ES2313605T3 - Procedimiento para la diagnosis de tumores. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para diagnosticar tumores de los órganos reproductores caracterizado por la determinación del contenido en afamina en una muestra de un fluido corporal o en una muestra de tejido, en el que un tumor se diagnostica si el contenido en afamina en la muestra está disminuida comparado con el contenido en afamina en una muestra de una persona sin un tumor de los órganos reproductores.
Description
Procedimiento para la diagnosis de tumores.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para diagnosticar tumores de los órganos
reproductores.
Los tumores en los órganos reproductores, en
particular tumores de ovarios y testiculares, específicamente
afectan a las personas jóvenes (también un gran grupo de personas
entre 30 y 50). En la mayoría de estos tumores la diagnosis
temprana es capital para la supervivencia. El sistema reproductor
las gónadas - testículos masculinos y ovarios femeninos y otros
conductos y glándulas accesorios (gonos = semilla). Éstos
proporcionan los medios para la reproducción, la continuación de
las especies, y paso de material genético a las siguientes
generaciones.
Los tumores de ovarios son blastomas del ovario.
Cada tercio del tumor de ovario es o se desarrolla en un carcinoma.
El cáncer de ovario es la 5ª causa más común en mujeres y es
responsable del 5% de todos los cánceres y 6% de todas las muertes
por cáncer en mujeres. 1 de cada 55 desarrollará cáncer de ovario
alguna vez en su vida. Es un problema principal en la medicina
rutinaria, debido a que los síntomas de cáncer de ovario son
similares a los quistes o tumores no cancerosos. Los tumores de
ovarios se diagnostican de manera usual mediante examen con las dos
manos, examen ultrasónico, tomografía por ordenador, laparoscopia y
laboratorio exploratorio.
El marcador mejor conocido y bien descrito de
cáncer de ovario es el antígeno A125 (Whitehouse et al.
Gynecol Oncol 88, S152, 2003). Ya que el antígeno CA125 no
solamente ese expresa en las células tumorales de ovario sino
también mediante un número de diferentes tipos de células, no tienen
suficiente especificidad y sensibilidad para detectar cáncer de
ovario temprano cuando se usa solo. Las mejoras en la diagnosis
temprana y reducción de los resultados falso positivos se pueden
lograr si el nivel en suero de CA125 se usa en combinación con otros
marcadores.
El cáncer testicular (TC) es responsable de
aproximadamente 1% de los neoplasmas en los hombres y puede afectar
a los varones desde la infancia hasta la senilidad. El TC es la
malignidad más común en varones entre las edades de 15 y 35, el
segundo cáncer más común en hombres de edad entre 35 y 39 años, y la
tercera malignidad más común en varones de edad entre 15 y 19. La
incidencia de TC está actualmente creciendo en aproximadamente
7.000 nuevos casos al año. En un estudio entre 1988 y 1996 de
miembros de servicio de funciones activos se ha observado un 78% en
TC durante este período de nueve años.
Los neoplasmas testiculares se clasifican en dos
grupos histológicos principales: tumores de la línea germinal (95%
de todos los tumores testiculares,) y tumores de células no
germinales (4% a 5%). Los tumores de células germinales se dividen
en seminomas (S) que representan aproximadamente 40% de los tumores
de las células germinales, y no seminomas (NS) que suponen hasta un
60% de todos los tumores de las células germinales. Lo no seminomas
se dividen además en cuatro categorías: embrionarios (15% a 20%),
teratoma (20% a 25%), saco vitelino (10%), y coriocarcinoma (1%)
(para las recientes revisiones, véase Mac-Vicar
et al., 2004 Curr Opin Oncol 16: 253-256;
Parker et al., 1996 CA Cancer J Clin 46:
5-27; y Hellerstedt et al., Curr.Opin.Oncol.
14 (2002), 260-264). Seminomas típicamente se
extienden mediante los ganglios linfáticos regionales a
supraclavicular, mediastinal, y ganglios retroperitoneales. Los no
seminomas se metastatizan preferiblemente al hígado y pulmones
mediante las vías linfática y hematogénica. Aunque la tasa de
supervivencia para TC generalmente Buena, la supervivencia y
posibilidad de curación de los TC depende extremadamente de la
detección temprana (Parker et al, 1996). Una vez que se ha
extendido el cáncer más allá de los ganglios locales (Fase III) la
tasa de supervivencia cae drásticamente, mientras que la tasa de
supervivencia de cinco años para las fases I y II de cáncer
testicular es mejor que el 95%. En consecuencia, la diagnosis en una
fase temprana evoluciona con una mejor prognosis a largo plazo,
mientras que la diagnosis retrasada está asociada a la mortalidad
del paciente. Esto es debido a que la tasa de respuesta es menor al
tratamiento establecido si el desarrollo de tumor ha avanzado.
Ya que no cada hallazgo anormal relacionado con
el testículo es un neoplasma testicular, se deben realizar grandes
esfuerzos para separar los tumores de otros trastornos del testículo
tal como epididimitis. Ya que la biopsia por aguja fina, un
procedimiento comúnmente empelado para la confirmación de diagnosis
de cáncer está contraindicada en el caso de un TC debido a un
incremento en el riesgo de la extensión metastático, eliminación
quirúrgica radical del testículo afectado no es solamente la primera
etapa en la mayoría de los regímenes de tratamiento sino también a
menudo se realiza para la diagnosis definitiva.
El cáncer cervical es el segundo cáncer más
común entre las mujeres en todo el mundo, con más de 500.000 nuevos
casos y aproximadamente 288.000 de muerte al año (WHO: Human
papillomavirus infection and cervical cancer, 2004. A partir
de:
http://www.who.int/vaccine_research/diseases/hpv/en/).
La situación es incluso peor en muchos países desarrollados donde
más de dos tercios de los cánceres cervicales se diagnostican
primero en una fase avanzada, que típicamente está combinada con
una prognosis pobre para la supervivencia. Por otra parte, si las
lesiones precancerosas se identifican de una manera oportuna y se
inicia el tratamiento inmediatamente, las muertes por cáncer
cervical serían completamente evitables.
Los programas de prevención de cáncer se basan
en el hallazgo que los desarrollos de cáncer cervical de suave (CIN
I) a moderado (CIN II) y grave CIN (CIN III) y finalmente a cáncer.
La neoplasia cervical intraepitelial (CIN) describe cambios
precancerosos del cuello, es decir, el crecimiento anormal del
tejido epitelial sobre la superficie del cuello, CIN progresa a
cáncer durante un período prolongado de tiempo (típicamente 5 a 20
años) y es asintomático. De este modo CIN solamente se puede
detectar mediante procedimientos de ensayo adecuados. Mientras CIN
puede retroceder de manera espontánea, especialmente mujeres
jóvenes, es importante para tratar CIN moderado o grave debido a
que puede progresar de otra manera a cáncer.
Varios tipos de HPV (virus de papiloma humano),
una infección transmitida por vía sexual, se han identificado como
el agente causante principal para el desarrollo de lesiones
precursoras. Algunos tipos de HPV, especialmente los tipos 16 y 18,
pero también otros como 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, y 68
(denominados comúnmente "HPV de alto riesgo") están asociados a
neoplasia intraepitelial cervical y más probablemente provocan
graves lesiones y cáncer. Aunque las infecciones por HPV están
ampliamente extendidas en la población no se pueden encontrar en
cada paciente de cáncer cervical. Además, no todas las infecciones
con alto riesgo de HPV dan como resultado cáncer cervical. Por lo
tanto también se postulan otros agentes causantes del desarrollo de
cáncer cervical.
CIN usualmente se produce en la región del
cuello cervical donde el epitelio escamoso del ectocuello del útero
y el epitelio columnar del endocuello del útero se reúnen. Las
células de esta zona se deben muestrear para la selección
citocitológica (es decir, la selección de Papanicolau) o necesidad a
examinar durante los procedimientos de selección visual (es decir,
colposcopia) las dos herramientas de diagnóstico más usadas
comúnmente además de la tipificación de
HPV-DNA.
La selección de Papanicolaou hace uso de la
observación en la que CIN es un cambio celular en el que la relación
entre el núcleo celular y el tamaño global de la célula está
aumentado. El procedimiento se describió primero en Papanicolau en
1923, como procedimiento de recolección de células del tracto
vaginal y frotis de las células sobre un portaobjetos de vidrio
para el examen microscópico. Aunque todavía se emplea de manera
amplia, la selección de Papanicolaou es una técnica de selección
moderadamente eficaz. Los estudios de metástasis recientes han
mostrado que la selección de frotis de Papanicolaou tiene una
sensibilidad global de solamente aproximadamente 50% para la
detección de cualquier grado de CIN, que significa que solamente la
mitad de las mujeres con CIN se diagnostican de manera correcta. La
tasa de selección de Papanicolaou falso negativo se estima que es
tan alta como 25% a 50% (Mandelblatt et al., JAMA 287
(2002), 2372-2381) debido a una pobre recogida de
muestras, preparación incorrecta de m portaobjetos, y errores de la
interpretación de laboratorio. La interpretación de los cambios
citomorfológicos es altamente subjetivo dando como resultado un alto
riesgo de clasificación errónea. Para obtener los resultados de
selección por frotis de Papanicolaou, son necesarios profesionales
muy bien entrenados para obtener células de la zona de
transformación en el cuello del útero. Además, un laboratorio de
citología bien establecido con citologistas experimentados es otro
requisito previo para asegurar no solamente la calidad de muestreo
sino también la precisión de la interpretación microscópica de las
muestras. Todas estas limitaciones y diferencias muestra a muestra
hacen imposible ofrecer una selección de Papanicolaou eficaz.
Aunque se han desarrollado nuevas tecnologías,
tal como citología de base líquida y capa fina,, se han desarrollado
para mejorar la precisión del muestreo, la interpretación de la
morfología celular todavía permanece la fuente principal de
interpretación errónea y falsa diagnosis. En la citología de base
líquida y capa fina, la muestra e recoge de cuello del útero
mecánicamente mediante el uso de un cepillo pequeño (es decir,
citocepillo) y se suspende en una solución conservadora de células
para la preparación de portaobjetos automatizada. El líquido se
pasa a través de un microfiltro y las células remanentes se
transfieren en forma de una monocapa desde el microfiltro a un
portaobjetos. El propio portaobjetos se procesa después y se
interpreta como un procedimiento de selección convencional de
Papanicoloau, que en general limita la precisión de este
procedimiento. La sensibilidad puede ser incluso menor cuando se
seleccionan las mujeres posmenopáusicas, debido a que los cambios el
cuello del útero hace difícil obtener muestras adecuadas de la zona
de transformación. Además la citología monocapa (es decir,
Thin-Prep, Cytyc Corporation, Boxborough,
Massachusetts), que aparentemente se puede convertir en el más
ampliamente usado en los Estados Unidos, es mucho más cara que la
selección farmacéutica. Los datos epidemiológicos sugieren que los
procedimientos actuales de selección de Papanicoloau es improbable
que prevengan más de un 60% de cánceres cervicales en una población
(Sasieni P.D., J Am Med Wom Assoc. 55 (2000),
216-219).
La selección visual (colposcopia) - otro
procedimiento usado de manera amplia para la detección de cáncer
cervical - es la inspección visual del cuello del útero con el fin
de encontrar cambios patológicos en la transformación del cuello
del útero. En su comienzo este planteamiento usaba la inspección
visual solo y era muy impreciso en la identificación de las
lesiones precursoras. La inspección visual después de la
"tinción" previa de la zona de la zona de transformación del
cuello del útero con ácido acético ha establecido este
procedimiento como una técnica de selección sencilla y rentable.
Esta inspección visual modificada implica la inserción de un
espéculo vaginal y muestreo con hisopo del cuello del útero con 3% a
5% de solución de ácido acético antes de la inspección visual del
cuello del útero. El epitelio normal aparece color rosa mientras
que las lesiones CIN se volverán blancas durante unos pocos minutes
después de la aplicación de ácido acético debido al incremento de
la cantidad de proteínas nucleares y citoqueratinas en el epitelio
cervical. A pesar de esta mejora, el procedimiento está todavía
limitado en la precisión de la detección de las lesiones CIN II y
CIN III. Además, la interpretación de los resultados de la
colposcopia es, similar a la selección de Papanicolaou, que depende
en gran medida de la experiencia de los examinadores.
Además de éstos, en el sentido más amplio, los
procedimientos de selección en base visual, de tipo
HPV-DNA se hace más y más importante durante los
últimos años. Los recientes avances en la detección de ADN a partir
de HPV de alto riesgo (es decir, ensayo II de captura de Híbrida
(Digene Corporation, Gaithersburg, Maryland) en combinación con la
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)), han permitido que el
ensayo de HPV se use como una herramienta de selección para la
neoplasia intraepitelial cervical asociada a HPV y cuello del útero.
El ensayo de ADN de captura II híbrida usa sondas de ácido
ribonucleico no radiactivas en un ensayo inmunoabsorbente ligado a
enzimas (ELISA) para detectar ADN de las especies de HPV de alto
riesgo. Aunque el ensayo de HPV es eficaz, su distribución está
limitada por el hecho que es más cara que la selección de
Papanicolaou. De acuerdo con las directrices de FDA, el ensayo de
HPV-ADN no pretende que reemplace la selección de
Papanicolaou regular o para seleccionar las mujeres por debajo de
los 30 con resultados de Papanicolaou normales. Además, el ensayo
HPV-ADN está per se limitado a las lesiones
de CIN inducidas por HPV y cánceres cervicales inducidos por
HPV.
La determinación de la fase del Cáncer Cervical
se ha desarrollado para describir el grado de desarrollo de cáncer.
La fase de cáncer cervical describe el tamaño de tumor, profundidad
de penetración dentro del cuello del útero y extensión de dentro y
más allá del cuello del útero. La determinación de la fase del
cáncer cervical se describe usualmente en términos del sistema
FIGO, una puesta en escena del esquema desarrollado por la
Federación Internacional de Ginecología y Obstetricia. Las
clasificaciones de FIGO se agrupan dentro de las fases básicas
marcadas fase 0 hasta la fase IV (0-4):
* Fase 0 o carcinoma in situ es cáncer
muy temprano. Las células anormales se encuentran solamente en la
primera capa de las células del revestimiento del cuello del útero
y no invaden los tejidos más profundos del cuello del útero.
* Fase I cáncer implica el cuello del útero pero
no se ha extendido en la proximidad.
* Fase IA indica una cantidad muy pequeña de
cáncer que es solamente visible con un microscopio se encuentra más
profundo en los tejidos del cuello del útero.
* Fase IB indica una mayor cantidad de cáncer
que se encuentra en los tejidos del cuello del útero.
* Fase II el cáncer se ha extendido hasta áreas
cercanas pero todavía está en el interior del área pélvica.
* Fase IIA el cáncer se ha extendido más allá
del cuello del útero hasta los dos tercios superiores de la
vagina.
* Fase IIB el cáncer se ha extendido hasta el
tejido alrededor del cuello del útero.
* Fase III el cáncer se ha extendido a través
del área pélvica. Las células cancerosas se pueden haber extendido
hasta la parte inferior de la vagina. Las células también se haber
extendido para bloquear los tubos que conectan los riñones a la
vejiga.
* Fase IV el cáncer se ha extendido hasta otras
partes del cuerpo.
* Fase IVA el cáncer se ha extendido hasta la
vejiga o recto (órganos cercanos al cuello del útero).
* Fase IVB el cáncer se ha extendido hasta otros
órganos tales como los pulmones.
A pesar de la capacidad de reducir la incidencia
del cáncer cervical de manera significativa mediante la detección
temprana (especialmente antes de la fase O (prefase 0)), existen
todavía limitaciones actualmente en el procedimiento de selección
para esta enfermedad. Lo más dominante es el hecho que muchos
pacientes no están enterados de los procedimientos de selección
disponibles. La detección del cáncer cervical en muestras de suero
con análisis de suero realizados de manera rutinaria resolverían
este problema. Los procedimientos de selección presentes no son
capaces de detectar CIN y/o cáncer cervical en muestras de suero, se
diseñan para el análisis de células cervicales. Todos los
procedimientos de selección establecidos hasta ahora tienen sus
limitaciones específicas y ninguno de estos procedimientos permite
la detección de CIN o cáncer cervical en muestras diferentes de las
derivadas de la región de transformación del cuello del útero.
Además, cada uno de estos programas de selección está más allá de
la posibilidad de usarse para una selección de población
especialmente en los países desarrollados. Esta situación cambiaría
drásticamente con el desarrollo de herramientas de diagnóstico de
CIN y/o cáncer cervical precisas, rápidas, y baratas.
Claramente, las mejores herramientas de
diagnóstico, con una mayor especificidad y una mayor sensibilidad
son una materia de urgente necesidad. Con respecto a esto, los
marcadores en suero no solamente serían marcadores de gran ayuda de
cánceres del sistema reproductor, especialmente TC, cáncer de
ovario, sino también se usaría para la diagnosis, determinación de
la fase, y seguimiento de estas formas de tumores.
Actualmente, por ejemplo, se usan varios
marcadores de suero para diagnosticar neoplasmas de los
testículos:
(1) La subunidad \beta de la gonadotropina
coriónica humana (\beta-HCG) se eleva en un 30% a
35% de tumores de células germinales no seminomatosas y 10% a 25%
en pacientes con seminoma. Esto se debe lo más probable a la
capacidad de algunos tumores de secretar cantidades abundantes de
\beta-HCG. (2) Los niveles de
Alfa-fetoproteína (AFP) se sabe que están elevados
en aproximadamente 55% de los casos de tumores de células germinales
no seminomatosas, pero no en seminomas. (3) La lactato
deshidrogenasa (LDH) se eleva en aproximadamente 50% de todos los
pacientes con neoplasmas testiculares. LDH está elevada de manera
usual en proporción al volumen tumoral y no específica a cualquier
categoría de tumor. A medida que LDH se expresa en varios tejidos,
los niveles anormales de LDH a menudo reflejan otras entidades
patológicas. A pesar del hecho que los niveles HCG, AFP, y LDH se
deberían deliberar en todos los pacientes antes de que se realice
una eliminación quirúrgica radical del testículo afectado
(orquiectomía), el valor predictivo muy limitado de los tres
marcadores de suero es obvio, debido al gran grupo de pacientes que
son negativos para estos marcadores clásicos. De este modo, e la
mayoría de los casos los facultativos no pueden tomar la decisión
de si o no realizan una orquiectomía sobre estos tres marcadores de
diagnóstico. Además, también después de la orquiectomía el valor
predictivo de los niveles en suero de HCG, AFP y LDH permaneces
críticos cuando se controla el tratamiento de los cánceres
respectivos. De este modo, se necesitan de manera urgente nuevos
marcadores de tumores para los neoplasmas testiculares o bien como
marcadores de posición solos, así como marcadores a combinar con las
herramientas de diagnóstico existentes. Desafortunadamente, LDH se
expresa en varios tejidos e incrementa las concentraciones de LDH a
menudo por lo tanto reflejan otras entidades patológicas.
Se han reseñado otros varios nuevos marcadores
de tumores (que incluyen factor de crecimiento epidérmico,
NES-1 e i(12p)) (Hellerstedt et al.,
2002 Curr Opin Oncol 14: 260-264).
Los resultados anormales de marcador usualmente
reflejan enfermedad en pacientes con cáncer testicular. Los
marcadores falsos positivos (por ejemplo la producción de AFP) son
raros pero pueden dar como resultado un tratamiento excesivo
significativo (quimioterapia, cirugía). Por otra parte, el control
de tratamiento mediante marcadores de tumores es solamente posible
en los tumores de células germinales no seminomatoso (NSGCT),
mientras en los pacientes de seminoma la respuesta de tratamiento
se ha estimado mediante resultados de procedimiento s de formación
de imágenes (exploración CT, exploración PET), que obviamente tienen
sus limitaciones.
Una investigación de nuevos marcadores de
tumores del sistema reproductor, especialmente cánceres testiculares
y de ovario, específicamente en el grupo mayor de marcador negativo
reseñado anteriormente (1/3 de NSGCT y la mayoría de seminomas) se
necesita por lo tanto de manera urgente.
Un objeto de la presente invención es
proporcionar estrategias novedosas para la diagnosis de tumores del
sistema reproductor, especialmente para los tumores de ovario y
testiculares así como cáncer cervical.
Por lo tanto, la presente invención proporciona
un procedimiento para la diagnosis de tumores de los órganos
reproductores (es decir, el sistema reproductor) dicho procedimiento
se caracteriza por la determinación del contenido de afamina en una
muestra de un fluido corporal o en una muestra de tejido, en la que
un tumor se diagnostica si el contenido de afamina en la muestra
disminuye comparado con el contenido en afamina en una muestra de
una persona sin un tumor de los órganos reproductores.
La afamina es una proteína de 87 kDa que
pertenece al grupo de albúmina y que tiene muchas cosas en común,
estructuralmente en términos de bioquímica, con las proteínas de
este grupo, tal como, por ejemplo, con albúmina sérica humana
(HSA), [alfa]-fetoproteína humana (AFP) o proteína
de unión a la Vitamina D humana. Afamina también se ha clonado y
secuenciado y de esta manera también está disponible en forma
(documento WO 95/27059). Afamina es una glicoproteína
principalmente de origen hepático que se secreta en la circulación.
Se ha mostrado que afamina se produce de manera abundante en plasma
y otros fluidos corporales como fluido folicular, fluido
cerebroespinal y seminal. Aparte de estas homologías de secuencia
con la albúmina, se conoce poco sobre la función de afamina. La
posibilidad se ha descrito ya que la afamina tiene sitios de unión a
esterol, incluso probablemente no se une actina. Debido a la
similitud existente, todavía no asumida entre la afamina y albúmina,
se duda que estas proteínas se unan a los mismos ligandos
(Lichenstein et al., The Journal of Biological Chemistry,
269 (27) (1994), p. 18149-18154). También se ha
mostrado in vitro e in vivo que posee las propiedades
de unión a la vitamina E (Voegele et al., 2002 Biochemistry
41: 14532-14538). Los ratones en los que el gen de
afamina está inactivado mediante la interrupción dirigida, mostraron
(entre otros fenotipos) testículos con una reducción significativa
de los tamaños de los órganos medios y, en algunos casos, cáncer
testicular. Algunos ratones hembra tenían los órganos reproductores
aumentados en gran medida (útero y ovario) sugiriendo tumores
también en estos órganos. El uso de afamina para determinar la
fertilidad de los mamíferos se ha descrito en el documento WO
01/01148 A1.
Para la presente invención, el papel de afamina
en el desarrollo de cáncer testicular también en seres humanos se
investigó (en un caso/control así como en el control de del diseño
después de tratamiento curativo) en pacientes con tumores en el
sistema reproductor. La Afamina se ha identificado de manera
sorprendente como un marcador de tumores notablemente significativo
para estos tumores. Esto además se demostró clínicamente con
diversas formas de los tumores de células germinales masculinos.
Preferiblemente los tumores testiculares o de
ovarios se diagnostican de cuerdo con la presente invención. En
particular, la presente invención es adecuada de manera específica
para los tumores de las células germinales.
De acuerdo con una realización preferida, el
tumor diagnosticado de acuerdo con la presente invención se
selecciona entre seminomas, no seminomas, tumor testicular
embrionario, teratoma, saco vitelino o corioncarcinoma, y las
mezclas de los tumores anteriormente mencionados.
Los tumores de ovario preferidos a diagnosticar
por el procedimiento presente se seleccionan entre tumores de
ovario de epitelio primario, especialmente cistadenoma,
cistadenomacarcinoma o tumor de Brenner, tumores de ovario de
mesenquémica primarios y tumores mixtos, especialmente fibroma o
adenofibroma de ovarios, tumores del cordón sexual, especialmente
tumor de células granulosa, tumor de células theka, androblastoma o
ginandroblastoma, tumores de las células germinales, especialmente
disgerminoma, teratoma, dermoide, estroma de ovarios, carcinoma
embrionario, poliembrioma, tumor del seno endodérmico o
corionepitelioma maligno, o tumores de ovario secundarios generados
por metástasis, especialmente de carcinoma de mama, carcinomas
gastrointestinales o carcinoma de cuerpo, y las mezclas de los
tumores anteriormente mencionados.
Los tumores testiculares (células germinales)
preferidos a diagnosticar de acuerdo con la presente invención se
seleccionan entre tumores testiculares derivados de las células
germinales, especialmente seminoma, orquioblastoma,
teratocarcinoma, corioncarcinoma o tumores mixtos con seminoma
parcel, o tumores testiculares derivados de células no germinales,
especialmente tumores del estroma testicular, especialmente del
estroma testicular, tumor de células Leydig, tumor de células de
Sertoli o tumor de células granulosa, y mezclas de los tumores
anteriormente mencionados.
Por otra parte, el procedimiento de acuerdo con
la presente invención también se ha probado que es eficaz para la
diagnosis de cáncer cervical, especialmente en las fases tempranas
de este tipo de cáncer (por ejemplo, pre-fase 0,
fase 0, I, IA o IB).
El presente procedimiento se puede combinar con
cualquier otro procedimiento para diagnosticar tumores en el
sistema reproductor, por ejemplo, examen manual, examen histológico
o diagnosis de marcador de tumor. Se prefiere particularmente
combinar el presente procedimiento con ensayos adicionales para
otros marcadores de tumores o combinaciones de tales marcadores,
especialmente para tumores del sistema reproductor, en la muestra.
Los marcadores adicionales preferidos para los tumores testiculares
son alfa- fetoproteína, subunidad beta de gonadotropina coriónica
humana, lactato deshidrogenasa, factor de crecimiento epidérmico,
NES-1 o i(12p) (Hellerstedt et al.,
2002). Los marcadores adicionales preferidos para tumores de ovarios
son CA125, ácido lipofosfatídico (LPA), CA130 o receptor
alfa-folato. Un marcador adicional preferido para el
tumor cervical es SCC (antígeno de carcinoma de células escamosas);
Gadducci A et al., Biomed Pharmacother 2004, 58:
24-38).
De acuerdo con la presente invención en el
contenido en afamina de la muestra se determina con un procedimiento
de determinación de afamina y - debido a comparación con una
referencia de afamina - analizado si la afamina en la muestra
disminuye o no Esto se puede hacer por ejemplo, comparando el
contenido en afamina en la muestra con un patrón de afamina, dicho
valor de referencia de afamina de un individuo sano o de un
individuo que no tiene un tumor del sistema reproductor. Como
alternativa (o además), se proporciona un valor de referencia de un
paciente con un tumor en el sistema reproductor individual. El valor
de referencia se puede proporcionar por ejemplo, en forma de una o
más muestras de referencia, tablas de referencia, curvas de
referencia o medios análogos así como sus combinaciones. Cuando se
analiza si la cantidad de la muestra ha disminuido, las personas
expertas en la técnica tienen numerosas posibilidades. Por ejemplo,
una comparación directa con valores de referencia publicados de
afamina en el fluido corporal o tejido. De cualquier forma, el
procedimiento de acuerdo con la presente invención no proporciona
una diagnosis médica final, proporciona un valor de afamina para
una muestra de del estado de tumor desconocido o de una persona que
está en riesgo de ser sospechosa de tener un tumor en el sistema
reproductor comparado con un valor de afamina de una muestra dada o
virtual que no tiene un tumor en el sistema reproductor,
específicamente un tumor testicular o un tumor de ovario. La
diagnosis médica final después se proporciona - independientemente
de la diagnosis in vitro o procedimiento de análisis de
acuerdo con la presente invención - por la persona educada
médicamente titulada para tal diagnosis.
De acuerdo con una realización preferida de la
presente invención, el contenido en afamina en la muestra se
considera que disminuye, si al menos es un 10% menor,
preferiblemente al menos un 30% menor, especialmente al menos un
50% menor, que el contenido en afamina en una muestra de una persona
sin un tumor de los órganos reproductores.
Como alternativa, el contenido afamina se
considera que ha disminuido de acuerdo con la presente invención,
si al menos es un 20% menor, preferiblemente al menos un 40% menor,
especialmente al menos un 60% menor, que el contenido en afamina en
una muestra de una persona sin un tumor de los órganos
reproductores.
Preferiblemente la persona sin un tumor de los
órganos reproductores es una persona sana con un contenido en
afamina de 50 a 70 mg, especialmente 60 mg, afamina por litro de
suero sanguíneo. Los valores en % anteriormente mencionados se
calculan después o bien a partir del valor de 60 mg o del límite
inferior de 50 mg (dependiendo también de los valores comparativos
del fluido corporal específico (por ejemplo, plasma o suero) o
sistema de determinación de afamina).
Las muestras de fluidos corporales o tejido
preferidas se seleccionan entre sangre, suero, plasma, fluido
cefalorraquídeo, fluido de esperma, fluido folicular, ovario,
testículo o epidídimo.
Aunque todos los procedimientos para determinar
afamina son adecuados para la presente invención, que permiten la
distinción entre un valor de afamina normal uno disminuido, el
contenido en afamina se determina preferiblemente con anticuerpos
anti-afamina, especialmente anticuerpos
monoclonales. Tales anticuerpos pueden comprender un marcador de
detección, preferiblemente un marcador cromogénico, fluorogénico o
radiactivo. De acuerdo con un aspecto adicional, la presente
invención se refiere al uso de un kit para determinar la cantidad
de afamina en una muestra de un fluido corporal o en una muestra de
tejido que comprende medios de detección de afamina y una
referencia de afamina para diagnosticar tumores de los órganos
reproductores. Los kits para la determinación de afamina son bien
conocidos en la técnica (por ejemplo, documentos WO 01/01148 o WO
95/27059). Preferiblemente, el uso de acuerdo con la presente
invención se reduce a la práctica mediante la aplicación de un
procedimiento de acuerdo con la la presente invención como se ha
descrito anteriormente.
Entre los componentes usuales de tales kits de
determinación de afamina, se prefiere específicamente el patrón de
afamina (por ejemplo, como un pocillo patrón en una ELISA de
microvaloración ELISA o como un punto o área patrón sobre un
procesador de génico o procesador de microdisposición de proteína
(anticuerpo).
La presente invención se describe además en los
siguientes ejemplos y las figuras de los dibujos, pero sin estar
restringidos a ello.
La Fig. 1 muestra la concentración media de
afamina [mg/l] en S = Seminoma, NS = No seminoma, MT = Tumor mixto,
NTT = Tumor No Testicular;
La Fig. 2 muestra la concentración media de AFP
[ng/ml] en S = Seminoma, NS = No seminoma, MT = Tumor mixto, NTT =
Tumor No Testicular;
La Fig. 3 muestra la concentración media de HCG
[mIU/ml] en S = Seminoma, NS = No seminoma, MT = Tumor mixto, NTT =
Tumor No Testicular;
La Fig. 4 muestra el desarrollo de concentración
en suero de afamina [mg/l] y HCG concentración en suero [mIU/ml]
durante el tiempo (en días) de un paciente representativo con un
seminoma. El momento 0 indica el valor en suero de la muestra
tomada el día antes de la operación del tumor; otros momentos varían
hasta 70 días después de la operación y muestran un incremento de
los valores de afamina a valores normales en las dos primeras
semanas después de la operación. La segunda curva muestra los
valores respectivos de las concentraciones de HCG en suero.
La Fig. 5 muestra el desarrollo de concentración
en suero de afamina [mg/l] y concentración en suero de HCG [mIU/ml]
durante el tiempo (en días) de un paciente representativo con un
seminoma. El momento 0 indica el valor en suero de la muestra
tomada el día antes de la operación del tumor; otros momentos varían
hasta 135 días después de la operación y muestran un nuevo
incremento de valores de afamina a valores normales dentro de las
primeras 2 semanas después de la operación. La segunda curva muestra
los valores respectivos de las concentraciones de HCG en suero.
La Fig. 6 muestra el desarrollo de concentración
en suero de afamina [mg/l] y concentración en suero de AFP [ng/ml]
durante el tiempo (en meses) de un paciente representativo con un no
seminoma. El momento 0 indica el valor en suero de la muestra
tomada el día antes de la operación del tumor; otros momentos varían
hasta 34 meses después de la operación y muestran un incremento de
los valores de afamina a valores normales en las 2 primeras semanas
después de la operación. La segunda curva muestra los valores
respectivos de las concentraciones de HCG en suero.
La Fig. 7 muestra que las concentraciones en
plasma de Afamina están significativamente reducidas en pacientes
que sufren de cáncer testicular en el momento de la primera
diagnosis de cáncer y se incrementan hasta niveles fisiológicos
después de la extirpación quirúrgica exitosa de tumor/órgano y se
incrementan hasta niveles normales típicamente en un mes
(n=15).
La Fig. 8 muestra las concentraciones en plasma
de Afamina (media + desviación estándar) de un grupo de control de
mujeres basado en la población (n = 410, IC al 95%
60,7-63,3) y las pacientes con cáncer de ovario (n =
111, IC al 95% 29,9-35,0) el día de la extirpación
quirúrgica del tumor (preoperativo).
La Fig. 9 muestra la correlación de
concentraciones en plasma de Afamina y el marcador de tumor
convencional CA125 en 111 pacientes con cáncer de ovario el día de
la extirpación quirúrgica del tumor (preoperativo).
La Fig. 10 muestra las concentraciones en plasma
de Afamina y el marcador de tumor convencional CA125 de un paciente
representativo con cáncer de ovario el día de la extirpación
quirúrgica del tumor (día 0) y aproximadamente 80 semanas más tarde
de la reaparición del tumor. Las concentraciones en plasma reducidas
de Afamina se incrementan hasta niveles de 60 \mug/ml y
disminuyen de nuevo en el caso de la reaparición del tumor (indicado
por la flecha).
La Fig. 11 muestra las concentraciones en plasma
de Afamina y el marcador de tumor convencional CA125 de un paciente
representativo con cáncer de ovario el día de la extirpación
quirúrgica del tumor (día 0) y aproximadamente 80 semanas después
de la reaparición del tumor. Las concentraciones en plasma reducidas
de Afamina se incrementan hasta niveles de 60 \mug/ml y
disminuyen de nuevo en el caso de la reaparición del tumor (indicado
por la flecha). En comparación con CA125, Afamina es altamente
específica para los cánceres gonadotróficos.
La Fig. 12 muestra las concentraciones en plasma
de Afamina (media + desviación estándar) de un grupo de control de
mujeres basado en la población (n = 410) y pacientes con cáncer
cervical (n = 18) en el estado IV FIGO el día de la extirpación
quirúrgica del tumor (preoperativo).
La Fig. 13 muestra las concentraciones en plasma
de Afamina (diamantes) y el marcador de tumor convencional SCC
(cuadrados) de 4 pacientes representativos con cáncer cervical en
las fases FIGO I-IV el día de la extirpación
quirúrgica del tumor (día 0, preoperativo) y después de tiempos
variables de observación hasta la reaparición del tumor (flecha).
Las concentraciones reducidas de Afamina se incrementan hasta
niveles normales y disminuyen de Nuevo en el caso de la reaparición
del tumor.
Desde enero de 2004 a enero de 2005, 16
pacientes con cáncer testicular (seminoma, n = 11, NSCGT, n = 1,
tumores mixtos, n = 4) se diagnosticaron y se trataron en el
departamento de Urología. Los tumores testiculares se clasificaron
basándose en la histología después de la orquiectomía inguinal. Los
tumores testiculares se clasificaron basándose en la histología
después de la orquiectomía inguinal. 4 pacientes se diagnosticaron
falsos positivos en la base de niveles elevados de AFP o HCG, 2 de
los cuales se diagnosticaron de manera histológica que tenían cáncer
de vejiga.
Los análisis de HCG y AFP inmunométricos de
suero se llevaron a cabo usando el Sistema de Inmunoensayo ADVIA®
Centaur (Bayer Diagnostics, Alemania) con la tecnología de
quimioluminiscencia directa. Un valor >10 ng/ml y >10 mIU/ml
se consideró patológico para AFP y hCG, respectivamente. La proteína
total se midió con un ensayo colorimétrico
(Folin-CieuCalteau, Merck-Chemicals,
Darmstadt, Alemania).
Las concentraciones en suero de afamina se
determinaron un ELISA de sándwich descrito recientemente (Voegele
et al., 2002) usando un anticuerpo de conejo de afamina
antihumano policlonal purificado por afinidad para revestir placas
de microvaloración y el anticuerpo N13 de ratón antihumano
monoclonal conjugado a POX para detección. La Afamina que se
purificó de plasma humano y se cuantificó mediante análisis de
composición de aminoácidos que sirven para calibrar una muestra de
plasma secundario.
AFP y HCG se analizaron en el momento de
diagnosis y antes de la orquiectomía, frecuentemente (al menos
bisemanalmente) durante la terapia posterior (quimioterapia,
cirugía retroperitoneal) y al menos tres meses de seguimiento. La
Afamina se midió a partir de muestras congeladas al final del
período del estudio.
La Afamina disminuyó de manera significativa en
pacientes con las tres formas investigadas de cáncer testicular
cuando se compara con un grupo de control basado en la población al
azar (Tabla 1, datos detallados en las Tablas 2 y 3 y en las
figuras). Los valores aumentaban hasta niveles normales en unas
pocas semanas muy comparables a la normalización de los niveles de
HCG/AFP. Los niveles en plasma de proteína total eran normales en
pacientes y no cambiaban durante el tratamiento y observación. De
manera más interesante los niveles de afamina normales se
encontraron en 4 pacientes que tenían los niveles elevados de o bien
HCG o AFP pero no mostraban ningún signo de tumor testicular
mediante examen histológico. Sin embargo, dos de ellos, se
diagnosticaron positivos para cáncer de vejiga.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados presentes son la primera reseña
de un nuevo marcador de tumor de plasma humano que identifica el
tumor testicular independiente de su subtipo (S, NS, MT) mediante la
disminución significativa de los niveles en plasma y un incremento
a valores normales después de la extirpación quirúrgica del tumor.
En el pequeño grupo de estudio presente se proporciona de esta
manera, por el contrario a los marcadores de tumores usados de
manera rutinaria, un marcador confiable para todos los grupos de
cáncer.
Se han detectado cuatro pacientes mediante los
niveles reducidos de afamina que no muestran anormalidades de los
parámetros usados de manera rutinaria (reduciendo de este modo los
falsos negativos). Se descubrieron cuatro casos en los que los
niveles de afamina eran normales, los valores de HCG y/o AFP estaban
elevados. Estos hallazgos ayudaron a reducir los resultados falsos
positivos y negativos debido a las no especificidades de los
marcadores clásicos.
Tomados conjuntamente, la diagnosis de afamina
en pacientes testiculares, como una forma representativa de tumores
del sistema reproductor, incrementa la especificidad de detección
comparada con marcadores específicos conocidos y aplicados en la
técnica. La segunda cuestión importante es la aplicabilidad general
de los valores disminuidos de afamina para todas las formas de
cáncer testicular. La presente observación longitudinal de
normalización de valores después de tratamiento curativo confirma en
gran medida la significación de afemina como un marcador valiosos
de tumor para el cáncer testicular.
Los factores patológicos, expresados en el tumor
testicular podría suprimir la producción y secreción de afamina en
el hígado. Como alternativa, el tumor de crecimiento podría de
manera creciente privar al plasma de ligandos que están llevados
por la afamina. A la vitamina E que es hasta ahora el único ligando
fisiológico conocido de la afamina (Voegele et al., 2002
Biochemistry 41: 14532-14538) se la han asignado
varios papeles en la carcogénesis (Sigounas et al., 1997
Nutr Cancer 28: 30-35).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Significación de afamina entre grupo de seminoma
y de control: p = 0,003
Significación de afamina entre grupo de no
seminoma y de control: p = 0,000 2 x falso neg 2 x falso neg 10 x
falso neg 3 x falso pos 8 x falso neg 3 x falso neg 8 x decr 1 x
decr 1 x decr 4 x normal 1 x normal 1 x incr 1 x incr 1 x incr 3 x
incr 3 x incr 1 x incr 3 x incr 1 x incr Normal Afa intervalo
50-70 mg/l AFA = Afamina, AFP = Alfafetoproteína,
HCG = gonadotropina coriónica humana
S = Seminoma, NS = No seminoma, MT = Tumor
mixto, NTT = Tumor NoTesticular AFP: >10 ng/ml = patológico CG =
grupo de control, basado en población, n = 360 HCG: >10 mlU/ml =
patológico
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de establecer la afamina como
marcador de tumor también para controlar el desarrollo de la
enfermedad (desaparición y reaparición de tumor) y de este modo
confirmar los resultados del estudio piloto mostrado en las Figs.
1-3, 15 pacientes con cáncer testicular
diagnosticado se midieron antes de la extirpación quirúrgica del
tumor y aproximadamente 1 mes después. La disminución de los niveles
de afamina en plasma volvieron a los valores típicos para la
población sana (véase la Tabla 2). Los valores de Afamina
permanecían dentro del intervalo normal incluso después de la
observación prolongada (hasta varios años) lo que indica que no
reaparecía el tumor. Esto está de acuerdo con la experiencia
clínica de una reaparición muy rara de tumor testicular.
\vskip1.000000\baselineskip
Basándose en la analogía y en los hallazgos
preliminares de los tumores sugeridos en los órganos reproductores
en los ratones hembra con la eliminación genética de afamina los
niveles de Afamina también se investigaron en pacientes humanos con
cáncer de ovario. La situación diagnóstica es de manera similar
insatisfactoria en esta enfermedad también ya que el marcador CA125
de tumor usado de manera convencional es muy inespecífico para el
cáncer de ovario y por lo tanto solamente adecuado para el control
de tumor.
Similar a los pacientes con cáncer testicular,
las concentraciones en plasma reducidas de manera significativa de
afamina se encontraron en 111 pacientes con cáncer de ovario cuando
se compara con los basados en la población y de edad coincidente (n
= 410). La diferencia era igual más pronunciada (32 frente a 62
mg/l; Fig. 8) como en los pacientes con cáncer testicular.
Cuando las concentraciones de afamina y CA 125
en plasma estaban correlacionadas entre sí, se observó una
correlación muy débil, no significativa (Fig. 9). Esto indica que no
existe virtualmente ninguna asociación entre estos 2
marcadores.
Con el fin de confirmar la idoneidad de la
afamina como marcador de tumor de cáncer de ovario también en el
diseño de del control 10 pacientes se investigaron longitudinalmente
del día preoperatorio en la diagnosis del cáncer hasta la
reaparición del tumor. La disminución significativa de los valores
de afamina en el momento de la diagnosis se incrementó hasta
valores de controles sanos (una investigación representativa se
observa en la Fig. 10). En algunos casos, la reducción de
concentraciones de afamina en la diagnosis de tumor se observó
también en la ausencia del aumento de marcadores CA125 (Fig. 11)
indicando una mayor especificidad de tumor de la afamina cuando se
compara con CA125.
\vskip1.000000\baselineskip
Finalmente, también se investigó un grupo de
pacientes con otro tumor de órganos reproductores, el cáncer
cervical que es el segundo cáncer más frecuente en mujeres. No
existe ningún marcador en absoluto de tumor en suero para la
identificación de este cáncer frecuente. El marcador SCC en plasma
usado de manera convencional (antígeno de carcinoma de células
escamosas) no es una vez más bastante específico para el cáncer
cervical.
Mediante la presente invención se puede
demostrar no solamente la concentraciones en plasma reducidas de
manera significativa en 18 pacientes con cáncer cervical, sino
también la idoneidad de la afamina como marcador de tumor de
control en el diseño longitudinal (n = 16). La Afamina disminuyó en
todas las fases FIGO investigadas del cáncer, aumentó hasta valores
normales de controles sanos después de la extirpación de tumor y
disminuyó de nuevo en la reaparición del tumor (Figs. 12 y 13).
Claims (18)
1. Procedimiento para diagnosticar tumores de
los órganos reproductores caracterizado por la determinación
del contenido en afamina en una muestra de un fluido corporal o en
una muestra de tejido, en el que un tumor se diagnostica si el
contenido en afamina en la muestra está disminuida comparado con el
contenido en afamina en una muestra de una persona sin un tumor de
los órganos reproductores.
2. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado porque el tumor es un tumor
testicular o de ovario.
3. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el tumor es un
tumor de las células germinales.
4. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque dicho
tumor se selecciona entre seminomas, no seminomas, tumor testicular
embrionario, teratoma, saco vitelino o corioncarcinoma, y las
mezclas de los tumores anteriormente mencionados.
5. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque dicho
tumor se selecciona entre tumores de ovario epiteliales primarios,
especialmente cistadenoma, cistadenomacarcinoma o tumor de Brenner,
tumores de ovario mesenquimales primarios, y tumores mixtos,
especialmente fibroma o adenofibroma de ovario, tumores del cordón
sexual, especialmente tumor de células de la granulosa tumor de
células de la teca, androblastoma o ginandroblastoma, tumores de
células germinales, especialmente disgerminoma, teratoma, dermoide,
estroma de los ovarios, carcinoma embrionario, poliembrioma, tumor
del seno endodérmicos o corionepitelioma maligno, tumores de ovario
secundarios generados por metástasis, especialmente de carcinoma de
mama, carcinomas gastrointestinales o carcinoma del corpus, y las
mezclas de los tumores anteriormente mencionados.
6. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque dicho
tumor se selecciona entre tumores testiculares derivados de las
células germinales, especialmente seminoma, orquioblastoma,
teratocarcinoma, coorioncarcinoma o tumores mixtos con seminoma
parcial, inactivo, o tumores testiculares derivados de las células
germinales, especialmente tumores del estroma testicular, tumor de
células de Leydig, tumor de células de Sertoli o tumor de células
de la granulosa, y mezclas de los tumores anteriormente
mencionados.
7. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque dicho
tumor es cáncer cervical.
8. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque se
determinan en la muestra marcadores adicionales para marcadores,
preferiblemente para tumores del sistema reproductor, especialmente
alfa-fetoproteína, subunidad beta de la
gonadotropina coriónica humana, lactato deshidrogenasa, factor de
crecimiento epidérmico, NES-1, i(12p), fase
PAP, antígeno de carcinomas de células escamosas (SCC) o sus
combinaciones.
9. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 8, caracterizado porque dicho marcador
adicional es CA125, ácido lisofosfatidílico (LPA), CA130 o receptor
alfa-folato.
10. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el
contenido en afamina en la muestra se considera que ha disminuido,
si es al menos un 10% menor, preferiblemente al menos un 30% menor,
especialmente al menos un 50% menor, que el contenido en afamina en
una persona sin un tumor de los órganos reproductores.
11. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el
contenido en afamina en la muestra se considera que ha disminuido,
si es al menos un 20% menor, preferiblemente al menos un 40% menor,
especialmente al menos un 60% menor, que el contenido en afamina en
una persona sin un tumor de los órganos reproductores.
12. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque la
persona sin un tumor de los órganos reproductores en una persona
sana con un contenido en afamina de 50 a 70 mg, especialmente 60
mg, de afamina por litro de suero sanguíneo.
13. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque la
muestra de fluido corporal o tejido se selecciona entre sangre,
suero, plasma, fluido cefalorraquídeo, fluido de esperma, fluido
folicular, ovario, testículo o epidídimo.
14. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque el
contenido en afamina se determina con anticuerpos antiafamina,
especialmente anticuerpos monoclonales.
15. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 14, caracterizado porque dicho anticuerpo
comprende un marcador de detección, preferiblemente un marcador
cromogénico, fluorogénico o radiactivo.
16. Uso de un kit para determinar la cantidad de
afamina in en una muestra de una muestra de fluido corporal o de
tejido que comprende medios de detección de afemina y una referencia
de afamina, para diagnosticar tumores de los órganos
reproductores.
17. Uso de acuerdo con la reivindicación 16,
caracterizado porque el kit se usa en un procedimiento de
acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.
18. Uso de acuerdo con la reivindicación 16 ó
17, caracterizado porque dicho kit contiene una cantidad
normalizada de afamina.
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