ES2299748T3 - Peptido inmunogenico de ptpkr. - Google Patents
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Abstract
El péptido inmunogénico PTPRK Gly677-->Arg de la SEQ ID N. 1.
Description
Péptido inmunogénico de PTPKR.
La presente invención se refiere a péptidos
inmunogénicos aislados de la proteína PTPRK (Proteína Tirosina
Fosfatasa Kappa de tipo receptor) y su uso en la diagnosis y
prevención de tratamiento terapéutico de tumores. Más
específicamente, la invención proporciona un epítope restringido de
Clase II de HLA novedosa reconocida por las células CD4+ T y su uso
en la diagnosis, prevención o terapia inmune d los pacientes con
melanoma que expresa PTPRK.
La identificación de los antígenos asociados a
tumores que permiten inducir una respuesta de células T
antitumorales específicas ha proporcionado un nuevo planteamiento
inmunológico para el tratamiento de los tumores. La gran mayoría de
antígenos asociados a tumores que hasta ahora se han definido hasta
ahora se reconocen se reconocen por los linfocitos T citotóxicos
restringidos a la Clase I de HLA (CTL), a pesar del papel crucial
jugado por las células CD+4 que reconocen los antígenos de la Clase
I de HLA para la regeneración y mantenimiento de de una respuesta
inmune eficaz en la infección viral así como en cáncer. La carencia
de epítopes específicos de tumores que permiten evocar una
respuesta auxiliar mediada por las células T y la propia naturaleza
de la mayoría de los antígenos asociados a tumores restringidos de
la Clase I de HLA constituyen los factores principales que limitan
la eficacia terapéutica de los ensayos de vacunación en pacientes de
cáncer. Por lo tanto, la caracterización de los antígenos
específicos de tumor restringidos de la clase II de MHC parece de
principal importancia con el fin de proporcionar vacunas nuevas y
más eficaces basadas en péptidos. Los mecanismos la ruta de
procesamiento/presentación del antígeno de MHC de Clase II parecen
bastante complejos y no completamente entendidos. Las dificultades
técnicas han complicado el descubrimiento de los antígenos de tumor
restringidos a HLA de clase II, limitando de esta manera la
disponibilidad de los epítopes auxiliares específicos de tumores
conocidos para el melanoma, la mayoría inmunogénicas entre los
tumores humanos.
La PTPRK pertenece a la familia de las moléculas
de PTP que se extienden sobre la membrana de plasma de tipo
receptor, y se caracteriza por la presencia en su parte extracelular
de las repeticiones de tipo III de fibronectina, dominios de
inmunoglobulina y meprina/A5/\mu (MAM) (30, 31). La PTPRK se
expresa en los tejidos normales tales como bazo, próstata, ovario,
las líneas celulares epidérmicas de queratinocitos pero no en PBL y
las líneas celulares hematológicas (24). Aunque todavía no está
claro el papel fisiológico preciso de la PTPRK, sus características
estructurales y la capacidad de mediar la interacción homofíica
entre las células conjuntamente con la observación de que la
expresión de la PTPRK está inducida por la densidad celular
fuertemente sugieren un papel crucial de esta proteína en la
regulación de la formación de contacto célula-célula
(30). Además, se ha demostrado recientemente que en los seres
humanos la PTPRK se localiza conjuntamente y se asocia con la
\beta- y \gamma-catenina en el área de contacto
célula-célula de las células adyacentes (25). Estos
hallazgos apoyan fuertemente la implicación de esta proteína en la
regulación de manera negativa de la acción de los episodios
inducidos por la tirosina quinasa en las uniones celulares,
posiblemente mediante la desfosforilación de la \beta- y
\gamma-catenina. Estos papeles funcionales, y el
hallazgo de que el gen de la PTPRK humana se ha mapeado con la
región del gen supresor de tumor supuesto
6q22.2-q22.3 (31, 32), que está suprimida
frecuentemente en los melanomas (33, 34), en conjunto apoyan la
hipótesis de que la pérdida de expresión así como las mutaciones
que se producen en los dominios funcionales de la proteína PTPRK,
podría directamente afectar al crecimiento
fenotipo de las células de crecimiento normales y juegan un papel en la transformación y progresión de tumores.
fenotipo de las células de crecimiento normales y juegan un papel en la transformación y progresión de tumores.
Con el deseo de identificar los antígenos de
melanoma de la clase II de HLA, los inventores estudiaron la
respuesta antitumoral de CD+4 en un paciente con melanoma que
experimentó una prognosis favorable que no es enfermedad 9 años
después de la resección quirúrgica de una metástasis de de ganglios
linfáticos. Esta evolución clínica positiva se asoció a una
respuesta fuerte y persistente mediada por CD8. Esta evolución
clínica positiva se asoció a una respuesta antitumoral mediada por
CD8 dirigida contra el antígeno de diferenciación gp100 y
TRP-2. Ya que las células CD4 T se sabe que son
esenciales para la generación y mantenimiento de las células CD8 T,
los inventores investigaron la posibilidad de que el paciente haya
desarrollado también una respuesta mediada por CD4 específica de
tumores.
Los linfocitos T obtenidos a partir de ganglios
linfáticos infiltrados en tumores se estimularon de manera
repetitiva in vitro con los tumores autólogos y se generaron
células T mediante dilución limitante. Se obtuvieron clones de
células CD4+ T que reconocían el tumor autólogo de una manera
restringida de HLA-DR, caracterizados in
vitro por su buena especificidad y se usó como sonda celular en
un planteamiento genético que pretende la definición de la
naturaleza molecular del antígeno reconocido. La selección de una
genoteca de expresión de ADNc construida usando como molde el ARN
de melanoma autólogo condujo a la identificación del gen K del
receptor de las tirosina fosfato
(R-PTP-K) ya que codifican el
antígeno reconocido por los clones específicos de melanoma CD4+. El
ARNm de R-PTP-K clonado por las
células de melanoma contiene una mutación Gly \rightarrow Arg no
conservadora en el cuarto dominio de tipo III de fibronectina de la
proteína. Este cambio de aminoácidos genera un epítope de células T
presentado por HLAD-DR\beta1*1001 que se reconoce
por el clon de células CD4 T usados para seleccionar la genoteca
del ADNc de tumor y mediante los 5 clones diferentes aislados de
los ganglios linfáticos infiltrados de tumor del mismo paciente. El
epítope antigénico se identificó en la región
667-682 de PTPRK_{Gly671 \rightarrow Arg} y tiene
la secuencia PYYFAAELPPRNLPEP (SEQ ID N. 1).
Un primer aspecto de la invención se refiere al
péptido inmunogénico de la SEQ ID N. 1 y su uso en la generación de
anticuerpos y/o células auxiliares T o citotóxicas, más generalmente
en la inducción de una respuesta inmune específica de tumor, para
aplicaciones de diagnóstico o terapéuticas, en particular para la
diagnosis, prevención o terapia inmune de tumores que expresan
PTPRK_{Gly677 \rightarrow Arg}.
El péptido de la invención se puede preparar
siguiendo diferentes procedimientos. Por ejemplo, se puede
sintetizar en solución o fase sólida de acuerdo con técnicas
convencionales, o usando un sintetizador automático. La teoría y
práctica de la síntesis de péptidos son bien conocidas por los
expertos en la técnica, véase por ejemplo Stewart y Young (1984)
Solid Phase Peptide Synthesis, 2ª ed., Pierce Chemical Co.; Tam
et al., J. Am. Chem. Soc., (1983) 105: 6442; Merrifield, The
Peptides, Gross y Meinenhofer eds. Academic Press (1979) Nueva York,
p. 1-284, que se incorpora en el presente documento
por referencia.
Para uso en terapia, el péptido se formulará de
manera adecuada conjuntamente con los excipientes farmacéuticamente
aceptables. Las formulaciones adecuadas para el tratamiento
preventivo o terapéutico se puede administrar por vía oral o
parenteral, preferiblemente por vía subcutánea o intramuscular, y
contendrán una cantidad eficaz del péptido. Dicha cantidad debe ser
capaz de provocar una respuesta inmune humoral o mediada por células
dirigida contra el tumor y variará dependiendo de las condiciones
generales del paciente, la progresión de la enfermedad y otros
factores.
Preferiblemente, el péptido de la invención se
administra en la forma de una vacuna o bien para tratamiento
preventivo de individuos susceptible de melanoma o para el
tratamiento terapéutico de pacientes de melanoma. La vacuna se
puede administrar de acuerdo con un esquema de dosificación
individual o múltiple, a dosis adecuadas y a intervalos de tiempo
diferentes de manera que se mantenga o se potencie la respuesta
inmune. La inmunogenicidad del péptido se puede incrementar
mediante reticulación o acoplamiento con vehículos inmunogénicos, o
mediante el uso de adyuvantes adecuados. Además, el péptido se
puede conjugar con lípidos, restos de glicósidos u otros péptidos
con el fin de incrementar la biodisponibilidad o la afinidad a las
moléculas de HLA.
En una realización adicional, la invención
proporciona anticuerpos policlonales o monoclonales, fragmentos o
derivados de los mismos tales como Fab, Fv o scFv, que permiten
reconocer y unirse a la SEQ ID N. 1 del péptido. Los anticuerpos
aislados se pueden usar en terapia inmune de tumores o en técnicas
de diagnóstico inmune para la definición de tumores que expresan
PTPRK_{Gly677 \rightarrow Arg}.
En todavía otra realización, la invención
proporciona células CD4+ T que reconocen específicamente un tumor
que expresa PTPRK_{Gly677 \rightarrow Arg} y su uso para inducir
una respuesta mediada por células contra tal tumor. Las células se
pueden usar a partir de PBMC obtenidas del paciente a ser sometido
al tratamiento, y se pueden activar in vitro con la SEQ ID
N. 1 del péptido, opcionalmente en la presencia de citoquinas, o
usando las células que llevan el péptido en asociación con las
moléculas de Clase A de HLA , tal como APC (células que presentan
antígeno) que expresan el alelo HLA-DR \beta1*1001
cargado con el péptido, las APC se pueden modificar genéticamente,
por ejemplo, mediante transfección con un vector viral o retroviral,
de manera que exprese el alelo específico HLA o el péptido o un
precursor del mismo. Se pueden usar células HLA modificadas para
activar las células T o bien in vitro o in vivo. Las
células T activadas in vitro se pueden volver a introducir
posteriormente en el paciente para prevenir la aparición, para
detener el crecimiento o para reducir la cantidad de células
tumorales. Antes de que se vuelvan a introducir en el paciente, los
linfocitos se pueden purificar, por ejemplo mediante una columna de
afinidad usando un anticuerpo dirigido contra CD4 u otros
marcadores.
En una realización adicional la invención
proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica el
epítope de PTPRK_{Gly677 \rightarrow Arg} descrito en el presente
documento, preferiblemente la secuencia
CCGTATTACTTTGCTG
CAGAACTCCCCCCGAGAAACCTACCTGAGCCT (SEQ ID N. 2) así como un vector y una célula huésped que incluye dicha secuencia. Las moléculas de ADN que contienen la secuencia que codifica el péptido, o una parte del mismo, y sus construcciones génicas se pueden usar en la vacunación de sujetos con riesgo de desarrollar tumores, particularmente melanoma, o pacientes de cáncer. La inmunización de y se puede llevar a cabo de acuerdo con técnicas conocidas (Donnelly J.J. et al., 1994, The Immunologist 2:1). Se prefiere la vía de administración intramuscular, pero también se pueden usar las vías parenteral y mucosal (pnas 1986, 83, 9551; documento WO90/11092). Además, se puede adsorber el y en partículas de oro para la administración por vía subcutánea con un aparato biolístico (Johnston, 1992 Nature, 356, 152).
CAGAACTCCCCCCGAGAAACCTACCTGAGCCT (SEQ ID N. 2) así como un vector y una célula huésped que incluye dicha secuencia. Las moléculas de ADN que contienen la secuencia que codifica el péptido, o una parte del mismo, y sus construcciones génicas se pueden usar en la vacunación de sujetos con riesgo de desarrollar tumores, particularmente melanoma, o pacientes de cáncer. La inmunización de y se puede llevar a cabo de acuerdo con técnicas conocidas (Donnelly J.J. et al., 1994, The Immunologist 2:1). Se prefiere la vía de administración intramuscular, pero también se pueden usar las vías parenteral y mucosal (pnas 1986, 83, 9551; documento WO90/11092). Además, se puede adsorber el y en partículas de oro para la administración por vía subcutánea con un aparato biolístico (Johnston, 1992 Nature, 356, 152).
Además de los usos terapéuticos descritos
anteriormente, moléculas de ácido nucleico que contienen la
secuencia que codifica el péptido, o una parte del mismo, así como
el propio péptido, se puede usar en la diagnosis de melanoma que
expresa PTPRK_{Gly677 \rightarrow Arg} por ejemplo mediante
análisis de PCR o inmunoensayos que usan anticuerpos específicos de
epítopes. Además, los complejos entre la SEQ ID N. 1 del péptido y
células HLA-DR \beta1*1001 se pueden usar para
controlar la respuesta inmune in vitro o ex vivo de
los sujetos vacunados con el péptido.
\newpage
Figura
1
TB515. (A) Sensibilidad de células Me15392 y
LCL15392 marcadas con 51Cr a la lisis por clon TB515: se midió la
liberación de 51Crdespués de 5 horas. El ensayo se realizó en la
ausencia (\blacksquare) o en la presencia (\ding{116}) del
anti-HLA-DR Ab, L243. (B) Ensayo de
liberación de citoquinas. Se incubó el clon TB515 durante toda una
noche con tumor autólogo o 15392LCL a una relación de células 1:1 en
presencia o ausencia del L243. Se recogió el sobrenadante, y el
contenido de INF-\gamma, GM-CSF,
TNF-\alpha e IL-2 se evaluó
mediante ensayo ELISA comercialmente disponible.
D. E. \leq 5%.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
2
El ADN complementario del clon nº 11 codifica
el antígeno que reconoce TB515. (A) CIITA+293 se transfectaron
con ADNc nº 11 en pEAK8.5-Ii solas o conjuntamente
con pcDNA3.1-DRB1*0102 o
pcDNA3.1-DRB1*1001, respectivamente. CIITA+293 se
transfectó de manera individual con
pcDNA3.1-DRB1*0102 o
pcDNA3-DRB1*1001, y CIITA+293
co-transfectado con pcDNA3 recombinante que
codifica proteína fluorescente (GFP) y
pcDNA3.1-DRB1*1001 se usaron como control negativo.
(B) ADNc nº 11 se subclonó en pcDNA3.1 y se cotransfectó con
pcDNA3.1-DRB1*1001 en CIITA+293. El clon TB515 (1 x
10^{5} linfocitos/pocillo) se añadió a cada transfectante y
después de 24 horas, se recogieron los sobrenadante y el contenido
de IFN-\gamma se evaluó mediante ELISA. En ambos
paneles, Me15392 se usó como control positivo. Se evaluaron todos
los transfectantes para determinar la capacidad de inducir la
liberación de IFN-\gamma por TB515.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
3
(A) Expresión de ARNm de PTPRK en células
Me15392. Se analizaron 10 \mug de poly(A)+ARNm obtenido
de Me15392 mediante transferencia de Northern. La hibridación se
realizó usando una mezcla equimolar de las sondas marcadas con
^{32}P que se extienden sobre las regiones extracelulares la
transmembrana e intracelulares del ADNc de PTPRK (Véase, materiales
y Procedimientos para detalles). Las franjas se cargaron con una
cantidad comparable del ARNm como se comprueba por la hibridación
del gen doméstico de la \beta-actina (datos no
mostrados). Muestras: Me15392, ARNm obtenido de células de melanoma
15392; PBL, combinación de ARNm a partir de 4 donantes sanos; A431,
ARNm de línea celular de tumores epidérmicos.
(B) Análisis de RT-PCR de
perfil de expresión de ARNm de PTPRK. La region que se extiende
sobre el dominio de fosfatasa intracellular se amplificó por los
cebadores F3/Rdthat generan una banda de amplificación específica
de 650 pares de bases. Las condiciones de reacción se establecieron
dentro del intervalo lineal de la amplificación de ADN. La cantidad
de molde se ajustó con el fin de obtener niveles comparables de
\beta-actina, permitiendo de esta manera la
comparación directa de PTPRK amplificado entre las muestras
examinadas. Como un ejemplo representativo, la evaluación de la
expresión de PTPRK mediante análisis de RT-PCR se
reseña para 5 de 10 líneas de células de melanoma examinadas: 4
líneas celulares de melanoma metastásicas (Me15392, Me335, Me337 y
Me349) y una primaria (Me366). También se incluye una combinación de
PBL de 4 donantes sanos (PBL), y melanocitos normales (FM2093).
La imagen es representativa de 3 experimentos
independientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
4
Caracterización de ADNc nº 11. ADNc nº 11
y los minigenes relacionados se representan por recuadros alineados
con una estructura esquemática de la proteína PTPRK. Los cuadros en
negro en cada minigen indica la posición de un codón ATG en fase
con el ATG de partida del gen de longitud completa (GenBank
NM__002844). Se indica el nucleótido mutado (g \rightarrow a) que
aparece en la posición 2249. Se sintetizaron minigenes mediante la
amplificación por la PCR del ADNc nº 11 usando un cebador directo
idéntico (F2) acoplado son diferentes cebadores encajados que se
mapean cadena debajo de la mutación (los cebadores inversos EPR1,
EPR2, EPR2WT, y EPR3, indicados por flechas). Se clonaron minigenes
en el vector de expresión pcDNA3/TOPO y después se cotrasfectaron
con pcDNA3-DRB1*1001 o
pcDNA3-DRB1*0102 en células CIITA+-293. Se añadió el
clon TB515 (1 x 10^{5} células/pocillo) a cada transfectante, y
después de 24 h se evaluaron los sobrenadantes para el contenido de
IFN-\gamma por ELISA. En la Tabla: +,
reconocimiento positivo TB515; -, no reconocimiento por TB515. El
gen minigen EP2wt contenía el nucleótido (g) no mutado. La secuencia
de aminoácidos en la parte inferior de la figura se dedujo de la
secuenciación de ADNc nº 11. Abreviaturas en la figura: LS,
secuencia guía; MAM, motivo meprina/A5/R-PTPP; Ig,
dominio de tipo inmunoglobulina; FNIII, fibronectina de tipo III;
TM, transmembrana; PTP, dominio proteína-tirosina
fosfatasa; R, arginina que se deriva de la mutación del nucleótido g
\rightarrow a.
Figura
5
Identificación del epítope TB515. Células
LCL15392 (A, B, C) (5,0 x 10^{3} células/pocillo) se pulsaron
durante 2 h a 37ºC con los péptidos sintéticos a diferentes
concentraciones se usaron para estimular los linfocitos TB515 T. Se
añadió TB515 (5 x 10^{3} células/pocillo), y después de 18 h se
recogió el medio e IFN-\gamma se midió mediante
ELISA. Se obtuvieron resultados idénticos usando LCL3700, que
comparten solamente el DRB*1001 con pt15392 (no mostrado). (D) 5 x
10^{3} de células LCL15392 se incubaron con diversas
concentraciones de los péptidos competidores durante 15 minutos.
Los péptido competidores incluían: PYGFAAELPPRNLPEP, modificado en
la posición 3, el PYYFAAELPPGNLPEP de tipo salvaje, y el péptido de
unión a HLA-A3 ILRGSVAHK se usó como control
negativo. El péptido PYYFAAELPPRNLPEP se añadió después a 100 nM.
Después der 1 hr de incubación adicional a 37ºC, se añadió TB515 (5
x 10^{3} células/pocillo), y después de 18 h se recogió medio y se
midió IFN-\gamma mediante ELISA. Se utilizaron
resultados idénticos usando LCL3700 que comparte solamente DRB*1001
con pt15392. El aminoácido mutado se escribe en letra negrita; los
aminoácidos sustituidos están subrayados.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
6
Especificidad de péptido del clon TB48 de
linfocitos T. Células LCL15392 (5,0 x 10^{3} células/pocillo)
se pulsaron durante 2 h a 37ºC con los péptidos sintéticos en
diferentes concentraciones se usaron para estimular TB48. Se añadió
el clon TB48 (5 x 10^{3} células/pocillo), y después de 18 h se
recogió el medio y se midió IFN-\gamma mediante
ELISA. Se obtuvieron resultados idénticos usando LCL3700, que
comparte solamente DRB*1001 con pt15392.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
7
Inmunidad específica de PTPRK en PBMCs de pt
15392. PBMC de pt15392, que se obtienen durante el período sin
enfermedad 12 meses después de cirugía, se estimularon in
vitro con el péptido PYYFAAELPPRNLPEP mutado. Al final de la
tercera semana de cultivo, las líneas de células T generadas se
evaluaron mediante el ensayo de ELISPOT para determinar la
capacidad de liberar IFN-\gamma en respuesta a la
estimulación de péptido o tumor autólogo, en la presencia o
ausencia de anti-HLADR Ab L243. Se incubaron células
T con (1) medio, (2) LCL15392, (3) LCL15392 se pulsaron con 4
\mug de PYYFAAELPPRNLPEP, (4) LCL15392 se pulsaron con 4 \mug
de PYYFAAELPPRNLPEP y se incubaron con 10 \mug/ml de
anti-HLA-DR L243 Ab, (5) LCL15392 se
pulsaron con 2 \mug de PYYFAAELPPRNLPEP, (6) LCL 15392 se
pulsaron con 2 \mug de PYYFAAELPPRNLPEP y se incubaron con 10
\mug/ml de anti-HLA DR Ab L243, (7) LCL15392 se
pulsaron con 4 \mug de péptido PYYFAAELPPGNLPEP de tipo salvaje,
(8) Me15392 autólogo, (9) Me15392 autólogo se incubaron con
anti-HLA DR Ab L243.
Abreviaturas: pt15392, paciente 15392;
LN, ganglio linfático, gp100, glicoproteína 100;
TRP-2, proteína relacionada con tirosinasa 2;
PTPRK, proteína tirosina fosfatasa kappa de tipo receptor;
RT-PCR, reacción en cadena de la polimerasa de
transcripción inverse; CIITA, Transactivador de Clase II; Ii, cadena
invariable; GFP, proteína fluorescente verde; LCL, línea de células
B transformadas por EBV linfoblastoides, MTS, señal de transporte
de melanosomas; MAM, motivo de meprina/AS/PTPR\mu; E, célula
efectora; T, célula diana; TCR, receptor de células T.
\vskip1.000000\baselineskip
Líneas celulares. Ya se ha descrito el
curso clínico del paciente (pt) 15392 (HLA-A*0301,
B*40012, B*1402, C*0602, C*8002, DRB1*0102, DRB1*1001), y la
estabilización in vitro de la línea celular de melanoma
Me15392 (16). Mediante análisis de la superficie celular se mostró
que las células Me15392 eran positivas para HLA de Clase I y para
expresar de manera constitutiva HLA de la clase II de DR, DP, pero
no DQ. LCL15392 y LCL3700 son líneas de células B transformadas por
EBV obtenidas a partir de células mononucleares de la sangre
periférica (PBMCs) de pt15392 y de un donante sano,
respectivamente. LCL3700 comparte con pt15392 el DRB1*1001
solamente. Células 293-EBNA (wt293) (Invitrogen, CA
9200, USA) y Class II de las células Transactivator+
293-EBNA (CIITA+293) se mantenían en medio DMEM
(Euroclone, Europe, TQ4 5ND Devon, Reino Unido) con 10% de FCS.
Células CIITA+293 se obtuvieron mediante la transducción de células
wt293 con el vector retroviral que codifica CIITA. Se
inmunoseleccionaros células CIITA+293 usando L243, un mAb
específico para los alelos HLA-DR.
Generación de clones de células T específicas
de tumor. Los linfocitos T que infiltran tumores (TIL), se
recogieron a partir de una lesión metastásica de ganglio linfático
que se retira de manera quirúrgica de pt15392 en 1991, se aislaron
mediante centrifugación en gradiente de densidad, se estimularon las
células T dos veces in vitro con células de tumor autólogo
irradiadas en medio RPMI suplementado con 300 IU/ml de la
IL-2 recombinante humana (EuroCetus, Amsterdam,
Holanda) y 10% de suero AB humano combinado. Después de 3 semanas de
cultivo in vitro, se clonaron células T mediante dilución
limitante y se seleccionaron los clones para crecimiento el día 15.
La especificidad del crecimiento de los clones de las células T y
los clones seleccionados para el crecimiento el día 15. La
especificidad del crecimiento de las células T se analizó en un
ensayo de liberación de ^{51}Cr; 140 clones independientes
mostraron una actividad lítica mediada por TCR contra el tumor
autólogo. 40 clones mostraron un reconocimiento restringido de
HLA-DR del tumor autólogo y se seleccionaron para
análisis posterior. Para confirmar la clonación y clasificar los
clones con especificidad de TDR idéntica, el repertorio de TCR de
cada clon se examinó mediante (RT) PCR de transcripción
inversa, usando un panel de cebadores específicos de TCR AV y TCRBV como se ha descrito previamente (17).
inversa, usando un panel de cebadores específicos de TCR AV y TCRBV como se ha descrito previamente (17).
Ensayo de liberación de citoquinas. Se
sembraron linfocitos (5 x10^{3} en 50 \mul) en placas de fondo
en U de 96 pocillos con 10^{4}/pocillo de células de melanoma o
con 5 x10^{3} de LCL autólogo que se pulsó durante 2 h a 37ºC con
diferentes dosis de péptidos, en un volumen final de 0,2 ml de RPMI
1640 suplementado con 10% de suero humano combinado (PHS). Después
de incubación durante toda una noche a 37ºC, se recogieron los
sobrenadantes y el contenido de citoquina se evaluó mediante ELISA
(Endogen, Woburn, MA 01801, Estados Unidos).
Ensayo citotóxico. La sensibilidad de
células diana a la lisis se evaluó mediante un ensayo de citotóxico
de liberación de ^{51}Cr a diferente efector: relación diana (E:T,
el ensayo de liberación de ^{51}C se realizó como se ha indicado
previamente (16).
Clonación de HLA-DRB1*0102 y
DRB1*1001. Clones de ADNc que codifican cadenas
HLA-DRB1*0102 y DRB1*1001 de pt15392 se obtuvieron
mediante RT-PCR que parte de poly(A)+ ARN
preparado a partir de 15392LCL. La amplificación se realizó usando
cebadores específicos para las regiones en 5' y 3' de DR\beta1
(directo
5'-CGCG
GATCCAGCATGGTGTGTCTG-3'; inverso 5'-GGAATTCCTCAGCTCAGGAATCCTGTT-3'), y se clonaron los productos de PCR en el vector pcDNA3.1/V5-His TOPO vector (Invitrogen).
GATCCAGCATGGTGTGTCTG-3'; inverso 5'-GGAATTCCTCAGCTCAGGAATCCTGTT-3'), y se clonaron los productos de PCR en el vector pcDNA3.1/V5-His TOPO vector (Invitrogen).
Construcción y selección de la genoteca de
ADNc derivado de tumor. Poly(A)+ ARN aislado de células
Me15392 usando el kit FASTRACK (Invitrogen) se convirtió en ADNc
con el sistema Superscript Choise (Life Technologies) usando un
cebador oligo(dT)
[5'-pGACTAGTTCTAGATCGCGAGCGGCCGCCC(T)_{15}-3']
que contenía un sitio XbaI (subrayado). El ADNc se ligó a los
adaptadores EcoRI-BstxI (Stratagene), digeridos con
XbaI, y se insertaron en los sitios XbaI y BstxI del poliengarce
localizado en el extremo 3' de la inserción de ADNc de cadena
invariable (Ii, aminoácidos 1-80), en el vector de
expresión pEAK8.5/Ii, creando de esta manera una genoteca de ADNc
de fusión derivado de Ii/tumor. Células de E. Coli DH5a se
transformaron mediante electroporación con los plásmidos
recombinantes y se seleccionaron con ampicilina (0,1 g/litro). La
genoteca se dividió en 1400 combinaciones de aproximadamente 100
clones de ADNc recombinante cada uno; las combinaciones se
desarrollaron durante toda una noche en medio LB más ampicilina
(0,1 g/litro), y ADN de plásmido se extrajo usando el kit del
plásmido QIAprep 96 (Qiagen).
Se sembraron células CIITA+293 en placas de 96
micropocillos de fondo plano (5 x10^{4} células/pocillo) se
cotransfectaron con 150 ng de una combinación de la genoteca de ADNc
y 150 ng del plásmido que contenía o bien HLA-DRB1
o HLA-DRB10, usando lipofectAMINE (Invitrogen).
Después de 24 horas, se añadió el clon TB515 de CD4+T a cada
microcultivo a 1 x 10^{4} células/pocillo; 24 h más tarde, se
recogieron 100 \mul de sobrenadante, y se midió la producción de
INF-\gamma mediante un ensayo de ELISA.
Construction y secuenciación de
minigenes. La secuenciación de ADNc nº 11 se realizó con
cebadores que mapean en las regiones del vector pEAK8.5/Ii que
flanquean la inserción (directo
5'-ACCTCGATTAGTTCTCGAGCTT-3',
inverso
5'-ATTAGGACAAGGCTGGTGGGCACT-3'). La
mutación puntual no conservadora (g \rightarrow a) se confirmó o
bien mediante o bien la secuenciación de ambas cadenas de ADN de
productos amplificados de Me15392 poly(A)+ARN de
trasncripción inversa (cebador directo F2
5'-GTGCTCCTATCAGTGCTTAT-3', cebador
inverso R2 5'-GCGTACGCACTGGGTTTT-3')
o a partir del ADN genómico de Me1539 (cebador directo
5'-CTGCACCCACACC
GAACCAAGAGAGAA-3', cebador inverso 5'-CGCCTGGAAATAGATGTTGTATCCTTT-3').
GAACCAAGAGAGAA-3', cebador inverso 5'-CGCCTGGAAATAGATGTTGTATCCTTT-3').
Se prepararon minigenes a partir de ADNc nº 11
como productos de amplificación por la PCR de diferentes
longitudes. Todos los amplicones se obtuvieron usando el mismo
cebador codificante F2 acoplado a cuatro cebadores no codificantes
diferentes: EPR1
5'-CCGATTGTCACCCACAGTGAA-3', EPR2
5'-GGGCAGGCTCAGGTA-3', EPR3
5'-CTCGGGGGGAGTTCT-3', y EPR2WT
5'-GGGCAGGCTCAGGTAGGTTTCCCG-3'. Lo
ultimo se usó para la preparación del minigen EP2wt que contiene el
nucleótido de tipo salvaje (subrayado en el cebador EPR2WT). Los
productos de la PCR se clonaron en el vector
pcDNA3.1/V5-His TOPO.
El minigen de fusión Ii-EP2wt se
obtuvo mediante escisión del minigen EP2wt a partir del vector TOPO
vector con AscI y las enzimas XbaI, seguido de la clonación de la
inserción en los sitios AscI y XbaI del vector pEAK8.5/Ii. Esta
reacción dio lugar a una construcción de fusión de fase.
Transferencia de Northern y análisis de
RT-PCR de la expresión de
R-PTPK. Poly(A)+ ARN de Me15392,
melanomas alogénicos y líneas de PBL se aislaron como se ha
descrito anteriormente. Se aisló el ARN mediante el uso del kit
RNAqueous^{TM}-_4PCR (Ambion, Austin, TX, 78744,
Estados Unidos). Para los experimentos de transferencia de
Northern, 10 \mug de cada muestra de ARN se sometieron a
electroforesis en un gel de 1% formaldehído agarosa y se
transfirieron a una membrana de nylon (Hybond-N+,
Amersham Biosciences, Inc. Piscataway, NJ
08855-1327, ESTADOS UNIDOS). Se marcaron las sondas
con [alpha-^{32}P]_CTP mediante el
procedimiento de cebado al azar (Amersham Biosciences), y se
realizaron la hibridación previa e hibridación de acuerdo con las
directrices del artículo de Hybond-N+. Las
membranas se lavaron cuatro veces con soluciones diluidas en serie
de SSC (entre 0,03M y 0,0015M). Las sondas A y C se obtuvieron
mediante amplificación por la PCR de Me15392 poly(A)+ ARN
con cebadores específicos . La sonda A, específica para la región 5'
del gen (bases 241-1110 del gen), se sintetizó con
los cebadores directo F1
(5'-GGCGCTGCCTGCTTTTGT-3') e
inversos R1
(5'-GGAGGAGCAATGGGTCTT-3'). Sonda
C, específica para la región que codifica los dos dominios fosfatasa
intracelulares (bases 2925-4547 del gen), se derivó
con los cebadores directo F3
(5'-CTTGGGATGTAGCTAAAAAAGATCAAAATA-3')
e inverso STOP
(5'-CCAAC
TAAGATGATTCCAGGTACTCCAA-3'). Todos los productos de amplificación se secuenciaron antes de usarse como sondas. El clon de ADN nº 11 (bases 2084-2751 del gen) se usó como sonda B.
TAAGATGATTCCAGGTACTCCAA-3'). Todos los productos de amplificación se secuenciaron antes de usarse como sondas. El clon de ADN nº 11 (bases 2084-2751 del gen) se usó como sonda B.
Los análisis de RT-PCR del
perfil de expresión de PTPRK en las líneas celulares normales y
tumorales se realizaron con el cebador directo F3 y con el cebador
inverso R\delta
(5'-CACCCTCTCTTTCAGCCAT-3') en las
condiciones siguientes:
2' 94ºC, 34 ciclos que constan de 1' 94ºC, 2'
54ºC, 3' 72ºC, y finalmente 10' 72ºC. Se establecieron las
condiciones con el objeto de conseguir la amplificación de ADN
lineal. Los ADN se cargaron sobre ges de azarosa, se tiñeron con
bromuro de etidio, y se analizaron con un software dedicado (Image
Master VDL-CS, Amersham Pharmacia Biosciences). Las
desviaciones estándar \leq 5% en experimentos triplicados. El
nivel de expresión de cada muestra se normalizó para la integridad
de ARN teniendo en cuenta el nivel de expresión del gen de la
\beta-actina (condiciones de reacción: 4' 94ºC,
21 ciclos que constan de 1' 94ºC, 2' 68ºC, 2' 72ºC, y finalmente 10'
72ºC, correspondiente a la amplificación de ADN lineal).
Síntesis de péptidos. Se sintetizaron los
péptidos mediante la síntesis de péptido de fase sólida convencional
usando Fmoc para la protección NH_{2}-terminal, y
y se caracterizó mediante espectrometría de masas. Todos los
péptidos usados eran >95% puros (Neosystem, Strasbourg, Francia).
Se disolvieron los péptidos a 5 mg/ml en DMSO, se almacenaron a
-20ºC, y se diluyeron en medio RPMI suplementado con 10% de suero
humano inmediatamente antes de uso.
Ensayo de reconstitución del epítope.
Para analizar el reconocimiento de péptidos, 5 x 10^{3} de células
LCL1S392 o LCL3700 se sembraron en placas de 96 micropocillos en
100 \mul de RPMI 1640-10% de PHS y después se
pulsaron con diferentes concentraciones del péptido relevante. La
carga del péptido se dejó que se desarrollara durante 2 h a 37ºC
antes de que se añadieran las células efectoras para proporcionar
una relación final de 1:1. Los sobrenadantes se recogieron después
de 18 horas y se determinó el contenido de
IFN-\gamma mediante ELISA (Mabtech AB, Stockholm,
Suecia). Se determinaron experimentos de competición incubando 5 x
10^{3} LCL15392 o 5 x 10^{3} de LCL3700 con diversas
concentraciones de los péptidos competidores durante 15 minutos
antes de la adición del péptido PYYFAAELPPRNLPEP a 100 nM.
Después de 1 hr de incubación adicional a 37ºC,
se añadió el clon de células T a una relación de 1:1.
Generación de células T específicas de PTPRK
de pt15392 PBMCs. PBMCs de pt15392 que se obtuvieron a los 12
meses después de cirugía durante el período sin enfermedad después
de seguimiento, se estimularon in vitro con el péptido
PYYFAAELPPRNLPEP como se ha descrito anteriormente (15). En resumen,
PBMCs (2 x 10^{6}/pocillo) se estimularon semanalmente con
monocitos pulsados de péptidos autólogos. Al final de cada
estimulación, se controló la reactividad específica de péptido
mediante ensayo de Elispot.
Ensayo
IFN\gamma-Elispotv. Placas de nitrocelulosa de
96 pocillos (Millititer, Millipore, Bredford, MA) se cubrieron
durante una noche con 50 \mul/pocillo de 8 \mug/ml de mAb
anti-humano IFN-\gamma (Mabtech).
Después los pocillos se lavan y se bloquean con DMEM de Iscove
modificado (BioWhittaker) y 10% de suero AB humano durante 2 h a
37ºC. Se mezclaron células T (2 x 10^{3} ó 2 x 10^{4}) con 1,5 x
10^{4} células LCL autólogo pulsadas con péptido y después se
sembraron en los 96 pocillos cubiertos previamente. Las células T
incubadas con medio solo o con mitógeno de espinaca de América
sirvieron como controles negativo y positivo, respectivamente.
Después de 24 h de incubación a 37ºC y CO_{2} al 5%, se realizó
después Elispot de acuerdo con las condiciones del fabricante. En
resumen, se lavaron las placas seis veces con PBS + 0,05% de
Tween-20. Los pocillos se incubaron durante 2 horas
a 37ºC con 50 \mul/pocillo de mAb IFN-\gamma
anti-humano de ratón biotinilado (Mabtech), a una
concentración de 2,5 \mug/ml. Después de lavar cuatro veces con
PBS, 100 \mul de estreptavidina-fosfatasa
alcalina (150 \mug/ml) diluida 1/1000 se añadió durante 2 h a
temperatura ambiente. Después de otra etapa de lavado con PBS, se
añadieron 100 \mul/pocillo de sustrato BCIP/NBT (BioRad, CA,
94547,ESTADOS UNIDOS) a cada pocillo durante 10-20
min. Se detuvo el desarrollo de color lavando en agua corriente de
grifo. Después de secar a temperatura ambiente, se contaron las
células T que secretan IFNg usando el sistema de análisis de
imágenes automático Elispot Reader (AID, Strassberg, Alemania). Cada
experimento se realizó por triplicado.
\vskip1.000000\baselineskip
Clones de células CD4+T específicas de
tumores. 40 clones de células CD4+T específicas de tumor
(15392CD4+T) se obtuvieron mediante clonación en dilución limitante
de aislamiento TIL a partir de una metástasis de LN de pt15392, y
se estimularon in vitro con el tumor autólogo durante dos
semanas. El análisis de TCR mediante RT-PCR reveló
que todos los clones se podían agrupar en 5 subseries diferentes de
acuerdo con la combinación de TCRAV y TCRBV (Tabla ). Los estudios
funcionales se realizaron en un solo clon de células T
representantes de cada subserie. Se encontró que todos los clones
mostraban idéntica actividad funcional en respuesta a la
estimulación de tumores. Los datos reseñados en la Figura 1 se
obtuvieron con el clon TB515 y son representativas de todos los
clones de células T ensayados. Tras la estimulación con el melanoma
autólogo, todos los clones ejercían una actividad lítica
restringida de HLA-DR contra las células Me15392, ya
que la lisis detectada por un ensayo de de liberación de ^{51}Cr,
se inhibió en gran medida en la presencia de L243, un mAb dirigido
al determinante monomórfico de HLA-DR (Fig. 1A).
Además, tras la estimulación de tumor los clones de células T CD4+
esepcíficas de tumor también liberaron un cóctel de citoquinas
compatible con el perfil Th1, incluyendo
INF-\gamma, GM-CSF,
TNF-\alpha y IL-2, pero no
IL-4 y
TGF\beta (Fig. 1B).
TGF\beta (Fig. 1B).
\newpage
Gen de PTPRK mutado codifica el epítope
TB515. Debido a su capacidad de crecimiento in vitro,
TB515 se seleccionó posteriormente y se usó para caracterizar de
manera molecular el antígeno específico de melanoma. El
planteamiento genético empleado para este propósito se desarrolló
como una optimización de las metodologías reseñadas recientes
usadas para la identificación de antígenos tumorales
(18-20). Las células 293-EBNA1
transfectadas de manera estable con ADNc de CIITA (CIITA+293) (21)
se usaron como receptores para la genoteca de tumor de ADNc. El
análisis de FACS con anti-HLA-DR Ab
reveló un incremento significativo en la expresión de la clase II de
HLA sobre células CIITA+293 (no mostrado). Para forzar la entrada
de las proteínas derivadas de tumor en la ruta que procesa la clase
II de HLA, y de esta manera mejorar potencialmente la sensibilidad
del procedimiento de selección de los inventores, los inventores
construyeron una genoteca (22) de ADNc de tumor de la cadena
invariable quimérica (II) La genoteca de ADNc dividida en
combinaciones se transfectó después en las células CIITA+293
conjuntamente con 100 ng de plásmido que contenía los alelos
DRB1*0102 o DRB1*1001 clonados para el mismo paciente.
La selección de transfectantes condujo al
aislamiento de un clon de ADNc positivo (cDNA nº 11) que se
reconoció por las células TB515 T cuando se cotransfectó en
CIITA+293 con DRBI*1001 (CIITA+-DRB10+293) pero no cuando se
cotransfectó con el alelo DRB1*0102 (CIITA+-DRB1+293) (Fig. 2A). No
se produjo ningún reconocimiento cuando ADNc nº 11 y DRB1*1001 se
transfectaron en 293 no modificado por CIITA (wt293), confirmando
además de esta manera el requerimiento de una maquinaria de
procesamiento de la clase II de HLA para la activación de TB515.
El análisis de secuenciación de AND indicó que
el ADNc nº 11 era homólogo a una región parcial de la Proteína
Tirosina Fosfatasa Kappa de tipo receptor (PTPRK, GenBank
NM_002844), una tirosina fosfatasa de tipo II (PTPs), que es una de
las cinco subfamilias de las PTP de tipo receptor de transmembrana
PTPs (23). El ADNc nº 11 derivado de tumor que se extiende entre
2084 pares de bases a 2751 pares de bases de la secuencia de ADNc
de PTPRK NM_002844, que abarca la región la región que codifica el
cuarto dominio de tipo fibronectina III más extracelular C, el
dominio completo de transmembrana y la secuencia intracelular muy
inicial. El clon presentó una mutación puntual g \rightarrow a no
conservadora en el nucleótido 2249 en el cuarto dominio de tipo
fibronectina III del gen (NM_002844), que condujo a una sustitución
de Glicina- a Arginina (G \rightarrow R) en la proteína
correspondiente (el nº de acceso del GenBank para la secuencia de
ADNc de PTPRK derivada de Me15392 es AF533875).
Con el fin de confirmar que este cambio de
aminoácidos no sea responsable de un solo polimorfismo de
nucleótidos, pero representó una mutación somática que se produce
en el tejido tumoral, la región que comprende la mutación se
amplificó y se secuenció partiendo o bien de ADN o ADNc genómico
obtenidos a partir tanto de PBL como LCL de pt15392. Ninguna de las
muestras analizadas mostró la transición g \rightarrow a y
solamente se encontró la secuencia de tipo salvaje (datos no
mostrados). Además, El AND y ADNc derivados de 10 líneas celulares
de melanoma adicionales se analizaron de manera similar pero ninguno
de ellos mostró ninguna mutación en el nucleótido 2249.
La secuencia de cadenas invariables no es
necesaria para la presentación de la clase II de HLA de epítope
derivado de R-PTPK.
El análisis de secuencia del plásmido
recombinante que contiene el clon de ADNc nº 11 reveló que la
traducción de la cadena II se desplazó con respecto a la fase
correspondiente a la traducción propia de la proteína PTPRK. Por lo
tanto, los inventores postularon la existencia en el plásmido
recombinante de un marco abierto de lectura dirigido por un ATG
interno adicional. Mediante el análisis de la secuencia del ADNc nº
11, los inventores encontraron una secuencia de tipo Kozak
((g/a)nnatgg) cuyo ATG (posición 2165 en la secuencia
NM_002844) estaba en fase con la primera metionina auténtica de
partida del gen PTPRK. Para verificar la capacidad de traducción
autosuficiente de este codón ATG interno, ADNc nº 11 se escindió del
vector pEAK8.5/Ii y se insertó en el vector de expresión que carece
de Ii pcDNA3.1. Después se evaluó el Nuevo plásmido recombinante
para determinar la capacidad de desencadenar la activación de TB515
cuando se transfectó en las células CIITA+293 conjuntamente con DRB
*1001 (Fig. 2B). Como se esperaba, el ADNc nº 11 clonado en la
ausencia de la cadena Ii indujo la liberación de
INF-\gamma por el clon TB515 de una manera
específica restringida de DRB1*1001. El reconocimiento era tan
eficaz como el ADNc nº 11 en el vector pEAK8.5/Ii o tumor de Me15392
(Fig. 2B) lo que indica que, en la ausencia del codón de partida
Ii, el ADNc nº 11 se podría traducir a partir de su propio ATG
interno y, además, el ADNc nº 11 se puede procesar de manera natural
y presentarse en una ruta de la clase II de HLA per se sin
ninguna necesidad para una redirección intracelular mediada por la
cadena li.
Patrones de expresión de ARNm de
R-PTPK. Para obtener más información sobre las
transcripciones específicas de PTPRK en Me15392, se realizó
análisis de transferencia de Northern (Fig. 3). Para abarcar el ARNm
de PTPRK total, se llevó a cabo la hibridación de usando una mezcla
equimolar de tres sondas específicas que se mapearon en diferentes
regiones del gen PTPRK. Las muestras examinadas también incluían PBL
poly(A)+ARN, como un control negativo de la expresión de
PTPRK, y la línea celular epidérmica transformada A431, como un
control positivo de de la transcripción de longitud completa ya que
esta línea celular se sabe que tiene un alto nivel de la expresión
génica de PTPRK (24). Los melanocitos se pueden no analizar, ya que
no se obtuvo suficiente ARNm para formar el desarrollo de células
in vitro. Como se esperaba, no se observó ninguna banda de
hibridación significativa en PBL, confirmando de esta manera los
datos previos (24), mientras que tanto A431 como Me15392
poly_(A)+ ARN dieron lugar a un patrón mejor de complejo
(Fig. 3A). Aunque eran fácilmente detectables bandas específicas
alrededor de 1800 pares de bases y 1000 pares de bases, ambas
muestras presentaban una señal intensa a aproximadamente 5600 pares
de bases correspondiente a la transcripción de longitud completa.
Todos estos resultados juntos indican que Me15392 puede expresar
una proteína PTPRK completa, mientras que la significación biológica
de las transcripciones de ARNm parciales queda para que se
dirijan.
La expresión del ARNm de PTPRK en otras células
tumorales y no tumorales se estudió mediante RT-PCR.
Las amplificaciones de RT-PCR se llevaron a cabo a
partir de ARN total usando el par de cebadores F3/R\delta, mapeo
en el dominio intracelular, la mayoría N fosfatasa (longitud del
producto de amplificación 650 pares de bases). Los cebadores se
diseñaron para que sean altamente específicos para el gen PTPRK. Su
especificidad se confirmó de manera experimental, y los productos
de amplificación obtenidos a partir de líneas celulares diferentes
se secuenciaron y se mostró que corresponden a solamente PTPRK,
mientras que no se encontró ninguna de las secuencias de otros
genes de R-PTP o PTP, incluso aquellos con alta
homología a PTPRK. Se establecieron las condiciones de reacción
para que tuvieran amplificaciones de ADN lineal, y se usó una
cantidad comparable de ARNm de cada una de las líneas celulares
como se evaluó mediante la amplificación de la
\beta-actina. Aunque se podía detectar de manera
clara en los melanocitos (línea celular FM2093), PTPRK se expresó de
manera diferente en 10 líneas celulares de melanoma ensayadas, 5 de
las cuales mostraron solamente una banda escasamente detectable
comparable con la obtenida a partir de PBL, que era negativa en el
análisis de transferencia de Northern (Fig. 3A).
Algunos ejemplos representativos se proporcionan
en la Fig. 3B.
Identificación del péptido derivado de PTPRK
que reconstituye el epítope para TB515. Para determinar la
importancia de la mutación G \rightarrow R para el reconocimiento
de las células T, una versión de tipo salvaje (no mutada) de ADNc
nº 11 se sintetizó mediante reacción de la PCR y sed cotransfectó
con ADNc de DRB1*1001 en las células CIITA+293. No se observó
ningún reconocimiento de la secuencia de tipo salvaje por los clones
15392CD4+T específicos de tumores (datos no mostrados), sugiriendo
de esta manera un papel directo del aminoácido mutado en la
formación de epítopes. Para ajustar después la región codificadora
de epítope ADNc nº 11, se sintetizaron una serie de
mini-genes mediante reacciones de la PCR de ADNc nº
11 usando un cebador directo idéntico (F2) acoplado a a cebadores
inversos encajados que se mapean cadena debajo de la mutación (Fig.
4). Los minigenes, que contienen todos el codón de partida ATG del
ADNc nº 11, se clonaron en el vector de expresión pcDNA3/TOPO
(Invitrogen), después se transfectaron en CIITA+ 293 que expresa o
bien DRB1*0102 o DRB1*1001, y finalmente se evaluó para el
reconocimiento de TB515. El minigen EP2 era la construcción más
corta que se reconoce. Como se esperaba, la versión de tipo salvaje
del minigen EP2 (EP2WT), que se obtuvo usando el cebador inverso
EPR2WT que del nucleótido de tipo salvaje (desacoplamiento a/g) no
se reconoció por los linfocitos TB515 cuando se clonaban en el
vector de expresión con o sin cadena invariable.
Estos experimentos de transfección se ajustaron
a la región de aminoácidos potencialmente inmunogénicas a un
péptido de 26 aminoácidos de longitud, que se muestra en la figura
4, que contenía la mutación. Para identificar el epítope TB515,
varios péptidos hexadecámeros de superposición se sintetizaron de
forma que se extendían sobre la región identificada de 26
aminoácidos. Se evaluaron los péptidos a diferentes dosis para
determinar su capacidad para sensibilizar las células LCL autólogas
in vitro para el reconocimiento por el clon TB515
anti-melanoma. Entre los péptidos hexadecámeros
ensayados PYYFAAELPPRNLPEP
(PTPRK(_{667-682})), que se extiende entre
los aminoácidos 667 a 682 de la proteína y contiene la mutación
(Fig. 5, en letra negrita), era el único que da lugar la mayor
liberación de INF\gamma por el clon TB515. De hecho, los
experimentos de titración mostraron que este péptido se puede
detectar por las células TB515 a una concentración tan baja como 10
nM, que alcanza su efecto semi máximo a 100 nM (Fig. 5A). La
sustitución en el péptido inmunogénico del resto de arginina mutado
con la glicina de tipo salvaje (Fig. 5A) eliminó completamente la
capacidad estimuladora, mostrando de esta manera definitivamente la
relevancia de la mutación para el reconocimiento mediado por las
células T. Los experimentos adicionales con los péptidos que pierden
de manera progresiva un resto de aminoácidos en cualquiera de los
extremos 5' o 3' (Fig. 5B y 5C) se propusieron para identificar
tanto núcleo del epítope mínimo como los aminoácidos de anclaje
candidatos. En particular la omisión o sustitución con aminoácidos
no relevantes de Y_{669} (Fig. 5B) o L679 y N678 (Fig. 5C) afcetó
en gran medida la capacidad de del péptido PTPRK
(_{667-682}) para estimular el clon TB515,
sugiriendo de esta manera un papel de estos aminoácidos en la
posición 3, 11 y 12 en la formación del complejo
HLA-DR10/péptido/TCR. El péptido de tipo salvaje
PYYFAAELPPGNLPEP y la PTPRK (667-682) con el
Y_{669} sustituido por G eran ambos capaces de unirse a
HLA-DR10, ya que en un ensato de finalización
inhibían de manera eficaz el reconocimiento del péptido PTPRK
(_{667-682}) por el clon TB515 (Fig. 5D).
Los otros 4 clones de linfocitos T descritos por
tener diferentes TCR se dirigieron de hecho contra el mismo
epítope, no reconocieron el péptido de tipo salvaje y todos
mostraron una afinidad similar para el péptido mutado como se
observó para TB515 (datos no mostrados). Además, el péptido
PTPRK(_{667-682}) que lleva una
sustitución en el residuo Y_{669} se reconoció de manera eficaz
por el clon TB48, confirmando que aunque Y_{669}, es esencial
para el reconocimiento mediado por TB515, no produjo una influencia
crucial en la capacidad de unión de HLA-DR10 del
péptido PTPRK(_{667-682}) (Fig. 6).
Epítope presentado de
HLA-DR10. Para establecer si pt15392 también
desarrollaba una inmunidad sistémica, de células T específica de
epítope, PBMCs obtenidas 12 meses después de la resección quirúrgica
de la metástasis del ganglio linfático se cultivaron in
vitro con el péptido PYYFAAELPPRNLPEP a 1 \muM. Después de
tres semanas de estimulación in vitro con los monocitos
antólogos pulsados por péptidos, las células T cultivadas mostraron
una reactividad específica de péptido como se detecta por el ensayo
de Elispot, que indica la presencia de en la sangre periférica de
las células T específicas de péptido (Fig. 7). Estas células también
se consideran capaces de reconocer el tumor autólogo de una manera
restringida de HLA-DR. Recíprocamente, no era
detectable ninguna reactividad específica en PBMCs que se obtuvieron
de donantes sanos positivos de DRB1*1001.
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
^{a} \begin{minipage}[t]{155mm} Se generaron cuarenta clones
de células 15392CD4+T antimelanoma mediante dilución limitante de
15392CD4+TIL estimulado in vitro con el melanoma autólogo
durante dos semanas. Los clones 15392CD4+T se agruparon en 5
subseries diferentes (T1-T5) que expresan diferentes
TCRAV y TCRBV.\end{minipage} \cr ^{b}
\begin{minipage}[t]{155mm} Para cada subserie de clon
específico de tumor, además se indica cultivado y expandido y in
vitro .\end{minipage} \cr ^{c}
\begin{minipage}[t]{155mm} Análisis de TCR se realizó mediante
RT-PCR usando un panel de cebadores específicos de
TCR V \alpha y V \beta (véase materiales y
Procedimientos).\end{minipage} \cr ^{d}
\begin{minipage}[t]{155mm} La capacidad de los clones indicados
para lisar el tumor autólogo se ensayó en un ensayo de liberación 5h
^{51} C a una relación E:T de 30:1. Los datos se reseñan como % de
lisis. Los números entre paréntesis se refieren a % de lisis logrado
en la presencia del mAb anti-HLA-DR
L343 usado a 10 \mu g/ml de concentración
final.\end{minipage} \cr ^{e}
\begin{minipage}[t]{155mm} El ensayo de liberación de citoquina
se realizó para evaluar la capacidad de los clones de células T
indicados que reconocen el tumor autólogo (véase material y
Procedimientos para detalles). La cantidad de
IFN- \gamma liberada después de la estimulación del
tumor en la ausencia o en la presencia (valores entre paréntesis) de
L343 usada al 10 \mu g/ml de concentración final se expresa en
pg/ml.\end{minipage} \cr}
\vskip1.000000\baselineskip
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<211> 16
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Tyr Tyr Phe Ala Ala Glu Leu Pro Pro Arg
Asn Leu Pro Glu Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskipccgtattact ttgctgcaga actccccccg agaaacctac ctgagcct
\hfill48
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<213> oligonucleótido sintético
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<212> ADN
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<212> ADN
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<210> 18
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<211> 28
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<212> ADN
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<213> oligonucleótido sintético
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<210> 20
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<211> 19
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<212> ADN
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<213> oligonucleótido sintético
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<400> 20
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill19
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\vskip0.400000\baselineskip
<110> ISTITUTO NAZIONALE PER LO STUDIO E
LA CURA DEI TUMORI
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PÉPTIDOS INMUNOGÉNICOS DE PTPKR
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<130> 6423MEUR
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<160> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 1
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Asn Leu Pro Glu Pro}
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<210> 2
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<213> Homo sapiens
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\hfill48
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<212> ADN
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<213> Desconocido
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<223> Oligonucleótido sintético
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<213> Desconocido
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<213> Desconocido
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<213> Desconocido
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<223> Oligonucleótido sintético
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<213> Desconocido
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<213> Desconocido
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<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggaggagcaa tgggtctt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctgggatgt agctaaaaaa gatcaaaata
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
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<212> ADN
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<213> Desconocido
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<220>
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<223> Oligonucleótido sintético
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccaactaaga tgattccagg tactccaa
\hfill28
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<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Desconocido
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<220>
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<223> Oligonucleótido sintético
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<400> 20
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaccctctct ttcagccat
\hfill19
Claims (14)
1. El péptido inmunogénico PTPRK_{Gly677
\rightarrow Arg} de la SEQ ID N. 1.
2. Un anticuerpo monoclonal o policlonal , o un
fragmento del mismo, que se une de manera selectiva al péptido de la
reivindicación 1.
3. Una molécula de ácido nucleico aislada que
codifica el péptido de la reivindicación 1.
4. Un vector de expresión que lleva la molécula
de ácido nucleico de la reivindicación 3.
5. Una célula huésped que contiene el vector de
la reivindicación 4.
6. Un linfocito de CD4+ T aislado capaz de
reconocer de manera selectiva y unirse a la secuencia del péptido
SEQ ID N. 1 asociada a una molécula de la clase II de HLA.
7. Un linfocito T de acuerdo con la
reivindicación 6, que reconoce de manera de manera selectiva y se
une a un complejo péptido/HLA-DR b1*1001.
8. Las células que presentan antígeno que llevan
la SEQ ID N. 1 del péptido unida a una molécula
HLA-DRb 1*1001.
9. La composición farmacéutica que contiene SEQ
ID N. 1 del péptido o una molécula de ácido nucleico que lo
codifica, en mezcla con los excipientes farmacéuticamente
aceptables.
10. La composición farmacéutica de la
reivindicación 9, en la forma de una vacuna.
11. El uso de la SEQ ID N. 1 del péptido, de las
moléculas de ácido nucleico que lo codifican, de APCs de acuerdo con
la reivindicación 8 o linfocitos T de acuerdo con las
reivindicaciones 6-7, para la preparación de un
medicamento para el tratamiento preventivo o terapéutico de
cáncer.
12. El uso según la reivindicación 11, para el
tratamiento preventivo o terapéutico de melanoma que expresa
PTPRKGly_{677 \rightarrow Arg}.
13. El uso de la SEQ ID N. 1 del péptido o de
una molécula de ácido nucleico que lo codifica para la preparación
de una composición de diagnóstico.
14. El uso de acuerdo con la reivindicación 13,
en el que dicha composición de diagnóstico se utiliza en la
caracterización de melanoma que expresa PTPRK_{Gly677 \rightarrow
Arg}.
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