ES2305100T3 - Tarjeta de reaccion y uso de tal tarjeta. - Google Patents

Abstract

Tarjeta (1) de reacción constituida por un cuerpo, que tiene una cara (62) delantera y una cara (63) trasera delimitadas por un reborde (68), por al menos una entrada (2, 3, 4 y/o 5) y por al menos una salida (7 y/u 8), una (2, 3, 4 y/o 5) unida a la otra (7 y/u 8) por una red de canales (64) que constituyen al menos una vía de reacción para al menos un fluido (70, 71 y/o 72), estando el o los fluidos (70, 71 y/o 72) dirigidos en el interior de la tarjeta (1) mediante válvulas (11 a 35 y/o 61); cada válvula (11 a 35 ó 61) está constituida por una película (67) flexible, que puede deformarse para permitir el paso de un fluido o que actúa conjuntamente con un medio (75) de compresión para impedir el paso del fluido, estando la película (67) fijada sobre la cara (63) trasera de dicha tarjeta (1) al nivel de una hendidura (74) periférico del conjunto de los canales relacionados con la válvula (11 a 35 ó 61); la tarjeta (1) comprende canales (64) que afloran sobre al menos una de sus caras (62 y/o 63), siendo los canales (64) de dos secciones diferentes, una sección pequeña para la transferencia del fluido o de los fluidos (70, 71 y/o 72) y una sección grande que actúa como compartimiento de reacción; cada cara (62) delantera o trasera (63) está delimitada por al menos una película (48, 49, 65, 66 y/o 67).

Description

Tarjeta de reacción y uso de tal tarjeta.

La presente invención se refiere a una tarjeta de reacción para llevar a cabo reacciones químicas y/o biológicas. Se refiere igualmente al uso de tal tarjeta para purificar y amplificar ácidos nucleicos y detectarlos.

El estado de la técnica está constituido por el documento US-A-4.585.623 que tiene como objeto un aparato para realizar rápidamente en un sitio único ensayos químicos o inmunoquímicos. Este aparato comprende un cuerpo de plástico moldeado que puede ser miniaturizado, y que presenta varios tubos que contienen reactivos, un tubo que contiene la muestra y un tubo de tamaño más pequeño que recibe la reacción. Estando cada tubo asociado a un pistón, es posible insertar el aparato en un autómata programable.

Este aparato es relativamente voluminoso aunque la miniaturización sea posible, porque hay que prever la posición de dicho aparato así como de las diferentes bielas que van a permitir accionar los pistones. Además, sólo es posible efectuar una sola reacción con tal aparato, si deben realizarse varias reacciones, habrá que prever varios aparatos e igualmente tiempo para cargar éstos con los reactivos y muestras adecuados.

El documento WO A-97/27324 se refiere a una cajita para llevar a cabo varias reacciones en paralelo que comprende una abertura de entrada y una abertura de salida para la transferencia de la o de las muestras que van a introducirse en la cajita. Algunas zonas de la cajita son de construcción particular (cámara de Bursapak, válvula de pistón, válvula de bola), permiten, bajo la acción de una fuerza interior o exterior continua, mantener un canal abierto o cerrado. Las cámaras de Bursapak se asocian a veces a filtros hidrófobos que permiten bloquear la progresión de un líquido.

No obstante, esta construcción comprende un inconveniente importante que radica en la estructura de las válvulas de las cámaras de Bursapak. Estas comprenden todas películas que tienen que preformarse previamente a su montaje sobre la tarjeta de reacción. Este preformado permite mantener cada cámara de Bursapak cerrada en posición de reposo (figuras 2A y 2B). La abertura de esta cámara es posible bajo una acción interior (figura 2C), como por ejemplo un aumento de la presión de un fluido contenido en la tarjeta de reacción, o bajo una acción exterior (figuras 2D y 2E), como por ejemplo un aumento de la presión debida a la presión de un pistón u otros contra la película preformada. Por tanto este preformado de cada película debe realizarse, antes de su colocación sobre dicha tarjeta de reacción. El coste de fabricación, de almacenamiento y de transporte de tales películas es claramente más importante que para películas que permanecen planas. Además, esto no facilita tampoco la fabricación, el almacenamiento y el transporte de las tarjetas de reacción así dotadas. Finalmente, las formas convexas de estas películas pueden dañarse más fácilmente, lo que puede acarrear escapes o errores en el uso posterior de dichas tarjetas.

El documento WO-A-97/02357 describe un aparato de diagnóstico de ácidos nucleicos que se parece a la cajita anterior, en cuanto a la complejidad. Así, la figura 2b presenta una válvula constituida por numerosos componentes.

Por tanto este aparato tiene sensiblemente los mismos inconvenientes que el documento WO-A-97/27324.

La solicitud de patente WO-A-99/33559 propone un cartucho o tarjeta de separación de un constituyente particular, tal como ácidos nucleicos, presente en una muestra. Para esto, comprende cierto número de compartimientos y de canales. Estos compartimientos contienen desde el principio el conjunto de los líquidos (líquido de elución, líquido de lavado por ejemplo) que va a usarse. El control de los movimientos de fluidos se realiza mediante válvulas dispuestas irregularmente en el interior de la tarjeta, y mediante sensores de la presencia de fluidos. Estas válvulas funcionan como diodos fluídicos, que dejan que un líquido fluya en un sentido pero no en el sentido opuesto. Utilizan para esto discos magnéticos que pueden desplazarse desde el exterior. Los sensores están unidos eléctricamente hacia el exterior o a un microprocesador interno en la tarjeta.

Este tipo de tarjeta es particularmente complejo ya que el cuerpo de esta tarjeta está de hecho constituido por un sándwich de varios elementos superpuestos, véase a este respecto los diodos fluídicos. Además conviene garantizar la estanquidad entre estos diversos elementos superpuestos. La tarjeta incorpora además de los sensores, hilos eléctricos, diodos fluídicos, que funcionan con imanes, e incluso un microprocesador. Por tanto el coste de fabricación es prohibitivo, y todos estos constituyentes eléctricos, magnéticos pueden tener una influencia sobre el funcionamiento interno de dicha tarjeta. Por tanto tal tarjeta no está muy adaptada a una tecnología basada en la microfluídica. La presencia de líquidos en el interior de la tarjeta necesita un almacenamiento limitado en el tiempo o la introducción de estos líquidos por un manipulador experto. Por tanto la flexibilidad de uso resulta bastante limitada.

Según la presente invención, se propone una tarjeta de reacción que responde al conjunto de estos problemas. Tal tarjeta propone el análisis biológico, de uno o de varios ligandos, necesitando para su detección y/o su cuantificación, el uso de uno o varios antiligandos. Un ejemplo de aplicación de las técnicas de análisis se refiere a los inmunoensayos, sea cual sea su formato, mediante análisis directo o mediante competición. Otro ejemplo de aplicación se refiere a la detección y/o la cuantificación de ácidos nucleicos que comprende el conjunto de las operaciones necesarias para esta detección y/o para esta cuantificación a partir de una extracción cualquiera que contiene los ácidos nucleicos diana. Entre estas diferentes operaciones, puede citarse la lisis, la fluidificación, la concentración, la purificación, las etapas de amplificación enzimática de los ácidos nucleicos, las etapas de detección que incorporan una etapa de hibridación que usa por ejemplo una chip de ADN o una sonda marcada. La solicitud de patente WO-A-97/02357 o la solicitud de patente presentada por el solicitante, con el número FR99/00111, explicita diferentes etapas necesarias en el caso de ácidos nucleicos.

El estado de la técnica más próximo se describe en el documento WO0013795, que se refiere a una tarjeta de análisis adaptada a una tecnología basada en la microfluídica que menciona las siguientes características de la reivindicación independiente 1: la tarjeta de reacción está constituida por un cuerpo, que tiene una cara delantera y una cara trasera delimitadas por un reborde, por al menos una entrada y por al menos una salida, unidas entre sí por una red de canales que constituyen al menos una vía de reacción para al menos un fluido, estando dirigidos el o los fluidos en el interior de la tarjeta mediante válvulas; la tarjeta comprende canales que afloran sobre al menos una de sus caras, siendo los canales de dos secciones diferentes, una sección pequeña para la transferencia del fluido o de los fluidos y una sección grande que actúa de compartimiento de reacción.

La diferencia entre el objeto de la reivindicación independiente 1 y el estado de la técnica según D1 radica en que: cada válvula está constituida por una película flexible, que puede deformarse para permitir el paso de un fluido o que actúa conjuntamente con un medio de compresión para impedir el paso del fluido, estando fijada la película sobre la cara trasera de dicha tarjeta al nivel de una hendidura periférico del conjunto de los canales relacionados con la válvula; cada cara delantera o trasera está delimitada por al menos una película.

Con ese fin, la presente invención se refiere a una tarjeta de reacción según las características de la reivindica-
ción 1.

Según un modo particular de realización, el cuerpo de la tarjeta es monobloque y el medio de compresión se añade y es solidario de dicha tarjeta, o constituye una parte de un aparato que permite la puesta en práctica de la tarjeta. Según un modo particular de realización, la relación entre la sección pequeña y la sección grande de los canales está comprendida entre l a 1,01 y 1 a 10, preferiblemente entre l a 1,01 y 1 a 3.

Todavía según un modo particular de realización, los canales afloran total o parcialmente al nivel de la cara delantera de la tarjeta y las válvulas están presentes al nivel de la cara trasera de dicha tarjeta.

Según aún un modo particular de realización, la cara delantera de la tarjeta comprende una sola película al nivel de todos los canales que afloran en esta cara, y la cara trasera de dicha tarjeta comprende:

- al menos una película flexible al nivel de las válvulas,

- al menos un filtro hidrófobo, y eventualmente

- al menos una película al nivel de los canales que afloran al nivel de la cara trasera.

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Según un modo particular de realización, el o las películas flexibles y el o las películas constituyen una sola y misma película.

Según otro modo particular de realización, cuando la tarjeta tiene la forma sensiblemente de un paralelepípedo, los canales están, total o parcialmente, circunscritos en la parte mediana de la tarjeta, los filtros de retención, que son hidrófobos, están circunscritos al nivel de al menos uno de los lados de dicha tarjeta, y las válvulas están posicionadas entre los canales y los filtros de retención.

En este último modo de realización y preferiblemente, el reborde comprende el conjunto de las entradas y salidas de fluidos de la tarjeta.

En el caso de que la tarjeta tenga forma sensiblemente de paralelepípedo, la o las entradas están presentes sobre uno de los lados que constituyen el reborde, mientras que la o las salidas están presentes sobre otro lado de este reborde.

En este último caso y preferiblemente, la o las entradas están presentes sobre un lado opuesto al lado donde están presentes la o las salidas.

En el caso de que la tarjeta tenga forma sensiblemente de paralelepípedo rectángulo, la o las entradas y la o las salidas están presentes sobre los dos lados pequeños que constituyen el reborde.

La presente invención se refiere igualmente al uso de una tarjeta de reacción, tal como se define en la reivindica-
ción 12.

La presente invención se refiere igualmente al uso de una tarjeta de reacción, tal como se ha definido anteriormente, para probar una disolución biológica, eventualmente tratada previamente con el fin de liberar los ácidos nucleicos, se efectúan las diferentes etapas biológicas en el siguiente orden:

-

captura de los ácidos nucleicos,

-

recogida de los ácidos nucleicos capturados en una disolución de elución,

-

mezcla de los ácidos nucleicos recogidos con los constituyentes estructurales y funcionales que permite la amplificación de estos ácidos nucleicos, y

-

detección cualitativa y/o cuantitativa de los productos de amplificación.

Eventualmente, se efectúa una última etapa que consiste en analizar estos ligandos o estos productos de amplificación, o bien en un nuevo emplazamiento en el interior de la tarjeta, o bien después de la transmisión hacia otro dispositivo. Según una variante particular del uso, los ligandos o ácidos nucleicos capturados se someten a al menos un líquido de lavado previamente a su recogida.

Según otra variante de uso, la captura y eventualmente el lavado se efectúan N veces sucesivamente, estando comprendido N entre 1 y 10.

Según aún otra variante particular del uso, se detecta un tratamiento de los ligandos o una amplificación de los ácidos nucleicos previamente a la transmisión hacia un compartimiento de la tarjeta o hacia otro dispositivo que permite analizar los ligandos o los amplicones.

Preferiblemente, para todas las variantes de uso anteriormente mencionadas, la tarjeta se usa después de un aparato que permite tratar una disolución que ha de probarse, tal como un aparato para lisar células biológicas y liberar los ligandos, tales como ácidos nucleicos, y antes de un aparato que permite analizar la presencia de estos ligandos, tal como un chip de ADN.

Estructuralmente, la tarjeta según la invención se inserta entre dos aparatos que pueden estar constituidos igualmente por tarjetas, una aguas arriba que efectúa un pretratamiento de la disolución que ha de probarse, la otra aguas abajo que efectúa un postratamiento de la disolución que ha de probarse ya tratada.

Las figuras adjuntas se dan a titulo de ejemplo explicativo y no tienen ningún carácter limitativo. Permitirán comprender mejor la invención.

La figura 1 representa una vista desde la cara delantera de una tarjeta de reacción según un primer modo de realización de la presente invención.

La figura 2 representa una vista idéntica pero parcial de la figura 1, cuando el procedimiento de uso de la tarjeta está en curso de funcionamiento, habiendo recibido dicha tarjeta la disolución que ha de probarse.

La figura 3 representa una vista idéntica a la figura 2, cuando el procedimiento de uso de la tarjeta está en curso de funcionamiento, habiendo sido objeto dicha tarjeta de una U purga que permite dosificar de manera precisa el volumen de disolución que ha de probarse.

La figura 4 representa una vista idéntica pero parcial de la figura 1, cuando el procedimiento de uso de la tarjeta está en curso de funcionamiento, siendo transferida la disolución que ha de probarse del compartimiento de dosificación de la disolución hacia la parte aguas arriba del compartimiento de separación.

La figura 5 representa una vista idéntica a las figuras 2 y 3, cuando el procedimiento de uso de la tarjeta está en curso de funcionamiento, habiendo recibido dicha tarjeta el líquido de elución.

La figura 6 representa una vista idéntica a las figuras 2, 3 y 5, cuando el procedimiento de uso de la tarjeta está en curso de funcionamiento, habiendo sido objeto dicha tarjeta de una purga que permite dosificar de manera precisa el volumen de líquido de elución.

La figura 7 representa una vista idéntica pero parcial de la figura 1, cuando el procedimiento de uso de la tarjeta está en curso de funcionamiento, estando el líquido de elución en el compartimiento de separación y permitiendo la recogida de los ácidos nucleicos.

La figura 8 representa una vista idéntica pero parcial de la figura 1, cuando el procedimiento de uso de la tarjeta está en curso de funcionamiento, transfiriéndose el líquido de elución, que contiene los ácidos nucleicos, al compartimiento de recogida de los constituyentes estructurales que permiten realizar una amplificación.

La figura 9 representa una vista idéntica a la figura 8, transfiriéndose el líquido de elución, que contiene los ácidos nucleicos y los constituyentes estructurales, al compartimiento de recogida de los constituyentes funcionales que permiten realizar una amplificación.

La figura 10 representa una vista idéntica a las figuras 8 y 9, transfiriéndose en parte el líquido de elución, que contiene los ácidos nucleicos y los constituyentes estructurales y funcionales, al compartimiento de muestreo con vistas a la etapa representada en la figura 12.

La figura 11 representa una vista idéntica a las figuras 8 a 10, transfiriéndose el líquido de elución, que contiene los ácidos nucleicos y los constituyentes estructurales y funcionales y que no se ha transferido al compartimiento de muestreo, al compartimiento de convergencia, con vistas a su salida hacia el exterior.

La figura 12 representa una vista idéntica a las figuras 8 a 11, el líquido de elución, que está presente en el compartimiento de muestreo, se transfiere al compartimiento de detección y de lectura.

La figura 13 representa una vista en corte según A-A de la figura 3.

La figura 14 representa una vista desde la cara delantera de una tarjeta de reacción según un segundo modo de realización de la presente invención.

La figura 15 representa una vista en perspectiva de varias válvulas asociadas a la tarjeta de reacción.

Finalmente, la figura 16 representa una vista en corte según B-B de la figura 15.

Definiciones

Por ligando, se entiende cualquier especie biológica que puede ser de naturaleza proteica o ácido nucleico, como por ejemplo un antígeno, un fragmento de antígeno, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un hapteno, un ácido nucleico, un fragmento de ácido nucleico, una hormona, una vitamina, un péptido o un polipéptido.

Un ejemplo de pretratamiento, puede estar constituido por una lisis celular, tal como se describe en las solicitudes de patente del solicitante:

- FR99/04289, presentada el 1 de abril de 1999, sobre la lisis por sonicación,

- PCT/FR99/01309, presentada bajo prioridad del 23 de julio de 1998, sobre la lisis mixta magnética y mecánica,

- PCT/FR99/00830, presentada bajo prioridad del 10 de abril de 1998, sobre la lisis eléctrica, y

- PCT/IB98/01475, presentada bajo prioridad del 23 de septiembre de 1997, sobre la lisis mecánica.

Un ejemplo de postratamiento, puede estar constituido por una detección por medio de un biochip. Por biochip, se entiende cualquier soporte sólido sobre el cual están fijados ligandos, y en particular por un chip de ADN, se entiende cualquier soporte sólido sobre el cual están fijados ácidos nucleicos. El método de fijación de los ligandos puede realizarse de diferentes maneras y especialmente mediante adsorción o covalencia como por ejemplo la síntesis in situ mediante las técnicas de fotolitografía o mediante un sistema piezoeléctrico, mediante deposición capilar de ligandos preformados. A título de ilustración, ejemplos de estos biochips aplicados a los chips de ADN se dan en las publicaciones de G. Ramsay, Nature Biotechnology, 16, p 40-44, 1998; F. Ginot, Human Mutation, 10, p 1-10, 1997; J. Cheng et al, Molecular diagnosis, 1(3), p 183-200, 1996; T. Livache et al, Nucleic Acids Research, 22(15), p 2915-2921, 1994; J. Cheng et al, Nature Biotechnology, 16, p 541-546, 1998 o en las patentes US 4981783 (Augenlicht), US 5700637 (Southern), US 5445934 (Fodor), US 5744305 (Fodor), US 5807522 (Brown).

A constituyentes estructurales que permiten la amplificación cuando se asocian a los constituyentes funcionales definidos a continuación, cabe dar la siguiente definición: nucleótidos (desoxirribonucleótidos dNTP y/o ribonucleótidos NTP), al menos un par de cebadores que encuadran regiones específicas que se desea amplificar, iones (por ejemplo MgCl_{2}, KC1) y un tampón (tal como el Tris).

Los constituyentes funcionales están formados por al menos una enzima, preferiblemente por dos o tres enzimas, en presencia de un tampón, tal como Tris de pH 7,5, sales e iones que permiten la reacción de amplificación cuando se asocian a los constituyentes estructurales definidos anteriormente.

Por amplicones, hay que comprender productos de una reacción de amplificación enzimática.

Descripción de la tarjeta de reacción

La presente invención se refiere a una tarjeta 1 de reacción representada en un primer modo de realización en la figura 1. Esta tarjeta 1 de reacción está constituida por un paralelepípedo rectángulo que comprende una cara 62 delantera y una cara 63 trasera unidas entre sí, por un reborde, igualmente denominado canto 68. En esta figura se representa por tanto en trazos continuos, el conjunto de los elementos que constituye la cara 62 delantera. Se observa entre otras cosas, cierto número de canales 64 que desembocan al nivel de esta cara 62. Estos canales 64 son tabicados mediante una película 65 transparente, pegada sobre dicha cara 62 delantera. No obstante, no es obligatorio que esta película 65, como las que se describirán a continuación, sea transparente, podría ser opaco translúcido, etc. La naturaleza transparente permite sin embargo visualizar mejor eventualmente la posición de una disolución 69 biológica que ha de probarse, o cualquier otra disolución 70, 71 ó 72, introducida en la tarjeta 1. La cara 63 trasera comprende igualmente una película transparente con número de referencia 66 que tabica los canales 64, que en algunos sitios afloran al nivel de esta cara 63 trasera. Estas películas 65 y 66 están constituidas por películas BOPP (Biaxially Oriented PolyPropylen, polipropileno orientado biaxialmente) u otras películas de la misma naturaleza, que están soldadas o pegadas sobre el cuerpo de la tarjeta 1, siendo este cuerpo inerte con respecto a las disoluciones 69 a 72 transferidas y a las reacciones que experimentan.

Esta película 66 puede estar presente sobre toda la superficie de la tarjeta 1, o sobre algunas porciones de dicha tarjeta 1. Sin embargo, esta película 66 puede estar constituida por una pared realizada con el mismo material que el resto del cuerpo de la tarjeta 1.

Se observa igualmente que la cara 63 trasera está dotada de un cierto número de válvulas, con números de referencia 11 a 35 e igualmente 61 en la figura; estas válvulas 11 a 35 y 61 corresponden a las válvulas descritas en la solicitud de patente FR99/08116 presentada el 22 de junio de 1999 en nombre del solicitante. A semejanza de este documento, el conjunto de las válvulas 11 a 35 y 61 está delimitado con respecto al exterior de la cara 63 trasera por una película 67 transparente. Ésta es de una naturaleza lo suficientemente flexible como para permitir el paso de una disolución 69 que ha de probarse, de una disolución 70 tratada, de un líquido 71 de lavado, de un líquido 72 de elución, etc. Puede estar constituida por una membrana de silicona o por una película compleja PE/PET (PolyEthylen/PolyEthylen Tetraphtalate, polietileno, polietileno tetraftalato).

Cabe señalar que las películas 66 y 67 transparentes situadas al nivel de la cara 63 trasera, pueden estar constituidas por una sola y la misma película transparente. Permitiendo esto facilitar la fabricación de la tarjeta 1. Además, la película 65 transparente situada al nivel de la cara 62 delantera, y las películas 66 y 67 transparentes situadas al nivel de la cara 63 trasera, pueden estar constituidas por una sola y la misma película transparente, lo que facilita aún más la fabricación de tal tarjeta 1 así dotada.

En esta cara 63 trasera, se observa igualmente la presencia de varios filtros 48 y 49 hidrófobos cuyo papel se expondrá a continuación. De hecho, hay, en este modo de realización de la tarjeta de la figura 1, dos vías paralelas. Una vía izquierda y una vía derecha que permiten efectuar el mismo procedimiento. Sin embargo es perfectamente posible tener únicamente una sola vía o una pluralidad, es decir superior a dos, según el número de reacciones que se desea efectuar.

Se observa finalmente sobre la periferia de la tarjeta 1, y de manera más precisa sobre los dos lados de pequeñas dimensiones, que están presentes entradas y salidas, que están claramente separadas entre sí. Por tanto, en la parte superior de esta figura 1, se representan cuatro entradas que corresponden a cuatro funciones claramente definidas. Por tanto, si se enumeran las funciones de entradas de la izquierda hacia la derecha, se observa la presencia de una entrada 2 del líquido 71 de lavado, de una entrada 3 de la disolución 69 que ha de probarse, de una entrada 4 del líquido 72 de elución, y finalmente de una entrada para la variación de presión 5 en el interior de dicha tarjeta 1. El conjunto de estas entradas 2 a 5 está unido a una válvula 6 de bola de entrada mediante cierto número de canales 64 así como las válvulas 11 y 12 primera y segunda.

En el lado opuesto, el otro lado de la tarjeta 1 comprende dos salidas 7 y 8. La primera salida, denominada salida 7 de la disolución 70 tratada, es una salida que permite la evacuación de una cantidad predeterminada de la disolución 70 tratada hacia el exterior con vistas a un análisis posterior o de cualquier otro tratamiento posterior. La segunda salida es una salida para el conjunto de los residuos biológicos y líquidos procedentes del funcionamiento de la tarjeta 1. La salida 7 se asocia a una válvula de bola de salida hacia el exterior mientras que la salida de los residuos se asocia a un válvula 9 de bola de salida hacia el exterior mientras que la salida de los residuos está asociada a una válvula 10 de bola de salida de los residuos.

Además de las dos partes, entradas 2 a 5 en posición superior y salidas 7 y 8 en posición inferior, se observa igualmente cierto número de canales, válvulas y compartimientos entre estas dos partes extremas. Como eso ya se ha señalado, se observa igualmente la presencia de dos vías separadas idénticas a la izquierda y a la derecha de la figura 1. El primer compartimiento en posición superior y en forma de C invertida sobre la vía de la izquierda y en forma de C sobre la vía de la derecha, es de gran tamaño y constituye un compartimiento 36 de dosificación de la disolución. Este compartimiento 36 encierra en su interior un compartimiento 37 de dosificación de líquido de elución, compartimiento 37 que es de forma similar pero de un volumen diferente. De hecho la relación existente entre el volumen del compartimiento 36 de dosificación de la disolución y el volumen de compartimiento 37 de dosificación de líquido de elución está comprendido entre 1 a 1 hasta 10 a 1, preferiblemente entre 1,5 a 1 hasta 4 a 1 y aún más preferiblemente de 2 a 1.

En posición subyacente está presente un compartimiento 38 de separación, que permite la recogida de entidades de captura, tales como partículas magnéticas, eventualmente revestidas de oligonucleótidos de captura, por adsorción o covalencia (véase a este respecto las patentes US-A-4.672.040 y 5.750.338), y así, después de la mezcla, la selección por separación de los ácidos nucleicos que se desea amplificar posteriormente. Las partículas magnéticas se encuentran en el interior de este compartimiento 38 de separación bajo la forma de una pastilla 39 de partículas magnéticas. Un modo de realización particularmente interesante de estas partículas magnéticas se describe en las solicitudes de patente presentadas por el solicitante con las siguientes referencias:

- PCT/FR97/00912 bajo prioridad francesa del 24 de mayo de 1996, y

- PCT/FR99/00011 bajo prioridad francesa del 6 de enero de 1998.

En la última de estas solicitudes de patente, se trata de partículas magnéticas termosensibles que tienen cada una un núcleo magnético recubierto de una capa intermedia. La capa intermedia está a su vez recubierta por una capa externa a base de un polímero susceptible de interaccionar con al menos una molécula biológica, el polímero externo es termosensible y presenta una temperatura crítica inferior de solubilidad (LCST) predeterminada comprendida entre 10 y 100°C y preferiblemente entre 20 y 60°C. Esta capa externa se sintetiza a partir de monómeros catiónicos, que generan un polímero que tiene la capacidad de unir los ácidos nucleicos. Esta capa intermedia aísla las cargas magnéticas del núcleo, con el fin de evitar los problemas de inhibición de las técnicas de amplificación de estos ácidos nucleicos. Partículas magnéticas en forma de pastillas ya se describieron en el estado de la técnica, constituido por el documento EP-A- 0.811.694, por ejemplo. La fabricación de las pastillas en general se describe claramente también en el estado de la técnica, por ejemplo los documentos US-A-4.678.812 y US-A- 5.275.016. Esta fabricación anteriormente mencionada podrá usarse para la síntesis de las otras pastillas que se expondrán a continuación.

En posición subyacente, está presente un compartimiento de recogida de los constituyentes estructurales que permiten posteriormente la amplificación. Este compartimiento 40 contiene también una pastilla 41 que comprende constituyentes que permitirán la amplificación posterior. Constituyentes en forma de pastillas, para realizar una amplificación, ya se describieron en el estado de la técnica. Es posible encontrar información en los siguientes documentos: la patente US-A-5.098.893 o el artículo "Ambiant-temperature-stable molecular biology reagents" R. Ramanujam et al., Product Application Focus, Vol. 14, No. 3 (1993), 470-473, por ejemplo.

Aún en posición subyacente está presente un compartimiento 42 de amplificación que comprende una pastilla 43 que contiene constituyentes funcionales, tales como enzimas que, asociados con los constituyentes estructurales anteriormente citados, van a permitir realmente llevar a cabo una amplificación. Enzimas en forma de pastillas, para realizar una amplificación, ya se describieron en el estado de la técnica. Es posible encontrar información en los siguientes documentos: la patente US-A-4.891.319, WO-A-87/00196, WO-A-95/33488 o el artículo "Extraordinary stability of enzymes dried in trehalose: simplified molecular biology" de C. Colago et al., Bio/Technology, Vol. 10, Septiembre de 1992, 1007-1011.

Pueden usarse todas las técnicas de amplificación. Por tanto, para la amplificación de los ácidos nucleicos, existen entre otras las siguientes técnicas:

- PCR (Polymerase Chain Reaction, reacción en cadena de la polimerasa), tal como se describe en las patentes US-A-4.683.195, US-A-4.683.202 y US-A-4.800.159,

- LCR (Ligase Chain Reaction, reacción en cadena de la ligasa), expuesta por ejemplo en la solicitud de patente EP-A-0.201.184,

- RCR (Repair Chain Reaction, reacción en cadena de reparación), descrita en la solicitud de patente WO-A-90/01069,

- 3SR (Self Sustained Sequence Replication, replicación de secuencia autosostenida) con la solicitud de patente WO-A-90/06995,

- NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification, amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos) con la solicitud de patente WO-A-91/02818,

- SPSR (Single Primer Sequence Replication, replicación de secuencia con un único cebador) con la patente S-A-5.194.370, y

- TMA (Transcription Mediated Amplification, amplificación mediada por transcripción) con la patente US-A-5.399.491.

No obstante es posible efectuar otras etapas en el compartimiento 42 anterior. Por ejemplo, estos cebadores pueden eventualmente contener un marcador fluorescente que permita la detección posterior de los productos de amplificación, sin tener que efectuar una etapa suplementaria para el marcado. Por tanto, tales cebadores se describen en el artículo de D. Whitcombe et al., "Detection of PCR products using self-probing amplicons and fluorescence", Nature Biotechnology (17) 1999, 804 y siguientes, o en las solicitudes de patente GB-A-2.338.301, WO-A-99/29905 y WO-A-99/60157.

Por debajo del compartimiento 42 de amplificación, está presente un compartimiento 44 de muestreo que va a permitir separar en dos, el volumen de la disolución 70 tratada presente en dicho compartimiento 42 de amplificación. Este compartimiento 44 de muestreo está destinado de hecho a recibir una cantidad predeterminada de dicha disolución 70 tratada. Transfiriéndose el resto de la disolución 70 a continuación a un compartimiento 47 de convergencia situado en posición inferior de dicha tarjeta 1, pero en posición superior con respecto a los medios de salida de los líquidos que estén asociados a la disolución 70 tratada o a los residuos. El compartimiento 47 de convergencia contiene por tanto una sola disolución que contiene el conjunto de las disoluciones amplificadas que tienen o bien que experimentar otros tratamientos en la misma tarjeta, o bien que transferirse a otro dispositivo para permitir su análisis. Esta disolución única procede del conjunto de las vías que constituye la tarjeta 1, es decir en el caso presente, la vía izquierda y la vía derecha.

Cuando los productos de amplificación contenidos en el compartimiento 47 de convergencia se transfieren hacia otro dispositivo para permitir su análisis, esto puede efectuarse mediante un tubo, tal como se describe en las figuras 8 a 11 de la solicitud PCT/FR99/02137 presentada el 8 de septiembre de 1999 por el solicitante. Este otro dispositivo puede estar constituido por un soporte que comprende por ejemplo sobre una de sus caras sondas de captura de fuerte densidad, por ejemplo los chips de ADN diseñados por la empresa Affymetrix ("Accessing Genetic Information with High-Density DNA arrays", M. Shee et al., Science, 274, 610-614. "Light-generated oligonucleotide arrays for rapide DNA sequence analysis", A. Caviani Pease et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 5022-5026), o cualquier otro sistema de chips que comprenda ácidos nucleicos fijados sobre un soporte sólido, como los chips de ADN definidos anteriormente.

La alícuota presente en el compartimiento 44 de muestreo va a transferirse a continuación hacia un compartimiento 45 de detección y de lectura. En este compartimiento 45 está presente una pastilla que contiene medios 45a de detección. Basándose en los documentos del estado de la técnica anteriormente mencionados, es posible fabricar por ejemplo pastillas 45a que contienen ácidos nucleicos marcados complementarios de todos o parte de los amplicones que deben obtenerse durante las etapas anteriores.

Como eso se ha descrito anteriormente es igualmente posible efectuar el marcado durante la amplificación mediante cebadores marcados. En este caso, ya no se necesita tener una pastilla 45a, y el compartimiento 45 sólo es un sencillo compartimiento de lectura. Este compartimiento 45 de marcado y de lectura comprende por tanto una pastilla 45a de marcadores a su entrada y una célula 46 de lectura aguas arriba. Esta célula 46 de lectura permite detectar, por ejemplo mediante medida de fluorescencia, si la amplificación efectivamente se ha realizado. Si este es el caso, esto permite al manipulador o al autómata que utiliza tal tarjeta 1, saber si se necesita transferir la disolución 70 tratada, presente en el compartimiento 47 de convergencia hacia medios de análisis de las secuencias amplificadas, pudiéndose integrar estos medios en la tarjeta 1 o estar contenidos en otro dispositivo más particularmente destinado a esta función.

Los movimientos de líquidos en el interior de la tarjeta 1 sea cual sea la disolución 69 que ha de probarse, la disolución 70 tratada, el líquido 71 de lavado o el líquido 72 de elución 72 se realizan mediante filtros hidrófobos que están presentes aguas abajo de ciertas válvulas. Cada película 48 ó 49 hidrófoba comprende cierto número de filtros de retención, con números de referencia 50 a 55 para la película 48 ó 56 a 60 para la película 49. Su uso se describirá posteriormente.

Descripción de las válvulas

Como se describe en la solicitud de patente FR99/08116 presentada el 1999 por el solicitante, las válvulas 11 a 35 y 61 tienen una estructura que permite responder a los problemas de soldadura de películas sobre un soporte sólido, tal como el cuerpo de una tarjeta 1 de reacción, generalmente constituido por materiales plásticos. Esta invención encuentra una aplicación particularmente interesante en la tarjeta 1 según la presente invención, así el cuerpo de dicha tarjeta 1 comprende en un cierto lugar una ranura o hendidura 74 de forma periférica, claramente representada en la figura 16, que va a recibir en la zona circunscrita una parte de la película 67 transparente que es flexible, dichas películas 67, cuatro en la figura 1, y el cuerpo de la tarjeta 1, siendo solidarios entre sí mediante una soldadura 84 situada en el fondo de la ranura 74. Por eso, la soldadura no genera ninguna deformación de la superficie superior de la tarjeta 1 y por tanto ningún problema posterior para usar dicha tarjeta 1 y efectuar análisis. La manipulación de estas válvulas 11 a 35 y/o 61 puede realizarse mediante la acción de electroimanes o de gatos de dimensiones adaptadas tal como se representa en las figuras 15 y 16.

Funcionamiento de la tarjeta

En la descripción que sigue la referencia que se hará a las válvulas 11 a 35 y 61, sólo se referirá a las válvulas 11 a 35 de la vía de la izquierda, en el caso de que no se precise ninguna precisión sobre la vía en cuestión. Cualquier información sobre las válvulas 11 a 35 y 61 de la vía de la derecha tendrán su posición sobre esta vía de la derecha precisada. Por otra parte, conviene subrayar que cuando una válvula 11 a 35 está cerrada, es o bien el orificio de la izquierda, denominado orificio exterior, o bien el orificio de la derecha, denominado orificio interior, de dicha válvula 11 a 35 el que está tapado. Eso se cumple también para la vía de la derecha y para las válvulas 11 a 35 y 61, pero la posición se invierte. Por tanto, el orificio de la derecha se denomina orificio exterior, y el orificio de la izquierda se denomina orificio interior, de dicha válvula 11 a 35 o 61.

Finalmente, las válvulas 11 a 35 y 61 están normalmente en reposo en posición abierta. Durante la transferencia de un fluido, líquido o gas, son las válvulas que están cerradas las que van a orientar este fluido.

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1ª etapa

Dosificación de la disolución que ha de probarse

En esta primera etapa, el funcionamiento del conjunto de los constituyentes se expondrá en detalle. Esto se hará en menor medida posteriormente, sin embargo las grandes funciones serán iguales, y será fácil extrapolar la información de esta primera etapa para las etapas posteriores.

Se introduce en la tarjeta 1 la disolución 69 que ha de probarse a través de la entrada 3, según F2. La disolución 69 toma el canal 64 entre la entrada 3 y la primera válvula 11 que está abierta. Por eso, dicha disolución 69 puede pasar al nivel de la segunda válvula 12 que está cerrada al nivel de su orificio exterior, lo que impide que esta disolución 69 tome el canal 64 que vuelve hacia la entrada 2 y dirige dicha disolución 70 hacia la válvula 6 de bola de entrada que está por su parte abierta. De esta válvula 6 de bola parten dos canales 64 uno hacia la vía de la izquierda el otro hacia la vía de la derecha. El canal que va hacia la vía de la derecha está tapado mediante cierre del orificio interior de la segunda válvula 12 de la vía de la derecha. El canal que va hacia la vía de la izquierda, por su parte, permite el paso de la disolución 69 que ha de probarse porque la tercera válvula 13 y la séptima válvula 17 están abiertas. El objetivo es permitir el rellenado del compartimiento 36 de dosificación de dicha disolución 69 según la figura 2, por eso el orificio interior de la cuarta válvula 14 y el orificio exterior de la octava válvula 18 están cerrados, es igualmente el caso del orificio exterior de la cuarta válvula 14 de la vía de la derecha.

Si se desea rellenar igualmente el compartimiento 36 de dosificación de la disolución 69 que ha de probarse de la vía de la derecha, conviene cerrar el orificio interior de la cuarta válvula 14 de la vía de la derecha, lo que deja el orificio exterior de esta válvula 14 abierto de modo que el rellenado del compartimiento 36 es posible, mientras que el del compartimiento 37 de dosificación del líquido 72 de elución no es posible. Conviene igualmente cerrar el orificio exterior de la válvula 61 intermedia y el orificio exterior de la octava válvula 18 de la vía de la derecha.

Para dar más detalles sobre el mero rellenado del compartimiento 36 de la vía de la izquierda, la disolución 69 que ha de probarse va a poder rellenar todos los canales 64 desde la entrada 3 hasta el filtro 51 de retención de dicha disolución 69. Este filtro 51 de retención está colocado en la prolongación del orificio exterior de la séptima válvula 17. Está constituido por una parte por el primer filtro 48 hidrófobo, lo que permite el paso de fluido gaseoso pero no de fluido líquido. Un material interesante para constituir este filtro hidrófobo es una membrana VERSAPOR 200R fabricada por la empresa americana GELMAN SCIENCES (USA). Es la configuración de la figura 2. Cuando se ha usado este tipo de filtro una vez, no puede usarse una segunda vez.

A continuación con el fin de dosificar exactamente el volumen de la disolución 69 presente en el compartimiento 36 de dosificación, cuyo volumen es de 100 \mul, va a purgarse los canales 64. Para eso, se introduce según F1 un líquido 71 de lavado por la entrada 2. En este caso se cierra las siguientes válvulas:

- el orificio interior de la primera válvula 11,

- el orificio interior de la tercera válvula 13,

- el orificio interior de la cuarta válvula 14,

- el orificio interior de la octava válvula 18,

- el orificio interior de la decimocuarta válvula 24,

- el orificio interior de la decimoquinta válvula 25,

- el orificio interior de la segunda válvula 12 de la vía de la derecha,

- el orificio interior de la tercera válvula 13 de la vía de la derecha,

- el orificio interior de la cuarta válvula 14 de la vía de la derecha,

- el orificio interior de la octava válvula 18 de la vía de la derecha,

- el orificio interior de la decimocuarta válvula 24 de la vía de la derecha, y

- el orificio interior de la decimoquinta válvula 25 de la vía de la derecha.

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Una vez que se ha efectuado el lavado, se reemplaza el líquido 71 de lavado presente en los canales 64 por un fluido gaseoso inerte, por ejemplo aire. En este caso, se inyecta aire a presión por la entrada 5 según F4. Las válvulas cerradas son entonces idénticas, con la excepción de las siguientes características:

- reapertura del orificio interior de la primera válvula 11,

- cierre del orificio interior de la segunda válvula 12,

- cierre del orificio interior de la primera válvula 11 de la vía de la derecha, y

- reapertura del orificio interior de la segunda válvula 12 de la vía de la derecha.

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En esta configuración, el resultado obtenido es el que se representa en la figura 3. La disolución 69 que ha de probarse, que estaba presente al nivel de los canales 64, se evacuó por tanto por la salida de los residuos 8 según F6. Además, los canales 64 están limpios, únicamente la porción de canal 64 entre la entrada 2 y el orificio interior de la segunda válvula 12 contiene líquido 71 de lavado, que podrá usarse posteriormente. Por supuesto, es necesario entonces que las válvulas 6 de bola de entrada y de salida de los residuos 10 estén abiertas.

Puede por supuesto repetirse este lavado varias veces. No obstante este resultado puede obtenerse sin efectuar el lavado. En este caso, conviene únicamente empujar los restos de la disolución 69 situados en los canales 64 por la entrada 5 de aire según F4. El resultado será idéntico con una única diferencia, no habrá líquido 71 de lavado entre la entrada 2 y el orificio exterior de la segunda válvula 12, y el líquido 71 de lavado presente entre el orificio interior de la segunda válvula 12 y la válvula 6 de bola de entrada será sustituido por disolución 69 que ha de probarse. Esta posibilidad es por tanto menos interesante, aunque sea posible, porque quedará en la tarjeta 1 disolución 69 susceptible de cruzar la válvula 6 de bola tan pronto como se introduzca líquido 71 de lavado según F1.

En los dos casos que acaban de comentarse, es posible desnaturalizar los ácidos nucleicos presentes en este compartimiento 36. Para esto, se calienta a una temperatura comprendida entre 80 y 100°C.

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2ª etapa

Separación de los ácidos nucleicos contenidos en la disolución que ha de probarse

En esta segunda etapa, la disolución 69 que ha de probarse, que acaba de dosificarse y está presente en el compartimiento 36, se transfiere al compartimiento siguiente, denominado 38 de separación. Entonces se va a empujar la disolución 69 que ha de probarse presente en el compartimiento 36 hacia el compartimiento 38 de separación, por la introducción en la red de canales 64 de un fluido inerte, tal como aire, por la entrada 5 según F4. En este caso las válvulas cerradas son las siguientes:

- el orificio interior de la segunda válvula 12,

- el orificio interior de la cuarta válvula 14,

- uno de los orificios de la sexta válvula 16,

- el orificio interior de la octava válvula 18,

- el orificio interior de la undécima válvula 21,

- el orificio exterior de la decimoquinta válvula 25

- el orificio interior de la primera válvula 11 de la vía de la derecha, y

- el orificio exterior de la cuarta válvula 14 de la vía de la derecha.

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Como información el cierre de una válvula puede no ser obligatorio, si el cierre de otra válvula aguas arriba o aguas abajo tiene el mismo efecto. Por tanto, la sexta válvula 16 podría estar abierta. En este caso, convendrá cerrar el orificio interior de la quinta válvula 15.

La transferencia de la disolución 69 dosificada se obtiene tal como se representa claramente en la figura 4 y se hace posible por la presencia en relación con este compartimiento 38 con un filtro 52 de retención que está unido a una derivación 73 en posición intermedia a lo largo de dicho compartimiento 38. Estando este filtro 52 en relación con la décima válvula 20, el aire presente aguas abajo de dicha disolución 69 puede escaparse por este filtro 52 de retención. Cuando la disolución 69 alcanza el filtro 52 de retención, a través de la derivación 73, la progresión de dicha disolución 69 se detiene. Además, el volumen total de esta disolución 69 es inferior al volumen de dicho compartimiento 38 aguas arriba de dicha derivación 73 y estará por tanto claramente circunscrito en esta parte aguas arriba del compartimiento 38.

Se observa que en esta posición la disolución 69 dosificada todavía no ha alcanzado la pastilla 39 de partículas magnéticas, que está a su vez situada aguas abajo de la derivación.

En esta posición, el volumen de aire aguas abajo de dicha disolución 69 que ha de probarse está aprisionado pero sigue siendo en un volumen importante. A continuación es posible forzando la entrada de aire según F4 comprimir el aire aprisionado. Cuando se hacen varios movimientos de vaivén, la disolución 69 va a permitir disolver la pastilla 39 de partículas magnéticas, partículas que estarán presentes de forma homogénea en esta nueva disolución 70, denominada disolución 70 tratada, nombre que se le dará en lo sucesivo sea cual sea el estadio de tratamiento en el que se encuentra (partículas magnéticas, constituyentes estructurales, constituyentes funcionales, amplicones) a partir del momento en que el líquido de base usado es la disolución 69 que ha de probarse. Además, para el líquido 71 de lavado que se describirá más adelante, cuando este líquido 71 de lavado ha cumplido su función y contiene residuos que hay que evacuar, su referencia no se modifica. Por otra parte, para el líquido 72 de elución que se describirá igualmente más adelante, cuando el líquido 72 de elución recoge los constituyentes estructurales, constituyentes funcionales, amplicones u otros, este líquido se denomina entonces líquido 70 tratado.

El movimiento de vaivén anteriormente expuesto, y que se explicará igualmente a continuación en relación con el líquido 71 de lavado y de elución 72, es posible por la configuración del compartimiento 38 de separación. Por tanto este compartimiento 38 es de un volumen más importante que el volumen de líquido 69 que ha de probarse introducido, de modo que el líquido 69 circunscrito aguas abajo un volumen de aire que está aprisionado. Por eso, cuando se empuja dicho líquido 69 mediante un aumento de presión aguas arriba, o bien mediante un empuje debido a dicho líquido 69 propiamente o bien mediante un aumento de la presión de aire mediante introducción de un exceso gaseoso al nivel de la entrada 5, y relajando a continuación este empuje, es posible efectuar un movimiento de vaivén al nivel de la pastilla 39 de partículas magnéticas. Este movimiento optimiza así poner o volver a poner en suspensión de dichas partículas magnéticas.

A este respecto, la relación existente entre el volumen del compartimiento 38 aguas arriba de la derivación 73 y el volumen de dicho compartimiento 38 aguas abajo de dicha derivación 73 está comprendido entre 1 a 2 y 1 a 5, preferiblemente es de 1 a 3. La relación entre el volumen de dicha disolución 70 y el volumen del compartimiento 38 aguas abajo de esta disolución 70 es por tanto sensiblemente igual o inferior. En el caso de que esta relación sea inferior, está por ejemplo comprendida entre 1 a 2,5 y 1 a 6, preferiblemente es de 1 a 3,5. Por las relaciones mencionadas anteriormente, en el ejemplo descrito en las figuras siendo el volumen total del compartimiento 36 de dosificación de 50 \mul, el compartimiento 38 de separación es por tanto de 150 \mul.

Las partículas magnéticas tienen la propiedad de unir específicamente los ácidos nucleicos. Para eso, hay que someter la mezcla de disolución 69 que ha de probarse y las pastillas 39 de partículas magnéticas a una temperatura o un ciclo de temperaturas que puede estar comprendido entre 25 y 60°C. A continuación se procede a una separación magnética de las partículas contra al menos una de las películas 65 y/o 66 transparentes que tabican la tarjeta al nivel de su cara 62 delantera y/o trasera 63, al nivel del compartimiento de separación. La separación magnética de las partículas magnéticas tiene lugar antes de que la disolución 70 tratada se evacue según F6.

Eventualmente, estas etapas de dosificación de disolución 70 tratada y la separación de los ácidos nucleicos pueden reiterarse N veces, estando comprendido N entre 1 y 10, con el fin de tratar volúmenes de disolución 70 tratada superiores al volumen del compartimiento 38 de separación.

Se procede a continuación al lavado de las partículas magnéticas con el fin de que sólo los ácidos nucleicos buscados sean retenidos. Cuando se introduce líquido 71 de lavado según F1, por la entrada 2, se cierran las siguientes válvulas:

- uno de los orificios de la primera válvula 11,

- el orificio interior de la cuarta válvula 14,

- uno de los orificios de la sexta válvula 16,

- el orificio interior de la octava válvula 18,

- el orificio interior de la duodécima válvula 22,

- uno de los orificios de la decimosexta válvula 26,

- uno de los orificios de la válvula 61 complementaria de la vía de la derecha,

- el orificio interior de la segunda válvula 12 de la vía de la derecha, y

- el orificio exterior de la cuarta válvula 14 de la vía de la derecha.

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El líquido 71 de lavado va por tanto a pasar al compartimiento 38 de separación, donde las partículas magnéticas siempre están imantadas. Se detiene el movimiento de este líquido mediante el filtro 53 de retención, luego se interrumpe la separación magnética y se procede a un movimiento de vaivén con el fin de que dicho líquido 71 de lavado pueda limpiar lo mejor posible las partículas magnéticas portadoras de los ácidos nucleicos.

La separación magnética de las partículas magnéticas se pone de nuevo en práctica antes de que el líquido 71 de lavado se evacue según F6. Las válvulas cerradas son por supuesto idénticas a las usadas durante la evacuación del resto de la disolución 70 que ha de probarse, cuyos ácidos nucleicos han sido capturados por las partículas magnéticas.

Cuando se reintroduce líquido de lavado según F5 para efectuar un segundo lavado, se cierran las mismas válvulas que para el primer lavado, con la excepción del orificio interior de la duodécima válvula 22 que está abierta mientras que es el orificio interior de la decimotercera válvula 23 el que está cerrado. En esta configuración se detiene el movimiento del nuevo líquido 71 de lavado introducido mediante el filtro 54 de retención, unido a la duodécima válvula 22. Se interrumpe la separación magnética y se procede a un movimiento de vaivén con el fin de que dicho líquido 71 pueda limpiar lo mejor posible las partículas magnéticas que llevan ácidos nucleicos.

Una vez que se efectúa el lavado, se reemplaza el líquido 71 de lavado presente en los canales 64 por un fluido gaseoso inerte, por ejemplo aire. En este caso, se inyecta aire a presión por la entrada 5 según F4. El líquido 71 de lavado evacuado sale de la tarjeta 1 por la salida 8 según F6 a través de la válvula 10 de bola de salida de los residuos. Las válvulas cerradas son entonces idénticas, con la excepción de las siguientes características:

- reapertura del orificio interior de la primera válvula 11,

- cierre del orificio interior de la segunda válvula 12,

- cierre del orificio interior de la primera válvula 11 de la vía de la derecha, y

- reapertura del orificio interior de la segunda válvula 12 de la vía de la derecha.

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Esta etapa puede por supuesto realizarse entre las dos etapas de lavado.

Puede por supuesto repetirse este lavado varias veces, estando el líquido 71 de lavado sucio siempre evacuado por la salida 8, a través de la válvula 10 de bola de salida, según F6. En este caso habrá que prever otros filtros de retención entre los filtros 54 y 55 de retención.

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3ª etapa

Recogida de las partículas magnéticas por el líquido de elución

En esta tercera etapa, la disolución 70 que ha de probarse se ha evacuado casi completamente según F6. Sólo permanecen enganchados sobre las partículas magnéticas, los ácidos nucleicos que han sido capturados durante la etapa anterior. Estas partículas magnéticas están siempre presentes porque la separación magnética todavía se efectúa esperando la recogida de los ácidos nucleicos por un líquido 72 de elución, lo que constituye el objetivo de esta etapa.

Previamente conviene bien dosificar el líquido 72 de elución que va a usarse. El volumen que es necesario en el caso presente es de 50 \mul. Hay por tanto una relación de 1 a 2 entre el volumen de la disolución 70 tratada y el volumen del líquido 72 de elución. Sin embargo una relación que varía entre 1 a 1 y 1 a 10 es posible. Ya que esta etapa puede reiterase de 1 a 10 veces, esta relación puede por tanto ir de 1 a 100. La dosificación del volumen de líquido 72 de elución se realiza en el compartimiento 37 de dosificación.

Para esto, se introduce el líquido 72 de elución por la entrada 4, según F3. Dicho líquido 72 toma luego los canales 64 para rellenar el compartimiento 37 de dosificación. Se detiene este movimiento de 72 mediante el filtro 50 de retención.

Las válvulas cerradas son entonces las siguientes:

- el orificio interior de la segunda válvula 12,

- el orificio exterior de la tercera válvula 13,

- el orificio interior de la sexta válvula 16, y

- el orificio exterior de la segunda válvula 12 de la vía de la derecha.

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Esta configuración se representa claramente en la figura 5.

Una vez que se ha efectuado la dosificación del líquido 72 de elución, se reemplaza en los canales 64 por un fluido gaseoso inerte, por ejemplo aire. En este caso, se inyecta aire a presión por la entrada 5 según F4. El líquido 72 de elución evacuado sale de la tarjeta 1 por la salida 8 según F6 a través de la válvula 10 de bola de salida de los residuos. Se obtiene así una tarjeta 1 que tiene una repartición de líquidos tal como se representa en la figura 6. Las válvulas cerradas son entonces las siguientes:

- cierre de uno de los orificios de la primera válvula 11,

- reapertura del orificio exterior de la segunda válvula 12,

- cierre del orificio interior de la octava válvula 18,

- cierre del orificio interior de la decimocuarta válvula 24,

- cierre del orificio interior de la decimoquinta válvula 25,

- reapertura del orificio exterior pero cierre del orificio interior de la tercera válvula 13,

- cierre del orificio interior de la tercera válvula 13 de la vía de la derecha,

- cierre del orificio interior de la cuarta válvula 14 de la vía de la derecha,

- cierre del orificio interior de la octava válvula 18 de la vía de la derecha,

- cierre del orificio interior de la decimocuarta válvula 24 de la vía de la derecha, y

- cierre del orificio interior de la decimoquinta válvula 25 de la vía de la derecha.

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El líquido 72 de elución, que acaba de dosificarse y está presente en el compartimiento 37, se transfiere al compartimiento siguiente, denominado 38 de separación. Por tanto se va a empujar dicho líquido 72 presente en el compartimiento 36 hacia el compartimiento 38 de separación, mediante la introducción en la red de canales 64 de un fluido inerte, tal como aire, por la entrada 5 según F4. El movimiento del líquido 72 de elución se detiene cuando dicho líquido 72 alcanza el filtro 55 de retención. En este caso las válvulas cerradas son las siguientes:

- el orificio interior de la segunda válvula 12,

- el orificio exterior de la tercera válvula 13,

- el orificio exterior de la novena válvula 19,

- uno de los orificios de la decimocuarta válvula 24,

- el orificio exterior de la decimoquinta válvula 25, y

- el orificio interior de la primera válvula 11 de la vía de la derecha.

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La configuración de la tarjeta 1 después del desplazamiento del líquido 72 de elución se representa en la figura 7. En esta posición, dicho líquido 72 de elución permite la recogida de las partículas magnéticas asociadas a los ácidos nucleicos. Es posible en este estadio efectuar una mezcla como se indicó anteriormente con la disolución 70 que ha de probarse y las partículas magnéticas de la pastilla 39.

El líquido 72 de elución, que puede ser un tampón tal como Tris de pH 7,5 y de baja fuerza iónica, va a permitir separar los ácidos nucleicos de las partículas magnéticas, procediendo a una incubación a una temperatura comprendida entre 25 y 60°C. Se va luego a proceder de nuevo a una separación magnética únicamente de las partículas magnéticas, permaneciendo los ácidos nucleicos en suspensión en dicho líquido 72.

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4ª etapa

Transferencia del líquido de elución y recogida de los constituyentes estructurales de la amplificación

Esta cuarta etapa se representa claramente en la figura 8. Las válvulas cerradas son las siguientes:

- el orificio interior de la segunda válvula 12,

- el orificio exterior de la tercera válvula 13,

- el orificio exterior de la novena válvula 19,

- uno de los orificios de la decimocuarta válvula 24,

- el orificio interior de la decimoquinta válvula 25,

- el orificio exterior de la decimoctava válvula 28, y

- el orificio interior de la primera válvula 11 de la vía de la derecha.

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En esta configuración, el líquido 72 de elución que contiene los ácidos nucleicos extraídos de la disolución 70 que ha de probarse se transfiere del compartimiento 38 de separación hacia el compartimiento 40 de recogida de los constituyentes que permiten la amplificación. Se trata aquí de los constituyentes estructurales que permiten esta amplificación. Estos constituyentes se amalgaman y forman una pastilla 41 presente en la entrada del compartimiento 40, de modo que el líquido de elución va a disolver rápidamente la pastilla 41 durante su entrada en este compartimiento 40 y va a arrastrar los constituyentes con él hasta su posición tal como se define en la figura 8.

El volumen de este compartimiento 40 es de 150 \mul, o sea una relación de 1 a 3 con los 50 \mul del líquido 72 de elución. Sin embargo esta relación puede ser desde 1 a 2 hasta 1 a 5. Esta relación permite el desplazamiento de dicho líquido 72 que contiene los ácidos nucleicos y que está cargado de constituyentes estructurales, lo que facilita la mezcla.

La transferencia se efectúa bajo la acción de un aumento de la presión en el interior de la tarjeta 1 aguas arriba del líquido 72 de elución. Este aumento de presión se realiza inyectando por la entrada 5 aire o cualquier otro fluido gaseoso inerte según F4.

El líquido 72, que contiene por una parte los ácidos nucleicos y por otra parte los constituyentes estructurales de la amplificación, va a ser detenido por el filtro 56 de retención asociado a la decimoséptima válvula 27.

Durante esta etapa, el orificio interior de la decimosexta válvula 26 y el orificio interior de la decimoséptima válvula 27 están cerrados cuando dicho líquido 72 está en este compartimiento 40. Se incuba con una duración de 1 a 15 minutos a una temperatura comprendida entre 30 y 65°C, lo que permite la fijación de los cebadores sobre los ácidos nucleicos correspondientes. Luego se ajusta la temperatura a un valor comprendido entre 37 y 42°C. Como se expuso anteriormente, el líquido resultante de esta 4ª etapa, que contiene esencialmente el líquido 72 de elución y los constituyentes estructurales aptos en algunas condiciones para permitir la amplificación, se denomina disolución o líquido 70 tratado.

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5ª etapa

Transferencia del líquido tratado y recogida de los constituyentes funcionales de la amplificación

Esta quinta etapa se representa claramente en la figura 9. Las válvulas cerradas son entonces las siguientes:

- el orificio interior de la segunda válvula 12,

- el orificio exterior de la tercera válvula 13,

- el orificio interior de la novena válvula 19,

- el orificio interior de al menos una de las válvulas 20, 21, 22 y/o 23 y/o uno de los orificios de la decimocuarta válvula 24,

- el orificio interior de la decimoquinta válvula 25,

- el orificio interior de la vigésimo cuarta válvula 34, y

- el orificio interior de la primera válvula 11 de la vía de la derecha.

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En esta configuración, el líquido 72 de elución, que contiene los ácidos nucleicos y los constituyentes estructurales aptos para permitir una amplificación, denominado disolución 70 tratada, se transfiere del compartimiento 40 de recogida de los constituyentes estructurales que permiten la amplificación hacia el compartimiento 42 de recogida de los constituyentes funcionales que permiten esta misma amplificación. El movimiento de dicha disolución 70 tratada es detenido por el filtro 59 de retención.

Estos constituyentes funcionales contienen esencialmente enzimas que permiten la amplificación. La naturaleza y el número de estas enzimas y de los otros constituyentes está en función de la técnica de amplificación que se elija. Estos constituyentes se amalgaman y forman una pastilla 43 presente en la entrada del compartimiento 42, de modo que la disolución 70 tratada va a disolver rápidamente la pastilla 43 durante su entrada en este compartimiento 42 y va a arrastrar los constituyentes con él hasta su posición tal como se define en la figura 9. Esta posición sólo es una posición intermediaria momentánea porque la presión según F4 va a permitir posteriormente transferir el líquido 72 de elución que contiene los constituyentes estructurales y funcionales que permiten realizar la amplificación, según, por supuesto, otra configuración de las válvulas.

La transferencia es idéntica a la de la cuarta etapa, se efectúa por tanto bajo la acción de un aumento de la presión en el interior de la tarjeta 1 aguas arriba del líquido 70 tratado. Este aumento de presión se realiza inyectando por la entrada 5 aire o cualquier otro fluido gaseoso inerte según F4. Hay igualmente la misma relación de 1 a 3 entre el volumen de líquido 70 y el volumen del compartimiento 42, con el mismo efecto de mezcla por vaivén ya descrito anteriormente.

Durante esta etapa, el orificio interior de la decimoctava válvula 28 y el orificio interior de la decimonovena válvula 29 están cerrados cuando dicho líquido 70 está en este compartimiento 42. Se calienta durante 30 a 90 minutos a una temperatura comprendida entre 30 y 75°C, preferiblemente entre 37 y 42°C, si se desea efectuar una amplificación isoterma como las técnicas NASBA, TMA, 3SR, SBA. Para efectuar una PCR, conviene cambiar de temperaturas varias veces quedando en el intervalo de temperatura 30 a 100°C, con el fin de poder realizar varios ciclos sucesivos de amplificación.

Debe observarse que estas etapas cuarta y quinta pueden asociarse en una sola etapa. La única condición entonces es usar enzimas estables a una temperatura superior o igual a 50°C, denominadas termoestables.

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6ª etapa

Transferencia del líquido tratado en el compartimiento de muestreo, en el compartimiento de detección y de lectura y en el compartimiento de convergencia

Durante esta sexta etapa que se representa claramente en las figuras 10 a 12, se producen tres fases sucesivas. Estas fases son las siguientes:

- la transferencia de una primera parte del líquido 70 tratado, es decir sensiblemente 20 \mul, que contiene o que no contiene el producto de amplificación, desde el compartimiento 42 de recogida de los constituyentes funcionales hacia el compartimiento 44 de muestreo, lo que corresponde a la figura 10,

- la transferencia de una segunda parte del líquido 70 tratado, correspondiente al resto de dicho líquido 70, o sea sensiblemente 30 \mul, desde el compartimiento 42 de recogida de los constituyentes funcionales hacia el compartimiento 47 de convergencia, lo que corresponde a la figura 11, y

- la transferencia de esta parte de dicho líquido 70 tratado desde el compartimiento 44 de muestreo hacia el compartimiento 45 de detección y de lectura, lo que corresponde a la figura 12.

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Según la figura 10, las válvulas cerradas son las siguientes:

- el orificio interior de la segunda válvula 12,

- el orificio exterior de la tercera válvula 13,

- el orificio exterior de la novena válvula 19,

- el orificio interior de al menos una de las válvulas 20, 21, 22 y/o 23 y/o uno de los orificios de la decimocuarta válvula 24,

- el orificio interior de la decimoquinta válvula 25,

- el orificio exterior de la vigésimo primera válvula 31

- el orificio interior de la vigésimo cuarta válvula 34, y

- el orificio interior de la primera válvula 11 de la vía de la derecha.

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Esta transferencia permite dosificar de manera precisa una alícuota de sensiblemente 20 \mul de disolución 70 tratada, que va a transferirse a continuación al compartimiento 45 de detección y de lectura. Durante esta fase, el líquido 70 se detiene en su movimiento por la presencia de un filtro 57 de retención, al nivel del compartimiento 45 de detección y de lectura, y de un filtro 59 de retención, aguas abajo del compartimiento 47 de convergencia.

Según la figura 11, las válvulas cerradas son idénticas a la fase anterior. Sólo existen las diferencias siguientes:

- apertura del orificio interior de la vigésimo cuarta válvula 34,

- cierre del orificio interior de la vigésimo quinta válvula 35,

- cierre del orificio exterior de la vigésimo cuarta válvula 34 de la vía de la derecha, y

- cierre del orificio interior de la vigésimo quinta válvula 35 de la vía de la derecha.

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Por eso, la transferencia hacia el compartimiento 47 de convergencia es posible para el resto del líquido 70 tratado que no se tiene en cuenta por el compartimiento 44. Esta parte de dicho líquido 70 se detiene en su movimiento por el filtro 60 de retención, asociado a la vigésimo quinta válvula 35.

Según la figura 12, las válvulas cerradas son las siguientes:

- el orificio interior de la segunda válvula 12,

- el orificio exterior de la tercera válvula 13,

- el orificio exterior de la novena válvula 19,

- el orificio interior de al menos una de las válvulas 20, 21, 22 y/o 23 y/o uno de los orificios de la decimocuarta válvula 24,

- el orificio interior de la decimoquinta válvula 25,

- uno de los orificios de la vigésimo tercera válvula 33, y

- el orificio interior de la primera válvula 11 de la vía de la derecha.

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La decimonovena válvula 29 está abierta, lo que permite la transferencia hacia el compartimiento 45 de detección y de lectura del líquido 70, anteriormente contenido en el compartimiento 44 de muestreo, que contiene eventualmente amplicones marcados. Se observa que durante esta fase, la alícuota de dicho líquido 70 va a pasar por una zona aguas arriba de dicho compartimiento 45 donde está presente una pastilla 45a de detección. Tal pastilla 45a puede contener, por ejemplo, productos de marcado y de corte de los amplicones, tal como se describen en la solicitud de patente PCT/FR99/01469 del solicitante presentada el 17 de junio de 1999, bajo prioridad del 17 de junio de 1998.

El líquido 70 que contiene los amplicones eventualmente marcados y excindidos prosigue su movimiento y se detiene en la parte aguas abajo del compartimiento 45 por un filtro 58 de retención, de modo que dicho líquido 70 está presente al nivel de una célula 46 de lectura. Al nivel de esta célula 46, es posible controlar que la amplificación ha tenido lugar y que la fase siguiente puede efectuarse. El control de esta amplificación puede realizarse mediante oligonucleótidos no marcados, denominados sondas de captura, fijados al nivel de la célula 46 de lectura. Estas sondas son aptas para hibridarse con el producto de amplificación que tuvo que amplificarse, marcarse y partirse.

En otro modo de realización, el líquido 70 que contiene los amplicones no marcados se detiene al nivel de la célula 46. El control de la amplificación pone en práctica una técnica de detección de los amplicones no marcados tal como la que se describe por ejemplo:

- en las solicitudes de patente WO-A-95/13399, WOA-97/39008 o WO-A-99/64432, o las patentes
US-A-5.283.174, US-A-5.656.207, US-A-5.658.737 o US-A-5.928.862, para las técnicas homogéneas, y

- en la solicitud de patente WO-A-91/19812, o las patentes US-A-4.889.798 o US-A-5.998.135, para las técnicas heterogéneas.

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7ª etapa

Transferencia del líquido de elución del compartimiento de convergencia hacia el exterior

La alícuota de líquido 70 tratado presente en el compartimiento 47 de convergencia procede de la vía de la izquierda de la tarjeta 1. Sin embargo, otra alícuota 70, que contiene o no otros amplicones específicos debido a la amplificación, puede estar igualmente presente procedente de la vía de la derecha de dicha tarjeta 1. En el caso de la figura 12, las válvulas cerradas son idénticas pero sobre las vías opuestas, es entonces el filtro 35 de retención de la vía de la derecha el que permite detener la llegada de esta alícuota al compartimiento 47 de convergencia, y así la mezcla entre dichas alícuotas de las vías de la derecha y de la izquierda.

Las amplificaciones en estas dos vías pueden ser idénticas (uso de cebadores idénticos), con el fin de obtener más amplicones, o diferentes (uso de cebadores diferentes), con el fin de permitir varios análisis en función del número de amplicones diferentes obtenidos.

Es igualmente posible tener más de dos vías en una tarjeta 1 de reacción según la invención. En este caso, cabe adaptar los canales 64 a las cercanías de las válvulas 6 de bola de entrada y 9 de salida. Por tanto, será necesario tener otros filtros de retención y otras válvulas en posición inferior con el fin de poder hacer converger todas las alícuotas en el compartimiento 47.

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Cuando la lectura al nivel de la célula 46 prueba que la amplificación se ha desarrollado bien lo que prueba la presencia de una diana en la muestra biológica de salida, es decir la disolución 69 que ha de probarse, la o las alícuotas presentes en el compartimiento 47 de convergencia se transfieren a continuación hacia otra tarjeta de análisis o de reacción, no representada en las figuras, que permite identificar y analizar los amplicones. Puede usar por ejemplo chips de ADN diseñados por la empresa Affymetrix, como ya se ha descrito anteriormente. Esta transferencia se efectúa entonces por la salida 7, según F5, a través de la válvula 9 de bola.

No obstante, es igualmente posible que un chip biológico sea estructuralmente solidario de la tarjeta 1 de reacción. Es igualmente posible que la sexta etapa se limite a la transferencia al compartimiento de convergencia, sin que haya control de la realización o no de la amplificación. Finalmente esta transferencia puede efectuarse directamente en el chip de ADN sin pasar por el compartimiento de convergencia.

Números de referencia

1.

Tarjeta de reacción

2.

Entrada del líquido 71 de lavado

3.

Entrada de la disolución 69 que ha de probarse

4.

Entrada del líquido 72 de elución

5.

Entrada para la variación de presión en el interior de la tarjeta 1

6.

Válvula de bola de entrada de la tarjeta 1

7.

Salida de la disolución 70 tratada hacia el exterior

8.

Salida de los residuos

9.

Válvula de bola de salida hacia el exterior

10.

Válvula de bola de salida de los residuos

11.

Primera válvula

12.

Segunda válvula

13.

Tercera válvula

14.

Cuarta válvula

15.

Quinta válvula

16.

Sexta válvula

17.

Séptima válvula

18.

Octava válvula

19.

Novena válvula

20.

Décima válvula

21.

Undécima válvula

22.

Duodécima válvula

23.

Decimotercera válvula

24.

Decimocuarta válvula

25.

Decimoquinta válvula

26.

Decimosexta válvula

27.

Decimoséptima válvula

28.

Decimoctava válvula

29.

Decimonovena válvula

30.

Vigésima válvula

31.

Vigésimo primera válvula

32.

Vigésimo segunda válvula

33.

Vigésimo tercera válvula

34.

Vigésimo cuarta válvula

35.

Vigésimo quinta válvula

36.

Compartimiento de dosificación de la disolución que ha de probarse

37.

Compartimiento de dosificación del líquido de elución

38.

Compartimiento de separación

39.

Pastilla de partículas magnéticas

40.

Compartimiento de recogida de los constituyentes estructurales

41.

Pastilla de constituyentes estructurales que permiten la amplificación

42.

Compartimiento de amplificación

43.

Pastilla de los constituyentes funcionales que permiten la amplificación

44.

Compartimiento de muestreo

45.

Compartimiento de detección y de lectura

45a.

Pastilla de detección

46.

Célula de lectura

47.

Compartimiento de convergencia

48.

Primer filtro hidrófobo

49.

Segundo filtro hidrófobo

50.

Filtro de retención de un volumen determinado del líquido de elución en el compartimiento 37

51.

Filtro de retención de un volumen determinado de la disolución 70 en el compartimiento 36

52.

Filtro de retención de la disolución 70 que ha de probarse en el compartimiento 38

53.

Filtro de retención del primer líquido 71 de lavado en el compartimiento 38

54.

Filtro de retención del segundo líquido 71 de lavado en el compartimiento 38

55.

Filtro de retención del líquido de elución en el compartimiento 38

56.

Filtro de retención de la muestra con los constituyentes en el compartimiento 40

57.

Filtro de retención de la muestra en la célula 46 de lectura

58.

Filtro de retención de la muestra marcada en el compartimiento 45

59.

Filtro de retención de la muestra con las enzimas en el compartimiento 42

60.

Filtro de retención de la muestra con las enzimas en el compartimiento 47

61.

Válvula complementaria de la vía de la derecha denominada válvula de purga

62.

Cara delantera de la tarjeta 1

63.

Cara trasera de la tarjeta 1

64.

Canales que desembocan al nivel de la cara 62 delantera

65.

Película transparente que tabica los canales 64 al nivel de la cara 62 delantera

66.

Película transparente o pared que tabica los canales 64 al nivel de la cara 63 trasera

67.

Película transparente que tabica las válvulas 11 a 35 y 61 sobre la cara 63 trasera

68.

Reborde o canto de la tarjeta 1

69.

Disolución que ha de probarse

70.

Disolución tratada

71.

Líquido de lavado

72.

Líquido de elución

73.

Derivación del compartimiento 38 para los filtros 52 a 55 de retención

74.

Hendidura o ranura de cada válvula 11 a 35 y 61 donde se suelda la película 67

75.

Medio de compresión de la película 67 o lengüeta flexible

76.

Medio de cierre estanco o pasador de elastómero

77.

Medio de apertura o bisel

78.

Lámina en banda constituida por varias lengüetas 75

79.

Accionador de tipo pistón

80.

Tubo de goma para aire comprimido

81.

Soporte

82.

Superficie biselada de la tarjeta 1

83.

Medio de fijación de la lámina 78

84.

Soldadura periférica situada en el fondo de la ranura 74

F1.

Entrada del líquido 71 de lavado

F2.

Entrada de la disolución 70 que ha de probarse

F3.

Entrada del líquido de elución

F4.

Entrada para la variación de presión en el interior de la tarjeta 1

F5.

Salida de la disolución que ha de probarse hacia el exterior

F6.

Salida de los residuos

F7.

Entrada de aire comprimido de los medios 77 de accionamiento

F8.

Salida de aire comprimido de los medios 77 de accionamiento

F9.

Movimiento de los medios 77 de accionamiento

F10.

Basculamiento de la lengüeta 75

Claims (18)

1. Tarjeta (1) de reacción constituida por un cuerpo, que tiene una cara (62) delantera y una cara (63) trasera delimitadas por un reborde (68), por al menos una entrada (2, 3, 4 y/o 5) y por al menos una salida (7 y/u 8), una (2, 3, 4 y/o 5) unida a la otra (7 y/u 8) por una red de canales (64) que constituyen al menos una vía de reacción para al menos un fluido (70, 71 y/o 72), estando el o los fluidos (70, 71 y/o 72) dirigidos en el interior de la tarjeta (1) mediante válvulas (11 a 35 y/o 61); cada válvula (11 a 35 ó 61) está constituida por una película (67) flexible, que puede deformarse para permitir el paso de un fluido o que actúa conjuntamente con un medio (75) de compresión para impedir el paso del fluido, estando la película (67) fijada sobre la cara (63) trasera de dicha tarjeta (1) al nivel de una hendidura (74) periférico del conjunto de los canales relacionados con la válvula (11 a 35 ó 61); la tarjeta (1) comprende canales (64) que afloran sobre al menos una de sus caras (62 y/o 63), siendo los canales (64) de dos secciones diferentes, una sección pequeña para la transferencia del fluido o de los fluidos (70, 71 y/o 72) y una sección grande que actúa como compartimiento de reacción; cada cara (62) delantera o trasera (63) está delimitada por al menos una película (48, 49, 65, 66 y/o 67).

2. Tarjeta, según la reivindicación 1, caracterizada porque el cuerpo de la tarjeta (1) es monobloque, y porque el medio (75) de compresión se añade y es solidario de dicha tarjeta (1) o constituye una parte de un aparato que permite la puesta en práctica de la tarjeta (1).

3. Tarjeta, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque la relación entre la sección pequeña y la sección grande de los canales (64) está comprendida entre l a 1,01 y 1 a 10, preferiblemente entre l a 1,01 y 1 a 3.

4. Tarjeta, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque los canales (64) afloran total o parcialmente al nivel de la cara (62) delantera de la tarjeta (1) y porque las válvulas están presentes al nivel de la cara (63) trasera de dicha tarjeta (1).

5. Tarjeta, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque la cara (62) delantera de la tarjeta (1) comprende una sola película (65) al nivel de todos los canales (64) que afloran en esta cara (62), y la cara (63) trasera de dicha tarjeta (1) comprende:

-

al menos una película (67) flexible al nivel de las válvulas (11 a 35 y/o 61),

-

al menos un filtro hidrófobo (48 y/o 49), y eventualmente

-

al menos una película (66) al nivel de los canales (64) que afloran al nivel de la cara (63) trasera.

6. Tarjeta, según la reivindicación 5, caracterizada porque la o las películas (67) flexibles y la o las películas (65 y/o 66) constituyen una única y misma película.

7. Tarjeta, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en forma sensiblemente de paralelepípedo, caracterizada porque los canales (64) están, total o parcialmente, circunscritos en la parte mediana de la tarjeta (1), porque los filtros (50 a 60) de retención, asociados a los filtros hidrófobos (48 y 49), están circunscritos al nivel de al menos uno de los lados de dicha tarjeta (1), y porque las válvulas (11 a 35 y/o 61) están posicionadas entre los canales (64) y los filtros (50 a 60) de retención.

8. Tarjeta, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque el reborde (68) comprende el conjunto de las entradas (2, 3, 4 y 5) y salidas (7 y 8) de fluidos (70, 71 y 72) de la tarjeta (1).

9. Tarjeta, según la reivindicación 8, en forma sensiblemente de paralelepípedo, caracterizada porque la o las entradas (2, 3, 4 y 5) están presentes sobre uno de los lados que constituyen el reborde (68), y porque la o las salidas (7 y 8) están presentes sobre otro lado de este reborde (68).

10. Tarjeta, según la reivindicación 9, caracterizada porque la o las entradas (2, 3, 4 y 5) están presentes sobre un lado opuesto al lado donde están presentes la o las salidas (7 y 8).

11. Tarjeta, según la reivindicación 10, en forma sensiblemente de paralelepípedo rectángulo, caracterizada porque la o las entradas (2, 3, 4 y 5) y la o las salidas (7 y 8) están presentes sobre los dos lados pequeños que constituyen el reborde (68).

12. Uso de una tarjeta de reacción, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, para probar una disolución (69) biológica, eventualmente tratada previamente con el fin de liberar ligandos, en el que se efectúan las diferentes etapas biológicas en el siguiente orden:

-

introducción de la disolución (69) biológica que ha de probarse en dicha tarjeta,

-

captura de los ligandos,

-

recogida de los ligandos capturados en una disolución (72) de elución,

-

mezcla de los ligandos recogidos con los constituyentes estructurales y funcionales que permiten tratar los ligandos, y

-

detección cualitativa y/o cuantitativa de los ligandos tratados.

13. Uso, según la reivindicación 12, en el que los ligandos son ácidos nucleicos, los constituyentes estructurales y funcionales que permiten tratar los ligandos son constituyentes que permiten la amplificación de estos ácidos nucleicos, y la detección cualitativa y/o cuantitativa de los ligandos tratados es una detección cualitativa y/o cuantitativa de los productos de amplificación.

14. Uso, según una cualquiera de las reivindicaciones 12 o 13, en el que se efectúa una última etapa que consiste en analizar estos ligandos o estos productos de amplificación, o bien en un nuevo emplazamiento en el interior de la tarjeta (1), o bien después de la transmisión hacia otro dispositivo.

15. Uso, según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en el que los ligandos o los ácidos nucleicos capturados están sometidos a al menos un líquido (71) de lavado previamente a su recogida.

16. Uso, según la reivindicación 15, en el que la captura y eventualmente el lavado se efectúan N veces sucesivamente, estando comprendido N entre 1 y 10.

17. Uso, según una cualquiera de las reivindicaciones 12 ó 13, en el que se detecta un tratamiento de los ligandos o una amplificación de los ácidos nucleicos previamente a la transmisión hacia un compartimiento de la tarjeta (1) o hacia otro dispositivo que permite analizar los ligandos o los amplicones.

18. Uso, según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, en el que la tarjeta (1) se usa después de un aparato que permite tratar una disolución (69) que ha de probarse, tal como un aparato para lisar células biológicas y liberar los ligandos, tales como ácidos nucleicos, y antes de un aparato que permite detectar la presencia de estos ligandos, tal como un chip de ADN.