar el deseado efecto terapéutico.

La patente US 4 284 623 describe un método para el tratamiento de la inflamación en un animal, el cual comprende la administración al animal de una cantidad efectiva anti-inflamatoria de leche de un bóvido mantenido en un estado de producción de un factor antiinflamatorio.

Consecuentemente, el problema de la presente invención es el de proporcionar los medios adicionales para la inhibición de las ciclooxigenasas, en particular de la COX-2, los cuales medios deberían estar asociados con un bajo riesgo de efectos colaterales dañinos.

Este problema ha sido solucionado proporcionando fracciones específicas y/o una preparación de leche, la cual presenta una actividad inhibidora de la COX-2, para el tratamiento y/o prevención de enfermedades inducidas por la COX-2.

En las figuras,

La figura 1 es un diagrama que muestra la preparación de fracciones de leche bovina, como se esboza en el ejemplo 1.1.;

La figura 2 es un diagrama que muestra la preparación de fracciones de leche humana, como se esboza en el ejemplo 1.2.;

La figura 3 es un diagrama que muestra la preparación de fracciones de leche de búfalo, como se esboza en el ejemplo 1.3.; y

la figura 4 muestra una comparación de las actividades inhibidoras de la COX-2, de varias fracciones de proteína de leche y preparaciones de proteína de leche derivadas de la leche humana (HM), leche de vaca (CM), y leche de búfalo (BM).

De acuerdo con un aspecto, la presente invención proporciona un empleo de acuerdo con la reivindicación 1.

El término "tratamiento y/o prevención de las enfermedades inducidas por la ciclooxigenasa-2", como se emplea en la presente solicitud, comprende tanto el tratamiento de una enfermedad asociada con la expresión, en particular con una expresión aumentada de ciclooxigenasa-2, así como también la prevención de una enfermedad que puede influenciarse mediante la reducción del nivel de ciclooxigenasa-2 en un sitio específico del cuerpo de un individuo, o mediante la prevención de un aumento del nivel de ciclooxigenasa-2 en un sitio específico del cuerpo de un individuo. Un nivel aumentado de ciclooxigenasa-2, representa una cantidad, que es superior al nivel de la ciclooxigenasa-2 estadísticamente presente en un individuo sano en un sitio específico, como promedio.

Un primer grupo de enfermedades inducidas por la ciclooxigenasa-2, las cuales pueden ser tratadas y/o la aparición de las mismas puede ser prevenida de acuerdo con la presente invención, es el cáncer, abarcando cualquiera de sus estados precancerosos. De acuerdo con los datos científicos a mano se acepta en la actualidad que en los tejidos premalignos y malignos, la COX-2 está sobreexpresada, y que dicha expresión aumentada de la COX-2, está asociada, por lo menos en parte, a la inducción de la formación del tumor. De hecho, esta sobreexpresión de la COX-2 ha sido observada en varias condiciones premalignas y malignas en órganos tales como por ejemplo el colon, estómago, esófago, hígado, jugos biliares, páncreas, cabeza y cuello, pulmón, pecho, vejiga órganos genitales femeninos, y la piel. También, se ha logrado ya un tratamiento con éxito de tumores sobre la base de inhibidores de la COX-2 de la técnica anterior. Así, la administración de una composición de acuerdo con la presente invención será de ayuda en el tratamiento y/o prevención del cáncer y/o de los estados precancerosos.

También, los inhibidores de la COX-2 han sido presentados como bloqueadores de la formación de prostaglandinas, la presencia de las cuales está asociada con el desarrollo y progreso del dolor, fiebre e inflamación. Grupos diana adicionales de la ciclooxigenasa-2, para las cuales, de acuerdo con la presente invención, se reivindica un tratamiento y/o prevención, son la artritis, fiebre reumática, síntomas asociados con la gripe u otras infecciones víricas, dismenorrea, dolor de cabeza, dolor de muelas, enfermedades degenerativas de las articulaciones, etc.. También la enfermedad de Alzheimer se considera que es una enfermedad diana de acuerdo con la presente invención, dado que los inhibidores de la COX-2 han mostrado tener un efecto protector en el desarrollo de esta enfermedad.

El empleo de la presente invención está ideado para cualquier individuo que tenga necesidad del mismo, de preferencia mamíferos, en particular, humanos y animales, por ejemplo animales domésticos.

Una "actividad inhibidora de la ciclooxigenasa-2" como se ha mencionado aquí, puede determinarse de acuerdo con un método de exploración de la COX-2, sobre la base de celulas HUV-EC-C, como se indica en los ejemplos de más adelante, pero también sobre la base de otros ensayos ya conocidos en la técnica.

La cantidad terapéuticamente efectiva de una o más fracciones de proteína de la leche, y/o uno o más preparados de proteína de la leche específicamente requeridos para un individuo dado, puede determinarse fácilmente por el experto especializado, de acuerdo con su conocimiento general de la técnica, considerando una variedad de factores, tales como el peso corporal, edad, salud general, sexo, dieta, tiempo de administración, ruta de administración, velocidad de excreción, combinación de fármacos, etc.. Básicamente, el régimen de dosificación especial para un individuo particular dependerá del hecho de sí se pretende una prevención general o bien se desea un tratamiento agudo de una enfermedad. Por ejemplo, la dosificación diaria de dicha una o más fracciones de proteína de leche, y/o una o más preparaciones de proteína de leche puede seleccionarse entre 7 mg y 70 g en caso de una persona de 70 kg, lo cual corresponde a una dosis diaria de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 1 g por kilo de peso corporal, de preferencia, de aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 100 mg, con más preferencia de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 70 mg e incluso con mayor preferencia, de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 50 mg.

La composición nutritiva preparada mediante el empleo de la presente invención, es cualquier composición adecuada para el consumo humano o animal, la cual comprende por lo menos un material seleccionado del grupo formado por el agua, proteínas y/o péptidos, hidratos de carbono, grasas.

La composición farmacéutica preparada mediante el empleo de la presente invención, es cualquier composición que comprende por lo menos un compuesto terapéuticamente activo como se detalla en la presente.

Además, la presente invención proporciona una composición nutritiva y/o farmacéutica, de la presente invención, la cual comprende una cantidad aumentada de dicha una o más fracciones de proteína de la leche y/o una o más preparaciones de proteína de la leche que proporcionan una actividad inhibidora de la ciclooxigenasa-2 la cual proporciona una actividad inhibidora de la ciclooxigenasa-2 la cual es mayor que la actividad inhibidora de la ciclooxigenasa-2 de una composición nutritiva y/o farmacéutica, en donde la cantidad de dicha una o más fracciones de proteína de la leche y/o una o más preparaciones de proteína de la leche no ha sido aumentada.

Dicha cantidad aumentada de dicha una o más fracciones de proteína de la leche y/o una o más preparaciones de proteína de la leche, que proporcionan una actividad inhibidora de la ciclooxigenasa-2, puede obtenerse, o bien por adición de una cantidad adicional de dicha una o más fracciones de proteína de la leche y/o una o más preparaciones de proteína de la leche, y/o por substitución de una fracción de la leche con una fracción de la leche en donde el (los) compuesto (s) bioactivo(s) ha(n) sido enriquecido(s). Un enriquecimiento puede lograrse de acuerdo con las técnicas físicas, químicas y biológicas ya bien conocidas en la técnica, por ejemplo sobre la base del ensayo que se describe en los ejemplos.

La actividad inhibidora de la ciclooxigenasa-2 de un producto que resulta de un enriquecimiento o adición como se ha esbozado más arriba, debería ser por ejemplo por lo menos de un 1%, con más preferencia por lo menos de un 5%, con más preferencia por lo menos de un 10% mayor, y en particular por lo menos de un 25% mayor que la actividad inhibidora de la ciclooxigenasa-2 de la composición nutritiva/farmacéutica de referencia, es decir la composición nutritiva/farmacéutica que tiene - aparte de una o más fracciones de proteína de la leche adicional y/o enriquecida, y/o una o más preparaciones de proteína de la leche - la misma composición que la composición nutritiva/farmacéutica que tiene una actividad inhibidora aumentada de la ciclooxigenasa-2.

A lo largo de numerosos estudios, los presentes inventores demostraron que las fracciones específicas de proteína de la leche, proporcionan una actividad inhibidora de la ciclooxigenasa-2 la cual esencialmente puede no ser encontrada en la leche, o bien excede la de la leche como tal. Sin desear adscribirnos a ninguna teoría, puede suponerse que la baja actividad inicial observada en la leche humana puede estar asociada con las proteínas del suero de leche. Las propias caseínas podrían tener un efecto supresor, o contener una "bioactividad latente", la cual es activada (y entonces se encuentra en la fracción del suero de leche) mediante la acidificación o tratamiento con cuajo.

Como fracciones de leche que se han encontrado que presentan una actividad aumentada de la inhibición de la COX-2, pueden mencionarse las fracciones de suero dulce de leche humana, leche bovina, fracción de caseína dulce de la leche bovina, etc. o combinaciones de las mismas.

El subfraccionamiento adicional de la proteína soluble de suero de leche, y el screening, revelan que se prefieren algunas subfracciones de proteína de suero de leche de bovinos.

En principio, la separación y el aislamiento de sub-fracciones de proteína soluble de suero de leche, puede lograrse mediante cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) ó mediante cromatografía líquida de alta resolución de interacción hidrofóbica (HI-HPLC), cromatografía líquida de alta resolución de fase invertida (RP-HPLC), y similares, todas las cuales están basadas, por ejemplo, sobre los mismos principios de separación. Los principios de la HIC son ya conocidos por una persona experta. Generalmente, las muestras se cargan en una columna equilibrada (fase estacionaria) que comprende un material hidrofóbico que retiene las muestras. El material hidrofóbico puede ser, por ejemplo, poliestireno reticulado macroporoso, comercializado como Amberlite Xad 16 XAD 16 de Rohm y Hass, por ejemplo. Puede emplearse también el 15 RPC TN 17-0727-02 (poliestireno-divinilbenceno), de Amersham o equivalentes.

Antes de que la proteína se cargue en la columna, esta última puede ser equilibrada con un tampón. Después de cargar la fracción, un tampón o una mezcla de tampones (fase móvil) puede incorporarse a la columna, por lo que la mezcla de tampones es variable y puede tener, por lo tanto propiedades variables de elución de las subfracciones de proteína de acuerdo con su hidrofobicidad de la columna. La separación de las proteínas del suero de leche, de acuerdo con este método está descrita en: "Simultaneous separation and quantitation of the major bovine whey proteins including proteose peptone and caseinomacropeptide by reversed-phase high-performance liquid chromatography on polystirene-divinylbenzene" ("Separación simultánea y cuantificación de las proteínas de suero de leche bovina principales, incluyendo la proteosa peptona y el caseinomacropéptido, mediante cromatografía líquida de alta resolución de fase invertida, sobre poliestireno-divinilbenceno"), D.F. Elgar et al., Journal of Chromatogra-phy ("Revista de Cromatografía") A 878 (2000) 183-196.

Las subfracciones de proteína eluidas de la columna pueden ser exactamente determinadas mediante la composición del contenido de la mezcla de tampones o del contenido de acetonitrilo que efectuó su elución de la fase estacionaría. Por ejemplo, la proteína de suero de leche soluble puede cargarse en una columna llena de esferas de poliestireno-divinilbenceno (15 RPC TN 17-0727-02 de Amersham) un tampón A puede definirse como 0,1% en volumen de ácido trifluor-acético (TFA) en agua y un tampón B puede definirse como el 80% en volumen de acetonitrilo y el 0,85% en volumen de TFA (% en volumen). A continuación, la mezcla y transporte de los tampones A y B puede controlarse mediante un sistema específico, por ejemplo una FPLC (cromatografía líquida rápida de proteína) de una estación UNICORN (Pharmacia/Amersham), y pueden pasarse a través de la columna.

La subfracción de la proteína eluída puede ser definida por un margen de elución de ratios de mezclado de los tampones A y B mencionados más arriba. Empleando la composición específica de tampones (debido a que el orden de elución es función del pH), el momento o intervalo de elución de una sub-fracción de proteína puede ser descrita simplemente por la cantidad relativa de acetonitrilo presente en el momento de la elución de una fracción de proteína de acuerdo con la invención.

Si se desea, las subfracciones así obtenidas, pueden ser concentradas mediante técnicas ya bien conocidas en la especialidad, tales como la evaporación, ultrafiltración, o dializadas, para eliminar el disolvente orgánico antes del secado, por ejemplo mediante un proceso al vacío, por congelación, por pulverización, lecho fluidizado, estufa o cualquier otro proceso de secado adecuado.

Las subfracciones relacionadas en los ejemplos de la tabla 7, han sido mostradas como particularmente efectivas en promover la inhibición de la COX II. De acuerdo con una versión todavía más preferida, la presente invención se refiere a las subfracciones 1, 9, 10, y 14, como se muestra en la tabla 7, las cuales son altamente efectivas.

Generalmente, puede emplearse la leche humana y de vaca, para la preparación de las fracciones de proteína de la leche o preparaciones de proteína, de acuerdo con la presente invención.

La leche desnatada, el suero de leche ácido y el suero de leche dulce, pueden ser preparados de acuerdo con un proceso como se describe en los ejemplos. Los términos "proteína de suero soluble de leche", o "proteína soluble", como se emplea en el contexto de la presente invención, significa la proteína recuperada en solución acuosa después de una ultra-centrifugación (por ejemplo durante 1 hora, a 100.000 g) o de acuerdo con otro proceso ya conocido por una persona experta. Los términos "proteína no-soluble" o "caseína micelar" indica el material lavado recuperado del sedimento después de dicha ultracentrifugación (por ejemplo, de acuerdo con los pasos indicados en el ejemplo 1, ó de acuerdo con otro proceso ya conocido por una persona experta).

Particularmente, se proporciona una alta actividad de inhibición de la ciclooxigenasa-2, mediante el suero dulce de la leche humana y mediante varias fracciones de la leche de vaca, es decir suero dulce de leche, caseína dulce. Para las tres especies de leche investigadas en los ejemplos (humana, bovina y de búfalo), las proporciones más altas de inhibición de la COX-2, se obtienen con suero dulce de leche, lo cual representa por lo tanto, una versión preferida de la presente invención.

Las preparaciones de proteína de suero de leche proporcionan buenos resultados, aunque no fueron tan efectivas como varias fracciones de proteína de leche. Puede asumirse de esta forma, que en las fracciones de proteína de leche de acuerdo con la presente invención, se proporcionan efectos sinérgicos positivos, potenciando la actividad inhibidora de la COX-2. Si se desea pueden también combinarse las fracciones de proteína de leche y las preparaciones de proteína de suero de leche.

Estudios dirigidos a la identificación del (de los) compuesto(s) inhibidor(es) de la ciclooxigenasa-2, presente en las fracciones de proteína de leche, de acuerdo con la presente invención, mostraron que los compuestos deben ser proteínicos. La lactoferrina, un compuesto ya conocido, se ha demostrado que no tiene ninguna actividad de inhibición de la ciclooxigenasa-2.

La biodisponibilidad y la estabilidad con respecto a la biodegradación de dichas una o más fracciones de proteína de leche y/o una o más preparaciones de proteína de leche, pueden aumentarse además mediante la protección de uno o más grupos funcionales tales como por ejemplo -OH, -NH_{2}, -SH, -COOH, de los compuestos presentes en dicha una o más fracciones de proteína de leche y/o una o más preparaciones de proteína de leche. Dicha protección puede efectuarse por ejemplo mediante una reacción con uno o más azúcares o hidratos de carbono, tales como por ejemplo, la lactosa. Por ejemplo, calentando las proteínas de la leche en presencia de lactosa se obtienen proteínas lactosiladas. Después de la protección, los compuestos proporcionarán una mayor resistencia contra la degradación, en particular una degradación proteolítica en el cuerpo, lo cual a su vez da generalmente como resultado una mayor biodisponibilidad. Puede emplearse también una derivatización para obtener la deseada solubilidad y con ello la deseada y controlada bio-disponibilidad.

La presente invención se refiere al empleo de la reivindicación 1.

La una o más fracciones de proteína de leche y/o una o más preparaciones de proteína de leche que proporcionan la actividad inhibidora de la COX-2, pueden por ejemplo ser administradas en una forma de dosificación oral, tópica, parenteral, o rectal, que contiene soportes convencionales farmacéuticamente aceptables no tóxicos, excipientes, adyuvantes, y vehículos. El término parenteral tal como se emplea en la presente, incluye las inyecciones subcutáneas, intra-venosas, intramusculares, la inyección intrasternal o las técnicas de infusión.

La composición nutritiva o farmacéutica de acuerdo con la presente invención, puede emplearse para el tratamiento o prevención de las enfermedades inducidas por la ciclooxigenasa-2, tales como el cáncer o estados precancerosos, en particular de colon, estómago, esófago, hígado, jugos biliares, páncreas, cabeza y cuello, pulmón, pecho, vejiga, órganos genitales de la mujer y enfermedades de la piel y/o inflamatorias, tales como la artritis, fiebre reumática, síntomas asociados con la gripe u otras infecciones víricas, y dismenorrea, dolor de cabeza, dolor de muelas, enfermedades articulares degenerativas, etc., y/o enfermedad de Alzheimer.

Adicionalmente, la composición nutritiva o farmacéutica de acuerdo con la presente invención, puede ser aplicada como un co-tratamiento durante un tratamiento convencional del cáncer y/o un tratamiento de un estado precanceroso, una quimioterapia, una terapia de radiación, una bioterapia y/o durante el tratamiento de una enfermedad inflamatoria y/o durante el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.

La una o más fracciones de proteína de leche y/o una o más preparaciones de proteína de leche que proporcionan una actividad inhibidora de la ciclooxigenasa-2, pueden ser también útiles como sustitutos parciales o completos para medicamentos convencionales, tales como por ejemplo los NSAID's. Así, la invención comprende composiciones farmacéuticas para el tratamiento de enfermedades inducidas por la ciclooxigenasa-2, como se ha definido más arriba, lo cual comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de dichas una o más fracciones de proteína de la leche y/o una o más preparaciones de proteína de la leche y uno o más ingredientes terapéuticamente efectivos, tales como un analgésico; un potenciador; un antagonista del H2, un descongestionante; un antitusígeno; un diurético; una antihistamina sedante o no sedante; un agente para el tratamiento o prevención del cáncer y/o estados precancerosos, etc..

Las composiciones farmacéuticas que contienen el (los) ingrediente(s) activo(s) pueden ser cualquier forma adecuada para el empleo oral, como por ejemplo, comprimidos, discos, obleas, suspensiones acuosas o aceitosas, polvos o gránulos dispersables, emulsiones, cápsulas duras o blandas, o jarabes o elixires.

Las composiciones para uso oral pueden prepararse de acuerdo con cualquier método ya conocido en la técnica para la fabricación de composiciones farmacéuticas, y tales composiciones pueden contener uno o más agentes seleccionados del grupo formado por agentes edulcorantes, agentes saborizantes, agentes colorantes, y agentes conservantes con el fin de proporcionar preparaciones farmacéuticas de buen aspecto y buen paladar.

Los comprimidos contienen el (los) ingrediente(s) activo(s), mezclado(s) con los excipientes no tóxicos farmacéuticamente aceptables, tales como diluyentes inertes, agentes de granulación, agentes de desintegración y lubricantes, adecuados para la fabricación de comprimidos. Los comprimidos pueden estar sin recubrir o pueden estar recubiertos mediante técnicas ya conocidas, para retrasar la desintegración y absorción en el tracto gastrointestinal y con ello proporcionar una acción continuada durante un largo período de tiempo.

Las formulaciones para el empleo oral, pueden estar también presentadas en forma de cápsulas de gelatina dura, en donde el ingrediente activo se mezcla con un diluyente sólido inerte, o como cápsulas de gelatina blanda en donde los ingredientes activos se mezclan con agua o un medio aceitoso.

Las suspensiones acuosas contienen el material activo en mezcla con excipientes adecuados para la preparación de suspensiones acuosas, tales como por ejemplo agentes de suspensión, agentes de dispersión o agentes humectantes, conservantes, agentes colorantes, agentes saborizantes, y agentes edulcorantes.

Los polvos dispersables y gránulos adecuados para la preparación de una suspensión acuosa mediante la adición de agua, proporcionan el (los) ingrediente(s) activo(s) en mezcla con un agente dispersante o humectante, un agente de suspensión y uno o más conservantes. Pueden también estar presentes, excipientes adicionales, por ejemplo agentes edulcorantes, saborizantes, y colorantes.

Las fracciones de proteína de leche y/o las preparaciones de proteína de leche como se han descrito más arriba, pueden emplearse en cualquier composición nutritiva, farmacéutica o alimenticia funcional, las cuales composiciones pueden comprender por ejemplo por lo menos un componente del grupo formado por el agua, proteínas y/o péptidos, grasas e hidratos de carbono. Dicha composición puede además comprender minerales y vitaminas, por ejemplo en una cantidad del 30% al 150% de la dosificación diaria de acuerdo con la "U.S. RDA". Además, dichas composiciones pueden comprender material de fibras, agentes saborizantes, emulsionantes, secuestrantes de radicales, conservantes, ácidos, lípidos, frutas y zumos de frutas, tés, etcétera.

En particular, las composiciones preparadas mediante el empleo de la presente invención pueden comprender por ejemplo una composición alimenticia seleccionada de la leche, yogur, cuajada, queso, leches fermentadas, productos fermentados a base de leche, helados, productos basados en cereales, leche en polvo, fórmulas para niños o comida para animales domésticos.

Las formulaciones que permiten esperar que van a ser altamente aceptadas por los consumidores son por ejemplo bebidas, por ejemplo a base de productos lácteos, bebidas convencionales tales como el agua, zumos de fruta o tés, comprendiendo las fracciones de proteína de leche y/o preparaciones preparadas mediante el empleo de la presente invención.

Otros ejemplos de formulaciones ventajosas son por ejemplo composiciones en forma de preparaciones para postres, geles o espumas (tales como por ejemplo "mousses", ("espumas"), cremas, jaleas, flanes, preparaciones a base de yogourt) o en forma de bocadillos que comprenden un producto de panadería con un relleno o centro que comprende las fracciones de proteína de leche y/o preparaciones de acuerdo con la presente invención. Las fracciones de proteína de leche y/o preparaciones preparadas mediante el empleo de la presente invención, pueden también por ejemplo ser aplicadas en forma de una capa en la parte superior o recubrimiento sobre cualquier producto alimenticio convencional, o ser incluidos como material de relleno en cualquier producto alimenticio convencional.

El producto preparado mediante el empleo de la presente invención en donde la actividad inhibidora de la ciclooxigenasa-2 es aumentada, puede ser por ejemplo una composición alimenticia nutritiva y/o una composición alimenticia farmacéutica y/o una composición alimenticia funcional, en particular un producto alimenticio lácteo.

\newpage

El procedimiento para el aislamiento de la proteína de suero de leche dulce que proporciona una actividad inhibidora de la ciclooxigenasa-2, comprende los siguientes pasos: centrifugación de la leche a 13.600 g durante 30 minutos para obtener una capa cremosa y una capa de leche desnatada; separación de dicha capa cremosa; aislamiento de la leche desnatada; adición de una solución acuosa de CaCl_{2} a la leche desnatada en una cantidad tal que se obtenga una mezcla con una concentración de 2 mmoles/Ca^{2+}; calentando dicha mezcla a 35ºC y añadiendo cuajo con una actividad de 50 mg de quimosina activa por litro (por ejemplo en una cantidad de 0,4 a 0,6, de preferencia 0,5 \mul de cuajo por ml de leche desnatada) a dicha mezcla, o calentando dicha mezcla a 25ºC y acidificando dicha mezcla a un pH de 4,6 con una solución acuosa de HCl (32%); centrifugando la mezcla a 13.600 g durante 30 minutos con el fin de obtener una separación de las fases; y aislamiento de la proteína de suero de leche dulce.

El proceso para el aislamiento de la proteína de suero soluble de leche que proporciona una actividad inhibidora de la ciclooxigenasa-2, comprende los siguientes pasos: centrifugación de la leche a 13.600 g durante 30 minutos para obtener una capa de nata y una capa de leche desnatada; separación de dicha capa de nata; separación de la leche desnatada; adición de una solución acuosa de CaCl_{2} en tal cantidad a la leche desnatada que se obtenga una mezcla con una concentración de 2 mmoles/litro de Ca^{2+}; centrifugación durante 1 hora a 100.000 g para la separación de la fase de proteína del suero soluble de leche de la fase de caseína micelar no soluble; y aislamiento de la fase de proteína del suero soluble de leche.

Debido a su actividad inhibidora de la ciclooxigenasa-2, la fracción de proteína de leche, preparada mediante el empleo de la presente invención, proporcionará alternativas a los NSAIDs convencionales, en particular en casos en donde dichos NSAIDs están contraindicados, tales como en casos de individuos que sufren de úlcera, trastornos de coagulación, enfermedades del riñón, etc.. Además, puede esperarse que dicho producto estará esencialmente libre de efectos laterales perjudiciales y puede por lo tanto ser consumido incluso durante un largo período de tiempo. En particular, esto será de un alto interés cuando se desea la prevención de una enfermedad inducida por la ciclooxigenasa- 2, por ejemplo en caso de personas en las que se teme un elevado riesgo de desarrollar un cáncer debido a su predisposición genética o debido a la exposición de factores de riesgo bien conocidos (nutrición de alto riesgo tal como por ejemplo una "dieta del oeste" típica, alta en grasas y baja en fibras, exposición a productos químicos, etc.).

Puesto que los productos lácteos han sido consumidos en todos los tiempos por la humanidad, puede esperarse que una comida funcional o un medicamento preparado mediante el empleo de la presente invención será altamente aceptado por los consumidores.

Los siguientes ejemplos ilustran la invención sin limitar las versiones específicas mencionadas.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplos

Todos los disolventes empleados fueron de calidad analítica o para HPLC y fueron adquiridos en Merck (Dietikon; Suiza). El agua, o bien se purificó en casa, empleando un sistema de purificación de agua Millipore Milli-Q (Millipore, Volketswil, Suiza) o bien fue de calidad HPLC (Merck, Darmstadt, Alemania). Los CaCl_{2} x 2 H_{2}O, HCl (32%), hidróxido de sodio, perhidrol 30% H_{2}O_{2} p.A., fueron todos adquiridos en Merck.

El cuajo ("de simple presión") fue producido por TEXEL (38470 Vinay, Francia) y fue adquirido en Rhone Poulenc Rohrer (Cooperation Pharmaceutique Française, 77000 Melun, Francia; lote nº 101089007) con una actividad de 50 mg de quimosina activa por litro.

Ejemplo 1 Preparación de la muestra de leche

Se efectuaron pasos estándar para la preparación de fracciones de leche, como se ha descrito en: C. Alais, Science du Lait, Principe des Tecniques Laitieres ("Ciencia de la leche, Principios de las técnicas lecheras") SEPAIC, París, 4ª edición, 1984, págs. 29-35 y 159-178, a no ser que se indique explícitamente otra cosa.

Los pasos de fraccionamiento indicados a escala de laboratorio, se desarrollaron a partir de procedimientos convencionales con leche industrial. Sorprendentemente la selectividad y eficacia de la separación pudieron aumentarse significativamente efectuando los pasos del procedimiento indicado más adelante, en particular efectuando una centrifugación a altas velocidades de aceleración y pasos de lavado específicamente adaptados.

1.1 Leche bovina

Se obtuvo leche bovina de un mercado local ("leche Toni", Suiza).

En un primer paso, se extrajo la nata de una leche entera mediante centrifugación con una velocidad de aceleración de hasta 13.600 g empleando un rotor de ángulo fijo Sorval GS3 (9.000 rpm, durante 30 minutos). Partiendo de 2200 ml de leche entera, se obtuvieron 90 g de nata en la capa superior. Después de la separación de la capa superior, se obtuvieron 2090 ml de leche desnatada.

La separación del suero dulce de leche de la caseína, se logró mediante tratamiento enzimático de la leche desnatada que induce la coagulación de la caseína. Se añadieron 520 \mul de una solución acuosa 200 mM (200 mmoles/litro) de CaCl_{2} 520 ml de de leche desnatada con el fin de lograr una mezcla que tuviera una concentración final de 2 mM (moles/litro) de Ca^{2+}. Esta mezcla de leche desnatada se calentó a 35ºC y a continuación se añadieron inmediatamente 250 \mul de cuajo con una moderada agitación magnética. Después de 1 minuto, la mezcla se incubó durante 50 minutos a 35ºC al baño María, se vertió en frascos para la centrifugación y a continuación se centrifugó durante 30 minutos a 13.600 g (rotor de ángulo fijo Sorval GS3; 9000 rpm, 30 minutos), con el fin de separar el suero dulce de leche de la caseína del cuajo no soluble.

Los 476 ml del sobrenadante (es decir el "suero dulce") fueron fraccionados en 10 x 1,3 ml alícuotas (Eppendorf) y tubos de plástico de 40 ml de, los cuales fueron marcados (suero dulce de leche), se congelaron por inmersión en nitrógeno líquido y se almacenaron en bolsas de plástico a -20ºC.

La caseína del cuajo (45 g) se dispersó en 286 ml de una solución acuosa de CaCl_{2} 2 mM (moles/litro), estando suplementada dicha solución de CaCl_{2} con 0,9% en peso de NaCl, y a continuación se centrifugó; el sobrenadante (246 ml) se dividió en alícuotas en recipientes, los cuales se marcaron (lavado de caseína de cuajo), y se congeló en nitrógeno líquido.

Los 31 g obtenidos de caseína de cuajo lavada, se dispersaron en una solución acuosa de CaCl_{2} 2 mM (mmoles/litro), estando suplementada dicha solución de CaCl_{2} con 0,9% en peso de NaCl, de forma que se obtuviera un volumen de 250 ml. La mezcla se dividió a continuación en alícuotas en recipientes, los cuales fueron marcados (caseína de cuajo) y se congelaron.

La separación del suero ácido de la caseína se obtuvo mediante acidificación química de la leche desnatada induciendo la coagulación de la caseína. Se añadieron 520 \mul de una solución acuosa de CaCl_{2} 200 mM (mmoles/litro) a 520 ml de leche desnatada con el fin de lograr una mezcla que tuviera una concentración final de 2 mM (moles/litro) de Ca^{2+}. Esta mezcla se acidificó a 25ºC mediante la adición de una solución acuosa de HCl (32%) de pH 6,6 a pH 4,6 con una moderada agitación magnética. Después de 1 minuto de agitación, la mezcla se incubó durante 60 minutos a 25ºC, se vertió en frascos para la centrifugación y a continuación se centrifugó durante 30 minutos a 13.600 g (rotor de ángulo fijo Sorval GS3; 9000 rpm, durante 30 minutos), para separar el suero ácido de la caseína ácida no soluble.

Los 503 ml del sobrenadante (es decir, el suero ácido de leche), se fraccionaron en alícuotas 10 x 1,3 ml (Eppendorf) y tubos de plástico de 40 ml, los cuales fueron marcados (suero ácido de leche), y se congelaron por inmersión en nitrógeno líquido y se almacenaron en una bolsa de plástico a -20ºC.

La caseína ácida (41 g) se dispersó en 233 ml de una solución acuosa de acetato de sodio 20 mM (mmoles/litro) con un pH de 4,6. La mezcla así obtenida se centrifugó, y el sobrenadante (250 ml) se separó, y a continuación se dividió en alícuotas en recipientes, los cuales fueron marcados (lavado de caseína ácida) y se congeló en nitrógeno líquido.

Los 28,6 g obtenidos de caseína ácida lavada se dispersaron en agua. El pH de esta mezcla se ajustó de 4,67 a 6,6 mediante la adición de NaOH. A continuación, el volumen se ajustó a 250 ml, y la mezcla así obtenida se dividió en alícuotas en recipientes, los cuales fueron marcados (caseína ácida) y se congelaron.

Con el fin de separar las proteínas solubles (suero de leche) y las proteínas no solubles lavadas (caseína micelar), se efectuaron los siguientes pasos:

Se añadieron 250 \mul de una solución acuosa de CaCl_{2} 200 mM (mmoles/litro), a 250 ml de leche desnatada para obtener una mezcla con una concentración final de 2 mM (moles/litro) de Ca^{2+}. Esta leche se ultracentrifugó (6 tubos conteniendo 42,1 g de leche desnatada en un rotor de ángulo fijo 45 Tl, se centrifugaron durante una hora en una ultracentrífuga Beckman L8-60M a una velocidad de 32.000 rpm correspondientes a 100.000 g en el centro del tubo) con el fin de separar la proteína de suero soluble de leche, de la caseína micelar no soluble.

Los 228 ml de sobrenadante (es decir, la proteína de suero soluble de leche) se fraccionaron en alícuotas 10 x 1,3 ml (Eppendorf) y tubos de plástico de 40 ml, los cuales fueron marcados (proteína de suero soluble de leche) y se congelaron por inmersión en nitrógeno líquido y se almacenaron en una bolsa de plástico a -20ºC.

La caseína micelar (24 g) se dispersó en 220 ml de una solución acuosa de CaCl_{2} 2 mM (mmoles/litro), estando dicha solución de CaCl_{2}, suplementada con 0,9% en peso de NaCl. La mezcla se ultracentrifugó (en una ultracentrífuga Beckman L8-60M durante 1 hora a la velocidad de 32.000 rpm correspondientes a 100.000 g en el centro del tubo). El sobrenadante (229 ml) se separó, y a continuación se dividió en alícuotas en recipientes, los cuales fueron marcados (lavado de caseína micelar), y se congeló en nitrógeno líquido.

Los 22 g obtenidos de caseína micelar lavada, se dispersaron en una solución acuosa de CaCl_{2} 2mM (mmoles/litro), estando dicha solución de CaCl_{2} suplementada con 0,9% en peso de NaCl de manera que se obtuviera un volumen final de 250 ml. Esta mezcla se dividió en alícuotas en recipientes, los cuales fueron marcados (caseína micelar) y se congelaron.

\global\parskip0.860000\baselineskip

1.2. Leche de pecho humana

Se obtuvo leche de pecho humano de madres sanas, las cuales estuvieron de acuerdo en dar muestras de leche de pecho en cantidades que no hicieran correr peligro el suministro nutritivo del bebé (10-60 ml). Las muestras fueron obtenidas hasta 70 días después del parto, mediante expresión por bombeo del pecho, o ocasionalmente mediante expresión manual, y fueron procesadas dentro de las 2 horas después de la recogida. Cuando no se indica expresamente otra cosa, todos los pasos del procedimiento fueron efectuados como se ha descrito en 1.1, más arriba.

Se añadieron 7,2 ml de una solución acuosa de CaCl_{2} 200 mM (mmoles/litro), a 715 ml de leche entera con el fin de obtener una mezcla de una concentración final de 2 mM (mmoles/litro) de Ca^{2+}. Después de una centrifugación para la separación de la nata (como se ha descrito en 1.1, más arriba), se obtuvieron 26,6 g de nata como capa superior y se separaron 713 g de leche desnatada.

La separación de suero dulce de leche/caseína se obtuvo mediante tratamiento enzimático de la leche desnatada induciendo la coagulación de la caseína. La leche desnatada (200 g) se calentó a 35ºC, y a continuación se añadieron inmediatamente 100 \mul de cuajo, con agitación magnética moderada. Después de 1 minuto, la mezcla se incubó durante 50 minutos a 35ºC al baño María, se vertió en frascos para centrifugación y a continuación se centrifugó a 13.600 g durante 30 minutos (como se ha descrito en 1.1), con el fin de separar el suero dulce de la caseína de cuajo no soluble.

Los 199 ml de sobrenadante (es decir, el suero dulce de leche), se fraccionaron en alícuotas 10 x 1,3 ml (Eppendorf) y tubos de plástico de 40 ml, los cuales fueron marcados (suero dulce de leche), y se congelaron por inmersión en nitrógeno líquido y se almacenaron en una bolsa de plástico a -20ºC.

La caseína de cuajo (2 g) se dispersó en 98 ml de una solución acuosa de CaCl_{2} 2 mM (mmoles/litro), estando dicha solución de CaCl_{2} suplementada con 0,9% en peso de NaCl. La mezcla resultante se centrifugó; el sobrenadante (99 ml) se separó y a continuación se dividió en alícuotas en recipientes, los cuales fueron marcados (lavado de caseína de cuajo), y se congeló en nitrógeno líquido.

Los 1,15 g obtenidos de caseína de cuajo, se dispersaron en una solución acuosa de CaCl_{2} 2 mM (mmoles/litro), estando dicha solución de CaCl_{2} suplementada con 0,9% en peso de NaCl, con el fin de obtener un volumen de 100 ml. A continuación, la mezcla resultante se dividió en alícuotas en recipientes, los cuales fueron marcados (caseína de cuajo), y se congelaron.

La separación del suero ácido de la caseína se obtuvo mediante acidificación química de la leche desnatada induciendo la coagulación de la caseína. Se acidificaron 200 ml de leche desnatada, a 25ºC mediante la adición de una solución acuosa de HCl (32%) de pH 6,6 a pH 4,6 con agitación magnética moderada. Después de 1 minuto de agitación, la mezcla se incubó durante 60 minutos a 25ºC, se vertió en frascos para centrifugación y a continuación se centrifugó a 13.600 g durante 30 minutos (como se describe en el ejemplo 1.1) con el fin de separar el suero ácido de la caseína ácida no soluble.

Los 195 ml de sobrenadante (es decir suero ácido de leche) se fraccionaron en alícuotas 10 x 1,3 ml (Eppendorf) y tubos de plástico de 40 ml, los cuales fueron marcados (suero ácido de leche) y se congelaron por inmersión en nitrógeno liquido y se almacenaron en una bolsa de plástico a -20ºC.

La caseína ácida (4,9 g) se dispersó en 95 ml de una solución acuosa de acetato de sodio 20 mM (mmoles/litro) con un pH de 4,6, y la mezcla se centrifugó. El sobrenadante (96 ml) se dividió en alícuotas en recipientes, los cuales fueron marcados (lavado de caseína ácida) y se congelaron en nitrógeno líquido.

Los 2,9 g obtenidos de caseína ácida lavada se dispersaron en 95 ml de agua. El pH de esta mezcla se ajustó mediante la adición de 6,2 ml de NaOH. A continuación, el volumen se ajustó a 100 ml. A continuación, la mezcla se dividió en alícuotas en recipientes, los cuales fueron marcados (caseína ácida) y se congelaron.

Se ultracentrifugó leche desnatada como se ha descrito en 1.1.

Los 198 ml de sobrenadante se fraccionaron en alícuotas de 10 x 1,3 ml (Eppendorf) y tubos de plástico de 40 ml, los cuales fueron marcados (proteína de suero soluble de leche) y se congelaron por inmersión en nitrógeno líquido y se almacenaron en una bolsa de plástico a -20ºC.

La caseína micelar (0,5 g) se dispersó en 32 ml de una solución acuosa de CaCl_{2} 2 mM (mmoles/litro), estando dicha solución de CaCl_{2} suplementada con 0,9% en peso de NaCl, y se ultracentrifugó (como se ha descrito en el ejemplo 1.1). El sobrenadante así obtenido (32,8 ml) se dividió en alícuotas en recipientes, los cuales fueron marcados (lavado de caseína micelar) y se congelaron en nitrógeno líquido.

Los 0,4 g obtenidos de caseína micelar lavada, fueron dispersados en una solución acuosa de CaCl_{2} 2 mM (mmoles/litro), estando dicha solución de CaCl_{2} suplementada con 0,9% en peso de NaCl, con el fin de obtener un volumen de 33 ml. La mezcla resultante se dividió en alícuotas en recipientes, los cuales fueron marcados (caseína micelar) y se congelaron.

\global\parskip1.000000\baselineskip

1.3. Leche de búfalo

Se obtuvo leche de búfalo fresca pura en la región Lahore de Pakistán, y se suministró refrigerada a un cercano laboratorio en donde se liofilizó. La temperatura de congelación fue aproximadamente de -20ºC a aproximadamente -25ºC y la temperatura de secado fue de 40ºC. La presión de vacío se mantuvo por debajo de 2 Torr, con una presión final de 0,2 Torr. El polvo seco se selló en bolsas de plástico forradas de aluminio, se embarcó y a continuación se almacenó a temperatura ambiente. Cuando no se indica explícitamente otra cosa, todos los pasos del procedimiento fueron efectuados como se ha descrito en el ejemplo 1.1.

La leche de búfalo liofilizada, se reconstituyó con un total de sólidos del 13% (TS), disolviendo 70 g del polvo en 468 ml de H_{2}O, y se añadieron 5,4 ml de una solución acuosa de CaCl_{2} 200 mM (200 mmoles/litro). Se obtuvieron 543 ml de leche de búfalo reconstituida con una concentración final de 2 mM de Ca^{2+}. Después de una centrifugación para la separación de la nata como se ha indicado en el ejemplo 1.1., se obtuvieron 46 g de nata en la capa superior y se separaron 485 ml de leche desnatada.

La separación del suero dulce de la caseína, se obtuvo mediante tratamiento enzimático de la leche desnatada induciendo la coagulación de la caseína. Se calentaron 145 ml de leche desnatada a 35ºC, a continuación se añadieron inmediatamente 73 \mul de cuajo con una agitación magnética moderada. Después de 1 minuto, la mezcla se incubó durante 50 minutos a 35ºC al baño María, se vertió en frascos para centrifugación y a continuación se centrifugó durante 30 minutos a 13.600 g (como se describe en el ejemplo 1.1) con el fin de separar el suero dulce de la caseína de cuajo no soluble.

Los 130 ml de sobrenadante (es decir suero dulce de leche) fueron fraccionados en alícuotas de 10 x 1,3 ml (Eppendorf) y tubos de plástico de 40 ml, los cuales fueron marcados (suero dulce de leche), y se congelaron por inmersión en nitrógeno líquido y se almacenaron en una bolsa de plástico a -20ºC.

La caseína de cuajo (14 g) se dispersó en 140 ml de una solución acuosa de CaCl_{2} 2 mM (mmoles/litro), estando dicha solución de CaCl_{2} suplementada con 0,9% en peso de NaCl, y se centrifugó (como se indica en el ejemplo 1.1). El sobrenadante así obtenido (130 ml) se dividió en alícuotas en recipientes, los cuales fueron marcados (lavado de caseína de cuajo) y se congeló en nitrógeno líquido.

Los 13 g obtenidos de caseína de cuajo lavada, fueron dispersados en una solución acuosa de CaCl_{2} 2 mM (mmoles/litro), estando dicha solución de CaCl_{2} suplementada con 0,9% en peso de NaCl, con el fin de obtener un volumen de 145 ml. A continuación, la mezcla resultante se dividió en alícuotas en recipientes, los cuales fueron marcados (caseína de cuajo) y se congeló.

La separación de la caseína ácida de suero de leche se obtuvo mediante acidificación química de la leche desnatada induciendo la coagulación de la caseína. Se acidificaron 145 ml de leche desnatada a 25ºC por adición de 0,6 ml de una solución acuosa de HCl (32%) con un pH de 6,74 a un pH 4,6 con una moderada agitación magnética. Después de 1 minuto de agitación, la mezcla se incubó durante 60 minutos a 25ºC, se vertió en frascos para centrifugación y a continuación se centrifugó durante 30 minutos a 13.600 g (como se describe en el ejemplo 1.1), con el fin de separar el suero ácido de la caseína ácida no soluble.

Los 129 ml de sobrenadante fueron fraccionados en alícuotas de 10 x 1,3 ml (Eppendorf), y tubos de plástico de 40 ml, los cuales fueron marcados (suero ácido de leche) y se congelaron por inmersión en nitrógeno líquido y se almacenaron en una bolsa de plástico a -20ºC.

La caseína ácida (13 g) se dispersó en 130 ml de una solución acuosa de acetato de sodio 20 mM (mmmoles/litro) con un pH de 4,6, y la mezcla se centrifugó (ver ejemplo 1.1). El sobrenadante (129 ml) se dividió en alícuotas en recipientes, los cuales fueron marcados (lavado de caseína ácida) y se congelaron en nitrógeno líquido.

Los 12 g obtenidos de caseína ácida lavada, fueron dispersados en agua, y el pH se ajustó a 6,7 mediante la adición de NaOH. A continuación, el volumen se ajustó a 145 ml. A continuación la mezcla se dividió en alícuotas en recipientes, los cuales fueron marcados (caseína ácida) y se congelaron.

Con el fin de separar las proteínas solubles y las proteínas no solubles lavadas (caseína micelar), se efectuaron los siguientes pasos:

Se ultracentrifugaron 145 ml de leche de búfalo desnatada (como se describe en el ejemplo 1.1) para separar el suero de la caseína micelar no soluble. Los 132 ml de sobrenadante se fraccionaron en alícuotas de 10 x 1,3 ml (Ependorff) y tubos de plástico de 40 ml, los cuales fueron marcados (proteína de suero soluble de leche), y se congelaron por inmersión en nitrógeno líquido y se almacenaron en una bolsa de plástico a -20ºC.

Se dispersó la caseína micelar gelatinosa (11,4 g) en 133 ml de una solución acuosa de CaCl_{2} 2 mM (mmoles), estando dicha solución de CaCl_{2} suplementada con 0,9% en peso de NaCl. La mezcla se ultracentrifugó (ver 1.1., más arriba). El sobrenadante así obtenido (125 ml) se dividió en alícuotas en recipientes, los cuales fueron marcados (lavado de caseína micelar), y se congeló en nitrógeno líquido.

Los 11 g obtenidos de caseína micelar se dispersaron en una solución acuosa de CaCl_{2} 2 mM (mmoles), estando dicha solución de CaCl_{2} suplementada con 0,9% en peso de NaCl, con el fin de obtener un volumen de 145 ml. La mezcla resultante se dividió en alícuotas en recipientes, los cuales fueron marcados (caseína micelar), y se congelaron.

Ejemplo 2 Subfraccionamiento de la proteína de suero soluble de leche bovina

15 ml de proteína de suero soluble de leche obtenida como se ha descrito en el ejemplo 1, se descongelaron durante 20 minutos al baño María a 37ºC, se mezclaron en el aparato Vortex, y se centrifugaron durante un minuto a 13.000 rpm en una centrífuga Eppendorf 5415. Después de filtrar sobre un filtro Millipore de 0,45 \mum (306/GSWP04700.GS), se inyectaron 10 ml de esta preparación en una columna HR 16x50 rellena con 100 ml de Source 15 RPC TN 17-027-02 (poliestireno - divinilbenceno), la cual se conectó a un sistema FPLC controlado por una estación UNICORN (Amersham Pharmacia Biotech).

Las condiciones cromatográficas fueron:

Tampón A: TFA 0,1% en agua (2000 ml de agua millQ filtrada por un sistema Millipore de 0,45 \mum, más 2 ml de TFA (Sigma 91699, 100 ml),

Tampón B: acetonitrilo 80%, TFA 0,85% (400 ml de agua millQ filtrada por un sistema Millipore de 0,45 \mum, más 1600 ml de acetonitrilo, desgasificado en un baño de ultrasonidos durante 15 minutos, y finalmente complementado con 1,7 ml de TFA).

La columna se equilibró con un 20% de tampón B. A continuación, después de un volumen de columna (CV), se inyectó la muestra, se aumentó el tampón B al 75% en 15 CV y al 100% en 2,5 CV. Al final, el gradiente disminuyó al 20% de tampón B en 0,4 CV. La velocidad del flujo se fijó en 3 ml/minuto.

Se recogieron 96 fracciones de 18 ml en tubos de plástico. Las fracciones se guardaron a -20ºC. Después de un análisis HIC-HPLC, los 96 tubos recogidos se reunieron en 14 fracciones por similitud del perfil de HPLC y se concentraron por evaporación antes de la liofilización para el subsiguiente screening.

La tabla 1 muestra 14 subfracciones de proteína de suero de leche mediante un margen de porcentaje en volumen de tampón B, ó un margen en acetonitrilo, dentro del cual se eluyen las subfracciones.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 1

1

Ejemplo 3 Screening de COX-2 2.1 M 10 de material y método

Se sembraron celulas HUV-EC-C (una célula endotelial permanente derivada de la vena del cordón umbilical humano normal; ATCC CRL1730; M. Miralpeix, M. Camacho et al., Brit. J. Pharmacol 121 (1997), 171-180), en una placa de 96 pocillos (RPMI 1640 + 10% de FCS) y se trataron con 100 nM (n moles) de miristato 12 de forbol acetato 13, durante 6 horas a 37ºC para inducir la isoenzima COX-2. A continuación se añadieron 50 \muM (\mumoles) de ácido araquidónico, y las células se incubaron en presencia de los compuestos o mezclas de ensayo durante 30 minutos a 37ºC. La producción de prostaglandina-E2 se midió por radioinmunoensayo (RIA), y la radiactividad se determinó con un contador de centelleo (Topcount, Packard) empleando un cóctel de centelleo líquido (Packard).

Los resultados obtenidos fueron expresados como tanto por ciento de los valores de control y como tanto por ciento de los valores de inhibición del control, obtenidos en presencia de los compuestos de ensayo. Los valores de control se obtuvieron efectuando los pasos indicados más arriba, en donde sin embargo en lugar de ... (parece que falta algo - indicarlo por favor).

La concentración que ocasiona la mitad de la inhibición máxima de los valores de control (valor IC50) y los coeficientes Hill (nH), fueron determinados para los compuestos de referencia (cicloheximida) mediante análisis de la regresión no lineal de sus curvas de inhibición. Éstos parámetros fueron obtenidos por el ajuste de la curva de la ecuación Hill. Los valores de IC50 obtenidos para los compuestos de referencia estuvieron dentro de los límites aceptados de los promedios históricos obtenidos en \pm 0,5 unidades log.

Todos los experimentos de screening de COX-2 se efectuaron una vez. A continuación, los valores de inhibición por debajo del 10% no fueron tenidos en cuenta y se indicaron como "0".

\vskip1.000000\baselineskip

2.2. Screening de COX-2 de la fracción de leche humana

La leche humana desnatada muestra una significativa inhibición de la COX-2 (25%; tabla 2). Cuando se separa la caseína por acidificación o por cuajo (proporcionando suero ácido y suero dulce, respectivamente) se obtuvieron valores del 51% y el 58% de inhibición de la COX-2. De esta forma la separación de la caseína aumenta en gran manera la inhibición de la COX-2. Además, las caseínas solas (ácida, dulce, micelar) no muestran ningún efecto inhibidor sobre la COX-2.

El suero soluble de la leche humana se comporta igual que el producto de partida (es decir, leche humana desnatada).

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 2

2

2.3 Screening de la COX-2 de leche de búfalo

La leche de búfalo desnatada muestra un efecto inhibitorio medio (36%; tabla 3). En contraste con la leche humana, la eliminación ácida de la caseína conduce a una pérdida de dos tercios de su actividad (por debajo del 12%), probablemente debido a una pérdida inducida por el ácido de la actividad después de la acidificación. Si el pH se mantiene constante (es decir en el caso del tratamiento con cuajo y ultracentrifugación), la actividad aumenta a un 44% en ambos casos.

Como ocurre con la leche humana, la caseína micelar de leche de búfalo no mostró ninguna actividad. La caseína ácida y la caseína dulce no fueron ensayadas debido a su falta de solubilidad.

TABLA 3

3

2.4 Screening de la COX-2 de la leche de vaca

Las altas actividades de la leche de vaca cruda y desnatada (52-53%; tabla 4) demuestran que la eliminación de la nata no tiene ningún efecto sobre la inhibición de la COX-2. La actividad permanece constante en el suero soluble de leche (53%), disminuye ligeramente en el suero ácido de leche (45%), y aumenta en el suero dulce de leche (68%). Sin querer adscribirnos a ninguna teoría, la disminución de la actividad del suero ácido de leche, como en la leche de búfalo, puede estar relacionada con la influencia del ácido, mientras que el aumento de actividad después del tratamiento con cuajo podría ser explicado por la teoría de que la desestabilización de la caseína libera alguna bioactividad "latente", como se describe algunas veces durante la "disminución del fraccionamiento" lo cual conduce a un rendimiento superior al 100%.

TABLA 4

4

2.5 Screening de la COX-2 de las preparaciones de proteína de suero de leche

Dos preparaciones de proteína de suero de leche comercialmente disponibles, fueron también sometidas a un screening de la COX-2:

- Lacprodan 80 (MD Foods Ingredients, Viby, Dinamarca), el cual contiene altas cantidades de formas de lactosil \beta- lactoglobulina;

- WPl 95, un aislado de proteína de suero de leche nativa, el cual está virtualmente desprovisto de lactosil \beta-lactoglobulina (verificados mediante espectrometría). El WPI está disponible a partir de: Davisco Foods International. Inc. 620 North Main, Le Sueur, MN 56058 USA; BIPRO lote JE 251-0-420.

TABLA 5

5

Como puede deducirse de la tabla 4, también estos compuestos muestran una considerable actividad de la inhibición de la COX-2 del 23% y del 33%, respectivamente. En contraste con esto último, una proteolisis con tripsina destruye la actividad de la inhibición de la COX-2 de la proteína de suero de leche. Igualmente, la cisteína natural "aminoácido antioxidante" no tiene ningún efecto sobre la inhibición de la COX-2.

2.5. Screening de la leche bovina oxidada

Muestras de leche de bovino fresca (50 ml) fueron suplementadas con perhidrol (30% de H_{2}O_{2}) con el fin de obtener una concentración final de 0,1 mM, 1 mM, 10 mM, 100 mM (mmoles) de H_{2}O_{2} en la mezcla resultante. Todas las mezclas fueron incubadas durante 4 horas a 30ºC.

TABLA 6

6

La leche bovina sin tratar y la leche tratada con 0,1 mM de H_{2}O_{2}, mostraron el mismo efecto "medio" sobre la inhibición de la COX-2 (41%). Con 1 mM de H_{2}O_{2}, la inhibición disminuyó ligeramente (al 35%), un posterior aumento a 10 mM redujo la inhibición de la COX-2 al 27%, y a 100 mM de H_{2}O_{2} -lo cual no está sin embargo, lejos de las condiciones fisiológicas - no se observó en absoluto ninguna actividad inhibidora más.

Los resultados indican que el componente activo, es decir, el componente supresor de la COX-2 en la leche bovina, resiste el H_{2}O_{2} a un nivel de 0,1-10 mM. La disminución del efecto inhibidor corresponde al aumento de la oxidación de la proteína, lo cual indica que la actividad inhibidora de la COX-2 está basada en la proteína y fuertemente relacionada con el status nativo de la proteína.

2.6. Screening de la COX-2 de las subfracciones de proteínas de suero de leche solubles

Los resultados de la inhibición de la COX-2 mediante las subfracciones de proteína de suero soluble de leche, están indicados en la tabla 7. Los valores positivos indican un mejor rendimiento en comparación con el control.

TABLA 7

7

Claims

1. Empleo de una o más fracciones de proteína de la leche, que presentan una actividad inhibidora de la ciclooxigenasa-2, para la preparación de una composición nutritiva y/o farmacéutica para el tratamiento y/o prevención de las enfermedades inducidas por la ciclooxigenasa-2, en donde dichas fracciones de proteínas de la leche, se seleccionan a partir de la caseína dulce de la leche de vaca de suero dulce de la leche de vaca y suero dulce de la leche humana.

2. El empleo, de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la composición nutritiva y/o farmacéutica, se proporciona en forma de dosificación oral, tópica, parenteral, o rectal.

3. El empleo, de acuerdo con la reivindicación 1 al 2, en donde las enfermedades inducidas por la ciclooxigenasa-2 se seleccionan del grupo formado por el cáncer y/o estados precancerosos, en particular el cáncer y/o los estados pre- cancerosos de colon, estómago, esófago, hígado, jugos biliares, páncreas, cabeza y cuello, pulmón, pecho, vejiga, órganos genitales femeninos y la piel, y/o enfermedades inflamatorias, en particular la artritis, fiebre reumática, síntomas asociados con la gripe u otras infecciones víricas, dismenorrea, dolor de cabeza, dolor de muelas, enfermedades degenerativas de las articulaciones, y/o enfermedad de Alzheimer.

4. El empleo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la composición farmacéutica y/o nutritiva proporciona un co-tratamiento durante el tratamiento de un cáncer y/o un tratamiento de un estado precanceroso, en particular durante una quimioterapia, una terapia de radiación, una bioterapia, y/o durante un tratamiento contra el dolor, y/o durante un tratamiento de una enfermedad inflamatoria y/o durante el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.

5. El empleo, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 al 3, en donde la composición nutritiva comprende un material alimenticio seleccionado entre la leche, yogur, cuajada, queso, leches fermentadas, productos fermentados a base de leche, helados, productos a base de cereales, leche en polvo, fórmulas para niños.