WO2014167142A1 - Procedimiento para el tratamiento de células madre mesenquimales equinas y sistema para llevar a cabo el procedimiento - Google Patents

Procedimiento para el tratamiento de células madre mesenquimales equinas y sistema para llevar a cabo el procedimiento Download PDF

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WO2014167142A1
WO2014167142A1 PCT/ES2013/070226 ES2013070226W WO2014167142A1 WO 2014167142 A1 WO2014167142 A1 WO 2014167142A1 ES 2013070226 W ES2013070226 W ES 2013070226W WO 2014167142 A1 WO2014167142 A1 WO 2014167142A1
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WO
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solution
streptomycin
stem cells
penicillin
sterile
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PCT/ES2013/070226
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French (fr)
Inventor
Almudena PRADERA MUÑOZ
Original Assignee
Equicord, S.L.
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0665—Blood-borne mesenchymal stem cells, e.g. from umbilical cord blood

Definitions

  • the present invention relates to a method for the treatment of equine mesenchymal stem cells and a system for carrying out the procedure.
  • the invention provides a method for extracting, isolating, culturing and preserving mesenchymal stem cells (MSCs) from equine umbilical cord tissue, as well as a kit-type system for performing said procedure.
  • MSCs mesenchymal stem cells
  • the invention finds its application in the veterinary field, especially for the treatment and / or prophylaxis of horse diseases, for example those derived from musculoskeletal problems, aiding tissue regeneration of ligaments, joints, tendons, by example, as well as wound healing, treatment of corneal ulcers, laminitis, etc.
  • Stem cells are undifferentiated cells capable of dividing indefinitely and differentiating into any type of tissue.
  • mesenchymal stem cells are adult stem cells, that is, they come from an individual born, who are able to differentiate into tissues such as cartilage, tendon, bone, skin, muscle, etc. , being useful, therefore, in veterinary medicine for the regeneration and repair of injured tissues.
  • Cell culture media, kits and methods of use refers to a cell culture medium supplemented with albumin and free of xenogenic products, a medium supplemented for cell culture and a kit for the cultivation of non-hematopoietic cells of mesodermal origin for application in research and in clinical therapies.
  • WO2004 / 022078 “Pharmaceutical kits comprisingmesenchymalstemcells”, describes a method for the treatment of skeletal tissue damage comprising the administration of a composition of mesenchymal cells.
  • ES 201 031 01 6 “Mesenchymal cells and membrane composed for the treatment of osteochondral lesions”, refers to a pharmaceutical composition comprising mesenchymal stem cells housed in a composite membrane that has at least two layers with different structure, the bottom layer being porous and the top layer compact, preferably of collagen, as well as the use of said pharmaceutical composition for the treatment of osteochondral lesions.
  • An object of the present invention is to provide a method for extracting, isolating, culturing and preserving mesenchymal stem cells (MSCs) from Equine umbilical cord tissue easily without the need for umbilical cord collection to be performed by qualified personnel, while maintaining the sterility and functionality conditions of the collected material. It is also the object of the invention a kit type system for carrying out said procedure that maintains sterility from the moment the umbilical cord is collected and during transport to the maintenance center.
  • MSCs mesenchymal stem cells
  • the method for extracting, isolating, culturing and preserving mesenchymal stem cells (MSCs) from equine umbilical cord tissue includes:
  • the extracted cord fraction is introduced into a wash solution consisting of povidone iodine, for example Betadine®, in a sterile physiological serum solution, keeping the cord fraction submerged in said solution for 30 minutes;
  • the cord fraction is removed from the wash solution and introduced into a transport solution consisting of amphotericin B, penicillin, streptomycin, and gentamine in sterile physiological serum, keeping at a temperature between 5-8 ° C for transport to the laboratory;
  • cord fraction is then extracted from the transport solution in sterile environment provided by a laminar flow hood and an acroscopic review of its state is carried out at laboratory temperature;
  • the cord fraction is washed with physiological serum, then the amnion is removed by blunt dissection and sterile technique and discarded; optionally before removing the amnion, the fraction is washed with ethanol
  • the fragments are immersed uncompressed in a laboratory wash solution consisting of amphotericin B, penicillin, streptomycin and gentamicin in physiological serum and kept under refrigeration at 2-8 ° C for 2-4 hours;
  • the solid fraction obtained is filtered, discarding the liquid, and digested in a digestion solution consisting of collagenase type I, penicillin, streptomycin in DMEN 4.5 glucose + L-glutamine, incubating at 37 ° C and 5% C0 2 for 15-24 hours;
  • the result of the centrifugation obtained is seeded with a solution of culture medium consisting of fetal bovine serum, amphotericin B, gentamicin, penicillin and streptocycline in DMEN 4.5 glucose + L-glutamine for a maximum of 96 hours or up to a confluence of 90%, at 37 ° C and 5% C0 2 ;
  • the pellets are cryogenized in a solution of DMEN 4, 5 gl ucosa + L-glutamine, fetal bovine serum, DMSO, penicillin and streptomycin at -80 ° C, keeping at this temperature for at least 24 hours, for subsequent maintenance at -196 ° C until use.
  • the washing solution of step 2) is prepared by dissolving in sterile 10% povidone iodinated physiological serum at a concentration of between 0.10% and 20.00%, keeping at 2 -5 ° C until use.
  • the transport solution of step 3) is prepared by dissolving in sterile physiological serum amphotericin B 0.1 pg / ml - 8 pg / ml, penicillin 100-500 Ul / ml, streptomycin 100 pg / ml - 500 pg / ml and gentamicin 30 pg / ml - 300 pg / ml, kept at 2-5 ° C until use.
  • the laboratory wash solution from step 7) is prepared by dissolving in sterile physiological serum amphotericin B 0.1 pg / ml - 8 Mg / ml, penicillin 100-500 Ul / ml, streptomycin 100 pg / ml - 500 pg / ml and gentamicin 30 pg / ml - 300 pg / ml, kept at 2-5 ° C until use.
  • the digestion solution of step 8) is prepared by dissolving in DMEN 4.5 glucose + L-glutamine, collagenase type I 0.50 mg / ml - 2.00 mg / ml, penicillin 100 Ul / ml - 200 Ul / ml and streptomycin 100 pg / ml - 200 pg / ml, keeping at a temperature between - 15 and -22 ° C until use.
  • the base culture medium solution of step 9) is prepared by dissolving in DMEN 4.5 glucose + L-glutamine fetal bovine serum 7.5% -12.5%, penicillin 75 Ul / ml - 125 Ul / ml and streptomycin 75 pg / ml - 125 pg / ml, kept at 2-5 ° C until use.
  • the culture medium solution of step 10) is prepared by dissolving in DMEN 4.5 glucose + L-glutamine fetal bovine serum 7.5% -12.5%, amphotericin B 0, 10 pg / ml - 5 pg / ml, gentamicin 10 pg / ml - 300 Mg / ml, penicillin 75 Ul / m - 225 Ul / ml and streptomycin 75 pg / ml - 225 pg / ml, keeping at 2-5 ° C Until its use.
  • the trypsin solution of step 1 1) is prepared by dissolving trypsin in 15-25% physiological serum, keeping at a temperature between -15 and -22 ° C until use.
  • the cryopreservation solution of step 12) consists of DMEN 4.5 glucose + L-glutamine 40 ml - 80 ml, fetal bovine serum 30 ml - 50 ml, DMSO 5 ml - 15 my, penicillin 7,500 U. l. - 12,500 U. l. and streptom icine 7.5 mg - 12.5 mg, being maintained at a temperature between 2 and 5 ° C until use.
  • kit type system to carry out said procedure that maintains the appropriate cleaning and temperature conditions from the moment of the umbilical cord collection and during transport to the maintenance center.
  • the invention provides a kit-type system that includes, in an isothermal box capable of maintaining temperatures between 2-8 ° C for at least 48 hours, a sterile field cloth (A), at least one pair of scanning gloves (B), preferably in a self-closing bag, a pair of scissors (C), preferably in a self-closing bag, a sterile sample collection container (D) containing the washing solution from step 2), a container of collection of sterile samples (E) containing the transport solution from step 3), preferably in a self-closing bag, at least one cold accumulator (F) for 72 hours, at least one isothermal separator (G) and other than one soaper (H).
  • the kit type system includes instructions for use, animal data sheets, sticker with data and shipping address, roll of adhesive tape to seal the box and a temperature indicator.
  • the isothermal box that includes the aforementioned elements is made of high density injected polyurethane and coated with brown paper with polyethylene anti-humidity treatment.
  • the invention is explained below on the basis of an exemplary embodiment, which is merely illustrative and in no case limiting the scope thereof.
  • sample collection containers containing the washing solution (D) and the transport solution (E) are removed from the self-closing bags, preferably approved for transport. Both sample collection vessels will be kept at a temperature between +2 and + 8 ° C, for example in a domestic refrigerator.
  • the cold storage tanks (F) must be kept between -15 and -22 ° C, for example in a domestic freezer, until used. The rest of the elements will be stored inside the box at room temperature and away from sources of heat and / or light.
  • a nursing table or nursing table is placed in the most aseptic place possible, but never inside the box, a small portable table.
  • the operator puts on the scanning gloves (B), place the sterile field cloth (A) on the table.
  • the umbilical cord is collected directly with gloved hands.
  • cutting the cord with the scissors (C) about 7 centimeters from the placenta, it is washed with abundant water with a soft jet, in order to clean the thickness of the straws attached to it.
  • the cord is immersed in the sterile sample collection container containing the washing solution (D) for 30 minutes, placing its corresponding lid.
  • the operator removes the scanning gloves (B), discarding them.
  • the operator puts on a new pair of scanning gloves takes the cord from inside the container that contains the washing solution (D) and introduces it into the one corresponding to the transport solution (E).
  • the wash solution is discarded.
  • the container (E) is inserted into a bag next to one of the soakers (H) and it is closed.
  • the cold accumulators (F) are removed from the freezer and placed in the box.
  • the isothermal separators (G) attached to the cold accumulators are placed.
  • the container containing the prepared cord (E) is placed in the resulting hole, placing, in the Remaining hole, scissors (C), the empty container containing the wash solution (D) and the previously filled data sheet.
  • the temperature indicator is activated and inserted into the box next to the rest of the components.
  • the box is closed and sealed with adhesive tape, sticking on the outside the sticker with the data and shipping address to the laboratory. It is transported to the laboratory within 36 hours.
  • the kit type system Upon receipt of the kit type system, it and its contents are checked, checking the good condition of all components, confirming the maintenance of the cold chain by analyzing the temperature indicator. Then, the sample container containing the umbilical cord fraction is removed and introduced into a laminar flow hood, where the cord is removed by sterile technique by performing a macroscopic review of its condition. Once the quality control has been passed and always inside the laminar flow hood, the sample is sprayed with 70% ethanol for a period of 2 to 3 minutes, subsequently washed with physiological serum, then the amnion is removed by blunt dissection and sterile technique of the entire cord, the amnion is discarded.
  • the cord is opened longitudinally with scissors and the endothelial tissue is removed by blunt dissection, discarding the endothelium. Subsequently, the cord is cut longitudinally with scissors in strips of 1 centimeter maximum width, cutting these strips into fragments of 5 millimeters.
  • Uncompressed fragments are introduced into 50 ml Falcon tubes until level 30 is reached and laboratory wash solution is added until the Falcon tube (level 50) is filled, so that all fragments are submerged in said solution.
  • the tubes are kept in a refrigerator at a temperature between +2 and + 8 ° C for 2 to 4 hours. From this point on, the fabric is considered sterile, being able to be in contact only with sterile elements.
  • the contents of each tube are passed through a filtering Büchner funnel, discarding the liquid fraction and reserving the solid.
  • the solid fraction obtained is poured into 50 ml Falcon tubes until reaching level 30, filling each tube with digestion solution to level 40.
  • the tubes are sealed and placed in an incubator at 37 ° C and 5% CO2 for 3 to 24 hours. Once the digestion time has elapsed, the contents of all the tubes are poured, through a filtering system, into a single cuvette, achieving a separation of the solid and liquid phases. The solid phase is discarded. The liquid phase is passed through a 100 micron filter, discarding the filters. The necessary 50 Falcon type tubes are filled, up to level 1, 5 with the liquid phase, adding 30 measures only based on each base, homogenizing both phases, then centrifuging for 10 minutes at 450g The supernatant is removed by aspiration, discarding it.
  • the liquid obtained is sown in culture vessels.
  • Each vessel is supplemented with a solution of culture medium and placed in an incubator at a controlled temperature of 37 ° C and with a CO2 percentage of 5%.
  • each culture vessel is considered an independent element and allowed to stand in the incubator, until it reaches the desired confluence. Then the supernatant is removed by aspiration, discarding it. Add 5 ml of trypsin solution, stirring gently. It is introduced for at least one minute in the incubator at 37 ° C and 5% CO2. Once removed from the incubator, 7 ml of base culture medium solution is added. It is aspirated by introducing the aspirate into a Falcon type tube, which is then centrifuged for 5 minutes at 300g, the cells forming a pellet at the bottom of the tube. The supernatant is aspirated, discarded.
  • Each pellet obtained is deposited in a 2 ml cryotube, to which 2 ml of cryopreservation solution is added. This operation will be repeated with the rest of the pellets, kept in a special freezing box and labeled. This box will be placed in a freezer at -80 ° C, where it will be kept for at least 24 hours, and then immediately placed in a liquid nitrogen container at -196 ° C, where it will be kept until use.

Abstract

La presente invención se refiere a un procedimiento para el tratamiento de células madre mesenquimales equinas y a un sistema para llevar a cabo tal procedimiento. En particular, la invención proporciona un procedimiento para extraer, aislar, cultivar y preservar células madre mesenquimales (MSCs) procedentes de tejido de cordón umbilical equino, así como un sistema de tipo kit para la realización de dicho procedimiento.

Description

PROCEDIMIENTO PARA EL TRATAMIENTO DE CELULAS MADRE MESENQUIMALES EQUINAS Y SISTEMA PARA LLEVAR A CABO EL
PROCEDIMIENTO
La presente invención se refiere a un procedimiento para el tratamiento de células madre mesenquimales equinas y a un sistema para l l evar a cabo ta l procedimiento. En particular, la invención proporciona un procedimiento para extraer, aislar, cultivar y preservar células madre mesenquimales (MSCs) procedentes de tejido de cordón umbilical equino, así como un sistema de tipo kit para la realización de dicho procedim iento. Así, la invención encuentra su aplicación en el campo veterinario, en especial para el tratamiento y/o la profilaxis de enfermedades del caballo, por ejemplo las derivadas de problemas del aparato locomotor, ayudando a la regeneración tisular de ligamentos, articulaciones, tendones, por ejemplo, así como en la cicatrización de heridas, tratamiento de úlceras corneales, laminitis, etc.
Las células madre son células indiferenciadas capaces de dividirse de manera indefinida y de diferenciarse en cualquier tipo de tejido. En particular las células madre mesenquimales son células madre adultas, esto es proceden de un individuo nacido, que son capaces de diferenciarse a tejidos tales como cartílago, tendón, hueso, piel, músculo, etc. , siendo úti les, por tanto, en la medicina veterinaria para la regeneración y reparación de tejidos lesionados.
En el estado actual de la técnica se han descrito procedimientos para la extracción de células madre a partir de médula ósea, un procedimiento invasivo y limitado por la edad del donante. Así, las características invasivas de este tipo de procedimientos para obtener células madre en las cantidades adecuadas y en el momento oportuno han llevado a nuevas investigaciones para la obtención de células madre a partir de adultos y de forma extra-embrionaria, por ejemplo de membranas fetales, líquido amniótico o cordón umbilical. Así, estos procedimientos claramente no invasivos permiten la recolección de células extra- embrionarias de forma segura, ética y sencilla (AriannaBarbaraLovati y col. , Vet. Res. Commun (201 1 ), 35: 103-1 21 , "Com parison of equine bone marrow-, umbilical cord matrix and amniotic fluid-derived progenitor cells").
En este sentido, Hoynowski y col. ("Characterization and differentiation of equine umbilical cord-derived matrix cells", Biochem. Biophys. Res. Commun 2007, 362: 347-53) asilaron y caracterizaron una población de células madre procedentes de cordón umbilical equino. Este estudio, así como otros similares, pusieron de manifiesto la necesidad de establecer un protocolo de extracción de tejido no invasivo que permitiera obtener una fuente abundante de células y un bajo nivel de contaminación, en particular teniendo en cuenta que tanto el canal del parto como el entorno ambiental donde éste se produce presentan una condición no esté ri l . L a co n c l u s i ó n d e ta l es e st u d i o s es q u e l a co n ta m i n ac i ó n bacteriana/fúngica es uno de los principales problemas de este tipo de procedimientos, debido al ambiente no estéril donde se desarrollan y al posible contacto con material fecal y con el conducto del parto.
A este respecto, por ejemplo la WO2007/044418, "Cell culture media, kits and methods of use", se refiere a un medio de cultivo celular suplementado con albúmina y libre de productos xenogénicos, a un medio suplementado para el cultivo celular y a un kit para el cultivo de células no hematopoyéticas de origen mesodérmico para su aplicación en investigación y en terapias clínicas.
La WO2004/022078, "Pharmaceutical kits comprisingmesenchymalstemcells", describe un método para el tratam iento del daño de tej ido esqueletal que comprende la administración de una composición de células mesenquimales. La ES 201 031 01 6, "Células mesenquimales y mem brana com puesta para el tratam iento de lesiones osteocondrales", se refiere a una composición farmacéutica que comprende células madre mesenquimales alojadas en una membrana compuesta que presenta al menos dos capas con distinta estructura, siendo la capa inferior porosa y la capa superior compacta, preferiblemente de colágeno, así como al uso de dicha composición farmacéutica para el tratamiento de lesiones osteocondrales.
Un objeto de la presente invención es proporcionar un procedimiento para extraer, aislar, cultivar y preservar células madre mesenquimales (MSCs) procedentes de tejido de cordón umbilical equino de forma sencilla sin necesidad de que la recogida del cordón umbilical sea realizada por personal cualificado, pero manteniendo las condiciones de esterilidad y funcionalidad del material recogido. Es igualmente objeto de la invención un sistema tipo kit para la llevar a cabo dicho procedimiento que mantenga la esterilidad desde el momento de la recogida del cordón umbilical y durante su transporte hasta el centro de mantenimiento.
De acuerdo con el primer objeto de la invención, el procedimiento para extraer, aislar, cultivar y preservar células madre mesenquimales (MSCs) procedentes de tejido de cordón umbilical equino incluye:
1 ) Cortar el cordón umbilical a aproximadamente unos 7 cm de la placenta y lavarlo bajo un chorro suave de agua para eliminar el grueso de materiales extraños adheridos al mismo;
2) La fracción de cordón extraída se introduce en una solución de lavado consistente en povidona yodada, por ejemplo Betadine®, en una solución de suero fisiológico estéril, manteniendo la fracción de cordón sumergida en dicha solución durante 30 minutos;
3) Tras el tiempo indicado anteriormente, la fracción de cordón se retira de la solución de lavado y se introduce en una solución de transporte consistente en anfotericina B , penicilina, estreptom icina y gentam icina en suero fisiológico estéril, manteniéndose a una temperatura de entre 5-8°C para su transporte al laboratorio;
4) La fracción de cordón se extrae entonces de la solución de transporte en ambiente estéril proporcionado por una campana de flujo lam inar y se real iza una revisión m acroscópica de su estado a tem peratura de laboratorio;
5) Siempre bajo campana de flujo laminar, la fracción de cordón se lava con suero fisiológico, se retira entonces el amnios mediante disección roma y técnica estéril y se desecha; opcionalmente antes de retirar el amnios, la fracción se lava con etanol
6) La fracción del cordón se abre longitudinalmente y se retira el tej ido endotelial mediante disección roma, desechándose. El resto detejido se corta a continuación en tiras de cómo máximo 1 cm de ancho, troceándose en fragmentos de 5 mm de longitud;
) Los fragmentos se sumergen sin comprimir en una solución de lavado en laboratorio consistente en anfotericina B, penicilina, estreptomicina y gentamicina en suero fisiológico y se mantienen bajo refrigeración a 2-8°C durante 2-4 horas;
) Se filtra la fracción sólida obtenida, desechándose el líquido, y se digiere en una solución de digestión consistente en colagenasa tipo I, penicilina, estreptomicina en DMEN 4,5 glucosa + L-glutamina, incubándose a 37°C y 5% C02 durante 15-24 horas;
) Tras la incubación, se separan las fases, se desecha la fase sólida, se filtra la fase líquida (100 pm) y se añade una solución de medio de cultivo base consistente en suero bovino fetal, penicilina y estreptomicina en DMEN 4,5 glucosa + L-glutamina, homogeneizando el sistema, y posteriormente se centrifuga 10 minutos a 450g;
0) Tras retirar el sobrenadante, el resultado de la centrifugación obtenido se siembra con una solución de medio de cultivo consistente en suero bovino fetal, anfotericina B, gentamicina, penicilina y estremptomicina en DMEN 4,5 glucosa + L-glutamina durante como máximo 96 horas o hasta una confluencia del 90%, a 37°C y 5% C02;
1 ) Una vez alcanzada la confluencia del 90% u observada la presencia de esferoides, se aspira el sobrenadante y se añade una solución de tripsina en suero fisiológico, con agitación suave, incubándose durante al menos 1 minuto a 37°C y 5% CO2, añadiéndose solución de medio de cultivo base y centrifugando durante 5 minutos a 300g, observándose la formación de un pellet, el sobrenadante se desecha;
2) Finalmente, los pellets se criogenizan en una solución de DMEN 4, 5 gl u c o s a + L-glutamina, suero bovino fetal, DMSO, penicilina y estreptomicina a -80°C, manteniéndose a esta temperatura durante al menos 24 horas, para su posterior criomantenimiento a -196°C hasta su uso. En una realización preferente del procedimiento de la invención, la solución de lavado del paso 2) se prepara disolviendo en suero fisiológico estéril povidona yodada al 10% a una concentración de entre el 0,10% y el 20,00%, manteniéndose a 2-5°C hasta su uso.
En una realización preferente del procedimiento de la invención, la solución de transporte del paso 3) se prepara disolviendo en suero fisiológico estéril anfotericina B 0,1 pg/ml - 8 pg/ml, penicilina 100-500 U.l./ml, estreptomicina 100 pg/ml - 500 pg/ml y gentamicina 30 pg/ml - 300 pg/ml, manteniéndose a 2-5°C hasta su uso.
En otra realización preferente del procedimiento de la invención, la solución de lavado en laboratorio del paso 7) se prepara disolviendo en suero fisiológico estéril anfotericina B 0,1 pg/ml - 8 Mg/ml, penicilina 100-500 U.l./ml, estreptomicina 100 pg/ml - 500 pg/ml y gentamicina 30 pg/ml - 300 pg/ml, manteniéndose a 2-5°C hasta su uso.
En una realización preferente del procedimiento de la invención, la solución de digestión del paso 8) se prepara disolviendo en DMEN 4,5 glucosa + L-glutamina, colagenasa tipo I 0,50 mg/ml - 2,00 mg/ml, penicilina 100 U.l./ml - 200 U.l./ml y estreptomicina 100 pg/ml - 200 pg/ml, manteniéndose a una temperatura entre - 15 y -22°C hasta su uso.
En otra realización preferente del procedimiento de la invención, la solución de medio de cultivo base del paso 9) se prepara disolviendo en DMEN 4,5 glucosa + L-glutamina suero bovino fetal 7,5% - 12,5%, penicilina 75 U.l./ml - 125 U.l./ml y estreptomicina 75 pg/ml - 125 pg/ml, manteniéndose a 2-5°C hasta su uso.
En otra realización preferente del procedimiento de la invención, la solución de medio de cultivo del paso 10)se prepara disolviendo en DMEN 4,5 glucosa + L- glutamina suero bovino fetal 7,5% - 12,5%, anfotericina B 0,10 pg/ml - 5 pg/ml, gentamicina 10 pg/ml - 300 Mg/ml, penicilina 75 U.l./m - 225 U.l./ml y estreptomicina 75 pg/ml - 225 pg/ml, manteniéndose a 2-5°C hasta su uso. En otra realización preferente del procedimiento de la invención, la solución de tripsina de la etapa 1 1 ) se prepara disolviendo tripsina en suero fisiológico al 15 - 25%, manteniéndose a una temperatura entre -15 y -22°C hasta su uso.
En otra realización preferente del procedimiento de la invención, la solución de criopreservación de la etapa 12) consiste en DMEN 4,5 glucosa + L-glutamina 40 mi - 80 mi, suero bovino fetal 30 mi - 50 mi, DMSO 5 mi - 15 mi, penicilina 7.500 U. l. - 12.500 U. l. y estreptom icina 7,5 mg - 12,5 mg, manteniéndose a una temperatura entre 2 y 5°C hasta su uso.
Es igualmente objeto de la invención un sistema tipo kit para llevar a cabo dicho procedimiento que mantenga las condiciones de limpieza y de temperatura adecuadas desde el momento de la recogida del cordón umbilical y durante su transporte hasta el centro de mantenimiento.
Así, la invención proporciona un sistema tipo kit que incluye, en una caja isotérmica capaz de mantener temperaturas de entre 2-8°C durante al menos 48 horas, un paño de campo estéril (A), al menos un par de guantes de exploración (B), preferentem ente en una bolsa de autocierre, un par de tijeras (C), preferentemente en una bolsa de autocierre, un recipiente de recogida de muestras estéril (D) conteniendo la solución de lavado del paso 2), un recipiente de recogida de muestras estéril (E) conteniendo la solución de transporte del paso 3), preferentemente en una bolsa de autocierre, al menos un acumulador de frío (F) para 72 horas, al menos un separador isotérm ico (G) y a l m enos u n empapador (H). Opcionalmente, el sistema tipo kit incluye instrucciones de uso, hojas de datos del animal, pegatina con los datos y dirección de envío, rollo de cinta adhesiva para sellar la caja y un indicador de temperatura.
En una realización preferente del sistema tipo kit de la invención, la caja isotérmica que incluye los elementos antes citados está fabricada con poliuretano inyectado de alta densidad y revestido con papel de estraza con tratam iento antihumedad de polietileno. A continuación se explica la invención en base a un ejemplo de realización, que es meramente ilustrativo y en ningún caso limitativo del alcance de la misma.
Ejemplo
A la recepción del sistema tipo kit, se sacan los recipientes de recogida de muestras que contienen la solución de lavado (D) y la solución de transporte (E) de las bolsas de autocierre, preferentemente homologadas para transporte. Ambos recipientes de recogida de muestras se mantendrán a una temperatura entre +2 y +8°C, por ejemplo en un refrigerador doméstico.
Los acumuladores de frío (F) deben mantenerse entre -15 y -22°C, por ejemplo en un congelador doméstico, hasta su uso. El resto de los elementos, se guardarán en el interior de la caja a temperatura ambiente y alejada de fuentes de calor y/o de luz.
Cuando se produzca el parto, se coloca, en el lugar más aséptico posible, enfermería o sala de curas si existiese, pero nunca en el interior del box, una mesita portátil. Tras ponerse el operario los guantes de exploración (B), coloca sobre la mesita anterior el paño de campo estéril (A). Se recoge el cordón umbilical directamente con las manos enguantadas. Tras cortar el cordón con las tijeras (C), a unos 7 centímetros de la placenta, se lava con abundante agua a chorro suave, con el fin de limpiar el grueso de las pajas adheridas al mismo. Se sumerge durante 30 minutos el cordón en el recipiente de recogida de muestras estéril que contiene la solución de lavado (D), colocándose su correspondiente tapa. El operario se quita los guantes de exploración (B), desechándolos. El operario se pone un nuevo par de guantes de exploración (B) saca el cordón del interior del recipiente que contiene la solución de lavado (D) y lo introduce en el correspondiente a la solución de transporte (E). Se desecha la solución de lavado. El recipiente (E) se introduce en una bolsa junto a uno de los empapadores (H) y ésta se cierra. Se sacan los acumuladores de frío (F) del congelador y se colocan en la caja. Para evitar congelaciones no deseadas, se colocan los separadores isotérmicos (G) pegados a los acumuladores de frío. Se deposita en el hueco resultante el recipiente que contiene el cordón ya preparado (E), colocando, en el hueco restante, las tijeras (C), el recipiente vacío que contenía la solución de lavado (D) y la hoja de datos previamente rellenada. Se activa el indicador de temperatura y se introduce en la caja junto al resto de los componentes. Se cierra la caja y se sella con cinta adhesiva, pegando en su exterior la pegatina con los datos y dirección de envío al laboratorio. Se transporta al laboratorio en el plazo de 36 horas.
A la recepción del sistema tipo kit, se revisa éste y su contenido, comprobando el buen estado de todos los componentes, confirmándose el mantenimiento de la cadena de frío mediante el análisis del indicador de temperatura. Entonces, se retira el recipiente de muestras que contiene la fracción de cordón umbilical y se introduce en una campana de flujo laminar, donde se saca el cordón mediante técnica estéril realizando una revisión macroscópica de su estado. Una vez superado el control de calidad y siempre en el interior de la campana de flujo lam inar, se rocía la muestra con etanol al 70% durante un tiem po de 2 a 3 minutos, lavándose posteriormente con suero fisiológico, entonces se retira el amnios mediante disección roma y técnica estéril de todo el cordón, el amnios se desecha. Se abre longitudinalmente el cordón con unas tijeras y se retira el tejido endotelial mediante disección roma, desechándose el endotelio. Posteriormente, se corta longitudinalmente el cordón con unas tijeras en tiras de 1 centímetro de anchura como máximo, troceando dichas tiras en fragmentos de 5 milímetros.
Se introducen los fragmentos sin comprimir en tubos tipo Falcon de 50 mi hasta llegar al nivel 30 y se añade solución de lavado en laboratorio hasta llenar el tubo tipo Falcon (nivel 50), de forma que todos los fragmentos estén sumergidos en dicha solución. Los tubos se mantienen en una nevera a una temperatura entre +2 y +8°C de 2 a 4 horas. A partir de este punto, el tej ido se considera estéril, pudiendo estar en contacto sólo con elementos estériles. Una vez transcurrido este tiempo, se pasa el contenido de cada tubo, a través de un embudo Büchner de filtrado, desechando la fracción líquida y reservando la sólida. Se vierte la fracción sólida obtenida en tubos tipo Falcon de 50 mi hasta llegar al nivel 30, rellenando cada tubo con solución de digestión hasta el nivel 40. Se sellan los tubos y se introducen en una incubadora a 37°C y 5% de CO2 durante 3 a 24 horas. Una vez transcurrido el tiempo de digestión, el contenido de todos los tubos se vierte, a través de un sistema de filtrado, en una única cubeta, consiguiendo una separación de las fases sólidas y líquidas. La fase sólida se desecha. La fase líquida se pasa por un filtro de 100 mieras, desechando los filtros. Se llenan los tubos tipo Falcon de 50 necesarios, hasta el nivel 1 5, con la fase líquida, añadiendo 30 m i d e so l u ci ó n d e m ed i o d e cu l t ivo base a cad a u n o , homogeneizando ambas fases, entonces se centrifuga durante 10 minutos a 450g. Se retira el sobrenadante por aspiración, desechándolo.
Se siembra el líquido obtenido en recipientes de cultivo. Cada recipiente se suplementa con solución de medio de cultivo y se introducen en una incubadora a una temperatura controlada de 37°C y con un porcentaje de CO2 del 5%.
A partir de este momento, cada recipiente de cultivo se considera un elemento independiente y se deja reposar en la incubadora, hasta alcanzar la confluencia deseada. Entonces se retira por aspiración el sobrenadante, desechándolo. Se añaden 5 mi de solución de tripsina, agitando suavemente. Se introduce durante almenos un minuto en la incubadora a 37°C y 5% de CO2. Una vez retirado de la incubadora, se añaden 7 mi de solución de medio de cultivo base. Se aspira introduciendo el aspirado en un tubo tipo Falcon, que entonces se centrifuga durante 5 minutos a 300g, formando las células un pellet en el fondo del tubo. Se aspira el sobrenadante, desechándolo.
Se deposita cada pellet obtenido en un criotubo de 2 mi, al que se añaden 2 mi de solución de criopreservacion. Se repetirá esta operación con el resto de los pellets, manteniéndose en una caja especial de congelación y etiquetándose. Esta caja se introducirá en un congelador a -80°C, donde se mantendrá durante al menos 24 horas, para posteriormente introducirse inmediatamente en un contenedor de nitrógeno líquido a -196°C, donde se mantendrá hasta su uso.

Claims

REIVINDICACIONES
Procedim iento para el tratam iento de células madre mesenquimales equinas, en particular para extraer, aislar, cultivar y preservar células madre mesenquimales procedentes de tejido de cordón umbilical equino, caracterizado porque incluye los pasos de:
Cortar el cordón umbilical a aproximadamente unos 7 cm de la placenta y lavarlo bajo un chorro suave de agua para eliminar el grueso de materiales extraños adheridos al mismo;
Introducir la fracción de cordón extraída en una solución de lavado consistente en povidona yodada en suero fisiológico estéril, manteniendo la fracción de cordón sumergida en dicha solución;
retirar la fracción de cordón de la solución de lavado e introducirla en una sol ución de transporte cons istente en anfoterici na B , pen ici l i na, estreptomicina y gentamicina en suero fisiológico estéril;
Extraer la fracción de cordón de la solución de transporte bajo ambiente estéril proporcionado por una campana de flujo laminar y revisar su estado a temperatura de laboratorio;
Siempre bajo campana de flujo laminar, lavar con suero fisiológico y retirar el amnios mediante técnica estéril y desechar;
Abrir la fracción del cordón longitudinalmente y retirar el tejido endotelial mediante disección roma, desechándose, cortándose a continuación la fracción de cordón para obtener fragmentos pequeños;
Sumergir los fragmentos sin comprim ir en una solución de lavado en laboratorio consistente en anfotericina B, penicilina, estreptom icina y gentamicina en suero fisiológico y mantener bajo refrigeración;
Filtrar la fracción sólida obtenida, desechándose el líquido, y digerir en una solución de digestión consistente en colagenasa tipo I, penicilina, estreptomicina en DMEN 4,5 glucosa + L-glutamina, e incubar a 37°C y 5%
C02;
Separar las fases, desechar la fase sólida, filtrar la fase líquida y añadir una solución de medio de cultivo base consistente en suero bovino fetal, penicilina y estreptomicina en DMEN 4,5 glucosa + L-glutamina, homogeneizando el sistema y centrifugar;
10) Sembrar el resultado de la centrifugación anterior con una solución de med io de cultivo consistente en suero bovino fetal, anfotericina B , gentamicina, penicilina y estremptomicina en DMEN 4,5 glucosa + L- glutamina;
1 1 ) Una vez alcanzada la confluencia del 90% u observada la presencia de esferoides, aspirar el sobrenadante y añadir una solución de tripsina en suero fisiológico, con agitación suave, incubándose durante al menos un minuto, añadir medio de cultivo base y centrifugar, se observa la formación de un pellet y el sobrenadante se desecha;
12) Finalmente, criogenizar los pellets en una solución de DMEN 4,5 glucosa + L-glutamina, suero bovino fetal, DMSO, penicilina y estreptomicina a -80°C, manteniéndose a esta temperatura durante al menos 24 horas, para su posterior criomantenimiento a -196°C hasta su uso.
2. Procedim iento para el tratam iento de células madre mesenquimales equinas según la reivindicación 1 , caracterizado porque la solución de lavado del paso 2) se prepara disolviendo en suero fisiológico estéril povidona yodada al 1 0% a una concentración de entre el 0, 1 0% y el 20,00%, manteniéndose a 2-5°C hasta su uso.
3. Procedim iento para el tratam iento de célu las madre mesenquimales equinas según la reivindicación 1 , caracterizado porque la solución de transporte del paso 3) se prepara disolviendo en suero fisiológico estéril anfotericina B 0, 1 pg/m l - 8 p g/m l , pe n i ci l i n a 1 00-500 U. l./m l, estreptomicina 100 pg/ml - 500 pg/ml y gentamicina 30 pg/ml - 300 pg/ml, manteniéndose a 2-5°C hasta su uso.
4. Procedim iento para el tratam iento de células madre mesenquimales equinas según la reivindicación 1 , caracterizado porque la solución de lavado en laboratorio del paso 7) se prepara d isolviendo en suero fisiológico estéril anfotericina B 0, 1 pg/ml - 8 pg/ml, penicilina 1 00-500 U. l./ml, estreptomicina 100 g/ml - 500 g/ml y gentamicina 30 g/ml - 300 pg/ml, manteniéndose a 2-5°C hasta su uso.
5. Procedim iento para el tratam iento de células madre mesenquimales equinas según la reivindicación 1 , caracterizado porque la solución de digestión del paso 8) se prepara disolviendo en DMEN 4,5 glucosa + L- glutamina, colagenasa tipo I 0,50 mg/ml - 2,00 mg/ml, penicilina 100 U. l./ml - 200 U. l./ml y estreptomicina 100 pg/ml - 200 pg/ml, manteniéndose a una temperatura entre -15 y -22°C hasta su uso.
6. Procedim iento para el tratam iento de células madre mesenquimales equinas según la reivindicación 1 , caracterizado porque la solución de medio de cultivo base del paso 9) se prepara disolviendo en DMEN 4,5 glucosa + L-glutamina, suero bovino fetal 7,5% - 12,5%, penicilina 75 U. l./ml - 125 U. l./ml y estreptomicina 75 pg/ml - 125 pg/ml, manteniéndose a 2-5°C hasta su uso.
7. Procedim iento para el tratam iento de células madre mesenquimales equinas según la reivindicación 1 , caracterizado porque la solución de medio de cultivo del paso 10) se prepara disolviendo en DMEN 4,5 glucosa + L-glutamina suero bovino fetal 7,5% - 12,5%, anfotericina B 0, 10 pg/ml - 5 pg/ml, gentamicina 10 pg/ml - 300 pg/ml, penicilina 75 U. l./m - 225 U. l./ml y estreptomicina 75 pg/ml - 225 pg/ml, manteniéndose a 2-5°C hasta su uso.
8. Procedim iento para el tratam iento de células madre mesenquimales equinas según la reivindicación 1 , caracterizado porque la solución de tripsina de la etapa 1 1 ) se prepara disolviendo tripsina en suero fisiológico al 15 - 25%, manteniéndose a una temperatura entre -15 y -22°C hasta su uso.
9. Procedim iento para el tratam iento de células madre mesenquimales equinas según la reivindicación 1 , caracterizado porque la solución de criopreservación de la etapa 1 2) consiste en DM EN 4, 5 glucosa + L- glutamina 40 ml - 80 mi, suero bovino fetal 30 mi - 50 mi, DMSO 5 mi - 15 mi, penicilina 7.500 U. l. - 12.500 U.l. y estreptomicina 7,5 mg - 12,5 mg, manteniéndose a una temperatura entre 2 y 5°C hasta su uso.
10. Sistema tipo kit para llevar a cabo el procedim iento según las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque incl uye, en una caja isotérmica, un paño de campo estéril (A), al menos un par de guantes de exploración (B), preferentemente en una bolsa de autocierre, un par de tijeras (C), preferentemente en una bolsa de autocierre, un recipiente de recogida de muestras estéril (D) conteniendo la solución de lavado del paso 2), un recipiente de recogida de m uestras estéri l (E) conteniendo la solución de transporte del paso 3), preferentemente en una bolsa de autocierre, al menos un acumulador de frío (F) para 72 horas, al menos un separador isotérmico (G) y al menos un empapador (H).
11. Sistema tipo kit según la reivindicación 10, caracterizado porque la caja isotérmica que incluye los elementos citados está fabricada con poliuretano inyectado de alta densidad y revestido con papel de estraza con tratamiento antihumedad de polietileno.
12. Sistema tipo kit según la reivindicación 10, caracterizado porque la caja isotérmica mantiene una temperatura de entre 2-8°C durante al menos 48 horas.
13. Utilización del sistema tipo kit según la reivindicación 10, caracterizada porque, tras cortar el cordón con las tijeras (C) y lavarlo con abundante agua, la fracción de cordón se sumerge durante 30 minutos en el recipiente de recogida de muestras estéril que contiene la solución de lavado (D), para posteriormente extraerlo del interior de dicho recipiente e introducirlo en el recipiente correspondiente a la solución de transporte (E), recipiente (E) que se guarda en una bolsa con al menos un empapador (H) y, a su vez, en la caja isotérmica, donde se mantiene refrigerado mediante acumuladores de frió (F) y correspondientes separadores isotérmicos (G) para su transporte.
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