ES2304541T3 - Medicamento que comprende celulas madre mesenquimales. - Google Patents
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Abstract
Uso de una composición de MSC en una suspensión líquida de sobrenadante de médula ósea, en la fabricación de un medicamento para tratar una lesión natural y subcutánea, inducida por una distensión, en un tendón o en un ligamento de un caballo, perro, camello o ser humano, en el que el medicamento queda retenido en el sitio de la lesión en una cavidad.
Description
Medicamento que comprende células madre
mesenquimales.
La presente invención se refiere al uso de una
composición de células madre mesenquimales (MSC) en la fabricación
de un medicamento para tratar una lesión en un tendón o en un
ligamento; en particular, se refiere al tratamiento de una lesión
natural y subcutánea, inducida por una distensión, usando las MSC en
una suspensión líquida.
Las lesiones del tendón flexor digital
superficial son una causa común de desgaste entre caballos de
competición, y van asociadas a un escaso éxito de retorno al nivel
previo de rendimiento y a una elevada incidencia de que se vuelva a
producir la lesión. Los regímenes de tratamiento actuales (revisados
por Dowling y col., 2000) tienen sólo efectos marginales en la
evolución de la tendinopatía, siendo la principal influencia en el
pronóstico la gravedad de la lesión inicial. Estudios recientes que
han investigado la eficacia del inhibidor de la
lisil-oxidasa, el fumarato de
beta-aminoproprionitilo, han puesto de manifiesto
mejoras importantes en la evolución de la tendinopatía, de moderada
a grave, de flexor digital superficial (Genovese, 1992), aunque esta
evolución no ha sido tan favorable en ensayos clínicos posteriores
(Reef y col., 1996, 1997), y un trabajo experimental reciente ha
demostrado posibles efectos adversos de este tratamiento (Dahlgren y
col., 2002). Además, aunque este tratamiento previene las
reticulaciones de colágeno que se forman demasiado pronto,
permitiendo así que un régimen de ejercicio controlado mejore la
funcionalidad del tejido cicatricial, no regenera el tejido
tendinoso. Ya que el tejido cicatricial nunca será tan funcional
como el tejido tendinoso, un objetivo de un futuro tratamiento
eficaz es el desarrollo de métodos para regenerar tejido
tendinoso.
Recientemente ha habido un interés considerable
en los beneficios terapéuticos potenciales de las células madre
mesenquimales (MSC) para la curación de tendones y ligamentos (Woo y
col., 1999; Caplan y Bruder, 2001; Hildebrand y col., 2002). Estas
células residen en pequeñas cantidades en todos los tejidos y poseen
capacidades multipotenciales para diferenciarse en diversos tejidos
diferentes. Informes recientes han demostrado que las MSC se pueden
implantar en tejido de tendones y ligamentos mediante el uso de
armazones en animales experimentales (Young y col., 1998). Una de
las fuentes de MSC ha sido la medula ósea, e informes recientes
(Herthel, 2001) han descrito un éxito considerable con el uso de
médula ósea aspirada de las esternebras e inyectada directamente en
el tendón o ligamento dañado. En este informe, el pronóstico global
para un retorno a trabajar a pleno rendimiento en 100 caballos con
lesiones de ligamento suspensor, tratados con médula ósea, fue del
84%, mientras que un grupo comparativo de 66 caballos tratados de
manera conservadora tuvo un pronóstico del 15%. Sin embargo, no
existe documentación sobre el número de lesiones de extremidades
anteriores y extremidades posteriores, ni sobre la región del
ligamento suspensor dañado, todos los cuales se sabe que presentan
pronósticos muy diferentes (Dyson, 1995, 2000). Además, esta
técnica tiene muchas limitaciones. La inyección de volúmenes
grandes de medula ósea (30 ml -
50 ml) causaría potencialmente una alteración considerable en el tejido tendinoso intacto restante, incluiría otros componentes de la médula ósea tales como espículas de hueso, células de grasa, etc., deletéreos para la curación del tendón, y únicamente se esperaría que estuvieran presentes pequeñas cantidades de MSC. No se ha descrito ni validado ni la presencia ni el número de células madre mesenquimales en este método de tratamiento. Algunos especialistas han dudado por ello de la eficacia de esta técnica ya que los frotis de médula ósea aspirada se asemejan a los frotis de sangre periférica. Los autores de la invención han encontrado también una mineralización no conveniente usando esta
técnica.
50 ml) causaría potencialmente una alteración considerable en el tejido tendinoso intacto restante, incluiría otros componentes de la médula ósea tales como espículas de hueso, células de grasa, etc., deletéreos para la curación del tendón, y únicamente se esperaría que estuvieran presentes pequeñas cantidades de MSC. No se ha descrito ni validado ni la presencia ni el número de células madre mesenquimales en este método de tratamiento. Algunos especialistas han dudado por ello de la eficacia de esta técnica ya que los frotis de médula ósea aspirada se asemejan a los frotis de sangre periférica. Los autores de la invención han encontrado también una mineralización no conveniente usando esta
técnica.
En una realización preferida de la presente
invención, se ha desarrollado una técnica para el aislamiento,
caracterización y expansión in vitro de MSC equinas, con la
reimplantación de un número grande de MSC autólogas en un tendón
flexor digital superficial dañado en un caballo. Las MSC poseen el
potencial de diferenciarse en tenocitos y de regenerar la matriz
del tendón después de ocurrida la lesión.
La invención no se limita al tratamiento de
caballos ni, por supuesto, al tratamiento del tendón flexor digital
superficial, ni al uso de células autólogas, aunque este uso se
prefiere. Más bien, la invención tiene aplicaciones más amplias
según se describe aquí con detalle.
Un primer aspecto de la invención proporciona un
uso de una composición de MSC en una suspensión líquida de
sobrenadante de médula ósea, en la fabricación de un medicamento
para tratar una lesión natural y subcutánea, inducida por una
distensión en un tendón o en un ligamento de un caballo, perro,
camello o ser humano, en el que el medicamento queda retenido en el
sitio de la lesión en una cavidad.
El tejido esquelético blando incluye tendones,
ligamentos, discos intervertebrales, que están asociados con el
dolor o una lesión de columna vertebral, y los meniscos.
El tejido esquelético blando se puede lesionar
de diferentes maneras, tales como mediante laceración quirúrgica,
que es un tipo de lesión percutánea traumática. Esas lesiones
quirúrgicas pueden ser consideradas "no naturales". Las
lesiones adecuadas para ser tratadas por medio de la presente
invención son lesiones "naturales", término que significa que
la lesión típicamente se produce subcutáneamente, por ejemplo, por
ser inducida por una distensión, que frecuentemente es una
acumulación de daños a lo largo de un período de tiempo. Por lo
tanto, las lesiones naturales son lesiones clínicas e incluyen
lesiones traumáticas que se presentan al especialista, e incluyen
laceraciones accidentales.
Esas lesiones naturales son comunes en animales
de competición o de carreras, incluyendo a seres humanos. Las
lesiones naturales de tejido esquelético blando son fácilmente
diagnosticadas por el médico o el veterinario usando técnicas muy
conocidas, tales como el estudio del historial clínico del pacienta,
exploración física, palpación, ecografía, barrido de MRI y técnicas
similares.
Se prefiere que la lesión a tratar sea una
lesión por distensión.
El tejido esquelético blando que se trata es un
tendón o un ligamento. Los tendones o ligamentos particularmente
preferidos para tratar mediante el medicamento de la invención son
los que comúnmente se lesionan en animales de competición o de
carreras o animales que participan en competiciones deportivas,
debido a distensiones o por una acumulación de daños, tal como
daños producidos por distensión.
El paciente puede ser cualquier paciente
adecuado. Típicamente, el paciente es un mamífero (que incluye seres
humanos). Típicamente, el animal no humano, tal como un mamífero no
humano, es un animal de importancia económica, tal como un animal
de carreras o un animal de trabajo o un animal de compañía (tales
como perros o gatos). Aún más típicamente, el animal es un mamífero
que recibe entrenamiento para competiciones (es decir, para
competiciones deportivas), tales como seres humanos, caballos,
perros (tales como lebreles, galgos, perros de caza, sabuesos y
perros esquimales) o camellos.
Se prefiere particularmente que el paciente sea
un caballo que, debido a su uso en deportes (carreras, saltos,
exhibiciones etc.), o como animales de trabajo, son particularmente
susceptibles a una lesión natural en el tejido esquelético blando
según se ha definido.
Aunque en estos mamíferos, toda lesión de un
tendón o ligamento se puede tratar con el medicamento de la
invención, algunas lesiones particulares se pueden tratar de manera
más adecuada que otras. Así, cuando el paciente es un caballo o un
camello, se prefiere si el tejido esquelético blando se selecciona
entre el grupo que consiste en tendón flexor digital superficial
(SDFT), ligamento suspensor y tendón flexor profundo (tanto de las
extremidades anteriores como de las extremidades posteriores),
ligamento accesorio del tendón flexor digital profundo (DDFT) (del
inglés, "Deep Digital Flexor Tendon"), meniscos, y otros
ligamentos tales como los ligamentos cruzados. Cuando el paciente
es un perro, se prefiere si la lesión de tejido esquelético blando
se selecciona entre el grupo que consiste en tendón de Aquiles,
ligamento cruzado, menisco y tendón flexor. Cuando el paciente es
un ser humano, se prefiere si el tejido esquelético blando se
selecciona entre grupo que consiste en tendón de Aquiles, tendón
del cuádriceps, manguito de los rotadores, epicondilitis lateral o
media, ligamento cruzado, disco intervertebral y menisco.
El medicamento es particularmente adecuado para
tratar tendones flexores más que tendones extensores. Los tendones
flexores almacenan energía y el daño acumulado que precede a una
rotura parcial o total. Los tendones flexores por lo general no
curan bien y las lesiones en ellos presentan una elevada
morbilidad.
Se prefiere de manera particular que el
medicamento se use para tratar tendones o ligamentos lesionados que
almacenan energía mecánica. Así, el tratamiento de una tendinitis
(tendonitis), tendinopatía (tendonopatía, es decir, lesión en un
tendón), desmitis (lesión en un ligamento), tendón arqueado, pierna
arqueada y lesiones por distensión, se contempla
específicamente.
La composición de células madre mesenquimales
puede ser cualquier composición adecuada de esas células con la
condición de que la composición esté enriquecida en comparación con
una fuente natural de dichas células. Fuentes naturales de células
madre mesenquimales incluyen médula ósea (p. ej., con y sin
extracción previa de sangreo), sangre periférica (p. ej., con y sin
un incremento procedente de médula) y cordón umbilical, pero
también incluyen grasa, músculo, vasos sanguíneos, periostio y
pericondrio, y en pequeñas cantidad, células en las que se
diferencian (p. ej., tendones, ligamentos, cartílagos, etc.). La
composición de células para usar en la invención puede estar
enriquecida en comparación con las fuentes naturales, por medio de
cualquier método adecuado, que incluya típicamente métodos de
fraccionamiento celular y concentración. Los métodos adecuados son
muy conocidos en la técnica e incluyen la metodología que utiliza
Ficoll-Paque descrita en los Ejemplos. Otros
métodos adecuados incluyen la concentración de células madre
mesenquimales usando anticuerpos dirigidos contra marcadores de
células madre mesenquimales que están inmovilizados, por ejemplo, en
una columna de cromatografía de afinidad o en un subestrato en un
esquema de revestimiento de superficies (del inglés,
"panning"). El enriquecimiento también se puede
realizar cultivando las células y expandiendo las células en
condiciones que conservan su carácter de células madre
mesenquimales. Esos métodos son muy conocidos en la técnica y uno
de ellos se describe con detalle en los Ejemplos. Las células madre
mesenquimales se caracterizan por su pluripotencia, es decir, por
su capacidad para diferenciarse en diferentes líneas celulares de
tejido esquelético y conjuntivo cuando están presentes señales
biológicas y/o mecánicas adecuadas. En particular, las células madre
mesenquimales son capaces de diferenciarse en cartílago, hueso,
músculo (tal como miotubos), células productoras de tendón
(tenocitos), fibroblastos y adipocitos (células productoras de
grasa). Convenientemente, en el procedimiento de enriquecimiento
(que incluye la expansión de las células en cultivo), la presencia
de (y el enriquecimiento de, que incluyen la expansión en el
cultivo) las células madre mesenquimales se puede determinar antes
de su uso en el método de la invención, haciendo que las células se
diferencien en diferentes líneas celulares características de las
células madre mesenquimales. De manera adicional o como alternativa,
los marcadores (típicamente marcadores de superficie celular)
pueden ser útiles en la identificación de células madre
mesenquimales. En algunas especies, las células madre mesenquimales
exhiben el marcador STRO1 (pero probablemente no en el caballo).
Típicamente, los tenocitos producen colágeno de tipo I y COMP (véase
más adelante). El gen de "scleraxis" puede ser un marcador
para tenocitos.
Los tipos celulares derivados de células madre
mesenquimales se pueden identificar usando los marcadores que
vienen a continuación, en donde + indica la presencia del marcador
en la célula y - indica la ausencia (o la presencia de trazas) del
marcador en la célula.
Típicamente, el enriquecimiento de células madre
mesenquimales en la composición es de al menos 2 veces más sobre el
contenido de dichas células en la fuente natural que se enriquece de
ellas. Preferiblemente, el enriquecimiento es de al menos de 3
veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, o más preferiblemente,
de al menos 30 ó 40 ó 50 ó 100 veces.
Preferiblemente es de al menos 1.000 veces o
10^{4} veces o 10^{5} veces.
Típicamente, la composición enriquecida contiene
al menos el 10% de sus células en forma de células madre
mesenquimales y preferiblemente al menos el 50% o el 60% o el 70%, o
un porcentaje mayor. Puede ser ventajoso que al menos el 90%, o al
menos el 95%, o al menos el 99%, de las células presentes en la
composición sean células madre mesenquimales.
Es particularmente preferido que las células
madre mesenquimales deriven de médula ósea o de sangre de cordón
umbilical. Es particularmente preferido si las células están
enriquecidas en comparación con la médula ósea, por ejemplo, usando
los métodos descritos en los Ejemplos o variantes del método basado
en los principios generales de enriquecimiento, expansión (en caso
necesario) y escrutinio de células. Cuando la sangre de cordón
umbilical es la fuente de células madre mesenquimales, se valora que
la sangre de cordón haya sido almacenada la para la eventualidad de
que se necesitara para usar en los métodos de la invención. Así, se
contempla que la sangre de cordón umbilical se conserve en el
momento del nacimiento y sea usada, en caso necesario, en el futuro
por el paciente.
Aunque se contempla que cualquier composición de
células madre mesenquimales enriquecida en comparación con su
fuente natural sería útil, se prefiere si las células son alógenas
(es decir, procedan de la misma especie que el paciente), en
contraposición a que sean células xenógenas (es decir, procedentes
de una especie diferente). Si las células son alógenas, pero no
autólogas, se prefiere si las células son de un tipo de tejido
similar (p. ej., tienen haplotipos de MHC/HLA similares). Es
particularmente preferido si las células son autólogas (es decir,
derivan del paciente al que van a ser administradas). Esas células
autólogas tienen la ventaja de ser mucho menos susceptibles al
rechazo en comparación con otras células alógenas (o xenógenas).
Asimismo, el uso de células autólogas evita cualquier problema de
"dopaje" (p. ej., con un DNA "extraño"), lo que puede
representar una preocupación. Así, un método particularmente
preferido de la invención comprende obtener células madre
mesenquimales procedentes del paciente (por ejemplo, procedentes de
la médula ósea), enriquecer las células y, en caso necesario,
expandirlas en el cultivo e introducir las células así enriquecidas
en el paciente. Se valorará que parte de las células se puedan
reservar para usar en una fecha posterior, y típicamente estas
células se congelan en condiciones que conservan su viabilidad. Se
valorará que las células se pueden obtener y enriquecer (expandir
si es necesario) antes de que tenga lugar alguna lesión en el
paciente, y que se puedan guardar para su administración inmediata
en caso de que, y cuando, el paciente padece una lesión en un tejido
esquelético blando. Este procedimiento significa que no se perdería
tiempo en el comienzo del tratamiento una vez ocurrida la
lesión.
Por suspensión líquida de células se incluye
toda suspensión líquida adecuada. Por ejemplo, la suspensión
líquida puede ser una suspensión de células en un medio que
contienen señales biológicas apropiadas para estimular la
diferenciación de las células madre mesenquimales en tipos celulares
que son útiles para la regeneración de lesiones de tejido
esquelético blando (p. ej., en tenocitos en el caso de la
regeneración de tendones), y para desestimular la diferenciación de
las células en tipos celulares que no son útiles (p. ej., en tejido
óseo). Una suspensión líquida adecuada es aquella en la que las
células madre mesenquimales están suspendidas en un plasma rico en
plaquetas tal como se describe los Ejemplos. Medios de suspensión
líquidos adecuados incluyen el sobrenadante de médula ósea. Para
evitar cualquier duda, la suspensión líquida puede ser una
suspensión que gelifica in situ, por ejemplo, debido a la
temperatura del sitio de la lesión en el paciente o debido a que se
mezcla con otro agente que causa gelificación.
Las señales biológicas adecuadas incluyen
moléculas que estimulan a las células a diferenciarse de la manera
adecuada. Esas moléculas pueden incluir factores de crecimiento,
citoquinas que, debido al altísimo grado de similitud entre las
especies, no necesitan ser autólogas o alógenas (p. ej. , los
factores de crecimiento o las citoquinas de seres humanos se pueden
usar en el caballo). Los factores de crecimiento adecuados pueden
incluir TGF\beta (preferiblemente la isoforma 3), IGF 1, IGF 2,
PDGF y FGF. También puede ser útil que en la suspensión líquida de
células estén presentes otros factores que estimulan a las células a
regenerarse como tejido esquelético blando, tales como una proteína
oligomérica de la matriz del cartílago (COMP), que puede ayudar en
la formación de tejido esquelético blando, pero que no suelen estar
presente en animales de edad en algunas especies tales como en el
caballo. Se valorará que aunque se prefiere que las señales
biológicas estén presentes en la suspensión líquida, estas señales
pueden como alternativa o de manera adicional, administrarse al
paciente por separado, por ejemplo, en el sitio de la lesión. Es
particularmente preferido que las señales biológicas usadas, o sus
combinaciones, sean unas señales que disminuyen la posibilidad de
formación de cicatrices.
Los tenocitos se pueden estimular para que se
formen a partir de células madre mesenquimales aplicando una fuerza
de alargamiento a las células. Típicamente, esto se puede hacer
sembrando las células en un armazón de colágeno y estirando
(alargando) la estructura, aunque las células se puede hacer crecer
en una placa de cultivo de tejidos que lleva una superficie
inferior flexible la cual se puede alargar a medida que las células
crecen.
Las células se pueden eluir del armazón de
colágeno o de la superficie de la placa de cultivo y se pueden usar
en suspensión líquida.
Las células madre mesenquimales no producen
colágeno I, mientras que los tenocitos sí producen colágeno I, de
manera que la presencia de colágeno I es indicativa de una
diferenciación de las células madre mesenquimales en tenocitos.
La composición de células madre mesenquimales se
administra al paciente de alguna de las maneras adecuadas.
Preferiblemente, la composición se administra directamente en el
sitio de la lesión (o en un sitio adyacente a él), y típicamente de
manera que las células madre mesenquimales permanezcan en el sitio
de la lesión. Determinados sitios de una lesión natural de tejido
blando comprenden cavidades cerradas y es particularmente preferidos
que el sitio de la lesión natural de tejido blando que se está
tratando sea un sitio con esa cavidad o sea una lesión que se pueda
cerrar con facilidad para formar una cavidad. Cuando se tratan ese
tipo de lesiones, la posibilidad de un escape hacia el exterior
desde el sitio lesionado se reduce. Se prefiere que la lesión
tratada sea una rotura parcial intratendinosa. En el SDFT en
caballos, la lesión a lo largo del tendón está comúnmente en la
región metacarpiana media. En el DDFT la lesión suele estar dentro
de la vaina digital. En algunos casos, la lesión es tal que el daño
(p. ej., un desgarro) abre una cavidad, o la lesión está situada en
un sitio en el que no hay una cavidad natural, y puede ser necesario
introducir un empaquetamiento (por ejemplo, en forma de una matriz
de un gel), cerca de la cavidad o retener las células de alguna otra
manera en el sitio de la lesión. Los tendones o ligamentos
rescatados se pueden cerrar quirúrgicamente para que formen una
cavidad dentro de la que la suspensión líquida de células se puede
administrar. Como alternativa, la composición de células madre
mesenquimales se puede introducir en el tejido desgarrado y se puede
suturar sin crear una cavidad específica.
Se valorará que las células madre mesenquimales
se puedan suministrar por vía intravenosa o, por ejemplo, en el
suministro de sangre local al sitio de la lesión.
Se prefiere que la composición de células madre
mesenquimales en suspensión líquida se inyecte en el sitio de la
lesión. Típicamente, esto se hace mediante inyección percutánea, con
o sin ultrasonidos para guiar la inyección hacia el sitio de la
lesión (p. ej., dentro de la cavidad de un tendón que se ha
lesionado). Así, la aguja de una jeringuilla puede pasar a través
de la piel, directa hacia el tejido esquelético blando, tal como un
tendón. De manera adecuada, puede haber una "parada" de la
aguja, que significa que su extremo está en la posición deseada
dentro del sitio de la lesión, para la liberación de la composición
que contienen las células. Como alternativa, la aguja de inyección
se puede guiar mediante técnicas de artroscopia, lo cual puede
constituir una manera mínimamente invasiva de llegar al tejido
esquelético blando, tal como un tendón. La dirección mediante
artroscopia puede ser particularmente útil en los casos en los que
el sitio de la lesión es una estructura
intra-articular o intratecal (es decir, dentro de
una vaina tendinosa) o una estructura
intra-articular colaginosa, un ligamento cruzado o
un menisco.
En una de las realizaciones de la invención, el
sitio de la herida se limpia de tejido dañado y de tejido
cicatricial de reparación incipiente que puede estar empezando a
formarse en el sitio, antes de la administración de la composición
de células madre mesenquimales o tenocitos. De esta manera, puede
ser posible prevenir o reducir las posibilidades de formación de
tejido cicatricial, o de otro tejido no deseado. Esto se puede
realizar usando un desbridamiento quirúrgico mínimamente invasivo,
o usando métodos enzimáticos o biofísicos.
La dosis de células que se administra al
paciente puede variar en relación con el tipo y la gravedad de la
lesión y pueden ser determinados por el médico o el veterinario.
Típicamente, la suspensión líquida se administra en partes
alícuotas de aproximadamente 0,1 ml (o 0,2 ml o 0,3 ml o 0,4 ml,
pero típicamente en partes alícuotas de no más de 0,5 ml) en el
sitio de la lesión. Típicamente, una parte alícuota, tal como una
parte alícuota de 0,1 ml, contiene desde aproximadamente 50.000
hasta aproximadamente 500.000 células madre mesenquimales.
El tamaño y/o el número de partes alícuotas
puede variar dependiendo de la naturaleza y de la extensión de la
lesión. El volumen de la lesión (sitio lesionado) se puede
determinar con precisión mediante ultrasonografía. El volumen de la
lesión se puede determinar por lo general a partir de imágenes
ultrasónicas solamente. Típicamente, cuando la lesión está en un
sitio que tiene una cavidad (o que se puede hacer que forme una
cavidad por compactación, según se ha descrito anteriormente), la
cavidad si rellena con la suspensión líquida de células.
Se prefiere que los regímenes de tratamiento de
la invención comiencen lo antes posible después de producida la
lesión; sin embargo, puede ser ventajoso dejar que la sangre se
coagule y se comience a formar un tejido de granulación de
aparición temprana, que induzca o estimule el suministro de sangre.
Convenientemente, el tratamiento comienza en el plazo de 24 horas a
4 semanas, típicamente en el plazo de 48 horas a 7 días.
En una realización preferida de la invención, la
regeneración del tejido esquelético blando en el sitio de la lesión
se vigila mediante ultrasonografía, incluyendo la medida de las
superficies transversales (p. ej., mediante ultrasonografía).
También es particularmente preferido que después del tratamiento, el
paciente se someta a una procedimiento de rehabilitación que
incluye ejercicio del sitio lesionado. Típicamente, si la
superficie transversal del tejido dañado (tal como un tendón o un
ligamento) aumenta en más del 10% en cualquiera de los niveles, el
ejercicio se reduce, mientras que si permanece constante o
disminuye, el ejercicio se incrementa gradualmente. El médico o el
veterinario pueden diseñar fácilmente regímenes de rehabilitación
adecuados (p. ej., ejercicio) teniendo en cuenta la naturaleza de
la lesión, su tratamiento y el progreso hecho por el paciente en
cuanto regenerar tejido esquelético blando adecuado en el
sitio
de la lesión. Un régimen de rehabilitación adecuado se muestra para el caso del tratamiento de SDFT en el caballo.
de la lesión. Un régimen de rehabilitación adecuado se muestra para el caso del tratamiento de SDFT en el caballo.
La invención se describirá ahora con más detalle
haciendo referencia a las siguientes Figuras y Ejemplos no
limitativos.
La Figura 1 muestran células madre mesenquimales
que se adhieren a plástico después de una semipurificación a partir
de médula ósea mediante centrifugación en Ficoll.
La Figura 2 muestra ultrasonografías del tendón
flexor digital superficial de un poni de polo de 11 años de edad,
con una tendinitis de flexor digital superficial de 5 semanas de
duración, antes de la implantación de las células madre y 10 días
después de la implantación de células madre. La lesión ocupa el 45%
central del tendón y está llena de tejido granuloso /tejido fibroso
joven. No se ha producido ningún trastorno significativo en el
tendón en curación, debido al procedimiento de implantación.
- (a)
- Imagen transversal del nivel 4 (20 cm distal al hueso carpiano accesorio).
- (i) Antes de la implantación.
- (ii) 10 días después de la implantación.
- (b)
- Imagen longitudinal: 20 cm - 24 cm distal al hueso carpiano accesorio.
- (i) Antes de la implantación
- (ii) 10 días después de la implantación.
La Figura 3 muestra barridos realizados después
del tratamiento, según se describe en el Ejemplo 4.
Células MSC autólogas se reimplantaron después
de su expansión in vitro, en un tendón flexor digital
superficial dañado de un poni de polo de 11 años de edad será que
había sufrido una lesión inducida por distensión de su tendón
flexor digital superficial cinco semanas antes.
Tras la sedación (con hidrocloruro de
detomidina^{1}, 10 \mug/kg (Domosedan, Pfizer Animal
Health, Ramsgate, Kent) y butorfanol, 20 \mug/kg (Torbugesic,
Fort Dodge Animal Health, Southampton, UK)), se preparó una
superficie de 5 cm x 20 cm a lo largo del esternón mediante rasurado
y fregado. Después de la preparación aséptica, los espacios
interesternebrales, fácilmente identificados mediante
ultrasonografía diagnóstica, se marcaron sobre la piel usando un
rotulador esterilizado. Una disolución para anestesia local (2 ml;
mepivicaína (Intra-Epicaine, Arnolds,
Shrewsbury, UK)) se infiltró por vía subcutánea sobre el punto medio
del plano sagital de dos esternebras adyacentes. Se hizo una
incisión punzante con un escalpelo del número 11 a través de la
piel. Una aguja Jamshidi para biopsias (11G, 10,16 cm (4 pulgadas))
se introdujo unos 4 cm - 6 cm aproximadamente hasta que entró en
contacto con la esternebra. Entonces se empujó otros 3 cm - 4 cm
hacia el interior de la esternebra y a continuación se aspiraron
partes alícuotas de 1,8 ml de médula ósea de cada una de las dos
esternebras, con jeringuillas de 2 ml, precargadas con 1.000 UI de
heparina (Heparin (Multiparin, CP Pharmaceuticals,
Wrexham, UK); 5.000 UI/ml). Se extrajeron 5 partes alícuotas en la
primera serie de aspirados, para cuantificar el número de células
MSC y a continuación se extrajeron 2 partes alícuotas para realizar
la preparación de las MSC para su reimplantación. Los 1,8 ml de los
aspirados de médula se hicieron oscilar cuidadosamente y se
transfirieron luego a tubos estériles de 5 ml y se colocaron sobre
hielo para su inmediata transferencia al laboratorio.
Las MSC se separaron usando una técnica similar
a la descrita para el aislamiento de MSC en otras especies (Rickard
y col., 1996). Brevemente expuesto, los 2 ml iniciales de un
aspirado de médula ósea se extendieron con cuidado sobre 4 ml de
Ficoll (Ficoll Paque PLUS, Amersham Pharmacia Biotech. UK
Ltd., Little Chalfont, UK). Esta mezcla extendida se centrifugó
luego a 1.510 rpm (400 g) durante 30 minutos de manera que se formó
una capa leuco-plaquetaria (del inglés, "buffy
coat"), de color pajizo, entre el plasma y el residuo de
eritrocitos en el Ficoll. Esta capa
leuco-plaquetaria se recuperó y se lavó añadiendo 10
ml de Medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Sigma
Aldrich, Poole, UK; glucosa 4.500 mg/l,
L-glutamina y piruvato sódico, con suero de ternera
fetal al 10%, penicilina 50 UI/ml y estreptomicina 50 \mug/ml). La
muestra se centrifugó a 2.000 rpm (702 g) durante 10 minutos para
retirar la heparina y el Ficoll. El sobrenadante se desechó y el
sedimento celular se resuspendió en 12 ml de DMEM. Esta suspensión
celular se añadió luego a matraces T75.
Se dejó que las células primarias sembradas se
adhirieran al matraz durante dos días antes de cambiar el medio, y
después de ello el medio se cambió cada dos días durante 14 - 16
días, momento en el que las unidades formadoras de colonias se
hicieron visibles. Estas células se traspasaron antes de alcanzar la
confluencia, por medio de una tripsinización, a matraces T175, y
después se expandieron durante otros 5 - 9 días hasta que fueron
confluentes.
Las células se extrajeron de los matraces usando
una digestión con tripsina y se centrifugaron a 2.000 rpm (702 g)
durante 10 minutes para sedimentar las células. El sobrenadante de
medio se desechó y el sedimento de células se resuspendió en 1 ml
de DMEM recién preparado sin suero. Se aspiró una parte alícuota de
20 \mul y sometió a recuento en un hemocitómetro para obtener el
recuento de células por mililitro.
Para cuantificar el rendimiento de las MSC
obtenidas de médula ósea equina, partes alícuotas sucesivas de 1,8
ml de médula ósea procedente de tres caballos diferentes (que
incluían el caballo en el que se realizó la reimplantación) se
cultivaron por separado. El número de células se determinó después
de que las unidades formadoras de colonias se hubieron establecido,
y al alcanzar la confluencia después del primer pase.
Se sedimentaron de nuevo 6,4 x 10^{5} células
(para obtener 40.000 células - 50.000 células/0,1 ml inyectados)
mediante centrifugación y a continuación se resuspendieron en 1,5 ml
de plasma rico en plaquetas (PRP). El PRP se preparó a partir de
sangre recién obtenida, procedente del mismo caballo, recogiendo 10
ml de sangre en tubos esterilizados para recogida de sangre que
contenían heparina, 500 UI/ml, y centrifugándolos a 1.620 g durante
12 minutos. Los 2,5 ml de plasma de la parte superior se desecharon
y seguidamente se aspiraron 2,5 ml de PRP. Se ha encontrado que
esta técnica produce un PRP con más de tres veces el número de
plaquetas encontrado en el plasma normal.
Los 1,5 ml de suspensión celular se inyectaron
luego dentro del tendón flexor digital superficial dañado del mismo
caballo del que las células procedían originariamente. La inyección
se realizó de manera estéril, bajo sedación y analgesia perineural,
en el sitio metacarpiano proximal, en 15 inyecciones de 0,1 ml
(aproximadamente 43.000 células/0,1 ml) administradas usando una
aguja de 23G, de 2,54 cm (1 pulgada), a lo largo de la extensión de
la lesión, desde las caras palmar y medial del tendón, al tiempo que
se realizaba una vigilancia ultrasonográfica. La extremidad después
se vendó con un vendaje estándar de Robert Jones modificado, de tres
capas.
Este protocolo dio como resultado la generación
de unidades formadoras de colonias, características de las MSC de
otras especies (Figura 1).
El número de células recuperadas antes y después
de efectuado el pase se muestra en la Tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Estos números de células reflejan el número
relativo de las MSC aisladas en partes alícuotas procedentes del
mismo caballo, ya que todas las muestras se traspasaron al mismo
tiempo. Se obtuvieron aproximadamente un millón de células después
del cultivo inicial durante 14-16 días. Además, esto
muestra que el pase expande el número de células en un factor de
entre 2 y 20 veces. No crecieron MSC en el cultivo de una muestra de
control de sangre periférica.
Había una región central hipoecoica en el tendón
flexor digital superficial, que ocupaba el 45% de la superficie
transversal del tendón en la zona en la que la lesión era máxima y
se extendía desde la región metacarpiana media hasta la distal
(niveles 3 - 5 (Smith y col., 1994); 16 cm - 26 cm distal al hueso
carpiano accesorio). La superficie transversal del tendón en la
zona en la que la lesión era máxima fue el 64% más grande que la
del tendón contralateral. La lesión central se había empezado ya a
rellenar con tejido de granulación/fibroso ecogénico (Figura
2).
La colocación precisa de las MSC dentro de la
lesión central del tendón se identificó claramente por las burbujas
de aire introducidas en el momento de la inyección. Se observó que
la mezcla de células/plasma inyectada se extendía en dirección
próximo-distal a los límites de la lesión.
No se hubo hinchazón observable de la extremidad
después del procedimiento. En un nuevo examen, 10 días después de
la implantación, no hubo cojera al andar y no hubo un aumento de
engrosamiento en la región del tendón flexor digital superficial,
aunque hubo dolor ligero a la presión digital. Una repetición de la
ultrasonografía no mostró ningún cambio en la sustancia del tendón
(Figura 2). Las medidas de la superficie transversal en los siete
niveles mostraron un cambio mínimo por la reimplantación (porcentaje
medio del cambio para todos los niveles, 0,46% (descenso); cambio
máximo en uno cualquiera de los niveles, 9% (descenso)). No hubo por
lo tanto ninguna alteración de la sustancia tendinosa.
Esta nueva técnica proporciona un método para la
reimplantación de un número grande de MSC autólogas, que han sido
expandidas en cantidad in vitro, dentro del tendón dañado del
mismo caballo. Estas células tienen el potencial de producir una
auténtica matriz tendinosa en vez de un tejido cicatricial poco
funcional, como sucede con la tendinopatía de flexor digital
superficial tratada de modo convencional. La tendinopatía equina de
flexor digital superficial, con su frecuente daño situado en
posición central y rodeado de tejido tendinoso relativamente
intacto o de un paratendón grueso (que invariablemente permanece
intacto incluso después de las lesiones tendinosas más graves
inducidas por una distensión), en un tendón del tamaño suficiente
para hacer una práctica precisa una inyección
intra-tendinosa, se presta perfectamente como vaso
cerrado en el que implantar las MSC. Aunque la implantación de las
MSC dentro de otras formas de tendones y ligamentos dañados (p.
ej., lesiones eccéntricas) puede también resultar beneficiosa, la
colocación exacta, la retención de las células y la minimización
del trauma iatrogénico causado por el procedimiento de la inyección
son más problemáticos, pero aún así se pueden realizar, por
ejemplo, usando suspensiones que gelifican in situ.
Hubo una mayor variación del número células
antes del pase que después del pase porque el número de células
medido antes del pase estaba en subconfluencia y estaba en relación
con el número de unidades formadoras de colonias presentes en la
placa, derivadas de las MSC individuales. El número de células en la
confluencia después del pase se esperaría que fuera más constante
debido a que las células se expanden hasta que cubren la totalidad
de la superficie del matraz. Por lo tanto, el pase será con
frecuencia necesario para expandir suficientemente el número de
células.
Se hizo un intento para introducir
aproximadamente 50.000 células/0,1 ml (aproximadamente 500.000
células en total). En vista de la rápida expansión de las células
in vitro después del pase, se esperaba que este número de
células fuera suficiente para poblar la lesión central del tendón.
Ciertamente, la expansión de las MCS in vitro permite la
implantación autóloga de un número considerablemente mayor de MSC
del que se puede disponer de manera endógena o del que se puede
suministrar mediante la inyección directa de médula ósea, y evita
los potenciales efectos adversos de otros componentes de un aspirado
de médula ósea. Además, el almacenamiento de un exceso de células
congeladas proporciona una fuente adicional de MSC en el caso de
que se requirieran con posterioridad.
En este caballo, se dejó tiempo suficiente para
que tuviera lugar una angiogénesis adecuada y para que se formara
tejido de granulación el cual sería más probable que soportara a las
MCS que una lesión hemorrágica anterior. En un tejido tendinoso en
las primeras fase de la cicatrización están presentes abundantes
factores de crecimiento (Cauvin, 2001) y las MCS expandidas se
suministraron en un plasma rico en plaquetas para aumentar este
medio rico en factores de crecimiento.
Este estudio ha demostrado que los primeros
mililitros de un aspirado de médula ósea procedentes del esternón
pueden producir un número sustancial de MSC después de la expansión
en cultivo (del orden de 10^{6} células a partir de 1,8 ml de
médula ósea). La técnica de recuperación de las MSC equinas a partir
de médula ósea, de su cultivo y expansión ex vivo, y de su
reimplantación es tanto racional como factible.
Desde el comienzo de este estudio, los autores
han tratado 6 casos que se han resuelto bien. Dos caballos como
defectos hipoecoicos obvios ("agujeros negros") en el tendón,
en el momento de la implantación mostraron un rellenado rápido de
los efectos. Los otros casos, que eran más crónicos, y por lo tanto
ya rellenados largamente en el momento de implantación, mostraron
un cambio menor.
Lesión en el tendón flexor digital superficial o
en el ligamento suspensor de la cara palmar del metacarpo, en la
que no está implicada una vaina tendinosa. Solamente se incluirán
las lesiones que tengan un núcleo central definido y la lesión
actual debe tener una duración de más de 3 semanas y menos de 3
meses.
1) Reconocimiento médico de referencia que
incluye un examen ultrasonográfico completo y obtención de una
muestra de sangre (para la preparación de plasma enriquecido en
plaquetas y del estudio de marcadores).
2) Superficies transversales del tendón dañado
que han de ser calculadas, que incluyen la superficie transversal
del tendón y de la lesión para los siete niveles transversales de la
región metacarpiana, para obtener un porcentaje de implicación de
la lesión (gravedad).
3) Después de la sedación (con un agonista
alfa-2 y butorfanolphanol), de rasurado y fregado a
lo largo del esternón, se identificarán las esternebras
individuales usando ultrasonido diagnóstico y el espacio
inter-esternebral marcará en la piel con un
rotulador esterilizado.
4) La infiltración local de un anestésico local
se pondrá sobre el sitio de la aspiración de médula (en el centro
de dos esternebras adyacentes). Se hace una incisión punzante a
través de la piel usando un escalpelo del núm. 11. Una aguja de
Jamshidi para biopsia se introduce hasta que choca con la
esternebra. Se empuja unos 3 cm - 4 cm más hacia el interior de la
esternebra y a continuación se aspiran 2 partes alícuotas de 2 ml
de cada una de las dos esternebras, en jeringuillas de 2 ml,
precargadas con 500 UI de heparina (0,2 ml de una concentración de
5.000 UI/ml, en cada una de las jeringuillas).
5) Después de haberse obtenido las partes
alícuotas, se extraen otros 20 ml de una de las esternebra con una
jeringuilla precargada con la misma concentración de heparina (2 ml
en una jeringuilla de 20 ml). El aspirado de médula ósea se
centrifuga luego a 2.000 rpm durante 20 min y el sobrenadante se
recoge, se transfiere a tubos esterilizados de 20 ml y se congela a
-20ºC.
6) Partes alícuotas de 2 ml se transfieren a
tubos esterilizados de 5 ml.
7) Se transfieren de inmediato a Stanmore sobre
hielo.
8) Las partes alícuotas se usan para recuperar y
cultivar las MSC (véase el protocolo que se adjunta en la página
4).
9) Expansión de las MSC durante un período de
aproximadamente 1-2 semanas hasta que se forman
colonias de MSC sobre el plástico. Las células se someten a un pase
y se expanden de nuevo (durante \sim5 días hasta que se hacen
confluentes), momento en el que hay aproximadamente 7 x 10^{6}
células/ml.
10) Se retiran las células de los matraces y se
dividen en 3 partes alícuotas.
11) Se centrifugan en tubos esterilizados (1.000
rpm durante 10 minutos) para sedimentar las células.
12) Parte alícuota 1, se usa para caracterizar
las células (es decir, para garantizar que son MSC).
Parte alícuota 2, las células se congelan en
DMSO (para su futuro uso potential).
Parte alícuota 3, se preparan para ser
inyectadas.
13) Se retira el sobrenadante.
14) Se sedimentan las células (aproximadamente 7
x 10^{6} células) se lavan con DMEM recién preparado sin
suero.
15) Se centrifugan en tubos esterilizados (1.000
rpm durante 10 minutos) para sedimentar las células.
16) Se resuspenden las células en 2 ml de plasma
rico en plaquetas (PRP) (o en sobrenadante de médula), previamente
descongelado, derivado del mismo caballo.
17) Se inyectan las células en el tendón dañado
y de manera estéril, bajo sedación y analgesia perineural, usando
múltiples pinchazos de la aguja (23G, aguja de 2,54 cm (una
pulgada)), 10 inyecciones de 0,1 ml a todo lo largo de la
lesión.
18) Se venda la extremidad con un vendaje
estándar de Robert Jones modificado.
19) Se escanean los tendones a los 3 días de la
inyección y después el caballo es dado de alta en el hospital.
20) Se escanean los tendones a los 3 días de la
inyección y después el caballo es dado de alta en el hospital.
21) El caballo descansa en el box durante 1
semana y después se le pasea con ejercicio controlado durante 3
semanas más antes de repetir el análisis ultrasónico.
22) Se repiten los exámenes ultrasónicos y la
obtención de muestras de sangre mensualmente, al mismo tiempo que
se sigue el programa de ejercicios controlados que se muestra a
continuación:
23) Se comparan los resultados con un grupo de
caballos de edades parejas, con lesiones similares tratadas de una
manera conservadora con solamente el anterior programa de
ejercicios.
\vskip1.000000\baselineskip
Evolución ultrasonográfica
Niveles de marcadores
Evolución atlética
\vskip1.000000\baselineskip
En caso de que el animal sea sacrificado
mediante métodos de eutanasia, se recupera el tendón para someterlo
a análisis mecánicos y de la matriz.
Ficoll | Médula |
Jeringuilla de 5 ml | 3x Pipeta de 12 ml |
Aguja hipodérmica verde | Pipeta automática |
Universal | Cubo de desechos |
2x Pipeta de transferencia |
\vskip1.000000\baselineskip
1. Se invierte la botella de Ficoll para mezclar
su contenido, se desprende el tapón de polipropileno, se inserta
una jeringuilla a través del septo y se inyecta aire para igualar la
presión. Se invierte la botella y se extraen 3 ml de líquido.
2. Se extienden con cuidado 4 ml de médula ósea
sobre 30 ml de Ficoll. Se consigue una mejor disposición de las dos
capas manteniendo el universal derecho y dispensando dispensando la
médula lentamente, dejándola caer por el lateral del universal.
3. Se centrifuga a 1.510 rpm durante 30 minutos
(el programa 5 de la centrífuga en la cámara 2 se detiene
lentamente y no revuelve las capas) de manera que se forma una capa
leuco-plaquetaria de color pajizo entre el plasma y
el residuo de eritrocitos en el Ficoll.
4. Se traslada la capa
leuco-plaquetaria a un universal recién preparado
usando una pipeta de transferencia. Solamente deben quedar células
mononucleares en la suspensión.
\vskip1.000000\baselineskip
- DMEM:
- 500 ml; glucosa 4.500 mg/l, L-glutamina y piruvato sódico,
- \quad
- 50 ml de suero de ternera fetal al 10%
- \quad
- Penicilina 50 U/ml y Estreptomicina 50 \mug/ml
2x T75 / 2x T25
Cubo de desechos
aguja del 23
jeringuilla de 5 ml
3x pipetas de 12 ml
\vskip1.000000\baselineskip
5. Se lava la capa
leuco-plaquetaria resuspendiendo las células en 10
ml DMEM. Se centrifuga a 1.500 rpm durante 10 minutos para separar
la heparina y el Ficoll.
6. Se retira el sobrenadante. Las células madre
deben estar en el sedimento.
7. Se resuspende el sedimento en 2 ml de DMEM
usando una aguja hipodérmica de calibre 23 para obtener una
suspensión de un solo tipo de células aisladas.
8. Se reparten las células en los dos matraces
T75. Los matraces T25 se pueden usar si solamente se hubiera
recogido un volumen pequeño de aspirado.
\vskip1.000000\baselineskip
9. Se deja que las células primarias sembradas
se adhieran al matraz durante dos días antes de cambiar el medio.
(Si las células se han instalado en un jueves, déjense durante el
fin de semana).
10. Se cambia el medio cada dos días.
- Los matraces pueden mostrar un aspecto turbio.
Esto es debido a que en la suspensión hay eritrocitos que se
retirarán mediante lavado en los lavados posteriores con DMEM.
- Las células madre se puede observar
inicialmente como objetos redondos y brillantes que se han adherido
al matraz al contrario que las células de alrededor que permanecen
en suspensión.
- Las CFU-F se deben observar
después de dos semanas en cultivo.
NB Se producen 100 - 500 MSC humanas a partir
de 50 millones - 100 millones de células introducidas en el cultivo
(Hayensworth S.E. y col.).
\vskip1.000000\baselineskip
Aislamiento y expansión de MSC de caballo con el
fin de reinyectar las células en el tendón.
\vskip1.000000\baselineskip
El número de células presentes en los 4 ml
iniciales de aspirado extraído de la médula del caballo producirán
un número de células mayor en comparación con los 4 ml finales.
1. Se extrajo un aspirado de médula del esternón
del caballo en las siguientes partes alícuotas (se usó heparina en
una concentración 500 U/ml):
\vskip1.000000\baselineskip
1) Muestra 1: 1 ml - 2 ml
2) Muestra 2: 3 ml - 4 ml
3) Muestra: 5 ml - 6 ml (administrada al
caballo)
4) Muestra 3: 7 ml - 8 ml
5) Muestra 4: 9 ml - 10 ml
\vskip1.000000\baselineskip
2. Las muestras 1 y 2 se reunieron para obtener
los primeros 4 ml de una muestra de 10 ml. Las muestras 3 y 4 se
reunieron para obtener los 4 ml finales de la muestra de 10 ml. Se
les dio las denominaciones de:
\vskip1.000000\baselineskip
\bullet HS1 A: Muestra 1 + 2
\bullet HS1 B: Muestra 3 + 4
\vskip1.000000\baselineskip
3. Se continuó con la técnica para aislar
células madre a partir de médula ósea anteriormente descrita. Las
células se traspasaron a 2 matraces T75 y se dejaron en cultivo
durante 19 días.
4. Se efectuó el recuento de las células y se
traspasaron a 2 matraces T175.
\vskip1.000000\baselineskip
Recuento celular:
\vskip1.000000\baselineskip
HSA1 P0 T75
\dotl3,1 x 10^{6} células/ml
HSB1 P0 T75
\dotl7,2 x 10^{5} células/ml
\vskip1.000000\baselineskip
5. Las células se cultivaron durante 5 días
hasta que alcanzaron la confluencia. El recuento de las células se
efectuó en P1 y se congelaron en DMSO.
\vskip1.000000\baselineskip
Recuento celular:
\vskip1.000000\baselineskip
HSA 1 P1 T175
\dotl7,8 x 10^{6} células/ml
HSB 1 P1 T175
\dotl4,48 x 10^{6} células/ml
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Recuento celular efectuado en P0:
\vskip1.000000\baselineskip
HSA 1 P0 T75
\dotl3,1 x 10^{6} células/ml
HSB 1 P0 T75
\dotl7,2 x 10^{5} células/ml
\vskip1.000000\baselineskip
Recuento celular efectuado en P1:
\vskip1.000000\baselineskip
HSA 1 P1 T 175
\dotl7,8 x 10^{6} células/ml
HSA 1 P1 T175
\dotl4,48 x 10^{6} células/ml
\vskip1.000000\baselineskip
Hay una mayor producción de células en los 4 ml
iniciales de aspirado en comparación con los últimos 4 ml de la
médula extraída.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Lesión: Tendinitis de flexor digital
superficial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La repetición de ecografías que se muestra
corresponden al número mínimo. Se pueden realizar nuevos exámenes
cuando sea necesario.
Este programa de ejercicios se puede modificar
(acortar o alargar) dependiendo de la evolución del caso.
\newpage
Informe veterinario: 1
- Asunto:
- Caso núm. 333942
- \quad
- "Setta", una hembra TB de color gris y de 10 años de edad
- Fecha del examen:
- 6 - 19 de junio de 2002
HISTORIAL CLÍNICO: El poni anteriormente
mencionado fue remitido al Royal Veterinary College para una
inyección de médula ósea de una lesión de su tendón flexor digital
superficial en la extremidad anterior izquierda.
RECONOCIMIENTO FÍSICO: En el reconocimiento
inicial había solamente un ligero engrosamiento en el tendón flexor
digital superficial de su extremidad anterior izquierda, en la
región metacarpiana media, aunque todavía había una moderada
respuesta de dolor frente a la palpación. Además, se apreciaba que
había un leve engrosamiento del tendón flexor superficial digital
en la región metacarpiana media de la pata anterior derecha.
ULTRASONOGRAFÍA: La ultrasonografía reveló la
presencia de una lesión central grande en el SDFT anterior
izquierdo, que ocupaba aproximadamente el 55% de la superficie
transversal del tendón en la zona de lesión máxima (entre los
niveles 3 y 4). Esta lesión se extendía a través de la mayor parte
de la longitud de la región metacarpiana. En la extremidad anterior
derecha había también una lesión central, pero ésta era mucho más
pequeña y se restringía a los niveles 3 y 4. No es inusual que una
tendinitis bilateral esté presente. Los cambios ultrasonográficos
fueron consecuentes con el historial clínico de una duración de la
lesión de 4 semanas.
Este caso se resolvió bastante bien con un
tratamiento conservador, aunque sin embargo, la extensión de la
lesión indicaba que ciertamente no había un buen pronóstico para un
retorno a un alto nivel de ejercicio. Se trataron los diferentes
pros y contras de considerar una inyección de médula ósea, siendo la
razón fundamental suministrar células madre mesenquimales, con o
sin factores de crecimiento asociados, que puedan mejorar la
curación total de las lesiones de tendones/ligamentos.
CIRUGÍA: Después de tratar extensamente el caso
con el dueño, se decidió que se probaría la inyección de médula
ósea en este caso. Ésta se realizó el 7 de junio de 2002, y la
médula ósea se obtuvo de las esternebras bajo anestesia general. Se
modificó la técnica procedente de Estados Unidos, previamente
descrita, en la que se obtienen volúmenes grandes de médula ósea
procedentes de las esternebras y se inyectan en el tendón. Existen
dos razones por las que la técnica se modificó. En primer lugar,
volúmenes grandes de fluido causarán una considerable alteración en
un tendón ya mínimamente dilatado, lo cual se pensó que sería
contraproducente. Pero además, existe evidencia por un trabajo
llevado a cabo en el Institute of Orthopaedics en Stanmore,
que sugiere que la mayoría de las células madre mesenquimales están
presentes en los primeros mililitros de un aspirado de médula ósea.
Por lo tanto, se extrajeron distintos aspirados de médula ósea
procedentes de esternebras distintas, en partes alícuotas de 2 ml,
y se inyectaron tanto en el tendón flexor digital superficial
derecho como en el izquierdo, a través de múltiples incisiones
punzantes. En total se inyectaron 6 ml de aspirado de médula ósea
dentro de la lesión central del SDFT de la extremidad anterior
izquierda y 4 ml en el SDFT de la extremidad anterior derecha. El
caballo se recuperó bien de la GA y las extremidades permanecieron
vendadas para prevenir una hinchazón postoperatoria.
EVOLUCIÓN CLÍNICA: Dos escáneres postoperatorios
mostraron que las inyecciones se habían puesto con precisión en el
interior de la lesión central de ambas extremidades. Hubo un cierto
aumento de heterogeneidad en las lesiones, pero éstas no aumentaron
de tamaño, lo cual animaba y apoyaba la decisión de no usar
volúmenes grandes. Hubo una cierta hinchazón peritendinosa, aunque
fue mínima y el aspecto estético del tendón en esta etapa fue muy
satisfactorio.
INSTRUCCIONES PARA EL ALTA: El caballo fue dado
de alta el 19 de junio y se le mandó que regresara para un escáner
de seguimiento en los siguientes días:
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Informe veterinario 2:
- Fecha del reconocimiento:
- 1 de agosto de 2002
HISTORIAL CLÍNICO: El caballo había sufrido una
tendinitis del tendón flexor digital superficial, que se había
tratado con una inyección de médula ósea el 7 de junio de 2002. Este
reconocimiento corresponde por lo tanto a 8 semanas después de
tratamiento. El caballo recibe actualmente un paseo controlado en
cantidad variable, entre de 10 a 30 minutos al día.
EVALUACIÓN DE LA ANDADURA: Setta se mantuvo
firme fue firme en el paseo, pero presentó una extensión ligeramente
reducida de la articulación metacarpo falangeal. Exhibió una cojera
de la extremidad anterior izquierda 1/10 en el trote en línea
recta, con cierta molestia suave cuando giraba. Dada la ausencia de
herraduras, esta molestia puede ser debida a dolor en las
patas.
RECONOCIMIENTO FÍSICO: Había solamente una
ligera hinchazón de la región metacarpiana de la extremidad anterior
izquierda. Había una hinchazón mínima en la extremidad anterior
derecha. No se evidenció enema y los bordes del tendón estaban
perfectamente definidos y suaves a la palpación. Una respuesta
moderada se inició por presión digital en los tendones flexores en
ambas extremidades anteriores.
ULTRASONOGRAFÍA: La ecografía mostró que las
lesiones centrales se estaban rellenando en ambas extremidades
anteriores, aunque sin embargo este tejido no exhibió un fuerte
patrón estriado en ese momento. No hubo incremento en la superficie
mineralizada previamente observada en el SDFT delantero izquierdo
aunque hubo una pequeña superficie proximal a ésta que puede estar
desarrollando cierta mineralización. En la actualidad no hay ninguna
zona de sombreado, y es una superficie localizada muy pequeña, pero
esta superficie será vigilada cuidadosamente en el futuro.
COMENTARIOS Y RECOMENDACIONES: La evolución de
este caballo es buena; sin duda alguna el tratamiento no parece
haber empeorado la situación, y la lesión centra se está rellenando
bien. Es difícil saber si esto es más rápido o de mejor calidad,
solamente el tiempo dirá a medida que el tejido madure.
\vskip1.000000\baselineskip
Informe veterinario 3:
- Fecha del reconocimiento:
- 2 de junio de 2003
HISTORIAL CLÍNICO: Este poni había sufrido una
tendinitis del tendón flexor digital superficial en la extremidad
anterior izquierda en mayo de 2002. El Royal Veterinary College
Equine Referral Hospital había admitido el 6 de junio de 2002
el tratamiento en el interior de la lesión con médula ósea aspirada
del esternón e inyectada directamente en el tendón de ambas
extremidades anteriores, derecha e izquierda. Esto se realizó
mediante anestesia general. Desde entonces el caballo ha vuelto a
ser examinado el 1 de agosto de 2002, que fue unas seis semanas más
o menos después del tratamiento. En esta etapa hubo una hinchazón
mínima en la región metacarpiana del SDFT de la extremidad anterior
izquierda. La superficie de mineralización en el SDFT que se había
observado antes del tratamiento, no era mayor, aunque había una
superficie extra que tenía un aspecto un poco sospechoso de haber
desarrollado cierta mineralización. El caballo no volvió a tener
nuevos reconocimiento hasta el 2 de junio de 2003. El poni
actualmente ha vuelto a jugar al polo sin problemas obvios.
EVALUACIÓN DE LA ANDADURA: El poni se mantuvo
firme al paso y al trote en línea recta.
RECONOCIMIENTO FÍSICO: Había un ligero
alargamiento en el tendón flexor superficial en la región
metacarpiana media de la extremidad anterior izquierda, pero no
hubo dolor importante a la palpación. Sin embargo, sí pareció haber
un incremento en la rigidez de los SDFT derecho e izquierdo, siendo
más marcada en la extremidad anterior izquierda. El reconocimiento
en el trabajo a la cuerda sobre una superficie dura reveló una
cojera mínima. No obstante, las pruebas de flexión fueron positivas
en ambas extremidades derecha e izquierda, exacerbándose la cojera
en 3/10 y 2/10 respectivamente.
EXAMEN ULTRASONOGRÁFICO: Este reconocimiento
reveló la presencia de una mineralización extensa dentro de la
región metacarpiana anterior derecha del tendón flexor digital
superficial, con múltiples artefactos de sombreado. Es difícil
afirmar la calidad del resto del tendón en proceso de curación
debido a este sombreado creado por estos artefactos. Hubo un
pequeño grado de mineralización también presente en la extremidad
anterior derecha.
EXAMEN RADIOGRÁFICO: Se obtuvieron radiografías
lateromediales de ambas regiones metacarpianas. Esto reveló una
mineralización intratendinosa en el interior del tendón flexor
digital superficial, pero ninguna evidencia de una mineralización
detectada radiográficamente en la extremidad anterior derecha.
SUMARIO: Parecería que la mineralización ha
avanzado considerablemente en el SDFT anterior izquierdo, muy
probablemente a consecuencia de la inyección de médula ósea. El
aspecto de estos tendones es decepcionante, aunque esto obviamente
no compromete la capacidad del animal para jugar polo en la
actualidad.
La modificación para usar las células en cultivo
como una manera alternativa para proporcionar las células
necesarias para reparar en una tendinitis de SDFT, se considera que
disminuye el riesgo de mineralización.
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Claims (8)
1. Uso de una composición de MSC en una
suspensión líquida de sobrenadante de médula ósea, en la fabricación
de un medicamento para tratar una lesión natural y subcutánea,
inducida por una distensión, en un tendón o en un ligamento de un
caballo, perro, camello o ser humano, en el que el medicamento queda
retenido en el sitio de la lesión en una cavidad.
2. Un uso según la reivindicación 1, en el que
las células de la composición contienen MSC al menos al 10%, o MSC
al menos al 50%, o MSC al menos al 60%, o MSC al menos al 70%, o MSC
al menos al 90%, o MSC al menos al 95%, o MSC al menos al 99%.
3. Un uso según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el sitio de la lesión
comprende una cavidad, o una lesión que se puede cerrar para que
forme una cavidad, para retener la composición.
4. Un uso según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la lesión está en un tendón
o ligamento seleccionado entre el grupo que consiste en tendón
flexor digital superficial (SDFT), ligamento suspensor, tendón
flexor digital profundo, ligamento cruzado y ligamento accesorio del
tendón flexor digital profundo.
5. Un uso según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la composición comprende un
agente gelificante.
6. Un uso según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la composición comprende
además uno o más factores de crecimiento, factores de
diferenciación o factores de regeneración que estimulan la
diferenciación de las MSC en tenocitos y desestimulan la
diferenciación de las MSC en tejido óseo.
7. Un uso según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que las MSC son alógenas o
autólogas.
8. Un uso según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que las MSC derivan de: i) la
médula ósea del individuo que ha de ser tratado; o de ii) la sangre
de cordón umbilical del individuo que ha de ser tratado, recuperada
con anterioridad.
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