CN101360998A - 宫颈非典型增生和宫颈癌中的Na+、K+腺苷三磷酸酶表达 - Google Patents

Abstract

本公开内容提供通过检测Na⁺、K⁺－腺苷三磷酸酶表达来诊断宫颈非典型增生或宫颈癌的方法。例如，本文说明了：相对于正常宫颈组织，宫颈非典型增生或宫颈癌中的Na⁺、K⁺－腺苷三磷酸酶β1亚基的表达增加。还提供了通过减少Na⁺、K⁺－腺苷三磷酸酶生物活性来治疗宫颈非典型增生或宫颈癌的方法。例如，可将治疗有效量的一种或多种Na⁺、K⁺－腺苷三磷酸酶抑制剂运用到宫颈，以治疗宫颈非典型增生或宫颈癌。

Description

宫颈非典型增生和宫颈癌中的Na+、K+腺苷三磷酸酶表达

相关申请的交叉参考

[0001]本发明要求在2006年2月1日提交的美国临时申请第60/764,447号和在2005年12月30日提交的美国临时申请第60/755,223号的优先权，这两个申请通过引用全部并入此处。

技术领域

[0002]本申请涉及通过检测Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶表达来诊断宫颈非典型增生(或宫颈发育异常，cervical dysplasia)和宫颈癌的方法，并且涉及通过减少Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶的生物活性来治疗宫颈非典型增生和宫颈癌的方法。

背景技术

[0003]宫颈癌预防的目标是在癌细胞侵入发生前，检测和治疗所有“定型的(committed)”初期癌细胞。人乳头状瘤病毒(HPV)是形成宫颈癌的因子，并且在宫颈组织中对其的检测目前被用来诊断宫颈非典型增生和宫颈癌。然而，大多数HPV-诱导的损伤被患者天然免疫系统所清除，实际上仅小部分具有HPV感染宫颈的女性形成宫颈癌。因此，需要生物标记以帮助在低度和高度恶性的临床病例和所有癌症病例中检测初期癌细胞组。一旦用于早期检测宫颈癌的生物标记被识别后，这些生物标记成为了治疗宫颈非典型增生的候选物。

发明概述

[0004]本发明已经确定，宫颈组织中的Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶表达，在正常宫颈组织中与宫颈非典型增生和宫颈癌组织中的相比是不同的，例如β1-亚基表达和α-和β1-亚基的相对表达。例如，在宫颈组织中Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶β-亚基表达的增加与从低度恶性发育异常到高度恶性发育异常到宫颈癌的进展相关。此外，在宫颈组织中Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶α-亚基与β-亚基表达的比值随着从低度恶性发育异常到高度恶性发育异常到宫颈癌的进展而降低。Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶的定位模式在正常和患病宫颈组织中是不同的。在一些实例中，正常Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶在基部表达，而在宫颈非典型增生或癌症组织中，Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶表达更多的位于细胞膜。基于这些观察，提供使用Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶作为宫颈非典型增生和宫颈癌生物标记和使用Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶作为治疗宫颈非典型增生和宫颈癌的治疗靶的方法。

[0005]提供在对象中检测宫颈非典型增生或宫颈癌的方法。在特定的实例中，该方法包括在从对象获得的宫颈样品中检测Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶表达(例如蛋白质或核酸分子表达)。例如，可以检测β-亚基(例如β1-亚基)、α-亚基或两者的表达。在特定的实例中，用数量来表示表达水平。例如，检测的Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶表达可与代表特定疾病状态(例如宫颈非典型增生或宫颈癌，或其特定阶段)的参考值或参考样品相比较。例如，在样品中检测的Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶表达水平可与在一种或多种参考宫颈组织样品的Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶表达水平相比较或在对照组织样品中代表期望的Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶表达的参考值相比较。示例性的参考样品和参考值包括代表已知宫颈非典型增生或宫颈癌存在、不存在或等级的那些参考样品和参考值。例如，如果检测的Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶表达(例如β亚基表达)水平与在特定参考样品和参考值的Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶表达(例如β亚基表达)水平基本相似，那么这表明对象具有参考样品和参考值代表的宫颈非典型增生或宫颈癌存在、不存在或等级。在特定的实例中，如果参考值或参考样品是正常的(非发育异常的、非癌性的)宫颈细胞，那么相对于参考值的至少2倍(例如至少3倍)的检测的Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶表达表明从对象获得的宫颈样品中存在宫颈非典型增生或宫颈癌。

[0006]本公开的方法可进一步包括在宫颈组织样品中检测Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶表达的α-亚基，以及确定α-和β-亚基表达的比值。在一些实例中，将确定的比值与一种或多种参考值或参考样品中观察到的α-和β-亚基表达的比值相比较，所述参考值或参考样品具有已知的宫颈非典型增生或宫颈癌存在、不存在或等级。例如，如果检测的α-和β-亚基表达的比值与在特定参考样品或参考值中的α-和β-亚基表达的比值基本上相似，那么这表明对象具有参考样品或参考值代表的宫颈非典型增生或宫颈癌存在、不存在或等级。在特定的实例中，如果参考值或参考样品是正常的(非发育异常的、非癌性的)宫颈细胞，那么相对于参考值的检测的α-和β-亚基表达的比值的减少(例如至少20％或至少50％的减少)表明从对象获得的宫颈样品中存在宫颈非典型增生或宫颈癌。

[0007]在一些实例中，本公开的方法可进一步包括检测另一种标记，例如细胞周期标记如细胞核标记。例如，该方法可包括检测组蛋白H3(例如使用组蛋白H3-特异性抗体)。可使用这类另外的标记以进一步区分正常宫颈组织和宫颈非典型增生或宫颈癌。例如，相对于正常宫颈组织检测到的分裂细胞的增加(例如增加至少2倍、至少5倍或至少10倍，如2-3倍、2-10倍或2-20倍)将表明存在宫颈非典型增生或宫颈癌。

[0008]检测和评定宫颈非典型增生或宫颈癌的方法也可包括确定Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶(例如α-或β-亚基)在宫颈样品中的定位模式。α-或β-亚基或它们两者在宫颈组织样品中的定位可以与一种或多种参考值或参考样品相比较，所述参考值或参考样品具有已知的宫颈非典型增生或宫颈癌存在、不存在或等级。例如，如果检测的Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶的定位与在特定参考样品或参考值中的Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶的定位基本上相似，那么这表明对象具有参考样品或参考值代表的宫颈非典型增生或宫颈癌存在、不存在或等级。在特定的实例中，如果参考值或参考样品是正常的(非发育异常、非癌性的)宫颈细胞，那么相对于参考值的检测的Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶的定位(例如在细胞膜定位的增加)表明从对象获得的宫颈样品中存在宫颈非典型增生或宫颈癌。

[0009]本公开内容也提供治疗组合物。在一个实例中，这类组合物包括一种或多种Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶抑制剂(例如，β-亚基的抑制剂)和药学上可接受的载体。在一个实例中，药学上可接受的是允许局部运用Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶抑制剂的载体，例如局部运用到宫颈。Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶抑制剂可明显降低蛋白质(例如强心苷)的酶活性或减少Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶(例如抑制性的RNA分子)的表达。

[0010]也提供治疗宫颈非典型增生和宫颈癌的方法。在一个实例中，该方法包括给具有宫颈非典型增生或宫颈癌的对象施用组合物，所述组合物含有治疗有效量的Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶抑制剂，例如本文提供的组合物。例如，可以选择使用本文描述的方法确定的具有宫颈非典型增生或宫颈癌的对象接受用于宫颈非典型增生的治疗。在一些实例中，患病的宫颈可与一定数量的Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶抑制剂接触一段时间，以充分降低宫颈中Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶活性(例如，宫颈非典型增生或宫颈癌细胞中)。

[0011]从下面详述的说明书，本公开前述内容和其它对象和特征将变得更加明显，下述说明书通过引用对附图进行说明。

附图简述

[0012]图1A-H表示Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶(A、C、E、G)α和(B、D、F、H)β亚基在(A、B)正常宫颈组织、(C、D)低度恶性宫颈非典型增生、(E、F)高度恶性宫颈非典型增生和(G、H)宫颈癌组织样品中免疫定位的数字图像。正常宫颈组织表达Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶α亚基，但是不表达β1亚基。宫颈非典型增生和宫颈癌样品对于Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶α和β1亚基都为阳性。

[0013]图2A-D表示染色的宫颈组织的数字图像，以表示子宫颈内粘液腺中Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶表达。子宫颈内粘液腺很少在正常组织中见到(A和B)，其主要在宫颈非典型增生样品的基质中观察到(C和D)。

[0014]图3A-F表示数字图像，其将宫颈非典型增生组织样品中(A和D)着丝粒和(B和E)端粒原位杂交与Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶β-亚基水平对比。这些图表示在宫颈非典型增生的情况下，Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶β-亚基增加的水平与端粒缩短正相关(在E中用低水平染色表示)。

发明详述

缩写和术语

[0015]提供下面术语和方法的解释以更好地描述本公开内容和给本领域普通技术人员在实行本公开内容中的指导。除非上下文明确另有说明，单数形式“一”(″a，″″an，″和″the″)指一个或多个。例如，术语″包括Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶抑制剂″包括一种或多种Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶抑制剂，并且其被确定与短语″包括至少一种Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶抑制剂″相同。除非上下文明确另有说明，术语″或″指所述的可选元素的一种元素或两种或多种元素的组合。如本文使用的“包括”指“包含”。因此，“包括A或B”指“包含A、B或A和B”，而没有排除其它元素。

[0016]除非另有解释，本文使用的所有技术和科学术语与本公开内容所属领域的普通技术人员共同理解的含义相同。

[0017]HPV：人乳头状瘤病毒。

[0018]Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶：钠钾腺苷三磷酸酶(也称为钠泵)。

[0019]施用(给药)：通过任何有效途径，为了提供或给予对象制剂，例如包括Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶抑制剂的组合物。示例性的给药途径包括但不限于口服、注射(例如皮下、肌肉内、皮内、腹膜内和静脉内)、舌下、直肠、经皮、鼻内、阴道、宫颈和吸入途径。在特定实施方式中，试剂施用通过阴道或宫颈给药完成。

[0020]抗体：包括特异性结合(免疫反应)抗原的抗原结合位点的分子。包括免疫球蛋白分子和其免疫活性部分，以及类免疫球蛋白分子。免疫球蛋白基因包括kappa、lambda、alpha、gamma、delta、epsilon和mu恒定区基因，以及多种免疫球蛋白可变区基因。轻链被分为kappa或lambda。重链被分为gamma、mu、alpha、delta或epsilon，其本身又分别限定免疫球蛋白分类IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。在特定的实例中，使用Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶-特异性抗体检测细胞中Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶的表达或定位。抗体包括单克隆和多克隆抗体制品。

[0021]在一些实例中，特异性结合于靶向(例如Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶)的抗体的结合常数至少比样品中其它分子的结合常数大10³M^-1、10⁴M^-1或10⁵M^-1。在其它实例中，抗体具有用于结合于抗原决定簇(例如半抗原或表位)的Kd值，其为10^-6M或更低的级，例如10^-9M或更低的级，甚至10^-12M或更低的级。例如，可以通过竞争性ELISA(酶联免疫吸附测定)或使用表面细胞质基因组共振仪(例如，BiacoreT100，其可从Biacore，Inc.，Piscataway，NJ获得)确定Kd值。

[0022]抗体片段包括蛋白水解抗体片段[例如F(ab′)2片段、Fab′片段、Fab′-SH片段和Fab片段]，重组抗体片段(例如sFv片段、dsFv片段、双特异性sFv片段、双特异性dsFv片段、双体和三体)、camelid抗体(参见，例如美国专利第6,015,695、6,005,079、5,874,541、5,840,526、5,800,988和5,759,808号)和由软骨和多骨鱼制造的抗体以及其分离的结构域(参见，例如，国际专利申请第WO03014161号)。

[0023]强心苷：Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶抑制剂，其被传统用于治疗充血性心力衰竭和心律失常。这种苷类被发现在数种植物和一些动物中作为次级代谢产物。例如，强心苷可从毒毛旋花子(例如毒毛旋花子苷g/k/e-毒毛旋花子苷)、毛花洋地黄和紫花洋地黄(地高辛、洋地黄毒苷)、海葱(proscillaridine A)、春福寿草、福寿草、长圆叶尖药木(Acokanthera oblongifolia)、铃兰属(Convallaria)和蛙(例如蟾蜍灵、海蟾蜍毒素和蟾蜍二烯羟内酯)获得。其它非限制性的实例在美国专利公开20060205679中提供。

[0024]宫颈癌：宫颈的恶性赘生物，其已经经历特征性的间变(损失了分化)，增加了生长率、周围组织侵入，并且能转移。有两种主要类型的宫颈癌：扁平细胞(表皮状的)宫颈癌和腺癌宫颈癌。在特定的实例中，用人乳头状瘤病毒(HPV)感染引起宫颈癌。宫颈癌可以根据癌细胞播散程度进行分类，I期是最轻的，IV期是最严重的(例如转移的)。

[0025]宫颈非典型增生(宫颈上皮内瘤(CIN))：在宫颈存在异常细胞(细胞没有成熟)。发育异常被认为是癌前期的。在表面发现的异常细胞越多，发育异常越严重。宫颈非典型增生通常根据异常细胞渗透入组织衬(tissue lining)(上皮细胞)的程度分类：CIN I描述涉及上皮细胞底部三分之一；CIN II涉及上皮细胞底部三分之二；CIN III涉及上皮细胞三分之二以上。当全部宫颈上皮细胞(该组织与宫颈成线状排列)被原始细胞覆盖时，这被称为宫颈原位癌。

[0026]宫颈样品：从宫颈获得的生物样品，其可包括宫颈外边(外宫颈或portio)两侧的细胞和宫颈内部(子宫颈内膜)细胞。可被用来获得宫颈样品的示例性方法包括PAP涂片、阴道镜检查和锥形活组织检查。

[0027]宫颈：子宫的下端部分，其通向阴道。

[0028]化学疗法：在癌症治疗中，例如宫颈癌治疗中，化学疗法指施用一种或多种制剂以杀死或减缓快速生殖的细胞例如肿瘤细胞或癌细胞生殖。在特定的实例中，化学疗法指施用一种或多种抗肿瘤药以明显减少对象中的肿瘤细胞的数量，例如减少至少10％、至少20％或至少50％。细胞毒素的抗肿瘤化学治疗剂包括但不限于：5-氟尿嘧啶(5-FU)、硫唑嘌呤、环磷酰胺、抗代谢物(例如氟达拉滨)和其它抗瘤药例如依托泊甙、阿霉素、甲氨嘌呤、长春新碱、卡铂、顺铂和紫杉烷类(例如紫杉酚)。在特定的实例中，顺铂(例如Platinol

)和氟尿嘧啶(例如Adrucil

、Efudex

)被组合应用，另外放射治疗侵入性宫颈癌。

[0029]减少(下降)：一些事物质量、数量或强度上的减少。

[0030]在一个实例中，例如与没有治疗的反应相比，治疗(例如用Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶抑制剂治疗)减少宫颈非典型增生或宫颈癌(例如宫颈非典型增生或宫颈癌的大小、异常发育或肿瘤的数量、肿瘤的转移或它们的组合)，或与宫颈非典型增生或宫颈癌相关的一种或多种症状。在特定的实例中，治疗减少宫颈非典型增生或宫颈癌的大小、宫颈非典型增生或宫颈癌的数量、宫颈癌的转移或它们的组合，治疗后，例如减少至少10％、至少20％、至少50％或甚至至少90％。使用本文公开的方法，可测量这些减少。

[0031]检测：确定试剂是否存在或没有存在。在一些实例中，这可进一步包括量化。例如，对Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶特异性的抗体可被用来检测在宫颈样品中Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶(例如α-或β-亚基)存在或没有存在，例如通过检测有抗体相连的标记。

[0032]诊断：例如从一个或多个诊断过程的结果，识别医疗条件或疾病的过程。在特定的实例中，包括确定对象的预后。在特定的实例中，通过检测在宫颈样品中Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶表达，诊断宫颈癌或宫颈非典型增生，其中Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶β-亚基表达增加、α-与β-亚基表达比值减少或它们的组合表明宫颈非典型增生或宫颈癌。例如，可包括确定存在的宫颈非典型增生或宫颈癌的具体阶段。

[0033]洋地黄：在洋地黄植物中存在强心苷，其明显减少Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶的生物活性，因此是Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶抑制剂。洋地黄化合物的实例包括地高辛、洋地黄毒甙、毒毛旋花子苷k和毒毛旋花子甙g。

[0034]表达：基因编码的信息被转化入细胞操作、未操作或结构部分的过程，例如蛋白质合成。

[0035]相对于正常(野生型)核酸分子，可以改变核酸分子的表达。改变基因表达，例如不同差异表达，包括但不限于：(1)过表达；(2)表达不足；或(3)表达抑制。核酸分子表达的改变可与相应蛋白质表达变化相关，并且是其实际上原因。

[0036]也可以以一些与正常(野生型)情况中蛋白表达不相同的方式改变蛋白表达。这包括但不必限于：(1)在蛋白中的突变，所以一个或多个氨基酸残基是不同的；(2)对蛋白质序列的一个或几个(例如不超过10-20)氨基酸残基的短缺失或加成；(3)氨基酸残基的较长缺失或加成(例如至少20个残基)，所以整个蛋白质结构域或亚结构域被除去或加成；(4)相对于对照或标准量，蛋白质表达的量增加；(5)相对于对照或标准量，蛋白质表达的量减少；(6)蛋白质亚细胞定位或靶向的改变；(7)蛋白质短暂调控表达的改变(所以当其正常不表达时，蛋白质表达，或者当其正常表达时，蛋白质不表达)；(8)通过增加蛋白质在细胞中保持集中的时间寿命，改变蛋白质的稳定性；和(9)每一个与对照或标准相对比，改变蛋白质集中(例如器官或组织特异性或亚细胞定位)表达(所以当其正常表达时，蛋白质不表达，或者当其正常不表达时，蛋白质表达)。

[0037]用于与样品对比以确定差异表达的对照或标准，尽管可以任意设定，但是包括被确定为正常的样品(所以对于预期特性它们没有被改变，例如从没有患有宫颈非典型增生或宫颈癌的对象获得的样品)以及实验室值，记住这些值在不同的实验室可具有差异。

[0038]可以基于已知的或确定的人口数值设定实验室标准和值，并且可以以图或表的形式提供实验室标准和值，其允许对比测量的、实验确定的值。

[0039]增加：使一些事物的质量、数量或强度变大，或者一些事物的质量、数量或强度变大。例如，在宫颈非典型增生或宫颈癌细胞中，Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶β-亚基蛋白或核酸分子的表达，当所检测的宫颈样品中检测到的β-亚基水平为相对于正常样品的至少2倍，例如至少3倍、至少4倍或至少10倍时，可以说表达“增加”。

[0040]标记：例如通过ELISA、分光光度法、流式细胞仪(flowcyotometry)或显微镜能检测的制剂。例如，可连接到蛋白质或核酸分子的标记，例如Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶亚基，从而允许检测蛋白质或核酸分子。标记的实例包括但不限于：放射性同位素、酶底物、辅助因子、配体、化学发光剂、荧光基团、半抗原、酶和它们的组合。研究用于标记和指导选择对于各种目的适当的标记的方法，例如在Sambrook et al，(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor，New York，1989)和Ausubel et al，(In Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons，New York，1998)中。

[0041]Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶(钠、钾-腺苷三磷酸酶)：在本领域也成为钠泵。Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶在哺乳动物细胞中是普遍的膜转运酶(EC 3.6.3.9)，其负责在细胞质中产生和维持正常静息膜电位和各种细胞活性所需要的高浓度K⁺、低浓度Na⁺。在膜中，Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶包括两个α和两个β-亚基。有至少四种不同亚型的α-(α1、α2、α3和α4)亚基和β-(β1、β2、β3和β4)亚基。

[0042]Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶抑制剂：能明显减少Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶生物活性的制剂。这类制剂能在核酸水平(例如通过减少Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶例如siRNA分子的表达)或在蛋白质水平(例如通过减少蛋白质活性)发挥作用。抑制剂可以但不必须减少100％的Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶生物活性或表达。例如，当抑制剂减少至少20％、至少50％、至少75％或至少90％的Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶生物活性或表达时，可观察到治疗效果。可在蛋白质水平发挥作用的示例性Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶抑制剂是本领域已知的，并且可包括强心苷。

[0043]瘤(赘生物)：异常细胞增殖，其包括良性和恶性肿瘤，以及其它增殖性疾病。在特定的实例中，宫颈瘤(赘生物)包括宫颈非典型增生和宫颈癌。

[0044]药剂或药物：当单独施用或与其它治疗剂(一种或多种)或药学上可接受的载体组合施用给对象时，能诱导期望治疗效果的化学化合物或组合物。在特定的实例中，药剂(例如能诱导Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶抑制剂的药剂)治疗宫颈非典型增生或宫颈癌，例如通过减小发育异常或癌症的大小(例如体积或减小发育异常或癌症的数量)、减少癌症的转移或它们的组合。

[0045]药学上可接受的载体：在本公开内容中可用的药学上可接受的载体(载体)是常规的。E.W.Martin的Remington′s PharmaceuticalSciences，Mack Publishing Co.，Easton，PA，15th Edition(1975)，描述适合一种或多种治疗剂例如Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶抑制剂药物输运的组合物和剂型。

[0046]一般而言，载体的性能取决于被使用的给药的具体模式。例如，羟嗪剂型可包括可注射的液体，其包括药学和生理可接受的液体例如水、生理盐水、平衡盐溶液、含水右旋醣、甘油等作为载体。除了生物学上中性载体，待被施用的药物组合物可包括少量无毒性辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如乙酸钠或单月桂酸脱水山梨醇酯、乳酸钠、氯化钾、氯化钙和三乙醇胺油酸酯。示例性局部载体包括但不限于适合于宫颈或阴道给药的那些载体。

[0047]参考值：表示特定条件的数或数的范围。实验值可与参考值比较，例如来进行诊断或预后。例如，参考值可以是对于特定宫颈条件(例如正常宫颈细胞、宫颈非典型增生(例如发育异常的特定阶段)或宫颈癌(例如癌症的特定阶段))预期的Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶表达(例如α-或β-亚基)的相对或绝对数量(或范围)。

[0048]样品：生物样品例如含有生物分子如核酸分子、蛋白质或两者的样品。示例性的样品是含有对象细胞或细胞溶胞产物的那些样品，例如存在于外周血(或其部分例如血清)、尿、唾液、组织生检(tissuebiopsy)、颊拭子(cheek swabs)、手术样品、细针抽吸物(fine needleaspirates)、宫颈样品和尸检材料。在特定的实例中，从宫颈得到样品(例如PAP涂片)，其可包括宫颈外边(外宫颈或portio)两侧的细胞和宫颈内部(子宫颈内膜)细胞。

[0049]对象：活的多细胞脊椎动物有机体，其类别包括人和非人的哺乳动物(例如实验室对象或兽医对象)。

[0050]治疗有效量：一定量的制剂，其单独或与药学上可接受的载体或一种或多种另外的治疗剂一起诱导期望的应答。以治疗有效量施用治疗剂例如Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶抑制剂，其刺激期望的应答，例如治疗宫颈非典型增生或宫颈癌。

[0051]治疗剂的有效量可在许多不同方式中确定，例如分析以提高具有宫颈非典型增生或宫颈癌的对象的生理条件。有效量也可通过各种体外、体内或原位分析来确定。

[0052]在治疗过程期间，可以以单次剂量或多次剂量施用治疗剂，例如一周一次、一月一次或两月一次。然而，有效量可取决于运用的源、被治疗的对象、被治疗的疾病的严重性和类型以及给药方式。

[0053]在一个实例中，其为足够部分或完全缓解对象中宫颈非典型增生或宫颈癌症状的量。治疗可包括仅暂时减缓宫颈非典型增生或宫颈癌的进展，也可包括永久停止或反转宫颈非典型增生或宫颈癌的进展。例如，与不存在药物制品的量相对比，药物制品可减少宫颈非典型增生或宫颈癌的一种或多种症状(例如发育异常或癌症的大小或肿瘤的数量)，例如减少至少20％、至少50％、至少70％、至少90％、至少98％或甚至至少100％的症状。

[0054]治疗疾病：″治疗″指治疗性干涉，其缓解疾病或生理条件的迹象或症状，例如宫颈非典型增生或宫颈癌的迹象或症状。治疗也可诱导疾病例如宫颈非典型增生或宫颈癌的减轻或治愈。在特定的实例中，治疗包括防止疾病，例如通过抑制疾病的完全发生，例如防止从宫颈非典型增生生成宫颈癌或防止宫颈癌转移。疾病的防止不需要完全不存在发育异常或癌症。例如，减少至少50％可能是足够的。

[0055]在充分(足够)的条件下：用来描述允许期望活性的任何环境的短语。

[0056]在一个实例中，包括在允许抗体特异性结合到样品中的Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶蛋白的条件下，将Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶抗体与宫颈样品一起培育。在另一个实例中，包括将一种或多种Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶抑制剂与对象中宫颈非典型增生或宫颈癌细胞接触，以足够许允期望的活性。在特定的实例中，期望的活性减少这类细胞的生长或增殖，或者减少这类细胞侵入宫颈，或者减少这类细胞转移到其它器官。

[0057]剂量单位：含有预定量的活性物质(例如Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶)的物理分离的单位，其被计算各个或共同产生期望影响，例如治疗效果。单一剂量单位或多剂量单位可被用来提供期望影响，例如治疗效果。

综述

[0058]Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶具有两个主要的功能：保持细胞功能Na⁺/K⁺泵和信号转导。本文示出在正常和发育异常和癌宫颈组织之间的Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶α-和β1-亚基表达模式不同。例如，在宫颈非典型增生和宫颈癌组织中，观察到Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶β1-亚基表达的增加。此外，Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶α-和β1-亚基的比值在正常和Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶α-和β1-亚基之间是不同的。相对于正常宫颈样品，在宫颈非典型增生和宫颈癌中，Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶α-亚基与β1-亚基的相对比值减少。

[0059]在对Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶α-和β1-亚基阳性的基质组织中子宫颈内粘液腺主要位于HV-诱导的损伤下。在子宫颈内上皮细胞中，胰岛素样生长因子I(IGF-I)刺激子宫颈内上皮细胞中Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶活性(Deachapunya et al.，J Gen.Physiol.114：561-72，1999)。本发明观察基质的IGF-I子宫颈内粘液腺中的免疫反应性和上皮细胞层中的免疫反应性。本发明也观察到宫颈上皮细胞和癌细胞中胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP-3)蛋白聚集位点和Na⁺/K⁺-腺苷三磷酸酶β1表达位点。这表明在宫颈组织的上皮细胞层和基质之间的旁分泌调控机制。

[0060]不希望被特定原理所束缚，提议由于HPV感染在上皮层或宫颈中过表达的IGFBP-3增强IGF-I受体敏感性。从粘液腺分泌的IGF-I与在上皮层的IGF-I受体结合，并且IGF-I与受体结合引起信号转导，其包括Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶和KCC表达的增加，以及HPV-感染细胞的表型形成(癌形成和发展)。

[0061]基于这些观察，提供在临床组织切片中检测宫颈非典型增生或宫颈癌的方法。此外，提供治疗宫颈非典型增生和宫颈癌的方法。例如，可将Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶抑制剂(例如洋地黄化合物，例如毒毛旋花子甙g或洋地黄毒甙)运用到宫颈(例如外用药膏的形式)以治疗宫颈非典型增生和宫颈癌。这类抑制剂可明显减少Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶表达或生物活性。在一些实例中，靶向Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶β1亚基。

检测宫颈非典型增生和宫颈癌的方法

[0062]本公开内容提供可被用来检测宫颈瘤例如宫颈非典型增生或宫颈癌的方法。检测可包括确定宫颈非典型增生或宫颈癌是否存在，评定宫颈非典型增生或宫颈癌等级(例如确定其是否是CIN I、CIN II或CIN III宫颈非典型增生，或0期、I期(例如IA、IA1、IA2、IB1、IB2期)、II期(例如IIA或IIB)、III期(例如IIIA或IIIB)或IV期(例如IVA或IVB)或宫颈癌)，确定发现具有宫颈非典型增生或宫颈癌的对象的预后，或它们的组合。

[0063]在特定的实例中，该方法包括检测从对象获得的宫颈样品中的Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶或其亚基(例如α-亚基、β-亚基或两者)，例如检测Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶蛋白表达或核酸分子表达。例如，可以检测β-亚基(例如β1-亚基)、α-亚基或两者的表达。在特定的实例中，量化表达水平。检测蛋白质或核酸分子表达的方法是公知的。

[0064]在特定的实例中，相对于在正常宫颈组织(非癌性的、非发育异常的)中的Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶表达水平，存在明显增加的Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶(例如β-亚基，例如β1-亚基)表达例如至少2倍，表明从对象获得的宫颈样品中存在宫颈非典型增生或宫颈癌。在特定的实例中，相对于在正常组织中的Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶β1-亚基表达，检测到Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶β1-亚基表达至少2倍的增加(例如至少3-倍、至少4-倍或2-到10-倍)表明从对象获得的宫颈样品中存在宫颈非典型增生或宫颈癌。在表1中，提供示例性的变化。

表1Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶表达的是示例性相对值

组织	相对β1-亚基表达	相对α亚基对β1-亚基的表达
			正常宫颈组织	0	1
宫颈非典型增生	至少2(例如2-4)	0.75或更少(例如0.75-0.6)
			宫颈癌	至少5(例如5-10)	0.5或更少(例如0.5-0.01)

[0065]检测的Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶表达可与代表特定疾病或无疾病状态(例如正常宫颈组织、宫颈非典型增生或宫颈癌，或宫颈非典型增生或宫颈癌的特定阶段)的参考值或参考样品相比较。例如，在样品中检测的Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶表达水平可与在一种或多种参考宫颈组织样品的Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶表达水平相比较或与在对照组织样品中代表期望的Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶表达的参考值相比较。示例性的参考样品和参考值包括代表已知宫颈非典型增生或宫颈癌存在、不存在或等级的那些参考样品和参考值。例如，如果检测的Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶表达(例如β亚基表达例如β1亚基)水平与在特定参考样品和参考值的Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶表达(例如β亚基表达例如β1亚基)水平基本相似，那么这表明对象具有参考样品或参考值代表的宫颈非典型增生或宫颈癌存在、不存在或等级。在特定的实例中，如果参考值或参考样品是正常的(非发育异常、非癌性的)宫颈细胞，那么相对于参考值的至少2倍(例如至少3倍)的检测的Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶表达增加表明从对象获得的宫颈样品中存在宫颈非典型增生或宫颈癌。

[0066]在特定的实例中，实施检测β-亚基(例如β1-亚基)。如果在检测宫颈样品中检测的β-亚基水平与在特定参考样品和参考值的β-亚基表达水平基本相似，那么这表明对象具有参考样品或参考值代表的宫颈非典型增生或宫颈癌存在、不存在或等级。例如，如果检测的β-亚基表达的相对值是50，而对于正常宫颈组织β-亚基表达的参考值是10，对于宫颈非典型增生β-亚基表达的参考值是40，对于宫颈癌β-亚基表达的参考值是100，那么可以推断对象具有宫颈非典型增生。可使用相似的方法，使用任何Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶亚基和适当的参考值或参考样品，确定对象是否具有正常、发育异常、癌性宫颈细胞。

[0067]在特定的实例中，参考值或参考样品是正常的宫颈细胞(非发育异常、非癌性的)，检测Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶β1-亚基表达，其中相对于参考值的至少2倍(例如至少3倍)的β1-亚基表达增加表明从对象获得的宫颈样品中存在宫颈非典型增生或宫颈癌。

[0068]本公开的方法可包括在宫颈组织样品中检测α-亚基和β-亚基Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶表达。例如，该方法可包括确定α-与β-亚基表达的比值，其中相对于正常的宫颈组织(非发育异常、非癌性的)中α-对β-亚基表达水平至少20％的减少表明从对象获得的宫颈样品中存在宫颈非典型增生或宫颈癌。在特定的实例中，相对于正常的宫颈组织中α-与β-亚基比值至少20％、至少40％、至少50％或至少75％减少的检测表明从对象获得的宫颈样品中存在宫颈非典型增生或宫颈癌。

[0069]在一些实例中，将确定的比值与一种或多种参考值或参考样品中观察到的α-和β-亚基表达的比值相比较，所述参考值或参考样品具有已知的宫颈非典型增生或宫颈癌存在、不存在或等级。例如，如果检测的α-和β-亚基表达的比值与在特定参考样品或参考值中的α-和β-亚基表达的比值基本上相似，那么这表明对象具有参考样品或参考值代表的宫颈非典型增生或宫颈癌存在、不存在或等级。在特定的实例中，如果参考值或参考样品是正常的(非发育异常、非癌性的)宫颈细胞，那么相对于参考值的检测的α-和β-亚基表达的比值的减少(例如至少20％或至少50％的减少)表明从对象获得的宫颈样品中存在宫颈非典型增生或宫颈癌。

[0070]检测宫颈非典型增生或宫颈癌的方法也可包括确定Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶(例如α-或β-亚基)在宫颈样品中的定位模式。α-或β-亚基或它们两者在宫颈组织样品中的定位可以与一种或多种参考值或参考样品相比较，所述参考值或参考样品具有已知的宫颈非典型增生或宫颈癌存在、不存在或等级。例如，如果检测的Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶的定位与在特定参考样品或参考值中的Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶的定位基本上相似，那么这表明对象具有参考样品或参考值代表的宫颈非典型增生或宫颈癌存在、不存在或等级。在特定的实例中，如果参考值或参考样品是正常的(非发育异常、非癌性的)宫颈细胞，那么相对于参考值的检测的Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶的定位(例如相对于基础定位在细胞膜定位的增加)表明从对象获得的宫颈样品中存在宫颈非典型增生或宫颈癌。

[0071]DNA复制状况是细胞生长速率的指示，特别是在致癌作用中。在宫颈组织中Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶表达可表明细胞生理状况，但是不表明细胞周期状况。因此，在一些实例中，方法进一步包括检测细胞周期标记，例如组蛋白H3(例如使用组蛋白H3-特异性抗体)。可使用这样的检测提供关于诊断含有宫颈非典型增生或宫颈癌对象的能力的额外信息。例如，相对于正常宫颈细胞的细胞周期标记增加的检测表明存在增加的细胞分裂，例如其发生在宫颈非典型增生或宫颈癌中。在一些实例中，相对于正常宫颈组织可检测的至少2倍组蛋白H3或其它细胞周期标记(例如至少5-倍或至少20-倍)，与一种或多种β-亚基(例如β1)表达的增加、α-与β-亚基表达比值的减少、细胞膜染色的增加或它们的组合结合，表明对象具有宫颈非典型增生或宫颈癌。

检测Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶蛋白表达

[0072]检测样品中蛋白质的方法在本领域是公知的。例如，可以使用免疫测定法和免疫细胞学方法。然而，本公开内容不限定于特定的检测方法。对于Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶特异性的抗体(例如对α-或β-亚基特异性的抗体，例如其特定的同种型)的可用性，促进检测和量化Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶蛋白。示例性商业可获得的抗体在表2中示出。示例性的免疫测定法在Harlow和Lane(Antibodies，A LaboratoryManual，CSHL，New York，1988)、Bancroft和Stevens(Theory andPractice of Histological Techniques，Churchill Livingstone，1982)以及Ausubel等(Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York，1998)中提出。

表2示例性Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶-特异性抗体

α亚基(制造商，目录编号)	β亚基(制造商，目录编
		α1：Abcam，ab2867；Santa CruzBiotechnology，Inc.，sc-16041：GeneTex，Inc.，GTX22872	β1：Abcam，ab8344；Santa CruzBiotechnology，Inc.，sc-21713 and sc-25709；GeneTex，Inc.，GTX30203 and GTX22873
α2：Santa Cruz Biotechnology，Inc.，sc-16049；Chemicon，AB9094	β2：Upstate(Temecula，CA)，06-171 and BDBiosciences Pharmingen(San Diego，CA)，610915
		α3：Santa Cruz Biotechnology，Inc.，sc-16052 and Upstate 06-172	β3：BD Bioscicnces Pharmingen，610992
	β：Abcam，ab35645；Chemicon，CBL223

[0073]一般而言，该方法包括在足够使抗体与样品中Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶蛋白特异性结合的条件下，将从对象获得的生物样品(例如含有从样品分离的宫颈细胞或蛋白质的样品)与Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶-特异性抗体接触，从而形成Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶-抗体复合体。然后，使用任何标准的检测系统检测所形成的Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶-抗体复合体。例如，Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶-抗体可包含标记，从而允许检测复合体。在一些实例中，将Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶-抗体复合体与适当标记的第二抗体在足够使第二抗体与Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶-抗体复合体特异性结合的条件下接触，从而形成被标记的Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶-抗体复合体。然后，可检测该与第二标记相连的标记。可以使用相似的方法检测Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶在从对象获得的宫颈细胞中的定位模式。

[0074]标记抗体以便其可被检测的方法是公知的。示例性的标记包括荧光基团，例如Cy3、FITC、BODIPY和Cy5。检测标记的方法是已知的，包括使用显微镜和流式细胞术检测。

[0075]在一些实例中，生物样品包括从宫颈样品分离的宫颈蛋白。在这些实例中，可使用任何标准免疫测定法形式(例如ELISA、蛋白质印迹或RIA分析)测量Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶蛋白水平。

[0076]此外，可使用抗体探针阵列、定量光谱方法(例如质谱法，例如基于表面增强的激光去吸附/离子化(desorption/ionization)(SELDI)质谱法)或它们的组合检测并量化Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶蛋白。

检测Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶核酸表达

[0077]检测样品中靶核酸分子(例如RNA或DNA，例如mRNA或cDNA)的方法在本领域是公知的。例如，可以使用核酸扩增方法(用适当探针和引物)以及核酸阵列(含有适当探针)。例如，使用本领域公知的方法检测或甚至量化Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶基因表达的水平，所述方法例如RNA印迹、RNA酶保护分析、核酸阵列、定量PCR(例如TaqMan分析)、点印迹法、原位杂交或它们的组合。

[0078]在一个实例中，该方法包括在足够使探针与样品中Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶核酸分子(例如mRNA分子)特异性结合的条件下，将从对象获得的生物样品(例如含有从样品分离的宫颈细胞或核酸的样品)的核酸分子(其可被分离)与Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶-核酸探针(例如α-或β-亚基特异性探针)接触，从而形成Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶-核酸分子复合体。然后，使用任何标准的检测系统例如通过检测探针上的标记检测所形成的复合体。

[0079]在另一个实例中，该方把包括将从对象获得的生物样品(例如含有从样品分离的宫颈细胞或核酸的样品)的核酸分子(其可被分离)与允许Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶(例如α-或β-亚基)扩增的引物接触。例如通过检测扩增子上的标记，可检测所形成的扩增子。在特定的实例中，在适当形成杂交复合体的条件下，将扩增子运用到核酸分子检测阵列，所述检测阵列含有Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶特异性核酸探针，该探针可与扩增子特异性杂交。选择杂交条件以允许区分配对的和错配的寡核苷酸。选择杂交的条件以符合已知杂交到过滤器的标准过程中适合的那些条件，然后用阵列对其优化以应用。例如，调节适合杂交一种类型靶(例如Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶的亚基)的条件以用于阵列的其它靶(例如对照序列)。特别地，控制温度以基本上除去序列间形成的不是精确互补的Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶序列的双链体。可使用多种已知的杂交溶剂，该选择依赖于本领域普通技术人员已知的考虑(参见美国专利5,981,185)。在寡核苷酸探针中检测杂交的复合体先前已被描述(参见美国专利第5,985,567号)。在一个实例中，检测包括检测存在于从对象获得的寡核苷酸、序列或两者上的一种或多种标记。检测可进一步包括用结合溶液(conjugating solution)处理杂交复合体，以完成杂交复合体与检测标记的结合或偶联，并且用检测试剂处理结合的、杂交复合体。在特定的实例中，该方法进一步包括例如通过确定杂交的量而进行量化。

[0080]用于标记核酸分子以便其能被检测的方法是公知的。这些标记的实例包括非放射标记的和放射标记的。非放射标记包括但不限于酶、化学发光、荧光基团、金属络合物、半抗原、比色剂、染料或它们的组合。放射标记包括但不限于¹²⁵I和³⁵S。放射性和荧光标记方法以及本领域已知的其它方法，适合用于本公开内容。在一个实例中，标记用来扩增对象核酸的引物(例如用生物素、放射标记或荧光基团)。在另一个实例中，扩增的核酸样品被末端标记以形成标记的扩增材料。例如，通过在扩增反应中包含标记的核苷酸，可标记扩增的核酸分子。在另一个实例中，标记从对象获得的核酸分子，并且将其运用到含有寡核苷酸的阵列。

参考值和参考样品

[0081]在一些实例中，检测的Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶(例如α-或β-亚基蛋白或核酸)可与参考值(例如值的数量或范围)或参考样品(例如实际的生物样品)相比较。与代表正常宫颈组织或特定疾病状态例如宫颈非典型增生或宫颈癌(或它们的特定阶段)期望的Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶表达的参考样品或参考值相比较，可被用来确定从其获得样品的对象是否具有宫颈非典型增生或宫颈癌。

[0082]在一个实例中，参考值或样品表明相对或实际量的正常(非发育异常、非癌性)宫颈组织期望或常规观察到的Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶α-或β-亚基(或两者)表达。在另一个实例中，参考值或参考样品表明相对或实际量的宫颈非典型增生或其特定等级(例如CIN I、CIN II或CIN III)期望或常规观察到的Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶α-或β-亚基(或两者)表达。在另一个实例中，参考值或参考样品表明相对或实际量的宫颈癌或其特定等级(例如0期、I期、II期、III期或IV期或其亚期(substage)例如IIA期)期望或常规观察到的Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶α-或β-亚基(或两者)表达。在一些实例中，使用一个或多个这类的参考值或参考样品，例如至少2、至少5、至少10个这类的参考值或参考样品，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个这类的参考值或参考样品。

[0083]在一些实例中，参考样品或参考值表明正常宫颈组织或特定疾病状态例如宫颈非典型增生或宫颈癌(或其特定阶段)期望的Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶定位模式。在一个实例中，参考值或样品表明相对或实际的正常(非发育异常、非癌性)宫颈组织期望或常规观察到的Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶α-或β-亚基(或两者)定位模式。在另一个实例中，参考值或参考样品表明相对或实际的宫颈非典型增生或其特定等级(例如CIN I、CIN II或CIN III)期望或常规观察到的Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶α-或β-亚基(或两者)定位模式。在另一个实例中，参考值或参考样品表明相对或实际的宫颈癌或其特定等级(例如0期、I期、II期、III期或IV期或其亚期(substage)例如IIA期)期望或常规观察到的Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶α-或β-亚基(或两者)定位模式。在一些实例中，使用一个或多个这类的参考值或参考样品，例如至少2、至少5、至少10个这类的参考值或参考样品，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个这类的参考值或参考样品。

[0084]在一些实例中，使用表明Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶表达的参考值或参考样品和表明Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶定位模式的参考值或参考样品。

治疗宫颈非典型增生和宫颈癌

[0085]提供识别在发育期常宫颈组织和宫颈癌肿观察到的Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶β-亚基水平增加、治疗宫颈非典型增生和宫颈癌的药剂和方法。在一些实例中，首先例如使用本文提供的方法，筛选对象以确定是否其具有宫颈非典型增生或宫颈癌。例如使用本文提供的治疗方法，选择具有宫颈非典型增生或宫颈癌的对象进行治疗。

[0086]例如，可以选择识别为相对于对宫颈非典型增生或宫颈癌阴性的宫颈样品的Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶表达的参考值，在其宫颈样品中至少2倍的Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶表达的增加的对象进行治疗。示例性的治疗包括将一种或多种Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶抑制剂施用给例如患病的宫颈细胞。在一些实例中，这类对象就受手术以至少部分除去宫颈非典型增生或宫颈癌细胞(例如电套圈外科切除操作(LEEP)、锥形活组织检查或子宫切除术)、放射治疗、化学疗法、用一种或多种Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶抑制剂治疗或它们的组合。

组合物

[0087]提供治疗组合物。在特定的实例中，治疗组合物包括一种或多种Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶抑制剂(例如抑制Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶β-亚基的制剂)和药学上可接受的载体。在一些实例中，可以使用这类组合物治疗宫颈非典型增生或宫颈癌。

[0088]Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶抑制剂是明显减少Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶生物活性的制剂。尽管这类减少可以是100％减少，但是100％减少不是组合物有效必须的。例如，Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶抑制剂可以是减少至少20％、至少50％或至少90％的Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶生物活性的制剂。测量Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶生物活性的方法在本领域是已知的，并且本公开内容不限于特定方法。在一个实例中，该方法包括测量⁸⁶Rb⁺的摄取作为Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶离子转运活性的指示剂。例如，将细胞与每10⁶细胞1μCi的⁸⁶Rb⁺——作为盐酸盐(Amersham Biosciences)一起培育，在30分钟后通过将细胞至于冰上并加入冰冷磷酸盐缓冲盐溶液停止反应，然后使细胞沉淀。在计数器(Cobra Quantium，Packard)中计算细胞沉淀，其中检测的⁸⁶Rb⁺的量反应Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶活性(例如检测的⁸⁶Rb⁺的量越大，表明Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶活性越大)。可使用另一个确定Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶活性的方法是使用配对酶分析(coupled-enzyme assay)(例如参见Norby，Methods Enzymol.156：1169，1988)测量微粒体中腺苷三磷酸酶活性，其中通过检测样品对Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶特异性抑制剂例如毒毛旋花子甙-g或寡毒素的敏感性和通过测量在无K⁺的介质中的腺苷三磷酸酶活性，确定Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶活性对总腺苷三磷酸酶活性的贡献。

[0089]在一个实例中，Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶抑制剂是减少Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶蛋白生物活性的制剂。例如，Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶抑制剂可以是强心苷，例如从植物或动物分离的强心苷。强心苷的实例包括毒毛旋花子甙g/k/e-毒毛旋花子苷、洋地黄、地高辛和洋地黄毒甙(从毛花洋地黄和紫花洋地黄)、海葱(proscillaridine A)(从海葱(Scillamaritime))、牡荆甙(vitexin)和芸香甙(丛山楂)，以及从春福寿草、福寿草、阿密茴、长圆叶尖药木(Acokanthera oblongifolia)和铃兰属(Convallaria)以及蛙(例如蟾蜍灵、海蟾蜍毒素和蟾蜍二烯羟内酯)获得的强心苷。从问号钩端螺旋体制备的糖脂蛋白以被表明具有Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶抑制活性。在特定的实例中，Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶抑制剂是洋地黄化合物。

[0090]在一个实例中，强心苷以治疗有效量存在于组合物中，例如减少宫颈非典型增生或宫颈癌细胞中Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶生物活性的量。例如，强心苷可以以减少宫颈非典型增生或宫颈癌细胞生长或将其杀死的量存在于该组合物中。在特定的实例中，强心苷以按组合物的重量计至少0.01mg/g的浓度存在于组合物中，例如按组合物的重量计至少0.1mg/g、至少0.25mg/g、至少0.5mg/g或至少5mg/g，例如按组合物的重量计0.01mg/g到0.5mg/g或0.01mg/g到10mg/g。

[0091]在一个实例中，Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶抑制剂是明显减少Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶表达的制剂。再体内抑制表达的方法是本领域已知的，并且可包括抑制的RNA(RNAi)分子，例如siRNA、mRNA和短发夹结构(sh)RNA分子。在特定的实例中，抑制剂明显减少Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶β-亚基的表达。基于多数种类的Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶分子的公开可用性(例如参见GenBank检索号AH002617、M30309、U16799、X03747和NM_001677)，使用本领域的常规方法可产生RNAi分子，例如长度为20-30个核苷酸的RNAi分子，例如大约27个核苷酸。在美国公开第20060172965和20060234970号中，提供示例性Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶RNAi分子。以治疗有效量将Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶RNAi分子施用到例如阴道或宫颈。在特定的实例中，治疗组合物包括按重量计0.1％到99％的RNAi。一般而言，治疗有效量的RNAi导致在靶宫颈细胞(例如赘生性细胞，例如发育异常或癌性细胞)表面的细胞外浓度至少100pM、至少1nM或至少100nm，例如100pM到100nM、1nM到50nM、5nM到10nM或100pM到25nM。

[0092]本文提供的组合物可以是软膏、乳膏、乳液、洗液、凝胶、固体、溶液、悬液、泡沫或脂质体组合物；例如适合于阴道或宫颈输运的剂型。包括Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶的组合物的pH可以是大约pH4-9，例如pH 4.5到pH 7.4。在一个实例中，治疗组合物被包含在阴道环、棉球、栓剂、海绵、垫座、泡沫或渗透泵系统中。

[0093]药学上可接受的载体包括允许输运一种或多种治疗剂例如Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶抑制剂的制剂。可以使用的药学上可接受的载体是本领域技术人员已知的；例如，参见Remington′s PharmaceuticalSciences，18th Ed.(Easton，Pa.：Mack Publishing Company，1990)。在特定的实例中，药学上可接受的载体是局部载体，例如适合在体内将组合物施用到宫颈的载体。局部载体在本领域是已知的，包括用作软膏、洗液、乳膏、药膏、气溶胶、栓剂、凝胶等基础成份的那些任何载体，例如那些适合于阴道或宫颈施用的载体。

[0094]适合本文应用的载体包括水、硅氧烷、蜡、石油凝胶、聚乙二醇(例如聚乙二醇-1000(PEG-1000))、丙二醇、脂质体、糖类(例如甘露糖和乳糖)、软膏基质；传统的眼用载体；乳膏；和凝胶。可被使用的额外的药学上可接受的载体被提供在美国专利号：6,699,494；6,306,841；5,814,338和美国公开号2005/0129736和2006/0205679。

[0095]如果需要，本公开的组合物或其部分(例如载体)可被灭菌或与辅助剂混合，所述辅助剂例如触变剂(thixotrope)、稳定剂、润湿剂等。

[0096]可通过使用传统的技术，将细分的或溶解的Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶抑制剂均匀的分散到整个载体或基质，形成本公开的药物组合物，例如通过与少量基质一起研磨制剂以形成浓缩剂，然后用更多的基质几何倍数稀释。可选地，使用机械混合器。通过俩相加热系统可形成乳膏、洗液和乳液，其中在加热下结合油相成份以提供液化的、均匀系统。例如，使用加热单独结合水相成份。然后伴随恒定搅拌将油相和水相添加到一起，并且将其冷却。在这一点，加入浓缩的制剂作为膏剂(slurry)。在乳液充分冷却后加入挥发性的或芳香族的物质。制备这类药物组合物在本领域的一般技术内。

[0097]也可使用本领域的方法，将Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶抑制剂掺入凝胶制剂。两相凝胶系统通常包括小的、离散颗粒的悬液或网络，液体渗透所述颗粒以提供分散相和液相。通过将有机大分子均匀分布到整个液体形成单一相凝胶系统，所以在分散相和液相之间没有明显的界线。适合的胶凝剂包括合成大分子(例如卡波姆、聚乙烯醇和聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物)、橡胶例如西黄芪树胶、以及藻胶钠、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、甲基羟乙基纤维素和羟乙基纤维素。为了制备均匀凝胶，可加入分散剂例如醇或甘油，或者可以通过研磨、机械混合或搅拌或它们混合的分散胶凝剂。

[0098]可使用脂质体制备含有Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶抑制剂的组合物。一般而言，脂质体制剂被用于溶解差或不溶解的药物制剂。可以使用的脂质体制品包括阳离子(带正电荷的)、阴离子(带负电荷的)和中性制品。阳离子脂质体(例如，N[1-2，3-二油醇氧基)丙基]-N，N，N-三乙铵(″DOTMA″)，其在商品名称Lipofectin(GIBCO BRJL，Grand Island，N.Y.)下可获得)和阴离子以及中性脂质体容易获得，或者使用容易获得的材料(例如磷脂酰胆碱、胆固醇磷脂酰乙醇胺(cholesterol phosphatidylethanolamine)、二油醇磷脂酰胆碱(dioleoylphosphatidylcholine)(″DOPC″)、二油醇磷脂酰甘油(dioleoylphosphatidylglycerol)(″DOPG″)和二油醇磷脂酰乙醇胺(dioleoylphoshatidylethanolamine)(″DOPE″))可容易进行制备。这些物质也可与DOTMA以适当比例混合。使用这些物质制备脂质体的方法在本领域是公知的。

方法

[0099]本公开内容也提供治疗对象中宫颈非典型增生或宫颈癌的方法。在特定的实例中，该方法包括在允许治疗宫颈非典型增生或宫颈癌的条件下，将治疗有效量的一种或多种Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶抑制剂施用给具有宫颈非典型增生或宫颈癌的对象。前面提供了示例性的治疗组合物。

[0100]例如，可以以足够明显减少宫颈细胞例如宫颈非典型增生或宫颈癌细胞内Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶活性的量施用Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶抑制剂。在一些实例中，在宫颈细胞(例如患病的发育异常或癌性细胞)中的Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶生物活性减少至少50％，例如至少95％。在一些实例中，将治疗有效量的Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶抑制剂施用到宫颈减少至少20％、至少40％、至少50％、至少80％，例如至少95％的患病宫颈细胞的数量和大小。

[0101]在一些实例中，治疗宫颈非典型增生防止或延迟了宫颈癌的发生，减少了发育异常或癌症的阶段或等级(例如CIN III到CIN II或I，或者IHA期到IIA期或I期或0期)，或者它们的组合。例如，在其发展为癌症之前，使用该方法治疗宫颈非典型增生。

[0102]在本领域，给药的方法是已知的。在一个实例中，将含有一种或多种Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶抑制剂的治疗组合物直接施用到宫颈。例如，可将宫颈上皮层与治疗有效量的Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶抑制剂(例如洋地黄化合物)接触，从而减少或反转与从发育异常到癌症或增加发育异常或癌症的进展相关的分子变化。更高的浓度和更长的接触时期可被用来达到或治疗上皮层下入侵的癌细胞，或者达到或治疗位于发育异常宫颈组织中上皮层下的内子宫颈腺。在另一个实例中，将含有一种或多种Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶抑制剂的治疗组合物阴道施用，从而使组合物达到患病的宫颈细胞。

[0103]在特定的实例中，将含有一种或多种Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶抑制剂的治疗组合物以至少0.001μg/kg对象的剂量施用给对象，例如至少0.01μg/kg、至少0.1μg/kg，诸如0.001μg/kg到1μg/kg。治疗组合物可以随时间以单一剂量单位或多计量单位运用，例如在一段时间诸如至少1个月、至少6个月或至少12个月内，一日一次、一周一次或一月一次。

实施例1

宫颈非典型增生和宫颈癌中的Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶表达

[0104]该实施例描述用来比较在正常、宫颈非典型增生和宫颈癌样品中Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶表达的方法。尽管提供特定的检测方法，但是本领域技术人员将理解可以使用其它抗体和其它免疫组织化学方法。

[0105]使用单克隆抗-Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶α亚基(克隆M7-PB-E9)和β1亚基(克隆M17-P5-F11)抗体(Sigma-Aldrich，Inc.，St.Louis，MO)，应用BenchMark XT自动组织切片染色机(Ventana MedicalSystems，Inc.，Tucson，AZ)分别检测宫颈组织样品中(即正常、低度恶性、高度恶性和癌症病例)的Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶的α和β1亚基。使用iVIEW DAB(Ventana Medical Systems，Inc.)使Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶α和β1亚基的信号可视化，并且用苏木精II和上蓝剂复染组织切片。用含有正常和癌症组织(Super Bio Chips，Korea)的组织微阵列载玻片证实Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶α和β1免疫染色。

[0106]一般而言，在组织微阵列载玻片上的组织切片表现了同一细胞集落中Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶的α和β1亚基。然而，在不同类型组织中，Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶的α和β1亚基的细胞膜染色模式是不同的。例如，肾脏切片表现基底和侧面细胞表面染色，而小肠主要表现侧面细胞表面染色。

[0107]在宫颈组织切片中，可见Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶α和β1亚基。Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶α亚基位于正常宫颈组织的宫颈上皮细胞的基底层(图1A)。接近基质组织的第一细胞层表现强细胞质染色的Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶α亚基，而向表皮层方向邻近的几个细胞层表现细胞膜染色。然而，对于Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶β1亚基在正常宫颈组织中不存在(图1B)，尽管Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶β1亚基水平可能太低而不允许免疫组织化学检测，或者不同β亚基(例如β2和/或β3)可能被表达。

[0108]所有低度恶性(图1C)和高度恶性(图1E)发育异常的临床病例的损伤表现Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶α亚基的膜染色。然而，低度恶性(图1D)和高度恶性(图1F)发育异常的临床样品也表明Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶β1亚基在膜中表达。

[0109]八个癌病例中的全部八个对Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶α(图1G)和β1(图1H)亚基阳性。然而，在癌细胞集落中Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶α和β1亚基的表达水平的比例是不同的(与发育异常地和正常组织相比)。因此，Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶α和β1亚基的表达在宫颈上皮层和癌中可能被不同机制调控。同样，在发育异常组织样品(图2C和2D)的基质组织中的损伤下观察到子宫颈内粘液腺，但是在正常组织中很少见(图2A和2B)，并且腺体也表现增加Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶α和β1亚基的水平，特别是在腺体周围(图2C和2D)。

实施例2

宫颈非典型增生中的端粒和着丝粒模式

[0110]该实施例描述用来在宫颈非典型增生样品中使染色体DNA可视化并且比较Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶表达的方法。尽管提供特定的检测方法，但是本领域技术人员将理解可以使用其它抗体和其它免疫组织化学方法。

[0111]端粒和着丝粒(其作为DNA阳性对照)特异性寡探针被用于原位杂交以使宫颈组织样品中的染色体DNA序列可视化。在BenchMark XT仪器上，通过修改建立的HPV原位杂交方案使端粒和着丝粒原位杂交的应用最优化。用iVIEW Blue Plus检测和用红复染剂(Red Counterstain)II复染端粒和着丝粒染色体DNA的信号。按照实施例1的描述检测Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶β-亚基。

[0112]如在图3A-F中所示，发育异常宫颈组织样品具有不同水平端粒缩短，并且随着端粒缩短发生，在样品中表达有相应的Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶β-亚基水平增加。图3A和3D是表明在样品中存在的染色体DNA的阳性对照，图3B和3E表明两种发育异常病例中不同水平的端粒DNA(信号越少表明端粒区越短)，图3C和3F表明相应的Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶β-亚基表达水平。

实施例3

治疗宫颈非典型增生或宫颈癌的局部药物和方法

[0113]该实施例描述包括Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶抑制剂的组合物，以及使用该组合物治疗宫颈非典型增生或宫颈癌的方法。尽管提供特定示例性的Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶抑制剂和给药方法，但是本公开内容不限于这类制剂和方法。

[0114]如在上述实施例中描述的，在非典型增生宫颈组织和宫颈癌中观察到Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶β-亚基表达增加。基于这些观察，提供治疗宫颈非典型增生和宫颈癌的治疗组合物和方法。

[0115]治疗组合物包括一种或多种Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶抑制剂，例如抑制Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶β-亚基(例如β1-亚基)表达活性的制剂。在特定的实例中，Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶抑制剂包括洋地黄化合物和药学上可接受的局部载体。在特定的实例中，洋地黄化合物是地高辛、洋地黄毒甙或它们的组合，例如洋地黄为按组合物的重量计0.01mg/g，例如按组合物的重量计至少0.1mg/g、至少0.25mg/g、至少0.5mg/g或至少5mg/g，例如按组合物的重量计0.01mg/g到0.5mg/g或0.01mg/g到10mg/g。

[0116]在特定实施方式中，可在宫颈非典型增生发展为癌症之前，特异性使用药剂和方法进行治疗宫颈非典型增生。通过接触上皮层(其中β-亚基表达水平首先增加)与洋地黄化合物，与从非典型增生进展到癌症相关的分子变化可别停止或反转。更高浓度和更长时期的接触对于达到或治疗上皮层下的侵入性癌细胞或位于非典型增生宫颈组织的上皮层下的内子宫颈腺是有用的。

[0117]洋地黄化合物可被加入到任何药学上可接受的局部载体以制备药剂。局部载体可以是公知用于药物、化妆品和医学领域的任何那些载体，其为软膏、洗液、乳膏、药膏、气溶胶、栓剂、凝胶等基础成份。如果需要，这些载体可被灭菌并和辅助剂混合，所述辅助剂例如触变剂、稳定剂、润湿剂等。非可喷雾局部制品的载体的实例包括软膏基质，例如聚乙二醇-1000(PEG-1000)；传统的眼用载体；乳膏；和凝胶，以及石油凝胶等。

[0118]考虑到许多可能的运用本公开内容原理的实施方式，应该认识到阐述的实施例仅仅作为本公开内容的实例，而不应该被理解为限制本发明的范围。更确切的下面的权利要求限定本发明的范围。因此我们要求属于这些权利要求的范围和精神的所有发明。

Claims (33)

1.用于在对象中检测宫颈非典型增生或宫颈癌的方法，包括：

在从所述对象获得的宫颈样品中检测Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶的表达，其中，相对于宫颈非典型增生或宫颈癌阴性的宫颈样品的Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶表达的参考值至少两倍的表达增加表明从所述对象获得的所述宫颈样品中存在宫颈非典型增生或宫颈癌。

2.如权利要求1所述的方法，其中检测Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶的表达包括检测Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶蛋白的表达。

3.如权利要求2所述的方法，其中检测Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶的蛋白表达包括：

使所述宫颈样品与Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶-特异性抗体在足以使所述抗体与所述样品中的Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶蛋白结合的条件下接触，从而形成Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶-抗体复合体；和

检测所述Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶-抗体复合体。

4.如权利要求3所述的方法，其中检测所述Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶-抗体复合体包括：

使所述Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶-抗体复合体与包含标记的第二抗体在足以使所述第二抗体与Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶-抗体复合体结合的条件下接触，从而形成被标记的Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶-抗体复合体；和

检测所述标记。

5.如权利要求2所述的方法，其中检测Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶蛋白的表达包括使用显微镜或流式细胞仪检测所述Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶蛋白。

6.如权利要求1所述的方法，其中检测Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶的表达包括检测Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶核酸分子的表达。

7.如权利要求6所述的方法，其中检测Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶核酸分子的表达包括检测Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶mRNA的表达。

8.如权利要求7所述的方法，其中使用PCR检测Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶mRNA的表达。

9.如权利要求1所述的方法，其中检测Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶的表达包括对Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶的表达进行定量测定。

10.如权利要求1所述的方法，其中所述参考值还包括宫颈非典型增生或宫颈癌阳性的宫颈样品的Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶表达的第二参考值，其中，Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶表达的量基本上与在所述第二参考值中的Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶表达的量相似表明从所述对象获得的所述宫颈样品中存在宫颈非典型增生或宫颈癌。

11.如权利要求1所述的方法，其中检测Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶表达包括检测Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶β亚基的表达。

12.如权利要求1所述的方法，其中检测Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶的表达还包括检测Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶α-亚基的表达。

13.如权利要求12所述的方法，还包括确定α-亚基与β-亚基表达的比值，其中相对于宫颈非典型增生或宫颈癌阴性的宫颈样品的α-亚基与β-亚基表达的比值的参考值，α-亚基与β-亚基表达的比值至少减少20％表明从所述对象获得的所述宫颈样品中存在宫颈非典型增生或宫颈癌。

14.如权利要求11所述的方法，还包括将α-亚基与β-亚基表达的比值与参考值或参考样品比较，其中在所述宫颈组织样品中观察的、与在特定参考值或参考样品中观察的α-亚基与β-亚基表达的比值基本上相似的α-亚基和β-亚基表达的比值表明所述对象具有所述参考值或参考样品的宫颈非典型增生或宫颈癌的特定存在、不存在或等级。

15.如权利要求1所述的方法，还包括：

确定Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶在存在于所述宫颈样品中的宫颈细胞中的定位；和，

将所述Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶定位与参考Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶定位相比较，其中Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶定位基本上与所述参考中的Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶定位相似表明所述对象具有所述参考的宫颈非典型增生或宫颈癌的存在、不存在或等级。

16.如权利要求1所述的方法，还包括：

检测存在于所述宫颈样品中的宫颈细胞中的组蛋白H3；和，

将组蛋白H3表达与参考组蛋白H3表达相比较，其中组蛋白H3表达基本上与所述参考组蛋白H3表达相似表明所述对象具有所述参考的宫颈非典型增生或宫颈癌的存在、不存在或等级。

17.如权利要求1所述的方法，还包括：

选择相对于宫颈非典型增生或宫颈癌阴性的宫颈样品的Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶表达的参考值具有Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶表达至少两倍增加的对象，用于治疗所述的宫颈非典型增生或宫颈癌。

18.如权利要求17所述的方法，还包括：

将治疗有效量的宫颈细胞的一种或多种Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶抑制剂施用给所述对象。

19.如权利要求18所述的方法，其中所述一种或多种Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶抑制剂包括洋地黄。

20.如权利要求17所述的方法，还包括：

从所述对象切除宫颈非典型增生细胞或宫颈癌细胞，将治疗有效量的化学治疗剂施用给所述对象，将治疗有效量的放射治疗剂施用给所述对象，或它们的组合。

21.如权利要求1所述的方法，其中相对于所述参考值所述表达的增加为至少3倍。

22.如权利要求1所述的方法，其中相对于所述参考值所述表达的增加为大约2倍到10倍。

23.如权利要求1所述的方法，其中相对于所述参考值所述表达的增加为2倍。

24.如权利要求1所述的方法，其中所述对象是人类女性对象。

25.组合物，包括：

一种或多种Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶抑制剂；和

药学上可接受的局部载体。

26.如权利要求25所述的组合物，其中所述一种或多种Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶抑制剂包括洋地黄。

27.如权利要求25所述的组合物，其中所述药学上可接受的局部载体包括适于体内施用给宫颈组织的试剂。

28.如权利要求25所述的组合物，其中所述洋地黄化合物的浓度按所述组合物的重量计为至少0.01mg/g。

29.如权利要求25所述的组合物，其中所述一种或多种Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶抑制剂包括Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶β-亚基的特异性RNAi分子。

30.用于治疗对象的宫颈非典型增生或宫颈癌的方法，包括：

在足以降低宫颈的细胞中Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶生物活性的条件下，将如权利要求25所述的组合物施用到所述对象的所述宫颈。

31.如权利要求30所述的方法，其中使所述组合物与所述宫颈的上皮层接触。

32.如权利要求30所述的方法，其中所述宫颈的细胞中所述Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶的生物活性减少至少50％。

33.如权利要求30所述的方法，其中所述宫颈的细胞中所述Na⁺、K⁺-腺苷三磷酸酶的生物活性减少至少95％。

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