WO2010066928A1 - Método para la subclasificación de tumores - Google Patents
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Definitions
- the present invention falls within the field of molecular biology and medicine. Specifically, the present invention relates to a method of tumor subclassification. Specifically, it refers to a method of prognosis of the evolution of tumors, and therefore, a useful method for making decisions regarding the treatment to be administered to the patient. In addition, the present invention relates to a kit that allows the subclassification of tumors by this method.
- Breast cancer is the most frequent malignant tumor in women and the first cause of cancer death also in women. It is a heterogeneous disease in terms of clinical manifestations, prognosis and sensitivity or resistance to different medical treatments.
- the prognosis of breast cancer is particularly relevant because it serves to select the adjuvant treatments that the patient will receive after surgery to reduce the risk of relapse.
- the "70-gene Signature" prognostic gene profile marketed under the name of MammaPrint® by the company Agendia (van 't Veer et al. Nature. 2002 Jan 31; 415 (6871): 530-6; patent with Publication number EP1782315) is offered for the diagnosis of patients presenting the following criteria: tumor size less than 5 cm, stage I or II breast carcinoma, without lymph node involvement or up to 3 affected lymph nodes, regardless of the expression of the estrogen receptor (ER).
- the procedure requires the measurement of the expression of 70 genes that determine the gene signature associated with prognosis.
- the method used for the analysis consists in obtaining RNA from fresh frozen tissue (FF) and the use of cDNA microarrays.
- RNA obtained from these samples is very degraded.
- studies using microarrays are very sensitive to RNA degradation, the use of quantitative RT-PCR (qRT-PCR) has proven to be a technique that offers better results against RNA degradation.
- expression analysis using microarrays is a complex technique that requires sophisticated equipment that is not available in many laboratories. Therefore, in view of the reasons set forth, the use of the qRT-PCR from RNA obtained from FFPE tissue samples used in the present invention offers numerous advantages over expression analysis by microarray. from RNA obtained from FF tissue samples.
- the "H / l Index” marketed under the name of Theros H / l TM by the company BioTheranostics (Ma et al. J Clin Oncol. 2006 Oct 1; 24 (28): 4611-9; patent with publication number WO2007084220) It requires the measurement of the expression of the HOXB13 and IL17BR genes that determine the gene signature associated with prognosis and 4 genes that allow normalization. This method allows predicting the response to hormonal treatment in women with positive breast carcinoma for estrogen receptor expression and without affected nodes.
- Ovarian cancer although less frequent than breast cancer, is the most lethal tumor of the female genital tract, due not only to its intrinsic aggressiveness, but also to the difficulty of early diagnosis, which means that almost two thirds of the women diagnosed are already in advanced stages of the disease.
- ovarian cancer we can also find papers that analyze expression profiles using high performance techniques (Crijns et al, 2006. lnt J Gynecol Cancer. 16: 152-65).
- cancer is a heterogeneous disease with different tumor subtypes in terms of their prognosis and response to different therapeutic options.
- high performance techniques in genomics are very useful to predict the risk of relapse, survival and response to different adjuvant medical treatments.
- the gene profiles described to date for the prognosis of cancer still require validation tests.
- the predictive capacity of each type of each profile is quite limited and there is a need for gene profiles that allow predicting the response to new adjuvant therapies (Marchionni et al. Evid Rep Technol Assess. 2007 Dec; (160): 1-105).
- the present invention relates to a tumor subclassification method. Specifically, it refers to a method of prognosis of the evolution of tumors, and therefore, a useful method for making decisions regarding the treatment to be administered to the patient. In addition, the present invention relates to a kit that allows the subclassification of tumors by this method.
- a first aspect of the invention refers to a method for the subclassification of tumors comprising:
- step (b) obtaining an isolated biological sample comprising tumor cells of the mammal; b. Detection of the quantity of the product of the expression of between two and eight genes selected from the following: DTL, ECT2, MTDH, PRC1, RFC4, SCUBE2, STK32B or ZNF533, in the sample obtained in (a) and c. comparison of the amount detected in step (b) with a reference amount.
- Another aspect of the present invention refers to a method of prognosis of the evolution of the tumor that comprises, in addition to the steps (a) - (c) described above, a step (d) where an amount detected in step (b) of the DTL, ECT2, MTDH, PRC1 or RFC4 genes greater than the reference amount with that compared in step (c) or an amount detected in step (b) of the SCUBE2, STK32B or ZNF533 genes less than Ia reference amount with that compared in step (c) is indicative of a lower survival free from distant relapse or a lower overall survival.
- prognosis refers to, but is not limited to, the probability of death due to cancer or progression, including relapse, metastatic dissemination capacity or response to a particular treatment. of a neoplastic disease.
- prediction refers, but is not limited, to the probability that a patient responds favorably or unfavorably to a certain treatment, and to the extent of said responses, or that The patient survives, after the surgical removal of a primary tumor and / or the chemotherapy for a period of time without cancer relapse.
- SLRD free relapse survival
- SG global survival
- isolated biological sample comprising tumor cells refers to, but is not limited to, tissues and / or biological fluids of a subject, obtained by any method known to a person skilled in the art. That serves for that purpose.
- the biological sample may be a tissue, for example, but not limited to, a tumor biopsy or a fine needle aspirate, or it may be a biological fluid, for example, but not limited to, a fluid sample, such as blood, plasma, serum , lymph, ascites fluid, urine or breast exudate.
- the sample can be taken from a human mammal, but also from non-human mammals, such as, but not limited to rodents, ruminants, felines or canines.
- the biological sample can be fresh, frozen, fixed, embedded in paraffin. Preferably, the sample is fixed and embedded in paraffin.
- product of expression refers to its transcription or expression products (RNA or protein). Or to any form resulting from the processing of said transcription or expression products.
- gene expression profile refers to any method that allows the quantification of messenger RNA (mRNA) and / or protein in a sample biological
- reference quantity refers to any value derived from the quantification of the product of the expression of the genes in a biological sample, which allows to define two populations with different risk of distant relapse.
- the detection of the quantity of product of the expression of the genes in Ia Sample obtained refers to the measurement of the amount or concentration, preferably semi-quantitative or quantitative.
- the measure can be carried out directly or indirectly.
- Direct measurement refers to the measurement of the quantity or concentration of the product of the gene expression based on a signal that is obtained directly from the product of the gene expression and that is directly correlated with the number of molecules of the product of the gene. expression of the gene present in the sample.
- Said signal - to which we can also refer to as an intensity signal - can be obtained, for example, by measuring an intensity value of a chemical or physical property of the expression product.
- the indirect measurement includes the measurement obtained from a secondary component (for example, a component other than the product of the gene expression) or a biological measurement system (for example the measurement of cellular responses, ligands, "labels" or enzymatic reaction products ).
- the detection of the quantity of product of the expression of the genes can be carried out by any method of determining the quantity of the product of the expression of the genes known by the person skilled in the art.
- the detection of the product of the expression of the genes is performed by determining the level of mRNA derived from its transcription where the analysis of the level of mRNA can be performed, by way of illustration and without limiting the scope of the invention, by amplification by polymerase chain reaction (PCR), back transcription in combination with the ligase chain reaction (RT-LCR), back transcription in combination with the polymerase chain reaction (RT-PCR), back transcription in combination with the quantitative polymerase chain reaction (qRT-PCR), or any other nucleic acid amplification method; DNA microarrays made with oligonucleotides deposited by any mechanism; DNA microarrays made with oligonucleotides synthesized in situ by photolithography or by any other mechanism; in situ hybridization using specific probes marked with any method of marking;
- the mRNA can be extracted, for example, but not limited to fresh tissue samples, FF tissue or FFPE tissue samples.
- the methods of obtaining total RNA or mRNA are well known in the state of the art.
- the use of FFPE tissue samples has important advantages over FF tissue samples: they are stable at room temperature, easy to store and there is a large archive of clinical samples available along with their clinical information and disease monitoring. Therefore, in a preferred embodiment the mRNA is extracted from FFPE tissue samples.
- RNA obtained from samples of FFPE tissue is often very degraded. While studies using microarrays are very sensitive to RNA degradation, the use of quantitative RT-PCR (qRT-PCR) has proven to be a technique that offers better results against RNA degradation. In addition, expression analysis using microarrays is a complex technique that requires sophisticated equipment that is not available in many laboratories. Therefore, in a preferred embodiment the detection of the mRNA is performed by means of the qRT-PCR technique.
- one aspect of the invention consists of a normalization method, which from now on we will refer to as NorMean, which serves to correct the errors due to the different enzymatic efficiencies of the retrotranscription and amplification reactions, as well as those caused for the variations due to the different quality of the RNA due to the degradation consequence of the fixation in formalin.
- NF Normalization Factor
- the NorMean normalization method allows to select a gene or group of genes that are used as reference genes based on the value of the parameter a ⁇ :
- CVy is the coefficient of variation of the reference gene i in material j
- ry is the Pearson correlation coefficient between the expression of the gene i and the average expression of all the genes in each sample in the material j.
- the a ⁇ value allows to order the reference genes: those reference genes with lower value a ⁇ are those with the most stable expression (low CV) and with greater correlation with the average gene expression per sample (high r).
- the NF is determined by calculating the geometric mean of the expression values of the selected reference genes.
- the Pearson correlation coefficient between the normalized expression values is used.
- the variations in mRNA expression due to the different enzymatic efficiencies of the detection method as well as those due to the degradation of mRNA in FFPE tissues are corrected.
- the expression of 83 genes, included in three gene profiles related to the prognosis of breast cancer, in samples of patients with infiltrating ductal carcinoma of the breast was normalized using NorMean.
- the Pearson correlation between the normalized data of a series of FF tissue samples with their paired FFPE tissue samples those genes whose correlation was comparable between both types of tissue (53 genes) were chosen.
- step (b) of the method of the present invention the amount of the product of the expression of between 2 and 8 genes selected from the following is detected: DTL, ECT2, MTDH, PRC1, RFC4, SCUBE2, STK32B or ZNF533.
- step (b) of the method of the present invention the amount of the product of the expression of the DTL, ECT2, MTDH, PRC1, RFC4, SCUBE2, STK32B and ZNF533 genes is detected.
- the detection of the amount of product in step (b) of a larger amount of genes, which include at least 2 of these 8 genes could reach similar results.
- a cut-off point is defined, so that patients with a lower profile score than the cut-off point are assigned to the low-risk group of distant relapse and patients with A higher score than said cut-off point constitute the group with a high risk of distant relapse.
- step (b) of the DTL, ECT2, MTDH, PRC1 or RFC4 genes greater than the reference amount with that compared in step (c) or an amount detected in step (b) of the SCUBE2, STK32B or ZNF533 genes smaller than the reference amount with that compared in step (c) is indicative of a lower survival free from distant relapse or a lower overall survival.
- these genes are, but are not limited to: AYTL2, BIRC5, CCNB1, CCNE2, GMPS, MCM6, MELK, MYBL2, ORC6L, PGR or TGFB3.
- the present invention provides a method for the subclassification of tumors and / or for the prognosis of the evolution of the tumor in a simple and effective way.
- tumor refers to transformed cells that have uncontrolled growth. Depending on its possible evolution, it may be a benign tumor, which remains in its starting place and does not produce metastasis; or malignant tumor or cancer, invasive or metastatic. Therefore, the term “cancer” or “cancerous”, as used in the present description, refers to an alteration of the tumor cells that have the capacity to invade tissues or produce metastases in distant places of the primary tumor.
- cancer examples include, but are not limited to, breast cancer, gynecological cancers, colon cancer, prostate cancer, skin cancer, hepatocellular cancer, lung cancer, esophageal cancer, gastric cancer, pancreatic cancer, bladder cancer, liver cancer, urinary tract cancer, thyroid cancer, kidney cancer, melanoma, brain cancer, sarcoma, lymphoma or leukemia.
- Gynecological cancers include tumors of the ovary, uterus, cervix, vagina and vulva. There is a group of tumors in which the participation of hormonal regulation is important, such as breast, gynecological or prostate tumors. Therefore, preferably, the method of the present invention refers, but is not limited to a method for the subclassification of breast, gynecological or prostate tumors.
- the method of the present invention refers to a method for the subclassification of breast tumors.
- the breast tumor is the accelerated, disordered and uncontrolled proliferation of cells belonging to different tissues of a mammary gland.
- the word carcinoma is applied to malignant tumors that originate from cell lines of epithelial or glandular origin.
- the majority of breast carcinoma has its origin in the accelerated and uncontrolled proliferation of the cells that cover the interior of the ducts that during lactation, carry the milk from the glandular acini, where it is produced, to the galactophores ducts, located behind of the areola and the nipple, where it accumulates waiting to go outside;
- This breast cancer is known as ductal carcinoma.
- the cancer has its origin in the glandular acini itself and is called lobular carcinoma.
- breast carcinomas are confined in the lumen of the ducts or acini, without invading neighboring tissues; They are called carcinomas in situ. When they proliferate too much they can break the so-called basement membrane and spread by infiltrating the tissues surrounding ducts and acini and then receive names such as infiltrating ductal carcinoma or infiltrating lobular carcinoma.
- the TNM staging system (Tumor size, Node, Metastasis) is the most common method to subclassify breast carcinoma. It allows breast carcinomas to be included in 5 possible stages (0, I, II, III and IV) depending on the size of the tumor (T), the spread to the lymph nodes (N), and the metastasis or spread to other parts of the body (M).
- lymph node involvement refers to a cancer that has not spread to the lymph nodes.
- lymph node involvement refers to a cancer that has spread to at least one lymph node.
- the method of the present invention refers, but is not limited to a method for subclassification of infiltrating breast carcinomas. Even more preferably, for the subclassification of stage I or II infiltrating breast carcinomas.
- Another factor that allows subclassifying breast cancer is the expression of estrogen or progesterone receptors.
- the method of the present invention refers, but is not limited, to a method for the subclassification of breast tumors positive for estrogen receptor expression.
- the main cancer treatment is usually surgery. In the case of breast cancer, surgery usually consists of either a mastectomy or conservative surgery.
- mastectomy refers to the removal of the breast or as much breast tissue as possible. In most cases, the surgeon also removes the lymph nodes of the axilla.
- conservative surgery expression refers to the removal of the tumor but not from the breast; It is also known as lumpectomy, segmental mastectomy or partial mastectomy.
- adjuvant therapy refers to the treatment that is given after the main treatment in order to prevent relapse of cancer in the breast or elsewhere.
- adjuvant therapy may consist, for example, but not limited to radiotherapy, chemotherapy, hormonal therapy or biological therapy.
- neoadjuvant therapy refers to the adjuvant therapy that is administered before the main treatment in order to reduce the size of the tumor, to enable or facilitate surgery.
- said therapy may include, for example, but not limited to, radiation therapy, chemotherapy, hormonal therapy or biological therapy.
- Radiation therapy involves the use of ionizing radiation to destroy cancer cells. After conservative breast surgery, most patients receive radiotherapy. Some patients receive radiation therapy after a mastectomy. Some patients receive radiotherapy before surgery.
- Hormonal receptor positive tumors are usually treated with therapy hormonal in order to reduce or stop the effects of estrogen on tumor cells.
- Hormone therapy may consist, for example, but not limited to the administration of selective estrogen receptor modulators, aromatase inhibitors, luteinizing hormone-releasing hormone agonists or other hormonal agents.
- Some selective estrogen receptor modulators are, for example, but not limited to tamoxifen, raloxifene or toremifene.
- Some aromatase inhibitors are, for example, but not limited to letrozole, anastrozole or exemestane.
- Other anti-estrogenic substances fulvestrant.
- Other hormonal agents are, for example, but not limited to, androgens.
- Chemotherapy involves the use of compounds or combinations of compounds with the aim of destroying cancer cells.
- the compounds administered in the chemotherapy for breast cancer can be, for example, but not limited to, alkylating agents, antimetabolites, mitosis inhibitors or antitumor antibiotics.
- alkylating agents are, for example, but not limited to, cisplatin, cyclophosphamide, dacarbazine, ifosfamide, mechlorethamine or melphalan.
- Some antimetabolites are, for example, but not limited to, fluorouracil, methotrexate, gemcitabine, cytarabine or fludarabine.
- mitosis inhibitors are, for example, but not limited to paclitaxel, docetaxel, etoposide, vinblastine, vincristine or vinorelbine.
- Some antitumor antibiotics are, for example, but not limited to bleomycin or anthracyclines.
- Some anthracyclines are, for example, daunorubicin, doxorubicin, epirubicin or idarubicin.
- the biological sample is isolated from a mammal that has undergone hormonal therapy and either a mastectomy or conservative surgery followed by radiotherapy.
- the method for the subclassification of tumors of the present invention is useful for predicting the response of cancer to a certain treatment.
- the method for the subclassification of tumors of Ia The present invention is useful for making decisions regarding the adjuvant treatment of a main treatment administered to the patient.
- the method for the subclassification of tumors of the present invention is useful for making decisions regarding neoadjuvant treatment to a main treatment administered to the patient.
- the method for the subclassification of tumors of the present invention is useful for predicting cancer response to anthracycline treatment of a patient with stage I or Il infiltrating ductal carcinoma who has received hormonal therapy and a mastectomy or a conservative surgery followed by radiotherapy.
- the method for the subclassification of tumors of the present invention is useful for predicting the cancer response to treatment with cyclophosphamide-methotrexate-fluorouracil (CMF) of a patient with stage I or Il infiltrating ductal carcinoma that has received hormonal therapy and mastectomy or conservative surgery followed by radiation therapy.
- CMF cyclophosphamide-methotrexate-fluorouracil
- the method of the present invention refers, but is not limited, to a method for the subclassification of ovarian tumors.
- the ovarian tumor is the accelerated, disordered and uncontrolled proliferation of cells belonging to different tissues of the ovary.
- ovarian tumors may be, for example, but not limited to, epithelial tumors, germ cell tumors, stromal sex cord tumors, lipid cell tumors or gonadoblastomas.
- epithelial tumors germ cell tumors
- stromal sex cord tumors lipid cell tumors or gonadoblastomas.
- the most frequent type of tumor is that which originates in the epithelial cells or epithelial tumor of the ovary.
- the method of the present invention refers, but is not limited, to a method for the subclassification of epithelial ovarian tumors. More preferably, the method of the present invention refers, but is not limited, to a method for the subclassification of serous epithelial tumors of ovary.
- kits adapted to carry out the method for tumor subclassification, which comprises the means to determine the expression products of between two and eight genes selected from the following: DTL, ECT2, MTDH , PRC1, RFC4, SCUBE2, STK32B or ZNF533, in an isolated biological sample that comprises the patient's cells.
- Said kit may comprise primers, probes, monoclonal antibodies, and all those reagents necessary to analyze the variation in the level of expression of the genes by means of any of the methods described above in this document and / or known in the state of the art .
- the kit can also include, without any limitation, the use of buffers, enzymes, polymerase enzymes, cofactors to obtain optimal activity of these, agents to prevent contamination, etc.
- the kit can include all the supports and containers necessary for commissioning and optimization.
- the kit also includes instructions for carrying out the first method of the invention.
- Figure 1 Shows the percentage of genes significantly correlated between FF tissue and FFPE tissue samples using different normalization methods. It allows comparing the efficacy of the different normalization methods when correcting errors due to the different enzymatic efficiencies of the back-transcription and amplification reactions, as well as those caused by the variations due to the different quality of the RNA due to its consequent degradation of the fixation in formalin.
- Figure 2 It shows the Kaplan-Meier curves that show SLRD for the low-risk and high-risk relapse groups in the groups defined by the "8-gene Score".
- Figure 3 It shows the sub-analysis of the "8-gene Score" attending to lymph node involvement.
- Figure 4 Shows the Kaplan-Meier curves that show the SLRD in the low and high risk patient groups defined by the "8-gene Score" in the databases used for validation.
- Figure 5 It shows the Mann-Whitney test that shows that the "8-gene Score" is able to differentiate serous ovarian tumors with low malignant potential (LMP) from serous ovarian tumors of the invasive type.
- LMP malignant potential
- EXAMPLE 1 Development of a normalization method to compensate for the effect of RNA degradation.
- FFPE formalin-fixed and paraffin-embedded tissue samples
- FF frozen tissue samples
- samples were selected from 30 patients diagnosed with infiltrating breast carcinoma for which there was both a sample of FF tissue and FFPE tissue, both obtained from the same surgery.
- TLDAs Two microfluidic card configurations ⁇ "Taqman Low Density Arrays", TLDAs) were used in this comparison analysis of FF and FFPE tissue data.
- One of them consisted of a configuration of 95 genes in which 78 genes from the studies of van ' t Veer and collaborators, Paik and collaborators, and Ma and collaborators, as well as 17 reference genes were amplified.
- a second configuration of 63 genes 50 genes from the study by Wang et al. Were measured along with 13 reference genes.
- each card included cDNA of two different samples, the one corresponding to the FF tissue sample and the one corresponding to the FFPE tissue sample, both of the same biopsy.
- the isolated RNA was quantified by spectrophotometry, measuring Ia absorbency at 260 and 280 nm. Likewise, the quality of the different RNAs was evaluated through native electrophoresis in 1% agarose gels, and capillary electrophoresis using the Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies) equipment. The total RNA isolated and analyzed was re-transcribed using the High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems) using 1 ⁇ g RNA in 100 ⁇ l_ reaction in a GeneAmp PCR System 2700 thermocycler model (Applied Biosystems), using random hexamers as primers.
- the qRT-PCR reactions were carried out in an ABI PRISM 7900 HT Sequence Detection System (Applied Biosystems) thermocycler.
- Microfluidic cards (Taqman Low Density Arrays, TLDAs), also designed by Applied Biosystems, were used as support.
- Each of the ports of the microfluidic card contained a final volume of 100 ⁇ L, 50 ⁇ L of Taqman Universal PCR Master Mix and 50 ⁇ L of the cDNA equivalent to 100 ng of the total RNA.
- the expression of each gene was measured in duplicate in the configuration of 95 genes and in triplicate in Ia of 63 genes.
- Ct mean raw threshold cycle
- CVy is the coefficient of variation of the reference gene i in material j
- ry is the Pearson correlation coefficient between the expression of the gene i and the average expression of all the genes in each sample in the material j.
- the a ⁇ value allows to order the reference genes: those reference genes with lower value a ⁇ are those with the most stable expression (low CV) and with greater correlation with the average gene expression per sample (high r).
- the normalization factor is determined by calculating the geometric mean of the expression values of the selected reference genes. 7. Presentation of the Data:
- Optimal treatment defined as: ⁇ Mastectomy or conservative surgery, with infiltration-free surgical margins.
- tumors included in the study corresponded to stages I and II, defined according to the TNM pathological staging system (acronym for "Tumor size, Node, Metastasis') for malignant tumors of 2002 used by the UICC (" Union Internationale Contre Ie Cancer ") and the AJCC (" American Joint Committee on Cancer "). Tumors with negative or unknown hormonal receptors. Likewise, cases that had not received hormone therapy as part of their treatment were excluded, since these cases would have received suboptimal treatment. Finally, those cases for which there was no clinical history available and those samples whose extraction product did not have sufficient quality were excluded. Finally, the study included 153 cases.
- Histological type only cases of infiltrating ductal carcinoma were admitted.
- Hormonal receptors for their entry into the analysis, the case should present positivity at least for the estrogen receptor or for the progesterone receptor.
- Adjuvant treatment chemotherapy (indicating the scheme administered in each case), hormone therapy and / or radiotherapy.
- OS Overall survival
- Ct The mean raw threshold cycle (Ct) values were obtained, defined as the point from which the fluorescence is clearly distinguishable from baseline fluorescence by means of SDS 2.2 software (Applied Biosystems). The maximum Ct value was set at 40. These Ct values were noted in Excel 2003 for later calculations. Ct values were normalized using the four selected reference genes (IPO8, HMBS, POLR2A and SDHA). Gene expression values were calculated using the ⁇ Ct method described previously (Livak and Schmittgen. Methods. 2001 Dec; 25 (4): 402-8). The relative expression values were calculated as differences between the Ct values of each gene and a normalization factor (NF), calculated with the geometric mean of the expression of the four reference genes selected by NorMean in Example 1 (IPO8, POLR2A, UBC and SDHA):
- NF normalization factor
- the normalized expression was adjusted taking as 0 the lowest expression value, so that an increase of one unit in the expression reflected approximately a doubling in the amount of RNA.
- the LOOCV Leave-One-Out-Cross-Validation
- the analyzes were carried out using BRB-ArrayTools v3.6.1 (developed by Richard Simón and Amy Peng).
- the corrected Harrell concordance index for bias was calculated.
- the models were readjusted 500 times with the "bootstrap resampling" technique.
- a reduced genetic profile was constructed. First, 53 genes with high correlation between the expression data of the FF and FFPE tissue samples were identified. Subsequently, 17 genes were selected based on their p-value related to SLRD. With these 17 genes, a model was constructed that adequately identified a group of patients at high risk of distant relapse. Models with 10, 9, 8, 7 or even fewer genes also showed a good separation between groups of high and low risk of distant relapse. The 8 gene profile was selected because it was the one that obtained the best performance.
- the information related to these eight genes, as well as that of the reference genes, is encoded in Table 3.
- a cut-off point was defined at 2.86.
- patients with a profile score ⁇ 2.86 were assigned to the group with a low risk of distant relapse and patients with a score> 2.86 were the group with a high risk for distance relapse.
- the p-value of the statistical "log-rank" test among the risk groups based on 2000 permutations was 0.044. This value provided statistical significance to the cutoff point.
- the "8-gene Score" assigns patients to the low (60%) and high risk (40%) groups, as shown in Figure 2.
- the 5-year distance relapse-free survival was 97.7% for the low-risk group and 60.6% for the high-risk group (HR: 20.4, 95% CI: 6.2 - 67.5; p ⁇ 0.001).
- the five-year overall survival was also calculated: 98.9% for the low-risk group of distant relapse and 86.6% for the high-risk group (HR: 7,496, 95% CI: 2.4-23.4; p ⁇ .001).
- Cox multivariate analysis included the "8-gene Score", tumor size, lymph node involvement status and the degree of tumor differentiation.
- the “8-Gene Score” is a predictor of SLRD (Table 5), indicating that this gene expression profile adds important prognostic information to that provided by traditional clinical factors. Nodal status is the only traditional clinical factor that maintains statistical significance in this multivariate analysis. Table 5.
- Multivariate analysis for the "8-gene Score", the "70-gene Signature” and the "Recurrence Score” (Tumor Size:> 2 cm vs. ⁇ 2 cm.
- Ganglionic Status
- the "8-gene Score” was applied to a database of the Dutch Cancer Institute (NKI) that had previously been used to compare several profiles (Fan et al. N Engl J Med. 2006 Aug 10; 355 (6): 560-9).
- the "8-gene Score” presented significant differences in SLRD in the entire population of 295 patients, and also in the groups of positive nodes, negative nodes and positive estrogen receptors (Table 6).
- the "8-gene Score” assigned more patients to the low-risk group, while the SLRD was slightly lower for all groups. If the cut-off point was modified to include as many patients in the low-risk group as the "70-gene Signature” does, the results were virtually identical.
- Serous ovarian tumors account for more than 50% of all ovarian tumors. Approximately 10-15% of these tumors are classified as proliferative tumors or with low malignant potential (LMP, acronym for "Low Malignant Potential”), considering the rest invasive tumors.
- LMP low malignant potential
- the ability of the "8-gene Score" to separate these two populations of serous ovarian tumors has been verified using the GSE12172 database of the National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) .
- the microarray data were processed following the protocol described for the validation series used in the development of the "8-gene Score" in Example 2.
- the database contains 90 samples, of which 30 are invasive LMP and 60 samples .
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Abstract
La presente invención se encuadra dentro del campo de la biología molecular y la medicina. Específicamente, la presente invención se refiere a un método de subclasificación de tumores. Concretamente, se refiere a un método de pronóstico de la evolución de los tumores, y por tanto, un método útil para tomar decisiones con respecto al tratamiento a administrar al paciente. Además, la presente invención se refiere a un kit que permite la subclasificación de tumores mediante este método.
Description
MÉTODO PARA LA SUBCLASIFICACION DE TUMORES
La presente invención se encuadra dentro del campo de Ia biología molecular y Ia medicina. Específicamente, Ia presente invención se refiere a un método de subclasificación de tumores. Concretamente, se refiere a un método de pronóstico de Ia evolución de los tumores, y por tanto, un método útil para tomar decisiones con respecto al tratamiento a administrar al paciente. Además, Ia presente invención se refiere a un kit que permite Ia subclasificación de tumores mediante este método.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
El cáncer de mama es el tumor maligno más frecuente en las mujeres y Ia primera causa de muerte por cáncer también en mujeres. Es una enfermedad heterogénea en cuanto a las manifestaciones clínicas, el pronóstico y Ia sensibilidad o resistencia a los diferentes tratamientos médicos. El pronóstico del cáncer de mama es particularmente relevante porque sirve para seleccionar los tratamientos adyuvantes que Ia paciente recibirá después de Ia cirugía para reducir el riesgo de recaída.
En los últimos años numerosas publicaciones han puesto de manifiesto que las nuevas técnicas de alto rendimiento en genómica pueden ser de gran utilidad en Ia consecución de estos objetivos (Marchionni et al. Evid Rep Technol Assess. 2007 Dec;(160):1-105). Estas técnicas pueden proporcionar información sobre el riesgo de padecer Ia enfermedad, Ia presencia de un tumor oculto en programas de detección precoz, Ia detección precoz de una recaída, Ia posibilidad de que aparezca dicha recaída del cáncer (pronóstico) y Ia posibilidad de efectos secundarios y de respuesta a los tratamientos. Así, se han encontrado varios perfiles de genes relacionados con el pronóstico del cáncer de mama. Tres de estos perfiles, los conocidos como "70-gene Signature" (van 't Veer et al. Nature. 2002 Jan 31 ;415(6871 ):530-6), "Recurrence Score" (Paik et al. N Engl J Med. 2004 Dec 30;351 (27):2817-26), y
"H/l Index" (Ma et al. J Clin Oncol. 2006 Oct 1 ;24(28):4611-9) han pasado una validación independiente, Io que se podría llamar ensayos en fase II.
El perfil de genes con valor pronóstico "70-gene Signature", comercializado con el nombre de MammaPrint® por Ia empresa Agendia (van 't Veer et al. Nature. 2002 Jan 31 ;415(6871 ):530-6; patente con número de publicación EP1782315) se ofrece para el diagnóstico de pacientes que presenten los siguientes criterios: tamaño del tumor menor de 5 cm, carcinoma de mama en estadio I o II, sin afectación ganglionar o hasta 3 ganglios linfáticos afectos, independientemente de Ia expresión del receptor de estrógenos (ER). El procedimiento requiere Ia medida de Ia expresión de 70 genes que determinan Ia firma génica asociada a pronóstico. El método empleado para el análisis consiste en Ia obtención de RNA a partir de tejido congelado en fresco (FF, siglas del inglés "Fresh Frozen") y el empleo de microarrays de cDNA. El uso de tejido congelado para estudios moleculares a gran escala presenta varios problemas: las muestras congeladas son difíciles de recoger, complicadas de procesar y costosas de almacenar. Por el contrario, las muestras de tejido fijadas en formol y embebidas en parafina (FFPE, siglas del inglés "Formalin- Fixed Paraffin-Embedded") son estables a temperatura ambiente, fáciles de almacenar y, Io que es más importante, existe un amplio archivo de muestras clínicas disponibles junto con su información clínica y el seguimiento de Ia enfermedad. Frente a estas ventajas ofrecidas por las muestras fijadas y embebidas en formol, existe Ia desventaja de que el RNA obtenido a partir de estas muestras está muy degradado. Mientras que los estudios mediante microarrays son muy sensibles a Ia degradación del RNA, el uso de Ia RT-PCR cuantitativa (qRT-PCR) ha demostrado ser una técnica que ofrece mejores resultados ante Ia degradación del RNA. Además, el análisis de expresión mediante microarrays es una técnica compleja que requiere de equipos sofisticados que no están disponibles en muchos laboratorios. Por tanto, a Ia vista de los motivos expuestos, el uso de Ia qRT-PCR a partir de RNA obtenido de muestras de tejido FFPE utilizados en Ia presente invención ofrece numerosas ventajas frente al análisis de expresión mediante microarrays a
partir de RNA obtenido de muestras de tejido FF.
En los otros dos perfiles de genes con valor pronóstico mencionados, conocidos como "Recurrence Score" (Paik et al. N Engl J Med. 2004 Dec 30;351(27):2817-26), y "H/l Index" (Ma et al. J Clin Oncol. 2006 Oct 1 ;24(28):4611-9), el método empleado consiste en Ia obtención de RNA a partir de muestras de tumores FFPE y el empleo de Ia técnica RT-PCR a tiempo real, con las ventajas que ello supone.
El "H/l Index" comercializado con el nombre de Theros H/l™ por Ia empresa BioTheranostics (Ma et al. J Clin Oncol. 2006 Oct 1 ;24(28):4611-9; patente con número de publicación WO2007084220) requiere Ia medida de Ia expresión de los genes HOXB13 e IL17BR que determinan Ia firma génica asociada a pronóstico y 4 genes que permiten Ia normalización. Este método permite pronosticar Ia respuesta al tratamiento hormonal en mujeres con carcinoma de mama positivo para Ia expresión del receptor de estrógenos y sin ganglios afectos.
El perfil "Recurrence Score", comercializado con el nombre de Oncotype DX™ por Ia empresa Genomic Health, Inc. (Paik et al. N Engl J Med. 2004 Dec 30;351(27):2817-26; patente con número de publicación EP1815014) se ofrece para el pronóstico de pacientes a las que se les ha diagnosticado un carcinoma de mama invasivo en estadio I o Il positivo para Ia expresión del receptor de estrógenos y que no presentan afectación de los ganglios linfáticos. Este perfil es uno de los pocos para los que se han realizado estudios que permiten afirmar su utilidad clínica para predecir el beneficio de un tratamiento quimioterapéutico (Gianni et al. J Clin Oncol. 2005;23(29):7265-7277; Paik et al. J Clin Oncol. 2006;24(23):3726-3724; Chang et al. Breast Cáncer Res Treat. 2008 Mar; 108(2):233-40).
El cáncer de ovario, aunque menos frecuente que el de mama, es el tumor más letal del tracto genital femenino, debido no sólo a su agresividad intrínseca,
sino también a Ia dificultad del diagnóstico precoz, Io que hace que casi las dos terceras partes de las mujeres diagnosticadas estén ya en fases avanzadas de Ia enfermedad. En el caso concreto del cáncer de ovario también podemos encontrar trabajos que analizan perfiles de expresión mediante técnicas de alto rendimiento (Crijns et al, 2006. lnt J Gynecol Cáncer. 16:152-65).
En conclusión, el cáncer es una enfermedad heterogénea con distintos subtipos tumorales en cuanto a su pronóstico y respuesta a las diferentes opciones terapéuticas. Durante los últimos años se ha puesto de manifiesto que las técnicas de alto rendimiento en genómica son de gran utilidad para pronosticar el riesgo de recaída, Ia supervivencia y Ia respuesta a los diferentes tratamientos médicos adyuvantes. Sin embargo, los perfiles génicos descritos hasta Ia fecha para el pronóstico del cáncer requieren aún de ensayos de validación. Por otra parte, Ia capacidad predictiva de cada tipo de cada perfil es bastante limitada y existe Ia necesidad de perfiles génicos que permitan pronosticar Ia respuesta a las nuevas terapias adyuvantes (Marchionni et al. Evid Rep Technol Assess. 2007 Dec;(160):1-105).
EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a un método de subclasificación de tumores. Concretamente, se refiere a un método de pronóstico de Ia evolución de los tumores, y por tanto, un método útil para tomar decisiones con respecto al tratamiento a administrar al paciente. Además, Ia presente invención se refiere a un kit que permite Ia subclasificación de tumores mediante este método.
Por tanto, un primer aspecto de Ia invención se refiere a un método para Ia subclasificación de tumores que comprende:
a. obtención de una muestra biológica aislada que comprende células tumorales del mamífero;
b. detección de Ia cantidad del producto de Ia expresión de entre dos y ocho genes seleccionados de entre los siguientes: DTL, ECT2, MTDH, PRC1 , RFC4, SCUBE2, STK32B o ZNF533, en Ia muestra obtenida en (a) y c. comparación de Ia cantidad detectada en el paso (b) con una cantidad de referencia.
Otro aspecto de Ia presente invención, se refiere un método de pronóstico de Ia evolución del tumor que comprende, además de los pasos (a)-(c) anteriormente descritos, un paso (d) donde una cantidad detectada en el paso (b) de los genes DTL, ECT2, MTDH, PRC1 o RFC4 mayor que Ia cantidad de referencia con Ia que se compara en el paso (c) o una cantidad detectada en el paso (b) de los genes SCUBE2, STK32B o ZNF533 menor que Ia cantidad de referencia con Ia que se compara en el paso (c) es indicativa de una menor supervivencia libre de recaída a distancia o una menor supervivencia global.
El término "pronóstico", tal y como se utiliza en Ia presente descripción, se refiere, pero no se limita, a Ia probabilidad de Ia muerte debida al cáncer o Ia progresión, incluyendo recaída, capacidad de diseminación metastásica o respuesta a un determinado tratamiento de una enfermedad neoplásica.
El término "predicción", tal y como se utiliza en Ia presente descripción, se refiere, pero no se limita, a Ia probabilidad de que un paciente responda favorable o desfavorablemente a un determinado tratamiento, y a Ia extensión de dichas respuestas, o de que el paciente sobreviva, tras Ia eliminación quirúrgica de un tumor primario y/o Ia quimioterapia por un periodo de tiempo sin que se produzca recaída del cáncer.
El término "supervivencia libre de recaída a distancia" (SLRD), tal y como se utiliza en Ia presente descripción, se refiere al tiempo transcurrido desde Ia fecha de Ia cirugía hasta Ia recaída a distancia o hasta Ia última visita. El término "supervivencia global" (SG), tal y como se utiliza en Ia presente
descripción, se refiere al tiempo transcurrido desde Ia fecha de Ia cirugía hasta Ia última visita o hasta el fallecimiento de Ia enferma.
El término "muestra biológica aislada que comprende células tumorales", tal y como se utiliza en Ia descripción se refiere, pero no se limita, a tejidos y/o fluidos biológicos de un sujeto, obtenidos mediante cualquier método conocido por un experto en Ia materia que sirva para tal fin. La muestra biológica puede ser un tejido, por ejemplo, pero sin limitarse, una biopsia tumoral o un aspirado por aguja fina, o puede ser un fluido biológico, por ejemplo, pero sin limitarse, una muestra de fluido, como sangre, plasma, suero, linfa, fluido ascítico, orina o exudado mamario. La muestra puede ser tomada de un mamífero humano, pero también de mamíferos no humanos, como por ejemplo, pero sin limitarse como roedores, rumiantes, felinos o caninos. La muestra biológica puede ser fresca, congelada, fijada, embebida en parafina. Preferiblemente, Ia muestra es fijada y embebida en parafina.
El término "producto de Ia expresión", tal y como se utiliza en Ia descripción, hace referencia a sus productos de transcripción o expresión (ARN o proteína). O a cualquier forma resultante del procesamiento de dichos productos de transcripción o expresión.
El término "perfil de expresión génica" o "perfil de expresión de genes", tal y como se utiliza en Ia presente descripción, se refiere a cualquier método que permita Ia cuantificación del RNA mensajero (mRNA) y/o de proteína en una muestra biológica.
El término "cantidad de referencia" o "punto de corte", tal y como se utiliza en Ia presente descripción, se refiere a cualquier valor derivado de Ia cuantificación del producto de Ia expresión de los genes en una muestra biológica, que permita definir dos poblaciones con diferente riesgo de recaída a distancia.
La detección de Ia cantidad de producto de Ia expresión de los genes en Ia
muestra obtenida, tal y como se utiliza en Ia descripción, hace referencia a Ia medida de Ia cantidad o Ia concentración, preferiblemente de manera semi- cuantitativa o cuantitativa. La medida puede ser llevada a cabo de manera directa o indirecta. La medida directa se refiere a Ia medida de Ia cantidad o Ia concentración del producto de Ia expresión del gen basada en una señal que se obtiene directamente del producto de Ia expresión del gen y que está correlacionada directamente con el número de moléculas del producto de Ia expresión del gen presente en Ia muestra. Dicha señal - a Ia que también podemos referirnos como señal de intensidad - puede obtenerse, por ejemplo, midiendo un valor de intensidad de una propiedad química o física del producto de expresión. La medida indirecta incluye Ia medida obtenida de un componente secundario (por ejemplo, un componente distinto del producto de Ia expresión génica) o un sistema de medida biológica (por ejemplo Ia medida de respuestas celulares, ligandos, "etiquetas" o productos de reacción enzimática).
De acuerdo con Ia presente invención, Ia detección de Ia cantidad de producto de Ia expresión de los genes puede ser llevada a cabo por cualquier método de determinación de Ia cantidad del producto de Ia expresión de los genes conocido por el experto en Ia materia. En una realización preferida, Ia detección del producto de Ia expresión de los genes se realiza determinando el nivel de mRNA derivado de su transcripción donde el análisis del nivel de mRNA se puede realizar, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de Ia invención, mediante amplificación por reacción en cadena de Ia polimerasa (PCR), retrotranscripción en combinación con Ia reacción en cadena de Ia ligasa (RT- LCR), retrotranscripción en combinación con Ia reacción en cadena de Ia polimerasa (RT-PCR), retrotranscripción en combinación con Ia reacción en cadena de Ia polimerasa cuantitativa (qRT-PCR), o cualquier otro método de amplificación de ácidos nucleicos; microarrays de DNA elaborados con oligonucleótidos depositados por cualquier mecanismo; microarrays de DNA elaborados con oligonucleótidos sintetizados in situ mediante fotolitografía o por cualquier otro mecanismo; hibridación in situ utilizando sondas específicas
marcadas con cualquier método de mareaje; mediante geles de electroforesis; mediante transferencia a membrana e hibridación con una sonda específica; mediante RMN o cualquier otra técnica de diagnóstico por imagen utilizando nanopartículas paramagnéticas o cualquier otro tipo de nanopartículas detectables funcionalizadas con anticuerpos o por cualquier otro medio.
El mRNA puede ser extraído, por ejemplo, pero sin limitarse a partir de muestras de tejido fresco, tejido FF o de muestras de tejido FFPE. Los métodos de obtención de RNA total o mRNA son bien conocidos en el estado de Ia técnica. El uso de muestras de tejido FFPE presenta importantes ventajas con respecto a las muestras de tejido FF: son estables a temperatura ambiente, fáciles de almacenar y existe un amplio archivo de muestras clínicas disponibles junto con su información clínica y el seguimiento de Ia enfermedad. Por tanto, en una realización preferida el mRNA se extrae de muestras de tejido FFPE.
El RNA obtenido de muestras de tejido FFPE suele encontrarse muy degradado. Mientras que los estudios mediante microarrays son muy sensibles a Ia degradación del RNA, el uso de Ia RT-PCR cuantitativa (qRT-PCR) ha demostrado ser una técnica que ofrece mejores resultados ante Ia degradación del RNA. Además, el análisis de expresión mediante microarrays es una técnica compleja que requiere de equipos sofisticados que no están disponibles en muchos laboratorios. Por tanto, en una realización preferida Ia detección del mRNA se realiza mediante Ia técnica de qRT-PCR.
El sesgo que puede introducir Ia pérdida de RNA amplificable debida a Ia degradación debe además ser corregido mediante estrategias de normalización que puedan compensar este efecto de Ia degradación del RNA. Por tanto, un aspecto de Ia invención consiste en un método de normalización, al que de ahora en adelante nos referiremos como NorMean, que sirve para corregir los errores debidos a las diferentes eficiencias enzimáticas de las reacciones de retrotranscripción y amplificación, así como las causadas por las variaciones
debidas a Ia diferente calidad del RNA debida a Ia degradación consecuencia de Ia fijación en formol.
Una vez seleccionados el gen o grupo de genes apropiados que funcionarían como genes de referencia se calcula el Factor de Normalización (NF, siglas del inglés "Normalization Factor") utilizando Ia media geométrica de los genes seleccionados.
El método de normalización NorMean permite seleccionar un gen o grupo de genes que se usan como genes de referencia basándose en el valor del parámetro a¡:
a¡=ΣCV¡j/Σr¡j
Donde CVy es el coeficiente de variación del gen de referencia i en el material j, y ry es el coeficiente de correlación de Pearson entre Ia expresión del gen i y Ia media de expresión de todos los genes en cada muestra en el material j. El valor a¡ permite ordenar los genes de referencia: aquellos genes de referencia con menor valor a¡ son aquellos con Ia expresión más estable (bajo CV) y con mayor correlación con Ia expresión génica media por muestra (alto r). El NF se determina calculando Ia media geométrica de los valores de expresión de los genes de referencia seleccionados. El número óptimo de genes de referencia se determina comparando el porcentaje de genes con correlación significativa entre las muestras de tejido FF y tejido FFPE para cada factor de normalización. Los datos se calculan mediante los valores de expresión normalizados para cada gen en cada tipo de muestra dada por el valor 2"ΛCt, donde: ΔCt = Ctgen - NF.
Para determinar Ia concordancia entre los datos de muestras de tejido FF y tejido FFPE se utiliza el coeficiente de correlación de Pearson entre los valores de expresión normalizados.
Utilizando el método NorMean se corrigen las variaciones en Ia expresión del mRNA debidas a las diferentes eficiencias enzimáticas del método de detección así como las debidas a Ia degradación del mRNA en tejidos FFPE. La expresión de 83 genes, incluidos en tres perfiles génicos relacionados con el pronóstico del cáncer de mama, en muestras de pacientes con carcinoma ductal infiltrante de mama, fue normalizada utilizando NorMean. A continuación, mediante el cálculo de una correlación de Pearson entre los datos normalizados de una serie de muestras de tejido FF con sus muestras de tejido FFPE pareadas, se eligieron aquellos genes cuya correlación era comparable entre ambos tipos de tejido (53 genes). Posteriormente, un análisis univariante permitió conocer cuáles de ellos se encuentra asociado con Ia supervivencia libre de recaída a distancia (SLRD) en función de su p valor (17 genes). Con 17 genes se construyó un perfil génico que identificaba un grupo de pacientes de alto riesgo de recaída. Perfiles génicos con 10, 9, 8, 7 o incluso hasta 2 genes mostraron también una buena separación entre grupos de alto y bajo riesgo de recaída a distancia. Finalmente, un análisis de componentes principales y un estudio de correlación de los genes entre sí, ha permitido distinguir un perfil de 8 genes con capacidad pronostica, denominado "8-gene Score". Por tanto, en una realización preferida, en el paso (b) del método de Ia presente invención, se detecta Ia cantidad del producto de Ia expresión de entre 2 y 8 genes seleccionados de entre los siguientes: DTL, ECT2, MTDH, PRC1 , RFC4, SCUBE2, STK32B o ZNF533. En una realización muy preferida, en el paso (b) del método de Ia presente invención se detecta Ia cantidad del producto de Ia expresión de los genes DTL, ECT2, MTDH, PRC1 , RFC4, SCUBE2, STK32B y ZNF533. La detección de Ia cantidad de producto en el paso (b) de una cantidad mayor de genes, que incluyan al menos 2 de estos 8 genes podría llegar a resultados similares.
El perfil de 8 genes de Ia presente invención se calcula en cada muestra utilizando las medidas de expresión génica normalizadas basándose en Ia siguiente ecuación: "8-gene Score" = (de 0.0968 a 0.2904)*DTL + (de 0.1088 a 0.3264)*ECT2 + (de 0.0227 a 0.0681 )*MTDH + (de 0.0664 a 0.1994)*PRC1 +
(de 0.0278 a 0.0834)*RFC4 - (de 0.0956 a 0.2870) *SCUBE2 - (de 0.0221 a 0.0665)*STK32B - (de 0.0591 a 0.1773)*ZNF533. Con Ia intención de asignar a cada paciente a un grupo de riesgo se define un punto de corte, de manera que pacientes con una puntuación en el perfil menor que el punto de corte son asignadas al grupo de bajo riesgo de recaída a distancia y pacientes con una puntuación mayor que dicho punto de corte constituyen el grupo de alto riesgo de recaída a distancia.
Una cantidad detectada en el paso (b) de los genes DTL, ECT2, MTDH, PRC1 o RFC4 mayor que Ia cantidad de referencia con Ia que se compara en el paso (c) o una cantidad detectada en el paso (b) de los genes SCUBE2, STK32B o ZNF533 menor que Ia cantidad de referencia con Ia que se compara en el paso (c) es indicativa de una menor supervivencia libre de recaída a distancia o una menor supervivencia global.
Debido a Ia naturaleza multigénica del predictor, Ia sustitución de estos genes por genes que coexpresan con ellos con un coeficiente de correlación de Pearson r > 0,4 no altera Ia capacidad discriminativa del predictor. Ejemplos de estos genes son, pero sin limitarse: AYTL2, BIRC5, CCNB1 , CCNE2, GMPS, MCM6, MELK, MYBL2, ORC6L, PGR o TGFB3.
Por tanto, Ia presente invención proporciona un método para Ia subclasificación de tumores y/o para el pronóstico de Ia evolución del tumor de una manera sencilla y eficaz.
Los términos "tumor" o "tumoral", tal y como se utiliza en Ia presente descripción, se refiere a células transformadas que presentan un crecimiento incontrolado. Dependiendo de su posible evolución puede tratarse de un tumor benigno, que permanece en su lugar de inicio y no produce metástasis; o tumor maligno o cáncer, invasivo o que produce metástasis. Por tanto, el término "cáncer" o "canceroso" tal y como se utiliza en Ia presente descripción, se refiere a una alteración de las células tumorales que tienen capacidad de
invadir tejidos o de producir metástasis en lugares distantes del tumor primario. Ejemplos de cáncer incluyen, pero sin limitarse, cáncer de mama, cánceres ginecológicos, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer de piel, cáncer hepatocelular, cáncer de pulmón, cáncer de esófago, cáncer gástrico, cáncer de páncreas, cáncer de vejiga, cáncer de hígado, cáncer del tracto urinario, cáncer tiroideo, cáncer renal, melanoma, cáncer de cerebro, sarcoma, linfoma o leucemia. Dentro de los cánceres ginecológicos se engloban los tumores de ovario, de útero, de cérvix, de vagina y de vulva. Existe un grupo de tumores en los que es importante Ia participación de Ia regulación hormonal, tales como los tumores de mama, ginecológicos o de próstata. Por tanto, preferiblemente, el método de Ia presente invención se refiere, pero no se limita a un método para Ia subclasificación de tumores de mama, ginecológicos o de próstata.
En una realización más preferida, el método de Ia presente invención se refiere a un método para Ia subclasificación de tumores de mama. El tumor de mama es Ia proliferación acelerada, desordenada y no controlada de células pertenecientes a distintos tejidos de una glándula mamaria. La palabra carcinoma se aplica a los tumores malignos que se originan en estirpes celulares de origen epitelial o glandular. La mayoría de los carcinoma de mama tiene su origen en Ia proliferación acelerada e incontrolada de las células que tapizan el interior de los conductos que durante Ia lactancia, llevan Ia leche desde los acinos glandulares, donde se produce, hasta los conductos galactóforos, situados detrás de Ia areola y el pezón, donde se acumula en espera de salir al exterior; este cáncer de mama se conoce como carcinoma ductal. En los casos restantes el cáncer tiene su origen en los propios acinos glandulares y se Ie llama carcinoma lobulillar.
Muchos carcinomas de mama se encuentran confinados en Ia luz de los ductos o de los acinos, sin invadir los tejidos vecinos; reciben el nombre de carcinomas in situ. Cuando proliferan en demasía pueden romper Ia llamada membrana basal y extenderse infiltrando los tejidos que rodean a ductos y acinos y entonces reciben nombres como carcinoma ductal infiltrante o
carcinoma lobulillar infiltrante.
El sistema de estadificación TNM (siglas del inglés "Tumor size, Node, Metástasis") es el método más común para subclasificar el carcinoma de mama. Permite incluir a los carcinomas de mama en 5 estadios posibles (0, I, II, III y IV) en función el tamaño del tumor (T), Ia diseminación a los ganglios linfáticos (N), y Ia metástasis o diseminación a otras partes del cuerpo (M).
Las expresiones "sin afectación de los ganglios linfáticos", "sin ganglios linfáticos afectos", tal y como se utiliza en Ia presente descripción, se refiere a un cáncer que no se ha diseminado a los ganglios linfáticos. Por el contrario, el "término con afectación de los ganglios linfáticos" o "con ganglios linfáticos afectos", tal y como se utiliza en Ia presente descripción, se refiere a un cáncer que se ha diseminado al menos a un ganglio linfático.
Más preferiblemente el método de Ia presente invención, se refiere, pero no se limita a un método para Ia subclasificación de carcinomas de mama infiltrantes. Aún más preferiblemente, para Ia subclasificación de carcinomas de mama infiltrantes en estadio I o II.
Otro factor que permite subclasificar el cáncer de mama es Ia expresión de los receptores de estrógenos o progesterona. Las expresiones "positivo para receptores hormonales" tal y como se utiliza en Ia presente descripción, se refiere a un tumor que presenta expresión para el receptor de estrógenos y/o progesterona. La expresión "positivo para receptor de estrógenos" tal y como se utiliza en Ia presente descripción, se refiere a un tumor que presenta expresión para el receptor de estrógenos. La expresión "positivo para receptor de progesterona" tal y como se utiliza en Ia presente descripción, se refiere a un tumor que presenta expresión para el receptor de progesterona. Preferiblemente, el método de Ia presente invención se refiere, pero no se limita, a un método para Ia subclasificación de tumores de mama positivos para Ia expresión del receptor de estrógenos.
El tratamiento del cáncer principal habitualmente suele ser Ia cirugía. En el caso del cáncer de mama, Ia cirugía suele consistir bien en una mastectomía o bien en una cirugía conservadora. La expresión "mastectomía", tal y como se utiliza en Ia presente descripción, se refiere a Ia extirpación de Ia mama o de tanto tejido de Ia mama como sea posible. En Ia mayoría de los casos, el cirujano extirpa también los ganglios linfáticos de Ia axila. La "expresión cirugía conservadora", tal y como se utiliza en Ia presente descripción, se refiere a Ia extirpación del tumor pero no de Ia mama; también se conoce como tumorectomía, mastectomía segmentaria o mastectomía parcial.
Después de Ia cirugía, muchos pacientes reciben terapia adyuvante. El término "terapia adyuvante", tal y como se utiliza en Ia presente descripción, se refiere al tratamiento que se da después del tratamiento principal con el objetivo de prevenir Ia recaída del cáncer en el seno o en otro lugar. En el tratamiento del cáncer, Ia terapia adyuvante puede consistir, por ejemplo, pero sin limitarse en radioterapia, quimioterapia, terapia hormonal o terapia biológica.
Algunos pacientes antes de Ia cirugía reciben terapia "neoadyuvante". El término "terapia neoadyuvante", tal y como se utiliza en Ia presente descripción, se refiere a Ia terapia adyuvante que se administra antes del tratamiento principal con el objetivo de reducir el tamaño del tumor, para posibilitar o facilitar Ia cirugía. En el tratamiento del cáncer dicha terapia, puede incluir, por ejemplo, pero sin limitarse, radioterapia, quimioterapia, terapia hormonal o terapia biológica.
La radioterapia consiste en el uso de radiaciones ionizantes para destruir las células cancerosas. Después de Ia cirugía conservadora de mama, Ia mayoría de los pacientes reciben radioterapia. Algunos pacientes reciben radioterapia después de una mastectomía. Algunas pacientes reciben radioterapia antes de Ia cirugía.
Los tumores positivos para receptores hormonales suelen tratarse con terapia
hormonal con el objetivo de reducir o detener los efectos del estrógeno sobre las células tumorales. La terapia hormonal, puede consistir, por ejemplo, pero sin limitarse, en Ia administración de moduladores selectivos de receptores de estrógeno, inhibidores de aromatasa, agonistas de hormonas liberadoras de hormonas luteinizantes u otros agentes hormonales. Algunos moduladores selectivos de receptores de estrógeno son, por ejemplo, pero sin limitarse tamoxifeno, raloxifeno o toremifeno. Algunos inhibidores de aromatasa son, por ejemplo, pero sin limitarse letrozol, anastrozol o exemestano. Otras sustancias anti-estrogénicas: fulvestrant. Otros agentes hormonales son, por ejemplo, pero sin limitarse, los andrógenos.
La quimioterapia consiste en el uso de compuestos o combinaciones de compuestos con el objetivo de destruir células cancerosas. Los compuestos administrados en Ia quimioterapia para el cáncer de mama pueden ser por ejemplo, pero sin limitarse, agentes alquilantes, antimetabolitos, inhibidores de Ia mitosis o antibióticos antitumorales. Algunos agentes alquilantes son, por ejemplo, pero sin limitarse, cisplatino, ciclofosfamida, dacarbazina, ifosfamida, mecloretamina o melfalán. Algunos antimetabolitos, son por ejemplo, pero sin limitarse, fluorouracilo, metotrexato, gemcitabina, citarabina o fludarabina. Algunos inhibidores de Ia mitosis son, por ejemplo, pero sin limitarse paclitaxel, docetaxel, etopósido, vinblastina, vincristina o vinorelbina. Algunos antibióticos antitumorales, son por ejemplo, pero sin limitarse bleomicina o antraciclinas. Algunas antraciclinas son, por ejemplo, daunorrubicina, doxorrubicina, epirrubicina o idarrubicina.
En una realización preferida, Ia muestra biológica se aisla de un mamífero que ha sido sometido a una terapia hormonal y bien a una mastectomía o bien a una cirugía conservadora seguida de radioterapia.
El método para Ia subclasificación de tumores de Ia presente invención es útil para predecir Ia respuesta del cáncer a un determinado tratamiento. En una realización preferida, el método para Ia subclasificación de tumores de Ia
presente invención es útil para tomar decisiones con respecto al tratamiento adyuvante a un tratamiento principal administrado al paciente. En una realización alternativa, el método para Ia subclasificación de tumores de Ia presente invención es útil para tomar decisiones con respecto al tratamiento neoadyuvante a un tratamiento principal administrado al paciente.
En una realización preferida, el método para Ia subclasificación de tumores de Ia presente invención es útil para predecir Ia respuesta del cáncer al tratamiento con antraciclinas de un paciente con carcinoma ductal infiltrante en estadios I o Il que ha recibido una terapia hormonal y una mastectomía o una cirugía conservadora seguida de radioterapia. En una realización alternativa, el método para Ia subclasificación de tumores de Ia presente invención es útil para predecir Ia respuesta del cáncer al tratamiento con ciclofosfamida- metotrexato-fluorouracilo (CMF) de un paciente con carcinoma ductal infiltrante en estadios I o Il que ha recibido una terapia hormonal y una mastectomía o una cirugía conservadora seguida de radioterapia.
En otra realización preferida, el método de Ia presente invención se refiere, pero no se limita, a un método para Ia subclasificación de tumores de ovario. El tumor de ovario es Ia proliferación acelerada, desordenada y no controlada de células pertenecientes a distintos tejidos del ovario. Dependiendo del origen de las células, los tumores de ovario pueden ser, por ejemplo, pero sin limitarse, tumores del epitelio, tumores de células germinales, tumores de los cordones sexuales del estroma, tumores de células lipídicas o gonadoblastomas. El tipo de tumor más frecuente es el que se origina en Ia las células epiteliales o tumor epitelial del ovario. Dependiendo del tipo de epitelio en el que se origina los tumores epiteliales del ovario pueden ser, por ejemplo, pero sin limitarse, tumores serosos, mucinosos, endometrioides, de células claras o de Brenner. Preferiblemente, el método de Ia presente invención se refiere, pero no se limita, a un método para Ia subclasificación de tumores epiteliales de ovario. Más preferiblemente, el método de Ia presente invención se refiere, pero no se limita, a un método para Ia subclasificación de tumores epiteliales serosos de
ovario.
Otro aspecto de Ia invención se refiere a un kit adaptado para llevar a cabo el método para Ia subclasificación de tumores, que comprende los medios para determinar los productos de expresión de entre dos y ocho genes seleccionados de entre los siguientes: DTL, ECT2, MTDH, PRC1 , RFC4, SCUBE2, STK32B o ZNF533, en una muestra biológica aislada que comprenda células del paciente. Dicho kit puede comprender cebadores, sondas, anticuerpos monoclonales, y todos aquellos reactivos necesarios para analizar Ia variación en el nivel de expresión de los genes por medio de cualquiera de los métodos descritos anteriormente en este documento y/o conocidos en el estado de Ia técnica. El kit además puede incluir, sin ningún tipo de limitación, el uso de tampones, enzimas, enzimas polimerasas, cofactores para obtener una actividad óptima de éstas, agentes para prevenir Ia contaminación, etc. Por otro lado el kit puede incluir todos los soportes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y optimización. Preferiblemente, el kit comprende además las instrucciones para llevar a cabo el primer método de Ia invención.
Salvo que se defina de otra manera, los términos científicos y técnicos usados a Io largo de Ia presente descripción y las reivindicaciones tienen el mismo significado que el entendido por un experto en Ia materia perteneciente al estado de Ia técnica del que forma parte Ia presente invención.
A Io largo de Ia descripción y las reivindicaciones Ia palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en Ia materia, otros objetos, ventajas y características de Ia invención se desprenderán en parte de Ia descripción y en parte de Ia práctica de Ia invención. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de Ia presente invención.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Muestra el porcentaje de genes correlacionados significativamente entre muestras de tejido FF y tejido FFPE usando distintos métodos de normalización. Permite comparar Ia eficacia de los distintos métodos de normalización a Ia hora de corregir los errores debidos a las diferentes eficiencias enzimáticas de las reacciones de retrotranscripción y amplificación, así como las causadas por las variaciones debidas a Ia diferente calidad del RNA debida a su degradación consecuencia de Ia fijación en formol.
Figura 2. Muestra las curvas de Kaplan-Meier que muestran SLRD para los grupos de bajo riesgo y alto riesgo de recaída a distancia en los grupos definidos mediante el "8-gene Score".
Figura 3. Muestra el subanálisis del "8-gene Score" atendiendo a Ia afectación ganglionar. (A) Ganglios positivos. (B) Ganglios negativos.
Figura 4. Muestra las curvas de Kaplan-Meier que muestran Ia SLRD en los grupos de pacientes de bajo y alto riesgo definidos por el "8-gene Score" en las bases de datos utilizadas para Ia validación.
Figura 5. Muestra el test de Mann-Whitney que demuestra que el "8-gene Score" es capaz de diferenciar tumores serosos de ovario con bajo potencial maligno (LMP) de tumores serosos de ovario del tipo invasivo.
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en este documento de patente sirven para ilustrar Ia naturaleza de Ia presente invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a Ia invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran Ia invención sin limitar el campo de
aplicación de Ia misma.
EJEMPLO 1. Desarrollo de un método de normalización para compensar el efecto de Ia degradación del RNA.
El uso de muestras de tejido fijadas en formol y embebidas en parafina (FFPE, siglas del inglés "Formalin-Fixed Paraffin-Embedded") presenta importantes ventajas con respecto a las muestras de tejido congelado (FF, siglas del inglés "Fresh Frozen"): son estables a temperatura ambiente, fáciles de almacenar y existe un amplio archivo de muestras clínicas disponibles junto con su información clínica y el seguimiento de Ia enfermedad. Frente a estas ventajas ofrecidas por las muestras de tejido FFPE, existe Ia desventaja de que el RNA obtenido a partir de estas muestras está muy degradado. El sesgo que puede introducir esta pérdida de RNA amplificable puede ser corregido mediante estrategias de normalización que puedan compensar este efecto de Ia degradación del RNA.
Materiales y métodos.
1. Características clinicopatológicas de las pacientes incluidas en el estudio:
Para el estudio de comparación de datos de tejido FF y tejido FFPE se seleccionaron muestras de 30 pacientes diagnosticadas de carcinoma de mama infiltrante para las cuales había tanto muestra de tejido FF como de tejido FFPE, ambas obtenidas a partir de Ia misma cirugía.
2. Selección de genes:
Para Ia realización del estudio de comparación de datos de expresión génica de 30 muestras de tejido FF y tejido FFPE se seleccionaron una serie de genes descritos previamente obtenidos de los siguientes perfiles génicos descritos: "70-gene Signature" (van 't Veer et al. Nature. 2002 Jan 31 ¡415(6871 ):530-6),
"Recurrence Score" (Paik et al. N Engl J Med. 2004 Dec 30;351 (27):2817-26), "H/l Index" (Ma et al. Cáncer CeII. 2004 Jun;5(6):607-16), y "76-Gene Prognostic Signature" (Wang et al. Lancet 2005;365:671-9), todos ellos descritos con valor pronóstico en cáncer de mama, así como varios genes de referencia (18S, ACTB, B2M, GAPDH, GUSB, HMBS, HPRT1 , IPO8, PGK1 , POLR2A, PPIA, RPLPO, SDHA, TBP, TFRC, UBC, YWHAZ).
En este análisis de comparación de datos de tejido FF y tejido FFPE se utilizaron dos configuraciones de tarjetas microfluídicas {"Taqman Low Density Arrays", TLDAs). Una de ellas consistió en una configuración de 95 genes en Ia que se amplificaron 78 genes de los estudios de van't Veer y colaboradores, Paik y colaboradores, y Ma y colaboradores, así como 17 genes de referencia. En una segunda configuración de 63 genes, se midieron 50 genes del estudio de Wang y colaboradores junto con 13 genes de referencia. En ambos casos cada tarjeta incluía cDNA de dos muestras distintas, Ia correspondiente a Ia muestra de tejido FF y Ia correspondiente a Ia muestra de tejido FFPE, ambas de Ia misma biopsia.
3. Aislamiento del RNA y síntesis de cDNA:
Con el objeto de seleccionar las muestras de tejido FFPE adecuadas para el estudio, se obtuvieron secciones teñidas con hematoxilina/eosina que fueron analizadas por un patólogo con experiencia en mama. Se eligieron muestras que presentaran al menos un 70% de células tumorales. Secciones de 5 μm de cada una de las muestras de tejido FFPE se desparafinaron mediante extracción con xileno, y lavados con etanol en concentraciones decrecientes (100%, 90% y 70%). El RNA se extrajo mediante el kit Master Puré Purification (Epicentre), según las especificaciones del fabricante. El RNA de las muestras FF se extrajo con el reactivo TRIzol (Invitrogen) según las especificaciones del fabricante.
El RNA aislado se cuantificó mediante espectrofotometría, midiendo Ia
absorbencia a 260 y 280 nm. Así mismo, Ia calidad de los distintos RNA fue evaluada a través de electroforesis nativa en geles de agarosa al 1 %, y electroforesis capilar mediante el equipo Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies). El RNA total aislado y analizado se retrotranscribió mediante el kit High Capacity cDNA Reverse Transcription (Applied Biosystems) utilizando 1 μg de RNA en 100 μl_ de reacción en un termociclador modelo GeneAmp PCR System 2700 (Applied Biosystems), empleando hexámeros al azar como cebadores.
4. RT-PCR Cuantitativa:
Las reacciones de qRT-PCR se llevaron a cabo en un termociclador ABI PRISM 7900 HT Sequence Detection System (Applied Biosystems). Como soporte se utilizaron las tarjetas microfluídicas (Taqman Low Density Arrays, TLDAs), también diseñadas por Applied Biosystems. Cada uno de los puertos de Ia tarjeta microfluídica contenía un volumen final de 100μL, 50μL de Taqman Universal PCR Master Mix y 50 μL del cDNA equivalente a 100 ng del RNA total. La expresión de cada gen se midió por duplicado en Ia configuración de 95 genes y por triplicado en Ia de 63 genes.
5. Cálculos para los perfiles de expresión génica:
Se obtuvieron los valores medios de ciclo umbral crudo (Ct, del inglés "Threshold Cycle"), definido como el punto a partir del cual Ia fluorescencia es claramente distinguible de Ia fluorescencia basal, mediante el software SDS 2.2 (Applied Biosystems). El valor máximo de Ct se fijó en 40. Estos valores de Ct fueron anotados en Excel 2003 para cálculos posteriores. Los datos de expresión génica también fueron analizados mediante el software GenEx de MultiD Analysis (www.multid.se) y Prism4 de Graphpad (www.graphpad.com).
Los valores de expresión génica se calcularon mediante el método ΔCt descrito previamente (Livak KJ, Schmittgen TD. Methods. 2001 Dec;25(4):402-8). Los
valores de expresión relativa fueron calculados como diferencias entre los valores de Ct de cada gen y un factor de normalización.
6. Factores de Normalización:
En este estudio, de comparación de datos de tejido FF y tejido FFPE, se analizaron y compararon varios métodos de normalización: geNorm (Vandesompele et al. Genome Biol 2002;3: RESEARCH0034), Normfinder (Andersen et al. Cáncer Res 2004;64:5245-50), Ia media de expresión de todos los genes, así como un método desarrollado por los inventores denominado NorMean. Una vez seleccionados el gen o grupo de genes apropiados que funcionarían como genes de referencia se calculó el Factor de Normalización (NF, de sus siglas en inglés "Normalization Factor") utilizando Ia media geométrica de los genes seleccionados en cada método.
El método de selección de genes de referencia desarrollado por los inventores, NorMean, permite seleccionar genes de referencia basándose en el valor del parámetro a¡:
Donde CVy es el coeficiente de variación del gen de referencia i en el material j, y ry es el coeficiente de correlación de Pearson entre Ia expresión del gen i y Ia media de expresión de todos los genes en cada muestra en el material j. El valor a¡ permite ordenar los genes de referencia: aquellos genes de referencia con menor valor a¡ son aquellos con Ia expresión más estable (bajo CV) y con mayor correlación con Ia expresión génica media por muestra (alto r). El factor de normalización se determina calculando Ia media geométrica de los valores de expresión de los genes de referencia seleccionados.
7. Presentación de los Datos:
Los datos se calcularon mediante los valores de expresión normalizados para ccaaddía gen en cada tipo de muestra dada por el valor 2"ΛCt, donde: ΔCt = Ctgen -
NF.
8. Análisis Estadístico:
Para determinar Ia concordancia entre los datos de muestras de tejido FF y tejido FFPE se utilizó el coeficiente de correlación de Pearson entre los valores de expresión normalizados con cada uno de los factores de normalización para cada gen.
Resultados.
Cada método de normalización genera un NF propio, utilizando para ello genes de referencia distintos (tablai ). El porcentaje de genes con un valor de correlación de Pearson significativo entre los dos tipos de material se utilizó para valorar Ia capacidad para corregir el efecto de Ia conservación en las muestras FFPE de cada uno de los factores de normalización (Figura 1 ). En Ia mencionada figura, se observa que el método de normalización desarrollado, NorMean, es el más estable entre los distintos métodos analizados, puesto que en las dos configuraciones de tarjetas, más del 80% de los genes mostró una buena correlación entre tejido FF y tejido FFPE.
Tabla 1. Genes de referencia seleccionados por cada método en cada material
Materiales y métodos.
1. Pacientes y Datos Clínicos:
Para el desarrollo del perfil se recogieron de manera retrospectiva las características clínicas y anatomopatológicas de 206 pacientes diagnosticadas entre 1996 y 2002 de un carcinoma de mama ductal infiltrante en el Hospital Universitario La Paz (HULP). Se establecieron los siguientes criterios de inclusión:
• Diagnóstico anatomopatológico de carcinoma de mama ductal infiltrante.
• Estadio I o Il anatomopatológico según Ia clasificación TNM de 2002.
• Muestra conservada en parafina disponible.
• Receptores hormonales positivos.
• Tratamiento óptimo, definido como: π Mastectomía o cirugía conservadora, con márgenes quirúrgicos libres de infiltración.
° Radioterapia mamaria tras una cirugía conservadora. ° Hormonoterapia.
• Seguimiento clínico superior a 60 meses (excepto en casos de recidiva precoz).
• Ausencia de cáncer de mama contralateral.
Todos los tumores incluidos en el estudio correspondían a los estadios I y II, definidos según el sistema de estadificación anatomopatológico TNM (siglas del inglés "Tumor size, Node, Metástasis') para tumores malignos de 2002 utilizado por Ia UICC ("Union Internationale Contre Ie Cáncer") y el AJCC ("American Joint Committee on Cáncer"). Fueron excluidos los tumores con
receptores hormonales negativos o desconocidos. Así mismo, también fueron excluidos los casos que no hubieran recibido hormonoterapia como parte de su tratamiento, puesto que estos casos habrían recibido un tratamiento subóptimo. Por último quedaron fuera del análisis aquellos casos para los que no había historia clínica disponible y aquellas muestras cuyo producto de extracción no presentaba suficiente calidad. Finalmente el estudio incluyó 153 casos.
Las características clínicas y anatomopatológicas que se recogieron de manera retrospectiva fueron:
• Edad al diagnóstico (años).
• Fecha del diagnóstico.
• Tipo histológico: sólo se admitieron los casos de carcinoma ductal infiltrante.
• Tamaño del tumor primario (mm).
• Estado de los ganglios axilares: afectos (positivos) o no (negativos).
• Número de ganglios afectos.
• Grado de diferenciación: 1 , 2 o 3.
• Receptores hormonales: para su entrada en el análisis, el caso debía presentar positividad al menos para el receptor de estrógenos o para el de progesterona.
• Tratamiento adyuvante: quimioterapia (señalando el esquema administrado en cada caso), hormonoterapia y/o radioterapia.
• Fecha de Ia recaída.
• Localización inicial de Ia recaída: loco-regional o a distancia (con especificación de los órganos afectados).
• Supervivencia libre de recaída a distancia (SLRD): tiempo transcurrido desde Ia fecha de Ia cirugía hasta Ia recaída a distancia.
• Supervivencia global (SG): tiempo transcurrido desde Ia fecha de Ia cirugía hasta Ia última visita o hasta el fallecimiento de Ia enferma.
Este estudio fue aprobado por el Comité Ético de Hospital Universitario La Paz (HULP).
2. Aislamiento del RNA y síntesis de cDNA:
Se llevó a cabo mediante el método descrito en el ejemplo 1.
3. RT-PCR Cuantitativa:
Se llevó a cabo mediante el método descrito en el ejemplo 1.
4. Selección de Genes:
Se seleccionaron genes que se incluyeron en una tarjeta microfluídica (TLDA) con configuración de 96 y que contenía los ensayos disponibles para los genes del "70-gene Signature" (van 't Veer et al. Nature. 2002 Jan 31 ¡415(6871 ):530- 6.), del "Recurrence Score" (Paik et al. N Engl J Med. 2004 Dec 30;351(27):2817-26), así como para los genes del "H/l Index" (Ma et al. J Clin Oncol. 2006 Oct 1 ;24(28):4611-9). Además se incluyeron varios genes de referencia (POLR2A, IPO8, SDHA, HMBS, UBC, RPLPO, ACTB, PPIA, GAPDH, B2M, GUSB, HPRT1 , TFRC).
5. Cálculos para los perfiles de expresión génica:
Se obtuvieron los valores medios de ciclo umbral crudo (Ct, del ingles "Threshold Cycle"), definido como el punto a partir del cual Ia fluorescencia es claramente distinguible de Ia fluorescencia basal mediante el software SDS 2.2 (Applied Biosystems). El valor máximo de Ct se fijó en 40. Estos valores de Ct fueron anotados en Excel 2003 para cálculos posteriores. Los valores de Ct se normalizaron utilizando los cuatro genes de referencia seleccionados (IPO8, HMBS, POLR2A y SDHA).
Los valores de expresión génica se calcularon mediante el método ΔCt descrito previamente (Livak and Schmittgen. Methods. 2001 Dec;25(4):402-8). Los valores de expresión relativa fueron calculados como diferencias entre los valores de Ct de cada gen y un factor de normalización (NF, de sus siglas en inglés), calculado con Ia media geométrica de Ia expresión de los cuatro genes de referencia seleccionados por NorMean en el ejemplo 1 (IPO8, POLR2A, UBC y SDHA):
ΔCt = NF- Ctgen
La expresión normalizada fue ajustada tomando como 0 el menor valor de expresión, de manera que un aumento de una unidad en Ia expresión reflejara aproximadamente una duplicación en Ia cantidad de RNA.
6. Metodología empleada en Ia búsqueda de un perfil de expresión génica reducido:
En primer lugar se descartaron aquellos genes con baja correlación entre muestras de tejido FF y tejido FFPE, en base a los resultados obtenidos en el ejemplo 1. Se calculó un nivel de significación estadística para cada gen basado en el modelo de riesgos proporcionales de Cox o modelo de Cox (Cox. J Roy Stat Soc. 1972; 34:187-220), con el objetivo de identificar aquellos genes cuya expresión estaba relacionada con supervivencia libre de recaída a distancia. Los genes relacionados con SLRD fueron posteriormente filtrados en función de su valor p y de Ia correlación entre ellos mismos, seleccionando aquellos genes con menor valor p en cada grupo de correlación. Estos genes seleccionados fueron utilizados para desarrollar un predictor de riesgo de recaída basado en Ia expresión génica utilizando el método supervisado de componentes principales de Tibshirani y Bair (Bair and Tibshirani. PLoS Biol. 2004 Apr;2(4):E108).
Para evaluar el valor predictivo del método se utilizó el LOOCV ("Leave-One- Out-Cross-Validation"). Para probar Ia significación estadística del punto de corte se evaluó el valor p del estadístico "log-rank" test entre los grupos de riesgo mediante 2000 permutaciones aleatorias. Los análisis se llevaron a cabo mediante BRB-ArrayTools v3.6.1 (desarrollado por Richard Simón y Amy Peng).
7. Análisis Estadístico:
Para evaluar el valor pronóstico del "8-gene Score" en nuestra población se llevó a cabo un análisis de Kaplan-Meier y se compararon los grupos mediante el "log-rank" test. También se aplicó un análisis univariante y multivariante de Cox, en un modelo que incluía el Grado tumoral (1 vs 2 y 1 vs 3), tamaño (<2 cm vs. >2 cm) y estado ganglionar (ausencia de afectación ganglionar vs. uno a tres ganglios positivos). El criterio de valoración fue SLRD, como en otros estudios de perfiles génicos en cáncer de mama.
Para medir Ia fuerza de asociación entre el "8-gene Score" y el "70-gene Signature" y el "Recurrence Score" se llevaron a cabo análisis de tablas de contingencia de doble entrada y se calculó el estadístico V de Cramer (Fan et al. N Engl J Med. 2006 Aug 10;355(6):560-9).
Para medir Ia capacidad discriminativa del modelo a cinco años se calculó el índice de concordancia de Harrell corregido para el sesgo. Los modelos fueron reajustados 500 veces con Ia técnica de "bootstrap resampling". El índice de concordancia es el porcentaje de pares de pacientes en los que Io predicho y Io observado concuerdan. De esta manera c = 0.50 representa Ia concordancia debida a Ia casualidad; c = 1.0 representa Ia discriminación perfecta (Harrell et al. Stat Med. 1996 Feb 28;15(4):361-87).
8. Bases de datos para Ia Validación del "8-gene Score":
Se utilizaron cuatro grupos de datos independientes disponibles online para validar el "8-gene Score". Estos grupos de datos fueron: NKI, descargado de Ia página web de Rosetta Inpharmatics
(http://www.rii.com/publications/2002/nejm.html), SWE (GSE1456 - Pawitan et al. Breast Cáncer Res. 2005;7(6):R953-64), UPP (GSE4922 - Ivshina et al. Cáncer Res. 2006 Nov 1 ;66(21 ): 10292-301 ) y LOI (GSE6532 - Loi et al. BMC Genomics. 2008;9:239). Los tres últimos fueron descargados del depósito de datos NCBI GEO (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/geo/index.cgi). Para aplicar el "8-gene Score" obtenido mediante qRT-PCR sobre estos datos de microarrays, los valores de expresión fueron z-transformados. A continuación fueron ajustados tomando el menor valor de expresión como 0 y escalados. Se llevó a cabo una normalización por gen dentro de las cohortes de validación utilizando los valores medios obtenidos en Ia cohorte de descubrimiento (Schmidt. Cáncer Res. 2008 JuI 1 ;68(13):5405-13).
Se llevó a cabo un análisis de Kaplan-Meier y se compararon los grupos mediante el "log-rank" test. También se aplicó un análisis de los riesgos proporcionales de Cox. El criterio de valoración fue de nuevo SLRD.
Todos los análisis estadísticos fueron llevados a cabo mediante Ia versión 9.1 del paquete de software SPSS, Ia versión 5.00 de GraphPad Prism y Ia versión 2.2 de R con el paquete estadístico Design versión 2.0-12. Los valores p se consideraron bilaterales y estadísticamente significativos cuando p<0.05.
Resultados
Se incluyeron 153 pacientes diagnosticadas entre febrero de 1995 y marzo de 2003; sus características clínicas se muestran en Ia tabla 2. La mediana de Ia edad fue de 58 años y Ia mediana de seguimiento 91 meses. Se llevó a cabo una mastectomía en 66 pacientes (43%), mientras que el resto fueron operadas
con cirugía conservadora seguida de radiación adyuvante. Todas las pacientes recibieron tamoxifeno adyuvante durante cinco años y 97 de ellas (63%) fueron tratadas con quimioterapia adyuvante, consistente en Ia administración de ciclofosfamida-metotrexato-fluorouracilo (CMF) o un esquema similar pero incluyendo una antraciclina (FAC o FEC). Treinta y cuatro pacientes (22%) tuvieron una recaída a distancia, de las cuales 17 fallecieron, y no se tuvo seguimiento tras Ia recaída de 7 de ellas. De las 119 pacientes sin recaída a distancia cuatro tuvieron recaída local tratada con cirugía exitosamente.
Tabla 2. Características clínicas de las pacientes.
Se construyó un perfil genético reducido. En primer lugar se identificaron 53 genes con alta correlación entre los datos de expresión de las muestras de tejido FF y tejido FFPE. Posteriormente se seleccionaron 17 genes en función de su valor p relacionado con SLRD. Con estos 17 genes se construyó un modelo que identificaba adecuadamente un grupo de pacientes de alto riesgo de recaída a distancia. Modelos con 10, 9, 8, 7 o incluso menos genes mostraron también una buena separación entre grupos de alto y bajo riesgo de recaída a distancia. Se seleccionó el perfil de 8 genes porque fue el que obtuvo el mejor rendimiento. El perfil de 8 genes se calculó en cada muestra utilizando las medidas de expresión génica normalizadas basándose en Ia siguiente ecuación: "8-gene Score" = 0.1936*DTL + 0.2176*ECT2 + 0.0454*MTDH + 0.1329*PRC1 + 0.0556*RFC4 - 0.1913*SCUBE2 - 0.0443*STK32B - 0.1182*ZNF53. La información relativa a estos ocho genes, así como Ia de los genes de referencia, se encuentra codificada en Ia tabla 3.
Un aumento en Ia expresión de los genes DTL, ECT2, MTDH, PRC1 y RFC4 esta asociado con menor SLRD (es decir, son factores que aumentan el riesgo de recaída), mientras que un aumento en Ia expresión de SCUBE2, STK32B y ZNF533 esta asociado con mayor SLRD (es decir, son factores protectores frente a Ia recaída).
Del total de genes analizados hay ciertos genes que coexpresan con los componentes del predictor. Debido a Ia naturaleza multigénica del predictor, Ia sustitución de estos genes por genes que coexpresen con ellos con un coeficiente de correlación de Pearson r > 0,4 no alteraría Ia capacidad discriminativa del predictor. Estos genes son: AYTL2, BIRC5, CCNB1 , CCNE2, GMPS, MCM6, MELK, MYBL2, ORC6L, PGR y TGFB3 (Tabla 4).
Tabla 3. Identificación de los genes incluidos en el "8-gene Score"y genes de referencia (el asterisco indica los genes de referencia).
Tabla 4. Identificación de los genes que pueden sustituir a los que constituyen el "8-gene Score".
Con Ia intención de asignar a cada paciente a un grupo de riesgo se definió un punto de corte en 2.86. Así, pacientes con una puntuación en el perfil <2.86 fueron asignados al grupo de bajo riesgo de recaída a distancia y pacientes con una puntuación >2.86 constituyeron el grupo de alto riesgo de recaída a distancia. El valor p del estadístico "log-rank" test entre los grupos de riesgo basado en 2000 permutaciones fue 0.044. Este valor proporcionó significación estadística al punto de corte. El "8-gene Score" asigna pacientes a los grupos de bajo (60%) y alto riesgo (40%), como refleja Ia Figura 2.
La supervivencia libre de recaída a distancia a cinco años fue del 97.7% para el grupo de bajo riesgo y de 60.6% para el grupo de alto riesgo (HR: 20.4, IC 95%: 6.2 - 67.5; p<0.001 ). También se calculó Ia supervivencia global a cinco años: 98.9% para el grupo de bajo riesgo de recaída a distancia y 86.6% para el grupo de alto riesgo (HR: 7.496, IC 95%: 2.4 - 23.4; pθ.001 ).
Se llevó a cabo un subanálisis considerando el estado de los ganglios linfáticos, como muestra Ia Figura 3. En pacientes con afectación ganglionar positiva el "8-gene Score" incluía Ia mitad de pacientes en cada grupo (bajo riesgo vs alto riesgo): La SLRD a cinco años era de 93.3% vs. 39.5%. En mujeres con afectación ganglionar negativa los valores fueron 100% vs. 75.7%, respectivamente.
El análisis multivariante de Cox incluyó el "8-gene Score", el tamaño tumoral, el estado de afectación ganglionar y el grado de diferenciación del tumor. El "8- gene Score" es predictor de SLRD (Tabla 5), indicando que este perfil de expresión génica añade importante información pronostica a Ia aportada por los factores clínicos tradicionales. El estado ganglionar es el único factor clínico tradicional que mantiene significación estadística en este análisis multivariante.
Tabla 5. Análisis multivariante para el "8-gene Score" , el "70-gene Signature"y el "Recurrence Score" (Tamaño Tumoral: >2 cm vs. ≤2 cm. Estado Ganglionar:
Positivo (1-3 ganglios afectos) vs Negativo.
Se utilizó el estadístico V de Cramer para determinar Ia concordancia entre el "8-gene Score" y los otros perfiles estudiados. La correlación para el "8-gene Score" fue de 0.65 con el "70-gene Signature" y de 0.58 con el "Recurrence Score". Estos resultados indican una fuerte correlación entre el "8-gene Score", el "70-gene Signature" y el "Recurrence Score".
Para determinar Ia capacidad discriminativa de cada perfil a 5 años, se calculó el índice de concordancia de Harrell corregido para el sesgo. Los valores fueron: 0.81 para el "8-gene Score", 0.73 para el "Recurrence Score" y 0.70 para el "70-gene Signature". Estos valores indican que el "8-gene Score" es comparable a los otros dos perfiles en cuanto a capacidad discriminativa.
Se aplicó el "8-gene Score" a una base de datos del Instituto Holandés del Cáncer (NKI) que había sido previamente utilizada para comparar varios perfiles (Fan et al. N Engl J Med. 2006 Aug 10;355(6):560-9). El "8-gene Score" presentó diferencias significativas en SLRD en Ia población completa de 295 pacientes, y también en los grupos de ganglios positivos, ganglios negativos y receptores de estrógenos positivos (Tabla 6). En una comparación directa con el "70-gene Signature", el "8-gene Score" asignó más pacientes al grupo de bajo riesgo, mientras que Ia SLRD fue ligeramente menor para todos los grupos. Si el punto de corte se modificaba para incluir tantos pacientes en el grupo de bajo riesgo como hace el "70-gene Signature" los resultados eran virtualmente idénticos.
A continuación se analizó el rendimiento del "8-gene Score" en otras tres bases de datos adicionales: SWE, UPP y LOI. Se encontraron diferencias significativas en SLRD en todas ellas (Tabla 7 y Figura 4). En todos los casos el "8-gene Score" asignaba más del 55% de pacientes al grupo de bajo riesgo, con una SLRD por encima del 90% en las bases de datos LOI y SWE y por encima del 80% en Ia de UPP.
Diferencias en SLRD a diez años también fueron significativas (datos no mostrados).
Tabla 6. Comparación entre el "8-gene Score"y otros perfiles génicos utilizando las base de datos del NKI. * Proporción de pacientes incluidos en los grupos de riesgo favorable y desfavorable con cada perfil génico. ** Bajo riesgo + riesgo intermedio vs alto riesgo.
Perfil Grupo % Bajo vs Alto Riesgo * SLRD a los 5 años
"8-gene Todos Pacientes 52 vs 48 85,7 ± 2,7 vs 54,8 ± 4,3
Score" Ganglios- 53 vs 47 86,1 ± 3,9 vs 50,5 ± 6,2
Ganglios+ 52 vs 48 89,0 ± 3,7 vs 59,1 ± 6,1
RE+ 65 vs 35 88,8 ± 2,6 vs 54,2 ± 5,7
"70-Gene Todos Pacientes 39 vs 61 94,7 ± 2,1 vs 60,5 ± 3,8
Signature" Ganglios- 40 vs 60 93,4 ± 3,2 vs 56,2 ± 5,5
Ganglios+ 38 vs 62 95,2 ± 2,6 vs 66,3 ± 5,2
RE+ 50 vs 50 92,9 ± 2,4 vs 58,2 ± 4,7
"Recurrence Todos Pacientes 35 vs 65 ** 92,2 vs 58,5
Score"
"Wound Todos Pacientes 23 vs 77 92,5 vs 63,6 response"
Tabla 7. Funcionamiento del "8-gene Score" en otras bases de datos. *Los valores de SLRD son a 5 años.
Ejemplo de utilización del "8-gene Score" en tumores serosos de ovario.
Los tumores serosos de ovario suponen más del 50% de todos los tumores de ovario. Aproximadamente el 10-15% de estos tumores se clasifican como tumores proliferativos o de bajo potencial maligno (LMP, siglas de inglés "Low Malignant Potential"), considerándose el resto tumores invasivos. Se ha verificado Ia capacidad del "8-gene Score" de separar estas dos poblaciones de tumores serosos de ovarios utilizando Ia base de datos GSE12172 del National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Los datos de los microarrays fueron procesados siguiendo el protocolo descrito para las series de validación utilizadas en el desarrollo del "8-gene Score" en el Ejemplo 2. La base de datos contiene 90 muestras, de las cuales 30 son muestras LMP y 60 invasivas. Los datos clínicos no incluyen el tiempo hasta Ia recaída, por Io tanto no se pueden hacer estudios de supervivencia como se realizaron para las bases de datos utilizadas en Ia validación. Sin embargo, como se muestra en el artículo de Anglesio y cois. (Anglesio et al. Mol Cáncer Res. 2008 Nov;6(11 ): 1678-90), es posible hacer una discriminación entre los dos tipos de tumores. Aplicando el "8-gene Score" y realizando un test de Mann-Whitney, se concluye que el "8-gene Score" es capaz de diferenciar tumores serosos de ovario con bajo potencial maligno de tumores serosos de ovario del tipo invasivo en esta población (figura 5). Los resultados obtenidos muestran el potencial diagnóstico del "8-gene Score" en un tipo tumoral diferente a aquel en el que ha sido desarrollado.
Claims
1. Método para Ia subclasificación de tumores, que comprende:
a. obtención de una muestra biológica aislada que comprende células tumorales del mamífero; b. detección de Ia cantidad del producto de Ia expresión de entre dos y ocho genes seleccionados de entre los siguientes: DTL, ECT2, MTDH, PRC1 , RFC4, SCUBE2, STK32B o ZNF533, en Ia muestra obtenida en (a) y c. comparación de Ia cantidad detectada en el paso (b) con una cantidad de referencia.
2. Método según Ia reivindicación 1 donde en el paso (b) se detecta Ia cantidad del producto de Ia expresión de los genes DTL, ECT2, MTDH, PRC1 , RFC4, SCUBE2, STK32B y ZNF533.
3. Método de pronóstico de Ia evolución del tumor que comprende los pasos (a)-(c) según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, que además comprende un paso (d) donde una cantidad detectada en el paso (b) del producto de expresión de los genes DTL, ECT2, MTDH, PRC1 o RFC4 mayor que Ia cantidad de referencia con Ia que se compara en el paso (c) o una cantidad detectada en el paso (b) de los genes SCUBE2, STK32B o ZNF533 menor que Ia cantidad de referencia con Ia que se compara en el paso (c) es indicativa de una menor supervivencia libre de recaída a distancia o una menor supervivencia global.
4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el producto de expresión de los genes es el mRNA.
5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde Ia detección del mRNA se realiza mediante Ia técnica de qRT-PCR.
6. Método según cualquiera de las reivindicación 1 a 5 donde Ia muestra biológica aislada que comprende células tumorales está fijada y embebida en parafina.
7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 donde el tumor pertenece al siguiente grupo: mama, ginecológico o próstata.
8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 donde el tumor es de mama.
9. Método según Ia reivindicación 8 donde el tumor de mama es un carcinoma de mama infiltrante.
10. Método según Ia reivindicación 9 donde el carcinoma de mama infiltrante está en un estadio I o II.
11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 donde el tumor es positivo para Ia expresión de los receptores hormonales de estrógenos.
12. Método según Ia reivindicación 11 donde Ia muestra se aisla de un mamífero que ha sido sometido a una terapia hormonal y bien una mastectomía o bien una tumorectomía seguida de radioterapia.
13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 donde el tumor es de ovario.
14. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 donde el tumor de ovario es un tumor epitelial del ovario.
15. Método según Ia reivindicación 14 donde el tumor epitelial del ovario es un tumor seroso.
16. Kit adaptado para llevar a cabo el método para Ia subclasificación de tumores, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 que comprende los elementos necesarios para:
a. detección de Ia cantidad del producto de Ia expresión de entre dos y ocho genes seleccionados de entre los siguientes: DTL, ECT2, MTDH, PRC1 , RFC4, SCUBE2, STK32B o ZNF533, en Ia muestra obtenida en (a) y b. comparación de Ia cantidad detectada en el paso (b) con una cantidad de referencia.
17. Kit según Ia reivindicación 16 donde Ia detección de Ia cantidad del producto es de Ia expresión de los genes DTL, ECT2, MTDH, PRC1 , RFC4, SCUBE2, STK32B y ZNF533.
18. Kit según cualquiera de las reivindicación 16 ó 17 que además comprende las instrucciones para llevar a cabo el método para Ia subclasificación de tumores según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.
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