CN102094084B - 检测EphA2基因表达量的荧光定量PCR方法及试剂盒与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测EphA2基因表达量的荧光定量PCR方法及试剂盒与应用。该方法中提供了如下引物和探针：上游引物5’-CAGGGCAAGGAAGTGGTACTG-3’，下游引物5’-TGTAGATCGGCATGTCATTCATG-3’，探针5’-FAM-CTCGGCTGGCTCACACACCCGT-TAMRA-3’。通过该方法能准确、快速、定量地确定EphA2基因表达量。本发明所述方法和试剂盒应用在医学临床中，有利于医生针对患者的情况，制定治疗方案。

Description

检测EphA2基因表达量的荧光定量PCR方法及试剂盒与应用

技术领域

本发明涉及一种荧光定量PCR方法，特别涉及一种检测EphA2基因表达量的荧光定量PCR方法及试剂盒与应用。

背景技术

中国是个癌症高发国家，但目前对癌症的术前诊断还停留在传统的组织病理切片检查上。依靠内窥镜钳取的少量组织来进行术前病理诊断有很大的局限性，活检组织的病理报告经常模棱两可。恶性肿瘤的分子诊断由于其敏感度高、特异性强、客观性好、可重复性高，可以克服上述传统病理学的缺点，是肿瘤诊断的发展趋势。

EphA2受体是大小为130kDa的受体酪氨酸激酶，在正常生理应答过程中的细胞生长和分化，以及致瘤转化和肿瘤发展中发挥了不同的作用。研究发现，EphA2受体在膀胱癌、前列腺癌、结肠癌、宫颈癌、卵巢癌、脑胶质瘤等癌症或肿瘤中过表达。其中脑肿瘤的发病率为21/10万人，约占所有癌症的2％，脑胶质瘤发病率占60％以上，脑胶质瘤70％为恶性。已发现EphA2mRNA表达阳性率随脑星形胶质细胞瘤病理级别增高而显著增高，该表达阳性率与患者性别、年龄，以及肿瘤大小及部位无关。因此，对EphA2的表达量实时、准确、定量地检测，有利于医生及时、准确地制定治疗方案、采取医疗措施。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种检测EphA2基因表达量的荧光定量PCR方法。

本发明的另一目的在于提供实现所述检测EphA2基因表达量的荧光定量PCR方法的试剂盒。

本发明的再一目的在于提供所述试剂盒的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种检测EphA2基因表达量的荧光定量PCR方法，包含以下步骤：

(1)设计引物和探针：

上游引物F1为：5’-CAGGGCAAGGAAGTGGTACTG-3’

下游引物R1为：5’-TGTAGATCGGCATGTCATTCATG-3’

探针为：5’-FAM-CTCGGCTGGCTCACACACCCGT-TAMRA-3’；

其中FAM为羧基荧光素，是标记在5’端荧光基团；TAMRA为荧光染料，标记在3’端，荧光淬灭报告基团的同时，TAMRA自身会在更高波长处发射荧光；

(2)进行逆转录反应：抽提样本的RNA，进行逆转录反应，得到cDNA；

(3)进行荧光定量PCR反应：

以步骤(2)得到的cDNA为模板，加入步骤(1)中所述的引物，进行荧光定量PCR反应，每个浓度设置至少3个平行；其中，设置阳性对照组、空白对照组和阴性对照组；阳性对照组的模板为含有如下序列的重组质粒，空白对照的模板为水，阴性对照组的模板为正常人血液中的cDNA；

CAGGGCAAGGAAGTGGTACTGCTGGACTTTGCTGCAGCTGGAGGGGAGCTCGGCTGGCTCACACACCCGTATGGCAAAGGGTGGGACCTGATGCAGAACATCATGAATGACATGCCGATCTACA；

反应条件为93℃2min；94℃45sec，55℃60sec，40个循环；

(4)结果的处理：反应结束后计算机自动绘制标准曲线，根据阳性对照的拷贝数，得到EphA2基因的表达拷贝数。

步骤(2)中所述的逆转录反应优选以下游引物R1为逆转录引物；

步骤(2)中所述的逆转录反应的反应体系组成优选如下：

逆转录反应缓冲液                    4μl

下游引物R1(10p mol/μl)             0.5μl

逆转录酶(200U/μl)                  1μl

dNTPs(10mmol/l)                     0.5μl

DEPC处理水                          9μl

RNA模板                             5μl

总体积                              20μl；

步骤(2)中所述的逆转录反应的反应条件优选为37℃水浴60min，95℃3分钟；

步骤(3)中所述重组质粒优选通过如下方法构建得到：抽提人脑星形胶质瘤细胞系的RNA，进行逆转录反应，得到cDNA；以该cDNA为模板，引物为步骤(1)中所述的上游引物F1和下游引物R1，进行PCR反应，得到核苷酸序列如下所示的PCR产物，将PCR产物与TA克隆载体连接，得到所述重组质粒；

CAGGGCAAGGAAGTGGTACTGCTGGACTTTGCTGCAGCTGGAGGGGAGCTCGGCTGGCTCACACACCCGTATGGCAAAGGGTGGGACCTGATGCAGAACATCATGAATGACATGCCGATCTACA；

实现上述检测EphA2基因表达量的荧光定量PCR方法的试剂盒，包含阳性对照、阴性对照、上游引物、下游引物、荧光探针、Taq酶和荧光定量反应缓冲液，其中：阳性对照为含有如SEQ ID：NO.4所示序列的重组质粒；阴性对照为健康人血液的cDNA；上游引物如SEQ ID：NO.1所示；下游引物如SEQ ID：NO.2所示；荧光探针如SEQ ID：NO.3所示。

所述的试剂盒还包含逆转录酶、逆转录反应缓冲液；

所述的试剂盒还包含RNA抽提试剂，包括TRIzol等；

所述的试剂盒还包括DEPC处理水、无菌水。

所述的试剂盒应用于EphA2基因的定量检测，应用于医学领域。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：本发明中的上下游引物和探针是通过优化得到的，利用该引物和探针进行荧光定量PCR反应的准确度高，重复性好。

附图说明

图1是重组质粒进行荧光定量PCR得到的标准曲线图。

图2是重组质量的不同拷贝数的荧光定量PCR曲线图：

荧光曲线从左到右依次代表的cDNA浓度为10⁵、10⁴、10³、10²、10¹、1个copies/ml。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

(1)设计引物：

以Genebank中基因序列号为NM 004431的EphA2的编码序列为参照，设计如下引物和探针：

上游引物F1为：5’-CAGGGCAAGGAAGTGGTACTG-3’

下游引物R1为：5’-TGTAGATCGGCATGTCATTCATG-3’

探针为：5’-FAM-CTCGGCTGGCTCACACACCCGT-TAMRA-3’；

其中FAM为羧基荧光素，是标记在5’端荧光基团；TAMRA为荧光染料，标记在3’端，荧光淬灭报告基团的同时，TAMRA自身会在更高波长处发射荧光；

上述序列和探针由广州英俊公司合成。

(2)构建作为阳性对照的重组质粒

按照说明书，使用TRIzol(Invitrogen公司)抽提人脑星形胶质瘤细胞系U251(购自中国科学院上海细胞生物学研究所)的总RNA，接着进行逆转录反应，逆转录反应的体系和反应条件如下：

反应体系：

逆转录反应缓冲液(5×，Promega)            4μl

下游引物R1(10pmol/μl)                    0.5μl

MMLV酶(Promega公司)                       1μl

dNTPs(10mmol/l)                           0.5μl

DEPC处理水                                9μl

RNA模板                                   5μl

总体积                                    20μl

反应条件为：37℃水浴60分钟，95℃3分钟。

将逆转录反应得到的cDNA进行常规PCR反应，PCR反应体系和反应条件如下所示：

Ex Taq酶(5U/μl，Takara)                  0.5μl

10*Ex Taq buffer(Mg²⁺plus)                10μl

dNTP Mixture(各2.5mM)                     4μl

cDNA                                      5μl

上游引物F1(10pmol/μl)                    4μl

下游引物R1(10pmol/μl)                    4μl

双蒸水                                    补充至100μl；

反应条件为93℃→2分钟预变性，然后按93℃30秒→55℃45秒，72℃45秒共做40个循环，72℃5分钟。

进行琼脂糖凝胶电泳，用DNA胶回收试剂盒(Takara公司)对PCR产物进行纯化。按照说明书操作，将纯化后的PCR产物与PMD19-T载体(Takara公司)连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(Takara公司)，筛选阳性克隆，送去广州英俊公司测序，得到的重组质粒含有如下序列：

CAGGGCAAGGAAGTGGTACTGCTGGACTTTGCTGCAGCTGGAGGGGAGCTCGGCTGGCTCACACACCCGTATGGCAAAGGGTGGGACCTGATGCAGAACATCATGAATGACATGCCGATCTACA。

(3)定量标准曲线的确立

将步骤(2)构建好的重组质粒测定稀释后，测定吸光度A值，计算拷贝数/ml，10倍倍比稀释成10⁹-10¹copies/ml浓度梯度，在如下反应条件下每个浓度平行加入3个反应管同时进行荧光定量扩增，共做4次。反应结束后计算机自动绘制标准曲线。应用7500System SDS Software软件上分析结果，得到标准曲线：Y＝-3.39X+42.47，R：＝0.993(如图1所示)，起始模板在10⁷～10³copies/ml时线性较好。

荧光定量PCR反应体系：

Premix Ex Taq^TM(2×，Takara)                12.5μl

上游引物(10p mol/μl)                       0.5μl

下游引物(10p mol/μl)                       0.5μl

荧光探针(5p mol/μl)                        0.5μl

模板cDNA                                    5μl

灭菌蒸馏水补充至                            25μl；

93℃→2分钟预变性，然后按93℃45秒→55℃60秒，共做40个循环。

(4)敏感度实验

取重组质粒按比例稀释为10⁵、10⁴、10³、10²、10、1个拷贝/ml，进行荧光定量PCR，以检测为阳性的最低浓度为该方法的检测灵敏度。结果如图2所示，所得到的图呈现规律的C(t)值变化，说明仪器参数稳定，最低检测下线达到10copies/ml。

(5)阴性对照的制备

使用全血RNA抽提试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)抽提取正常人的外周血中的RNA，进行逆转录反应，得到cDNA，为阴性对照：

逆转录反应体系如下：

逆转录反应缓冲液(5×，Promega)            10μl

下游引物R1(10pmol/μl)1.25μl

MMLV酶(Promega公司)                       2.5μl

dNTPs(10mmol/l)                           1.25μl

RNA模板                                   12μl

DEPC处理水                                补至50μl；

反应条件为：37℃水浴60分钟，95℃3分钟。

检测该cDNA的完整性，检测的管家基因为GAPDH(引物购自TAKARA公司)，PCR产物电泳结果表明，该cDNA完整，可用作阴性对照。

(6)样本检测

取确诊患有脑癌的患者外周血抽提RNA，进行逆转录反应，逆转录反应的体系和条件同步骤(5)。

进行荧光定量PCR反应(反应条件和体系同步骤(3))，设置6个梯度，每个梯度4个平行；以步骤(2)构建得到的重组质粒为阳性对照、步骤(5)得到的cDNA为阴性对照、水为空白对照；阳性对照重组质粒按比例稀释为10⁵、10⁴、10³、10²、10、1个拷贝/ml。结果显示脑癌患者的EphA2表达量是阴性对照的103倍。

连续5天重复实验，实验结果表明该方法稳定，重复性好。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种检测EphA2基因表达量的荧光定量PCR试剂盒，包含阳性对照、阴性对照、上游引物、下游引物、荧光探针、Taq酶和荧光定量反应缓冲液，其中：阳性对照为含有如SEQ ID: NO.4所示序列的重组质粒；阴性对照为健康人血液的cDNA；上游引物序列如SEQ ID: NO.1所示；下游引物序列如SEQ ID: NO.2所示；荧光探针序列如SEQ ID: NO.3所示。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包含逆转录酶、逆转录反应缓冲液。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包含RNA抽提试剂。

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