JP2006506064A - Ptprk免疫原性ペプチド - Google Patents
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Abstract
PTPRK蛋白から単離された免疫原性ペプチドは、CD4+T細胞によって認識された新規なHLA II制限エピトープを表し、癌の免疫学的治療又は診断に用いられる。
Description
本発明は、蛋白PTPRK(受容体様プロテイン・チロシン・ホスホターゼ・カッパ)から単離された免疫原性ペプチド及び腫瘍の診断及び予防又は治療上の処置におけるそれらの使用に関する。より詳細には、本発明は、CD4+T細胞によって認識される新規なHLA−クラスII制限エピトープ及びメラノーマ発現PTPRKを有する患者の診断、予防又は免疫治療におけるその使用を提供する。
特異抗腫瘍T細胞応答の誘発を可能する腫瘍関連抗原の同定は、腫瘍の治療のための新規な免疫学的アプローチを提供している。ウィルス感染ならびに癌において、実質的な免疫応答の発現及び維持のため、HLA−クラスII抗原を認識するCD4+T細胞が決定的な役割を果たすにもかかわらず、現在までに明示された腫瘍関連抗原の大多数は、HLA−クラスI制限細胞障害性Tリンパ球(CTL)によって認識される。T細胞媒介ヘルパ
ー応答及びHLA−クラスI制限腫瘍関連抗原を誘発することができる腫瘍特異エピトープの欠損は、癌患者におけるワクチン接種の試みの治療上の効力を制限する主な因子を構成する。従って、新規なMHCクラスII制限腫瘍特異抗原の特徴づけは、新規でより有効なペプチドベースのワクチンを提供するために最重要と思われる。
ー応答及びHLA−クラスI制限腫瘍関連抗原を誘発することができる腫瘍特異エピトープの欠損は、癌患者におけるワクチン接種の試みの治療上の効力を制限する主な因子を構成する。従って、新規なMHCクラスII制限腫瘍特異抗原の特徴づけは、新規でより有効なペプチドベースのワクチンを提供するために最重要と思われる。
クラスIIMHC抗原処理(processing)/提示経路のメカニズムはかなり複雑であり、完全に理解されていないようである。技術的な困難性のために、クラスIIのHLA−制限腫瘍抗原の発見が阻害されており、よって、ヒトの腫瘍のなかで最も免疫原性であるメラノーマに対する公知の腫瘍特異ヘルパーエピトープの有効性が制限される。
PTPRKは、受容体様プラズマメンブレン−スパンニング(spanning)PTP分子のファミリーに属し、フィブロネクチンタイプIII反復、免疫グロブリン及びメプリン/A5/μ(MAM)ドメインのその細胞外部位に存在することによって特徴付けられる(30、31)。PTPRKは、すい臓、前立腺、卵巣及びケラチン生成細胞の表皮細胞系のような正常組織において発現するが、PBL及び血液細胞系では発現しない(24)。PTPRKの正確な生理学的役割はまだ明らかではないが、その構造的な特徴、及びPTPRKの発現が細胞密度によって誘発されるという観察とともに、細胞間での同種親和性相互作用を媒介する能力は、細胞−細胞接触形成の調整においてこの蛋白の決定的な役割を強く示唆している(30)。さらに、最近、ヒトにおいてPTPRKが共局在し(co-localize)、かつ隣接する細胞の細胞−細胞接触領域でβ−及びγ−カテニンと関連することが示されている(25)。これらの発見は、細胞接合部においてチロシンキナーゼ誘発事象の作用を、おそらくβ−及びγ−カテニンの脱リン酸化によって、負に調節することにおいて、この蛋白の関与を強力に支持する。これらの機能的な役割、及びヒトPTPRK遺伝子が想定される腫瘍サプレッサー遺伝子領域6q22.2-q22. 3(それはしばしばメラノーマにおいて削除される(33,34))にマッピングされているという所見(31、32)は、発現の欠損ならびにPTPRK蛋白の機能的ドメインにおいて発生する突然変異が、正常成長細胞の表現型に直接影響し得、腫瘍における形質変換及び進行において役割を果たし得るという仮説を総合的に支持する。
HLA−クラスIIメラノーマ抗原を同定することを目的として、われわれは、リンパ節転移の外科切除術後9年無病であった好調な予後診断を経験したメラノーマ患者におけるCD4+抗腫瘍応答を研究した。この見通しの明るい臨床上の進化論は、分化抗原gplOO及びTRP−2に対して指向する強力かつ持続的なCD8媒介抗抗腫瘍応答と関連していた。CD4T細胞は、CD8T細胞の発現及び維持のために必須であることが知られているため、われわれは、患者が腫瘍特異CD4媒介応答もまた発現した可能性を調査した。
腫瘍浸潤リンパ節から得られたTリンパ球を、インビトロにおいて、自己腫瘍で繰り返し刺激し、T細胞クローンを制限希釈によって発生させた。HLA−DR制限型における自己腫瘍を認識するCD4+T細胞クローンを得、それらの鋭い特異性のためにインビトロで特徴付けし、認識した抗原の分子特性の定義づけを意図する遺伝学的アプローチにおける細胞プローブとして使用した。自己メラノーマのRNAのテンプレートとして用いる、構築されたcDNA発現ライブラリのスクリーニングは、CD4+メラノーマ特異クローンによって認識された抗原をコードするようなチロシン・リン酸受容体K遺伝子(R−PTP−K)の同定を導いた。メラノーマ細胞によってクローン化されたR−PTP−K mRNAは、蛋白の第4フィブロネクチンIII様ドメインにおける非保存的Gly→Arg突然変異を含む。このアミノ酸変化は、腫瘍cDNAサイブラリをクリーニングするために用いられたCD4T細胞クローンによって、ならびに同じ患者の腫瘍浸潤リンパ節から単離された5つの異なるクローンのすべてによって認識されるHLA−DRβ1*1001によって提示されたT細胞エピトープを発生させる。抗原性エピトープは、PTPRKGly677→Arg682の領域667−682において同定され、それは配列PYYFAAELPPRNLPEP (配列番号1)を有する。
本発明の第1の観点は、配列番号1の免疫原性ペプチド、ならびに診断又は治療上の適用、特に、腫瘍発現PTPRKGly677→Arg682の診断、予防又は免疫治療のためのその使用、抗体及び/又はTヘルパー又は細胞傷害性細胞の発生における、より一般的には、腫瘍特異免疫応答の誘発におけるその使用に指向する。
本発明のペプチドは、以下の種々の手順で調製することができる。例えば、従来の技術に従って又は自動合成装置を用いて、溶液又は固相中で合成することができる。ペプチド合成の理論及び実施は、いずれかの当業者に知られており、例えば、Stewart及びYoung (1984) Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed. , Pierce Chemical Co.;Tam ら、J. Am. Chem. Soc., (1983) 105: 6442;Merrifield, The Peptides, Gross and Meinenhofer eds. Academic Press (1979) New York, pp. 1-284を参照のこと(ここに参照として組み込む)。
治療における使用について、そのペプチドは医薬的に許容される賦形剤とともに適切に製剤化されるであろう。予防又は治療上の処置のための適切な製剤化によって、経口又は非経口で、好ましくは皮下又は筋肉内に投与することができ、それらは、ペプチドの有効量を含むであろう。その量は、腫瘍に対して指向される体液又は細胞媒介免疫応答を誘発させることができるにちがいなく、患者の一般症状、疾患の進行及び他の因子に依存して変化するであろう。
好ましくは、本発明のペプチドは、メラノーマ感受性個人の予防処理のため又はメラノーマ患者の治療的処置のためのいずれかにワクチンの形態で投与される。そのワクチンは、免疫応答を維持又は高めるように、単回又は多数回投与計画に従って、適切な用量でかつ種々の時間間隔で投与することができる。ペプチド免疫原性は、免疫原担体との架橋又は結合によって、あるいは適切なアジュバントを用いることによって、増強させることができる。さらに、ペプチドは、バイオアベイラビリティ又はHLA分子との親和性を増加させるために、脂質、グルコシド残基又は他のペプチド結合してもよい。
さらなる実施形態では、本発明は、配列番号1のペプチドを認識し、結合することができる、Fab、Fv又はscFvのような、多クローン性又は単クローン性抗体、フラグメント又はそれらの誘導体を提供する。単離された抗体は、腫瘍発現PTPRKGly677→Arg682の定義づけのために、腫瘍免疫治療又は免疫診断技術に用いることができる。
さらなる実施形態では、本発明は、腫瘍発現PTPRKGly677→Arg682を特異的に認識する単離CD4+T細胞を提供し、そのような腫瘍に対する細胞媒介免疫応答を誘発するためのそれらの使用を提供する。これらの細胞は、治療に付される患者から得られたRBMCから単離することができ、それらは、任意にサイトカインの存在下で、又はペプチドで負荷されたAPC(抗原提示細胞)発現アレルHLA−DRβ1*1001のような、HLA−クラスII分子に関連するペプチドを有する細胞を用いて、配列番号1のペプチドとともにインビトロで活性化することができる。APCは、特異アレルHLA又はペプチドもしくはそれらの前駆体を発現するために、例えば、ウィルス又はレトロウイルス・ベクターにトランスフェクションすることによって一般に修飾することができる。修飾HLA細胞は、インビトロ又はインビボのいずれかで、T細胞を活性化するために使用することができる。インビトロにおいて活性化されたT細胞は、発症を防止するために、その後患者に再導入することができ、成長を抑制させ、あるいは腫瘍細胞の量を低減させる。患者へ再導入される前に、リンパ球は、例えば、CD4に対して指向する抗体又は他のマーカーを用いて、アフィニティーカラムによって精製してもよい。
さらなる実施形態では、本発明は、ここで示したPTPRKGly677→Arg682のエピトープをコードする単離核酸分子、好ましくは、配列CCGTATTACTTTGCTGCAGAACTCCCCCCGAGAAACCTACCTGAGCCT(配列番号2)ならびにその配列を含むベクター及びホストセルを提供する。ペプチド−コード配列又はそれらの一部を含むDNA分子、及びそれらの遺伝子構成物を、腫瘍、特にメラノーマの発生の危険にある患者又は癌患者のワクチン接種において使用することができる。DNA免疫化は、公知の技術にしたがって行うことができる(Donnelly J. J. ら、1994, The Immunologist 2: 1)。筋肉内投与経路が好ましいが、非経口及び粘膜経路も利用することができる(pnas 1986, 83,9551 ; WO90/11092)。さらに、DNAは、遺伝子銃装置(biolistic)を用いた皮下投与のために金粒子に吸着させることができる(Johnston, 1992 Nature, 356,152)。
上述した治療上の使用に加えて、ペプチドコード配列又はそれらの一部を含む核酸分子ならびにペプチド自体を、例えば、PCR分析又はエピトープ特異抗体を用いたイムノアッセイによって、メラノーマ発現PTPRKGly677→Arg682の診断に用いることができる。さらに、配列番号1のペプチドとHLA−DRβ1 * 1001細胞との複合体を、インビトロ又はエキスビボにおいて、ペプチドを用いたワクチン投与された被験者の免疫応答をモニタリングするために用いることができる。
図面の説明
図1
抗メラノーマTリンパ球クローンTB515の機能的特性。(A)TB515クローンによる51Cr-標識Mel5392及びLCL15392細胞の溶解感受性:51Cr放出を5時間後に測定した。アッセイを抗-HLA−DRAb,L243の不存在下(黒四角)又は抗-HLA−DRAb,L243の存在下(黒三角)で行った。(B)サイトカイン放出アッセイ:TB515クローンを、自己腫瘍又は15392LCLとともに、L243の存在下又は非存在下で、1:1の細胞比で一晩インキュベートした。上清を採取し、INF-γ、GM−CSF、TNF-α及びIL−2の含量を、市販のELISAアッセイによって評価した。S. D.≦5%。
図1
抗メラノーマTリンパ球クローンTB515の機能的特性。(A)TB515クローンによる51Cr-標識Mel5392及びLCL15392細胞の溶解感受性:51Cr放出を5時間後に測定した。アッセイを抗-HLA−DRAb,L243の不存在下(黒四角)又は抗-HLA−DRAb,L243の存在下(黒三角)で行った。(B)サイトカイン放出アッセイ:TB515クローンを、自己腫瘍又は15392LCLとともに、L243の存在下又は非存在下で、1:1の細胞比で一晩インキュベートした。上清を採取し、INF-γ、GM−CSF、TNF-α及びIL−2の含量を、市販のELISAアッセイによって評価した。S. D.≦5%。
図2
クローン#11の相補DNAはTB515認識抗原をコードする。(A)CIITA+293をそれぞれ、pEAK8.5-Ii単独又はpcDNA3.1-DRB 1 *0102もしくはpcDNA3.1-DRB1*1001とともに、cDNA#11にトランスフェクトした。CIITA+293は単独でpcDNA3.1DRB1*0102又はpcDNA3-DRB1*1001にトランスフェクトされ、CIITA+293は、緑蛍光プロテイン(GFP)をコードする組換えpcDNA3にコトランスフェクトされ、pcDNA3.1- DRB1*1001を陰性コントロールとして用いた。(B)cDNA#11をpcDNA3.1にサブクローンし、 CIITA+293においてpcDNA3.1-DRB 1 * 1001にコトランスフェクトした。クローンTB515 (1×105リンパ球/ウェル)を各トランスフェクタントに加え、24時間後、上清を採取し、IFN-γ含量をELISAによって評価した。双方のパネルにおいて、Mel5392を陽性コントロールとして用いた。トランスフェクタントをすべて、TB515によるIFN-γ放出を誘発する能力について評価した。
クローン#11の相補DNAはTB515認識抗原をコードする。(A)CIITA+293をそれぞれ、pEAK8.5-Ii単独又はpcDNA3.1-DRB 1 *0102もしくはpcDNA3.1-DRB1*1001とともに、cDNA#11にトランスフェクトした。CIITA+293は単独でpcDNA3.1DRB1*0102又はpcDNA3-DRB1*1001にトランスフェクトされ、CIITA+293は、緑蛍光プロテイン(GFP)をコードする組換えpcDNA3にコトランスフェクトされ、pcDNA3.1- DRB1*1001を陰性コントロールとして用いた。(B)cDNA#11をpcDNA3.1にサブクローンし、 CIITA+293においてpcDNA3.1-DRB 1 * 1001にコトランスフェクトした。クローンTB515 (1×105リンパ球/ウェル)を各トランスフェクタントに加え、24時間後、上清を採取し、IFN-γ含量をELISAによって評価した。双方のパネルにおいて、Mel5392を陽性コントロールとして用いた。トランスフェクタントをすべて、TB515によるIFN-γ放出を誘発する能力について評価した。
図3
(A)Me15392細胞でのPTPRK mRNA発現。Mel5392から得られた10μgのポリ(A)+mRNAをノーザンブロット法により分析した。ハイブリダイゼーションを、PTPRK cDNAの細胞外、膜貫通及び細胞内領域をスパンする3種の32P標識プローブの等モル混合物を用いて行った(材料及び方法の説明参照)。レーンを、β−アクチンハウスキーピング遺伝子ハイブリダイゼーションによってチェックしたように、mRNAの同程度の量で負荷した(データは示さず)。サンプル;Mel5392、培養15392メラノーマ細胞から得たmRNA ;PBL、4人の健常ドナーからのmRNAのプール;A431、類表皮腫瘍細胞系からのmRNA。
(A)Me15392細胞でのPTPRK mRNA発現。Mel5392から得られた10μgのポリ(A)+mRNAをノーザンブロット法により分析した。ハイブリダイゼーションを、PTPRK cDNAの細胞外、膜貫通及び細胞内領域をスパンする3種の32P標識プローブの等モル混合物を用いて行った(材料及び方法の説明参照)。レーンを、β−アクチンハウスキーピング遺伝子ハイブリダイゼーションによってチェックしたように、mRNAの同程度の量で負荷した(データは示さず)。サンプル;Mel5392、培養15392メラノーマ細胞から得たmRNA ;PBL、4人の健常ドナーからのmRNAのプール;A431、類表皮腫瘍細胞系からのmRNA。
(B)PTPRK mRNA発現プロファイルのRT−PCR分析。細胞内ホスファターゼドメインをスパンする領域を、650bpの特異増幅帯を発生させるプライマーF3/Rδによって増幅した。反応条件は、DNA増幅の線形範囲内に設定した。テンプレートの量をβ−アクチンの同程度のレベルを得るために調節し、よって、試験サンプルにおいて増幅PTPRKの直接比較を可能にした。実施例に示したように、RT−PCR分析によるPTPRK発現の評価が、試験した10のメラノーマ細胞系のうち5つについて報告された。4つの転移(Mel5392、Me335、Me337及びMe349)及び1つの初期(Me366)のメラノーマ細胞系である。4人の健常ドナーのPBLプール(PBL)及び正常なメラノサイト(FM2093)も含む。
図は、3種の独立した実験の結果である。
図は、3種の独立した実験の結果である。
図4
cDNA#11の特徴付け。cDNA#11及び関連ミニ遺伝子を、PTPRK蛋白の概略構造に位置合わせしたボックスとして示す。各ミニ遺伝子中の黒四角は、全長遺伝子(ゲンバンクNM002844)の開始ATGでフレームされた(in frame with)ATGコドンの位置を示す。2249位で発生した当然変異ヌクレオチド(g→a)を示す。ミニ遺伝子を、下流突然変異(EPR1、EPR2、EPR2WT及びEPR3逆プライマー、→で示す)をマッピングする、種々のネスト化された逆プライマーに結合した同一の正プライマー(F2)を用いてcDNA#11のPCR増幅によって合成した。ミニ遺伝子を、発現ベクターpcDNA3/TOPOにクローン化し、次いで、pcDNA3-DRB1 * 1001又はpcDNA3-DRBl*0102でCIITA+-293細胞にコトランスフェクトした。クローンTB515(1×105細胞/ウェル)を各トランスフェクタントに加え、24時間後、上清について、ELISAによってIFN−γ量を測定した。表中、+はTB515による陽性認識;−はTB515による認識なしである。EP2wtミニ遺伝子は、非突然変異(g)ヌクレオチドを含んでいた。図の下におけるアミノ酸配列を、cDNA#11の配列から推定した。図中の略号:LSはリーダ配列、MAMはメプリン/A5/R-PTPμモチーフ、Igはイムノグロブリン様ドメイン、FNIIIは、フィブロネクチンタイプIII様ドメイン、TMは膜貫通型、PTPはプロテイン−チロシンホスファターゼドメイン、Rはヌクレオチドg→a突然変異体から誘導されたアルギニンである。
cDNA#11の特徴付け。cDNA#11及び関連ミニ遺伝子を、PTPRK蛋白の概略構造に位置合わせしたボックスとして示す。各ミニ遺伝子中の黒四角は、全長遺伝子(ゲンバンクNM002844)の開始ATGでフレームされた(in frame with)ATGコドンの位置を示す。2249位で発生した当然変異ヌクレオチド(g→a)を示す。ミニ遺伝子を、下流突然変異(EPR1、EPR2、EPR2WT及びEPR3逆プライマー、→で示す)をマッピングする、種々のネスト化された逆プライマーに結合した同一の正プライマー(F2)を用いてcDNA#11のPCR増幅によって合成した。ミニ遺伝子を、発現ベクターpcDNA3/TOPOにクローン化し、次いで、pcDNA3-DRB1 * 1001又はpcDNA3-DRBl*0102でCIITA+-293細胞にコトランスフェクトした。クローンTB515(1×105細胞/ウェル)を各トランスフェクタントに加え、24時間後、上清について、ELISAによってIFN−γ量を測定した。表中、+はTB515による陽性認識;−はTB515による認識なしである。EP2wtミニ遺伝子は、非突然変異(g)ヌクレオチドを含んでいた。図の下におけるアミノ酸配列を、cDNA#11の配列から推定した。図中の略号:LSはリーダ配列、MAMはメプリン/A5/R-PTPμモチーフ、Igはイムノグロブリン様ドメイン、FNIIIは、フィブロネクチンタイプIII様ドメイン、TMは膜貫通型、PTPはプロテイン−チロシンホスファターゼドメイン、Rはヌクレオチドg→a突然変異体から誘導されたアルギニンである。
図5
TB515エピトープの同定。(A、B、C)種々の濃度の合成ペプチドを2時間37℃で適用(pulsed)されたLCL15392細胞(5.0×103細胞/ウェル)をTB515 Tリンパ球を刺激するために用いた。TB515(5×103細胞/ウェル)を加え、18時間後、メディウムを採取し、ELISAによってIFN-γを測定した。同一の結果が、ptl5392とDRB*1001のみを共有するLCL3700を用いることにより得られた(図示せず)。(D) 5×103のLCL15392細胞を15分間、種々の濃度の競合ペプチドとインキュベートした。競合ペプチドは、PYGFAAELPPRNLPEP(3位が修飾)、野生型PYYFAAELPPGNLPEP及び陰性コントロールとして用いたHLA-A3結合ペプチドILRGSVAHKを含む。次いで、PYYFAAELPPRNLPEPペプチドを100nMで加えた。37℃でのさらなるインキュベーションの1時間後、TB515(5×103細胞/ウェル)を加え、18時間後、メディウムを採取し、ELISAによってIFN-γを測定した。同一の結果が、ptl5392とDRB*1001のみを共有するLCL3700を用いることによって得られた。突然変異アミノ酸を太字、置換アミノ酸を下線で表す。
TB515エピトープの同定。(A、B、C)種々の濃度の合成ペプチドを2時間37℃で適用(pulsed)されたLCL15392細胞(5.0×103細胞/ウェル)をTB515 Tリンパ球を刺激するために用いた。TB515(5×103細胞/ウェル)を加え、18時間後、メディウムを採取し、ELISAによってIFN-γを測定した。同一の結果が、ptl5392とDRB*1001のみを共有するLCL3700を用いることにより得られた(図示せず)。(D) 5×103のLCL15392細胞を15分間、種々の濃度の競合ペプチドとインキュベートした。競合ペプチドは、PYGFAAELPPRNLPEP(3位が修飾)、野生型PYYFAAELPPGNLPEP及び陰性コントロールとして用いたHLA-A3結合ペプチドILRGSVAHKを含む。次いで、PYYFAAELPPRNLPEPペプチドを100nMで加えた。37℃でのさらなるインキュベーションの1時間後、TB515(5×103細胞/ウェル)を加え、18時間後、メディウムを採取し、ELISAによってIFN-γを測定した。同一の結果が、ptl5392とDRB*1001のみを共有するLCL3700を用いることによって得られた。突然変異アミノ酸を太字、置換アミノ酸を下線で表す。
図6
Tリンパ球クローンTB48のペプチド特異性。種々の濃度の合成ペプチドを2時間37℃適用されたLCL15392細胞 (5.0×103細胞/ウェル)を、TB48を刺激するために用いた。TB48クローン (5×103細胞/ウェル)を加え、18時間後、メディウムを採取し、ELISAによってIFN-γを測定した。同一の結果が、ptl5392とDRB*1001のみを共有するLCL3700を用いることによって得られた。
Tリンパ球クローンTB48のペプチド特異性。種々の濃度の合成ペプチドを2時間37℃適用されたLCL15392細胞 (5.0×103細胞/ウェル)を、TB48を刺激するために用いた。TB48クローン (5×103細胞/ウェル)を加え、18時間後、メディウムを採取し、ELISAによってIFN-γを測定した。同一の結果が、ptl5392とDRB*1001のみを共有するLCL3700を用いることによって得られた。
図7
pt15392のPBMCにおけるPTPRKエピトープ特異免疫。術後12ヶ月の無病期間中に得られたptl5392のPBMCをインビトロで、突然変異PYYFAAELPPRNLPEPエピトープで刺激した。培養3週間の終わりに、発生したT細胞系を、抗HLA−DR Ab L243の存在下又は不存在下で、ペプチド又は自己腫瘍刺激に対する応答におけるIFN−γの放出能について、ELISPOTアッセイによって評価した。T細胞を、(1)メディウム、(2)LCL15392、(3)4μgのPYYFAAELPPRNLPEPが適用されたLCL15392、(4)4μgのPYYFAAELPPRNLPEPが適用され、かつ10μg/mlの抗-HLA−DR L243 AbでインキュベートされたLCL15392、(5)2μgのPYYFAAELPPRNLPEPが適用されたCL15392、(6)2μgのPYYFAAELPPRNLPEPでが適用され、かつ10μg/mlの抗-HLA−DR Ab L243でインキュベートされたLCL 15392、(7)4μgの野生型PYYFAAELPPGNLPEPペプチドが適用されたLCL15392、(8)自己Mel5392、(9)抗-HLA−DR Ab L243とインキュベートされた自己Me15392とともにインキュベートした。
pt15392のPBMCにおけるPTPRKエピトープ特異免疫。術後12ヶ月の無病期間中に得られたptl5392のPBMCをインビトロで、突然変異PYYFAAELPPRNLPEPエピトープで刺激した。培養3週間の終わりに、発生したT細胞系を、抗HLA−DR Ab L243の存在下又は不存在下で、ペプチド又は自己腫瘍刺激に対する応答におけるIFN−γの放出能について、ELISPOTアッセイによって評価した。T細胞を、(1)メディウム、(2)LCL15392、(3)4μgのPYYFAAELPPRNLPEPが適用されたLCL15392、(4)4μgのPYYFAAELPPRNLPEPが適用され、かつ10μg/mlの抗-HLA−DR L243 AbでインキュベートされたLCL15392、(5)2μgのPYYFAAELPPRNLPEPが適用されたCL15392、(6)2μgのPYYFAAELPPRNLPEPでが適用され、かつ10μg/mlの抗-HLA−DR Ab L243でインキュベートされたLCL 15392、(7)4μgの野生型PYYFAAELPPGNLPEPペプチドが適用されたLCL15392、(8)自己Mel5392、(9)抗-HLA−DR Ab L243とインキュベートされた自己Me15392とともにインキュベートした。
略号:ptl5392は患者15392;LNはリンパ節;gp100はグリコプロテイン100;TRP-2はチロシナーゼ放出プロテイン2;PTPRKは受容体様プロテインチロシンホスファターゼカッパ;RT-PCRは逆転写遺伝子ポリメラーゼ連鎖反応;CIITAはクラスII トランスアクチベータ;liは不変鎖;GFPは遺伝子蛍光プロテイン;LCLはリンパ芽球様EBV-形質転換B細胞系;MTSはメラノーマ移行シグナル;MAMはメプリン/A5/PTPRモチーフ;Eは効果細胞;Tは標的細胞;TCRはT細胞受容体である。
材料及び方法
細胞系。患者(pt)15392(HLA-A*0301、B*40012、B*1402、C*0602、C*8002、DRB1*0102、DRB1*1001)の臨床経過及びメラノーマ細胞系Mel5392のインビトロでの安定化はすでに示した(16)。細胞表面の分析によって、Mel5392細胞が、クラスIHLA陽性であり、DQクラスII HLAではなく、本質的にDR、DPを発現することを示した。LCL15392及びLCL3700は、それぞれ、ptl5392及び健常ドナーの末梢血単核細胞(PBMC)から得られたEBV-形質転換B細胞系である。LCL3700は、ptl5392とDRB1*1001のみを共有する。293-EBNA細胞(wt293) (インビトロゲン、カリフォルニア9200、米国)及びクラスII トランスアクチベータ+ 293-EBNA細胞(CIITA+293) を、10%FCSを含むDMEMメディウム(ユーロクローン、ヨーロッパ、TQ4 5NDデボン、英国)で保持した。CIITA+293細胞を、wt293細胞をCIITA-コードレトロウィルスベクターに導入することによって得た。CIITA+293細胞を、L243、HLA−DRアレル特異的mAbを用いて、免疫的選択した。
細胞系。患者(pt)15392(HLA-A*0301、B*40012、B*1402、C*0602、C*8002、DRB1*0102、DRB1*1001)の臨床経過及びメラノーマ細胞系Mel5392のインビトロでの安定化はすでに示した(16)。細胞表面の分析によって、Mel5392細胞が、クラスIHLA陽性であり、DQクラスII HLAではなく、本質的にDR、DPを発現することを示した。LCL15392及びLCL3700は、それぞれ、ptl5392及び健常ドナーの末梢血単核細胞(PBMC)から得られたEBV-形質転換B細胞系である。LCL3700は、ptl5392とDRB1*1001のみを共有する。293-EBNA細胞(wt293) (インビトロゲン、カリフォルニア9200、米国)及びクラスII トランスアクチベータ+ 293-EBNA細胞(CIITA+293) を、10%FCSを含むDMEMメディウム(ユーロクローン、ヨーロッパ、TQ4 5NDデボン、英国)で保持した。CIITA+293細胞を、wt293細胞をCIITA-コードレトロウィルスベクターに導入することによって得た。CIITA+293細胞を、L243、HLA−DRアレル特異的mAbを用いて、免疫的選択した。
腫瘍特異T細胞クローンの発生。1991におけるptl5392から外科的に取り出したリンパ節転移障害から採取した、腫瘍浸潤Tリンパ球(TIL)を、密度勾配遠心法により単離した。T細胞を、インビトロで、300 IU/mL組換えヒトIL-2 (ユーロセタス、アムステルダム、オランダ)及び10 %のプールされたヒトAB血清が添加されたPRMIメディウムにおいて自己腫瘍細胞にさらすことによって、2回刺激した。インビトロでの培養の3週間後、T細胞を限界希釈法によってクローン化し、そのクローンを15日間で成長をスクリーニングした。成長T細胞クローンの特異性を、51Cr-放出アッセイで分析した。140の独立クローンが、自己腫瘍に対するTCR媒介溶解活性を示した。40クローンが自己腫瘍のHLA−DR制限認識を示し、さらなる分析のために選択された。クローナリティ(clonality)を確認するため及び同一TCR特異性を有するクローンを分類するために、各クローンのTCRレパートリーを、先に述べたような(17)、TCR AVのパネル及びTCRBV特異プライマーを用いて、逆転写(RT)PCRによって試験した。
サイトカイン放出アッセイ。リンパ球に、U底プレートの96ウェルで、104/ウェルのメラノーマ細胞又は種々のペプチド用量で2時間37℃適用された5×103の自己LCLを接種し、10%のプールされたヒト血清(PHS)が添加されたRPMI1640の0.2mLの最終容量とした。一晩、37℃でインキュベートした後、上清を採取し、サイトカイン含量をERISA(エンドーゲン、ボバーン、マサチューセッツ、01801、米国)によって評価した。
細胞障害アッセイ。標的セルの溶解に対する感受性を、種々のエフェクター:標的(E:T)比で、標準51Cr-放出細胞障害アッセイによって評価した。51Cr-放出アッセイを先に述べたように行った(16)。
HLA−DRB1*0102及びDRB1*1001クローニング。ptl5392のcDNAクローンコードHLA−DRB1*0102及びDRB1*1001鎖を、15392LCL から調製したポリ(A)+RNAから開始するRT−PCRによって得た。増幅を、DRβ1鎖(正5'-CGCGGATCCAGCATGGTGTGTCTG-3';逆5'-GGAATTCCTCAGCTCAGGAATCCTGTT-3')の保存5'及び3'領域に対して特異的なプライマーを用いて行い、PCR生成物を、pcDNA3. 1/V5-His TOPOベクター(インビトロゲン)にクローン化した。
腫瘍誘発cDNAライブラリの構築及びスクリーニング。FASTRACKキット(インビトロゲン)を用いてMel5392細胞から単離したポリ(A)+RNAを、スーパースクリプト・チョイス・システム(ライフ・テクノロジーズ)で、XbaI 部位(下線)を含有するオリゴ(dT)プライマー[5'- pGACTAGTTCTAGATCGCGAGCGGCCGCCC(T)15-3']を用いて、cDNAに変換した。cDNAをEcoRI-BstxIアダプター(ストラタジーン)に結紮し、XbaIで消化し、発現ベクターpEAK8. 5/Iiにおいて、不変鎖cDNAインサート(li、アミノ酸1-80)の3’末端に位置するポリリンカーのXbaI及びBstxI部位に挿入し、よって、Ii/腫瘍誘発融合cDNAライブラリを作製した。E. Coli DH5α細胞を、電気穿孔法により、組換えプラスミドで形質転換し、アンピシリン(0.1 g/l)で選択した。そのライブラリを、それぞれ約100cDNA組換えクローンの1400プールに分割した。プールは、LBメディウム+アンピシリン (0.1g/l)中で一晩成長させ、プラスミドDNAをQIAprep96プラスミドキット(クアゲン)を用いて抽出した。
平底96マイクロウェル中に接種したCIITA+293細胞(5×104細胞/ウェル)を、リポフェクトアミン(インビトロゲン)を用いて、cDNAライブラリの1プールの150ng及びHLA−DRB1又はHLA−DRB10のいずれかを含有するプラスミドの150ngでコトランスフェクトした。24時間後、CD4+Tクローン TB515を各マイクロ培地に1×104細胞/ウェルで添加した。24時間後、上清100μlを採取し、INF-γ生成物をERISA分析により測定した。
ミニ遺伝子の構築及びスクリーニング。cDNA#11のシーケンシングを、インサート (正5'-ACCTCGATTAGTTCTCGAGCTT-3'、逆5'-ATTAGGACAAGGCTGGTGGGCACT-3')をフランキングするpEAK8. 5/Ii ベクターの領域にマッピングするプライマーで行った。非保存的ポイント突然変異体(g→a)を、逆転写Mel5392ポリ(A)+RNA (正プライマーF2 5'-GTGCTCCTATCAGTGCTTAT-3'、逆プライマーR2 5'-GCGTACGCACTGGGTTTT-3')又はMel5392ゲノムDNA(正プライマー5'-CTGCACCCACACCGAACCAAGAGAGAA-3'、逆プライマー5'-CGCCTGGAAATAGATGTTGTATCCTTT-3')のいずれかからの増幅生成物の両DNAストランドをシーケンシングすることによって確認した。
ミニ遺伝子を、異なる長さのPCR増幅生成物としてcDNA#11から調製した。全てのアンプリコンを、4つの異なるアンチセンスプライマー、EPR1 5'- CCGATTGTCACCCACAGTGAA-3'、EPR2 5'-GGGCAGGCTCAGGTA-3'、EPR3 5'-CTCGGGGGGAGTTCT-3'及びEPR2WT 5'- GGGCAGGCTCAGGTAGGTTTCCCG-3'と結合した同じセンスプライマーF2を用いて得た。後者は、野生型ヌクレオチド(EPR2WT プライマー中に下線)を含有するEP2wtミニ遺伝子の調製のために用いた。PCR生成物をpcDNA3.1/V5-His TOPOベクターにクローン化した。
Ii-EP2wt融合ミニ遺伝子を、AscI及びXbaI酵素で、TOPOベクターからのEP2wtミニ遺伝子の摘出によって得、その後、pEAK8.5/IiベクターのAscI及びXbaI部位への挿入物をクローン化した。この反応は、インフレーム融合構築物を生じさせた。
R−PTPK発現のノーザンブロット及びRT−PCR分析
Mel5392からのポリ(A)+RNA、同種メラノーマ及びPBL系を、上述したように単離した。RNAの総量を、RNAクエオス(RNAqueous:商標)−4PCRキット(アンビオン、オースチン、テキサス、78744、米国)を用いることによって単離した。ノーザンブロット実験のために、それぞれRNAサンプルの10μgを、1%ホルムアルデヒドアガロースゲル中で電気泳動に付し、ナイロン膜 (ハイボンド-N+、アマーシャムバイオサイエンシスインク、ピスカタウェイ、ニージャージ、08855-1327、米国)に転写した。プローブを、ランダムプライマー法(アマーシャム・バイオサイエンシス)により[アルファ-32P]CTPで標識し、プレ−ハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションを、ハイボンド-N+文献のガイドラインに従って行った。膜を、連続的なSSCの希釈溶液(0.03Mから 0.0015M)で4回洗浄した。プローブA及びCを、特異プライマーを用いてMel5392ポリ(A)+RNAのPCR増幅によって得た。遺伝子(遺伝子の241-1110塩基)の5'領域に対して特異的なプローブAを、プライマー正F1(5'-GGCGCTGCCTGCTTTTGT-3')及び逆R1 (5'-GGAGGAGCAATGGGTCTT-3')で合成した。2つの細胞内ホスファターゼドメイン(遺伝子の2925-4547塩基)をコードする領域に対して特異的なプローブCを、プライマー正F3 (5'-CTTGGGATGTAGCTAAAAAAGATCAAAATA-3')及び逆STOP (5'-CCAACTAAGATGATTCCAGGTACTCCAA-3')で誘導した。全ての増幅生成物を、プローブとして用いる前にシーケンシングした。DNAクローン#11(遺伝子の2084-2751塩基)をプローブBとして用いた。
Mel5392からのポリ(A)+RNA、同種メラノーマ及びPBL系を、上述したように単離した。RNAの総量を、RNAクエオス(RNAqueous:商標)−4PCRキット(アンビオン、オースチン、テキサス、78744、米国)を用いることによって単離した。ノーザンブロット実験のために、それぞれRNAサンプルの10μgを、1%ホルムアルデヒドアガロースゲル中で電気泳動に付し、ナイロン膜 (ハイボンド-N+、アマーシャムバイオサイエンシスインク、ピスカタウェイ、ニージャージ、08855-1327、米国)に転写した。プローブを、ランダムプライマー法(アマーシャム・バイオサイエンシス)により[アルファ-32P]CTPで標識し、プレ−ハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションを、ハイボンド-N+文献のガイドラインに従って行った。膜を、連続的なSSCの希釈溶液(0.03Mから 0.0015M)で4回洗浄した。プローブA及びCを、特異プライマーを用いてMel5392ポリ(A)+RNAのPCR増幅によって得た。遺伝子(遺伝子の241-1110塩基)の5'領域に対して特異的なプローブAを、プライマー正F1(5'-GGCGCTGCCTGCTTTTGT-3')及び逆R1 (5'-GGAGGAGCAATGGGTCTT-3')で合成した。2つの細胞内ホスファターゼドメイン(遺伝子の2925-4547塩基)をコードする領域に対して特異的なプローブCを、プライマー正F3 (5'-CTTGGGATGTAGCTAAAAAAGATCAAAATA-3')及び逆STOP (5'-CCAACTAAGATGATTCCAGGTACTCCAA-3')で誘導した。全ての増幅生成物を、プローブとして用いる前にシーケンシングした。DNAクローン#11(遺伝子の2084-2751塩基)をプローブBとして用いた。
正常及び腫瘍細胞系のPTPRK発現プロファイルのRT−PCR分析を、以下の条件下に、正プライマーF3及び逆プライマーRδ(5'-CACCCTCTCTTTCAGCCAT-3')で行った;2'94℃、24サイクル(1'94℃、2'54℃、3'72℃からなる)及び最終10'72℃。条件は、線形DNA増幅を得るために設定した。増幅DNAは、アガロースゲルに負荷され、臭化エチジウムで染色し、専用ソフトウェア(イメージマスターVDL-CS、アマーシャム・ファルマシア・バイオサイエンシス)で分析した。標準偏差は三重試験において5%以下であった。各サンプルの発現レベルを、β−アクリン遺伝子の発現レベルを考慮して、RNA完全性のために標準化した(反応条件: 4'94℃、21サイクル(1' 94℃、2'68℃、2'72℃からなる)、最終10'72℃、線形DNA増幅に対応)。
ペプチド合成。ペプチドを、一時的にNH2−末端保護のためのFmocを用いて、従来の固相ペプチド合成によって合成し、マススペクトル法により特徴づけされた。用いられた全てのペプチドは95%より純粋であった(ネオシステム、ストランスボーグ、フランス)。ペプチドを、使用直前に、DMSO中5mg/mLで溶解し、−20℃で保存し、10%ヒト血清が添加されたRPMIメディウムで希釈した。
エピトープ再構築分析。ペプチド認識を分析するため、5×103LCL15392又はLCL3700 細胞を、100μlのRPMI1640-10% PHS中で、96マイクロウェルに接種し、次いで、適当なペプチドを異なる濃度で適用した。ペプチドを、効果細胞を添加する前に、2時間37℃で負荷し、最終1:1のE:T比にした。上清を18時間後に採取し、IFN−γ量をERISAにより測定した(マブテックAB、ストックホルム、スウェーデン)。100nMでPYYFAAELPPRNLPEPペプチドを添加する前に、15分間、種々の濃度の競合ペプチドと5×103LCL15392又は5×103LCL3700をインキュベートすることにより、競合実験を行った。37℃でのさらなるインキュベートの1時間後、T細胞クローンを採集濃度1:1で添加した。
ptl5392 PBMCからのPTPRK特異T細胞の発生。術後12ヶ月で得たptl5392のPBMC(フォローアップの無病期間中)を、インビトロで、上述した(15)ように、PYYFAAELPPRNLPEPペプチドで刺激した。簡単に言えば、PBMC(2×106/ウェル)を、自己ペプチド−適用単細胞で毎週刺激した。各刺激の終わりに、ペプチド特異反応性をエリスポット分析によりモニターした。
IFN−γエリスポットアッセイ。96ウェルのニトロセルロースウェル(ミリリットル、ミリポア、ブレッドフォード、マサチューセッツ)を一晩、50μl/ウェルの8μg/ml抗−ヒトIFN−γmAb(マブテック)で被覆した。次いで、ウェルを洗浄し、アイスコブ(Iscove's)修飾DMEM(バイオウィッタカー)及び10%ヒトAB−血清で、2時間37℃でブロックした。T細胞(2×103又は2×104)を1.5×104ペプチド−適用自己LCL細胞と混合し、96プレコートウェルに接種した。それぞれ、T細胞をメディウムのみと又はヤマゴボウマイトジェンとインキュベートした(それぞれ、陰性又は陽性コントロールとしての役割を果たす)。37℃、5%CO2でのインキュベーションの24時間後、次いで、エリスポットを製造者の指示に従って行った。簡単に言えば、プレートを、PBS + 0.05% トゥウィーン20で6回洗浄した。ウェルを2時間37℃にて、50μl/ウェルのビオチニル化マウス抗ヒトIFN−γmAb(マブテック)とともに、2.5μg/mlの濃度で、インキュベートした。PBSで4回洗浄した後、1/1000に希釈された100μlのストレプトアビジン−アルカリホスホターゼ(150μg/ml)を室温で2時間添加した。PBSでの別の洗浄工程の後、100μl/ウェルのBCIP/NBT基質(バイオラッド、カリフォルニア、94547、米国)を各ウェルに10から20分間添加した。色発現を流水下で洗浄することにより停止させた。室温で乾燥した後、IFN−γ分泌T細胞を、自動イメージ分析システムエリスポットリーダー(AID、ストラスブルグ、ドイツ)を用いて計数した。各実験を3重で行った。
結果
腫瘍特異的CD4+T細胞クローン。40の腫瘍特異CD4+T細胞クローン (15392CD4+T)を、ptl5392のLN転移から単離したTILの限界希釈クローニングによって得、インビトロにおいて、2週間、自己腫瘍で刺激した。RT−PCRによるTCR分析は、全てのクローンがTCRAV及びTCRBVコンビネーション(表)にしたがった5つの異なるサブセットにおいて分類することができたことを示す。各サブセットを代表する単一のT細胞クローンにおいて、機能研究を行った。全てのクローンが、腫瘍刺激に対する応答において同一の機能活性を示すことが認められた。図1に報告したデータはクローンTB515で得られ、試験された全てのT細胞クローンを表わす。51Cr放出アッセイによって検出された溶解は、L243、HLA−DRの単形性の決定子に指向されたmAb の存在において強力に阻害されたため、自己メラノーマでの刺激において、全てのクローンが、Mel5392細胞に対してHLA−DR制限的溶解活性を発揮した(図1A)。さらに、腫瘍刺激において、腫瘍特異CD4+T細胞クローンは、また、IL-4及びTGFβではなく、INF-γ、GM−CSF、TNF-α及びIL−2を含むTh1プロファイルに適合性のあるサイトカインカクテルを放出した(図1B)。
腫瘍特異的CD4+T細胞クローン。40の腫瘍特異CD4+T細胞クローン (15392CD4+T)を、ptl5392のLN転移から単離したTILの限界希釈クローニングによって得、インビトロにおいて、2週間、自己腫瘍で刺激した。RT−PCRによるTCR分析は、全てのクローンがTCRAV及びTCRBVコンビネーション(表)にしたがった5つの異なるサブセットにおいて分類することができたことを示す。各サブセットを代表する単一のT細胞クローンにおいて、機能研究を行った。全てのクローンが、腫瘍刺激に対する応答において同一の機能活性を示すことが認められた。図1に報告したデータはクローンTB515で得られ、試験された全てのT細胞クローンを表わす。51Cr放出アッセイによって検出された溶解は、L243、HLA−DRの単形性の決定子に指向されたmAb の存在において強力に阻害されたため、自己メラノーマでの刺激において、全てのクローンが、Mel5392細胞に対してHLA−DR制限的溶解活性を発揮した(図1A)。さらに、腫瘍刺激において、腫瘍特異CD4+T細胞クローンは、また、IL-4及びTGFβではなく、INF-γ、GM−CSF、TNF-α及びIL−2を含むTh1プロファイルに適合性のあるサイトカインカクテルを放出した(図1B)。
突然変異PTPRK遺伝子はTB515エピトープをコードする。インビトロでのその成長能のために、TB515は、さらに選択され、メラノーマ特異抗原を分子的に特徴付けるために用いられた。この目的のために用いられた遺伝学的アプローチは、腫瘍抗原の同定のために使用された最近報告された方法論の最適化として開発された(18から20)。安定にCIITA cDNA (CIITA+293)でトランスフェクトされた293- EBNA1細胞を、cDNA腫瘍ライブラリのレシピエントとして用いた。抗-HLA−DR AbでのFACS分析は、CIITA+293細胞におけるクラスII HLAの発現における顕著な増加を示した(図示せず)。腫瘍誘発プロテインのクラスIIHLAへの経過経路のエントランスを強いるために、このように、一時的にわれわれのスクリーニング方法の感受性を改善し、われわれは、キメラ不変鎖(Ii)/腫瘍cDNAライブラリを構築した(22)。プールに分割されたcDNAライブラリを、次いで、同じ患者からクローン化されたDRB1*0102 又はDRB1*1001を含むプラスミド100ngとともに、CIITA+293 細胞にトランスフェクトした。
トランスフェクタントのスクリーニングは、DRB1*0102アレルでトランスフェクトされた場合(CIITA+-DRB1+293) でなく、CIITA+293にDRB1*1001 (CIITA+-DRB 10+293)でコトランスフェクトされた場合、TB515T細胞によって認識される一つの陽性cDNAクローン(cDNA#11)の単離を導く(図2A)。cDNA#11及びDRB1*1001が293にトランスフェクトされ、CIITA (wt293)によって修飾されない場合、認識は生じず、よって、さらにTB515活性に対する活性クラス11-HLA処理機構の必要性を確認する。
DNAシーケンシング分析は、cDNA#11が受容体様プロテイン−チロシンホスホターゼカッパ(PTPRK, ゲンバンクNM002844)の一部の領域に相同であり、タイプIIチロシンホスホターゼ(PTPs)は、膜貫通型レセプター様PTPの5つのサブファミリーの一つであることを示す(23)。腫瘍誘導cDNA#11は、公表されたNM002844 PTPRK cDNA配列の2084bp から2751 bpに伸張し、第4のC−モスト細胞内フィブロネクチンIII様ドメイン、全膜貫通型ドメイン及びまさに初期の細胞内配列をコードする領域を包含する。クローンは、遺伝子(NM-002844)の第4のフィブロネクチンIII様ドメインにおけるヌクレオチド2249での非保存的g→aポイント突然変異を示し、これは、対応蛋白におけるグリシンからアルギニンへの置換(G→R)を導いた(Mel5392から誘導されたPTPRKcDNAの配列のゲンバンク受け入れ番号はAF533875である)。
このアミノ酸変化が単一のヌクレオチド多形でないことを確認するために(しかし、腫瘍組織で発生する体性突然変異を表す)、突然変異を包含する領域は増幅され、ptl5392の PBL及びLCLの双方から得られたゲノムDNA又はcDNAのいずれかから開始するシーケンスが行われた。分析されたサンプルは、いずれもg→aへの転移を示さず、野生型配列においてのみ認められた(図示せず)。さらに、10の追加メラノーマ細胞系から誘導されたDNA及びcDNAを、同様に分析したが、それらのいずれもヌクレオチド2249にいかなる突然変異も表さなかった。
不変の鎖配列は、R−PTPK誘導エピトープのHLA-クラスII提示に必要でない。cDNAクローン#11を含む組換えスラスミドの配列分析は、Ii鎖翻訳がPTPRK蛋白の適当な翻訳に対応するフレームに関連してシフトしたことを示す。したがって、われわれは、さらなる内部ATGによって指向される追加のオープンリードフレームの組換えプラスミドにおける存在を仮定した。CDNA#11の配列を分析することによって、われわれは、ATG(ゲンバンクNM002844配列における2165位)がPTPRK遺伝子のメチオニンからまず開始する真性でフレームされていたコザック様配列((g/a) nnatgg)を見出した。この内部ATGコドンの自給充足的翻訳能を検証するためにcDNA#11をpEAK8.5/Iiベクターから切除し、Ii欠損発現ベクターpcDNA3.1に挿入した。次いで、新たな組換えプラスミドを、DRB1*1001 とともにCIITA+293細胞にトランスフェクトした場合、TB515活性化を引き起こす能力について評価した(図2B)。予想したように、cDNA#11は、特異DRB1*1001-拘束型においてTB515クローンによってIi鎖誘導INF−γの不存在下でクローン化した。認識は、pEAK8.5/Iiベクター又はMel5392腫瘍において、cDNA#11のそれと同じくらい有効であった(図2B)ことは、Ii開始コドンの不存在下において、cDNC#11はその自体の内部ATGから翻訳され得、cDNA#11は、自然に処理することができ、本質的にIi鎖媒介細胞内再指向を必要とせずに、HLA−クラスII経路において提示したことを示す。
R−PTPK mRNAの発現パターン。Mel5392におけるPTPRK特異転写についてのより多くの情報を得るため、ノーザンブロット分析を行った(図3)。全PTPRKmRNAを包含するために、PTPRK遺伝子の種々の領域にマッピングした3種の特異プローブの等モル混合物を用いてハイブリダイゼーションを行った。また、試験したサンプルは、PBLポリ(A)+RNAをPTPRK発現の陰性コントロールとして含み、形質変換え表皮性細胞系A431を全長転写の陽性コントロールとして含んだ(この細胞系は、PTPRK遺伝子発現の高レベルを有することが知られていたため(24))。十分なRNAがインビトロの成長細胞から得られなかったため、メラニン細胞は、分析することができなかった。予想したように、PBLにおいて、十分なハイブリダイゼーションバンドが観察されず、よって、先のデータ(24)を確認し、一方、A431 及びMe15392ポリ(A)+RNAの双方が、かなり複雑なパターンを生じさせた(図3A)。1800bp及び1000bp周辺のさらなる特異バンドが明確に検出可能であり、両サンプルは、全長転写に対応する5600bp付近に強度のシグナルを現した。これらの結果の全てはともに、Me15392が完全なPTPRK蛋白を発現するかもしれず、一方、一部のmRNA転写の生物学的重要性が扱われるべきまま残ることを示す。
他の腫瘍及び非腫瘍細胞におけるPTPRKmRNAの発現をRT−PCRによって研究した。RT−PCR増幅を、細胞内でマッピングするプライマーペアF3/Rδ、Nモストホスファターゼドメイン(増幅生成物長650bp)を用いて、総RNAから行った。PTPRK遺伝子に高い特異性となるようにプライマーを設計した。それらの特性を、実験的に確認し、異なる細胞系から得られた増幅産物をシーケンシングし、PTPRKにのみ応答することを示し、一方、他のR−PTP又はPTP遺伝子の配列は(これらはPTPRKに高い相同性を有するものであるが)、認められなかった。反応条件を、線形DNA増幅を有するように設定し、mRNAの同程度の量を、β−アクチン増幅によって評価されたように各細胞系から用いた。メラニン細胞(FM2093細胞系)において明確に検出可能である一方、PTPRKは試験した10のメラノーマ細胞系において異なって発現し、その5つはPBL(これはノーザンブロットにおいて陰性であった(図3A))から得られたそれと比較して、わずかに検出可能バンドを示すのみであった。いくつかの代表的な例を図3Bに示す。
TB515に対するエピトープを再構築するPTPRK誘導ペプチドの同定
T細胞認識のためのG→R突然変異の重要性を評価するために、cDNA#11の野生型(突然変異していない)異形をPCR反応によって合成し、CIITA+293細胞にDRB1*1001cDNAでコトランスフェクトした。腫瘍特異15392CD4+Tクローンによる野生型配列の認識は観察されなかった(データは示さない)。よって、エピトープ形成において突然変異アミノ酸の直接的な役割を示唆する。さらにcDNA#11のエピトープコード領域を際立たせるために、ミニ遺伝子の列を、突然変異の下流をマッピングする種々のネスト化逆プライマーに結合した同一の正プライマー(F2)を用いて、cDNA#11のPCR反応によって合成した(図4)cDNA#11のATG開始コドンを全て含むミニ遺伝子を発現ベクターpcDNA3/TOPO (インビトロゲン)にクローン化し、DRB1*0102又はDRB1*1001のいずれかを発現するCIITA+ 293にトランスフェクトし、最終的に、TB515認識を評価した。EP2ミニ遺伝子は、認識された最も短い構成であった。予想したように、EP2ミニ遺伝子(EP2WT)の野生型異形は、野生型ヌクレオチド(a/gミスマッチ)を有する逆プライマーEPR2WTを用いて得られるが、不変鎖を有するまたは不変鎖なしに発現ベクターにクローン化した場合、TB515リンパ球によって認識されなかった。
T細胞認識のためのG→R突然変異の重要性を評価するために、cDNA#11の野生型(突然変異していない)異形をPCR反応によって合成し、CIITA+293細胞にDRB1*1001cDNAでコトランスフェクトした。腫瘍特異15392CD4+Tクローンによる野生型配列の認識は観察されなかった(データは示さない)。よって、エピトープ形成において突然変異アミノ酸の直接的な役割を示唆する。さらにcDNA#11のエピトープコード領域を際立たせるために、ミニ遺伝子の列を、突然変異の下流をマッピングする種々のネスト化逆プライマーに結合した同一の正プライマー(F2)を用いて、cDNA#11のPCR反応によって合成した(図4)cDNA#11のATG開始コドンを全て含むミニ遺伝子を発現ベクターpcDNA3/TOPO (インビトロゲン)にクローン化し、DRB1*0102又はDRB1*1001のいずれかを発現するCIITA+ 293にトランスフェクトし、最終的に、TB515認識を評価した。EP2ミニ遺伝子は、認識された最も短い構成であった。予想したように、EP2ミニ遺伝子(EP2WT)の野生型異形は、野生型ヌクレオチド(a/gミスマッチ)を有する逆プライマーEPR2WTを用いて得られるが、不変鎖を有するまたは不変鎖なしに発現ベクターにクローン化した場合、TB515リンパ球によって認識されなかった。
これらのトランスフェクション実験を、図4に示したように、突然変異を含む26アミノ酸−長ペプチドに対して部分的に免疫原性のアミノ酸領域を際立たせた。TB515エピトープを同定するために、同定した26のアミノ酸領域に及ぶ、ペプチドをオーバーラップするいくつかのヘキサデカマーを合成した。ペプチドを、抗メラノーマTB515クローンによる認識に対してインビトロでの自己LCLを感作するその能力について、種々の用量で評価した。試験したヘキサデカマーペプチドのうち、PYYFAAELPPRNLPEP (PTPRK (667-682))(それは蛋白のアミノ酸667から682に伸張し、突然変異体を含む(図5、太字))がTB515クローンによる強力なINF−γ放出を生じさせる一つであった。実際、滴定実験では、このペプチドを、10nMのような低い濃度でTB515細胞によって検出することができ、100nMでその半値作用に達することを示す(図5A)。突然変異したアルギニン残基の免疫原性ペプチドにおける野生型グリシンでの置換(図5A)は、促進能を完全に無効にし、よって、T細胞媒介認識に対する突然変異の関与度を明確に示す。さらに、5'又は3'末端のいずれかにおいてアミノ酸残基を徐々に欠損するペプチドでの実験(図5B及び5C)は、最小のエピトープコア又は候補アンカーアミノ酸の双方の同定に照準を向けた。特に、Y669 (図5B)又はL679及びN678 (図5C)の直接関与しないアミノ酸の欠損又は置換は、PTPRK (667-682)ペプチドのTB515クローンを刺激する能力に強力に影響を与え、よって、HLA−DR10/ペプチド/TCR複合体の形成における3、11及び12位でのこれらアミノ酸の役割を示唆する。競合アッセイにおいて、それらは、クローンTB515によってPTPRK (667-682)ペプチドの認識を有効に阻害した (図5D)ので、野生型ペプチドPYYFAAELPPGNLPEP及びGによって置換されたY669を有するPTPRK (667-682) は、双方ともHLA−DR10を結合することができた。
異なるTCRを有するとして説明された他の4つのT細胞クロ−ンは、現に、同じエピトープに対して指向し、それらは野生型ペプチドを認識せず、及びそれらの全ては、TB515について観察された(データは示さない)ような突然変異ペプチドに対する同様の親和性を示した。さらに、残基Y669で置換基を有するPTPRK (667-682)ペプチドは、TB48クローンによって有効に認識され、Y669(TB515媒介認識にとって必須ではないが)が、HLA−DR10にPTPRK (667-682)ペプチドの結合能の決定的な影響を与えなかった(図6)。
Ptl5392は、誘導されたPTPRKに対する全身性免疫性を発生し、HLA−DR100はエピトープを提示した。ptl5392も全身性エピトープ特異性T細胞免疫性を発現したかどうかを確認するために、リンパ節転移の切除術後12ヶ月で得たPBMCをインビトロで1μMでのPYYFAAELPPRNLPEPペプチドとともに培養した。インビトロでのペプチドパルス自己単細胞での刺激の3週間後、培養T細胞は、エリスポットアッセイによって検出されたようにペプチド特異性反応性を示し、ペプチド特異T細胞の末梢血中での存在を示す(図7)。これらの細胞は、また、HLA−DR拘束型において自己腫瘍を認識し得た。逆に、DRB1*1001陽性の健康なドナーから得たPBMCにおいては、特異反応性は検出されなかった。
機能的特徴づけ及び腫瘍特異CD4+TクローンのTCA発現
b 各サブセットに対する腫瘍特異性クローン(さらに培養し、インビトロで伸張)を示す。
c TCRの分析を、TCR Vαのパネル及Vβ特異的プライマー(材料及び方法参照)を用いてRT−PCR法によって行った。
d示されたクローンの自己腫瘍の溶解能を、E:T比30:1での5時間の51Cr-放出アッセイで試験した。データを溶解%で示す。丸カッコ中の数字は10μg/mlの最終濃度で用いたモノクローナル抗-HLA−DR L343 mAbの存在下で行った溶解%である。
e サイトカイン放出アッセイを、示されたT細胞クローンの自己腫瘍を認識する能力を評価するために行った(詳しくは材料と方法参照)。10μg/mlの最終濃度で用いたL343の不存在下または存在下(丸カッコ中の値)において腫瘍刺激の後のIFN−γ放出量を、pg/mlで表す。
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Claims (14)
- 配列番号1のPTPRKGly677→Arg682免疫原性ペプチド。
- 請求項1のペプチドに選択的に結合するモノクローナルもしくはポリクローナル抗体又はそれらの活性フラグメント。
- 請求項1のペプチドをコードする単離核酸分子。
- 請求項3の核酸分子を含む発現ベクター。
- 請求項4のベクターを含むホストセル。
- HLA−クラスII分子関連の配列番号1のペプチドを選択的に認識し、結合することができる単離CD4+Tリンパ球。
- ペプチド/HLA−DRβ1*1001複合体を選択的に認識し、結合する請求項6のTリンパ球。
- HLA−DRβ1 * 1001分子に結合する配列番号1のペプチドを備える抗原提示細胞。
- 配列番号1のペプチド又はそれをコードする核酸分子を含有し、医薬的に許容される賦形剤と混合物における医薬組成物。
- ワクチンの形態の請求項9の医薬組成物。
- 癌の予防、治療的措置のための医薬を製造するための、配列番号1、それをコードする核酸分子、請求項8のAPC又は請求項6又は7のTリンパ球の使用。
- メラノーマ発現PTPRKGly677→Arg682の予防又は治療的処置ための請求項11に記載の使用。
- 診断組成物の製造のための、配列番号1又はそれをコードする核酸分子の使用。
- 診断組成物を、メラノーマ発現PTPRKGly677→Arg682の特徴づけに用いる請求項13の使用。
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