ES2300176A1

ES2300176A1 - Metodo para el diagnostico molecular de cancer de prostata, kit para implementar el metodo.

Info

Publication number: ES2300176A1
Application number: ES200600348A
Authority: ES
Inventors: Timothy Thomson Okatsu; Raquel Bermudo Gascon; Angel Ramirez Ortiz; David Abia; Carlos Martinez Alonso; Pedro Luis Fernandez Ruiz; Berta Ferrer Fabrega; Elias Campo Guerri
Original assignee: FUNDACION PRIVADA CLINICA PER; FUNDACION PRIVADA CLINICA PER A LA RECERCA BIOMEDICA; Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Current assignee: FUNDACION PRIVADA CLINICA PER; FUNDACION PRIVADA CLINICA PER A LA RECERCA BIOMEDICA; Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Priority date: 2006-02-15
Filing date: 2006-02-15
Publication date: 2008-06-01
Anticipated expiration: 2026-02-15
Also published as: EP2000543A4; ES2300176B1; US20100227317A1; WO2007093657A2; EP2000543A2; WO2007093657A3

Abstract

Método para el diagnóstico molecular de cáncer de próstata, kit para implementar el método. La presente invención se refiere a un método para el diagnóstico molecular de cáncer de próstata que comprende el análisis in vitro de la sobreexpresión o infraexpresión de combinaciones de genes capaces de discriminar con alta significación estadística las muestras de próstata tumoral de las muestras de próstata no tumoral. En particular, la presente invención se refiere a un kit para el diagnóstico molecular del cáncer de próstata capaz de llevar a cabo la detección mencionada anteriormente.

Description

Método para el diagnóstico molecular de cáncer de próstata, kit para implementar el método.

Campo de la invención

La presente invención se engloba dentro del sector de la biotecnología y específicamente dentro del campo de los métodos de diagnóstico del cáncer de próstata. Así, la presente invención se refiere a un método para el diagnóstico molecular de cáncer de próstata que comprende el análisis in vitro de la sobreexpresión o infraexpresión de combinaciones de genes capaces de discriminar con alta significación estadística las muestras de próstata tumoral de las muestras de próstata no tumoral. En particular, la presente invención se refiere a un kit para el diagnóstico molecular del cáncer de próstata capaz de llevar a cabo la detección mencionada anteriormente.

Antecedentes de la invención

El cáncer de próstata (CP) es una de las neoplasias de mayor morbimortalidad en los países industrializados y por tanto de gran impacto socio-económico [1], por lo que es objeto de intenso estudio. A pesar de este esfuerzo, y a diferencia de otros tipos de neoplasia, son comparativamente escasos los conocimientos firmes sobre los factores moleculares que determinan su iniciación, su mantenimiento y su progresión maligna. Por otro lado, la característica más singular del CP, su alta dependencia de andrógenos, puede proporcionar importantes claves para comprender algunos de los mecanismos moleculares que subyacen a la biología de este tumor.

Como en otros tumores, existe una predisposición genética a padecer CP, por lo que múltiples estudios han buscado la vinculación entre loci genéticos y la predisposición a padecer CP. Estos estudios han proporcionado una multiplicidad y heterogeneidad de loci genéticos [2]. Ninguno de estos loci y genes explica más que una pequeña proporción de agregaciones familiares de CP y, lo que es más llamativo, ninguno ha sido confirmado en estudios de replicación independientes. Esto se podría explicar por la gran heterogeneidad genética del CP, de modo que varios genes altamente penetrantes pueden estar asociados a diferentes pedigrís de CP familiar, así como por la alta frecuencia de fenocopias, es decir, CP esporádicos incluidos en los estudios de CP familiar, por ser sus características indistinguibles. Alternativamente, es posible que ningún gen esté asociado singularmente a la predisposición al CP, sino que habría una participación de múltiples genes, cada uno de ellos con una penetrancia relativamente baja. Una característica adicional del CP familiar es que no se asocia significativamente con otros tipos de tumores, con la posible excepción de cáncer de mama y tumores del SNC (Sistema Nervioso Central) en agregaciones familiares concretas, lo que indica que el gen o genes implicados no participan en síndromes neoplásicos generalizados, sino que parecen ser "organoespecíficos". Sin embargo, se han estudiado en CP alteraciones de genes frecuentemente asociados a otras neoplasias, como TP53, BRCA1, PTEN o genes de reparación afectados, p. ej., en HNPCC (cáncer de colon hereditario sin poliposis), encontrándose escasas alteraciones o, como en el caso de TP53 o PTEN, mutaciones que aparecen sólo muy tardíamente en la evolución de los tumores.

El que los genes de predisposición al CP encontrados hasta ahora se encuentren alterados en muy pocos individuos y familias, impide una aproximación preventiva eficaz al problema. Una cuestión relacionada, aunque independiente, es la detección precoz de CP. La determinación de los niveles séricos de PSA (antígeno prostático específico) en sus diferentes formas sigue siendo la referencia más relevante para la detección y el seguimiento clínico del CP. Las dudas surgen cuando se requiere un diagnóstico diferencial, o en casos de CP sin niveles elevados de PSA. Esta proteína es un marcador tisular y de señalización androgénica y no un marcador de malignidad propiamente dicho, por lo que, en sentido estricto, sus niveles séricos son únicamente indicativos de la masa total de glándulas epiteliales prostáticas con capacidad de producirla y secretarla. Por tanto, se observan niveles elevados de PSA no sólo en CP, sino también en HBP (hiperplasia benigna de próstata) y otros procesos prostáticos benignos, y, en sentido contrario, su producción se puede ver comprometida en CP muy indiferenciados, en que las células epiteliales prostáticas neoplásicas pierden la capacidad de expresión de PSA.

Por todo ello, muchos laboratorios buscan nuevas moléculas que ofrezcan mayor especificidad y sensibilidad que el PSA como marcador de detección y seguimiento del CP. La aplicación de técnicas de alto rendimiento (High Throughput, HT) al estudio del CP ha permitido la identificación de moléculas previamente no asociadas a CP y que se han confirmado como excelentes marcadores de malignidad, con una capacidad discriminante y una especificidad muy superiores al PSA cuando se detectan en tejidos [3]. Entre estos marcadores destacan la alpha-metilacil-CoA racemasa (AMACR), la hepsina (HPN) y la sintasa de ácidos grasos (FASN), que se expresan a altos niveles en la gran mayoría de casos de CP, mientras que, a diferencia del PSA, sus niveles de expresión en epitelio prostático normal son mínimos. Por otro lado, la mayoría de células carcinomatosas en CP pierden la expresión de glutation-S-transferasa
\pi(GSTP1) por hipermetilación de su promotor. Además, puesto que en las gándulas prostáticas carcinomatosas no hay células basales, hay una disminución en CP de la expresión de genes y proteínas característicos de estas células, como son keratinas de alto peso molecular (por ejemplo, CK5 o CK14) o la proteína nuclear p63, un homólogo del supresor tumoral p53, que se expresa en las capas basales de varios epitelios, incluido el prostático.

La disponibilidad de buenos reactivos ha permitido el uso de algunos de estos marcadores en aplicaciones de relevancia clínica tales como la determinación de niveles en muestras de biopsias por punción, demostrándose su utilidad en el diagnóstico de casos dudosos de CP [4]. Sin embargo, a pesar de su gran especificidad tumoral, ninguna de las proteínas mencionadas es secretada fisiológicamente por el epitelio prostático, por lo que su determinación en suero y otros fluidos, una de las mayores cualidades del PSA como indicador de masa de epitelio prostático activo, no proporciona resultados totalmente coherentes con su determinación tisular. A partir de los estudios de alto rendimiento se están identificando otras moléculas secretadas, que se expresan a niveles anómalos en CP. La determinación de una o más de estas proteínas, aún no siendo específicas de tejido, en combinación con la determinación de niveles de PSA, es un camino prometedor para desarrollar ensayos de mayor especificidad y sensibilidad.

Por lo tanto existe una necesidad de identificar subconjuntos de marcadores para el diagnóstico y pronóstico del cáncer de próstata que mejoren significativamente los existentes. En esta invención se proporcionan nuevos métodos para el diagnóstico molecular de CP, con alta capacidad discriminatoria entre muestras tumorales y no tumorales, basados en la detección de la expresión de una serie de subconjuntos de genes descritos en la presente invención, así como kits capaces de llevar a cabo dichos métodos y los usos de dichas kits para el diagnóstico y pronóstico de la enfermedad. El uso de niveles de expresión de conjuntos de dos o más genes para discriminar muestras tumorales de muestras no tumorales permite alcanzar niveles de significación estadística en tal discriminación que con frecuencia no se alcanza con la determinación del nivel de expresión de un único gen.

Descripción de la invención Breve descripción de la invención

La presente invención se refiere a un método para el diagnóstico molecular de cáncer de próstata, que comprende el análisis, in vitro, en una muestra problema, del nivel de expresión de al menos un gen o subconjuntos de al menos dos genes seleccionados del grupo de 45 genes que consiste en: TACSTD1, HPN, AMACR, APOC1, GJB1, PP3111, CAMKK2, ZNF85, SND1, NONO, ICA1, PYCR1, ZNF278, BIK, HOXC6, CDK5, LASS2, NME1, PRDX4, SYNGR2, SIM2, EIF3S2, NIT2, FOXA1, CX3CL1, SNAI2, GSTP1, DST, KRT5, CSTA, LAMB3, EPHA2, GJA1, PER2, FOXO1A, TGFBR3, CLU, ROR2, ETS2, TP73L, DDR2, BNIP2, FOXF1, MYO6 y ABCC4.

Además la presente invención se refiere pero no se limita a kits, para llevar a cabo los métodos arriba indicados, así como los usos de dichos kits.

Descripción de las figuras

Figura 1. Agrupamiento de muestras analizadas sobre HGF (Human Genome Focus) arrays mediante FADA [13]. Las muestras se agruparon automáticamente en tumorales (círculo situado en la parte inferior de la Figura), normales (círculo situado en la parte superior derecha de la Figura), líneas celulares (círculo situado a la izquierda de la Figura) y muestras de estroma (círculo situado en la parte superior izquierda de la Figura).

Figura 2. Representación de Eisen, tras el análisis por FADA y cluster jerárquico (HC), de los 318 genes sobre e infraexpresados en muestras prostáticas que más significativamente discriminan muestras de tejido prostático normal de muestras de carcinoma prostático [Tabla 2]. Los valores de expresión utilizados para generar el agrupamiento jerárquico son los correspondientes a la tabla 6. La jerarquía se establece mediante el método llamado Hierarchical Clustering. Es un método estándar en estadística aplicada y por tanto cualquier experto en la materia puede derivar el resultado obtenido en la presente invención a partir de los valores numéricos de la Tabla 6. En la parte superior de la imagen: N, muestras de próstata normal; T, muestras de adenocarcinoma prostático; S, muestras de estroma prostático puro; C, células en cultivo. A la derecha se indican los compartimentos a que corresponden predominantemente los distintos grupos de genes. Esta es una interpretación post hoc, es decir, hecha a partir de los perfiles de expresión observados para estos genes.

Figura 3. Agrupamiento jerárquico de las 30 muestras analizadas sobre arrays Affymetrix HGF, usando los 45 genes incluidos en el Chip Diagnóstico 1 [Tabla 3]. Los valores de expresión utilizados para generar el agrupamiento jerárquico son los correspondientes a la Tabla 6. El agrupamiento resultante de las muestras se denota de forma idéntica a como se ha descrito para la Figura 2: N, tejido prostático normal; T, tejido tumoral; S, estroma; C, células en cultivo.

Figura 4. Diagrama de Eisen correspondiente al análisis por agrupamiento (cluster) jerárquico de los patrones de expresión en próstata tumoral, normal, estroma prostático puro y líneas celulares, obtenidos sobre arrays Affymetrix HGF, de 22 genes seleccionados y validados por RT-PCR en tiempo real [Tabla 4]. Los valores utilizados para el agrupamiento jerárquico de estos 22 genes se han tomado de la Tabla 6. El agrupamiento resultante de las muestras se denota de forma idéntica a como se ha descrito para la Figura 2: N, tejido prostático normal; T, tejido tumoral; E, estroma; C, células en cultivo.

Figura 5. Diagrama de Eisen correspondiente al análisis por cluster jerárquico de los patrones de expresión en próstata tumoral, normal, estroma prostático puro y líneas celulares, obtenidos sobre arrays Affymetrix HGF, de 14 genes seleccionados y validados por RT-PCR en tiempo real [Tabla 5]. Los valores utilizados para el agrupamiento jerárquico de estos 14 genes se han tomado de la Tabla 6. El agrupamiento resultante de las muestras se denota de forma idéntica a como se ha descrito para la Figura 2: N, tejido prostático normal; T, tejido tumoral; E, estroma; C, células en cultivo.

Figura 6. Discriminación entre muestras de próstata tumoral (T) y próstata normal (N) mediante determinación de niveles de transcrito con arrays de Affymetrix del gen MYO6 en combinación con la determinación de niveles de transcritos de los siguientes genes: ABCC4, AMACR, BIK, BNIP2, CDK5, CSTA, DST, EIF3S2, EPHA2, ETS2, GJB1, HPN, NIT2, PYCR1, ROR2, TACSTD1 y TP73L. Los valores de expresión utilizados para el agrupamiento jerárquico de estos genes se han tomado de la Tabla 6.

Figura 7. Discriminación entre muestras de próstata tumoral (T) y próstata normal (N) mediante determinación de niveles de transcrito con arrays de Affymetrix del gen ABCC4 en combinación con la determinación de niveles de transcritos de los siguientes genes: CSTA, GJB1, GSTP1, HOXC6, HPN, LAMB3, MYO6, PRDX4 y TP73L. Los valores de expresión utilizados para el agrupamiento jerárquico de estos genes se han tomado de la tabla 6.

Figura 8. Detección inmunohistoquímica de la proteína MYO6 en una muestra tisular de un paciente con cáncer de próstata que contiene glándulas tumorales (T) y glándulas normales (N). La tinción es de intensidad claramente superior en las células epiteliales tumorales que en las células epiteliales normales. La tinción para MYO6 presenta un patrón citoplasmático, con refuerzo submembranal.

Figura 9. Detección inmunohistoquímica de la proteína EPHA2 en una muestra tisular de un paciente con cáncer de próstata que contiene glándulas tumorales (T) y glándulas normales (N). La tinción es exclusivamente en glándulas normales, en concreto en células de la capa basal. La tinción presenta un patrón citoplasmático con refuerzo de membrana.

Figura 10. Detección inmunohistoquímica de la proteína CX3CL1 en diversas muestras de tejido prostático. Figura 10A: Muestra con glándulas tumorales (T) y normales (N), en que los niveles de CX3CL1 son claramente inferiores en las células tumorales en relación con las células normales. Figura 10B: Muestra con células epiteliales tumorales en que la tinción para CX3CL1 es intensa en la mayoría de células tumorales. Figura 10C: Muestra con PIN (P) y glándulas normales (N), en que la tinción es significativamente más intensa en las células de PIN que en las células epiteliales normales.

Descripción detallada de la invención

Para la realización de la presente invención se analizaron mediante hibridación sobre arrays Human Genome Focus de Affymetrix un total de 31 muestras prostáticas (figura 1).

Las señales crudas de hibridación se normalizaron según la normalización de Irizarry et al. (2003), y se sometieron a análisis no supervisado mediante el algoritmo FADA [13]. Los genes fueron considerados como diferencialmente expresados entre los grupos normal y tumoral cuando su valor de q asociado (17) era inferior a 2,5*10^{-4}. Este análisis permitió la agrupación automática de muestras, de forma que todas las muestras tumorales, excepto una, se agruparon en un clade y todas las muestras normales se agruparon en otro clade [Figura 1]. En este análisis se incluyeron también líneas celulares prostáticas establecidas y células provenientes de explantes primarios a partir de muestras humanas prostáticas. En el análisis por FADA, las células cultivadas se agruparon independientemente de los 2 clades anteriormente mencionados. A partir de este análisis se dedujeron aquellos genes que más significativamente discriminan muestras tumorales de muestras normales (con un P menor o igual a 10^{-4} en un test t de Student con corrección múltiple), encontrando un total de 318 genes, de los que 134 se encuentran significativamente sobrerrepresentados (sobreexpresados) en tumores y 184 significativamente infrarrepresentados en tumores (en la Tabla 2 se muestra una lista de genes capaces de discriminar entre muestras de próstata tumoral y próstata normal, analizados según sus perfiles de expresión obtenidos mediante hibridación sobre microarrays Affymetrix HGF).

En los siguientes apartados se describen con algo más de detalle algunos de estos genes y su relevancia en CP.

En primer lugar, se analizaron aquellos genes sobreexpresados en CP previamente estudiados [Figura 2]. La identificación de estos genes sirvió de validación externa del estudio. Los genes de esta categoría incluyen los bien estudiados HPN y AMACR, y, en menor medida, genes como SIM2 y HOXC6. HPN ha sido extensamente caracterizado [19-21], y se ha demostrado muy recientemente que su sobreexpresión puede conducir a un fenotipo transformado en modelos murinos de cáncer de próstata [22]. AMACR también se ha estudiado en muchos laboratorios como marcador de malignidad en CP [23-27], y su uso clínico se ha extendido recientemente [26-29]. SIM2 se ha encontrado de forma más limitada como asociado a CP [29], aunque ya ha sido objeto de estudio como posible diana terapéutica con siRNA y oligonucleótidos antisentido en modelos celulares [29, 31]. HOXC6 se ha estudiado tanto como marcador de malignidad [32-35], como en su papel en la supervivencia de células tumorales prostáticas en cultivo [36].

En segundo lugar, se analizaron aquellos genes sobreexpresados en CP previamente no relacionados inequívocamente con el tumor de próstata. Entre estos genes hay muchos que aparecen en "listados" de genes de trabajos que usan análisis de MA, pero sin que en tales trabajos se haga un especial énfasis o esfuerzo para su caracterización biológica. Entre estos genes los hay de factores transcripcionales de elevado interés en este contexto (FOXA1, NONO, ZNF278, ZNF85), genes de proteínas de tráfico vesicular (MYO6, RAB17, SYNGR2, RABIF), genes de transportadores de membrana (ABCC4, TMEM4, SLC19A7), genes de enzimas del metabolismo de ácidos grasos y del metabolismo de ácidos nucleicos.

En tercer lugar se analizaron aquellos genes infraexpresados en CP. De los 184 genes detectados como significativamente infraexpresados en tumores, hay un número relativamente alto de genes que se expresan en estroma, por lo que se sospecha que, a pesar del cuidado puesto en la selección de muestras para igualar el componente estromal en muestras tumorales y normales, hay una mayor representación del componente estromal en muestras normales. No obstante, hay también un número alto de genes que parecen propios de epitelio prostático normal, y que son los que permiten la agrupación no supervisada de muestras normales en una misma rama filética, separada de las muestras estromales [Figura 1]. Algunos de estos genes ya han sido descritos como de expresión disminuida en CP. Dos ejemplo son GSTP1 y LOH11CR2A, para los que ya se ha demostrado que la pérdida de su expresión en tumores se asocia a hipermetilación de islas CpG de sus regiones promotoras [37, 38]. Otro gen interesante es TP73L, que codifica para p63 y del que varias isoformas (principalmente \DeltaN y TA) participan en la acción efectora del supresor tumoral p53 [39]. Además, se ha demostrado que la expresión de p63 se asocia con células epiteliales basales de la glándula prostática normal, y que la deleción de este gen en ratones impide la formación de una próstata normal [40].

Adicionalmente, cultivos primarios de células epiteliales prostáticas, así como líneas celulares prostáticas inmortalizadas con HPV-16, pero no tumorogénicas (p. ej., RWPEl), expresan TP73L, mientras que células prostáticas establecidas a partir de tumores no expresan este gen. Otros genes infraexpresados en tumores son de factores transcripcionales de la familia FOX (FOXO1A, FOXF1) y otros factores transcripcionales, potenciales supresores tumorales (TACC1, SLIT2), receptores transmembrana y sus ligandos (TGFBR3, TGB3, FGFR1, FGF2, FGF7, IL6R), o proteínas de adhesión celular (DDR2, CADH9, ITGA5, GJA1).

Además, se validó mediante inmunohistoquímica sobre muestras parafinadas (en formato Tissue Microarrays) los niveles de expresión de algunas de las proteínas correspondientes a genes sobreexpresados o infraexpresados en CP del presente estudio, así como en estudios previos [13].

Uno de los genes que se encontró sobreexpresado en los estudios transcripcionales, y cuya proteína se estudió por inmunohistoquímica, fue MYO6. El presente estudio inmunohistoquímico validó los datos transcripcionales, demostrando que la proteína MYO6 también se sobreexpresa en una mayoría de tumores. Un claro ejemplo de sobreexpresión de la proteína MYO6 en carcinoma de próstata en relación con glándulas prostáticas normales se muestra en la Figura 8, correspondiente a una muestra que contiene tanto epitelio prostático tumoral como epitelio prostático normal, habiendo sido teñidas con un anticuerpo monoclonal específico de MYO6. Esta proteína es una miosina atípica con funciones en endocitosis y tráfico vesicular, y que previamente se había demostrado que se expresa a altos niveles en adenocarcinoma de ovario, principalmente en asociación con bordes invasivos [41].

También se llevó a cabo el análisis de la expresión in situ de varios de los genes infraexpresados en la presente invención, en particular aquellos cuya infraexpresión representa una novedad en esta neoplasia, como el receptor tirosina kinasa EPHA2, el regulador transcripcional SNAI2 o la quimioquina CX3CL1. Son de resaltar estos resultados, en particular en relación con EPHA2 y SNAI2, ya que tanto EPHA2 [42-58] como SNAI2 [59-62] se asociaron en múltiples publicaciones a una sobreexpresión, y no infraexpresión, en múltiples tipos de tumores, entre los que se incluyen los adenocarcinomas de próstata.

Un ejemplo de la pérdida de expresión de la proteína EPHA2 en epitelio prostático tumoral se muestra en la Figura 9, en que se ve que las glándulas prostáticas normales (en células de la capa basal) expresan altos niveles de EPHA2, mientras que las células epiteliales prostáticas tumorales situadas en glándulas adyacentes carecen por completo de reactividad y por tanto no expresan niveles detectables de esta proteína.

En el caso de la quimioquina CX3CL1 (también llamada fractalkina), la expresión determinada mediante RT-PCR en tiempo real indicaba una tendencia a que el epitelio tumoral mostrase niveles de expresión inferiores al epitelio normal. La tinción inmunohistoquímica para la correspondiente proteína, sin embargo, mostró perfiles variables según los casos, de modo que en algunas muestras se da una disminución significativa de la expresión de CXC3L1 en epitelio tumoral, mientras que en otros casos el epitelio prostático tumoral presentaba altos niveles de la misma proteína [Figura 10]. Finalmente, distintos casos de neoplasia intraepitelial prostática (PIN) mostraron niveles variables de tinción para CX3CL1, siendo en algunos casos de intensidad mayor que en el epitelio normal adyacente [Figura 10].

En el contexto de CP, por tanto, nuestros resultados indican que la posible sobreexpresión de estas moléculas no se debe utilizar como indicador de malignidad, o servir como base para diana terapéutica en este tipo de tumores, a diferencia de lo que generalmente se viene aceptando. Antes bien, nuestros datos indican que el nivel de expresión de estas moléculas es bajo o nulo en epitelio prostático maligno.

Como consecuencia de los anteriores análisis, se ha identificado y definido un conjunto de genes, correspondiente al grupo de 318 genes, y varios subconjuntos de genes, a partir de este primero, útiles para el diagnóstico molecular de cáncer de próstata con alta capacidad discriminatoria entre muestras tumorales y no tumorales, en los que la determinación de los niveles de mRNA y/o proteína representa una signatura diagnóstica de cáncer de prótata que mejora significativamente los métodos existentes de diagnóstico de dicho cáncer.

Con objeto de diseñar un método de diagnóstico de cáncer de prostata en un formato más reducido que el conjunto de 318 genes, más práctico y cercano a la práctica clínica (por ejemplo mediante análisis RT-PCR tipo microarray o chip de diagnóstico) se llevó a cabo una selección de grupo menor de genes incluidos en este primer conjunto (ver Ejemplo 2). Esta selección de un subconjunto de 45 genes representa una de las múltiples alternativas que se pueden obtener a partir del análisis de este grupo de genes original, y no debe ser entendida como una limitación del alcance de la presente invención. Un experto en la materia puede establecer grupos de genes distintos a los descritos en la presente invención.

El primero de los subconjuntos contiene un conjunto cuidadosamente seleccionado de 45 genes, validados por RT-PCR en tiempo real, con una alta capacidad de discriminación entre muestras normales y tumorales [Tabla 3, Figura 3]. Otra versión generada, para el análisis de un número aún más limitado de genes, validados por RT-PCR en tiempo real, mantiene prácticamente la misma capacidad de discriminación entre muestras normales y tumorales que el anterior. Dicho subconjunto de genes incluidos en este diseño corresponde a los 22 genes validados mostrados en la Tabla 4 y Figura 4, o incluso un subconjunto aún más reducido, que corresponde a los 14 genes mostrados en la Tabla 5 y Figura 5. Otras versiones generadas de subconjuntos de genes con alta capacidad discriminatoria entre muestras tumorales y no tumorales que entran dentro del alcance de la presente invención se muestran en las Figuras 6 y 7. La identificación de los niveles de expresión de todos estos subconjuntos de genes sirven de base para el desarrollo de un kit o dispositivo de diagnóstico de cáncer de próstata de relativo bajo coste y alto rendimiento para cuantificar múltiples transcritos, en tiempo real, en una plataforma que permite analizar simultáneamente un diverso y alto número de muestras. Preferentemente, cuando el kit de diagnóstico se basa en la cuantificación de transcritos, se requiere menos de 1 ng de RNA total por muestra. Igualmente, es posible el desarrollo de un kit o dispositivo de diagnóstico de cáncer de próstata basado en la determinación de los niveles de proteína de dichos genes en muestras tumorales.

Por lo tanto, en un primer aspecto, la presente invención se refiere pero no se limita a un método para el diagnóstico molecular de cáncer de próstata, que comprende el análisis, in vitro, en una muestra problema, del nivel de expresión de al menos un gen seleccionado del grupo de 45 genes que consiste en: TACSTD1, HPN, AMACR, APOC1, GJB1, PP3111, CAMKK2, ZNF85, SND1, NONO, ICA1, PYCR1, ZNF278, BIK, HOXC6, CDK5, LASS2, NME1, PRDX4, SYNGR2, SIM2, EIF3S2, NIT2, FOXA1, CX3CL1, SNAI2, GSTP1, DST, KRT5, CSTA, LAMB3, EPHA2, GJA1, PER2, FOXO1A, TGFBR3, CLU, ROR2, ETS2, TP73L, DDR2, BNIP2, FOXF1, MYO6 y ABCC4.

En otro aspecto, la presente invención se refiere pero no se limita a un método para el diagnóstico molecular de cáncer de próstata, que comprende el análisis, in vitro, en una muestra problema, del nivel de expresión de al menos dos genes seleccionados del grupo de 45 genes que consiste en: TACSTD1, HPN, AMACR, APOC1, GJB1, PP3111, CAMKK2, ZNF85, SND1, NONO, ICA1, PYCR1, ZNF278, BIK, HOXC6, CDK5, LASS2, NME1, PRDX4, SYNGR2, SIM2, EIF3S2, NIT2, FOXA1, CX3CL1, SNAI2, GSTP1, DST, KRT5, CSTA, LAMB3, EPHA2, GJA1, PER2, FOXO1A, TGFBR3, CLU, ROR2, ETS2, TP73L, DDR2, BNIP2, FOXF1, MYO6 y ABCC4 donde la capacidad discriminatoria entre muestras tumorales y no tumorales cuando se determinan conjuntamente los niveles de expresión de dos o más genes de dicho grupo es mayor que la capacidad discriminatoria de los mismos genes por separado.

En particular, la capacidad discriminatoria cuando se determinan conjuntamente los niveles de expresión de dos o más genes es un 1%, preferentemente un 10%, más preferentemente un 25%, aún más preferentemente un 50% mayor que la capacidad discriminatoria de al menos uno de los genes por separado.

En el contexto de la presente invención, se define la "capacidad discriminatoria" como la capacidad de discriminar entre muestras tumorales y no tumorales cuando se aplica un método de clasificación de muestras basado en el conjunto de datos obtenidos a partir de los experimentos de análisis de expresión para un gen o para un subconjunto de al menos dos genes del grupo de 45 genes objeto de la presente invención.

Por ejemplo, al aplicar un determinado método de clasificación al conjunto de muestras descrito en la tabla 6, la capacidad discriminatoria entre muestras tumorales y no tumorales de los genes MYO6 y CDK5 determinados individualmente era de 93,6% y 87,1%, respectivamente, mientras que la capacidad discriminatoria de la determinación conjunta de ambos genes era de 96,8%. Aún otro ejemplo, la capacidad discriminatoria de los genes ABCC4 y FOXO1A determinados individualmente era de 87,1% y 83,9%, respectivamente, mientras que la capacidad discriminatoria de la determinación conjunta de ambos genes era de 96,8%.

El término "muestra problema" tal y como se utiliza en la descripción se refiere, pero no se limita, a tejidos y/o fluidos biológicos (sangre, orina, saliva, etc.), obtenidos mediante biopsias, raspados o cualquier otro método conocido por un experto en la materia que sirva para el mismo fin, de un vertebrado susceptible de tener cáncer de próstata donde dicho vertebrado es un humano.

En una realización preferida, la presente invención se refiere pero no se limita a un método para el diagnóstico molecular de cáncer de próstata, que comprende el análisis, in vitro, en una muestra problema, del nivel de expresión de al menos dos genes seleccionados del grupo de 22 genes que consiste en: TACSTD1, HPN, AMACR, APOC1, GJB1, CX3CL1, SNAI2, GSTP1, DST, KRT5, CSTA, LAMB3, EPHA2, GJA1, PER2, FOXO1A, TGFBR3, CLU, ROR2, ETS2, MYO6 y ABCC4 donde la capacidad discriminatoria entre muestras tumorales y no tumorales cuando se determinan conjuntamente los niveles de expresión de dos o más genes de dicho grupo es mayor que la capacidad discriminatoria de los mismos genes por separado.

En una realización aún más preferida, la presente invención se refiere pero no se limita a un método para el diagnóstico molecular de cáncer de próstata, que comprende el análisis, in vitro, en una muestra problema, del nivel de expresión de al menos dos genes seleccionados del grupo de 14 genes que consiste en: TACSTD1, HPN, AMACR, APOC1, CX3CL1, SNAI2, GSTP1, DST, KRT5, CSTA, LAMB3, EPHA2, MYO6 y ABCC4 donde la capacidad discriminatoria entre muestras tumorales y no tumorales cuando se determinan conjuntamente los niveles de expresión de dos o más genes de dicho grupo es mayor que la capacidad discriminatoria de los mismos genes por separado.

En un tercer aspecto, la presente invención se refiere pero no se limita a un método para el diagnóstico molecular de cáncer de próstata con alta capacidad discriminatoria, entre muestras tumorales y no tumorales, que comprende el análisis, in vitro, en una muestra problema, del nivel de expresión de al menos dos genes seleccionados de la tabla 3 donde al menos uno de dichos genes seleccionados es el gen MYO6 o el gen ABCC4.

En una realización preferida, la presente invención se refiere pero no se limita a un método para el diagnóstico molecular de cáncer de próstata con alta capacidad discriminatoria, entre muestras tumorales y no tumorales, que comprende el análisis, in vitro, en una muestra problema, del nivel de expresión del gen MYO6 en combinación con el análisis del nivel de expresión de al menos un gen del grupo que consiste en: ABCC4, AMACR, BIK, BNIP2, CDK5, CSTA, DST, EIF3S2, EPHA2, ETS2, GJB1, HPN, NIT2, PYCR1, ROR2, TACSTD1 y TP73L.

En una realización aún más preferida, la presente invención se refiere pero no se limita a un método para el diagnóstico molecular de cáncer de próstata con alta capacidad discriminatoria, entre muestras tumorales y no tumorales, que comprende el análisis, in vitro, en una muestra problema, de la sobreexpresión del gen MYO6 en combinación con el análisis de la sobreexpresión de al menos un gen del grupo que consiste en: ABCC4, AMACR, BIK, CDK5, EIF3S2, GJB1, HPN, NIT2, PYCR1, TACSTD1.

En una realización aún más preferida, la presente invención se refiere pero no se limita a un método para el diagnóstico molecular de cáncer de próstata con alta capacidad discriminatoria, entre muestras tumorales y no tumorales, que comprende el análisis, in vitro, en una muestra problema, de la sobreexpresión del gen MYO6 en combinación con el análisis de la infraexpresión de al menos un gen del grupo que consiste en: BNIP2, CSTA, DST, EPHA2, ETS2, ROR2, y TP73L.

En otra realización preferida, la presente invención se refiere pero no se limita a un método para el diagnóstico molecular de cáncer de próstata con alta capacidad discriminatoria, entre muestras tumorales y no tumorales, que comprende el análisis, in vitro, en una muestra problema, del nivel de expresión del gen ABCC4 en combinación con el análisis del nivel de expresión de al menos un gen del grupo que consiste en: CSTA, GJB1, GSTP1, HOXC6, HPN, LAMB3, MYO6, PRDX4 y TP73L.

En una realización aún más preferida, la presente invención se refiere pero no se limita a un método para el diagnóstico molecular de cáncer de próstata con alta capacidad discriminatoria, entre muestras tumorales y no tumorales, que comprende el análisis, in vitro, en una muestra problema, de la sobreexpresión del gen ABCC4 en combinación con el análisis de la sobreexpresión de al menos un gen del grupo que consiste en: GJB1, HOXC6, HPN, MYO6, PRDX4.

En una realización aún más preferida, la presente invención se refiere pero no se limita a un método para el diagnóstico molecular de cáncer de próstata con alta capacidad discriminatoria, entre muestras tumorales y no tumorales, que comprende el análisis, in vitro, en una muestra problema, de la sobreexpresión del gen ABCC4 en combinación con el análisis de la infraexpresión de al menos un gen del grupo que consiste en: CSTA, GSTP1, LAMB3, y TP73L.

En otra realización preferida, la presente invención se refiere pero no se limita a un método para el diagnóstico molecular de cáncer de próstata con alta capacidad discriminatoria, entre muestras tumorales y no tumorales, que comprende el análisis, in vitro, en una muestra problema, de la sobreexpresión de MYO6 o ABCC4, TACSTD1, HPN, AMACR o APOC1 o el análisis de la infraexpresión de los genes CX3CL1, SNAI2, GSTP1, DST, KRT5, CSTA, LAMB3 o EPHA2.

En una realización aún más preferida, la presente invención se refiere pero no se limita a un método para el diagnóstico molecular de cáncer de próstata con alta capacidad discriminatoria, entre muestras tumorales y no tumorales, que comprende el análisis, in vitro, en una muestra problema, de la sobreexpresión de MYO6, ABCC4, TACSTD1, HPN, AMACR, APOC1 o GJB1 o el análisis de la infraexpresión de los genes CX3CL1, SNAI2, GSTP1, DST, KRT5, CSTA, LAMB3, EPHA2, GJA1, PER2, FOXO1A, TGFBR3, CLU, ROR2 o ETS2.

En una realización aún más preferida, la presente invención se refiere pero no se limita a un método para el diagnóstico molecular de cáncer de próstata con alta capacidad discriminatoria, entre muestras tumorales y no tumorales, que comprende el análisis, in vitro, en una muestra problema, de la sobreexpresión de MYO6, ABCC4, TACSTD1, HPN, AMACR, APOC1, GJB1, PP3111, CAMKK2, ZNF85, SND1, NONO, ICA1, PYCR1, ZNF278, BIK, HOXC6, CDK5, LASS2, NME1, PRDX4, SYNGR2, SIM2, EIF3S2, NIT2 o FOXA1 o el análisis de la infraexpresión de los genes CX3CL1, SNAI2, GSTP1, DST, KRT5, CSTA, LAMB3, EPHA2, GJA1, PER2, FOXO1A, TGFBR3, CLU, ROR2, ETS2, TP73L, DDR2, BNIP2, o FOXF1.

Por "gen sobrexpresado" tal y como se utiliza en la presente invención debe entenderse, en general, la expresión anormalmente alta de un gen o de sus productos de transcripción o expresión (ARN o proteína) en células procedentes de un tejido prostático tumorigénico respecto a la expresión de dicho gen o de sus productos de transcripción o expresión (ARN o proteína) en células normales del mismo tejido no tumorigénico. En el caso de la determinación de niveles de expresión mediante hibridación sobre microarrays Affymetrix definimos como gen "sobreexpresado" en una muestra de cáncer de próstata aquél cuyos niveles de expresión son al menos 2,0 veces superiores a los niveles de expresión de la correspondiente muestra de tejido prostático no tumoral. Cuando la determinación se realiza mediante RT-PCR cuantitativa definimos como "sobreexpresión" cuando el niveles de expresión en la muestra tumoral del gen en cuestión es al menos 1,5 veces el nivel de expresión en la correspondiente muestra prostática normal. Por otra parte, cuando se analizan varias muestras tumorales, un gen se considera "generalmente sobreexpresado", o "sobreexpresado" en tales tumores de próstata cuando dicho gen está sobreexpresado en al menos un 70% de las muestras tumorales estudiadas, comparando los niveles normalizados de dicho gen, determinados en muestras de tejido prostático tumoral, con la media aritmética de los niveles normalizados de al menos cinco muestras de tejido prostático no tumoral, definiendo cuantitativamente los niveles de "sobreexpresión" tal como se describe arriba para determinaciones sobre microarrays o mediante RT-PCR cuantitativa.

Por "gen infraexpresado" tal y como se utiliza en la presente invención debe entenderse, en general, la expresión anormalmente baja de un gen o de sus productos de transcripción o expresión (ARN o proteína) en células procedentes de un tejido prostático tumorigénico respecto a la expresión de dicho gen o de sus productos de transcripción o expresión (ARN o proteína) en células normales del mismo tejido no tumorigénico. En el caso de la determinación de niveles de expresión mediante hibridación sobre microarrays Affymetrix definimos como gen "infraexpresado" en una muestra de cáncer de próstata aquél cuyos niveles de expresión son 0,5 veces, o menos, en relación con los niveles de expresión de la correspondiente muestra de tejido prostático no tumoral. Cuando la determinación se realiza mediante RT-PCR cuantitativa definimos como "infraexpresión" cuando el niveles de expresión en la muestra tumoral del gen en cuestión es al 0,75 veces, o inferior, con respecto al nivel de expresión en la correspondiente muestra prostática normal. Por otra parte, cuando se analizan varias muestras tumorales, un gen se considera "generalmente infraexpresado" o "infraexpresado" en tales tumores de próstata cuando dicho gen está infraexpresado en al menos un 70% de las muestras tumorales estudiadas, comparando los niveles normalizados de dicho gen, determinados en muestras de tejido prostático tumoral, con la media aritmética de los niveles normalizados de al menos cinco muestras de tejido prostático no tumoral, definiendo cuantitativamente los niveles de "infraexpresión" tal como se describe arriba para determinaciones sobre microarrays o mediante RT-PCR cuantitativa.

Se consideró que una muestra presentaba sobreexpresión o infraexpresión de una proteína respecto a otra muestra, cuando la diferencia del porcentaje de tinción epitelial entre las dos muestras era superior al 20% y/o la intensidad era al menos un grado diferente.

Y, finalmente, en una realización aún más preferida la presente invención se refiere pero no se limita a un método para el diagnóstico molecular de cáncer de próstata con alta capacidad discriminatoria, entre muestras tumorales y no tumorales, que comprende el análisis, in vitro, en una muestra problema, de la sobreexpresión o infraexpresión de los 318 genes indicados en la Tabla 2.

En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere pero no se limita a un método para el diagnóstico molecular de cáncer de próstata con alta capacidad discriminatoria, entre muestras tumorales y no tumorales, que comprende el análisis, in vitro, en una muestra problema del nivel de expresión de al menos un gen o subgrupos de dos genes seleccionados de la tabla 3 donde el análisis del nivel de expresión de dichos genes se realiza determinando el nivel de ARNm derivado de su transcripción y/o determinando el nivel de proteína codificada por el gen o fragmentos de la misma.

En una realización preferida, la presente invención se refiere pero no se limita a un método para el diagnóstico molecular de cáncer de próstata con alta capacidad discriminatoria, entre muestras tumorales y no tumorales, que comprende el análisis, in vitro, en una muestra problema del nivel de expresión de al menos un gen o subgrupos de dos genes seleccionados de la tabla 3 donde el análisis del nivel de expresión de dichos genes se realiza determinando el nivel de ARNm derivado de su transcripción donde el análisis del nivel de ARNm se puede realizar, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, mediante amplificación por PCR (reacción en cadena de la polimerasa), RT-PCR (retrotranscripción en combinación con la reacción en cadena de la polimerasa), RT-LCR (retrotranscripción en combinación en combinación con la reacción en cadena de la ligasa), SDA o cualquier otro método de amplificación de ácidos nucleicos; chips de DNA elaborados con oligonucleótidos depositados por cualquier mecanismo; chips de DNA elaborados con oligonucleótidos sintetizados in situ mediante fotolitografía o por cualquier otro mecanismo; hibridación in situ utilizando sondas específicas marcadas con cualquier método de marcaje; mediante geles de electroforesis; mediante transferencia a membrana e hibridación con una sonda específica; mediante RMN o cualquier otra técnica de diagnóstico por imagen utilizando nanopartículas paramagnéticas o cualquier otro tipo de nanopartículas detectables funcionalizadas con anticuerpos o por cualquier otro medio.

En otra realización preferida, la presente invención se refiere pero no se limita a un método para el diagnóstico molecular de cáncer de próstata con alta capacidad discriminatoria, entre muestras tumorales y no tumorales, que comprende el análisis, in vitro, en una muestra problema del nivel de expresión de al menos un gen o subgrupos de dos genes seleccionados de la tabla 3 donde la determinación del nivel de expresión de dichos genes se realiza determinando el nivel de proteína codificada por el gen o fragmentos de la misma, mediante la incubación con un anticuerpo específico (donde el análisis se lleva a cabo mediante Western blot y/o inmunohistoquímica); mediante geles de electroforesis; mediante chips de proteína; mediante ELISA o cualquier otro método enzimático; mediante RMN o cualquier otra técnica de diagnóstico por imagen.

El término "anticuerpo" tal y como se utiliza en la presente descripción incluye anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, fragmentos recombinantes de anticuerpos, combibodies, fragmentos Fab y scFv de anticuerpos, así como los dominios de unión a ligando.

En un quinto aspecto, la presente invención se refiere pero no se limita a un Kit para el diagnóstico molecular de cáncer de próstata. Dicho kit puede comprender cebadores, sondas y todos aquellos reactivos necesarios para analizar la variación en el nivel de expresión de al menos un gen o subgrupos de dos genes de cualquiera de los métodos anteriores. El kit además puede incluir, sin ningún tipo de limitación, el uso de tampones, polimerasas, cofactores para obtener una actividad óptima de éstas, agentes para prevenir la contaminación, etc. Por otro lado el kit puede incluir todos los soportes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y optimización.

Así, otro objeto de la presente invención lo constituye un dispositivo para el diagnóstico molecular de cáncer de próstata, en adelante dispositivo diagnóstico de la invención, que comprende los elementos necesarios para analizar la variación en los niveles de expresión de al menos un gen o subgrupos de dos genes de cualquiera de los métodos anteriores.

Una realización preferente de la presente invención consiste en un dispositivo diagnóstico de la invención para la detección de los niveles de expresión de ARNm mediante una técnica, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, perteneciente al siguiente grupo: análisis Northern blot, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), retrotranscripción en combinación con la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) en tiempo real, retrotranscripción en combinación con la reacción en cadena de la ligasa (RT-LCR), hibridación o microarrays.

Otra realización preferente de la invención lo constituye un dispositivo diagnóstico de la invención para la detección de los niveles de expresión de ARNm que consiste, a título ilustrativo y sin que limite la invención, en un microarray de ADN, un gene-chip de ADN o un chip microelectrónico de ADN, que comprende sondas génicas.

Otra realización preferente de la invención lo constituye un dispositivo diagnóstico de la invención para la detección de los niveles de expresión de proteína mediante una técnica, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, perteneciente al siguiente grupo: ELISA, Western blot y un dispositivo tipo biochip o microarray de proteínas que incluyan anticuerpos específicos.

En un sexto aspecto, la presente invención se refiere pero no se limita a un método para el diagnóstico molecular de cáncer de próstata con alta capacidad discriminatoria, entre muestras tumorales y no tumorales, que comprende el análisis, in vitro, en una muestra problema, donde la sobreexpresión de los genes MYO6, ABCC4, TACSTD1, HPN, AMACR, APOC1 o el análisis de la infraexpresión de los genes CX3CL1, SNAI2, GSTP1, DST, KRT5, CSTA, LAMB3 o EPHA2 se utiliza como diagnóstico de la presencia de cáncer de próstata o de una condición pre-maligna del mismo o como pronóstico de la progresión del cáncer de próstata o de una condición pre-maligna del mismo o como pronóstico del riesgo de recurrencia de dicha enfermedad.

En una realización preferida, la presente invención se refiere pero no se limita a un método para el diagnóstico molecular de cáncer de próstata con alta capacidad discriminatoria, entre muestras tumorales y no tumorales, que comprende el análisis, in vitro, en una muestra problema, donde la sobreexpresión de MYO6, ABCC4, TACSTD1, HPN, AMACR, APOC1 o GJB1 o el análisis de la infraexpresión de los genes CX3CL1, SNAI2, GSTP1, DST, KRT5, CSTA, LAMB3, EPHA2, GJA1, PER2, FOXO1A, TGFBR3, CLU, ROR2 o ETS2 se utiliza como diagnóstico de la presencia de cáncer de próstata o de una condición pre-maligna del mismo o como pronóstico de la progresión del cáncer de próstata o de una condición pre-maligna del mismo o como pronóstico del riesgo de recurrencia de dicha enfermedad.

En una realización aún más preferida, la presente invención se refiere pero no se limita a un método para el diagnóstico molecular de cáncer de próstata con alta capacidad discriminatoria, entre muestras tumorales y no tumorales, que comprende el análisis, in vitro, en una muestra problema, donde la sobreexpresión de los genes MYO6, ABCC4, TACSTD1, HPN, AMACR, APOC1, GJB1, PP3111, CAMKK2, ZNF85, SND1, NONO, ICA1, PYCR1, ZNF278, BIK, HOXC6, CDK5, LASS2, NME1, PRDX4, SYNGR2, SIM2, EIF3S2, NIT2, o FOXA1 o el análisis de la infraexpresión de los genes CX3CL1, SNAI2, GSTP1, DST, KRT5, CSTA, LAMB3, EPHA2, GJA1, PER2, FOXO1A, TGFBR3, CLU, ROR2, ETS2, TP73L, DDR2, BNIP2 o FOXF1 se utiliza como diagnóstico de la presencia de cáncer de próstata o de una condición pre-maligna del mismo o como pronóstico de la progresión del cáncer de próstata o de una condición pre-maligna del mismo o como pronóstico del riesgo de recurrencia de dicha enfermedad.

En una realización aún más preferida, la presente invención se refiere pero no se limita a un método para el diagnóstico molecular de cáncer de próstata con alta capacidad discriminatoria, entre muestras tumorales y no tumorales, que comprende el análisis, in vitro, en una muestra problema, donde la sobreexpresión o infraexpresión de los 318 genes indicados en la tabla 2 se utiliza como diagnóstico de la presencia de cáncer de próstata o de una condición pre-maligna del mismo o como pronóstico de la progresión del cáncer de próstata o de una condición pre-maligna del mismo o como pronóstico del riesgo de recurrencia de dicha enfermedad.

Salvo que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto en la materia a la que la invención pertenece. A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

Ejemplos de la invención Ejemplo 1 Identificación de los genes asociados a un cluster identificativo de un patrón tumoral de cáncer de próstata

Para la realización de la presente invención se analizaron mediante hibridación sobre arrays Human Genome Focus de Affymetrix una serie de 31 muestras prostáticas humanas (figura 1):

I.: 20 muestras enriquecidas en epitelio tumoral.

II.: 7 muestras enriquecidas en epitelio normal (<1% de células carcinomatosas).

III.: 1 muestra que comprende un grupo de 5 muestras normales (POOL N).

IV.: 3 muestras consistentes exclusivamente en tejido estromal.

Los tejidos recogidos se incluyeron en OCT, se congelaron en isopentano y se almacenaron a -80°C. Las muestras fueron evaluadas histológicamente y seleccionadas para el análisis de acuerdo con dos criterios: (a) un mínimo del 90% de pureza de epitelio normal o tumoral en las muestras normales y tumorales, respectivamente; (b) ausencia o presencia mínima de focos de inflamación o de atrofia. Todas las muestras, excepto tres (una normal y dos tumorales), provienen de la zona periférica, incluyendo las muestras de estroma. El contenido epitelial medio estimado en las muestras tumorales fue del 70%, del cual, un promedio del 90% presentaba características neoplásticas. El contenido epitelial medio estimado en las muestras normales era del 40%, con ausencia de glándulas tumorales. Las muestras estromales presentaban menos del 1% de epitelio. De cada muestra, se usaron 20-30 criosecciones, de 20 \mum de grosor cada una, para la extracción de RNA total de los tejidos. La primera y la última sección de cada muestra se tiñeron con hematoxilina-eosina para confirmar el diagnóstico y la calidad de las muestras. La Tabla 1 describe las características clínico-patológicas correspondientes a las muestras utilizadas.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1 Características clínico-patológicas correspondientes a las muestras usadas en el estudio

1

Las líneas HeLa y RWPE-1 (obtenidas de la American Type Culture Collection) se cultivaron en DMEM (PAA, Ontario, Canada) suplementado con el 10% de suero (FBS) y KSFM (Gibco, Carlsbad, CA), respectivamente, con el objeto de utilizarlas como controles. Los cultivos primarios (PC17 and PC23) se derivaron de prostatectomías radicales de pacientes con cáncer de próstata clínicamente localizado, en los cuales el adenocarcinoma era detectado macroscópicamente. Los explantes de tejido se lavaron en PBS, se disgregaron y se cultivaron en KSFM (Gibco, Carlsbad, CA) suplementado con 5-\alpha-dihidrotestosterona a una concentración de 10^{-11} M. Después de 4-5 semanas de cultivo, y dos pases, los cultivos fueron morfológicamente evaluados para asegurar la ausencia de fibroblastos, y se usaron para obtener RNA total.

Las muestras de tejido se microdiseccionaron por láser. Se usaron criosecciones de 8 \mum de grosor, que fueron montadas sobre portaobjetos recubiertos de membrana plástica (PALM Mikrolaser Technology, Bernried, Germany), se fijaron durante 3 minutos en etanol 70%, se tiñeron con hematoxilina de Mayer (SIGMA, St. Louis, MO), se deshidrataron en una serie de alcoholes, se dejaron secar durante 5 minutos y se almacenaron a -80°C hasta su uso. La microdisección de las muestras se realizó con el sistema MicroBeam de PALM (PALM Mikrolaser Technology). Se recogió aproximadamente 1.2 mm^{2} de epitelio normal o tumoral para cada muestra y se estimó una homogeneidad del 99% mediante visualización microscópica.

La extracción del RNA total de las muestras de tejido y las líneas celulares se llevó a cabo mediante el kit RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA). El RNA total de las muestras microdiseccionadas se extrajo con el kit RNeasy Micro Kit (Qiagen). En todos los casos, se hizo una digestión con DNase I (Qiagen), y la calidad y la concentración del RNA se evaluó con el aparato 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA).

Para el análisis de expresión génica mediante hibridación sobre "microarrays" se usó RNA aislado a partir de 7 muestras de tejido prostático normal con su correspondiente pareja (es decir, del mismo paciente y misma resección quirúrgica) de muestra prostática tumoral, una muestra consistente en la mezcla a partes iguales del RNA extraído de 5 muestras de tejido prostático normal ("pool" normal), 13 muestras tumorales no emparejadas (es decir, sin representación de tejido prostático normal del mismo paciente), 3 muestras de estroma prostático normal puro (sin tejido epitelial), dos líneas celulares epiteliales establecidas (HeLa y RWPE-1) y dos cultivos primarios de próstata (PC17 y PC23). La síntesis de cDNA se hizo a partir de 2 \mug de RNA total, usando un cebador ("primer") con una secuencia promotora para la RNA polimerasa T7 añadida en el extremo 3' (Superscript II Reverse Transcriptase, Invitrogen, Carlsbad, CA). Después de la síntesis de la segunda cadena, se realizó una transcripción in vitro usando el kit de marcaje BioArray High Yield RNA (Enzo, Farmingdale, NY) para obtener cRNA marcado con biotina.

Previamente a la hibridación, lavado y escaneo de los microarrays, los cRNA (15 \mug) fueron calentados a 95°C durante 35 min para proporcionar fragmentos de 35-200 bases de longitud. Cada muestra se añadió a una solución de hibridación [100 mM ácido 2-(N-morfolino)etansulfónico, 1 M Na+, y 20 mM EDTA] en presencia de 0,01% Tween-20 a una concentración final de cRNA de 0.05 \mug/ml. Cinco pg de cRNA fragmentado se hibridaron sobre un TestChip (Test3, Affymetrix, Santa Clara, CA) como control de calidad. Diez pg de cada cRNA fragmentado se hibridaron sobre Affymetrix Human Genome Focus Arrays a 45°C durante 16 h, se lavaron y se tiñeron en la Affymetrix Fluidics Station 400 y se escanearon a 3 \mum de resolución en un scanner Agilent HP G2500A GeneArray (Agilent Technologies, Palo Alto, CA).

Posteriormente, se realizó el análisis informático y la normalización de los resultados obtenidos. Las señales crudas de hibridación se normalizaron según la normalización descrita por Irizarry et al., utilizando el algoritmo RMA [14], disponible como parte del paquete Bioconductor de Affymetrix. El primer paso en la normalización RMA es la sustracción de la señal de fondo; esto se consigue considerando que las sondas PM observadas pueden ser modeladas como un componente de la señal que sigue una distribución normal. Los parámetros de las distribuciones se ajustan a partir de los datos y entonces se elimina el componente de ruido. Después se realiza una normalización entre arrays, mediante la normalización cuantil-cuantil a nivel de sonda, usando el método propuesto por Bolstad et al. [15]. El objetivo es escalar todos los chips a la misma distribución empírica. Finalmente, las intensidades observadas de los grupos de sondas, se resumen para obtener la medida de expresión de cada gen usando el algoritmo medianpolish [16], el cual se ajusta a este modelo de manera robusta.

Previamente a la selección de genes expresados diferencialmente y al modelaje de redes génicas o de grupos de muestras genotípicamente coherentes (ver más adelante), se comprobó la coherencia genotípica de las muestras pertenecientes a cada uno de los grupos. Los datos de expresión normalizados fueron analizados con el programa FADA [13]. Este programa aplica un Análisis Factorial de modo Q (es decir, en el espacio de la muestra), una herramienta multivariable relacionada con el PCA, acoplada a algoritmos de clustering. Los genes fueron considerados como diferencialmente expresados entre los grupos normal y tumoral cuando su valor q asociado [17] era inferior a 2,5*10^{-4}. Los valores q fueron calculados a partir de los p-valores obtenidos del t-test usando el algoritmo Benjamini-Hochberg step-down false-discovery rate (FDR) [18], tal y como está implementado en el paquete de multitest del Bioconductor. Este algoritmo ajusta los p-valores hacia arriba para eliminar los efectos del testeo múltiple.

En el contexto de la presente invención se entiende que los valores de un parámetro distinguen dos clases o categorías de muestras (en nuestro caso, muestras tumorales de muestras normales) con alta significación cuando el valor de p en una comparación estadística (aplicando, p. ej., t-test) entre las dos categorías es inferior a 0.001. En la Tabla 6 se muestran los datos numéricos que corresponden a los niveles de expresión de los genes indicados en la primera columna para las muestras que se indican en la primera fila. Las muestras terminadas en T corresponden a próstata tumoral y las terminadas en N corresponden a próstata normal. La tabla 6 muestra también valores de expresión para las líneas celulares HeLa (procedente de un carcinoma de cérvix humano) y RWPE-1 (epitelio prostático humano transformado con el herpesvirus HPV16), y para dos explantes primarios derivados de tumores prostáticos, denominados PC17 y PC23. Los dígitos son valores de las señales obtenidas por hibridación de cRNAs marcados sobre microarrays Affymetrix HGF, normalizados por el método RMA [14].

Este análisis permitió la agrupación automática de las muestras, de forma que todas las muestras tumorales, excepto una, se agruparon en un clade y todas las muestras normales se agruparon en otro clade (Figura 1). Al mismo tiempo, las células cultivadas y las muestras estromales se agruparon independientemente de los 2 clades anteriormente mencionados (Figura 1).

A partir de este análisis se identificaron aquellos genes que más significativamente discriminan muestras tumorales de muestras normales (con un P menor o igual a 10^{-4} en un test t de Student con corrección múltiple), encontrando un total de 318 genes, de los que 134 se encuentran significativamente sobrerrepresentados (sobreexpresados) en tumores y 184 significativamente infrarrepresentados (infraexpresados en tumores (Tabla 2).

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 2 Lista de 318 genes capaces de discriminar entre muestras de próstata tumoral y próstata normal, analizados según sus perfiles de expresión obtenidos mediante hibridación sobre microarrays Affymetrix HGF

2

3

4

5

6

7

Ejemplo 2 Validación de los genes identificados como más relevantes en los experimentos de hibridación sobre microarrays mediante RT-PCR en tiempo real utilizando el formato TagMan LDA

Para ésto se ha realizado RT-PCR en tiempo real de los genes de mayor interés biológico y como marcadores a partir del panel completo de 318 genes identificados anteriormente, usando tanto muestras no microdiseccionadas como muestras microdiseccionadas por láser con el instrumento PALM. El objeto del análisis RT-PCR es determinar los niveles de expresión de estos genes en un formato, tipo chip de diagnóstico, más reducido y cercano a la práctica clínica.

Se llevó a cabo un RT-PCR en tiempo real para cada réplica de tejido prostático (triplicados) o de muestras microdisecadas (cuadruplicados), ya sea de tejido tumoral o normal. Así, se usó 1 ng de RNA total de partida para la síntesis de cDNA con la transcriptasa reversa Superscript II (Invitrogen) y hexámeros aleatorios a 42°C durante 50 min., seguido por un tratamiento con RNasa a 37°C durante 20 min. Los cDNA resultantes se usaron para realizar la PCR a tiempo real en un instrumento ABI PRISM 7900HT (Applied Biosystems, Foster City, CA), usando un array TaqMan de Baja Densidad (Applied Biosystems), diseñado expresamente, que contenía primers y sondas específicos para 45 genes de interés y el gen RPS18 como calibrador y que se ha definido como Chip Diagnóstico 1 (ver Tabla 3). Las condiciones del termociclador se establecieron según las especificaciones del fabricante. Los datos obtenidos se analizaron usando el software SDS 2.1 (Applied Biosystems) aplicando el método \Delta\DeltaCt de cuantificación relativa.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 3 Lista de los 45 genes que mejor discriminan entre muestras de próstata tumoral y próstata normal

8

Para estas determinaciones, el material microdiseccionado correspondió únicamente a células epiteliales puras, tanto a partir de tumores como a partir de tejido prostático normal.

Este primer conjunto cuidadosamente seleccionado de 45 genes proporcionó una alta capacidad de discriminación entre muestras normales y tumorales. La selección de estos genes se realizó en función de tres criterios: (1) la capacidad de cada gen de discriminar muestras normales de tumorales en el análisis de expresión sobre microarrays Affymetrix HGF (valores de la Tabla 6), es decir, aquellos genes con valores de p más significativos; (2) el interés biológico de los mismos, tomando datos funcionales y de expresión previamente descritos en la literatura científica; y (3) en la medida de lo posible, la existencia de anticuerpos comerciales específicos de las correspondientes proteínas, para una posterior validación de la expresión mediante inmunoensayos, incluyendo determinaciones inmunohistoquímicas.

De hecho, este subconjunto de genes incluye correctamente dentro del grupo de muestras tumorales una muestra que se agrupaba incorrectamente en el análisis transcriptómico global mediante FADA. [Figura 2].

Más concretamente, para muestras no microdiseccionadas se comprobó por este método que, de los 26 genes incluidos en el Chip Diagnóstico 1 que se consideró sobreexpresados en tumores mediante el análisis por microarrays Affymetrix HGF, 13 genes (50%) presentan también niveles más elevados en tumores que en tejido no tumoral en la determinación cuantitativa por RT-PCR en tiempo real. En el caso de los 19 genes que se encontraron infraexpresados en tumores mediante la determinación sobre microarrays, de los 18 genes que fueron detectables, los 18 (95%) se encontraron infraexpresados mediante RT-PCR en tiempo real, en el análisis de muestras no microdiseccionadas. Cuando se efectuó la determinación cuantitativa sobre muestras microdiseccionadas (es decir, comparando epitelios puros tumorales con epitelios puros normales de los mismos individuos), encontramos que, de los 26 genes seleccionados como sobreexpresados en tumores, solamente 9 (34.6%) también se encontraban sobreexpresados en la mayoría de muestras mediante cuantificación de transcritos por RT-PCR en tiempo real. En esta determinación sobre muestras microdiseccionadas, de los 19 genes considerados como infraexpresados en tumores tras los análisis sobre microarrays, 18 fueron evaluables, y de éstos, 15 (83.3%) también se encontraron infraexpresados en la mayoría de muestras microdiseccionadas mediante determinación cuantitativa por RT-PCR en tiempo real. Por tanto, de los 45 genes valorables del Chip Diagnóstico 1 (26 sobreexpresados y 19 infraexpresados), 24 (9 sobreexpresados y 15 infraexpresados) han sido validados en sus respectivos perfiles de expresión mediante RT-PCR en tiempo real sobre epitelios puros microdiseccionados por láser. Teniendo en cuenta los resultados obtenidos en las validaciones con muestras no microdiseccionadas y con muestras microdiseccionadas, se seleccionaron aquellos genes que fueron validados en ambos análisis, y de esta forma se obtuvo un conjunto de 22 genes (7 sobreexpresados y 15 infraexpresados, ver Tabla 4). Tomando los datos de expresión sobre microarrays Affymetrix HGF correspondientes a estos 22 genes, se comprobó que este pequeño subconjunto de datos de expresión permite una perfecta discriminación entre muestras normales y tumorales, con un alto valor estadístico [Figura 4].

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TABLA 4 Lista de los 22 genes que mejor discriminan entre muestras de próstata tumoral y próstata normal

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Usando criterios aún más estrictos de validación por RT-PCR en tiempo real para la selección de genes sobreexpresados o infraexpresados en tumores, y teniendo en cuenta los compartimentos en los que se había deducido que se expresaba cada gen a partir de sus perfiles de expresión, se pudo identificar un subconjunto aún más restringido de 14 genes (6 sobreexpresados y 8 infraexpresados en tumores, ver Tabla 5). Tomando de nuevo los datos de expresión correspondientes a estos 14 genes obtenidos para todas las muestras de partida sobre microarrays Affymetrix HGF, se comprobó que este reducido conjunto también discrimina con alta significación estadística las muestras tumorales de las muestras de próstata no tumoral [Figura 5].

TABLA 5 Lista de los 14 genes que mejor discriminan entre muestras de próstata tumoral y próstata normal

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Por tanto, se considera estos subconjuntos de 45, 22 y 14 genes como una signatura transcripcional validada experimentalmente en este estudio para la discriminación con alto poder estadístico de muestras tumorales y muestras no tumorales de tejido prostático. En la presente invención, se han comprobado también subconjuntos aún más reducidos, de dos genes, capaces de discriminar con alta significación estadística las muestras tumorales de las muestras de próstata no tumoral (Figuras 6 y 7).

Ejemplo 3 Técnica inmunohistoquímica utilizada sobre los microarrays de tejido

Las micromatrices ("microarrays") de tejido fueron construidas usando un instrumento Beecher (Beecher Instruments) y una aguja de 1 mm de diámetro. Se construyeron tres microarrays diferentes, conteniendo zonas seleccionadas de muestras de tejido prostático normal, tumoral y de PIN, previamente incluidas en parafina. Como marcadores de orientación de las muestras dentro de las matrices, se usaron bloques de tejido de pulmón, previamente incluidos en tres tintas de colores diferentes, y colocados en diferentes zonas del microarray. Se realizaron cortes completos de los microarrays y se tiñeron con hematoxilina-eosina para confirmar la calidad. Se utilizaron cortes de dos micrómetros de grosor montados en portaobjetos de vidrio recubiertos de xileno (Dako, Carpinteria, Calif., USA) para las tinciones inmunohistoquímicas. Éstas se realizaron con el sistema Techmate 500 (Dako), usando para la detección el sistema Envision (Dako). Brevemente, las secciones fueron desparafinadas y rehidratadas con series graduales de alcoholes y agua. Para la detección de MYO6 se realizó una desenmascaración de antígeno en una olla a presión con tampón citrato a pH 6 durante 5 min. Para los antígenos EPHA2 y CX3CL1 no se realizó este tratamiento. A continuación se incubaron los microarrays con los anticuerpos primarios durante 30 min (dilución 1/100 para MYO6, anticuerpo monoclonal de ratón, adquirido de Sigma, Missouri, USA; dilución 1/50 para EPHA2, anticuerpo monoclonal de ratón, adquirido de Sigma; y dilución 1/200 para CX3CL1, anticuerpo policlonal de cabra, adquirido de R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) y se lavaron en la solución tamponada ChemMate (Dako). Se bloqueó la peroxidasa endógena durante 7.5 min en la solución de bloqueo de peroxidasa ChemMate (Dako), y después se incubó durante 30 min con un polímero marcado con peroxidasa. Después de lavar con la solución tamponada ChemMate, los microarrays fueron incubados con la solución del sustrato cromogénico diaminobenzidina, lavados con agua, contrateñidos con hematoxilina, deshidratados y montados.

Los resultados fueron analizados por un patólogo. Se evaluaron dos aspectos de las inmunohistoquímicas: por un lado, el porcentaje de tinción epitelial, valorado de 0 a 100%, y por otro, la intensidad de dicha tinción, valorada en nula (0), débil (1), moderada (2) o intensa (3). También se analizó el patrón de expresión de cada una de las proteínas. Se consideró que una muestra presentaba sobreexpresión o infraexpresión de una proteína respecto a otra muestra, cuando la diferencia del porcentaje de tinción epitelial entre las dos muestras era superior al 20% y/o la intensidad era al menos un grado diferente.

TABLA 6 Datos numéricos que corresponden a los niveles de expresión de los genes indicados en la primera columna para las muestras que se indican en la primera fila

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Claims

1. Método para el diagnóstico molecular de cáncer de próstata, que comprende el análisis, in vitro, en una muestra problema del nivel de expresión de al menos dos genes seleccionados del grupo que consiste en: TACSTD1, HPN, AMACR, APOC1, GJB1, PP3111, CAMKK2, ZNF85, SND1, NONO, ICA1, PYCR1, ZNF278, BIK, HOXC6, CDK5, LASS2, NME1, PRDX4, SYNGR2, SIM2, EIF3S2, NIT2, FOXA1, CX3CL1, SNAI2, GSTP1, DST, KRT5, CSTA, LAMB3, EPHA2, GJA1, PER2, FOXO1A, TGFBR3, CLU, ROR2, ETS2, TP73L, DDR2, BNIP2, FOXF1, MYO6 y ABCC4, donde la capacidad discriminatoria entre muestras tumorales y no tumorales cuando se determinan conjuntamente los niveles de expresión de dos o más genes de dicho grupo es mayor que la capacidad discriminatoria de los mismos genes por separado.

2. Método, según la reivindicación 1, donde los genes se seleccionan del grupo que consiste en: TACSTD1, HPN, AMACR, APOC1, GJB1, CX3CL1, SNAI2, GSTP1, DST, KRT5, CSTA, LAMB3, EPHA2, GJA1, PER2, FOXO1A, TGFBR3, CLU, ROR2, ETS2, MYO6 y ABCC4, y donde la capacidad discriminatoria entre muestras tumorales y no tumorales cuando se determinan conjuntamente los niveles de expresión de dos o más genes de dicho grupo es mayor que la capacidad discriminatoria de los mismos genes por separado.

3. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, donde los genes se seleccionan del grupo que consiste en: TACSTD1, HPN, AMACR, APOC1, CX3CL1, SNAI2, GSTP1, DST, KRT5, CSTA, LAMB3, EPHA2, MYO6 y ABCC4, y donde la capacidad discriminatoria entre muestras tumorales y no tumorales cuando se determinan conjuntamente los niveles de expresión de dos o más genes de dicho grupo es mayor que la capacidad discriminatoria de los mismos genes por separado.

4. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde al menos uno de los genes seleccionados del grupo es el gen MYO6.

5. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde al menos uno de los genes seleccionados del grupo es el gen ABCC4.

6. Método según la reivindicación 4, donde el análisis del nivel de expresión del gen MYO6 se combina con el análisis del nivel de expresión de al menos un gen del grupo que consiste en: ABCC4, AMACR, BIK, BNIP2, CDK5, CSTA, DST, EIF3S2, EPHA2, ETS2, GJB1, HPN, NIT2, PYCR1, ROR2, TACSTD1 y TP73L.

7. Método según la reivindicación 5, donde el análisis del nivel de expresión del gen ABCC4 se combina con el análisis del nivel de expresión de al menos un gen del grupo que consiste en: CSTA, GJB1, GSTP1, HOXC6, HPN, LAMB3, MYO6, PRDX4 y TP73L.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, donde el análisis del nivel de expresión de dichos genes se realiza determinando el nivel de ARNm derivado de su transcripción.

9. Método según la reivindicación 8, donde el análisis se realiza mediante una amplificación por PCR, RT-PCR, RT-LCR, SDA o cualquier otro método de amplificación de ácidos nucleicos.

10. Método según la reivindicación 8, donde el análisis se lleva a cabo por chips de DNA elaborados con oligonucleótidos depositados por cualquier mecanismo.

11. Método según la reivindicación 8, donde el análisis se lleva a cabo por chips de DNA elaborados con oligonucleótidos sintetizados in situ mediante fotolitografía o por cualquier otro mecanismo.

12. Método según la reivindicación 8, donde el análisis se lleva a cabo mediante hibridación in situ utilizando sondas específicas marcadas con cualquier método de marcaje.

13. Método según la reivindicación 8, donde el análisis se lleva a cabo mediante geles de electroforesis.

14. Método según la reivindicación 13, donde el análisis se lleva a cabo mediante transferencia a membrana e hibridación con una sonda específica.

15. Método según la reivindicación 8, donde el análisis se lleva a cabo mediante RMN o cualquier otra técnica de diagnóstico por imagen.

16. Método, según la reivindicación 8, donde el análisis se lleva a cabo mediante RMN o cualquier otra técnica de diagnóstico por imagen mediante la utilización de nanopartículas paramagnéticas o cualquier otro tipo de nanopartículas detectables funcionalizadas con anticuerpos o por cualquier otro medio.

17. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, donde el análisis del nivel de expresión de dichos genes se realiza determinando el nivel de proteína codificada por el gen o fragmentos de la misma.

18. Método según la reivindicación 17, donde el análisis se lleva a cabo mediante incubación con un anticuerpo específico.

19. Método según la reivindicación 18, donde el análisis se lleva a cabo mediante Western blot.

20. Método según la reivindicación 18, donde el análisis se lleva a cabo mediante inmunohistoquímica.

21. Método según la reivindicación 17, donde el análisis se lleva a cabo mediante geles de electroforesis.

22. Método según la reivindicación 17, donde el análisis se lleva a cabo mediante chips de proteína.

23. Método según la reivindicación 17, donde el análisis se lleva a cabo mediante ELISA o cualquier otro método enzimático.

24. Método según la reivindicación 17, donde el análisis se lleva a cabo mediante RMN o cualquier otra técnica de diagnóstico por imagen.

25. Método según la reivindicación 17, donde el análisis se lleva a cabo mediante RMN o cualquier otra técnica de diagnóstico por imagen mediante la utilización de nanopartículas paramagnéticas o cualquier otro tipo de nanopartículas detectables funcionalizadas con anticuerpos o por cualquier otro medio.

26. Kit para el diagnóstico molecular de cáncer de próstata que comprende los reactivos y aditivos apropiados para detectar la variación en los niveles de expresión del gen o genes de acuerdo con el método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25.

27. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde la sobreexpresión de los genes MYO6, ABCC4, TACSTD1, HPN, AMACR o APOC1 o la infraexpresión de los genes CX3CL1, SNAI2, GSTP1, DST, KRT5, CSTA, LAMB3 o EPHA2 se utiliza como diagnóstico de la presencia de cáncer de próstata o de una condición pre-maligna del mismo o como pronóstico de la progresión del cáncer de próstata o de una condición pre-maligna del mismo o como pronóstico del riesgo de recurrencia de dicha enfermedad.

28. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde la sobreexpresión de los genes MYO6, ABCC4, TACSTD1, HPN, AMACR, APOC1 o GJB1 o la infraexpresión de los genes CX3CL1, SNAI2, GSTP1, DST, KRT5, CSTA, LAMB3, EPHA2, GJA1, PER2, FOXO1A, TGFBR3, CLU, ROR2 o ETS2 se utiliza como diagnóstico de la presencia de cáncer de próstata o de una condición pre-maligna del mismo o como pronóstico de la progresión del cáncer de próstata o de una condición pre-maligna del mismo o como pronóstico del riesgo de recurrencia de dicha enfermedad.

29. Método según la reivindicación 1, donde la sobreexpresión de los genes MYO6, ABCC4, TACSTD1, HPN, AMACR, APOC1, GJB1, PP3111, CAMKK2, ZNF85, SND1, NONO, ICA1, PYCR1, ZNF278, BIK, HOXC6, CDK5, LASS2, NME1, PRDX4, SYNGR2, SIM2, EIF3S2, NIT2, o FOXA1 o la infraexpresión de los genes CX3CL1, SNAI2, GSTP1, DST, KRT5, CSTA, LAMB3, EPHA2, GJA1, PER2, FOXO1A, TGFBR3, CLU, ROR2, ETS2, TP73L, DDR2, BNIP2 o FOXF1 se utiliza como diagnóstico de la presencia de cáncer de próstata o de una condición pre-maligna del mismo o como pronóstico de la progresión del cáncer de próstata o de una condición pre-maligna del mismo o como pronóstico del riesgo de recurrencia de dicha enfermedad.

30. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde la capacidad discriminatoria cuando se determinan conjuntamente los niveles de expresión de dos o más genes es un 1%, preferentemente un 10%, más preferentemente un 25%, aún más preferentemente un 50% mayor que la capacidad discriminatoria de al menos uno de los genes por separado.