ES2309586T3 - Aptameros anti-apoptoticamente activos. - Google Patents
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Abstract
El ácido nucleico que incluye una secuencia de ácidos nucleicos escogida a partir del grupo que consiste en: de SEQ ID NO. 1 a SEQ ID NO. 9, y sus variaciones, que tienen al menos una identidad de secuencia del 95% respecto a las secuencias seleccionadas a partir del grupo que consiste en de SEQ ID NO. 1 a SEQ ID NO. 9 y que son anti-apoptóticamente activas.
Description
Aptámeros anti-apoptóticamente
activos.
La presente invención se refiere a aptámeros
anti-apoptóticamente activos. Se muestran las
secuencias correspondientes. La invención describe posibles
aplicaciones terapéuticas y diagnósticas.
Se han descrito muy profundamente en la técnica
moléculas de ácidos nucleicos (denominados aptámeros) que se unen
específicamente a ciertas moléculas diana (antígenos), así como
métodos para la fabricación y el aislamiento de tales aptámeros.
Dichos aptámeros que consisten en los ADN o ARN
monocatenarios poseen muy altas afinidades y especificidades con los
antígenos correspondientes. Hasta ahora, se han aislado ligandos de
ácidos nucleicos para iones metálicos, compuestos orgánicos,
péptidos, proteínas, o hasta estructuras complejas tales como virus
y células (artículo de revisión: Gold et al., Annu. Rev.
Biochem. 64 (1995), 763-797; Ellington y
Conrad, Biotechnol. Annu. Rev. 1 (1995),
185-214; Famulok, Curr. Opin. Struct. Biol.
9 (1999), 324-329).
Los aptámeros son así ácidos nucleicos que
consisten en ADN o ARN que, debido a su estructura espacial, son
capaces de unirse específicamente y con una alta afinidad a una
cierta diana (Osborne, S. E. y Ellington, A. D., (1997). "Nucleic
Acid Selection and the Challenge of Combinatorial Chemistry."
Chem Rev 97(2): 349-370). Durante los
pasados años, han sido identificados un número de aptámeros contra
proteínas diana médicamente relevantes. Además, se espera que el uso
de ácidos nucleicos para fines terapéuticos y diagnósticos esté
ahora realmente comenzando (Jayasena, S. D. (1999). "Aptamers: an
emerging class of molecules that rival antibodies in
diagnostics." Clin Chem 45(9):
1628-1650, Cerchia, L., Hamm, J., et al.,
(2002). "Nucleic acid aptamers in cancer medicine." FEBS
Lett 528(1-3): 12-16.).
El razonamiento detrás de este nuevo desarrollo implica las ventajas
que la identificación y la aplicación de moléculas de ADN o ARN
tienen en comparación con los anticuerpos - que todavía dominan la
terapia y el diagnóstico en muchos campos hasta el momento.
El método para obtener anticuerpos monoclonales
(Köhler, G. y Milstein, C., (1975). "Continuous cultures of fused
cells secreting antibody of predefined specificity."
Nature 256 (5517): 495-497) significó
un gran avance científico en muchos campos de la biología moderna y
la medicina. En la investigación médica, estos juegan su papel más
prominente en el campo diagnóstico, pero, por otro lado, también han
sido concedidas autorizaciones para el uso de anticuerpos
individuales como fármacos. Si una cierta proteína, por ejemplo,
sobre la superficie de una célula, ha sido identificada como una
diana con fines diagnósticos o terapéuticos y luego a) su presencia
debe ser identificada para fines diagnósticos, o b) su función debe
ser bloqueada para fines terapéuticos, entonces hasta el momento,
en ambos casos, el desarrollo de un anticuerpo monoclonal es el
método más importante y/o más rápido. El desarrollo de agentes
terapéuticos de bajos pesos moleculares es todavía un procedimiento
muy largo y tedioso. Las desventajas y limitaciones en la
identificación y la producción de anticuerpos son conocidas
(Jayasena, 1999), por ejemplo la necesidad de llevar a cabo la
primera inmunización con ensayos en animales; el problema de la
disponibilidad y reproducibilidad de células de hibridoma en varios
años; o la alta carga de trabajo y los enormes gastos de producción
de los anticuerpos.
Un aptámero puede ser seleccionado en
condiciones experimentales específicamente diseñadas, tales como por
ejemplo las que son óptimas para un método diagnóstico (Jayasena,
1999). Los aptámeros pueden ser almacenados mejor durante períodos
más largos porque, a diferencia de las proteínas, no están sometidos
a una desnaturalización irreversible, sino que pueden ser
termalmente renaturalizados en cualquier momento. Durante el
procedimiento de selección, los aptámeros son sintetizados
enzimáticamente por lo general. Para la producción a una escala más
grande, sin embargo, pueden ser sintetizados químicamente también,
por lo tanto, en comparación con la producción de anticuerpos
monoclonales, su fabricación puede ser llevada a cabo con una
reproducibilidad muy mejorada (Jayasena, 1999).
Las modificaciones que conducen a la
estabilización del ADN (Agrawal, S. (1996). "Antisense
oligonucleotides: towards clinical trials". Trends
Biotechnol 14(10): 376-387) o ARN
(Pieken, W. A., Olsen, D. B., et al. (1991). "Kinetic
characterization of ribonuclease-resistant
2'-modified hammerhead ribozymes". Science
253(5017): 314-317; Ruckman, J., Green, L.
S., et al. (1998). "2'-Fluoropyrimidine
RNA-based aptamers to the 165-amino
acid form of vascular endothelial growth factor (VEGF165).
Inhibition of receptor binding and VEGF-induced
vascular permeability through interactions requiring the exon
7-encoded domain". J Biol Chem
273(32): 20556-20567), se han establecido
como métodos rutinarios En el documento WO02083160, se describen
péptidos como fármacos que inhiben la apoptosis en células
epiteliales y queratinocitos porque inhiben la unión de
trombospondina-1 frente a IAP y/o
\alpha_{v}\beta_{3}. Tales péptidos pueden ser usados para la
cicatrización. en la síntesis de ácidos nucleicos o sus precursores
de nucleótido, de modo que hoy en día, los primeros aptámeros puedan
ser analizados en ensayos clínicos (grupo de estudio de Eyetech
(2002). "Preclinical and phase 1A clinical evaluation of an
anti-VEGF pegylated aptamer (EYE001) for the
treatment of exudative age-related macular
degeneration". Retina 22 (2):
143-152).
La apoptosis es un "programa de suicidio"
genéticamente codificado que es inducido en células eucariotas en
ciertas condiciones fisiológicas o patológicas. La inducción de la
apoptosis debe ser extremadamente y precisamente regulada porque una
hiperactividad puede conducir a una enfermedad degenerativa. Por
otra parte, una inducción de la apoptosis reducida puede contribuir,
por ejemplo, a la progresión de tumores.
Ya han sido descritos diferentes inductores de
bajo peso molecular de la apoptosis. Una clase de sustancias
importantes son las sustancias citostáticas de tumores. Sin embargo,
no se conoce el camino por el cual estas sustancias citostáticas u
otras inducen la apoptosis en la mayor parte de los casos.
La inducción de la apoptosis puede ocurrir por
ejemplo vía una serie de los denominados receptores de muerte, es
decir receptores que contienen un "dominio de muerte" (DD,
siglas en ingles de "death domain") tales como CD95,
TNF-RI, DR3, DR4 o DR5, que después de unir sus
ligandos inducen rutas de señal de apoptosis. Por ejemplo, después
de la unión del ligando de CD95, el receptor de CD95 interactúa con
la proteína adaptadora FADD/MORT1 mediante la cual son inducidos el
"reclutamiento" y la activación de la proteasa FLICE/caspasa 8
en el DISC, siglas en inglés ("Death Inducing Signalling
Complex") del "Complejo de Señalización de la Inducción de
Muerte". FADD y FLICE cada uno contienen "Dominios Efectores de
Muerte" (DED, siglas en inglés de "Death Effector Domains").
La inducción de la apoptosis vía estas vías de señalización de la
apoptosis es también posible externamente administrando, por
ejemplo, sustancias citotóxicas, mediante radiación, virus, la
retirada de factores de crecimiento o daños celulares mecánicos.
Estas posibilidades de inducción de la apoptosis son acompañadas sin
embargo por ciertas desventajas. Por ejemplo, la administración de
toxinas tales como sustancias citoestáticas o el tratamiento por
radiación de células cancerígenas puede conducir al desarrollo de
resistencia y hasta al daño en células sanas normales donde no es
deseable ninguna inducción de la apoptosis para nada.
En general, se propone la inducción de la
apoptosis para el tratamiento, por ejemplo, del cáncer o para
prevenir procesos angiogenéticos, etc. Aunque ya hayan sido
descritos inductores en este sentido, éstos todavía muestran un
número de desventajas. Por ejemplo, las sustancias citoestáticas
está acompañadas de severos efectos secundarios.
Las condiciones patológicas en las que la
apoptosis tiene un efecto negativo y en las que el tratamiento
médico adecuado implica la inhibición de la apoptosis son también un
objeto de discusión.
Un ejemplo de tal condición es la
arteriosclerosis. En particular, los inventores ya han demostrado
previamente que las células apoptóticas aparecen particularmente en
zonas con placas arterioscleróticas (especialmente: células
endoteliales, células del músculo liso), y que esta presencia además
está realzada por condiciones de flujo desequilibradas, es decir,
son dependientes del flujo (Freyberg et al., BBRC,
286, 141-149, 2001).
También, pueden ser usadas sustancias que
modulen la apoptosis para obtener un efecto positivo en la
cicatrización de heridas. Otras condiciones en discusión que están
asociadas con niveles más altos de apoptosis son el SIDA, el cáncer
y la enfermedad de Alzheimer, el lupus eritematoso sistémico, la
artritis reumatoide y otras enfermedades inflamatorias crónicas.
Hay por lo tanto una gran demanda de sustancias
que puedan tener una influencia positiva o negativa sobre la
apoptosis. En el sentido de la presente invención, tales sustancias
que inhiben la apoptosis son realizaciones particularmente
preferidas. Sería particularmente favorable inhibir el flujo o la
apoptosis dependiente de la fuerza también vista como un factor
causal en los problemas de cicatrización y la arteriosclerosis.
Queda así una gran demanda de conseguir formulaciones farmacéuticas
que contengan tales sustancias y que puedan ser administradas para
el tratamiento de condiciones en las cuales la inducción o la
inhibición de la apoptosis está indicada, en particular para el
tratamiento de la arteriosclerosis y la mejora de la cicatrización,
así como el tratamiento del SIDA, la enfermedad de Alzheimer y el
cáncer.
En la solicitud de patente alemana más antigua
DE 101 63 130, los inventores de la presente invención describen
péptidos que inhiben o inducen la apoptosis.
El objeto de esta presente invención es por lo
tanto proporcionar mejores sustancias apoptoticamente activas. En
particular, un objeto más de la presente invención es proporcionar
sustancias que puedan inhibir una apoptosis inducida por
TSP-1 de células eucariotas, en particular en
células endoteliales y fibroblastos. Un objeto más de la presente
invención es proporcionar preparaciones farmacéuticas para
enfermedades que pueden ser tratadas con éstas tales como
arteriosclerosis, heridas, SIDA, enfermedad de Alzheimer, cáncer,
lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide y otras
enfermedades inflamatorias crónicas, en las que la inducción o la
inhibición de la apoptosis está indicada.
Estos y otros objetos no específicamente
definidos, que se vuelven evidentes sin embargo a partir de la
evaluación antes indicada del estado de la técnica, son solucionados
por las realizaciones de la presente invención definidas en las
reivindicaciones.
Sorprendentemente, este objeto puede ser
resuelto de una manera simple proporcionando una ácido nucleico que
comprenda una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada a partir
del grupo que consiste en los mostrados en las SEQ ID NO. 1 a 9.
Una realización más de la presente invención se
refiere a variaciones funcionales de estos ácidos nucleicos. Estos
son, para los fines de la presente invención, ácidos nucleicos que
muestran al menos una identidad de secuencia del 95% respecto a las
secuencias seleccionadas a partir del grupo que consiste en: de SEQ
ID NO. 1 a SEQ ID NO. 9, y que, en el procedimiento de ensayo
descrito más abajo, exhiben una actividad
anti-apoptótica con al menos un índice de inhibición
del 50%, preferiblemente de al menos 60%, muy preferiblemente de al
menos 70%, aún más preferiblemente de al menos 80%, más
preferiblemente todavía de al menos 90% y lo más preferiblemente de
todo de al menos 95%.
Una realización más de la presente invención se
refiere a ácidos nucleicos en los que, en la dirección 5'- y/o 3',
los nucleótidos se unen a una secuencia de ácidos nucleicos
seleccionada a partir del grupo que consiste en de SEQ ID NO. 1 a
SEQ ID NO. 9. En particular, esta extensión comprende en cada caso
no más de 100, preferiblemente no más de 70, especialmente
preferiblemente no más de 30, muy especialmente preferiblemente no
más de 20 y lo más preferiblemente no más de 10 nucleótidos.
Esto vale sin decir que en esta invención
bastantes variaciones funcionales de estos ácidos nucleicos
extendidos están comprendidas en el sentido de la definición
anterior.
Los aptámeros de la presente invención
comprenden preferiblemente modificaciones que aumentan la
estabilidad de los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención
hacia la degradación de nucleasa. Preferiblemente, en esta
invención,
2'-NH_{2}-2'-desoxiuridina
y/o
2'-NH_{2}-2'-desoxicitidina
son usadas en vez de los nucleótidos no modificados uridina y
citidina.
Para los fines de la presente invención, los
ácidos nucleicos se entienden como moléculas poliméricas que, en el
caso del ARN, están compuestos de los nucleótidos adenosina (A),
citidina (C), uridina (U), guanosina (G) y, y en el caso del ADN,
están compuestos de desoxiadenosina (A), desoxicitidina (C),
desoxiguanosina (G) y timidina (T). Estos nucleótidos pueden exhibir
al menos una de las modificaciones siguientes:
2'-desoxi, 2'-flúor,
2'-cloro, 2'-bromo,
2'-yodo, 2'-amino (preferiblemente
no sustituido o mono- o di-sustituido),
2'-mono-, di- o
tri-halo-metilo,
2'-O-alquilo, alquilo
2'-O-halo-sustituido,
2'-alquilo, azido, fosforotioato, sulfhidrilo,
metilfosfonato, fluoresceina, rodamina, pireno, biotina, xantina,
hipoxantina, 2,6-diaminopurina,
2-hidroxi-6-mercaptopurina,
modificaciones de polietilenglicol y para el azufre de las bases de
pirimidina en la posición 6 y el halógeno en la posición 5, grupos
alquilo C_{1-5}, enlazantes abásicos,
3'-desoxiadenosina u otros terminadores de cadena o
análogos de nucleótido no extensibles en el extremo 3' u otras
modificaciones en los extremos 5' y/o 3'. Otras modificaciones
anteriormente descritas en el estado de la técnica tales como, por
ejemplo, en el WO 02/26932 están por supuesto comprendidas en esta
invención también.
En general, los aptámeros comprenden de 10 a 100
nucleótidos, preferiblemente de 15 a 50 nucleótidos, especialmente
preferiblemente de 20 a 40 nucleótidos. Si fuera necesario, los
aptámeros exhiben una secuencia mínima de al menos 6,
preferiblemente al menos 10 y especialmente preferiblemente de al
menos de 14 a 15 nucleótidos, que son necesarios para garantizar la
unión.
Una realización preferida de la presente
invención son preparaciones farmacéuticas que incluyen al menos uno
de los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención.
Una realización especialmente preferida de la
presente invención es el uso de los ácidos nucleicos, de acuerdo con
la invención, para la fabricación de un fármaco para el tratamiento
de arteriosclerosis, heridas, SIDA, enfermedad de Alzheimer, cáncer,
lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide y otras
enfermedades inflamatorias crónicas, usando los métodos conocidos en
la industria.
En una realización más preferida, la presente
invención también se refiere al uso de ácidos nucleicos, de acuerdo
con la invención, como una herramienta diagnóstica. En esta
invención, se usan ácidos nucleicos marcados. La marcación puede ser
llevada a cabo por ejemplo con un tinte fluorescente, una enzima,
anticuerpo o un radionucleido. Los métodos de detección
correspondientes son conocidos por los expertos en la técnica.
Preferiblemente, un aptámero, de acuerdo con la
invención, comporta un componente parte de un kit junto con, por
ejemplo, controles negativos y positivos. El experto sabe muy bien
que los aptámeros correspondientes, en principio, pueden ser
aplicados como anticuerpos por ejemplo, en aplicaciones ELISA,
métodos cromatográficos y en procedimientos diagnósticos/de
rastreo.
Anti-apoptóticamente activo, en
el sentido de la presente invención, significa que la sustancia
correspondiente en el ensayo de inhibición de acuerdo con el Ejemplo
6, causa un índice de inhibición de al menos 50%, preferiblemente de
al menos 60%, especialmente preferiblemente de al menos 70%, aún más
preferiblemente de al menos 80%, aún más preferiblemente todavía de
al menos 90% y lo más preferiblemente de todo de al menos 95% en
relación con el control con la apoptosis inducida por
TSP-1.
Los aptámeros, que son los componentes activos
de una preparación farmacéutica, por lo general son disueltos en un
vehículo farmacéuticamente aceptable adecuado. Los ejemplos de tales
vehículos farmacéuticamente aceptables pueden ser soluciones tampón
tales como tampón fosfato o tampón citrato. Para cada paciente, la
medicación específica y la posología son dependientes de varios
factores incluyendo la actividad de los compuestos específicos
usados, la edad del paciente, el peso corporal, el estado general de
salud, el sexo, la nutrición, el tiempo de administración, el método
de administración, la velocidad de excreción, la interacción con
otras medicaciones, y la severidad de la enfermedad afectada para la
cual la terapia es aplicada. Éstas serán determinadas por un médico
dependiendo de estos factores.
Los fármacos de aptámero por lo general son
administrados paternalmente, por ejemplo, con una pulverización de
inhalación, por vía rectal, por inyección subcutánea, intravenosa,
intramuscular, intraarticular e intratecal y técnicas de infusión, o
externamente en preparaciones farmacéuticas, que contienen de manera
convencional un medio farmacéuticamente aceptable, adyuvantes y
vehículos. Dependiendo de la naturaleza de la sustancia
identificada, otros medios de administración son también posibles,
por ejemplo, oralmente. Además, el fármaco puede ser aplicado como
un ungüento, gel, preparación húmeda, etc.
La presente invención también proporciona
compuestos farmacéuticos que contienen una cantidad eficaz de un
aptámero anti-apoptótico eficaz en combinación con
un vehículo farmacéutico convencional. Un vehículo farmacéutico es,
por ejemplo, un relleno sólido o líquido, un material de
encapsulación o un disolvente. Los ejemplos para los materiales que
pueden servir como vehículos farmacéuticos son azúcares tales como
lactosa, glucosa y sacarosa; almidones tales como almidón de maíz y
almidón de patata; celulosa y sus derivados tales como
carboximetilcelulosa de sodio, etil-celulosa y
acetato de celulosa; tragacanto pulverizado; malta; gelatina; sebo;
vehículos de fármacos tales como manteca de cacao y ceras de
supositorios; aceites tales como aceite de cacahuete, aceite de
semilla de algodón, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de
oliva, aceite de maíz y aceite de soja; polioles tales como
propilenglicol, glicerol, sorbitol, manitol y polietilenglicol;
ésteres tales como oleato de etilo y laurato de etilo; agar;
tampones tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio;
ácido algínico; agua libre de pirógenos; solución salina isotónica;
solución de Ringer, etanol y soluciones de tampón fosfato así como
otras sustancias no tóxicas compatibles que son usadas en las
preparaciones farmacéuticas. También pueden estar presentes agentes
humectantes, emulsionantes y lubricantes tales como
lauril-sulfato de sodio y estearato de magnesio, así
como tintes, agentes de revestimiento, perfumes y agentes
conservantes en las preparaciones de acuerdo con los requerimientos
de la técnica farmacéutica. El volumen de la sustancia activa que es
combinado con los materiales vehículos para producir la dosificación
individual varía, dependiendo del paciente que se trate y del método
especial de adminis-
tración.
tración.
Las sales farmacéuticamente adecuadas de los
aptámeros de acuerdo con la presente invención pueden ser fabricadas
usando métodos conocidos tales como disolviendo los compuestos, de
acuerdo con la presente invención, en las soluciones tampón acuosas
correspondientes o en H_{2}O y posteriormente liofilizándolos.
Pueden ser obtenidas sales metálicas disolviendo los compuestos, de
acuerdo con la presente invención, en soluciones que contengan el
ión correspondiente y posteriormente aislando el compuesto usando
HPLC o métodos de filtración de gel.
Otros procedimientos y métodos para la
fabricación de fármacos de aptámero así como su administración son
descritos, por ejemplo, en el documento WO02/26932 y pueden ser
usados por supuesto en esta invención también.
Los ácidos nucleicos, de acuerdo con la presente
invención, pueden ser fabricados de una manera simple, por ejemplo,
por síntesis química convencional usando un sintetizador de ADN/ARN,
sin presentar ningún problema para el personal experto en este
campo. Los protocolos correspondientes y aparatos son conocidos para
el personal experto en este campo y son de funcionamiento
rutinario.
La figura 1 muestra una estructura secundaria
postulada para SEQ ID NO. 2. Junto con la secuencia de ARN
5'-CGGAC GGGAC CAGAG GUGCC GCUGU
CCG-3' la SEQ ID NO. 2 del aptámero forma la
estructura H1. Este área con una estructura (H1) de hélice
(horquilla) está al lado de dos secciones de ARN que también pueden
formar una estructura de hélice llamada "hélice F". La síntesis
de los ARN cambiados/mutados que comienzan a partir del aptámero 89
(SEQ ID NO. 2) muestra si las secuencias flanqueantes, que forman la
hélice F, son importantes para la función del aptámero y si el
aptámero 89 puede ser acortado manteniendo al tiempo su función (SEQ
ID NO. 4, ejemplo 7).
La figura 2 muestra una estructura secundaria
calculada para SEQ ID NO. 7. En la parte central de la secuencia
(SEQ ID NO. 9), la estructura posee un bucle de horquilla (H2) que
es complementado por una hélice más de las secuencias
flanqueantes.
Los ejemplos siguientes ejemplifican la presente
invención sin ningún efecto restrictivo pese a todo.
\newpage
La descripción siguiente muestra los materiales
usados y sus fuentes de suministro.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El agua doblemente destilada para preparar
soluciones fue tratada con pirocarbonato de dietilo (DEPC), 0,01%
durante 24 horas de 20 a 25ºC y posteriormente fue sometida a
autoclave durante 60 minutos a 121ºC.
- CI
- mezcla de cloroformo/alcohol de isoamilo 24:1 (volumen/volumen)
- 1xTBE
- Tris 90 mM, ácido bórico 90 mM, EDTA 2 mM.
\vskip1.000000\baselineskip
El aptámero describe un ARN modificado en el que
los nucleótidos de pirimidina (U y C) llevan un grupo
NH_{2}-(amino) en la posición 2' en vez del grupo OH. La síntesis
del ARN modificado es realizada en esta invención enzimáticamente
usando una ARN polimerasa por la inserción de nucleótidos de purina
no modificados y pirimidina modificados.
Comenzando a partir del ADN bicatenario
(60-70 pmol de ADN), que contiene la secuencia del
promotor T7 del bacteriófago T7 y, del primer nucleótido transcrito,
una copia de ADN del ARN del aptámero deseado (por ejemplo para el
aptámero de la secuencia de ADN NO. 89: "SEQ ID NO. 1",
empezando con 5'-GGGAGAC...-3', véase el ejemplo 2),
los ARN del aptámero se sintetizan mediante la ARN polimerasa de T7.
La transcripción ocurre en presencia de ATP y GTP así como los
nucleótidos modificados
2'-NH_{2}-UTP (2'
NH_{2}-2'-desoxiuridina) y
2'-NH_{2}-CTP (2'
NH_{2}-2'-desoxicitidina) por la
incubación con la ARN polimerasa comercial de T7, bajo las
condiciones de tampón y salinas recomendadas por el fabricante
(Fabricante: MBI-Fermentas, San
Leon-Roth), en un volumen de 40 \mul a 16ºC +/-
3ºC durante 20 a 44 horas. Entonces, el ADN que está todavía
presente es digerido añadiendo MgCl_{2} (aumento de la
concentración a 2,74 mM) y DNAsa I sin RNAsa (concentración final
0,06 unidades/\mul) e incubación a 37ºC durante 135 minutos, por
lo cual 1 unidad de DNasa I es definida como el volumen de enzima
que digiere completamente 1 \mug de ADN en 50 \mul en tampón con
Tris-HCl 40 mM, NaCl 10 mM, MgCl_{2} 6 mM,
CaCl_{2} 10 mM, (pH 7,9 a 25ºC), en 10 minutos a 37ºC.
Después de añadir 45 \mul de tampón TE
(Tris-HCl 10 mM, EDTA 0,1 mM, pH 7,8), la solución
primero es extraída con fenol y luego con cloroformo/alcohol de
isoamilo (24:1). Después de esto, el ARN del aptámero es precipitado
con etanol y, después del lavado con etanol del 70%, es disuelto en
30 \mul de dd-H_{2}O tratada con DEPC y se
almacena a -20ºC. El rendimiento de ARN de aptámero es determinado
por análisis de extinción a 260 y 280 nm, así como junto con los
ácidos nucleicos de concentración conocida, después de la separación
en un gel de poliacrilamida en presencia de urea 8 M y tampón
Tris-ácido bórico con acrilamida del 9,47% (p/v) y
bis-acrilamida del 0,53%, urea 8 M y tampón TBE
(sistema tampón estándar 1xTBE: Tris 90 mM, ácido bórico 90 mM, EDTA
2 mM). La separación de los ácidos nucleicos ocurre de 12 a 16 V/cm
durante 35 a 45 minutos. El gel entonces es teñido con el tinte
fluorescente SYBRGreen II (Molecular Probes; concentración de
acuerdo con las instrucciones del fabricante) durante 20 minutos y
es excitado con luz UV y la fluorescencia es analizada en luz
visible.
1.) Secuencias de ADN NO. 89 (SEQ ID NO.
1)
\vskip1.000000\baselineskip
2.) Secuencia de ARN del aptámero modificado
de pirimidina No. 89 (SEQ ID NO. 2)
(U=2'-NH_{2}-2'-desoxiuridina;
C=2'-NH_{2}-2'-desoxicitidina)
\vskip1.000000\baselineskip
3.) Secuencia de ARN del área central del
aptámero modificado de pirimidina No. 89 sin secuencias flanqueantes
(SEQ ID NO. 3)
(U=2'-NH_{2}-2'-desoxiuridina;
C=2'-NH_{2}-2'-desoxicitidina)
\vskip1.000000\baselineskip
4.) Secuencia de ARN del mutante de aptámero
``89-2'' (58 nt) (SEQ ID NO. 4)
(U=2'-NH_{2}-2'-desoxiuridina;
C=2'-NH_{2}-2'-desoxicitidina)
\vskip1.000000\baselineskip
5.) Secuencia de ARN del mutante de aptámero
No 89-Z (30 nt) (SEQ ID NO. 5)
(U=2'-NH_{2}-2'-desoxiuridina;
C=2'-NH_{2}-2'-desoxicitidina)
\vskip1.000000\baselineskip
6.) Secuencia de ADN NO. 82 (SEQ ID NO.
6)
\vskip1.000000\baselineskip
7.) Secuencia de ARN del aptámero modificado
de pirimidina NO. 82 (SEQ ID NO. 7)
(U=2'-NH_{2}-2'-desoxiuridina;
C=2'-NH_{2}-2'-desoxicitidina)
\vskip1.000000\baselineskip
8.) Secuencia de ARN del área central del
aptámero modificado de pirimidina NO. 82 sin secuencias flanqueantes
(SEQ ID NO. 8)
(U=2'-NH_{2}-2'-desoxiuridina;
C=2'-NH_{2}-2'-desoxicitidina)
\vskip1.000000\baselineskip
9.) Secuencia de ARN del mutante de aptámero
No 82-Z (30 nt) (SEQ ID NO. 9)
(U=2'-NH_{2}-2'-desoxiuridina;
C=2'-NH_{2}-2'-desoxicitidina)
\vskip1.000000\baselineskip
Medio de cultivo: Medio básico IF +15% (v/v)
NCS, 5 \mug/ml de transferina, 5 \mug/ml de heparina, 0,7
\mug/ml de FGF, L-glutamina 2 mM [Medio Básico IF:
1:1-mezcla del medio modificado de Dulbecco de
Iscove (IMDM) y F12 de Ham, ambos de Life Technologies, Paisley
(Gran Bretaña)]
NCS: Suero de becerro recién nacido (Sebak,
Aidenbach)
FGF: Factor de crecimiento de fibroblastos
(producción propia, parcialmente purificado de cerebro porcino).
\vskip1.000000\baselineskip
Recipientes de cultivos celulares, revestidos de
gelatina.
\vskip1.000000\baselineskip
El cultivo de HUVEC se lleva a cabo en
recipientes de cultivo revestidos de gelatina a 37ºC en una
atmósfera de CO_{2} del 5% y aire saturado de vapor. El medio de
cultivo es cambiado cada 2-3 días; en confluencia
las células son pasadas con una tasa de separación de 1:3 a 1:5.
HUVEC crece estrictamente inhibido por contacto y forma cultivos de
células de monocapas con la morfología típica de adoquín. En la
confluencia, los cultivos alcanzan una densidad celular de
4-9x10^{4} células/cm^{2}. Para los exámenes de
la apoptosis, los cultivos HUVEC de los pasos 1-4
son usados exclusivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Soluciones (estériles):
Solución de gelatina, 1% (p/v) en agua
Milli-Q
Suspender 1 g de gelatina (cultivo de célula
analizado) en 100 ml de agua Milli-Q, disuelto
mediante autoclave durante 20 minutos a 121ºC y 2 bares y almacenado
a temperatura ambiente.
PBS (NaCl 140 mM, KCl 3 mM, Na_{2}HPO_{4} 8
mM, KH_{2}PO_{4} 1,5 mM)
8 g/l de NaCl
0,2 g/l de KCl
1,44 g/l de Na_{2}HPO_{4} x 2 H_{2}O
0,2 g/l de KH_{2}PO_{4}.
\newpage
Se disuelven las sales en un volumen
correspondiente de agua Milli-Q, se somete a
autoclave durante 20 minutos a 121ºC y 2 bares, se almacena a
temperatura ambiente. El pH es medido y está entre 7,2 y 7,4.
\vskip1.000000\baselineskip
Recipientes de cultivo de células.
\vskip1.000000\baselineskip
Los recipientes de cultivo son revestidos de
gelatina para el cultivo de células adherentemente crecientes. Los
fondos de los recipientes de cultivo de células son recubiertos de
una solución de gelatina estéril y los recipientes son dejados
reposando 15 minutos a temperatura ambiente. La solución de gelatina
es succionada. Los recipientes de cultivo de células son lavados una
vez con PBS y entonces pueden ser usados.
\vskip1.000000\baselineskip
Soluciones (estériles):
PBS
Tripsina/EDTA (0,05% (p/v)/0,02% (p/v))
0,1 ml de solución madre de tripsina
0,05 ml de solución madre de EDTA
Se rellena hasta 50 ml con PBS estéril y se
almacena en porciones de 10 ml a -20ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Recipientes de cultivo de células,
gelatinizado.
\vskip1.000000\baselineskip
Todos los tipos de células son separados de la
superficie del cultivo con solución de tripsina/EDTA. El medio de
cultivo se retira por succión. El fondo del recipiente de cultivo se
lava brevemente con PBS y luego se reviste con la solución de
tripsina/EDTA (aprox. 1 ml para un matraz de cultivo de 25
cm^{2}). La solución enzimática es inmediatamente succionada de
nuevo de modo que una película delgada líquida permanezca sobre las
células. Las células se dejan reposar a temperatura ambiente durante
1-10 minutos y la separación de las células se
observa al microscopio. La separación de las células puede ser
acelerada golpeando con cuidado el recipiente de cultivo sobre el
borde. Las células son transferidas al medio de cultivo recién
preparado, de ser requerido se cuentan, y luego se siembran en
nuevos recipientes de cultivo.
\vskip1.000000\baselineskip
DAPI pertenece al grupo de tintes del indol y
proporciona una tinción de DNS selectiva. La tinción es excitada a
340-360 nm con un máximo de emisión de 480 nm. La
sustancia se usa para exámenes de apoptosis [compárese: Cohen et
al., Immunology Today, 14, NO. 3,
126-130 (1993)].
\vskip1.000000\baselineskip
Soluciones:
PBS
Solución de formaldehído
4% (v/v) de formaldehído en PBS
Solución de DAPI (Molecular Probes, Leiden,
Países Bajos)
2 \mug/ml de DAPI en metanol.
\vskip1.000000\baselineskip
Placas petri (35 mm) o placa de 24 pocillos con
células HUVEC en cultivo.
\vskip1.000000\baselineskip
El sobrenadante del cultivo de una placa Petri o
placa de 24 pocillos se succiona. La línea celular se fija durante
15 minutos con 1 ml de una solución de formaldehído enfriada en
hielo, se lava dos veces con 2 ml de PBS. Se añaden 0,5 ml de
solución DAPI durante 15 minutos, luego se lava de nuevo con PBS y
se evalúa bajo el microscopio de fluorescencia. Este trabajo se
lleva a cabo con un filtro UV puesto y un objetivo de 20x o 40x.
500-1000 células son escogidas al azar y se cuenta
el número con núcleos apoptóticos.
El índice de apoptosis es calculado de acuerdo
con la fórmula siguiente:
Índice de
apoptosis [%] = número de células apoptóticas/recuento de células
totales
x100
Las células son cultivadas de la manera descrita
en el ejemplo 3. Las células son sembradas en recipientes de cultivo
apropiados (por ejemplo, placa de 24 pocillos/0,5 ml por pocillo) y
después de alcanzar la confluencia completa pueden ser usadas para
el ensayo real.
La inducción de la apoptosis es llevada a cabo
por TSP 1, cuyas células endoteliales lo producen y secretan por
ellas mismas, y que está enriquecido en el medio de cultivo
(autoacondicionamiento del medio de cultivo).
Los exámenes son llevados a cabo para establecer
la influencia de los diversos aptámeros sobre la tasa de apoptosis
de las células endoteliales. Para estos, los aptámeros, que son
disueltos en agua doblemente destilada tratada con DEPC (ejemplo 1),
son diluidos en el medio de cultivo para HUVEC (ejemplo 3) y usados
en las concentraciones dadas. Se usa medio de cultivo sin ningún
aptámero o inhibidor en absoluto como control positivo.
El medio con los aptámeros es añadido a las
células e incubado durante tres días en condiciones de cultivo
(ejemplo 3). Después de 36 horas, el medio de cultivo/medio de
cultivo con aptámeros es cambiado una vez.
Posteriormente, las células, como se describe en
el ejemplo 4, son teñidas con DAPI para determinar la tasa de
apoptosis y el índice de apoptosis es calculado con la fórmula
dada.
La acción que induce la apoptosis claramente del
medio autocondicionado en el caso del control positivo, y la
apoptosis reducida en el caso del control de inhibición, demuestran
el éxito del ensayo como un control interno.
\vskip1.000000\baselineskip
Las células son cultivadas de la manera descrita
en el ejemplo 3. Las células son sembradas en recipientes de cultivo
apropiados (por ejemplo placas de 24 pocillos/0,5 ml por pocillo) y
después de alcanzar la confluencia completa pueden ser usadas para
el ensayo de acuerdo con el ejemplo 4. Las muestras siguientes son
preparadas:
(K) Medio de cultivo [medio autocondicionado,
tasa de base de apoptosis, control],
(1) Medio de cultivo + aptámero 89, SEQ ID NO.
2, concentración: 150 nM
(2) Medio de cultivo + aptámero 89, SEQ ID NO.
2, concentración: 300 nM
(3) Medio de cultivo + aptámero 82, SEQ ID NO.
7, concentración: 150 nM
(4) Medio de cultivo + aptámero 82, SEQ ID NO.
7, concentración: 300 nM.
\vskip1.000000\baselineskip
Después de 72 horas de incubación en condiciones
de cultivo, las células son fijadas, teñidas con DAPI, y examinadas
morfológicamente bajo un microscopio de fluorescencia. El recuento
de células apoptóticas y el recuento de células totales son
determinados y el índice de apoptosis es calculado (porcentaje de
células apoptóticas) (ejemplo 3, ejemplo 4, ejemplo 5).
El ensayo fue llevado a cabo como se describe en
el ejemplo 6. Un aptámero con una longitud total reducida (SEQ ID
NO. 4, llamada en este documento "89-2") fue
comparado con el Aptámero 89 (longitud completa SEQ ID NO. 2,
llamada "89"). La estructura de horquilla termodinámicamente
preferida HI también forma para SEQ ID NO. 4 - como se muestra en la
figura 1. Por el contrario, la secuencia existente
5'-UGAAUUCUCGACC-3' en el extremo 3'
de SEQ ID NO. 2 fue sustituida en SEQ ID NO. 4 por la secuencia de
ARN 5'-AUGGA-3' (ARN modificado,
véase el ejemplo 2). Esto destruye la estructura de "Hélice F"
y una nueva hélice corta puede formarse
(5'-AUGGA/5'-UCCAU).
Las células son cultivadas de la manera descrita
en el ejemplo 3. Las células son sembradas en recipientes de cultivo
apropiados (por ejemplo placa de 24 pocillos/0,5 ml por pocillo) y
después de alcanzar la confluencia completa pueden ser usadas para
el ensayo (ejemplo 4, ejemplo 5). Las muestras siguientes se
preparan:
(K) Medio de cultivo [medio autocondicionado,
tasa de base de apoptosis, control],
(5) Medio de cultivo + aptámero 89, SEQ ID NO.
2, concentración: 50 nM
(6) Medio de cultivo + aptámero 89, SEQ ID NO.
4, concentración: 50 nM.
\vskip1.000000\baselineskip
La Tabla 2 siguiente resume los resultados. Es
claramente reconocible que el área de la secuencia acortada en NO.
89-2 (SEQ ID NO. 4) tiene una actividad comparable
que la de la secuencia original NO. 89 (SEQ ID NO. 2).
<110> CytoTools GmbH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Aptámeros
anti-apoptóticamente activos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> C 720
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Aptámero;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1), (66)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Aptámero; U =
2'-NH_{2}-2'-desoxiuridina;
C =
2'-NH_{2}-2'-desoxicitidina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(21)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Aptámero; U =
2'-NH_{2}-2'-desoxiuridina;
C =
2'-NH_{2}-2'-desoxicitidina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(58)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Aptámero; U =
2'-NH_{2}-2'-desoxiuridina;
C =
2'-NH_{2}-2'-desoxicitidina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1). (30)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Aptámero; U =
2'-NH_{2}-2'-desoxiuridina;
C =
2'-NH_{2}-2'-desoxicitidina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Aptámero
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_ modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(63)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Aptámero; U =
2'-NH_{2}-2'-desoxiuridina;
C =
2'-NH_{2}-2'-desoxicitidina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Aptámero; U =
2'-NH_{2}-2'-desoxiuridina;
C =
2'-NH_{2}-2'-desoxicitidina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(30)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Aptámero; U =
2'-NH_{2}-2'-desoxiuridina;
C =
2'-NH_{2}-2'-desoxicitidina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
Claims (6)
1. El ácido nucleico que incluye una secuencia
de ácidos nucleicos escogida a partir del grupo que consiste en: de
SEQ ID NO. 1 a SEQ ID NO. 9, y sus variaciones, que tienen al menos
una identidad de secuencia del 95% respecto a las secuencias
seleccionadas a partir del grupo que consiste en de SEQ ID NO. 1 a
SEQ ID NO. 9 y que son anti-apoptóticamente
activas.
2. El ácido nucleico de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado porque no más de 100,
preferiblemente no más de 70, especialmente preferiblemente no más
de 30, muy especialmente preferiblemente no más de 20 y lo más
preferiblemente no más de 10 nucleótidos son unidos en la dirección
5' y/o 3' a la secuencia escogida a partir del grupo: de SEQ ID NO 1
a SEQ ID NO. 9.
3. El ácido nucleico escogido a partir del grupo
que consiste en de SEQ ID NO. 1 a SEQ ID NO. 9.
4. La preparación farmacéutica que comprende un
ácido nucleico de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3.
5. El uso de ácidos nucleicos de acuerdo con las
reivindicaciones de 1 a 3 como una herramienta diagnóstica.
6. El método para la fabricación de ácidos
nucleicos de acuerdo con las reivindicaciones de 1 a 3 mediante
síntesis química.
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|---|---|---|---|
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| DE10358407A DE10358407A1 (de) | 2003-12-11 | 2003-12-11 | Antiapoptorisch wirksame Aptamere (zur Therapie von Herz-Kreislauf Erkrankungen) |
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