FI123050B - Melanooma-antigeeni - Google Patents
Melanooma-antigeeni Download PDFInfo
- Publication number
- FI123050B FI123050B FI20115005A FI20115005A FI123050B FI 123050 B FI123050 B FI 123050B FI 20115005 A FI20115005 A FI 20115005A FI 20115005 A FI20115005 A FI 20115005A FI 123050 B FI123050 B FI 123050B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- seq
- cells
- peptide
- amino acid
- mart
- Prior art date
Links
- 102000007557 Melanoma-Specific Antigens Human genes 0.000 title description 24
- 108010071463 Melanoma-Specific Antigens Proteins 0.000 title description 24
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 533
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 331
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 271
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 268
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 246
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 220
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 181
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 178
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 124
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 124
- 210000003171 tumor-infiltrating lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 114
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 111
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 110
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 110
- 102100022430 Melanocyte protein PMEL Human genes 0.000 claims description 88
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 86
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 85
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 84
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 67
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 65
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 57
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 44
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 43
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 42
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 39
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 39
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 38
- -1 aliphatic amino acid Chemical class 0.000 claims description 30
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 29
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 29
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 29
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 28
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 28
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 28
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 28
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 28
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 28
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 27
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 27
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 27
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 27
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 26
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 26
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 25
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 24
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N lysine Chemical compound NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 23
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 22
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 18
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 16
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 16
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 15
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 14
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 13
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 12
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 12
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 108010072094 gp100(280-288) melanoma antigen peptide Proteins 0.000 claims description 11
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 10
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 10
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 9
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 8
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 8
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 5
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 claims 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 claims 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 124
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 89
- 108010074032 HLA-A2 Antigen Proteins 0.000 description 70
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 69
- 102000025850 HLA-A2 Antigen Human genes 0.000 description 68
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 47
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 42
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 37
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 37
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 36
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 36
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 34
- 102000016200 MART-1 Antigen Human genes 0.000 description 34
- 108010010995 MART-1 Antigen Proteins 0.000 description 34
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 34
- NEHKZPHIKKEMAZ-ZFVKSOIMSA-N (2s)-2-[[(2s,3r)-2-[[(2s)-2-[[(2s,3s)-2-[[2-[[(2s,3s)-2-[[2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-azaniumylpropanoyl]amino]propanoyl]amino]acetyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-methylb Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O NEHKZPHIKKEMAZ-ZFVKSOIMSA-N 0.000 description 32
- 210000002752 melanocyte Anatomy 0.000 description 30
- 108091005601 modified peptides Proteins 0.000 description 30
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 29
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 29
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 28
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 28
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 27
- 235000005772 leucine Nutrition 0.000 description 26
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 description 25
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 description 25
- 229960004295 valine Drugs 0.000 description 25
- 235000014393 valine Nutrition 0.000 description 25
- GFHXZNVJIKMAGO-IHRRRGAJSA-N Pro-Phe-Ser Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O GFHXZNVJIKMAGO-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 24
- 101100221606 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) COS7 gene Proteins 0.000 description 24
- 235000014705 isoleucine Nutrition 0.000 description 24
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 23
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 description 23
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 23
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 22
- 235000006109 methionine Nutrition 0.000 description 22
- 229960002449 glycine Drugs 0.000 description 21
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 21
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 19
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 19
- BMPPMAOOKQJYIP-WMZOPIPTSA-N Tyr-Trp Chemical compound C([C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C([O-])=O)C1=CC=C(O)C=C1 BMPPMAOOKQJYIP-WMZOPIPTSA-N 0.000 description 18
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 18
- BRPMXFSTKXXNHF-IUCAKERBSA-N (2s)-1-[2-[[(2s)-pyrrolidine-2-carbonyl]amino]acetyl]pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)CNC(=O)[C@H]1NCCC1 BRPMXFSTKXXNHF-IUCAKERBSA-N 0.000 description 17
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 17
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 17
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 16
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 16
- 229960003646 lysine Drugs 0.000 description 16
- 101100342977 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) leu-1 gene Proteins 0.000 description 15
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 15
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 15
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 15
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 15
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 14
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 14
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 14
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 14
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 14
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 13
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 13
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 13
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 13
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 13
- 108010014614 prolyl-glycyl-proline Proteins 0.000 description 13
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 12
- PHRWFSFCNJPWRO-PPCPHDFISA-N Ile-Leu-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)N PHRWFSFCNJPWRO-PPCPHDFISA-N 0.000 description 12
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 12
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 12
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 12
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 12
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 12
- 229960001153 serine Drugs 0.000 description 12
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 12
- 101000620359 Homo sapiens Melanocyte protein PMEL Proteins 0.000 description 11
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 11
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 11
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 11
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 11
- 206010027480 Metastatic malignant melanoma Diseases 0.000 description 10
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 10
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 10
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 10
- 208000021039 metastatic melanoma Diseases 0.000 description 10
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 description 10
- 235000008729 phenylalanine Nutrition 0.000 description 10
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 10
- 241000894007 species Species 0.000 description 10
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 description 10
- 108010038745 tryptophylglycine Proteins 0.000 description 10
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 description 10
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 description 10
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 9
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 9
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 9
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 9
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 9
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 8
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- HMHRTKOWRUPPNU-RCOVLWMOSA-N Gly-Ile-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(O)=O HMHRTKOWRUPPNU-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 8
- MQFGXJNSUJTXDT-QSFUFRPTSA-N Ile-Gly-Ile Chemical compound N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)O MQFGXJNSUJTXDT-QSFUFRPTSA-N 0.000 description 8
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 8
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 8
- 230000003302 anti-idiotype Effects 0.000 description 8
- 229960005261 aspartic acid Drugs 0.000 description 8
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 8
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 8
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 8
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 8
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 8
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 8
- 230000004044 response Effects 0.000 description 8
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 8
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 8
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 8
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 7
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 7
- UESJMAMHDLEHGM-NHCYSSNCSA-N Gly-Ile-Leu Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O UESJMAMHDLEHGM-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 7
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 7
- FZWVCYCYWCLQDH-NHCYSSNCSA-N Ile-Leu-Gly Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)O)N FZWVCYCYWCLQDH-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 7
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 7
- 230000003127 anti-melanomic effect Effects 0.000 description 7
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 7
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 7
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 7
- 108010089804 glycyl-threonine Proteins 0.000 description 7
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 7
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 7
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 7
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 7
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 7
- 102000008949 Histocompatibility Antigens Class I Human genes 0.000 description 6
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 6
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 6
- 102000003425 Tyrosinase Human genes 0.000 description 6
- 108060008724 Tyrosinase Proteins 0.000 description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 description 6
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 6
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 6
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 6
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 6
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 5
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 5
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 5
- 101710124413 Portal protein Proteins 0.000 description 5
- 101710137389 Probable tail terminator protein Proteins 0.000 description 5
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 5
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 5
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 108010060199 cysteinylproline Proteins 0.000 description 5
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 5
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 5
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 5
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 5
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 4
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 4
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 4
- 102000011786 HLA-A Antigens Human genes 0.000 description 4
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 4
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 4
- SXAGUVRFGJSFKC-ZEILLAHLSA-N Thr-His-Thr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O SXAGUVRFGJSFKC-ZEILLAHLSA-N 0.000 description 4
- KSCVLGXNQXKUAR-JYJNAYRXSA-N Tyr-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O KSCVLGXNQXKUAR-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 4
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 4
- MIKHIIQMRFYVOR-RCWTZXSCSA-N Val-Pro-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](C(C)C)N)O MIKHIIQMRFYVOR-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 4
- 108010005233 alanylglutamic acid Proteins 0.000 description 4
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 4
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 4
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000001400 expression cloning Methods 0.000 description 4
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 4
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 4
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 4
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 4
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 4
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 108010031719 prolyl-serine Proteins 0.000 description 4
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 4
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 4
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 4
- 101150084750 1 gene Proteins 0.000 description 3
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 3
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 3
- WVLZTXGTNGHPBO-SRVKXCTJSA-N Cys-Leu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O WVLZTXGTNGHPBO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 3
- KOSRFJWDECSPRO-WDSKDSINSA-N Glu-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-WDSKDSINSA-N 0.000 description 3
- NNCSJUBVFBDDLC-YUMQZZPRSA-N Gly-Leu-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O NNCSJUBVFBDDLC-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 3
- OLIFSFOFKGKIRH-WUJLRWPWSA-N Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN OLIFSFOFKGKIRH-WUJLRWPWSA-N 0.000 description 3
- 102100028976 HLA class I histocompatibility antigen, B alpha chain Human genes 0.000 description 3
- 108010075704 HLA-A Antigens Proteins 0.000 description 3
- 108010088652 Histocompatibility Antigens Class I Proteins 0.000 description 3
- 101000654734 Homo sapiens Septin-4 Proteins 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- JLWZLIQRYCTYBD-IHRRRGAJSA-N Leu-Lys-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O JLWZLIQRYCTYBD-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 3
- WXZOHBVPVKABQN-DCAQKATOSA-N Leu-Met-Asp Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N WXZOHBVPVKABQN-DCAQKATOSA-N 0.000 description 3
- AIQWYVFNBNNOLU-RHYQMDGZSA-N Leu-Thr-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O AIQWYVFNBNNOLU-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 3
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 3
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 3
- IOQWIOPSKJOEKI-SRVKXCTJSA-N Lys-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O IOQWIOPSKJOEKI-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 3
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 3
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-proline Natural products NCC(=O)N1CCCC1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 3
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 3
- RWCOTTLHDJWHRS-YUMQZZPRSA-N Pro-Pro Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1NCCC1 RWCOTTLHDJWHRS-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 3
- BGWKULMLUIUPKY-BQBZGAKWSA-N Pro-Ser-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 BGWKULMLUIUPKY-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 3
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 3
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 3
- 102100032743 Septin-4 Human genes 0.000 description 3
- NFDYGNFETJVMSE-BQBZGAKWSA-N Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO NFDYGNFETJVMSE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- VPZKQTYZIVOJDV-LMVFSUKVSA-N Thr-Ala Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O VPZKQTYZIVOJDV-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 3
- BNGDYRRHRGOPHX-IFFSRLJSSA-N Thr-Glu-Val Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O)C(O)=O BNGDYRRHRGOPHX-IFFSRLJSSA-N 0.000 description 3
- XKWABWFMQXMUMT-HJGDQZAQSA-N Thr-Pro-Glu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O XKWABWFMQXMUMT-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 3
- UJRIVCPPPMYCNA-HOCLYGCPSA-N Trp-Leu-Gly Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)NCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)N UJRIVCPPPMYCNA-HOCLYGCPSA-N 0.000 description 3
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 3
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010092854 aspartyllysine Proteins 0.000 description 3
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 3
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 230000005859 cell recognition Effects 0.000 description 3
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 108010054813 diprotin B Proteins 0.000 description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 3
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 3
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 3
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 3
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 3
- 108010074027 glycyl-seryl-phenylalanine Proteins 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010025306 histidylleucine Proteins 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 3
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 3
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 3
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 108010056582 methionylglutamic acid Proteins 0.000 description 3
- 229940031348 multivalent vaccine Drugs 0.000 description 3
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 3
- 108010077112 prolyl-proline Proteins 0.000 description 3
- 108010070643 prolylglutamic acid Proteins 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 3
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 3
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 3
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 3
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 3
- 108010020532 tyrosyl-proline Proteins 0.000 description 3
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- 210000004885 white matter Anatomy 0.000 description 3
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 2
- 102100022900 Actin, cytoplasmic 1 Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- BTYTYHBSJKQBQA-GCJQMDKQSA-N Ala-Asp-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](C)N)O BTYTYHBSJKQBQA-GCJQMDKQSA-N 0.000 description 2
- XYKDZXKKYOOTGC-FXQIFTODSA-N Ala-Cys-Met Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)N XYKDZXKKYOOTGC-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- VBRDBGCROKWTPV-XHNCKOQMSA-N Ala-Glu-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N VBRDBGCROKWTPV-XHNCKOQMSA-N 0.000 description 2
- PUBLUECXJRHTBK-ACZMJKKPSA-N Ala-Glu-Ser Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O PUBLUECXJRHTBK-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 2
- OMMDTNGURYRDAC-NRPADANISA-N Ala-Glu-Val Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O OMMDTNGURYRDAC-NRPADANISA-N 0.000 description 2
- VQAVBBCZFQAAED-FXQIFTODSA-N Ala-Pro-Asn Chemical compound C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N VQAVBBCZFQAAED-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- FFZJHQODAYHGPO-KZVJFYERSA-N Ala-Pro-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](C)N FFZJHQODAYHGPO-KZVJFYERSA-N 0.000 description 2
- PEEYDECOOVQKRZ-DLOVCJGASA-N Ala-Ser-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O PEEYDECOOVQKRZ-DLOVCJGASA-N 0.000 description 2
- WNHNMKOFKCHKKD-BFHQHQDPSA-N Ala-Thr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O WNHNMKOFKCHKKD-BFHQHQDPSA-N 0.000 description 2
- NLYYHIKRBRMAJV-AEJSXWLSSA-N Ala-Val-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N NLYYHIKRBRMAJV-AEJSXWLSSA-N 0.000 description 2
- WYBVBIHNJWOLCJ-IUCAKERBSA-N Arg-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N WYBVBIHNJWOLCJ-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- YKZJPIPFKGYHKY-DCAQKATOSA-N Arg-Leu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O YKZJPIPFKGYHKY-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- RZNAMKZJPBQWDJ-SRVKXCTJSA-N Asn-Lys-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N RZNAMKZJPBQWDJ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- PQKSVQSMTHPRIB-ZKWXMUAHSA-N Asn-Val-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O PQKSVQSMTHPRIB-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- GBAWQWASNGUNQF-ZLUOBGJFSA-N Asp-Ala-Cys Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N GBAWQWASNGUNQF-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 2
- NJIKKGUVGUBICV-ZLUOBGJFSA-N Asp-Ala-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O NJIKKGUVGUBICV-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 2
- OMMIEVATLAGRCK-BYPYZUCNSA-N Asp-Gly-Gly Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O OMMIEVATLAGRCK-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- POTCZYQVVNXUIG-BQBZGAKWSA-N Asp-Gly-Pro Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O POTCZYQVVNXUIG-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010004950 Birth mark Diseases 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 241001227713 Chiron Species 0.000 description 2
- XTHUKRLJRUVVBF-WHFBIAKZSA-N Cys-Gly-Ser Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XTHUKRLJRUVVBF-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- 108010090461 DFG peptide Proteins 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 2
- 208000006168 Ewing Sarcoma Diseases 0.000 description 2
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 2
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 2
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 2
- UTKUTMJSWKKHEM-WDSKDSINSA-N Glu-Ala-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O UTKUTMJSWKKHEM-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- OPAINBJQDQTGJY-JGVFFNPUSA-N Glu-Gly-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)C(=O)O OPAINBJQDQTGJY-JGVFFNPUSA-N 0.000 description 2
- UGSVSNXPJJDJKL-SDDRHHMPSA-N Glu-Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N UGSVSNXPJJDJKL-SDDRHHMPSA-N 0.000 description 2
- HQOGXFLBAKJUMH-CIUDSAMLSA-N Glu-Met-Ser Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N HQOGXFLBAKJUMH-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- BDISFWMLMNBTGP-NUMRIWBASA-N Glu-Thr-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O BDISFWMLMNBTGP-NUMRIWBASA-N 0.000 description 2
- BRFJMRSRMOMIMU-WHFBIAKZSA-N Gly-Ala-Asn Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O BRFJMRSRMOMIMU-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- JXYMPBCYRKWJEE-BQBZGAKWSA-N Gly-Arg-Ala Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O JXYMPBCYRKWJEE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- HDNXXTBKOJKWNN-WDSKDSINSA-N Gly-Glu-Asn Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O HDNXXTBKOJKWNN-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- XPJBQTCXPJNIFE-ZETCQYMHSA-N Gly-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CN XPJBQTCXPJNIFE-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 2
- QSQXZZCGPXQBPP-BQBZGAKWSA-N Gly-Pro-Cys Chemical compound C1C[C@H](N(C1)C(=O)CN)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O QSQXZZCGPXQBPP-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- YOBGUCWZPXJHTN-BQBZGAKWSA-N Gly-Ser-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N YOBGUCWZPXJHTN-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- SOEGEPHNZOISMT-BYPYZUCNSA-N Gly-Ser-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O SOEGEPHNZOISMT-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- JSLVAHYTAJJEQH-QWRGUYRKSA-N Gly-Ser-Phe Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JSLVAHYTAJJEQH-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- TVTZEOHWHUVYCG-KYNKHSRBSA-N Gly-Thr-Thr Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O TVTZEOHWHUVYCG-KYNKHSRBSA-N 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100036242 HLA class II histocompatibility antigen, DQ alpha 2 chain Human genes 0.000 description 2
- 108010058607 HLA-B Antigens Proteins 0.000 description 2
- 108010052199 HLA-C Antigens Proteins 0.000 description 2
- PROLDOGUBQJNPG-RWMBFGLXSA-N His-Arg-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)N)C(=O)O PROLDOGUBQJNPG-RWMBFGLXSA-N 0.000 description 2
- VIJMRAIWYWRXSR-CIUDSAMLSA-N His-Ser-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 VIJMRAIWYWRXSR-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- 101000930801 Homo sapiens HLA class II histocompatibility antigen, DQ alpha 2 chain Proteins 0.000 description 2
- SPQWWEZBHXHUJN-KBIXCLLPSA-N Ile-Glu-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SPQWWEZBHXHUJN-KBIXCLLPSA-N 0.000 description 2
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 2
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- RNKSNIBMTUYWSH-YFKPBYRVSA-N L-prolylglycine Chemical compound [O-]C(=O)CNC(=O)[C@@H]1CCC[NH2+]1 RNKSNIBMTUYWSH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- JUWJEAPUNARGCF-DCAQKATOSA-N Leu-Arg-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O JUWJEAPUNARGCF-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- HBJZFCIVFIBNSV-DCAQKATOSA-N Leu-Arg-Asn Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O HBJZFCIVFIBNSV-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- ULXYQAJWJGLCNR-YUMQZZPRSA-N Leu-Asp-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O ULXYQAJWJGLCNR-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- YFBBUHJJUXXZOF-UWVGGRQHSA-N Leu-Gly-Pro Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O YFBBUHJJUXXZOF-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- POZULHZYLPGXMR-ONGXEEELSA-N Leu-Gly-Val Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O POZULHZYLPGXMR-ONGXEEELSA-N 0.000 description 2
- LVTJJOJKDCVZGP-QWRGUYRKSA-N Leu-Lys-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(O)=O LVTJJOJKDCVZGP-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- KFKWRHQBZQICHA-STQMWFEESA-N Leu-Phe Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 KFKWRHQBZQICHA-STQMWFEESA-N 0.000 description 2
- QMKFDEUJGYNFMC-AVGNSLFASA-N Leu-Pro-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O QMKFDEUJGYNFMC-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- BMVFXOQHDQZAQU-DCAQKATOSA-N Leu-Pro-Asp Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N BMVFXOQHDQZAQU-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- MUCIDQMDOYQYBR-IHRRRGAJSA-N Leu-Pro-His Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O)N MUCIDQMDOYQYBR-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- RGUXWMDNCPMQFB-YUMQZZPRSA-N Leu-Ser-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O RGUXWMDNCPMQFB-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- SBANPBVRHYIMRR-UHFFFAOYSA-N Leu-Ser-Pro Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(CO)C(=O)N1CCCC1C(O)=O SBANPBVRHYIMRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LRKCBIUDWAXNEG-CSMHCCOUSA-N Leu-Thr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O LRKCBIUDWAXNEG-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 2
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 2
- NQCJGQHHYZNUDK-DCAQKATOSA-N Lys-Arg-Ser Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)CCCN=C(N)N NQCJGQHHYZNUDK-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- OZVXDDFYCQOPFD-XQQFMLRXSA-N Lys-Val-Pro Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N OZVXDDFYCQOPFD-XQQFMLRXSA-N 0.000 description 2
- 108700005089 MHC Class I Genes Proteins 0.000 description 2
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- OSOLWRWQADPDIQ-DCAQKATOSA-N Met-Asp-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O OSOLWRWQADPDIQ-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- SXWQMBGNFXAGAT-FJXKBIBVSA-N Met-Gly-Thr Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O SXWQMBGNFXAGAT-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 2
- HZVXPUHLTZRQEL-UWVGGRQHSA-N Met-Leu-Gly Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O HZVXPUHLTZRQEL-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- VSJAPSMRFYUOKS-IUCAKERBSA-N Met-Pro-Gly Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O VSJAPSMRFYUOKS-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- LUYURUYVNYGKGM-RCWTZXSCSA-N Met-Pro-Thr Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O LUYURUYVNYGKGM-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 2
- DBMLDOWSVHMQQN-XGEHTFHBSA-N Met-Ser-Thr Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O DBMLDOWSVHMQQN-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 2
- NDJSSFWDYDUQID-YTWAJWBKSA-N Met-Thr-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCSC)N)O NDJSSFWDYDUQID-YTWAJWBKSA-N 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- WYBVBIHNJWOLCJ-UHFFFAOYSA-N N-L-arginyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCCN=C(N)N WYBVBIHNJWOLCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- WFDAEEUZPZSMOG-SRVKXCTJSA-N Phe-Cys-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WFDAEEUZPZSMOG-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- JEBWZLWTRPZQRX-QWRGUYRKSA-N Phe-Gly-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O JEBWZLWTRPZQRX-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- SMFGCTXUBWEPKM-KBPBESRZSA-N Phe-Leu-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 SMFGCTXUBWEPKM-KBPBESRZSA-N 0.000 description 2
- MVIJMIZJPHQGEN-IHRRRGAJSA-N Phe-Ser-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H]([NH3+])CC1=CC=CC=C1 MVIJMIZJPHQGEN-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- SGCZFWSQERRKBD-BQBZGAKWSA-N Pro-Asp-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 SGCZFWSQERRKBD-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- LGSANCBHSMDFDY-GARJFASQSA-N Pro-Glu-Pro Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)O LGSANCBHSMDFDY-GARJFASQSA-N 0.000 description 2
- AFXCXDQNRXTSBD-FJXKBIBVSA-N Pro-Gly-Thr Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O AFXCXDQNRXTSBD-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 2
- FMLRRBDLBJLJIK-DCAQKATOSA-N Pro-Leu-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 FMLRRBDLBJLJIK-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- VTFXTWDFPTWNJY-RHYQMDGZSA-N Pro-Leu-Thr Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O VTFXTWDFPTWNJY-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 2
- XQPHBAKJJJZOBX-SRVKXCTJSA-N Pro-Lys-Glu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O XQPHBAKJJJZOBX-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- KDBHVPXBQADZKY-GUBZILKMSA-N Pro-Pro-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1NCCC1 KDBHVPXBQADZKY-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- SNGZLPOXVRTNMB-LPEHRKFASA-N Pro-Ser-Pro Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)O SNGZLPOXVRTNMB-LPEHRKFASA-N 0.000 description 2
- KHRLUIPIMIQFGT-AVGNSLFASA-N Pro-Val-Leu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O KHRLUIPIMIQFGT-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 2
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 2
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 2
- IDQFQFVEWMWRQQ-DLOVCJGASA-N Ser-Ala-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O IDQFQFVEWMWRQQ-DLOVCJGASA-N 0.000 description 2
- SFTZWNJFZYOLBD-ZDLURKLDSA-N Ser-Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CO SFTZWNJFZYOLBD-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 2
- FUMGHWDRRFCKEP-CIUDSAMLSA-N Ser-Leu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O FUMGHWDRRFCKEP-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- IUXGJEIKJBYKOO-SRVKXCTJSA-N Ser-Leu-His Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N IUXGJEIKJBYKOO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- FKYWFUYPVKLJLP-DCAQKATOSA-N Ser-Pro-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CO FKYWFUYPVKLJLP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- CKDXFSPMIDSMGV-GUBZILKMSA-N Ser-Pro-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O CKDXFSPMIDSMGV-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- SRSPTFBENMJHMR-WHFBIAKZSA-N Ser-Ser-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O SRSPTFBENMJHMR-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- CUXJENOFJXOSOZ-BIIVOSGPSA-N Ser-Ser-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)N)C(=O)O CUXJENOFJXOSOZ-BIIVOSGPSA-N 0.000 description 2
- XQJCEKXQUJQNNK-ZLUOBGJFSA-N Ser-Ser-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XQJCEKXQUJQNNK-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 2
- ZWSZBWAFDZRBNM-UBHSHLNASA-N Ser-Trp-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O ZWSZBWAFDZRBNM-UBHSHLNASA-N 0.000 description 2
- SIEBDTCABMZCLF-XGEHTFHBSA-N Ser-Val-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O SIEBDTCABMZCLF-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010041067 Small cell lung cancer Diseases 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 2
- 102100033130 T-box transcription factor T Human genes 0.000 description 2
- 101710086566 T-box transcription factor T Proteins 0.000 description 2
- MQCPGOZXFSYJPS-KZVJFYERSA-N Thr-Ala-Arg Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O MQCPGOZXFSYJPS-KZVJFYERSA-N 0.000 description 2
- JEDIEMIJYSRUBB-FOHZUACHSA-N Thr-Asp-Gly Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O JEDIEMIJYSRUBB-FOHZUACHSA-N 0.000 description 2
- DJDSEDOKJTZBAR-ZDLURKLDSA-N Thr-Gly-Ser Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DJDSEDOKJTZBAR-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 2
- GXUWHVZYDAHFSV-FLBSBUHZSA-N Thr-Ile-Thr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O GXUWHVZYDAHFSV-FLBSBUHZSA-N 0.000 description 2
- BVOVIGCHYNFJBZ-JXUBOQSCSA-N Thr-Leu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O BVOVIGCHYNFJBZ-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 2
- AMXMBCAXAZUCFA-RHYQMDGZSA-N Thr-Leu-Arg Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O AMXMBCAXAZUCFA-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 2
- FLPZMPOZGYPBEN-PPCPHDFISA-N Thr-Leu-Ile Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O FLPZMPOZGYPBEN-PPCPHDFISA-N 0.000 description 2
- NDZYTIMDOZMECO-SHGPDSBTSA-N Thr-Thr-Ala Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O NDZYTIMDOZMECO-SHGPDSBTSA-N 0.000 description 2
- KHTIUAKJRUIEMA-HOUAVDHOSA-N Thr-Trp-Asp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](N)[C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O)=CNC2=C1 KHTIUAKJRUIEMA-HOUAVDHOSA-N 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- AIISTODACBDQLW-WDSOQIARSA-N Trp-Leu-Arg Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O)=CNC2=C1 AIISTODACBDQLW-WDSOQIARSA-N 0.000 description 2
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 2
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 2
- YLRLHDFMMWDYTK-KKUMJFAQSA-N Tyr-Cys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 YLRLHDFMMWDYTK-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- GULIUBBXCYPDJU-CQDKDKBSSA-N Tyr-Leu-Ala Chemical compound [O-]C(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H]([NH3+])CC1=CC=C(O)C=C1 GULIUBBXCYPDJU-CQDKDKBSSA-N 0.000 description 2
- DAOREBHZAKCOEN-ULQDDVLXSA-N Tyr-Leu-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O DAOREBHZAKCOEN-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 2
- WDGDKHLSDIOXQC-ACRUOGEOSA-N Tyr-Leu-Phe Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 WDGDKHLSDIOXQC-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 2
- BJCILVZEZRDIDR-PMVMPFDFSA-N Tyr-Leu-Trp Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 BJCILVZEZRDIDR-PMVMPFDFSA-N 0.000 description 2
- OLYXUGBVBGSZDN-ACRUOGEOSA-N Tyr-Leu-Tyr Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 OLYXUGBVBGSZDN-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 2
- QKXAEWMHAAVVGS-KKUMJFAQSA-N Tyr-Pro-Glu Chemical compound N[C@@H](Cc1ccc(O)cc1)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O QKXAEWMHAAVVGS-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- KLQPIEVIKOQRAW-IZPVPAKOSA-N Tyr-Thr-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)N)O KLQPIEVIKOQRAW-IZPVPAKOSA-N 0.000 description 2
- XWYUBUYQMOUFRQ-IFFSRLJSSA-N Val-Glu-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O XWYUBUYQMOUFRQ-IFFSRLJSSA-N 0.000 description 2
- KZKMBGXCNLPYKD-YEPSODPASA-N Val-Gly-Thr Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O KZKMBGXCNLPYKD-YEPSODPASA-N 0.000 description 2
- XTDDIVQWDXMRJL-IHRRRGAJSA-N Val-Leu-His Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N XTDDIVQWDXMRJL-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- BTWMICVCQLKKNR-DCAQKATOSA-N Val-Leu-Ser Chemical compound CC(C)[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C([O-])=O BTWMICVCQLKKNR-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- NHXZRXLFOBFMDM-AVGNSLFASA-N Val-Pro-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)C(C)C NHXZRXLFOBFMDM-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- QIVPZSWBBHRNBA-JYJNAYRXSA-N Val-Pro-Phe Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(O)=O QIVPZSWBBHRNBA-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 2
- JAIZPWVHPQRYOU-ZJDVBMNYSA-N Val-Thr-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O JAIZPWVHPQRYOU-ZJDVBMNYSA-N 0.000 description 2
- LLJLBRRXKZTTRD-GUBZILKMSA-N Val-Val-Ser Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N LLJLBRRXKZTTRD-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- PBCJIPOGFJYBJE-UHFFFAOYSA-N acetonitrile;hydrate Chemical compound O.CC#N PBCJIPOGFJYBJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 2
- 108010070944 alanylhistidine Proteins 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 229940124650 anti-cancer therapies Drugs 0.000 description 2
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 2
- 238000011319 anticancer therapy Methods 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 108010013835 arginine glutamate Proteins 0.000 description 2
- 108010040443 aspartyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 2
- 108010047857 aspartylglycine Proteins 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 2
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 238000002619 cancer immunotherapy Methods 0.000 description 2
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 2
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 2
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 2
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 2
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- 108010026364 glycyl-glycyl-leucine Proteins 0.000 description 2
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 2
- 108010008486 gp100 Melanoma Antigen Proteins 0.000 description 2
- 102000007192 gp100 Melanoma Antigen Human genes 0.000 description 2
- 108010092114 histidylphenylalanine Proteins 0.000 description 2
- 108010018006 histidylserine Proteins 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 2
- APFVFJFRJDLVQX-AHCXROLUSA-N indium-111 Chemical compound [111In] APFVFJFRJDLVQX-AHCXROLUSA-N 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 108010044311 leucyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 108010057821 leucylproline Proteins 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 210000002780 melanosome Anatomy 0.000 description 2
- 208000037819 metastatic cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000011575 metastatic malignant neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 2
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 2
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 2
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 108010051242 phenylalanylserine Proteins 0.000 description 2
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 108010093296 prolyl-prolyl-alanine Proteins 0.000 description 2
- 108010029020 prolylglycine Proteins 0.000 description 2
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 2
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 108010048818 seryl-histidine Proteins 0.000 description 2
- 208000000587 small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GJLXVWOMRRWCIB-MERZOTPQSA-N (2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-acetamido-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-6-aminohexanoyl]amino]-6-aminohexanoyl]amino]-6-aminohexanoyl]amino]-6-aminohexanoyl]amino]-6-aminohexanoyl]amino]-6-aminohexanoyl]amino]-6-aminohexanamide Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(N)=O)C1=CC=C(O)C=C1 GJLXVWOMRRWCIB-MERZOTPQSA-N 0.000 description 1
- LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N (2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-dimethoxy-2-(methoxymethyl)-3-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-trimethoxy-6-(methoxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4,5,6-trimethoxy-2-(methoxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxane Chemical compound CO[C@@H]1[C@@H](OC)[C@H](OC)[C@@H](COC)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](OC)[C@@H](OC)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OC)[C@H](OC)O[C@@H]2COC)OC)O[C@@H]1COC LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N 0.000 description 1
- PVPBBTJXIKFICP-UHFFFAOYSA-N (7-aminophenothiazin-3-ylidene)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].C1=CC(=[NH2+])C=C2SC3=CC(N)=CC=C3N=C21 PVPBBTJXIKFICP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WHTVZRBIWZFKQO-AWEZNQCLSA-N (S)-chloroquine Chemical compound ClC1=CC=C2C(N[C@@H](C)CCCN(CC)CC)=CC=NC2=C1 WHTVZRBIWZFKQO-AWEZNQCLSA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N -2-Amino-4-hydroxybutanoic acid Natural products OC(=O)C(N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-2,4-dioxo-1,3-diazinane-5-carboximidamide Chemical compound CN1CC(C(N)=N)C(=O)NC1=O IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BRMWTNUJHUMWMS-UHFFFAOYSA-N 3-Methylhistidine Natural products CN1C=NC(CC(N)C(O)=O)=C1 BRMWTNUJHUMWMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940117976 5-hydroxylysine Drugs 0.000 description 1
- WKOBSJOZRJJVRZ-FXQIFTODSA-N Ala-Glu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O WKOBSJOZRJJVRZ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- HHRAXZAYZFFRAM-CIUDSAMLSA-N Ala-Leu-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O HHRAXZAYZFFRAM-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- CNQAFFMNJIQYGX-DRZSPHRISA-N Ala-Phe-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C)CC1=CC=CC=C1 CNQAFFMNJIQYGX-DRZSPHRISA-N 0.000 description 1
- RUXQNKVQSKOOBS-JURCDPSOSA-N Ala-Phe-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O RUXQNKVQSKOOBS-JURCDPSOSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 101100517196 Arabidopsis thaliana NRPE1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100499944 Arabidopsis thaliana POL2A gene Proteins 0.000 description 1
- 229930091051 Arenine Natural products 0.000 description 1
- VWVPYNGMOCSSGK-GUBZILKMSA-N Arg-Arg-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O VWVPYNGMOCSSGK-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- CYXCAHZVPFREJD-LURJTMIESA-N Arg-Gly-Gly Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O CYXCAHZVPFREJD-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- NUHQMYUWLUSRJX-BIIVOSGPSA-N Asn-Ala-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N NUHQMYUWLUSRJX-BIIVOSGPSA-N 0.000 description 1
- VKCOHFFSTKCXEQ-OLHMAJIHSA-N Asn-Asn-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O VKCOHFFSTKCXEQ-OLHMAJIHSA-N 0.000 description 1
- FTCGGKNCJZOPNB-WHFBIAKZSA-N Asn-Gly-Ser Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FTCGGKNCJZOPNB-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- RAQMSGVCGSJKCL-FOHZUACHSA-N Asn-Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O RAQMSGVCGSJKCL-FOHZUACHSA-N 0.000 description 1
- NECWUSYTYSIFNC-DLOVCJGASA-N Asp-Ala-Phe Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 NECWUSYTYSIFNC-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- KPNUCOPMVSGRCR-DCAQKATOSA-N Asp-His-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O KPNUCOPMVSGRCR-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- NTQDELBZOMWXRS-IWGUZYHVSA-N Asp-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O NTQDELBZOMWXRS-IWGUZYHVSA-N 0.000 description 1
- UTLCRGFJFSZWAW-OLHMAJIHSA-N Asp-Thr-Asn Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N)O UTLCRGFJFSZWAW-OLHMAJIHSA-N 0.000 description 1
- 241000182988 Assa Species 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 206010005949 Bone cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000018084 Bone neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101100190825 Bos taurus PMEL gene Proteins 0.000 description 1
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 101100512078 Caenorhabditis elegans lys-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010008805 Chromosomal abnormalities Diseases 0.000 description 1
- 208000031404 Chromosome Aberrations Diseases 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 description 1
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- 229920001076 Cutan Polymers 0.000 description 1
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HAYVTMHUNMMXCV-IMJSIDKUSA-N Cys-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CS HAYVTMHUNMMXCV-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- NOCCABSVTRONIN-CIUDSAMLSA-N Cys-Ala-Leu Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N NOCCABSVTRONIN-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- SBORMUFGKSCGEN-XHNCKOQMSA-N Cys-Glu-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N)C(=O)O SBORMUFGKSCGEN-XHNCKOQMSA-N 0.000 description 1
- 229930183912 Cytidylic acid Natural products 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 206010012559 Developmental delay Diseases 0.000 description 1
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 1
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 208000014061 Extranodal Extension Diseases 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 101100190826 Gallus gallus PMEL gene Proteins 0.000 description 1
- 230000010558 Gene Alterations Effects 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- JZDHUJAFXGNDSB-WHFBIAKZSA-N Glu-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O JZDHUJAFXGNDSB-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- WZZSKAJIHTUUSG-ACZMJKKPSA-N Glu-Ala-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WZZSKAJIHTUUSG-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- ZWQVYZXPYSYPJD-RYUDHWBXSA-N Glu-Gly-Phe Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 ZWQVYZXPYSYPJD-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- NJCALAAIGREHDR-WDCWCFNPSA-N Glu-Leu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O NJCALAAIGREHDR-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 1
- SWRVAQHFBRZVNX-GUBZILKMSA-N Glu-Lys-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O SWRVAQHFBRZVNX-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- ILWHFUZZCFYSKT-AVGNSLFASA-N Glu-Lys-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O ILWHFUZZCFYSKT-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- OCDLPQDYTJPWNG-YUMQZZPRSA-N Gly-Asn-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)CN OCDLPQDYTJPWNG-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- IEFJWDNGDZAYNZ-BYPYZUCNSA-N Gly-Glu Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O IEFJWDNGDZAYNZ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- XTQFHTHIAKKCTM-YFKPBYRVSA-N Gly-Glu-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O XTQFHTHIAKKCTM-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- LPCKHUXOGVNZRS-YUMQZZPRSA-N Gly-His-Ser Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O LPCKHUXOGVNZRS-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- KGVHCTWYMPWEGN-FSPLSTOPSA-N Gly-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN KGVHCTWYMPWEGN-FSPLSTOPSA-N 0.000 description 1
- PFMUCCYYAAFKTH-YFKPBYRVSA-N Gly-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN PFMUCCYYAAFKTH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- BMWFDYIYBAFROD-WPRPVWTQSA-N Gly-Pro-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)CN BMWFDYIYBAFROD-WPRPVWTQSA-N 0.000 description 1
- BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N Gly-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- FFJQHWKSGAWSTJ-BFHQHQDPSA-N Gly-Thr-Ala Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O FFJQHWKSGAWSTJ-BFHQHQDPSA-N 0.000 description 1
- GWNIGUKSRJBIHX-STQMWFEESA-N Gly-Tyr-Arg Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)NC(=O)CN)O GWNIGUKSRJBIHX-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- LYZYGGWCBLBDMC-QWHCGFSZSA-N Gly-Tyr-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)NC(=O)CN)C(=O)O LYZYGGWCBLBDMC-QWHCGFSZSA-N 0.000 description 1
- 101150118346 HLA-A gene Proteins 0.000 description 1
- 108010035452 HLA-A1 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 108010013476 HLA-A24 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 101150000578 HLA-B gene Proteins 0.000 description 1
- 101150035071 HLA-C gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 241001622557 Hesperia Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- PDSUIXMZYNURGI-AVGNSLFASA-N His-Arg-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 PDSUIXMZYNURGI-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- SVVULKPWDBIPCO-BZSNNMDCSA-N His-Phe-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O SVVULKPWDBIPCO-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- 101000937544 Homo sapiens Beta-2-microglobulin Proteins 0.000 description 1
- 101000979735 Homo sapiens NADH dehydrogenase [ubiquinone] 1 beta subcomplex subunit 8, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- OEQKGSPBDVKYOC-ZKWXMUAHSA-N Ile-Gly-Cys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N OEQKGSPBDVKYOC-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- DFFTXLCCDFYRKD-MBLNEYKQSA-N Ile-Gly-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)N DFFTXLCCDFYRKD-MBLNEYKQSA-N 0.000 description 1
- SVBAHOMTJRFSIC-SXTJYALSSA-N Ile-Ile-Asn Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N SVBAHOMTJRFSIC-SXTJYALSSA-N 0.000 description 1
- PWDSHAAAFXISLE-SXTJYALSSA-N Ile-Ile-Asp Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O PWDSHAAAFXISLE-SXTJYALSSA-N 0.000 description 1
- KLBVGHCGHUNHEA-BJDJZHNGSA-N Ile-Leu-Ala Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)O)N KLBVGHCGHUNHEA-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- GVKKVHNRTUFCCE-BJDJZHNGSA-N Ile-Leu-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N GVKKVHNRTUFCCE-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- RQQCJTLBSJMVCR-DSYPUSFNSA-N Ile-Leu-Trp Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)N RQQCJTLBSJMVCR-DSYPUSFNSA-N 0.000 description 1
- IALVDKNUFSTICJ-GMOBBJLQSA-N Ile-Met-Asp Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N IALVDKNUFSTICJ-GMOBBJLQSA-N 0.000 description 1
- YCKPUHHMCFSUMD-IUKAMOBKSA-N Ile-Thr-Asp Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N YCKPUHHMCFSUMD-IUKAMOBKSA-N 0.000 description 1
- JJQQGCMKLOEGAV-OSUNSFLBSA-N Ile-Thr-Met Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)N JJQQGCMKLOEGAV-OSUNSFLBSA-N 0.000 description 1
- WXLYNEHOGRYNFU-URLPEUOOSA-N Ile-Thr-Phe Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)N WXLYNEHOGRYNFU-URLPEUOOSA-N 0.000 description 1
- WCNWGAUZWWSYDG-SVSWQMSJSA-N Ile-Thr-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N WCNWGAUZWWSYDG-SVSWQMSJSA-N 0.000 description 1
- KWHFUMYCSPJCFQ-NGTWOADLSA-N Ile-Thr-Trp Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)N KWHFUMYCSPJCFQ-NGTWOADLSA-N 0.000 description 1
- DGTOKVBDZXJHNZ-WZLNRYEVSA-N Ile-Thr-Tyr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)O)N DGTOKVBDZXJHNZ-WZLNRYEVSA-N 0.000 description 1
- BVRPESWOSNFUCJ-LKTVYLICSA-N Ile-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)CC)C(O)=O)=CNC2=C1 BVRPESWOSNFUCJ-LKTVYLICSA-N 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N L-homoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- LHSGPCFBGJHPCY-UHFFFAOYSA-N L-leucine-L-tyrosine Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 LHSGPCFBGJHPCY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SENJXOPIZNYLHU-UHFFFAOYSA-N L-leucyl-L-arginine Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCN=C(N)N SENJXOPIZNYLHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 241000880493 Leptailurus serval Species 0.000 description 1
- SENJXOPIZNYLHU-IUCAKERBSA-N Leu-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N SENJXOPIZNYLHU-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- STAVRDQLZOTNKJ-RHYQMDGZSA-N Leu-Arg-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O STAVRDQLZOTNKJ-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- MLTRLIITQPXHBJ-BQBZGAKWSA-N Leu-Asn Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O MLTRLIITQPXHBJ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- MDVZJYGNAGLPGJ-KKUMJFAQSA-N Leu-Asn-Phe Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 MDVZJYGNAGLPGJ-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- VWHGTYCRDRBSFI-ZETCQYMHSA-N Leu-Gly-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O VWHGTYCRDRBSFI-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- CCQLQKZTXZBXTN-NHCYSSNCSA-N Leu-Gly-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O CCQLQKZTXZBXTN-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- YWYQSLOTVIRCFE-SRVKXCTJSA-N Leu-His-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O YWYQSLOTVIRCFE-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- RXGLHDWAZQECBI-SRVKXCTJSA-N Leu-Leu-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O RXGLHDWAZQECBI-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- IEWBEPKLKUXQBU-VOAKCMCISA-N Leu-Leu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O IEWBEPKLKUXQBU-VOAKCMCISA-N 0.000 description 1
- FOBUGKUBUJOWAD-IHPCNDPISA-N Leu-Leu-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 FOBUGKUBUJOWAD-IHPCNDPISA-N 0.000 description 1
- SYRTUBLKWNDSDK-DKIMLUQUSA-N Leu-Phe-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O SYRTUBLKWNDSDK-DKIMLUQUSA-N 0.000 description 1
- CHJKEDSZNSONPS-DCAQKATOSA-N Leu-Pro-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O CHJKEDSZNSONPS-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- SBANPBVRHYIMRR-GARJFASQSA-N Leu-Ser-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N SBANPBVRHYIMRR-GARJFASQSA-N 0.000 description 1
- SQUFDMCWMFOEBA-KKUMJFAQSA-N Leu-Ser-Tyr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 SQUFDMCWMFOEBA-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- RNYLNYTYMXACRI-VFAJRCTISA-N Leu-Thr-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O RNYLNYTYMXACRI-VFAJRCTISA-N 0.000 description 1
- ONHCDMBHPQIPAI-YTQUADARSA-N Leu-Trp-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)N3CCC[C@@H]3C(=O)O)N ONHCDMBHPQIPAI-YTQUADARSA-N 0.000 description 1
- LHSGPCFBGJHPCY-STQMWFEESA-N Leu-Tyr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 LHSGPCFBGJHPCY-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- UCRJTSIIAYHOHE-ULQDDVLXSA-N Leu-Tyr-Arg Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N UCRJTSIIAYHOHE-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- YQFZRHYZLARWDY-IHRRRGAJSA-N Leu-Val-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN YQFZRHYZLARWDY-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- YRWCPXOFBKTCFY-NUTKFTJISA-N Lys-Ala-Trp Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N YRWCPXOFBKTCFY-NUTKFTJISA-N 0.000 description 1
- WLCYCADOWRMSAJ-CIUDSAMLSA-N Lys-Asn-Cys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O WLCYCADOWRMSAJ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- UETQMSASAVBGJY-QWRGUYRKSA-N Lys-Gly-His Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CNC=N1 UETQMSASAVBGJY-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- IVFUVMSKSFSFBT-NHCYSSNCSA-N Lys-Ile-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN IVFUVMSKSFSFBT-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- GFWLIJDQILOEPP-HSCHXYMDSA-N Lys-Ile-Trp Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N GFWLIJDQILOEPP-HSCHXYMDSA-N 0.000 description 1
- VMTYLUGCXIEDMV-QWRGUYRKSA-N Lys-Leu-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN VMTYLUGCXIEDMV-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- PFZWARWVRNTPBR-IHPCNDPISA-N Lys-Leu-Trp Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N PFZWARWVRNTPBR-IHPCNDPISA-N 0.000 description 1
- DAHQKYYIXPBESV-UWVGGRQHSA-N Lys-Met-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(O)=O DAHQKYYIXPBESV-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- ZZHPLPSLBVBWOA-WDSOQIARSA-N Lys-Met-Trp Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N ZZHPLPSLBVBWOA-WDSOQIARSA-N 0.000 description 1
- YCJCEMKOZOYBEF-OEAJRASXSA-N Lys-Thr-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O YCJCEMKOZOYBEF-OEAJRASXSA-N 0.000 description 1
- SEZADXQOJJTXPG-VFAJRCTISA-N Lys-Thr-Trp Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N)O SEZADXQOJJTXPG-VFAJRCTISA-N 0.000 description 1
- YFQSSOAGMZGXFT-MEYUZBJRSA-N Lys-Thr-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O YFQSSOAGMZGXFT-MEYUZBJRSA-N 0.000 description 1
- YQAIUOWPSUOINN-IUCAKERBSA-N Lys-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN YQAIUOWPSUOINN-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- 101150109178 M1 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004907 Macro-emulsion Substances 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241001529870 Meoma Species 0.000 description 1
- OOSPRDCGTLQLBP-NHCYSSNCSA-N Met-Glu-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O OOSPRDCGTLQLBP-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- SLQDSYZHHOKQSR-QXEWZRGKSA-N Met-Gly-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCSC SLQDSYZHHOKQSR-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 1
- SODXFJOPSCXOHE-IHRRRGAJSA-N Met-Leu-Leu Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O SODXFJOPSCXOHE-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- PHKBGZKVOJCIMZ-SRVKXCTJSA-N Met-Pro-Arg Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O PHKBGZKVOJCIMZ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 206010027457 Metastases to liver Diseases 0.000 description 1
- 206010027458 Metastases to lung Diseases 0.000 description 1
- 101150076359 Mhc gene Proteins 0.000 description 1
- JDHILDINMRGULE-LURJTMIESA-N N(pros)-methyl-L-histidine Chemical group CN1C=NC=C1C[C@H](N)C(O)=O JDHILDINMRGULE-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- WUGMRIBZSVSJNP-UHFFFAOYSA-N N-L-alanyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(N)C)C(O)=O)=CNC2=C1 WUGMRIBZSVSJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-valine Natural products CC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010002311 N-glycylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100024975 NADH dehydrogenase [ubiquinone] 1 beta subcomplex subunit 8, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 206010029488 Nodular melanoma Diseases 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100073341 Oryza sativa subsp. japonica KAO gene Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- JQLQUPIYYJXZLJ-ZEWNOJEFSA-N Phe-Ile-Tyr Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 JQLQUPIYYJXZLJ-ZEWNOJEFSA-N 0.000 description 1
- YKUGPVXSDOOANW-KKUMJFAQSA-N Phe-Leu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O YKUGPVXSDOOANW-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- KDYPMIZMXDECSU-JYJNAYRXSA-N Phe-Leu-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 KDYPMIZMXDECSU-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- OSBADCBXAMSPQD-YESZJQIVSA-N Phe-Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)N OSBADCBXAMSPQD-YESZJQIVSA-N 0.000 description 1
- NJJBATPLUQHRBM-IHRRRGAJSA-N Phe-Pro-Ser Chemical compound C1C[C@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O NJJBATPLUQHRBM-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- NYQBYASWHVRESG-MIMYLULJSA-N Phe-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 NYQBYASWHVRESG-MIMYLULJSA-N 0.000 description 1
- RAGOJJCBGXARPO-XVSYOHENSA-N Phe-Thr-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@H](O)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 RAGOJJCBGXARPO-XVSYOHENSA-N 0.000 description 1
- KLYYKKGCPOGDPE-OEAJRASXSA-N Phe-Thr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O KLYYKKGCPOGDPE-OEAJRASXSA-N 0.000 description 1
- GAMLAXHLYGLQBJ-UFYCRDLUSA-N Phe-Val-Tyr Chemical compound N[C@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(=O)O)CC1=CC=C(C=C1)O)C(C)C)CC1=CC=CC=C1 GAMLAXHLYGLQBJ-UFYCRDLUSA-N 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 208000007452 Plasmacytoma Diseases 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- LCRSGSIRKLXZMZ-BPNCWPANSA-N Pro-Ala-Tyr Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O LCRSGSIRKLXZMZ-BPNCWPANSA-N 0.000 description 1
- OCSACVPBMIYNJE-GUBZILKMSA-N Pro-Arg-Asn Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O OCSACVPBMIYNJE-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- JQOHKCDMINQZRV-WDSKDSINSA-N Pro-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]1CCC[NH2+]1 JQOHKCDMINQZRV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- FEPSEIDIPBMIOS-QXEWZRGKSA-N Pro-Gly-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H]1CCCN1 FEPSEIDIPBMIOS-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 1
- DXTOOBDIIAJZBJ-BQBZGAKWSA-N Pro-Gly-Ser Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DXTOOBDIIAJZBJ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- SBVPYBFMIGDIDX-SRVKXCTJSA-N Pro-Pro-Pro Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1N(C(=O)[C@H]2NCCC2)CCC1 SBVPYBFMIGDIDX-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- FIODMZKLZFLYQP-GUBZILKMSA-N Pro-Val-Ser Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FIODMZKLZFLYQP-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 description 1
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004518 RNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000003391 RNA probe Substances 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108010039491 Ricin Proteins 0.000 description 1
- 241000220317 Rosa Species 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 101100028962 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) PDR1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 1
- SRTCFKGBYBZRHA-ACZMJKKPSA-N Ser-Ala-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O SRTCFKGBYBZRHA-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- GXXTUIUYTWGPMV-FXQIFTODSA-N Ser-Arg-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O GXXTUIUYTWGPMV-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- LTFSLKWFMWZEBD-IMJSIDKUSA-N Ser-Asn Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O LTFSLKWFMWZEBD-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- HEQPKICPPDOSIN-SRVKXCTJSA-N Ser-Asp-Tyr Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 HEQPKICPPDOSIN-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- OHKFXGKHSJKKAL-NRPADANISA-N Ser-Glu-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O OHKFXGKHSJKKAL-NRPADANISA-N 0.000 description 1
- SFTZTYBXIXLRGQ-JBDRJPRFSA-N Ser-Ile-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O SFTZTYBXIXLRGQ-JBDRJPRFSA-N 0.000 description 1
- UBRMZSHOOIVJPW-SRVKXCTJSA-N Ser-Leu-Lys Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O UBRMZSHOOIVJPW-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- HAYADTTXNZFUDM-IHRRRGAJSA-N Ser-Tyr-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O HAYADTTXNZFUDM-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- 208000000453 Skin Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- FQPQPTHMHZKGFM-XQXXSGGOSA-N Thr-Ala-Glu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O FQPQPTHMHZKGFM-XQXXSGGOSA-N 0.000 description 1
- LVHHEVGYAZGXDE-KDXUFGMBSA-N Thr-Ala-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N)O LVHHEVGYAZGXDE-KDXUFGMBSA-N 0.000 description 1
- XYEXCEPTALHNEV-RCWTZXSCSA-N Thr-Arg-Arg Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O XYEXCEPTALHNEV-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- IOWJRKAVLALBQB-IWGUZYHVSA-N Thr-Asp Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O IOWJRKAVLALBQB-IWGUZYHVSA-N 0.000 description 1
- BECPPKYKPSRKCP-ZDLURKLDSA-N Thr-Glu Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O BECPPKYKPSRKCP-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 1
- VGYBYGQXZJDZJU-XQXXSGGOSA-N Thr-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O VGYBYGQXZJDZJU-XQXXSGGOSA-N 0.000 description 1
- VULNJDORNLBPNG-SWRJLBSHSA-N Thr-Glu-Trp Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)N)O VULNJDORNLBPNG-SWRJLBSHSA-N 0.000 description 1
- LUMXICQAOKVQOB-YWIQKCBGSA-N Thr-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O LUMXICQAOKVQOB-YWIQKCBGSA-N 0.000 description 1
- BQBCIBCLXBKYHW-CSMHCCOUSA-N Thr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]([NH3+])[C@@H](C)O BQBCIBCLXBKYHW-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 1
- KRDSCBLRHORMRK-JXUBOQSCSA-N Thr-Lys-Ala Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O KRDSCBLRHORMRK-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 1
- IEZVHOULSUULHD-XGEHTFHBSA-N Thr-Ser-Val Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O IEZVHOULSUULHD-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N Thr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N 0.000 description 1
- KAFKKRJQHOECGW-JCOFBHIZSA-N Thr-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](N)[C@H](O)C)C(O)=O)=CNC2=C1 KAFKKRJQHOECGW-JCOFBHIZSA-N 0.000 description 1
- XEVHXNLPUBVQEX-DVJZZOLTSA-N Thr-Trp-Gly Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)NCC(=O)O)N)O XEVHXNLPUBVQEX-DVJZZOLTSA-N 0.000 description 1
- CKHWEVXPLJBEOZ-VQVTYTSYSA-N Thr-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]([NH3+])[C@@H](C)O CKHWEVXPLJBEOZ-VQVTYTSYSA-N 0.000 description 1
- BPGDJSUFQKWUBK-KJEVXHAQSA-N Thr-Val-Tyr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 BPGDJSUFQKWUBK-KJEVXHAQSA-N 0.000 description 1
- 241001130469 Tila Species 0.000 description 1
- 102100026145 Transitional endoplasmic reticulum ATPase Human genes 0.000 description 1
- SCQBNMKLZVCXNX-ZFWWWQNUSA-N Trp-Arg-Gly Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)NCC(=O)O)N SCQBNMKLZVCXNX-ZFWWWQNUSA-N 0.000 description 1
- IBBBOLAPFHRDHW-BPUTZDHNSA-N Trp-Asn-Arg Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N IBBBOLAPFHRDHW-BPUTZDHNSA-N 0.000 description 1
- UYKREHOKELZSPB-JTQLQIEISA-N Trp-Gly Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O)=CNC2=C1 UYKREHOKELZSPB-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- JVTHMUDOKPQBOT-NSHDSACASA-N Trp-Gly-Gly Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H]([NH3+])C(=O)NCC(=O)NCC([O-])=O)=CNC2=C1 JVTHMUDOKPQBOT-NSHDSACASA-N 0.000 description 1
- KIMOCKLJBXHFIN-YLVFBTJISA-N Trp-Ile-Gly Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(O)=O)=CNC2=C1 KIMOCKLJBXHFIN-YLVFBTJISA-N 0.000 description 1
- OGZRZMJASKKMJZ-XIRDDKMYSA-N Trp-Leu-Asp Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)N OGZRZMJASKKMJZ-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 1
- VPRHDRKAPYZMHL-SZMVWBNQSA-N Trp-Leu-Glu Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)=CNC2=C1 VPRHDRKAPYZMHL-SZMVWBNQSA-N 0.000 description 1
- YTZYHKOSHOXTHA-TUSQITKMSA-N Trp-Leu-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=3C4=CC=CC=C4NC=3)CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 YTZYHKOSHOXTHA-TUSQITKMSA-N 0.000 description 1
- WKQNLTQSCYXKQK-VFAJRCTISA-N Trp-Lys-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O WKQNLTQSCYXKQK-VFAJRCTISA-N 0.000 description 1
- YBRHKUNWEYBZGT-WLTAIBSBSA-N Trp-Thr Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(O)=O)=CNC2=C1 YBRHKUNWEYBZGT-WLTAIBSBSA-N 0.000 description 1
- DTPWXZXGFAHEKL-NWLDYVSISA-N Trp-Thr-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O DTPWXZXGFAHEKL-NWLDYVSISA-N 0.000 description 1
- SUGLEXVWEJOCGN-ONUFPDRFSA-N Trp-Thr-Trp Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC3=CNC4=CC=CC=C43)N)O SUGLEXVWEJOCGN-ONUFPDRFSA-N 0.000 description 1
- STJXERBCEWQLKS-IHPCNDPISA-N Trp-Tyr-Cys Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 STJXERBCEWQLKS-IHPCNDPISA-N 0.000 description 1
- XKTWZYNTLXITCY-QRTARXTBSA-N Trp-Val-Asn Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=CNC2=C1 XKTWZYNTLXITCY-QRTARXTBSA-N 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 239000006035 Tryptophane Substances 0.000 description 1
- 206010054094 Tumour necrosis Diseases 0.000 description 1
- SLCSPPCQWUHPPO-JYJNAYRXSA-N Tyr-Glu-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 SLCSPPCQWUHPPO-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- AZGZDDNKFFUDEH-QWRGUYRKSA-N Tyr-Gly-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 AZGZDDNKFFUDEH-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- ADECJAKCRKPSOR-ULQDDVLXSA-N Tyr-His-Arg Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N)O ADECJAKCRKPSOR-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- GGXUDPQWAWRINY-XEGUGMAKSA-N Tyr-Ile-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 GGXUDPQWAWRINY-XEGUGMAKSA-N 0.000 description 1
- BSCBBPKDVOZICB-KKUMJFAQSA-N Tyr-Leu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O BSCBBPKDVOZICB-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- DWAMXBFJNZIHMC-KBPBESRZSA-N Tyr-Leu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O DWAMXBFJNZIHMC-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- NSGZILIDHCIZAM-KKUMJFAQSA-N Tyr-Leu-Ser Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)N NSGZILIDHCIZAM-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- KYPMKDGKAYQCHO-RYUDHWBXSA-N Tyr-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 KYPMKDGKAYQCHO-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- VNYDHJARLHNEGA-RYUDHWBXSA-N Tyr-Pro Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 VNYDHJARLHNEGA-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- SYFHQHYTNCQCCN-MELADBBJSA-N Tyr-Ser-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)N)C(=O)O SYFHQHYTNCQCCN-MELADBBJSA-N 0.000 description 1
- UUBKSZNKJUJQEJ-JRQIVUDYSA-N Tyr-Thr-Asp Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)N)O UUBKSZNKJUJQEJ-JRQIVUDYSA-N 0.000 description 1
- AKKYBQGHUAWPJR-MNSWYVGCSA-N Tyr-Thr-Trp Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC3=CC=C(C=C3)O)N)O AKKYBQGHUAWPJR-MNSWYVGCSA-N 0.000 description 1
- QSPOLEBZTMESFY-SRVKXCTJSA-N Val-Pro-Val Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O QSPOLEBZTMESFY-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- KSFXWENSJABBFI-ZKWXMUAHSA-N Val-Ser-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O KSFXWENSJABBFI-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- JQTYTBPCSOAZHI-FXQIFTODSA-N Val-Ser-Cys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N JQTYTBPCSOAZHI-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- VIKZGAUAKQZDOF-NRPADANISA-N Val-Ser-Glu Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O VIKZGAUAKQZDOF-NRPADANISA-N 0.000 description 1
- VHIZXDZMTDVFGX-DCAQKATOSA-N Val-Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](C(C)C)N VHIZXDZMTDVFGX-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- NZYNRRGJJVSSTJ-GUBZILKMSA-N Val-Ser-Val Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O NZYNRRGJJVSSTJ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- HTONZBWRYUKUKC-RCWTZXSCSA-N Val-Thr-Val Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O HTONZBWRYUKUKC-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- QTXGUIMEHKCPBH-FHWLQOOXSA-N Val-Trp-Lys Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)=CNC2=C1 QTXGUIMEHKCPBH-FHWLQOOXSA-N 0.000 description 1
- PMKQKNBISAOSRI-XHSDSOJGSA-N Val-Tyr-Pro Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)O)N PMKQKNBISAOSRI-XHSDSOJGSA-N 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 241000341910 Vesta Species 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 108010006886 Vitrogen Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 108010050025 alpha-glutamyltryptophan Proteins 0.000 description 1
- 150000003862 amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical class N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000002788 anti-peptide Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 108010068380 arginylarginine Proteins 0.000 description 1
- 108010093581 aspartyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 125000001584 benzyloxycarbonyl group Chemical group C(=O)(OCC1=CC=CC=C1)* 0.000 description 1
- 102000015736 beta 2-Microglobulin Human genes 0.000 description 1
- 108010081355 beta 2-Microglobulin Proteins 0.000 description 1
- 238000001815 biotherapy Methods 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011342 chemoimmunotherapy Methods 0.000 description 1
- 229940044683 chemotherapy drug Drugs 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000002668 chloroacetyl group Chemical group ClCC(=O)* 0.000 description 1
- 229960003677 chloroquine Drugs 0.000 description 1
- WHTVZRBIWZFKQO-UHFFFAOYSA-N chloroquine Natural products ClC1=CC=C2C(NC(C)CCCN(CC)CC)=CC=NC2=C1 WHTVZRBIWZFKQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 238000005354 coacervation Methods 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 238000002967 competitive immunoassay Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 description 1
- IERHLVCPSMICTF-XVFCMESISA-N cytidine 5'-monophosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O1 IERHLVCPSMICTF-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- IERHLVCPSMICTF-UHFFFAOYSA-N cytidine monophosphate Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(COP(O)(O)=O)O1 IERHLVCPSMICTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 1
- 239000003405 delayed action preparation Substances 0.000 description 1
- YSMODUONRAFBET-UHFFFAOYSA-N delta-DL-hydroxylysine Natural products NCC(O)CCC(N)C(O)=O YSMODUONRAFBET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 description 1
- 230000035614 depigmentation Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 230000020595 eating behavior Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- YSMODUONRAFBET-UHNVWZDZSA-N erythro-5-hydroxy-L-lysine Chemical group NC[C@H](O)CC[C@H](N)C(O)=O YSMODUONRAFBET-UHNVWZDZSA-N 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- VNPZMCWUXKJOHF-UHFFFAOYSA-N ethene;methyl acetate Chemical compound C=C.COC(C)=O VNPZMCWUXKJOHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004494 ethyl ester group Chemical group 0.000 description 1
- 239000005038 ethylene vinyl acetate Substances 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 108010052305 exodeoxyribonuclease III Proteins 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 210000000245 forearm Anatomy 0.000 description 1
- 210000003953 foreskin Anatomy 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N formaldehyde Substances O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012520 frozen sample Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N glycyl-L-tyrosine hemihydrate Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N glycylglycine Chemical compound [NH3+]CC(=O)NCC([O-])=O YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010077515 glycylproline Proteins 0.000 description 1
- 108010087823 glycyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 108010037850 glycylvaline Proteins 0.000 description 1
- 208000037824 growth disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000003862 health status Effects 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108010036413 histidylglycine Proteins 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 102000047279 human B2M Human genes 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 229940042795 hydrazides for tuberculosis treatment Drugs 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 238000013095 identification testing Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000000899 immune system response Effects 0.000 description 1
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 229940055742 indium-111 Drugs 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004968 inflammatory condition Effects 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 108010061181 influenza matrix peptide (58-66) Proteins 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000001985 kidney epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 108010051673 leucyl-glycyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010044056 leucyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010000761 leucylarginine Proteins 0.000 description 1
- 108010012058 leucyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 108010017391 lysylvaline Proteins 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 229940115256 melanoma vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000004530 micro-emulsion Substances 0.000 description 1
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 1
- 238000007814 microscopic assay Methods 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- KVMLMFRXRZLEGU-UHFFFAOYSA-N n-(4-methoxyphenyl)-n,2,6-trimethylfuro[2,3-d]pyrimidin-4-amine Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1N(C)C1=NC(C)=NC2=C1C=C(C)O2 KVMLMFRXRZLEGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002088 nanocapsule Substances 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 230000010807 negative regulation of binding Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000000032 nodular malignant melanoma Diseases 0.000 description 1
- 230000036963 noncompetitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000037311 normal skin Effects 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N octafluoropropane Chemical compound FC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N ornithyl group Chemical group N[C@@H](CCCN)C(=O)O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 229940127084 other anti-cancer agent Drugs 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 206010033675 panniculitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 101150113162 pbl gene Proteins 0.000 description 1
- 230000001175 peptic effect Effects 0.000 description 1
- 108010055226 peptide A42 Proteins 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004976 peripheral blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010012581 phenylalanylglutamate Proteins 0.000 description 1
- AQSJGOWTSHOLKH-UHFFFAOYSA-N phosphite(3-) Chemical class [O-]P([O-])[O-] AQSJGOWTSHOLKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 210000001127 pigmented epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 229920001308 poly(aminoacid) Polymers 0.000 description 1
- 229920001200 poly(ethylene-vinyl acetate) Polymers 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010079317 prolyl-tyrosine Proteins 0.000 description 1
- 108010004914 prolylarginine Proteins 0.000 description 1
- 108010053725 prolylvaline Proteins 0.000 description 1
- 229950008679 protamine sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 125000000561 purinyl group Chemical group N1=C(N=C2N=CNC2=C1)* 0.000 description 1
- HNJBEVLQSNELDL-UHFFFAOYSA-N pyrrolidin-2-one Chemical compound O=C1CCCN1 HNJBEVLQSNELDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 210000003660 reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 210000000043 retinal melanocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003583 retinal pigment epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 101150005492 rpe1 gene Proteins 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 108010026333 seryl-proline Proteins 0.000 description 1
- 238000007493 shaping process Methods 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 210000004511 skin melanocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000000661 sodium alginate Substances 0.000 description 1
- 235000010413 sodium alginate Nutrition 0.000 description 1
- 229940005550 sodium alginate Drugs 0.000 description 1
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004304 subcutaneous tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 1
- 238000011287 therapeutic dose Methods 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- JWIXXNLOKOAAQT-UHFFFAOYSA-N tipepidine Chemical compound C1N(C)CCCC1=C(C=1SC=CC=1)C1=CC=CS1 JWIXXNLOKOAAQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 235000017103 tryptophane Nutrition 0.000 description 1
- 108010058119 tryptophyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010015666 tryptophyl-leucyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010084932 tryptophyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010035534 tyrosyl-leucyl-alanine Proteins 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/46449—Melanoma antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
- A61K2239/57—Skin; melanoma
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Mycology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Oncology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
Melanooma-antigeeni Tämä patenttihakemus on jakamalla erotettu hakemuksesta FI964235. b Keksinnön alue Tämä keksintö liittyy ihmisen syöpien ehkäisyyn ja hoitoon. Spesifisemmin tässä kuvataan geenejä, jotka koo-dittavat T-soluj en tunnistamia melanooma-antigeeneja, ja niitä vastaavia proteiineja ja sellaisia ehkäiseviä, dia-10 gnostisia j a terapeuttisia sovelluksia, joissa käytetään näitä geenejä tai proteiineja.
Keksinnön tausta
Melanoomat ovat aggressiivisia, usein metastasoivia kasvaimia, jotka ovat peräisin joko melanosyyteistä tai me-15 lanosyyteille sukua olevista luomisoluista ["Cellular and
Molecular Immunology" (1991) (toim.) Abbas, A.K., Lechtman, A.H., Pober, J.S.; W.B. Saunders Company, Philadelphia, sivut 340 - 341] . Melanoomat muodostavat noin kolme pro senttia kaikista ihosyövistä ja melanooman maailmanlaajui-20 nen lisääntyminen voittaa kaikki muut kasvaimet paitsi naisten keuhkosyövän ["Cellular and Molecular Immunology" (1991)(toim.) Abbas, A.K., Lechtman, A.H., Pober, J.S.; W.B. Saunders Company, Philadelphia, sivut 340 - 342; Kirkwood ja Agarwala (1993) Principles and Practice of Oncology 25 7: 1 - 16]. Jopa silloin, kun melanooma on paikantunut iholle, jopa 30 prosentille potilaista kehittyy systeemisiä £! metastaaseja ja suurin osa kuolee [Kirkwood ja Agarwala o cm (1993) Principles and Practice of Oncology 7: 1 - 16].
o Klassiset tavat melanooman hoitamiseksi sisältävät kirurgi- 30 an, säteilytyksen ja kemoterapian. Viime vuosikymmenen ai- x kana immunoterapia ja geeniterapia ovat ilmestyneet uusiksi ^ ja lupaaviksi menetelmiksi melanooman hoitamisessa.
m o o m o
CM
2 T-soluilla on tärkeä rooli kasvaimen regressiossa useimmissa hiiren kasvainmalleissa. Kasvaimeen tunkeutuvat lymfosyytit (TIL), jotka tunnistavat uniikit syöpäantigee-nit, voidaan eristää monista hiiren kasvaimista. Näiden 5 TIL-solujen adoptiivinen siirto yhdessä interleukiini-2-proteiinin kanssa voi välittää muodostuneiden keuhko- ja maksametastaasien regressiota [Rosenberg, S .A. et ai., (1986) Science 233: 1318 - 1321] . Lisäksi injektoitujen TIL-solujen erittämä IFN-gamma-proteiini korreloi merkit-10 tävästi hiiren kasvaimien regressiolle in vivo, joka antaa ehdottaa, että T-solut ovat aktivoituneet kasvainantigee-neilla [Barth, R.J. et ai., (1991) J. Exp. Med. 173: 647 -658] . Kasvaimen TIL-soluj en tunnettu kyky välittää metas-tasoivan syövän regressiota 35 - 40 prosentilla melanooma-15 potilaita silloin, kun ne siirretään adoptiivisesti potilaisiin, joilla on metastasoiva melanooma, osoittaa tunnistettujen antigeenien kliinisen tärkeyden [Rosenberg, S.A. et ai., (1988) N. Engl. J. Med. 319: 1676 - 1680;
Rosenberg, S.A. (1992) J. Clin. Oncol. 10: 180 - 199] .
20 T-solureseptorit CD8+-T-soluissa tunnistavat komp leksin, joka sisältää antigeenisen peptidin (9 - 10 aminohappoa HLA-A2-proteiinille) , β-2-mikroglobuliinin ja luokan I pääasiallisen histokompatibiliteettikompleksin (MHC) raskasketjun (ihmisillä HLA-A, B, C) . Peptidit, jotka muo-25 dostuvat endogeenisesti syntetisoitujen proteiinien diges-^ tiolla, kuljetetaan endoplastiseen retikkeliin, sidotaan 0 luokan I MHC -proteiinin raskasketjuun ja S2-mikroglobu-c\j
^ limun ;ja lopuksi ekspressoidaan solun pinnalle luokan I
° MHC -molekyylin uurteessa. Sen vuoksi T-solut voivat tun co 30 nistaa molekyylejä, jotka ovat peräisin solun sisäisistä 1 , , £ proteiineista, mikä on päinvastaista verrattuna vasta-ai- lo neisiin, jotka tunnistavat koskemattomia molekyylejä, jot- o g ka ekspressoidaan solun pinnalle. Sen vuoksi T-solujen ^ tunnistamat antigeenit voivat olla käyttökelpoisempia kuin ^ 35 vasta-aineiden tunnistamat antigeenit.
3
Vahvan todisteen siitä, että ihmisillä on olemassa immuunivaste syöpää vastaan, esittää lymfosyyttien läsnäolo melanoomaesiintymien sisällä. Nämä lymfosyytit kykenevät eristettyinä tunnistamaan spesifiset kasvainantigeenit 5 autologisissa ja allogeenisissa melanoomissa MHC-molekyy-liin restriktoituneella tavalla [Itoh, K. et ai. (1986) Cancer Res. 46: 3011 - 3017; Muul, L.M. et ai. (1987) J.
Immunol. 138: 989 - 995; Topalian, S.L. et ai. (1989) J.
Immunol. 142: 3714 - 3725; Darrow, T.L. et ai. (1989) J.
10 Immunol. 142: 332 9 - 3 3 3 5; Horn, S.S. et ai. (1991) J. Im- munother. 10: 153 - 164; Kawakami, Y. et ai. (1992) J.
Immunol. 148: 638 - 643; Horn, S.5. et ai. (1993) J. Immu-nother. 13: 18 - 30; O'Neil, B.H. et ai. (1993) J. Immunol. 151: 1410 - 1418] . TIL-solut potilaista, joilla on 15 metastasoiva melanooma, tunnistavat yhteiset antigeenit, jotka sisältävät melanosyytti-melanooma-linjalle spesifiset kudosantigeenit in vitro [Kawakami, Y. et ai. (1993) J. Immunother. 14: 88 - 93; Anichini, A. et ai. (1993) J. Exp. Med. 177: 989 - 998] . Anti-melanooma-T-solut tuntuvat 20 olevan rikastuneita TIL-solujen joukossa johtuen luultavasti klonaalisesta ekspansiosta ja akkumulaatiosta kasvaimen kohtaan in vivo [Sensi, M. et ai. (1993) J. Exp. Med. 178: 1231 -1246]. Se tosiasia, että monet melanooma-potilaat muodostavat soluvälitteisen ja humoraalisen vas-25 teen näitä kasvaimia vastaan ja että melanoomat ekspres- soivat sekä MHC-antigeenej a että kasvaimeen assosioitunei-c\j ^ ta antigeenej a (TAA) antaa ehdottaa, että uusien me1anoo- ^ ma-antigeenien tunnistaminen ja karakterisointi on tärkeää 9 me1anoomapoti1aiden immunoterapiaa varten.
CD
>- 30 Perifeerisen veren lymfosyyttejä on käytetty t unin nistamaan mahdolliset melanoomakasvainantigeenit. Van Der ^ Bruggen et ai. (1991) Science 254: 1643 - 1647 ovat karak- o terisoineet geenin, joka koodittaa melanooma-antigeenia, jolle annettiin nimi MAGE-1, käyttäen T-soluklooneja, jot-o 00 35 ka muodostettiin sellaisten potilaiden perifeerisen veren 4 lymfosyyteistä, jotka oli toistuvasti immunisoitu in vivo mutagenisoiduilla kasvainsoluilla. Melanoomapotilaiden perifeerisen veren lymfosyyteistä peräisin olevia sytotoksi-sia T-soluja käytettiin tunnistamaan mahdollinen antigeeni-5 nen peptidi, jota MAGE-l-geeni kooditti [Traversari, C. et ai. (1992) J. Exp. Med. 176: 1453 - 1457]. Brichard et ai. (1993) J. Exp. Med. 178: 489 - 495, ovat myös karakterisoineet geenin, joka koodittaa melanooma-antigeenia, jolle annettiin nimi tyrosinaasi, käyttäen perifeerisen veren lym-10 fosyyttejä potilaista, jotka oli herkistetty toistuvalla kasvaimen _in vitro stimulaatiolla. Lisätukea melanooma-antigeenien terapeuttiselle vahvuudelle esittävät Brown et ai. (US-patentti numero 5 262 177) . Julkaisu Brown et ai. (US-patentti numero 5 262 177) koskee rekombinanttivac- 15 ciniavirusperusteista melanoomarokotetta, jossa melanooma-antigeenin p97 julkaistiin osoittavan suojaavan vaikutuksen kasvainsolualtistusta vastaan hiirimallissa. Uusien melanooma-antigeenien karakterisointi on tärkeää uusien syö-päimmunoterapiastrategioiden kehittämiseksi erikoisesti me-20 lanoomaa vastaan.
Keksinnön yhteenveto Tämä keksintö liittyy yleisesti nukleiinihapposek- vensseihin, jotka koodittavat melanooma-antigeenej a (MART- 1) , jotka T-lymfosyytit tunnistavat, ja näiden sekvenssien 25 koodittamiin proteiineihin ja peptideihin.
Erityisesti esillä oleva keksintö koskee itsenäi- sissä patenttivaatimuksissa esitettyä. Keksinnölle on tunes cvj nusomaista se, mitä itsenäisissä patenttivaatimuksissa esi- i o tetään. Epäitsenäiset patenttivaatimukset kohdistuvat kek- 30 sinnön erityisiin suoritusmuotoihin, x Tässä esitetään edelleen biotestit näille nukle-
IX
iinihapposekvensseille, proteiineille ja peptideille. Tämä m , , , o keksintö esittää myös peptidit, jotka ovat peräisin MART-1- ^ aminohapposekvenssistä ja joita on modifioitu niiden immu- 35 nogeenisyyden tehostamiseksi. Tässä keksinnössä esitetään myös näiden tässä kuvattujen nukleiinihapposekvenssien, 5 proteiinien, peptidien tai modifioitujen peptidien terapeuttiset käytöt.
Esillä olevan keksinnön yleinen aihe on esittää oleellisesti puhdistettu ja eristetty nukleiinihapposek-5 venssi, joka koodittaa MART-l-rnelanooma-antigeenia.
Tämän keksinnön toinen aihe on esittää yhdistelmä-DNA-molekyyli, joka sisältää vektorin ja MART-1-proteiinia koodattavan nukleiinihapposekvenssin kokonaan tai osittain.
Tämän keksinnön muu aihe on tuottaa rekombinantti-10 proteiinit, joita MART-1-proteiinia koodittavan nukleiinihapposekvenssin koko sekvenssi tai osittaissekvenssi koodittaa .
Tämän keksinnön lisäaihe on esittää monoklonaaliset tai polyklonaaliset vasta-aineet, j otka reagoivat MÄRT-1-15 * proteiinin, MART-1-peptidien tai niiden osien kanssa.
Tämän keksinnön aihe on esittää menetelmät MART-1-geenin tai MART-1-mRNA-molekyy1in tunnistamiseksi biologisessa näytteessä.
Tämän keksinnön muu aihe on esittää menetelmät 20 MART-1-proteiinin tai MART-1-peptidien tunnistamiseksi bio logisessa näytteessä.
Tämän keksinnön aihe on esittää diagnostiset menetelmät ihmisen tauteja, erikoisesti melanoomia ja metas-tasoivia melanoomia, vastaan.
25 Tämän keksinnön aihe on myös esittää melanoomaro- kotteet, jotka sisältävät MART-1-geeniä koodittavan nukle-iinihapposekvenssin kokonaan tai osittain tai sen vastaavan cu proteiinin, melanooman ehkäisemiseksi tai hoitamiseksi.
i q Tämän keksinnön lisäaihe on esittää immunogeeniset i co 30 peptidit, jotka ovat peräisin MART-l-proteiinisekvenssistä, x rokotekäyttöä varten.
cc Tämän keksinnön vielä yksi aihe on esittää MART-1- LT3 o proteiinisekvenssistä peräisin olevat peptidit, j oita on li modifioitu niiden immunogeenisyyden lisäämiseksi tai joiden ° 35 aiheuttamaa melanooman vastaista immuunivasteen induktiota on tehostettu tehostamalla niiden sitoutumista MHC-molekyy- 6 leihin, käytettäväksi tässä kuvatuissa profylaktisissa tai terapeuttisissa menetelmissä.
Lisäksi tässä keksinnössä kuvataan multivalentit rokotteet, jotka sisältävät MART-l-nukleiinihapposekvenssin 5 kokonaan tai osittain tai sen vastaavan proteiinin tai vastaavat peptidit ja ainakin yhden muun immunogeenisen molekyylin, joka kykenee muodostamaan vasta-aineiden tuoton nisäkkäässä melanooma-antigeenej a vastaan.
Tämän keksinnön mukaista nukleiinihapposekvenssiä 10 voidaan käyttää menetelmässä melanooman ehkäisemiseksi tai hoitamiseksi, joka sisältää vaiheen, jossa käytetään MÄRT-l-nukleiinihapposekvenssiä kokonaan tai osittain tai sen vastaavaa proteiinia geeniterapiaprotokollissa.
Tämän keksinnön lisäaihe on esittää immunogeeniset 15 peptidit, j otka ovat peräisin gpl00-melanooma-antigeenin proteiinisekvensseistä, käytettäviksi rokotteissa.
Tässä keksinnössä kuvataan vielä gplOO-melanooma-antigeenisekvensseistä peräisin olevat peptidit, joita on modifioitu niiden immunogeenisyyden lisäämiseksi tai niiden 20 aiheuttaman melanooman vastaisen immuunivasteen induktion tehostamiseksi tehostamalla niiden sitoutumista MHC-mole-kyyleihin, käytettäviksi tässä kuvatuissa profylaktisissa ja terapeuttisissa menetelmissä.
Tässä kuvattuja rokotteita voidaan käyttää menetel-25 massa profylaktista tai terapeuttista immunisaatiota varten ^ melanoomalle.
δ Tässä keksinnössä esitetään menetelmä sellaisten
CVJ
melanooma-antigeenien tunnistamiseksi, jotka voivat muodos-o ^ taa mahdolliset kohteet immunoterapialle.
30 Tässä keksinnössä kuvataan vielä menetelmä sellais- x £ ten immunogeenisten kandidaattipeptidien tunnistamiseksi, g jotka ovat peräisin joko MART-1- tai gplOO-sekvensseistä, § käytettäviksi immunoterapiassa.
δ
CVJ
7
Kuvioiden kuvaus
Kuviossa 1 esitetään MART-1-antigeeniä koodittavan ) cDNA-molekyylin nukleotidisekvenssi ja ennustettu aminohapposekvenssi . Hydrofobinen alue on alleviivattu, 5 Kuviot 2 j a 2B esittävät MART-1-peptidien titrauk- sen TIL-soluj en tunnistuksen suhteen. T2-soluj a inkuboi-tiin puhdistettuj en MART-1-peptidien M9-1, M9-2, M9-3, M10-2, M10-3, M10-4 j a M10-5 vaihtelevissa konsentraati- oissa j a lyysis TIL-kloonin A42 (kuvio 2A) tai TIL-linj an 10 TIL1235 (kuvio 2B) toimesta mitattiin neljän tunnin pitui sella sytotoksisella 51Cr-vapautustestillä niin, että E : T-suhde (effektori: kohde) oli 20:1 A42 -kloonin j a 40:1 TIL1235-kloonin suhteen. Peptidi M9-2 herkisti T2-solut konsentraatiossa 1 ng/ml. Puhdistetun peptidin M10-4 tun-15 nisti TIL1235-klooni, mutta ei A42-klooni (M9-1 | - |, M9-2 t - i, M9-3 - I, M10-2 A - A, M10-3 ▼ - M10-4 | - |, M10-5 + - +).
Kuviossa 3A esitetään potilaan 1200, jolla on me-tastasoiva melanooma, radionuklidiskandeeraus sen jälkeen, 20 kun hän oli saanut autologisten 111In-leimattujen TIL1200-solujen adoptiivisen siirron. Nuoli osoittaa yhtä TIL-so-lujen akkumulaatioaluetta, joka vastaa metastaattista vauriota vasemmassa reidessä.
Kuvio 3B esittää ihonalaisten metastasoivien kas-25 vainten regression sen jälkeen, kun hoidettiin TIL1200-soluilla yhdessä IL-2-proteiinin kanssa. Hoito alkoi vuo- C\l ^ rokautena 0.
C\l ^ Kuviot 4A ja 4B esittävät täyspitkän cDNA25-kloonin ? nukleiinihapposekvenssin. Aloitus- ja lopetuskodonit on CD , , ·- 3 0 alleviivattu.
jr Kuviossa 5A esitetään täyspitkän cDNA25-kloonin ^ aminohapposekvenssi. Antigeeninen peptidi on aileviivattu.
O
o Kuviossa 5B esitetään täyspitkän cDNA25-kloonin ^ aminohapposekvens s in (cDNA2 5FL), cDNA25-kloonin lyhennetyn o c\j 8 muodon (cDNA25TR), Pmell7-, ME20- ja gpl00-molekyylin vertailu (iosoittaa deleetiota; - osoittaa identtisyyttä).
Kuviot 6A ja 6B esittävät melanooman (kuvio 6A) ja vastasyntyneen melanosyyttisolulinjojen (kuvio 6B) ja eri-5 laisten tuoreiden kudosten (kuvio 6C) Northern blot -analyysin (10 - 20 μg kokonais-RNA:ta) cDNA2 5-koettimella (Sali-entsyymillä digestoitu pCRII-cDNA25-fragmentti) ja β-aktiini-koettimellä (Clontech) . Melanoomasolulinjat C32 j a 586mel j a vastasyntyneen melanosyyttisolulinj at 10 NHEM529, NHEM530 olivat hyvin heikosti positiivisia.
Kuviot 7A ja 7B esittävät gplOO-epitooppien ja epi-tooppianalyysissä testattuj en DNA-f ragment tien sijainnin ja tunnistuksen CTL-solujen toimesta. Kuvio 7A. Viisi epi-tooppianalyysissä testattua DNA-fragmenttia (D3, D5, D4, 15 C4, 25TR) on esitetty (---, identtinen aminohappo) . Tun nistettujen epitooppien sijainnit on alleviivattu. Kuvio 7B. On esitetty sellaisten COS 7 -solujen tunnistus CTL-soluj en (620-1, 620-2, 660-1, 1143, 1200) toimesta, jotka on transfektoitu kullakin pcDNA3-plasmidissa olevalla DNA-20 fragmentilla yhdessä HLA-A2.1-cDNA:n kanssa, IFN-gamma-eritystesteillä (+, tunnistettu; -, ei tunnistettu).
Kuviot 8A - 8D esittävät gplOO-epitooppien titrauk-sen herkistämällä HLA-A2.1+ T2 -solut CTL-lyysille. Sellaisten T2-solujen lyysi, joita esi-inkuboitiin peptidien 25 kanssa, testattiin neljän tunnin sytotoksisessa 51Cr-vapau-tustestissä. Kuvio 8A, G9154- () tai G10154-peptidin (·) q kanssa inkuboitujen T2-solujen lyysi TIL1200-solujen toi- c\j ^ mesta. Kuvio 8B, G9209- () tai G10208-peptidin (·) kanssa ? inkuboitujen T2-solujen lyysi TIL620-solujen toimesta.
CD
30 Kuvio 8C, G9280-peptidin () kanssa inkuboitujen T2-solujen ϊ lyysi TIL660-l-solujen toimesta. Kuvio 8D, G10-5-peptidin lo () kanssa inkuboitujen T2-solujen lyysi TIL660-2-solujen o g toimesta.
δ
• C\J
9
Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus
Keksinnön täydellisemmäksi ymmärtämiseksi on tässä kuvattu seuraavat määritelmät. Nukleiinihapposekvenssit sisältävät, mutta eivät ole rajoittuneet, DNA-, RNA- tai 5 cDNA-sekvenssit. Nukleiinihapposekvenssit tässä käytettyinä viittaavat eristettyyn ja puhdistettuun nukleiinihap-posekvenssiin. MART-1-lähetti-RNA (mRNA) viittaa yhteen tai useampaan RNA-transkriptiin, j oka on MART-1-geenin tuote. Oleellisesti homologinen tässä käytettynä viittaa 10 oleelliseen vastaavuuteen kuviossa 1 esitetyn MART-1-nuk-leiinihapposekvenssin (SEQ ID -numero 1) ja minkä tahansa muun nukleiinihapposekvenssin välillä. Oleellisesti homologinen tarkoittaa noin 50 - 100 % homologisesti homologista, suositeltavasti noin 70 - 100 % homologiaa j a suo-15 siteltavimmin noin 90 - 100 % homologiaa MART-1-sekvenssin j a minkä tahansa muun nukleiinihapposekvenssin välillä. Lisäksi oleellisesti homologinen tässä käytettynä viittaa myös oleellisiin vastaavuuksiin kuviossa 1 esitetyn MART-1-antigeenin aminohapposekvenssin (SEQ ID -numero 2) ja 20 muun aminohapposekvenssin välillä.
Pääasiallinen histokompatibiliteettikompleksi (MHC) on geneerinen nimitys, jonka tarkoitetaan sisältävän his-tokompatibiliteettiantigeenisysteemit, jotka on kuvattu eri lajeilla sisältäen ihmisen leukosyyttiantigeenit 25 (HLA).
Termi melanooma sisältää, mutta ei ole rajoittunut, c\j 5 melanoomat, metastasoivat melanoomat, melanoomat, jotka
CnJ
^ ovat peräisin joko melanosyyteistä tai melanosyyteille ? sukua olevista luomisöluista, melanokarsinoomat, melano- co 30 epitelioomat, melanosarkoomat, in situ melanoomat, pinnal- jr lisesti leviävän melanooman, nodulaarisen melanooman, pa- ^ hanlaatuisen kesakkomelanooman, akraalisen kesakkomaisen o o melanooman, invasiivisen melanooman tai perinnöllisen epä- tyypillisen syntymämerkin ja melanoomaoireyhtymän (FAM-M).
O
^ 35 Sellaiset melanoomat nisäkkäillä voivat johtua kromosomaa- 10 lisistä epänormaaliuksista, degeneratiivisista kasvu- ja kehityshäiriöistä, mitogeenisista aineista, ultraviolettisäteilystä (UV) , virusinfektioista, geenin epäsopivasta kudosekspressiosta, muutoksista geenin ekspressiossa tai 5 karsinogeenisista aineista. Edellä mainitut melanoomat voidaan diagnosoida, määrittää tai hoitaa menetelmillä, jotka on kuvattu esillä olevassa patenttihakemuksessa.
Epätyypillisellä syntymämerkillä tarkoitamme syntymämerkkiä, jolla on sellaiset ominaisuudet, jotka ovat 10 epänormaalej a j a voivat olla syövän esiasteita.
Melanooma-antigeeni11a tai immunogeenilla tarkoitamme MART-1-proteiinia kokonaan tai sen osia tai MART-1-proteiinisekvenssiin perustuvia peptidejä, jotka kykenevät aiheuttamaan soluvälitteisen tai humoraalisen immuunivas-15 teen nisäkkäällä. Sellaiset antigeenit voivat myös olla reaktiivisia vasta-aineiden kanssa sellaisista nisäkkäistä, jotka on immunisoitu MART-1-proteiinin koko sekvenssillä, osalla tai osilla siitä (SEQ ID -numero 2) . Sellaista proteiinia tai peptidiä voi koodittaa tämän keksin-20 nön mukainen kokonainen MART-l-nukleiinihapposekvenssi tai sen osa.
Immunogeenisella peptidillä tarkoitamme peptidiä, joka on peräisin MART-l-proteiinisekvenssistä tai gplOO-proteiinisekvenssistä, joka kykenee aiheuttamaan soluvä-25 litteisen tai humoraalisen immuunivasteen nisäkkäässä. Sellaiset peptidit voivat reagoida sellaisten vasta-ainei-
CVJ
£ den kanssa, jotka ovat peräisin eläimestä, joka on immu- ^ nisoitu peptideillä. Sellaiset peptidit ovat pituudeltaan 9 noin 5-20 aminohappoa, suositeltavaati noin 8-15 ami-
CD
i- 30 nohappoa j a suosit el tavimmin noin 9-10 aminohappoa .
Er Alan asiantunti j a ymmärtää, että esillä olevan kek-
CL
^ sinnön mukaisia biotestejä voidaan käyttää mistä tahansa o selkärankaislaj ista peräisin olevien biologisten näyttei- ^ den tai kudosten analysoimisessa. Suositeltavassa suori- o c\j 11 tustavassa analysoidaan nisäkkään biologisia näytteitä tai kudoksia.
Kudos sisältää, mutta ei ole rajoittunut, yksittäiset solut, kokonaiset elimet ja niiden osat. Biologiset 5 näytteet sisältävät, mutta eivät ole rajoittuneet, kudokset, nisäkkään kudosten primaariviljelmät, biopsianäyt-teet, patologianäytteet ja ruumiinavausnäytteet. Nisäkäs sisältää, mutta ei ole rajoittunut, ihmiset, apinat, koirat , kissat, hiiret, rotat, siat, lehmät, siat, hevoset, 10 lampaat ja vuohet.
Esillä oleva keksintö esittää nukleiinihapposek-venssin, joka koodittaa uutta me1anooma-antigeenia, jonka T-solut tunnistavat. Tälle uudelle melanooma-antigeenilie annettiin nimi MART-1 (melanoma antigen recognized by T-15 cells-1). MART-1-sekvenssillä ei ole mitään merkittävää homologiaa millekään tunnetulle me1anooma-antigeenille ja näin ollen se edustaa uutta melanooma-antigeenia. MART-1-antigeeni sisältää erittäin hydro f ob i s en alueen aminohapoissa 27 - 47 (SEQ ID -numero 2), jota seuraa kolme ar- 20 giniinijäännöstä, joka antaa ehdottaa membraanin läpi menevän proteiinin rakenteen. Vaikka mitään merkittävää homologiaa ei ole kokonaiseen proteiiniin, on olemassa 27 aminohapon pituinen osa-alue (aminohapot 57 - 83; SEQ ID -numero 2), joka on 37 % identtinen tyypin II membraanipro-25 teiinille, joka aiemmin tunnistettiin hiiren luonnollisen tappajasolun pintaproteiiniksi NKR-P1 [Yokoyama, W.M. et c\j g ai. (1991) J. Immunol. 147: 3229 - 3236] . MART-1 ei sisäl-
C\J
, lä leader™sekvenssiä, joka on tyypillinen monille tyypin S- 9 II membraaniproteiineille [Singer, S.J. et ai. (1990) 30 Annu. Rev. Cell Biol. 6: 247 - 296] .
g MART-1-RNA-molekyylin ekspressio tuntuu olevan ra- ^ j oittunut tuoreeseen j a vilj eltyyn melanoomaan j a me1ano- o o syyttisoluiinjoihin ja ihmisen verkkokalvoon; ekspressiota ^ ei ole löydetty mistään muusta tuoreesta tai viljellystä 00 35 kudoksesta tai muista testatuista histologisista kasvain- 12 näytteistä. MART-1-cDNA-sekvenssi on esitetty kuviossa 1 {SEQ ID -numero 1), MART-l-proteiinin ennustettu aminohapposekvenssi on myös esitetty kuviossa 1 (SEQ ID -numero 1) .
5 Kuviossa 1 esitetty MART-1-nukleiinihapposekvenssi (SEQ ID -numero 1) edustaa keksinnön suositeltavaa suoritustapaa. Alan asiantuntijan on kuitenkin ymmärrettävä, että johtuen geneettisen koodin degeneraatiosta, voivat kuviossa 1 esitetyn cDNA-sekvenssin (SEQ ID -numero 1) 10 variaatiot vielä johtaa DNA-sekvenssiin, joka kykenee koo-dittamaan MART-l-proteiiniantigeenia. Sellaiset DNA-sekvenssit ovat sen vuoksi toiminnallisesti ekvivalentteja kuviossa 1 kuvatun sekvenssin (SEQ ID -numero 1) kanssa ja niiden on tarkoitettu kuuluvan esillä olevaan keksintöön. 15 Lisäksi, alan asiantuntija ymmärtää, että annetussa lajis-sa on kuviossa 1 esitetyn MART-1-nukleiinihapposekvenssin (SEQ ID -numero 1) luonnollisesti esiintyviä alleelisia variaatioita, näiden variaatioiden on myös tarkoitettu kuuluvan esillä olevaan keksintöön.
20 Ennustettu MART-1-antigeeni on 118 aminohapon pro teiini , jonka massa on noin 13 (kd). Tämä keksintö sisäl-tää lisäksi MART-l-proteiinin tai sen peptidit tai analogit , joilla on oleellisesti sama toiminta kuin tämän keksinnön mukaisella MART-1-ant igeeni11a tai MART-l-prote-25 iinilla. Sellaiset proteiinit tai polypeptidit sisältävät, mutta eivät ole rajoittuneet, proteiinin fragmentin tai
CM
g MART-l-proteiinin substituutio-, lisäys- tai deleetiomu- ^ tantin. Tämä keksintö sisältää myös proteiinit tai pepti- S5 dit, jotka ovat oleellisesti homologisia MART-l-antigee-
CD
Ί- 30 nille. Oleellisesti homologinen tarkoittaa noin 50 - 100 %
En homologiaa, suositeltavasti noin 70 - 100 % homologiaa ja Q_ suositeltavammin noin 90 - 100 % homologiaa MART-l-amino-o happosekvenssin ja minkä tahansa muun aminohapposekvenssin
LO
^ tai proteiinin tai peptidin välillä, o
CM
13
Termi "analogi" sisältää minkä tahansa polypepti-din, jolla on aminohappojäännössekvenssi, joka on oleellisesti identtinen MART-1-sekvenssille, joka tässä on spesifisesti esitetty (kuvio 1; SEQ ID -numero 1) , jossa yksi 5 tai useampi jäännös on konservoituneesti substituoitu toiminnallisesti samankaltaisella jäännöksellä ja joka sisältää ne MART-1-antigeenin toiminnalliset ominaisuudet, jotka tässä on kuvattu. Esimerkit konservoituneista substituutioista sisältävät yhden ei-polaarisen (hydrofobisen) 10 jäännöksen, kuten isoleusiinin, valiinin, leusiinin tai metioniinin, substituution toisella ei-polaarisella jäännöksellä, yhden polaarisen (hydrofiilisen) jäännöksen substituoimisen toisella polaarisella jäännöksellä, kuten arginiinin ja lysiinin välillä, glutamiinin ja asparagii-15 nin välillä, glysiinin ja seriinin välillä, yhden emäksisen jäännöksen, kuten lysiinin, arginiinin tai histidii-nin, substituoimisen toisella emäksisellä jäännöksellä, tai yhden happaman jäännöksen, kuten asparagiinihapon tai glutamiinihapon, substituoimisen toisella happamalla jään-20 nöksellä.
Fraasi "konservoitunut substituutio" sisältää myös kemiallisesti derivatisoidun jäännöksen käytön ei-deriva- tisoidun jäännöksen tilalla. "Kemiallinen j ohdannainen" viittaa aiheena olevaan polypeptidiin, jolla on yksi tai 25 useampi jäännös kemiallisesti derivatisoitu antamalla sen toiminnallisen sivuryhmän reagoida. Esimerkit sellaisista c\j £ derivatisoiduista molekyyleista sisältävät esimerkiksi ne ^ molekyylit, joissa vapaat aminoryhmät on derivatisoitu 9 niin, että ne muodostavat amiinivetyklorideja, p-toluee- co >- 30 ni sul f onyyl i ryhmiä, karbobentsoksi ryhmiä, t-butyylioksi- c karbonyy1iryhmiä, klooriasetyyliryhmiä tai formyyliryhmiä.
^ Vapaat karboksyyliryhmät voidaan derivatisoida niin, että o ne muodostavat suoloja, metyyli- ja etyyliestereitä tai muun tyyppisiä estereitä tai hydratsideja. Vapaat hydrok-00 35 syyliryhmät voidaan derivatisoida niin, että ne muodosta- 14 vat O-asyyli- tai O-alkyylijohdannaisia. Histidiinin imi-datsolin typpi voidaan derivatisoida niin, että se muodostaa N-im-bentsyylihistidiinin. Kemiallisiin johdannaisiin sisältyvät myös ne proteiinit tai peptidit, jotka sisäl-5 tävät yhden tai useamman 20 standardiaminohapon luonnollisesti esiintyvän aminohappojohdannaisen. Esimerkiksi: 4-hydroksiproliini voi substituoida proliinin; lysiini voidaan substituoida 5-hydroksilysiinillä; histidiini voidaan substituoida 3-metyylihistidiinillä; seriini voidaan subs-10 tituoida homoseriinillä; ja lysiini voidaan substituoisa ornitiinilla. Esillä olevan keksinnön mukaiset proteiinit tai polypeptidit sisältävät myös kaikki polypeptidit, joissa on yksi tai useampi lisäys ja/tai deleetio tai jäännös suhteessa sen polypeptidin sekvenssiin, jonka sek-15 venssiä koodittaa MART-1-DNA niin kauan kuin riittävä aktiivisuus säilyy.
Tämä keksintö esittää myös yhdistelmä-DNA-molekyy-
lin, joka sisältää MART-l-nukleiinihapposekvenssin (SEQ ID
-numero 1) kokonaan tai osittain ja vektorin. Esillä ole- 20 vassa keksinnössä käytettäviksi sopivat ekspressiovektorit voivat sisältää ainakin yhden ekspressiosäätelyelementin, joka on toiminnallisesti liitetty nukleiinihapposekvens- siin. Ekspressiosäätelyelementit insertoidaan vektoriin nukleiinihapposekvenssin ekspression säätelemiseksi j a 25 reguloimiseksi. Esimerkit ekspressiosäätelyelementeistä ^ sisältävät, mutta eivät ole rajoittuneet, lac-systeemin, o lambda-faagin operaattori- ja promoottorialueet, hiivan c\j ^ promoottorit ja promoottorit, jotka ovat peräisin po- ° lyoma-, adeno-, retro- tai SV40-viruksesta. Suoriteltavat co 30 tai tarvittavat toiminnalliset elementit sisältävät lisäk-x £ si, mutta eivät ole rajoittuneet, leader-sekvenssin, lope- m tuskodonit, polyadenylaatiosignaalit ja mitkä tahansa muut o g sekvenssit, jotka ovat tarpeen tai suositeltavia nukleii- £ nihapposekvenssin sopivaa transkriptiota ja sen jälkeistä ^ 35 translaatiota varten isäntäsysteemissä. Alan asiantuntijan 15 tulee ymmärtää, että tarvittavien tai suositeltavien eks-pressiosäätelyelementtien oikea yhdistelmä riippuu valitusta isäntäsysteemistä. On edelleen ymmärrettävä, että ekspressiovektorin tulee sisältää lisäelementit, jotka 5 ovat tarpeen nukleiinihapposekvenssin sisältävän ekspressiovektorin siirtämiseksi isäntäsysteemiin ja sen jälkei-sen replikaation. Esimerkit sellaisista elementeistä sisältävät , mutta eivät ole raj oittuneet, repiikaatio-origot j a selektiomarkkerit. Alan asiantuntij an tulee lisäksi 10 ymmärtää, että sellaiset vektorit voidaan helposti rakentaa käyttäen tavanomaisia menetelmiä [Ausubel et ai. (1987) teoksessa "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, New York, New York] tai ovat kaupal-lisesti saatavissa.
15 Esillä olevan keksinnön toinen näkökohta koskee isäntäorganismia, johon rekombinanttiekspressiovektori, joka sisältää MART-1-nukleiinihapposekvenssin kokonaan tai osittain, on insertoitu. Tämän keksinnön mukaisella MART-1-nukle i inihapposekvens sillä t rans formoidut isäntäsolut 20 sisältävät eukaryoottiset solut, kuten eläin-, kasvi-, hyönteis- ja hiivasolut, ja prokaryoottiset solut, kuten E. coli -solut. Keinot, joilla geenin sisältävä vektori kuljetetaan soluun sisältävät, mutta eivät ole rajoittuneet, mikroinjektion, elektroporaation, transduktion tai 25 transfektion käyttäen DEAE-dekstraania, lipofektion, kal- siumfosfaattimenetelmän tai muut alan asiantuntijan tunteen ^ mat menetelmät [Sambrook et ai. (1989) teoksessa "Molecu-
CVJ
^ lar Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor ? Press, Plainview, New York].
CD
30 Suositeltavassa suoritustavassa käytetään eukary- κ oottisia ekspressiovektoreita, jotka toimivat eukaryootti- ^ sissa soluissa. Esimerkit sellaisista vektoreista sisältä- o o vät, mutta eivät ole raj oittuneet, retrovirusvektorit, ^ vaeeiniavirusvektorit, adenovirusvektorit, herpesvirusvek-
O
^ 35 torit, linturokkovirusvektorit, bakteerien ekspressiovek- 16 torit, plasmidit, kuten pcDNA3-plasmidin (Invitrogen, San Diego, CA) , tai bakulovirussiirtovektorit. Suositeltavat eukaryoottiset solulinjat sisältävät, mutta eivät ole rajoittuneet, COS-solut, CHO-solut, HeLa-solut, NIH/3T3-SO-5 lut, 293-solut (ATCC # CRL1537), T2-solut, dendriittisolut tai monosyytit. Erityisen suositeltavassa suoritustavassa on MART-l-rekombinanttiproteiiniekspressiovektori siirretty nisäkässoluihin, kuten NIH3T3-, COS-, CHO-, 293-solui-hin (ATCC #CRL1537), T2-soluihin, dendriittisoluihin tai 10 monosyytteihin MART-1-proteiinin oikean prosessoinnin ja modifikaation varmistamiseksi. Vaihtoehtoisessa suoritustavassa MART-1-cDNA siirretään COS7-soluihin [Gluzman, Y. et ai. (1981) Cell 23 : 175 - 182] . Sopivan solun valinta kuuluu alan asiantuntijan taitoihin.
15 Yhdessä suoritustavassa ekspressoitu MART-1-rekom- binanttiproteiini voidaan tunnistaa alalla tunnetuilla menetelmillä, jotka sisältävät Coomassie blue -värjäyksen j a Western blottauksen käyttäen MART-1-proteiinille spesifisiä vasta-aineita.
20 Lisäsuoritustavassa isäntäsolujen ekspressoima re- kombinanttiproteiini voidaan saada raakalysaattina tai se voidaan puhdistaa standardeilla proteiinipuhdistusmenetel-millä, jotka alalla tunnetaan, jotka voivat sisältää erottavan saostuksen, molekyyliseulakromatografiän, ioninvaih- 25 tokromatografiän, isoelektrisen fokusoinnin, geelielektro- foreesin, affiniteetti- ja immunoaffiniteettikromatogra-
C\J
£ fian ja niiden kaltaiset menetelmät [Ausubel et ai. (1987) c\j ^ teoksessa "Current Protocols in Molecular Biology", John ? Wiley and Sons, New York, New York]. Immunoaffiniteetti- co 30 kromatografiän tapauksessa rekombinanttiproteiini voidaan
Er puhdistaa ajamalla se pylvään läpi, joka sisältää resii- ^ niä, johon on sidottu vasta-aineet, jotka ovat spesifisiä o o MART-1-proteiinille [Ausubel et ai. (1987) teoksessa ^ "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and ^ 35 Sons, New York, New York].
17 Tämän keksinnön mukainen nukleiinihapposekvenssi tai sen osat ovat käyttökelpoisia koettimina tunnistettaessa MART-1-geenin ekspressio normaalissa ja sairaassa kudoksessa. Sen vuoksi esillä olevan keksinnön toinen nä-5 kökohta koskee biotestiä, jolla tunnistetaan MART-1-proteiinia koodittava lähetti-RNA biologisessa näytteessä, joka sisältää vaiheet, joissa (a) saatetaan tämän keksinnön mukainen nukleiinihapposekvenssi kokonaan tai sen osa kosketukseen mainitun biologisen näytteen kanssa olosuhteis-10 sa, jotka sallivat kompleksin muodostumisen mainitun nuk-leiinihapposekvenssin ja mainitun lähetti-RNA-molekyylin välille, (b) tunnistetaan mainitut kompleksit, ja (c) määritetään mainitun lähetti-RNA-molekyylin taso.
RNA voidaan eristää solun kokonais-RNA-molekyyleinä 15 tai poly (A)+-RNA-molekyyleinä. Solun kokonais-RNA voidaan eristää erilaisilla menetelmillä, jotka ovat alan asiantuntijalle tuttuja [Ausubel et ai. (1987) teoksessa "Cur rent Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, New York]. Sellaiset menetelmät sisältävät RNA-molekyylin 20 uuttamisen erottavalla saostuksella [Birnboim, H. C. (1988) Nucleic Acids Res. 16: 1487 - 1497], RNA-molekyylin uuttamisen orgaanisilla liuottimilla [Chomczynski, P. et ai.
(1987) Anal. Biochem. 162: 156 - 159] ja RNA-molekyylin uuttamisen vahvoilla denaturanteilla [Chirgwin, J.M. et 25 ai. (1979) Biochemistry 18: 5294 - 5299] . Poly(A)+-RNA voidaan selektoida solun kokonais-RNA-molekyyleistä affini-cvj g teettikromatografiällä oligo-d(T)-pylväissä [Aviv, H. et c\] , ai. (1972) Proc. Natl. Acad. Sei. 69: 1408 - 1412] . Esi- ί 18 179], RNase-suojausmenetelmän [Sambrook et ai. (1989) teoksessa "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY] , polymeraasiketjureaktion [Watson, J.D, et al. (1992) teoksessa "Recombinant 5 DNA", 2. painos, W.H. Freeman and Company, New York] j a tuman run-off-testit [Ausubel et al. (1987) teoksessa "Current Protocols in Molecular Biology", lisäosa 9 (1990) , John Wiley and Sons, New York, New York] .
Biotestin vaiheessa (b) olevien kompleksien tunnis-10 tus voidaan suorittaa myös erilaisilla menetelmillä. Kompleksien tunnistus signaalin amplifikaatiolla voidaan suorittaa useilla tavanomaisilla leimausmenetelmillä, sisältäen radioaktiiviset leimat ja entsyymit [Sambrook et al. (1989) teoksessa "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 15 Cold Spring Harbor Press, Plainview, New York; Ausubel et al. (1987) teoksessa "Current Protocols in Molecular Bio logy" , John Wiley and Sons, New York, New York] . Radioaktiivisuus leimauksessa käytettävät käyt t öpakkauks e t ovat myös kaupallisesti saatavissa. MART-l-nukleiinihapposek-20 venssi, jota käytetään koettimena biotestin vaiheessa (c), voi olla RNA- tai DNA-molekyyli. Suositeltavat menetelmät DNA-sekvenssien leimaamiseksi tapahtuvat 32P-leimalla käyttäen Klenow-entsyymiä tai polynukleotidikinaasia. RNA- tai ribonukleotidikoetinsekvenssien suositeltavat leimausmene-25 telmät tapahtuvat 32P- tai 35S-leimalla käyttäen RNA-poly- meraaseja. Lisäksi on olemassa tunnettuja ei-radioaktiivi-c\j £ siä menetelmiä signaalin amplifioimiseksi sisältäen mene- ^ telmät, joilla kiinnitetään kemiallisia ryhmiä pyrimidii- 9 ni- ja puriinirenkaisiin [Dale, R.N.K. et al. (1973) Proc.
30 Natl. Avad. Sei. 70: 2238 - 2242; Heck, R.F. (1968) S. Am. ir Chem. Soc. 90: 5518 - 5523] , menetelmät, jotka sallivat ^ tunnistuksen kemiluminisenssilla [Barton, S.K. et al.
o (1992) J. Am. Chem. Soc. 114: 8736 - 8740] ja menetelmät,
LO
^ joissa käytetään biotinyloituja nukleiinihappokoettimia ^ 35 [Johnson, T.K. et al. (1983) Anal. Biochem. 133: 125 - 19 131; Erickson, P.F. et ai. (1982) J, of Immunology Methods 51: 241 - 249; Matthaei, F.S. et al. (1986) Anal. Biochem.
157: 123 - 128] ja menetelmät, jotka sallivat tunnistuksen fluoresenssilla käyttäen kaupallisesti saatavia tuotteita.
5 Ei-radioaktiiviset leimauskäyttöpakkaukset ovat myös kaupallisesti saatavissa.
Esimerkit biologisista näytteistä, joita voidaan käyttää tässä biotestissä sisältävät, mutta eivät ole rajoittuneet, primaariset nisäkäsvilj elmät, nisäkäsjatkoso-10 lulinjat, kuten melanosyyttisolulinjat, nisäkkään elimet, kuten ihon tai verkkokalvon, kudokset, biopsianäytteet, kasvaimet, patologiset näytteet ja ruumiinavausnäytteet.
o n
Suositeltavassa suoritustavassa käytetään P-lei-malla radioaktiiviseksi leimattua MART-1-koetintä, kuten 15 on esitetty esimerkissä 1. MART-1-koetin on suositeltavasta kuvion 1 mukainen täyspitkä cDNA (SEQ ID -numero 1) . Noin 1,6 kiloemäksen (kb) pituinen cDNA (kuvio 1; SEQ ID -numero 1) kloonattiin vektoriin j a tuloksena syntynyt plasmidi talletettiin American Type Culture Collection 20 -kokoelmaan (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852 USA, 14.4.1994 ja sille annettiin ATCC koodinumero 75738. Täyspitkä MART-l-nukleiinihapposekvenssi voidaan eristää pCRII-plasmidista digestoimalla Hindlll- ja Xhol-restriktioentsyymeillä. Sitten tätä 1,6 kb pituista nukle-25 iinihapposekvenssiä voidaan käyttää koettimena. Tätä koe- tinta käytetään tunnistamaan MART-1-mRNA niiden kokonaisen q RNA-molekyylien tai poly A+ RNA -molekyylien joukossa, jot en ^ ka eristetään erilaisista kudoksista tai biologisista ? näytteistä.
co 30 Toisessa suoritustavassa käytetään oligonukleoti- ϊ diparien, jotka perustuvat kuvion 1 mukaiseen MART-l-sek- u-, venssiin (SEQ ID -numero 1) , yhdistelmiä polymeraasiket- o o jureaktioalukkeina (PCR) MART-l-mRNA-molekyylin tunnista- ^ miseksi biologisessa näytteessä. Näitä alukkeita voidaan
O
^ 35 käyttää menetelmässä, jossa seurataan käänteiskopioijaent- 20 syymi - polymeraasiketjureaktiomenetelmää (RT-PCR) valitun RNA-nukleiinihapposekvenssien amplifioimiseksi, kuten on kuvattu yksityiskohtaisesti teoksessa Ausubel et ai, (toim.) (1987) "Current Protocols in Molecular Biology", 5 kappale 15, John Wiley and Sons, New York, New York. Oli-gonukleotidit voidaan syntetisoida automatisoiduilla laitteilla, joita useat valmistajat myyvät, tai ne voidaan valmistaa kaupallisesti perustuen tämän keksinnön mukaiseen nukleiinihapposekvenssiin, Alan asiantuntija tietää, 10 miten valita MART-1-nukleiinihapposekvenssiin perustuvat PCR-alukkeet näytteen MART-1-RNA-molekyylin amplifioimiseksi .
Tämän keksinnön mukainen MART-l-nukleiinihapposek-venssi tai osat siitä (kuvio 1; SEQ ID -numero 1) ovat 15 käyttökelpoisia MART-1-geenin muutosten tunnistamiseksi normaalissa tai sairaassa nisäkäskudoksessa. Muutoksella tarkoitamme lisäyksiä, deleetioita, substituutioita tai duplikaatioita MART-1-geenisekvenssissä tai MART-l-geeni-sekvenssin geeniamplifikaatiota. Sen vuoksi toinen esillä 20 olevan keksinnön näkökohta koskee testiä, jolla tunnistetaan MART-1-geenin muutokset biologisessa näytteessä, joka sisältää vaiheet, joissa (a) saatetaan tämän keksinnön mukainen nukleiinihapposekvenssi kokonaan tai osa siitä kosketukseen biologisesta näytteestä eristetyn genomisen 25 DNA:n kanssa olosuhteissa, jotka sallivat kompleksin muodostumisen mainitun nukleiinihapposekvenssin ja mainitun c\j £ genomisen DNA:n välille, (b) tunnistetaan mainitut komp- ^ leksit, ja (c) määritetään muutokset mainitussa MART-1- ? geenissä vertaamalla verrokkinäytteeseen.
co 30 Standardimenetelmät DNA:n eristämiseksi biologises- ir ta näytteestä, geenimuutosten tunnistamiseksi j a MART -1 - Q_ ^ nukleiinihappokoettimen ja genomisten DNA-sekvenssien vä- o listen kompleksien tunnistamiseksi on esitetty sellaisissa ^ käsikirjoissa, kuten Sambrook et ai. (toim.)(1989) "Mole- o 00 35 cular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor 21
Press, Plainview, New York ja Ausubel et al. (toim.) (1987) "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, New York, New York.
Tämän keksinnön mukaisia MART-l-nukleiinihapposek-5 venssejä (kuvio 1; SEQ ID -numero 1) voidaan myös käyttää koettimina MART-1-homologien eritämiseksi muista lajeista. Suositeltavassa suoritustavassa MART-l-cDNA-molekyyliä (kuvio 1; SEQ ID -numero 1) käytetään seulottaessa nisäkkään cDNA-kirjastoa, positiiviset kloonit valitaan ja sek-10 vensoidaan. Esimerkit kudoslähteistä, joista cDNA-kirjasto voidaan syntetisoida sisältävät, mutta eivät ole rajoittuneet, ihon, verkkokalvon, melanosyytit, vastasyntyneen ihon ja sikiöt. Melanoomakirjasto seulotaan suositeltavasta käyttäen MART-1-cDNA-molekyyliä koettimena (kuvio 1 ; 15 SEQ ID -numero 1). Alan asiantuntija ymmärtää, että homologien tunnistamiseksi tulee käyttää sopivia hybridisaatio -olosuhteita . Tavanomaiset menetelmät nukleiinihappo-hybridi saat iota, kirjastojen valmistusta ja kloonausmene-telmiä varten on kuvattu teoksissa Sambrook et ai. 20 (toim.)(1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press, Plainview, New York ja Ausubel et al. (toim.) "Current Protocols in Molecular Biology" (1987), John Wiley and Sons, New York, New York.
Tiedetään, että MART-1-proteiini kokonaan tai sen 25 osat toimivat antigeeninä, joka on läsnä melanoomasoluis-sa. Sen vuoksi tämän keksinnön toinen näkökohta on esittää C\1 ^ MART-1-nukleiinihappokoettimet käytettäviksi tunnistetta- c\j ^ essa MART-1-RNA-molekyylien läsnäolo tai muutokset MART-l- ° mRNA-tasoissa biologisessa näytteessä, joka on eristetty
CD
30 nisäkkäästä, j oka on sairastunut. Esimerkit sellaisista g taudeista sisältävät, mutta eivät ole rajoittuneet, mela- ^ noomat. Muutoksilla MART-1-mRNA-tasoissa tarkoitamme ko- o o hoamista tai alenemista RNA-molekyylin tasossa suhteessa ^ verrokkinäytteeseen tai MART-l-mRNA-molekyylin ilmestymis- 00 35 tä tai katoamista suhteessa verrokkinäytteeseen. MART-1- 22 mRNA-molekyylin muutosten tunnistus sallii diagnoosin tai tautitilan varmistamisen. Sen vuoksi muutokset MART-1-mRNA-tasossa voivat olla ennustavia sairastuneen nisäkkään prognoosille.
5 Toisessa suoritustavassa tämän keksinnön mukaista nukleiinihappoa voidaan käyttää in situ hybridisäätiössä nisäkkään kudoksilla MART-1-geenin tarkan soluekspression paikan määrittämiseksi kudoksessa. Suositeltava menetelmä MART-1-nukleiinihapposekvenssin leimaamiseksi on synteti-10 soida 35S-leimattu RNA-koetin in vitro transkriptiolla käyttäen SP6-polymeraasia. MART-l-plasmidissa (ATCC koodi-numero 75738) sense-juoste on T7-promoottorin säätelyn alaisuudessa, antisense-juoste on SP6-promoottorin säätelyn alaisuudessa. On suositeltavaa, että koetin hydroly-15 soidaan niin, että koettimen pituudeksi tulee noin 400 -200 emäsparia. Tavanomaiset menetelmät kudoksen valmistamiseksi in situ hybridisaatiota varten, koettimien synte-tisoimiseksi ja signaalin tunnistamiseksi voidaan löytää teoksista Ausubel et ai. (toim.)(1987) "Current Protocols 20 in Molecular Biology", John Wiley and Sons, New York, New York, kappale 14, ja Vander Ploeg, M. , Raap, A.K. (1988) "New Frontiers in Cytology", Goerttler, K. , Feichter, G.E., Witte, S. (toim.), sivut 13 - 21, Springer-Verlag, New York. Sitten koetin saatetaan kosketukseen nisäkäsku-25 dosleikkeiden kanssa ja in situ analyysit suoritetaan tavanomaisin menetelmin. Esimerkit kudoksista, joita voidaan
CM
g käyttää sisältävät, mutta eivät ole rajoittuneet, nisäk- ^ kään sikiöt, aikuisen nisäkkään kudokset, kuten iho, imu- l"'' 9 solmukkeet ja verkkokalvo, biopsianäytteet, patologiset cd T- 30 näytteet ja ruumiinavausnäytteet. Suositeltavassa suori- jr tustavassa in situ MART-l-koettimia voidaan käyttää MART- ^ 1-RNA-ekspression arvioimiseksi invasiivisen aikaisen πίθο lanooman suhteen sairaassa kudoksessa niin, että karakte-
LO
^ risoidaan me1anoomavaurion radiaaliset ja vertikaaliset o ^ 35 kasvuvaiheet ja määritetään taudin rajat kudoksessa.
23
Vielä eräässä tämän keksinnön suoritustavassa MART-1-nukleiinihapposekvenssiä tai osia siitä (SEQ ID -numero 1) voidaan käyttää siirtogeenisten eläinten muodostamiseksi. MART-1-geeni viedään sisään eläimeen tai eläimen esi-5 isään suositeltavaati alkiovaiheessa, suositeltavasti yksi soluvaiheen lopussa ja yleensä ei myöhemmin kuin noin kahdeksansoluvaiheessa. On olemassa useita tapoja, joilla sellaiset siirtogeeniset eläimet, joissa on MART-1-geeni, voidaan valmistaa. Yksi menetelmä sisältää sellaisten ret-10 rovirusten käytön, joissa on MART-1-sekvenssi kokonaan tai osa siitä. Siirtogeenin sisältävät retrovirukset viedään sisään eläimen alkioon transfektiolla. Muut menetelmät sisältävät siirtogeenin suoran injektion alkioon. Vielä muut menetelmät sisältävät alan asiantuntijoiden tuntemat 15 alkion kantasolumenetelmän tai homologisen rekombinaatio-menetelmän käytön. Esimerkit eläimistä, joihin MART-1-siirtogeeni voidaan viedä sisältävät, mutta eivät ole rajoittuneet , kädelliset, hiiret, rotat tai muut jyrsijät. Sellaiset siirtogeeniset eläimet voivat olla käyttökelpoi-20 siä biologisina malleina melanooman tutkimiseen ja diagnostisten ja terapeuttisten menetelmien arvioimiseksi melanoomaa varten.
Tämä keksintö sisältää edelleen vasta-aineen tai vasta-aineet, jotka reagoivat MART-1-proteiinin tai sen 25 peptidien tai modifioitujen peptidien tai analogien, joilla on kuviossa 1 määritelty aminohapposekvenssi (SEQ ID c\j 5 -numero 2), tai sen uniikin osan kanssa. Tässä keksinnön ^ suoritustavassa vasta-aineet ovat monoklonaalisia tai po- ? lyklonaalisia alkuperältään. Vasta-aineiden muodostukeen to „ , 30 käytetty MART-1-proteiini tai peptidit voivat olla perai- ir sin luonnollisista lähteistä tai rekombinanttilähteistä
CL
lq tai ne voidaan muodostaa kemiallisella synteesillä. Luon- o o nolliset MART-1-proteiinit voidaan eristää nisäkkään bio- ^ logisista näytteistä. Biologiset näytteet sisältävät, mut- 00 35 ta eivät ole rajoittuneet, nisäkkään kudokset, kuten tuo- 24 reen melanooman, ihon, verkkokalvon, nisäkässolujen primaariset tai jatkosoluviljelmät, kuten melanoomaviljelmät tai viljellyt melanosyytit. Luonnolliset MART-1-proteiinit voidaan eristää samoilla menetelmillä kuin on kuvattu yllä 5 rekombinanttiproteiinej a varten. MART-l-rekombinanttipro-teiinit tai peptidit voidaan tuottaa ja puhdistaa tavanomaisin menetelmin. Synteettiset MART-1-peptidit voidaan tilata ja valmistaa kaupallisesti perustuen esillä olevan keksinnön mukaiseen ennustettuun aminohapposekvenssiin 10 (kuvio 1; SEQ ID -numero 2) tai syntetisoida alan asiantunti j an tuntemin menetelmin [Merrifield, R.B. (1963) J. Amer. Soc. 85: 2149]. Esimerkit MART-1-peptideistä sisältävät , mutta eivät ole rajoittuneet, peptidin AAGIGILTV (M9-2; SEQ ID -numero 4), EAAGIGILTV (M10-3; SEQ ID -nume-15 ro 17) ja AAGIGILTVI (M10-4; SEQ ID -numero 18)(peptidit kirjoitetaan aminohappojen yksikirjainkoodilla) . Suositeltavin peptidi on AAGIGILTV (SEQ ID -numero 4).
MART-1-proteiinisekvenssistä peräisin olevat peptidit voidaan vaihtoehtoisesti modifioida niiden immuno-20 geenisyyden kohottamiseksi tehostamalla peptidin sitoutumista niihin MHC-molekyyleihin, joihin peptidi sisältyy. Esimerkit sellaisista käyttökelpoisista modifioiduista MART-1-peptideistä on esitetty, mutta eivät ole rajoittuneet , taulukossa 14. Suositeltavassa suoritustavassa MART-25 1-peptidi, joka on modifioitu niin, että sen sitoutuminen MHC luokan I -molekyyleihin on tehostunut, on AAGIGILTV c\j £ (SEQ ID -numero 4). Esimerkin vuoksi modifioidut peptidit c\j , ALGIGILTV (M9-2-2L)(SEQ ID -numero 50), WAGIGILTV (M9-2- t>· 9 1W)(SEQ ID -numero 53), FAGIGILTV (M9-2-1F)(SEQ ID -numero
CD
30 54) ja AAYIGILTV (M9-2-3Y) (SEQ ID -numero 58) . Peptidi tai ir modifioitu peptidi voidaan konjugoida kantajamolekyyliin lq peptidin antigeeni syyden tehostamiseksi. Esimerkit kanta- o o jamolekyyleistä sisältävät, mutta eivät ole rajoittuneet, g ihmisen albumiinin, naudan albumiinin, lipoproteiinin ja 00 35 Keyhole limpet -hemosyaniinin ("Basic and Clinical Immuno- 25 logy" (1991) Stites, D.P, ja Terr, A.I. (toim.), Appleton and Lange, Norwalk, Connecticut, San Mateo, Kalifornia].
Esimerkit esillä olevan keksinnön mukaisissa tunnistusmenetelmissä käytettävistä vasta-ainemolekyyleistä 5 ovat koskemattomat immunoglobuliinimolekyylit, oleellisesti koskemattomat immunoglobuliinimolekyylit tai ne osat immunoglobuliinimolekyyliä, jotka sisältävät antigeeniä sitovan kohdan, sisältäen ne osat immunoglobuliinimolekyyliä, jotka tunnetaan alalla F(ab)-, F(ab')-, F(ab)2- ja 10 F(v)-osina. Polyklonaaliset tai monoklonaaliset vasta-aineet voidaan valmistaa alalla tunnetuilla menetelmillä [Kohler ja Milstein (1975) Nature 256: 495 - 497; Campbell "Monoclonal Antibody Technology, the Production and Characterization of Rodent and Human Hybridomas" teoksessa 15 Burdon et ai. (toim.)(1985) "Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology", osa 13, Elsevier Science Publishers, Amsterdam] . Vasta-aineet tai antigeeniä sitovat fragmentit voidaan tuottaa myös yhdistelmä-DNA-mene-telmillä. Sekä raskas- että kevytketjugeenien ekspressio-20 menetelmät E. coli -bakteerissa ovat aiheena PCT-patent-tihakemuksissa, j oiden julkaisunumerot ovat WO 901 443, W0 901 443 ja WO 9 014 424, ja julkaisussa Huse et ai. (1989) Science 246: 1275 - 1281.
Tämän keksinnön mukaiset vasta-aineet voivat rea-25 goida luonnollisen ja denaturoituneen MART-1-proteiinin, sen peptidien tai analogien, tai sen modifioitujen pepti-
CVJ
^ dien ja analogien kanssa. Spesifinen immuunitesti, jossa c\i , „ ...... , ....
^ vasta-aineita tullaan käyttämään osoittaa, mitkä vestas’ aineet ovat toivottavia. Vasta-aineet voidaan muodostaa co 30 MART-1-proteiinia tai sen osia vastaan tai MART-1-amino- ir happosekvenssille homologisia synteettisiä peptidejä vas- ^ taan.
o o Eräässä suoritustavassa tämän keksinnön mukaisia ^ vasta-aineita käytetään immuunitesteissä uuden MART-1-pro- 00 35 teiinin tunnistamiseksi biologisissa näytteissä. Tässä 26 menetelmässä esillä olevan keksinnön mukaiset vasta-aineet saatetaan kosketukseen biologisen näytteen kanssa ja tunnistetaan kompleksin muodostuminen MART-1-antigeenin ja vasta-aineen kesken. Esillä olevan keksinnön mukaiset im-5 muunitestit voivat olla radioimmuunitesti, Western blot -testi, immunofluoresenssitesti, entsyymi-immuunitesti, kemiluminesenssitesti, immunohistokemiallinen testi j a niiden kaltainen testi [teoksessa "Principles and Practice of Immunoassay" (1991), Christopher, P. Price ja David J. 10 Neoman (toim.), Stockton Press, New York, New York; Ausu-bel et ai. (toim.)(1987) teoksessa "Current Ptotocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, NewYork, New York] . Alalla tunnetut standardimenetelmät ELISA-testiä varten on kuvattu teoksissa Methods in Immunodiagnosis, 2 . 15 painos, Rose j a Bigazzi, toim., John Wiley and Sons, New York, 198 0; j a Campbell et al. , Methods of Immunology, W. A. Benj amin, Inc., 1964, joista molemmat on liitetty tähän viitteeksi. Sellaiset testit voivat olla suoria, epäsuoria, kompetetiivisia tai ei-kompetetiivisia immuuni-20 testejä, joita alalla on kuvattu [teoksessa "Principles and Practice of Immunoassay" (1991), Christopher P. Price ja David J. Neoman (toim.), Stockton Press, MY, NY; Oel-lirich, M., 1984, J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 22: 895 -904] . Biologiset näytteet, jotka ovat sopivia sellaisia 25 tunnistustestejä varten, sisältävät nisäkkään kudokset, melanooman j a melanosyyttisolulinjat, ihon, verkkokaIvon,
CM
q imusolmukkeet, patologiset näytteet, ruumiinavausnäytteet cm ^ ] a biopsianaytteet. Proteiinit voidaan eristää biologisis- ? ta näytteistä tavanomaisin menetelmin, jotka on kuvattu co 30 teoksessa Ausubel et ai. (toim.) (1987) "Current Protocols g in Molecular Biology", John Wiley and Sons, New York, New to York, o o Sen vuoksi tämän keksinnön mukaisia vasta-aineita ^ voidaan käyttää immuunitesteissä MART-1-antigeenin läsnä- 00 35 olon tai MART-1-antigeenin ekspressiotason muutoksen tun- 27 riistämiseksi biologisissa näytteissä, jotka on eristetty nisäkkäistä, joka sairastaa tautia tai häiriötä. Esimerkit biologisista näytteistä sisältävät, mutta eivät ole rajoittuneet, nisäkkään kudokset, biopsiakudosnäytteet, me-5 lanooma- ja imusolmukebiopsianäytteet, patologiset ja kudosnäytteet. Esimerkit taudeista, jotka voidaan määrittää näillä immuunitesteillä sisältävät, mutta eivät ole rajoittuneet, melanoomat ja kudokset, jotka ovat melanooman metastaasien sekundaarisia kohtia. Ekspressiotason muutok-10 sella tarkoitamme kohoamista tai alenemista MART-proteii-nin tai sen osan määrässä suhteessa verrokkinäytteeseen. Muutoksen tarkoitetaan sisältävän myös MART-1-proteiinin substituutio-, deleetio- tai lisäysmutantit. Sellaiset mutaatiot voidaan määrittää käyttäen tämän keksinnön mu-15 kaisia vasta-aineita, joiden tiedetään reagoivan spesifisten MART-l-epitooppien kanssa ja määrittämällä, mitkä epi-toopit ovat läsnä suhteessa verrokkiin. Sen vuoksi tämän keksinnön mukaisia vasta-aineita voidaan käyttää immuuni-testissä sellaisen nisäkkään diagnooseissa, määrityksissä 20 tai prognooseissa, joka sairastaa kyseistä tautia.
Suositeltavassa suoritustavassa tämän keksinnön mukaisia MART-1-vasta-aineita käytetään määrittämään MART-1-antigeenin läsnäolo immunosytokemialla sellaisen nisäkkään kudosbiopsiässä, joka sairastaa melanoomaa. Sellaisen 25 määrityksen antamaa kuvaa MART-1-antigeenistä sairaassa kudoksessa voidaan käyttää ennustamaan taudin progressiota c\j 5 nisäkkäällä, joka sairastaa tautia. MART-1-vasta-aineita c\j ^ voidaan spesifisesti käyttää karakterisoimaan me lanooma- ? vaurion radiaaliset j a vertikaaliset kasvuvaiheet. Tavan-
CD
30 omaiset menetelmät imuunohistokemiaa varten on kuvattu g teoksissa Harlow j a Lane (toim.) (1988) "Antibodies: A La- ^ boratory Manual", Cold Spring Harbor Press, Cold Spring o o Harbor, New York; Ausubel et ai. (toim.) (1987) "Current ^ Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, New 00 35 York, New York.
28
Toisessa suoritustavassa tämän keksinnön mukaisia vasta-aineita voidaan käyttää MART-1-proteiinin tai sen osien puhdistuksessa. Immunoaffiniteettikromatografia voidaan suorittaa tavanomaisin menetelmin, jotka alan asian-5 tuntija tuntee [Ausubel et ai. (toim.) (1987) "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, New York, New York].
Toisessa suositeltavassa suoritustavassa kanin an-tiseerumeita, jotka sisältävät sellaisia vasta-aineita, 10 jotka spesifisesti tunnistavat MART-1-proteiinin, käytetään tunnistamaan mainittu proteiini Western blot -analyysissä. Sellaiset antiseerumit on kohdistettu koko MART-1-proteiinia tai sen osaa tai osia tai MART-1-proteiinisekvenssistä peräisin olevia synteettisiä peptidejä vastaan. 15 Suositeltavaati käytetään synteettistä MART-1-peptidiä, j oka on peräisin ennustetusta MART-1-aminohappo s ekvens s i s-tä (kuvio 1; SEQ ID -numero 2). Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää modifioituja MART-1-peptidejä. Peptidi syntetisoidaan standardimenetelmin automaattisella peptidisynteti-20 saattorilla ja puhdistetaan korkeapainenestekromatografi-alla (HPLC), kuten on kuvattu esimerkissä 2. Puhdistettu peptidi voidaan konjugoida kantajaan, kuten on kuvattu teoksessa M. Bodanszky (1984) "Principles of Peptide Synthesis", Springer Verlag, New York, New York. Käyttäen ta-25 vanomaisia menetelmiä kanit voidaan immunisoida MART-1-proteiinilla tai kantajaan konjugoidulla peptidillä. Suo-
<M
^ siteltavasti käytetään noin 0,1 - noin 10 mg adjuvantissa ^ olevaa antigeeniä, suositeltavimmin käytetään noin 1 mg S5 adjuvantissa olevaa antigeeniä. Eläimelle annetaan saman- co 30 laiset tehostinannokset ja antiseerumien tiitterit määri- ϊ tetään ELISA-testillä. Tyydyttävät antiseerumien tasot ^ saavutetaan, kun anti-peptidi-vasta-aineen tiitteri saa- o o vuttaa tasannevaxheen. Tata vasta-ainetta voidaan käyttää standardeissa immuunitesteissä, jotka on kuvattu yllä. o C\1 29 T-lymfosyytit tunnistavat antigeenin yhdessä luokan I tai luokan II MHC -molekyylien kanssa sellaisessa muodossa, jossa peptidifragmentti on sitoutunut MHC-molekyy-liin. Peptidin sitoutumisaste annettuun MHC-alleeliin pe-5 rustuu aminohappoihin peptidin tietyissä kohdissa [Parker et ai. (1992) Journal of Immunology 149: 3580; Kubo et ai. (1994) Journal of Immunology 52: 3913 - 3924; Ruppert, J. et ai. (1993) Cell 74: 929 - 937; Falk et ai. (1991) Nature 351: 290 - 296, joista kukin on liitetty tähän 10 viitteeksi]. Sen vuoksi toinen tämän keksinnön suoritustapa koskee peptidejä, jotka ovat peräisin MART-1-proteiini-sekvenssistä (kuvio 1; SEQ ID -numero 2), joita on modifioitu niin, että niiden immunogeenisyyttä on kohotettu tehostamalla peptidin sitoutumista siihen MHC-molekyyliin, 15 jonka kanssa peptidi assosioituu. Modifikaatio sisältää esimerkiksi aminohapon substituution, deleetion tai lisäyksen annetussa immunogeenisessä peptidisekvenssissä, tai olemassa olevien aminohappojen mutaation annetussa immunogeenisessä peptidisekvenssissä, tai olemassa olevien ami-20 nohappojen derivatisoinnin annetussa immunogeenisessä peptidisekvenssissä . Mikä tahansa aminohappo, joka sisältyy immunogeeniseen peptidisekvenssiin, voidaan modifioida tämän keksinnön mukaisesti. Suositeltavassa suoritustavassa ainakin yksi aminohappo substituoidaan tai korvataan 25 annetussa immunogeenisessä peptidisekvenssissä. Mitä tahansa aminohappoa voidaan käyttää substituoitaessa tai
OJ
q korvattaessa annettu aminohappo immunogeenisessä peptidi- c\j ^ sekvenssissä. Modifioitu]en peptidien on tarkoitettu si- ? sältävän minkä tahansa immunogeenisen MART-1-peptidin,
CD
30 joka on modifioitu ja joka sisältää tehostuneen sitoutu- £ misen siihen MHC-mo1ekyy1iin, jonka kanssa se assosioituu, ^ kun se esitetään T-solulle.
o o Esimerkiksi HLA-A2-alleeli sitoo yhdeksän tai kym- ^ menen aminohapon pituisia peptidejä. Esimerkit peptidin 00 35 kohdista, joita voidaan muuttaa sitomisen tehostamiseksi 30 sisältävät, mutta eivät ole rajoittuneet, peptidin ensimmäisen, toisen, kolmannen ja viimeisen kohdan. Mitä tahansa aminohappoa voidaan käyttää substituoitaessa tai korvattaessa nämä kohdat immunogeenisen peptidisekvenssin 5 sisällä. HLA-A2-molekyyliin tapahtuvaa tehostunutta sitoutumista varten peptidin toisessa kohdassa on suositelta-vasti hydrofobinen alifaattinen aminohappo. Esimerkit aminohapoista, joita voidaan käyttää toisessa kohdassa sisältävät, mutta eivät ole rajoittuneet, leusiinin, metionii-10 nin, alaniinin, isoleusiinin, valiinin, treoniinin tai glysiinin. Peptidin toisessa kohdassa sijaitsee suositeltavasta leusiini tai metioniini. Peptidin viimeinen aminohappo (joko 9. tai 10. aminohappo riippuen peptidin pituudesta) on suositeltavaati hydrofobinen alifaattinen amino-15 happo. Esimerkit aminohapoista, joita voidaan käyttää peptidin viimeisessä kohdassa sisältävät, mutta eivät ole rajoittuneet, valiinin, metioniinin, leusiinin, alaniinin, isoleusiinin, treoniinin tai glysiinin. Peptidin viimeinen kohta sisältää suositeltavasti valiinin. Peptidin ensim-20 maisen ja kolmannen kohdan aminohappoja voidaan myös modifioida peptidin sitoutumisen tehostamiseksi MHC luokan I -molekyyliin. Peptidin ensimmäisen ja kolmannen kohdan aminohappo voi olla mikä tahansa aminohappo. Ensimmäisen ja kolmannen kohdan aminohapot ovat suositeltavasti hydrofo-25 bisia alifaattisiä aminohappoja tai aromaattisia aminohappoja. Esimerkit aminohapoista, joita voidaan käyttää näis- q sä kohdissa sisältävät, mutta eivät ole rajoittuneet, leu- c\i ^ siinin, metioniinin, valimin, alaniinin, isoleusiinin, ? treoniinin, glysiinin, tryptofaanin, fenyylialaniinin, co
30 tyrosiinin, seriinin, asparagiinihapon tai lysiinin. Esi-jr merkit MART-1-peptideistä, joita voidaan modifioida sisällä tävät, mutta eivät ole rajoittuneet, peptidin AAGIGILTV
o (SEQ ID -numero 4), EAAGIGILTV (SEQ ID -numero 17) ja ^ AAGIGILTVI (SEQ ID -numero 18) (peptidit esitetään amino- ^ 35 happojen yksikirjainkoodilla) . Esimerkiksi immunogeeninen 31 MART-1-peptidi AAGIGILTV (SEQ ID -numero 4) voidaan modifioida seuraavan kaavan X1X2X3IGILTX4 (SEQ ID -numero 122) mukaisesti, jossa:
Xx voi olla mikä tahansa aminohappo, suositeltavasti 5 mikä tahansa hydrofobinen alifaattinen aminohappo tai aromaattinen aminohappo. Esimerkit aminohapoista, joita voidaan käyttää sisältävät, mutta eivät ole rajoittuneet, alaniinin, tryptofäänin, fenyylialaniinin, tyrosiinin, lysiinin, isoleusiinin, leusiinin, metioniinin, treonii-10 nin, glysiinin tai seriinin.
X2 voi olla mikä tahansa hydrofobinen aminohappo, suositeltavasti alifaattinen hydrofobinen aminohappo. Esimerkit aminohapoista, joita voidaan käyttää sisältävät, mutta eivät ole rajoittuneet, leusiinin, metioniinin, iso-15 leusiinin, valiinin, treoniinin, alaniinin tai glysiinin.
X3 voi olla mikä tahansa aminohappo, suositeltavasti hydrofobinen alifaattinen aminohappo tai aromaattinen aminohappo. Esimerkit aminohapoista, joita voidaan käyttää sisältävät, mutta eivät ole rajoittuneet, tryptofäänin, 20 fenyylialaniinin, tyrosiinin, lysiinin, asparagiinihapon, seriinin, alaniinin, glysiinin, isoleusiinin, valiinin tai treoniinin.
X4 voi olla mikä tahansa hydrofobinen aminohappo, suositeltavasti hydrofobinen alifaattinen aminohappo. Esi -25 merkit aminohapoista, joita voidaan käyttää sisältävät, mutta eivät ole rajoittuneet, valiinin, leusiinin, isoleu-
C\J
£ siinin, alaniinin, treoniinin tai glysiinin.
^ Esimerkit modifioiduista AAGIGILTV-peptidisekvens- 9 seistä (SEQ ID -numero 4), joita voidaan tuottaa, on esi- co >- 3 0 tetty taulukossa 14 {esimerkki 5) , mutta eivät ole rajoitit tuneet niihin.
CL
^ Tämä keksintö sisältää edelleen näiden immunogee- o nisten modifioitujen peptidien, jotka ovat peräisin MARTTI 1-aminohapposekvenssistä (kuvio 1; SEQ ID -numero 2), joi- o 00 35 ta on modifioitu, analogit. Termin analogi tarkoitetaan 32 sisältävän kaikki peptidit, jotka sisältävät näiden modi-fioituj en peptidien toiminnalliset ominaisuudet. Termi analogi sisältää myös näiden modifioitujen peptidien kon-servoituneet substituutiot tai kemialliset johdannaiset, 5 kuten yllä on kuvattu. Nämä modifioidut peptidit voidaan tuottaa tavanomaisin synteettisin menetelmin tai yhdistelmä -DNA-menetelmin .
MART-l-rekombinanttiproteiinia tai luonnollista MART-1-proteiinia, sen peptidejä tai analogeja tai modi-10 foltuja MART-1-peptidejä tai niiden analogeja voidaan käyttää rokotteena joko profylaktisesti tai terapeuttisesti. Kun annetaan profylaktisesti, rokote annetaan etukäteen silloin, kun havaitaan jokin osoitus melanoomasta. MART-1-rokotteen profylaktisen annon tulisi toimia estä-15 mällä tai lieventämällä melanoomaa nisäkkäällä. Suositeltavassa suoritustavassa nisäkkäät, suositeltavasti ihmiset , joilla on korkea riski saada melanooma, hoidetaan profylaktisesti tämän keksinnön mukaisilla rokotteilla. Esimerkit sellaisista nisäkkäistä sisältävät, mutta eivät 20 ole rajoittuneet, ihmiset, joilla on ollut melanoomaa aiemmin suvussa, ihmiset, joilla on ollut aiemmin epätyypillisiä syntymämerkkejä, ihmiset, joilla on ollut aiemmin FAM-M-oireyhtymä tai ihmiset, joilla on aiemmin ollut melanooma, joka on leikattu, ja sen vuoksi riski saada se 25 uudelleen. Kun annetaan terapeuttisesti, rokote annetaan Λ potilaan oman immuunivasteen tehostamiseksi kasvainanti- c\j o geeniä vastaan, joka on läsnä melanoomassa tai metastasoi-
CM
^ vassa melanoomassa. Rokote, joka toimii immunogeeninä, voi o ^ olla solu, solulysaatti soluista, jotka on transfektoitu "H" 30 rekombinanttiekspressiovektorilla, solulysaatit soluista, x g [jotka on transfektoitu MART-l-rekombinanttiekspressiovek- lo torilla tai viljelmäsupernatantti, joka sisältää ekspres- o g soidun proteiinin. Vaihtoehtoisesti immunogeeni on osit- ^ tain tai oleellisesti puhdistettua MART-l-rekombinantti- ^ 35 proteiinia, sen peptidiä tai analogia tai sen modifioituja 33 peptidejä tai analogeja. Proteiinit tai peptidit voidaan konjugoida lipoproteiinin kanssa tai antaa 1iposomimuodos-sa tai adjuvantin kanssa.
Samalla, kun on mahdollista antaa immunogeeni puh-5 taassa muodossa tai oleellisesti puhtaassa muodossa, on suositeltavaa antaa se farmaseuttisena koostumuksena, for-mulaationa tai valmisteena.
Esillä olevan keksinnön formulaatiot, sekä eläin-että ihmiskäyttöä varten, sisältävät yllä kuvatun immuno-10 geenin yhdessä yhden tai useamman farmaseuttisesti hyväksyttävän kantajan, ja vaihtoehtoisesti muiden terapeuttisten täyteaineiden, kanssa. Kantajan (kantaj ien) täytyy olla "hyväksyttävä" ("hyväksyttäviä") siinä mielessä, että se (ne) on (ovat) yhteensopiva (yhteensopivia) muiden for-15 mulaation täyteaineiden kanssa eikä ole tuhoisa sen (niiden) vastaanottajalle. Formulaatiot voidaan helposti antaa yksikköannosmuodossa ja ne voidaan valmistaa millä tahansa farmaseuttisen alan hyvin tunnetulla menetelmällä.
Kaikki menetelmät sisältävät vaiheen, jossa aktii-20 vinen aine saatetaan kosketukseen kantajan kanssa, joka muodostuu yhdestä tai useammasta apuaineesta. Yleisesti formulaatiot valmistetaan saattamalla aktiivinen aine tasaisesti j a läheisesti kosketukseen nestemäisten kantaj ien tai hienoj akoisten kiinteiden kantaj ien tai molempien 25 kanssa ja sitten, jos on tarpeen, muovaamalla tuote haluttuun formulaatioon.
CM
5 Formulaatiot, jotka ovat sopivia suonensisäiseen,
CM
i lihaksensisäiseen, ihonalaiseen tai vatsaontelonsisäiseen Γ"» 9 antoon, sisältävät suositeltavasti aktiivisen aineen ste- co 30 rillit vesipohjaiset liuokset yhdessä sellaisten liuosten ir kanssa, jotka ovat suositeltavasti isotonisia vastaanotta- ^ jän veren suhteen. Sellaiset formulaatiot on helppo val- o o mistaa liuottamalla kiinteä aktiivinen aine veteen, joka
LO J
^ sisältää fysiologisesti yhteensopivia aineita, kuten nat- o ^ 35 riumkloridia (esim. 0,1 - 2,0 M), glysiiniä ja niiden kai- 34 talsia aineita, ja joka on puskuroitu pH:hon, joka on yhteensopiva fysiologisten olosuhteiden kanssa niin, että tuotetaan vesipohjainen liuos, ja tehdään mainitusta liuoksesta steriili. Nämä voivat olla läsnä yksikköannos-tai 5 moniannossäiliöissä, esimerkiksi suljetuissa ampulleissa tai lääkepulloissa.
Esillä olevan keksinnön mukaiset formulaatiot voivat sisältää stabiloivan aineen. Kuvaavia stabiloivia aineita ovat polyetyleeniglykoli, proteiinit, sakkaridit, 10 aminohapot, epäorgaaniset hapot ja orgaaniset hapot, joita voidaan käyttää joko yksinään tai seoksina. Nämä stabiloivat aineet lisätään suositeltavasti määränä 0,11 -10,000 paino-osaa immunogeenin paino-osaa kohden. Jos käytetään kahta tai useampaa stabiloivaa ainetta, niiden kokonais-15 määrä on suositeltavasti yllä spesifioiduissa rajoissa. Näitä stabiloivia aineita käytetään vesipohjaisissa liuoksissa sopivana konsentraationa ja sopivassa pH:ssa. Sellaisten vesipohj aisten liuosten spesifinen osmoottinen paine on yleensä 0,1 - 3,0 osmolia, suositeltavasti 0,8 -20 1,2. Vesipohjaisen liuoksen pH säädetään niin, että se on 5,0 - 9,0, suositeltavasti 6-8. Formuloitaessa esillä olevan keksinnön mukaista immunogeenia voidaan käyttää anti-adsorptioainetta.
Farmaseuttisia lisämenetelmiä voidaan käyttää toi-25 minnan keston säätelemiseksi. Säädellyn vapautuksen sisältävät valmisteet voidaan tehdä käyttämällä polymeeriä c\j £ kompleksoimaan tai absorboimaan proteiinit tai niiden joh- ^ dannaiset. Säädelty kuljetus voidaan suorittaa valitsemal- ? la sopivat makromolekyylit (esimerkiksi polyesteri, poly- co i- 30 aminohapot, polyvinyyli, pyrrolidoni, etyleenivmyyliase- ir taatti, metyyliselluloosa, karboksimetyyliselluloosa tai Q_ protamiinisulfaatti) ja makromolekyylien konsentraatiota o kuin myös inkorporaatiomenetelmiä vapautuksen säätelemien seksi. Toinen mahdollinen menetelmä toiminnan keston sää- o ^ 35 telemiseksi käyttämällä säädellyn vapautuksen sisältäviä 35 valmisteita on inkorporoida MART-1-proteiini, sen peptidit j a analogit polymeerimateriaalipartikkeleihin, kuten poly-estereihin, polyaminohappoihin, hydrogeeleihin poly (maitohappoon) tai etyleenivinyyliasetaattikopolymeereihin.
5 Vaihtoehtoisesti sen sijaan, että nämä aineet inkorporoi-daan polymeeripartikkeleihin, on mahdollista sulkea nämä materiaalit mikrokapseleihin, jotka on valmistettu esimerkiksi koaservaatiomenetelmillä tai pintapolymerisaatiolla, esimerkiksi hydroksimetyyliselluloosa- tai gelatiinimikro- 10 kapseleihin ja poly(metyylimetasylaatti)mikrokapseleihin, vastaavasti, tai kolloidisiin lääkekulj etussysteemeihin, esimerkiksi liposomeihin, albumiinimikropallosiin, mikro-emulsioihin, nanopartikkeleihin j a nanokapseleihin tai makroemulsioihin.
15 Kun halutaan suun kautta annettavat valmisteet, kooostumukset voidaan yhdistää tyypillisten kantaj ien, kuten laktoosin, sakkaroosin, tärkkelyksen, talkin, magnesiums trearaat in, kiteisen selluloosan, metyyliselluloosan, karboksimetyyliselluloosan, glyseriinin, natriumalgi- 20 naatin tai arabikumin kanssa muiden muassa.
Esillä olevan keksinnön mukaiset proteiinit voidaan hankkia joko käyttöpakkauksen muodossa, yksinään tai yllä kuvatun farmaseuttisen koostumuksen muodossa.
Rokotus voidaan suorittaa tavanomaisin menetelmin.
25 Immunogeeniä voidaan esimerkiksi käyttää sopivassa laimen- ^ timessa, kuten suolaliuoksessa tai vedessä, tai täydelli- 5 sissä tai epätäydellisissä adjuvanteissa. Lisäksi immuno- c\j ^ geeni voi olla tai ei ole sidottu kantajaan proteiinin ° tekemiseksi immunogeeniseksi. Esimerkit sellaisista kan- 30 tajamolekyyleistä sisältävät, mutta eivät ole rajoittu-x £ neet, naudan seerumialbumiinin (BSA), Keyhole limpet -hein mosyaniinin (KLH), tetanustoksoidin ja niiden kaltaiset, o g Immunogeeni voi myös olla kiinnitetty lipoproteiineihin ^ tai se voidaan antaa liposomimuodossa tai adjuvanttien ^ 35 kanssa. Immunogeeni voidaan antaa millä tahansa reitillä, 36 joka on sopiva vasta-aineen tuottamiseksi, kuten suonensisäisesti , vatsaontelonsisäisesti, lihaksensisäisesti, ihonalaisesti j a niiden kaltaisin reitein. Immunogeeni voidaan antaa yhden kerran tai tietyin aikavälein, kunnes 5 tuotetaan merkittävä anti-MART-1-immuunisolujen tai anti-MART-1-vasta-aineen tiitteri. Ant i-MART-1-immuuni solujen läsnäolo voidaan määrittää mittaamalla esiaste-CTL-solujen (sytotoksiset T-lymfosyytit) frekvenssi MART-1-antigeeniä vastaan ennen j a j älkeen immunisaatiota käyttämällä esi-10 aste-CTL-analyysitestiä [Coulie, P. et ai. (1992) International Journal of Cancer 50: 289 - 297] . Vasta-aine voidaan tunnistaa seerumissa käyttäen yllä kuvattua immuuni-testiä.
Esillä olevan keksinnön mukaisen rokotteen tai im-15 munogeenin anto voidaan suorittaa joko profylaktista tai terapeuttista tarkoitusta varten. Kun annetaan profylakti-sesti, immunogeeni annetaan etukäteen silloin, kun on olemassa mikä tahansa todiste melanoomasta tai etukäteen silloin, kun on olemassa mikä tahansa melanoomasta johtuva 20 oire. Immunogeenin profylaktinen anto toimii ehkäisemällä tai lievittämällä melanoomaa nisäkkäällä. Kun annetaan terapeuttisesti, immunogeeni annetaan taudin alkaessa (tai juuri sen jälkeen) tai silloin, kun mikä tahansa taudin oire alkaa. Immunogeenin terapeuttinen anto toimii tautia 25 lievittämällä.
Suositeltava suoritustapa on rokote, j oka on val-
CVJ
£ mistettu käyttäen MART-1-rekombinanttiproteiini tai -pep- ^ tidiekspressiovektoreita. Rokotteen antamiseksi yksilölle 9 geneettinen sekvenssi, joka koodittaa koko MART-l-nukleii- co >- 30 nihapposekvenssiä tai osaa siitä, insertoidaan ekspressio- c vektoriin, kuten yllä on kuvattu, ja viedään sisään immu- ^ nisoitavaan nisäkkääseen. Esimerkit vektoreista, joita o o voidaan käyttää edellämainituissa rokotteissa sisältävät, ^ mutta eivät ole rajoittuneet, defektit retrovirusvektorit, o ^ 35 adenovirusvektorit, vacciniavirusvektorit, linturokkovi- 37 rusvektorit tai muut virusvektorit [Mulligan, R.C. (1993) Science 260: 926 - 932]. Virusvektorit, joissa on koko MART-l-nukleiinihapposekvenssi tai osa siitä, voidaan viedä sisään nisäkkääseen joko ennen, kun on olemassa mitään 5 todistetta melanoomasta, tai melanoomaa sairastavaan nisäkkääseen taudin regression välittämiseksi. Esimerkit menetelmistä, joilla virusvektorit annetaan nisäkkäille sisältävät, mutta eivät ole rajoittuneet, solujen altistuksen virukselle ex vivo tai retroviruksen tai virusta 10 tuottavan solulinjan injektion sairaaseen kudokseen tai viruksen suonensisäisen annon. Vaihtoehtoisesti virusvek-tori, joka sisältää koko MART-l-nukleiinihapposekvenssin tai osan siitä, voidaan antaa paikallisesti suoralla injektiolla melanoomavaurioon tai ulkoisesti farmaseuttises-15 ti hyväksyttävässä kantajassa. Virusvektorin, joka sisältää koko MART-l-nukleiinihapposekvenssin tai osan siitä, annettava määrä perustuu vi ruspart i kkelien tiitteriin. Annettavan immunogeenin suositeltava määrä on välillä noin 106 - noin 1011 viruspartikkelia per nisäkäs, suositelta-20 vasti ihminen. Immunisaation jälkeen rokotteen tehokkuus voidaan määrittää tuottamalla vasta-aineita tai immuunisoluja, jotka tunnistavat antigeenin, määritettynä spesifisenä lyyttisenä aktiivisuuteena tai spesifisenä sytokiini-tuottona tai kasvaimen regressiona. Alan asiantuntija tie-25 tää ne tavanomaiset menetelmät, joilla edellämainitut parametrit määritetään. Jos immunisoitava nisäkäs sairastaa ^ jo melanoomaa tai metastasoivaa melanoomaa, rokote voidaan ^ antaa yhdessä muiden terapeuttisten hoitojen kanssa Esi- 9 merkit muista terapeuttisista hoidoista sisältävät, mutta
CD
30 eivät ole rajoittuneet, adoptiivisen T-soluimmunoterapian, ai sytokiinien tai muiden terapeuttisten melanoomalääkkeiden
CL
yhtäaikaisen annon.
§ Vaihtoehtoisesti oleellisesti tai osittain puhdisti tettu MART-1-proteiini kokonaan tai sen osat voidaan antaa o 35 rokotteena farmaseuttisesti hyväksyttävässä kantajassa.
38 MART-1-proteiinin määrät, joita voidaan antaa, ovat noin 0,001 - noin 100 mg per potilas, suositeltavasti annokset ovat noin 0,01 - noin 100 mg per potilas. Suositeltavassa suoritustavassa MART-1-peptidi AAGIGILTV (SEQ ID -numero 5 4)(esitetty yksikirjainkoodilla) tai sen analogit annetaan terapeuttisesti tai profylaktisesti nisäkkäälle, joka on sellaisen hoidon tarpeessa. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää modifioituja MART-1-peptidejä, joista esimerkit on esitetty taulukossa 14 . Suositeltavat annokset voivat olla 10 noin 0,001 mg - noin 100 mg, suositeltavimmat annokset ovat noin 0,01 mg - noin 100 mg. Peptidi voidaan tuottaa synteettisesti tai yhdistelmä-DNA-menetelmin. Immunisaatio toistetaan tarpeen mukaan, kunnes on saatu aikaan riittävä anti-immunogeeni-vasta-aineen tai immuunisolujen tiitteri. 15 Vielä eräässä vaihtoehtoisessa suoritustavassa vi- rusvektori, kuten retrovirusvektori, voidaan viedä sisään nisäkässoluihin. Esimerkit nisäkässoluista, joihin retrovirusvektori voidaan viedä sisään sisältävät, mutta eivät ole raj oittuneet, primaariset nisäkäsvilj elmät tai nisäk-20 kään jatkosoluviljelmät, COS-solut, NIH3T3-solut tai 293-solut (ATCC #CRL 1573). Keinot, joilla geenin sisältävä vektori voidaan viedä sisään soluihin sisältävät, mutta eivät ole rajoittuneet, mikroinjektion, elektroporaation, transfektion tai transfektion käyttäen DEAE-dekstraania, 25 lipofektiiniä, kalsiumfosfaattia tai muut alan asiantuntijan tuntemat menetelmät [Sambrook et ai. (toim.) (1989) c\j £ "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring c\j I Harbor Press, Plainview, New York]. Nisäkässolut, jotka ? ekspressoivat MART-1-antigeeniä, voidaan antaa nisäkkäille co 30 j a se toimii rokotteena tai immunogeenina. Esimerkit sii-c tä, kuinka MART-1-antigeeniä ekspressoivat solut voidaan ^ antaa sisältävät, mutta eivät ole rajoittuneet, suonensi- § säisen, vatsaontelonsisäisen tai vaurionsisäisen annon.
LO
^ Suositeltavassa suoritustavassa se osa MART-l-nukleiini- o
00 35 happosekvenssiä, joka vastaa peptidiä AAGIGILTV (SEQ ID
39 -numero 4) , insertoidaan MART-l-ekspressiovektoriin ja viedään sisään nisäkässoluihin. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää nukleiinihapposekvenssiä, joka vastaa MART-1-peptidejä, jotka on modifioitu niin, että niiden sitoutuminen 5 MHC-molekyyleihin on tehostunut. Esimerkiksi nukleiinihap-posekvenssit, jotka koodittavat taulukossa 14 esitettyjä modifioituja peptidejä, voidaan insertoida ekspressiovek-toriin ja viedä sisään nisäkässoluihin.
Esillä olevan keksinnön mukainen rokoteformulaatio 10 sisältää immunogeenin, joka indusoi immuunivasteen, joka on suunnattu melanoomaan assosioituneita antigeenejä, melanoomaan assosioitunutta MART-l-antigeenia, vastaan. Ro-koteformulaatiot voidaan arvioida ensin eläinmalleissa, aluksi jyrsijöissä ja muissa kädellisissä kuin ihmisissä 15 ja lopuksi ihmisissä. Immunisaatiomenetelmien turvallisuus määritetään katsomalla immunisaation vaikutusta immunisoidun eläimen yleiseen terveydentilaan (painon muutos, kuume, ruokailukäyttäytyminen, jne.) ja katsomalla patologisia muutoksia autopsioista. Kun on aluksi testattu eläi-20 missä, voidaan testata melanoomasyöpäpotilaissa. Tavanomaisia menetelmiä voidaan käyttää arvioitaessa potilaan immuunivaste rokotteen tehon määrittämiseksi.
Vielä eräässä tämän keksinnön mukaisessa suoritustavassa koko MART-l-proteiini, sen osa tai osat tai MART-25 1-peptidit tai niiden analogit tai modifioidut MART-1-peptidit tai niiden analogit voidaan altistaa in vitro vil-
CVJ
^ j ellyille dendriittisoluille. Viljellyt dendriittisolut ^ muodostavat keinon T-solusta riippuvaisten antigeenien S5 tuottamiseksi, joka sisältää dendriittisolun modifoiman
CD
>- 3 0 antigeenin tai dendriittisolut, joita on inkuboitu lyhyt- ir aikaisesti antigeenin kanssa, jossa antigeenin aktivoimat ^ dendriittisolut prosessoivat ja ekspressoivat antigeeniä.
o MART-1-antigeeni11a aktivoituja dendriittisoluja tai pro- ^ sessoituja dendriittisoluantigeeneja voidaan käyttää immu- o , 00 35 nogeeneina rokotteita varten tai melanooman hoitamiseksi.
40
Dendriittisolut tulee altistaa antigeenille riittävä aika, jotta sallitaan antigeenien internalisoiminen ja niiden ilmaantuminen dendriittisolujen pinnalle. Tuloksena syntyneet dendriittisolut tai dendriittisolujen prosessoima 5 antigeeni voidaan sitten antaa yksilölle, joka on hoidon tarpeessa. Sellaiset menetelmät on kuvattu julkaisuissa Steinman et ai. (WO93/208 185) ja Banchereau et ai. (EP-patenttihakemus 0 563 485A1), jotka on liitetty tähän viitteiksi.
10 Vielä eräässä tämän keksinnön suoritustavassa yksi löistä eristetyt T-solut voidaan altistaa MART-1-proteiinille tai sen osille, tai MART-1-peptideille tai niiden analogeille tai modifioiduille MART-l-peptideille tai niiden analogeille in vitro ja sitten antaa ne terapeuttises-15 ti tehokkaana määränä potilaalle, joka on sellaisen hoidon tarpeessa. Esimerkit siitä, mistä T-lymfosyytit voidaan eristää sisältävät, mutta eivät ole rajoittuneita, perifeerisen verisolujen lymfosyytit (PBL), imusolmukkeet tai kasvaimeen tunkeutuvat lymfosyytit (TIL). Sellaiset lymfo-20 syytit voidaan eristää hoidettavasta yksilöstä tai luovuttajasta menetelmillä, jotka alalla tunnetaan, ja viljellä in vitro [Kawakami, Y. et ai. (1989) J. Immunol. 1 142: 2453 - 3461] . Lymfosyyttejä viljellään sellaisissa alustoissa, kuten RPMI tai RPMI 1640 tai AIM V, 1 - 10 viik-25 koa. Elinkyky määritetään trypaanisiniväriekskluusiotes-tillä. Lymfosyytit altistetaan koko MART-1-proteiinille
CM
£ tai sen osalle koko viljelyn ajaksi tai osaksi viljelyai-
CM
^ kaa. Suositeltavassa suoritustavassa lymfosyytit altiste- ? taan AAGIGILTV-peptidin (SEQ ID -numero 4) (esitetään yksi- co <- 3 0 kirj ainkoodilla) konsentraatiolle, j oka on noin 1 - noin ir 10 mikrogrammaa (//g) /ml/107 solua, koko lymfosyyttiviljelyn ^ ajaksi tai osaksi viljelyaikaa. Kun on herkistetty peptics dille, T-lymfosyytit annetaan nisäkkäälle, joka on seilaili sen hoidon tarpeessa. Vaihtoehtoisesti taulukossa 14 esi- o ^ 35 tetyt modifioidut MART-1-peptidit voidaan altistaa lymfo- 41 syyteille. Esimerkit siitä, kuinka nämä herkistetyt T-so-lut voidaan antaa nisäkkäälle sisältävät, mutta eivät ole rajoittuneet, suonensisäisen, vatsaontelonsisäisen tai vaurionsisäisen annon. Parametrit, jotka voidaan määrittää 5 näiden herkistettyjen T-lymfosyyttien tehokkuuden määrittämiseksi sisältävät, mutta eivät ole rajoittuneet, immuu-nisolujen tuoton nisäkkäässä, jota hoidetaan tai jolla on kasvaimen regressio. Tavanomaisia menetelmiä käytetään näiden parametrien määrittämiseksi. Sellainen hoito voi-10 daan antaa yhdessä sytokiinien tai geenimodifioitujen solujen kanssa [Rosenberg, S.A. et ai. (1992) Human Gene Therapy 3: 75 -90; Rosenberg, S.A. et ai. (1992) Human
Gene Therapy 3:57- 73].
Rokotekäytön lisäksi koostumuksia voidaan käyttää 15 MART-1-antigeenia, sen peptidejä tai analogeja tai modi-fioituj a MART-1-peptidejä ja sen analogeja vastaan olevien vasta-aineiden valmistukseen. Vasta-aineita voidaan käyttää suoraan anti-melanooma-aineina. Vasta-aineiden valmistamiseksi isäntäeläin immunisoidaan käyttäen MART-l-prote-20 iinia, sen peptidej ä tai analogej a tai modifioituj a peptide j ä tai niiden analogeja immunogeenina sidottuna kan-tajaan, kuten yllä on kuvattu rokotteille. Isännän seerumi tai plasma kerätään sopivan aikajakson jälkeen niin, että saadaan koostumus, joka sisältää vasta-aineet, jotka ovat 25 reaktiivisia immunogeenin kanssa. Gammaglobuliinifraktio tai IgG-vasta-aineet voidaan saada esimerkiksi käyttämällä
CVJ
£ kyllästettyä ammoniumsulfaattia tai DEAE-S ephadex-re s i i ni ä c\j i tai muilla alan asiantuntij an tuntemilla menetelmillä.
? Vasta-aineet ovat oleellisesti vapaita monista haitalli- co 30 sista sivuvaikutuksista, jotka voivat liittyä muihin syö- jr van vastaisiin aineisiin, kuten kemoterapiaan.
^ Vasta-ainekoostumukset voidaan valmistaa jopa yh- o o teensopivammiksi isäntäsysteemin kanssa minimoimalla mah- ^ dolliset haitalliset immuunisysteemin vasteet. Tämä saa- ^ 35 daan aikaan poistamalla vieraan lajin vasta-aineen koko 42
Fc-osa tai osa siitä tai käyttämällä saman lajin vasta-ainetta kuin isäntäeläin, esimerkiksi käyttämällä vasta-aineita ihmis/ihmishybridoomista. Humanisoidut vasta-aineet (se on vasta-aineet, jotka eivät ole immunogeenisia 5 ihmiselle) voidaan tuottaa esimerkiksi korvaamalla vasta-aineen immunogeeninen osa vastaavalla, mutta ei-immunogee-nisellä osalla (se on, kimeeriset vasta-aineet). Sellaiset kimeeriset vasta-aineet voivat sisältää reaktiivisen tai antigeeniä sitovan osan yhden lajin vasta-aineesta ja vas-10 ta-aineen Fc-osan (ei-immunogeenisen) eri lajista. Esimerkit kimeerisistä vasta-aineista sisältävät, mutta eivät ole rajoittuneita, muun nisäkkään kuin ihmisen - ihmisen kimeerit, jyrsijä - ihmis-kimeerit, hiiri - ihmis ja rotta - ihmis-kimeerit [Robinson et ai., WO-patenttihakemus 15 184 187; Taniguchi, M., EP-patenttihakemus 171 496; Morri son et ai., EP-patenttihakemus 173 494; Neuberger et ai., PCT-patenttihakemus WO 86/01 533; Cabilly et ai., 1987
Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84: 3439; Nishimura et ai. , 1987 Cane. Res. 47: 999; Wood et ai., 1985 Nature 314: 20 446; Shaw et ai. , 1988 J. Natl. Cancer Inst. 80: 15553, jotka kaikki on liitetty tähän viitteeksi].
Yleiset yhteenvedot "humanisoiduista" kimeerisistä vasta-aineista esitetään julkaisuissa Morrison, S., 1985
Science 229: 1202 ja Oi et ai., 1986 BioTechniques 4: 214. 25 Sopivat "humanisoidut" vasta-aineet voidaan vaihto ehtoisesti tuottaa CDR- tai CEA-substituutiolla [Jones et cm 5 ai., 1986 Nature 321: 552; Verhoeyan et ai., 1988 Science c\j ^ 239: 1534; Biedleret et ai., 1988 J. Immunol. 141: 4053, ° jotka kaikki on liitetty tähän viitteiksi] .
CD
30 Vasta-aineet tai antigeeniä sitovat fragmentit voi- £ daan tuottaa myös yhdistelmä-DNA-menetelmillä. Menetelmät
Lo sekä raskas- että kevytketjugeenien ekspressoimiseksi E.
o g coli -bakteerissa on seuraavien PCT-patenttihakemuksien
^ aiheena: julkaisu numero W0 901 443, W0 901 443 ja WO
o ^ J
C\l 43 9 014 424, ja julkaisussa Huse et ai., 1989 Science 246: 1275 - 1281.
Vasta-aineita voidaan myös käyttää immuunivasteen tehostamiskeinona. Vasta-aineet voidaan antaa samanlaisina 5 määrinä kuin ne, joita käytettiin vasta-aineen terapeuttisissa annoissa. Esimerkiksi poolattu gammaglobuliini annetaan määränä, joka on välillä noin 1 mg - noin 100 mg per potilas. Näin ollen MART-1-antigeenin kanssa reagoivat vasta-aineet voidaan antaa passiivisesti yksinään tai yh-10 dessä muiden syövän vastaisten hoitojen kanssa melanoomasta kärsivälle nisäkkäälle. Esimerkit syövän vastaisista hoidoista sisältävät, mutta eivät ole rajoittuneet, kemo-terapian, säteilytysterapian, adoptiivisen immunoterapian, terapian TIL-soluilla.
15 Vaihtoehto!sestianti-MART-1-antigeeni-vasta-aineet voidaan indusoida antamalla anti-idiotyyppi-vasta-aineita immunogeeneiksi. Suositeltavasti yllä kuvatulla tavalla valmistettua puhdistettua anti-MART-1-vasta-ainevalmistet- ta käytetään indusoimaan anti -idiotyyppi-vasta-aine isän-20 täeläimessä. Koostumus annetaan isäntäeläimelle sopivassa laimentimessa. Annon, tavallisesti toistetun annon, jälkeen isäntä tuottaa anti-idiotyyppistä vasta-ainetta. Fc-osaa vastaan tapahtuvan immunogeenisen vasteen poistamiseksi voidaan käyttää vasta-aineita, jotka on tuotettu 25 samassa laj issa kuin isäntäeläin, tai annettujen vasta-^ aineiden Fc-alue voidaan poistaa. Anti-idiotyyppisen vas- o ta-aineen induktion j älkeen isäntäeläimessä seerumi tai
C\J
^ plasma poistetaan niin, että saadaan aikaan vasta-aine- o ^ koostumus. Koostumus voidaan puhdistaa, kuten yllä on ku- ^ 30 vattu anti-MART-1-vasta-aineille, tai affiniteettikroma- x £ tografiällä käyttäen anti-MART-1-vasta-aineita, jotka on g sidottu affiniteettimatriksiin. Tuotetut anti-idiotyyppi- § vasta-aineet ovat samanlaisia konformaatioltaan kuin au- £ tenttinen MART-1-antigeeni ja niitä voidaan käyttää val- 00 35 mistettaessa MART-1-melanooma-antigeenirokote mieluummin 44 kuin käyttäen MART-l-proteiinia, sen peptidianalogeja tai niiden osia.
Kun käytetään keinona indusoida anti-MART-1-vasta-aineet eläimessä, vasta-aineen injektiotapa on samanlainen 5 kuin rokotetarkoituksiin, nimittäin lihaksensisäinen, vat-saontelonsisäinen, ihonalainen, vaurionsisäinen tai niiden kaltainen, tehokkaassa konsentraatiossa fysiologisesti sopivassa laimentimessa adjuvantin kanssa tai ilman sitä. Yksi tai useampi tehostininjektio voi olla toivottava.
10 MART-1-sekvenssistä peräisin olevia proteiineja tai tämän keksinnön mukaisia peptidejä tai modifioituja peptidejä on myös tarkoitettu käytettäviksi tuotettaessa anti-seerumeita, jotka on suunniteltu profylaksiaan ennen tautia tai taudin jälkeen. Tässä MART-1-antigeeni, sen pepti-15 dit tai analogit tai modifioidut MART-1-peptidit tai niiden analogit formuloidaan sopivan adjuvantin kanssa ja annetaan injektoimalla vapaaehtoisille ihmisille tunnettujen ihmisen antiseerumituottomenetelmien mukaisesti. Vasta- ainevast et ta injektoituja proteiineja vastaan tarkkail-20 laan usean viikon ajan immunisaation jälkeen niin, että otetaan aj ottain seeruminäyte anti-MART-1-seerumivasta-aineiden läsnäolon tunnistamiseksi käyttäen tässä kuvattua immuunitestiä.
Antiseerumi immunisoiduista yksilöistä voidaan an- 25 taa profylaktisesti yksilöille, joilla on riski melanooman kehittymiselle. Antiseerumi on myös käyttökelpoinen hoi- o dettaessa yksilöä, joka sairastaa melanoomaa, taudin jäi- c\j ^ keisessä profylaksiassa.
^ Sekä MART-1-antigeeni-vasta-aineiden että anti en 30 idiotyyppivasta-aineiden in vivo käyttöä että diagnostista £ käyttöä varten voi olla suositeltavaa käyttää monoklonaa- lisiä vasta-aineita. Monoklonaaliset anti-MART-1-vasta-o o aineet tai anti -idiotyyppivasta-aineet voidaan tuottaa ^ seuraavasti. Immunisoidun eläimen perna tai lymfosyytit ^ 35 poistetaan j a ne tehdään kuolemattomiksi tai käytetään 45 hybridoomien valmistukseen alan asiantuntijoiden tuntemilla menetelmillä (Goding, J.W. 1983, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Pladermic Press, Inc., NY, NY, sivut 56 - 97) . Ihmis-ihmis-hybridooman valmistamiseksi 5 valitaan ihmislymfosyyttiluovuttaja. Luovuttaja, jonka tiedetään sisältävän melanooman, jossa on MART-1-antigeeni, voi toimia sopivana lymfosyyttHuovuttajana. Lymfosyytit voidaan eristää perifeerisen veren näytteestä tai pernasoluja voidaan käyttää, jos luovuttajalta poistetaan 10 perna. Epstein-Barr-virusta (EBV) voidaan käyttää ihmisen lymfosyyttien kuolemattomaksi tekemiseen tai ihmisfuusio-kumppania voidaan käyttää ihmis-ihmishybridoomien tuottamiseksi. Primaarista in vitro immunisaatiota peptideillä voidaan myös käyttää ihmisen monoklonaa1isten vasta-ainei-15 den muodostuksessa. Esimerkit suositeltavista MART-1-peptideistä , mutta ei rajoittavista, ovat AAGIGILTV (SEQ ID -numero 4), EAAGIGILTV (SEQ ID -numero 17) ja AAGIGILTVI (SEQ ID -numero 18) (peptidit on esitetty aminohappojen yksikirj ainkoodilla) . Suositeltavimmin peptidiä AAGIGILTV 20 (SEQ ID -numero 4) käytetään immunogeenina. Vaihtoehtoisesti MART-1-aminohapposekvenssistä peräisin olevia peptide j ä j a j oita on modifioitu niin, että peptidin sitoutuminen MHC luokan I -molekyyliin on tehostunut, voidaan myös käyttää. Esimerkiksi taulukossa 14 esitettyj ä modi-25 fioituja peptidejä voidaan käyttää immunogeenina.
^ Kuolemattomiksi tehtyjen solujen erittämät vasta- q aineet seulotaan niiden kloonien määrittämiseksi, jotka c\j ^ erittävät vasta-aineita, joilla on toivottu spesifisyys.
° Monoklonaalisten MART-1-antigeeni- tai peptidivasta-ainei- co 30 den tapauksessa vasta-aineiden täytyy sitoutua MART-l-an- H tigeeniin tai -peptidiin. Monoklonaalisten anti-idiotyyp- lo pivasta-aineiden tapauksessa vasta-aineiden täytyy sitou- o o tua anti-MART-1-vasta-aineisiin. Valitaan toivotun spesi- ^ fisyyden sisältäviä vasta-aineita tuottavat solut.
CVJ
46 Tässä kuvatut vasta-aineet tai kimeeriset vasta-aineet voidaan myös kiinnittää toksiinimolekyyleihin,' radioaktiivisiin isotooppeihin ja lääkkeisiin tavanomaisin menetelmin [Vitetta et ai. (1991) teoksessa Biologic The-5 rapy of Cancer", De Vita, V.T., Hellman, S., Rosenberg, S . A. (toim.), J.B. Lippincott Co . , Philadelphia; Larson, S.M. et ai. (1991) teoksessa "Biological Therapy of Cancer" , De Vita, V.T., Hellman, S., Rosenberg, S.A. (toim.), J.B. Lippincott Co., Philadelphia]. Esimerkit toksiineis-10 ta, joihin vasta-aineet voidaan liittää sisältävät, mutta eivät ole raj oittuneet, risiinin tai difteriatoksiinin. Esimerkit lääkkeistä tai kemoterapeuttisista aineista sisältävät, mutta eivät ole, rajoittuneet, syklofosfamidin tai doksorubisxinin. Esimerkit radioaktiivisista isotoo-15 peistä sisältävät, mutta eivät ole rajoittuneet, 131I-lei-man. Vasta-aineita, jotka on kovalenttisesti konjugoitu edellä mainittuihin aineisiin, voidaan käyttää syövän im-munoterapiässä melanooman hoitamiseksi.
Paikallinen anto sairaaseen kohtaan voidaan suorit-20 taa alalla tunnetuin menetelmin sisältäen, mutta ei rajoittuen, ulkoisen annon, injektion ja huokoisen laitteen istuttamisen, joka sisältää soluja, jotka yhdistelmä-DNA-menetelmin ekspressoivat, huokoisen laitteen istuttamisen, joka sisältää MART-l-vasta-aineita tai kimeerisiä MART-1-25 vasta-aineita, toksiineihin, lääkkeisiin tai radioaktiivisiin leimoihin konjugoituja MART-l-vasta-aineita tai
CVJ
^ niiden osia.
c\i , Yllä kuvatut vasta-aineet ja niiden antigeeniä si- 9 tovat fragmentit voidaan hankkia käyt t öpakkausmuodo s s a, co >- 3 0 yksinään tai farmaseuttisena koostumuksena in vivo käyttöä e varten. Vasta-aineita voidaan käyttää terapeuttisiin tar- ^ koituksiin, diagnostisiin tarkoituksiin immuunitesteissä o , o tai immunoaffiniteettlaineena MART-1-proteiinin tai tässä ^ kuvattujen peptidien puhdistamiseksi.
oj 47
Esillä oleva keksintö esittää myös oleellisesti puhdistetun ja eristetyn nukleiinihapposekvenssin, jolle annettiin nimi cDNA25 (komplementaarinen) (kuviot 4A ja 4B; SEQ ID -numero 26), joka koodittaa toista melanooma, jonka 5 kasvaimeen tunkeutuvat lymfosyytit tunnistavat. TIL-solut, jotka tunnistavat cDNA2 5 -sekvens s in koodittaman melanooma-antigeenin, assosioituvat kasvaimen rejektioon in vivo. TIL-solut tunnistivat cDNA25-sekvenssin koodittaman melanooma-antigeenin HLA-A2-molekyylin yhteydessä. cDNA25-nuk-10 lei inihapposekvenssin (kuviot 4A j a 4B; SEQ ID -numero 26) vertailu sellaisten geenien nukleiinihapposekvensseihin, jotka koodittavat melanosyyt ti-melanooma-spesifistä proteiinia gplOO osoittavat tämän sekvenssin olevan samanlainen, mutta erillinen, kuin aiemmin tunnistetut gplOO-sek-15 venssit. Aiemmin tunnistetut gplOO-sekvenssit sisältävät gplOO-sekvenssin (GenBank-koodinumero M32295; nimeltään myös gp95), Pmel 17 -sekvenssin [GenBank-koodinumero M7 734 8; Kwon et ai. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 9228 - 9232] j a ME2 0-sekvenssin [Maresh et ai. (1994) DNA 20 and Cell Biology 13: 87 - 95] .
Tässä esitetty cDNA25-sekvenssi (kuviot 4A ja 4B; SEQ ID -numero 26) eroaa aiemmin julkaistusta Genbank-ko-koelman gplOO-sekvenssistä (Genbank-koodinumero M32295) kahdella nukleotidilla, Pmel 17 -sekvenssistä (Kwon et ai. 25 (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 9228 - 9232) kolmel la nukleotidilla ja 21 emäsparin pituisella deleetiolla ja ™ ME20-sekvenssistä (Maresh et ai. (1994) DNA and Cell Bio- ^ logy 13: 87 - 95) yhden nukleotidin erolla. Aminohappota- o solia cDNA25-sekvenssin koodittama proteiini eroaa 30 GenBank-kokoelman gplOO-sekvenssistä (GenBank-koodinumero x M32295) yhdellä aminohapolla kohdassa 162, kahden amino-
CC
hapon erolla kohdissa 162 ja 274 verrattuna Pmel 17 -sekin o venssiin eikä se sisältnyt niitä seitsemää aminohappoa, jotka olivat läsnä Pmel 17 -sekvenssissä kohdilla 588 -£3 35 594. Sen vuoksi cDNA25 tuntuu koodittavan erilaista gplOO- 48 geenimuotoa, cDNA25-nukleiinihapposekvenssin (kuviot 4A ja 4B; SEQ ID -numero 26) ja aminohapposekvenssin (kuvio 5A; SEQ ID -numero 27) ja aiemmin julkaistujen gplOO-sekvenssien väliset erot voivat johtua polymorfiasta, alleelisis-5 ta variaatioista tai mutaatioista kasvaimessa. Kokeet hiiren kasvaimilla ovat osoittaneet, että uudet antigeenit, jotka T-solut tunnistavat, voivat johtua pistemutaatiosta inaktiivisen geenin koodittavalla alueella [Boon, T.
(1992) Advances in cancer Research 58: 177 - 210], 10 Tämä keksintö esittää myös immunogeeniset peptidit, jotka ovat peräisin tässä esitetyistä gplOO-proteiinisek-vensseistä tai niiden analogeista (kuvio 5A ja kuvio 7A; SEQ ID -numero 27 ja 121) . Nämä immunogeeniset peptidit edustavat gpl00-proteiinin immunogeenisia osia (kuvio 5A 15 j a 7A; SEQ ID -numero 27 j a 121), jotka TIL-solut tunnistavat . Esimerkit immunogeenisista peptideistä sisältävät, mutta eivät ole rajoittuneet, peptidin LLDGTATLRL (peptidi G10-4; SEQ ID -numero 33) , VLYRYGSFSV (peptidi G10-5; SEQ ID -numero 34), ALDGGNKHFL (peptidi G10-22; SEQ ID -numero 20 35) , VLKRCLLHL (peptidi G9-19; SEQ ID -numero 36), VLPSP- ACQLV (peptidi G10-8; SEQ ID -numero 37) , SLADTNSLAV (peptidi G10-9; SEQ ID -numero 38) , SVSVSQLRA (peptidi G9-216; SEQ ID -numero 39), YLEPGPVTA (peptidi G9-280; SEQ ID -numero 40), LNVSLADTN (peptidi G10-400; SEQ ID -numero 41), 25 KTWGQYWQV (peptidi G9154; SEQ ID -numero 46; kuvio 7A; ami nohapot 154 - 162) , KTWGQYWQVL (peptidi G10154; SEQ ID -nu- £! mero 47; kuvio 7A; aminohapot 154 - 163), ITDQVPFSV (pe- o cvJ ptidi G92q9 i SEQ ID -numero 4 8; kuvio 7A; aminohapot 209 - o 217) j a TITDQVPFSV (peptidi G10208 '> SEQ ID -numero 4 9,- ku- 30 vio 7A; aminohapot 208 - 217) . Tämä keksintö sisältää x . edelleen näiden immunogeenisten peptidien analogit, jotka cc ovat peräisin gplOO -aminohapposekvenssistä (kuviot 5A j a o 7A; SEQ ID -numero 27 ja 121). Termi analogi sisältää min- kä tahansa peptidin, joka sisältää näiden immunogeenisten £3 35 peptidien toiminnalliset ominaisuudet. Termi analogi si- 49 sältää myös konservoituneet substituutiot tai kemialliset johdannaiset yllä kuvatuista peptideistä. Nämä immuno-geeniset peptidit voidaan tuottaa synteettisesti tai yh-distelmä-DNA-menetelmin samalla tavalla tai samalla kei-5 nolla kuin on kuvattu yllä MART-l-sekvenssille.
Vielä eräässä tämän keksinnön mukaisessa suoritustavassa gplOO-sekvensseistä peräisin olevia immunogeenisia peptidejä (kuvio 5A ja 7A; SEQ ID -numero 27 ja 121) modifioidaan niin, että kohotetaan niiden immunogeenisyyttä 10 tehostamalla peptidin sitoutumista siihen MHC-molekyyliin, jonka kanssa peptidi assosioituu, kun se esitetään T-so-luille. Modifikaatiot voivat sisältää esimerkiksi yhden tai useamman aminohapon substituution, deleetion tai lisäyksen immunogeenisessa peptidisekvenssissä tai aminohap-15 pojen insertion annettuun immunogeeniseen peptidisekvens- siin tai olemassa olevien aminohappojen derivatisoinnin annetussa immunogeenisessä peptidisekvenssissä tai aminohappo j en mutatoinnin annetussa immunogeenisessä peptidi-sekvenssissä . Suositeltavassa suoritustavassa ainakin yksi 20 aminohappo substituoidaan tai korvataan annetussa immunogeenisessä peptidisekvenssissä. Mikä tahansa aminohappo, j oka muodostaa annetun immunogeeni sen peptidisekvenssin, voidaan modifioida tämän keksinnön mukaisesti. Mitä tahansa aminohappoa voidaan käyttää substituoitaessa tai kor-25 vattaessa annettu aminohappo immunogeenisessä peptidisek-venssissä. Modifikaatio voi tapahtua missä tahansa amino- ^ happokohdassa immunogeenisessä gplOO-peptidissä. Modifioi- o cvJ tujen gplOO-peptidien on tarkoitettu sisältävän kaikki 0 modifioidut immunogeeniset gplOO-peptidit, jotka sisältäkö 30 vät tehostuneen sitoutumisen sen MHC-molekyylin kanssa, 1 johon se assosioituu, kun se esitetään T-soluille.
DC
Esimerkiksi peptidit, jotka T-solut tunnistavat
LO
o HLA-A2-aileelin yhteydessä ovat yhdeksän tai kymmenen ami- !ί? nohapon pituisia. Peptidin tehostuneeksi sitoutumiseksi ^ 35 HLA-A2-molekyyliin peptidin toisessa ja viimeisessä koh- 50 dassa on suositeltavasti hydrofobinen aminohappo, suosi-teltavasti alifaattinen hydrofobinen aminohappo. Toisessa kohdassa voi olla mikä tahansa alifaattinen hydro fobinen aminohappo, jotka sisältävät, mutta eivät ole rajoittu-5 neet, leusiinin, metioniinin, isoleusiinin, valiinin, treoniinin, glysiinin tai alaniinin. Peptidin viimeinen aminohappo (joko 9. tai 10. aminohappo riippuen peptidin pituudesta) voi olla mikä tahansa alifaattinen hydrofobi-nen aminohappo, jotka sisältävät, mutta eivät ole rajoit-10 tuneet, valiinin, leusiinin, alaniinin, isoleusiinin, glysiinin, metioniinin, valiinin tai treoniinin.
Immunogeenisen peptidin ensimmäinen ja kolmas kohta voi olla substituoitu tai korvattu millä tahansa aminohapolla, suositeltavasti hydrofobisella aiifaattiseila ami-15 nohapolla tai aromaattisella aminohapolla. Esimerkit aminohapoista, joita voidaan käyttää ensimmäisessä tai kolmannessa kohdassa sisältävät, mutta eivät ole rajoittuneet , alaniinin, leusiinin, lysiinin, isoleusiinin, glysiinin, metioniinin, valiinin, treoniinin, tryptofäänin, 20 fenyylialaniinin, seriinin, lysiinin tai tyrosiinin. Esimerkit gplOO-peptideistä, joita voidaan modifioida esillä olevan suoritustavan mukaisesti sisältävät, mutta eivät ole rajoittuneet, peptidin LLDGTATLRL (peptidi G10-4; SEQ ID -numero 33), VLYRYGSFSV (peptidi G10-5; SEQ ID -numero 25 34) , ALDGGNKHFL (peptidi G10-22; SEQ ID -numero 35) , VLKRCLLHL (peptidi G9-19; SEQ ID -numero 36), VLPSPACQLV cm (peptidi G10-8; SEQ ID -numero 37) , SLADTNSLAV (peptidi
° G10-9; SEQ ID -numero 38), SVSVSQLRA (peptidi G9-216; SEQ
^ ID -numero 39), YLEPGPVTA (peptidi G9-280; SEQ ID -numero co 30 40) , LNVSLADTN (peptidi G10-400; SEQ ID -numero 41) , x KTWGQYWQV (peptidi G9154; SEQ ID -numero 46; kuvio 7A; ami- nohapot 154 - 162), KTWGQYWQVL (peptidi G10154; SEQ ID -nu-o mero 47; kuvio 7A; aminohapot 154 - 163), ITDQVPFSV (pep- !£ tidi G9209; SEQ ID -numero 48; kuvio 7A; aminohapot 209 - δ
C\J
51 217) ja TITDQVPFSV (peptidi G10208'' SEQ ID -numero 49; kuvio 7A; aminohapot 208 - 217) .
Esimerkiksi immunogeenisesta gplOO-peptidistä KTWGQYWQV (SEQ ID -numero 46) peräisin olevilla modifioi-5 duilla gplO0-peptideillä voi olla kaava Xj^-^sGQYWQX^. (SEQ ID -numero 123), jossa: X2 voi olla mikä tahansa aminohappo, suositeltavasti mikä tahansa hydrofobinen alifaattinen aminohappo tai aromaattinen aminohappo. Esimerkit aminohapoista, joita voi-10 daan käyttää sisältävät, mutta eivät ole raj oittuneet, alaniinin, leusiinin, lysiinin, isoleusiinin, glysiinin, metioniinin, valiinin, treoniinin, tryptofäänin, fenyyli-alaniinin, lysiinin tai seriinin, asparagiinihapon tai tyrosiinin; 15 X2 voi olla mikä tahansa hydrofobinen aminohappo, suositeltavasti mikä tahansa alifaattinen hydrofobinen aminohappo. Esimerkit aminohapoista, joita voidaan käyttää sisältävät, mutta eivät ole raj oittuneet, leusiinin, metioniinin, isoleusiinin, alaniinin, treoniinin, glysiinin 20 tai valiinin. Suositeltavimmin leusiini, metioniini tai isoleusiini.
X3 voi olla mikä tahansa aminohappo, suositeltavasti mikä tahansa hydrofobinen alifaattinen aminohappo tai aromaattinen aminohappo. Esimerkit aminohapoista, joita voi-25 daan käyttää sisältävät, mutta eivät ole rajoittuneet, alaniinin, leusiinin, lysiinin, isoleusiinin, glysiinin, c\j metioniinin, valiinin, treoniinin, tryptof äänin, fenyyli- ^ alaniinin, seriinin, lysiinin tai tyrosiinin; X4 voi olla mikä tahansa hydrofobinen aminohappo, co 30 suositeltavasti alifaattinen hydrofobinen aminohappo. Esi- x merkit aminohapoista, joita voidaan käyttää sisältävät, cr mutta eivät ole rajoittuneet, valiinin, leusiinin, isoleu- o siinin, metioniinin, alaniinin, treoniinin tai glysiinin.
o
LO
δ
C\J
52
Esimerkit modifioiduista peptideistä on esitetty taulukossa 15. Suositeltava modifioitu peptidi on KIWGQYWQV (G9-154-21)(SEQ ID -numero 70).
Vaihtoehtoisesti voidaan modifioida immunogeenista 5 gplOO-peptidiä ITDQVPFSV (G9-209; SEQ ID -numero 48) niin, että sellaisilla modifioiduilla peptideillä on yleinen kaava X1X2X3QVPFSX4 (SEQ ID -numero 124), jossa: X1 voi olla mikä tahansa aminohappo, suositeltavasti mikä tahansa hydrofobinen alifaattinen aminohappo tai aro-10 maattanen aminohappo. Esimerkit aminohapoista, joita voidaan käyttää sisältävät, mutta eivät ole rajoittuneet, leusiinin, metioniinin, alaniinin, isoleusiinin, valiinin, treoniinin, glysiinin, lysiinin, fenyylialaniinin, trypto-fäänin tai tyrosiinin, asparagiinihapon tai seriinin; • 15 X2 voi olla mikä tahansa hydrofobinen aminohappo, suositeltavasti mikä tahansa hydrofobinen alifaattinen aminohappo. Esimerkit aminohapoista, joita voidaan käyttää sisältävät, mutta eivät ole rajoittuneet, leusiinin, metioniinin, alaniinin, isoleusiinin, valiinin, treoniinin tai 2 0 glysiinin; X3 voi olla mikä tahansa aminohappo, suositeltavasti mikä tahansa hydrofobinen alifaattinen aminohappo tai aromaattinen aminohappo. Esimerkit aminohapoista, joita voidaan käyttää sisältävät, mutta eivät ole rajoittuneet, 25 leusiinin, metioniinin, alaniinin, isoleusiinin, valiinin, treoniinin, glysiinin, lysiinin, fenyylialaniinin, tryp-c\i tofaanin, tyrosiinin, asparagiinihapon tai seriinin; ^ X4 voi olla mikä tahansa hydrofobinen aminohappo, suositeltavasti mikä tahansa hydrofobinen alifaattinen cd 30 aminohappo. Esimerkit aminohapoista, joita voidaan käyttää x sisältävät, mutta eivät ole rajoittuneet, leusiinin, me-
CC
tioniinin, alaniinin, isoleusiinin, valiinin tai treonii- o nin.
o !£ Esimerkit modifioiduista peptideistä, jotka ovat o 35 peräisin peptidistä ITDQVPFSV, on esitetty taulukossa 16.
ja 53
Suositeltavasti käytetään peptidiä FLDQVPFSV (peptidi G9-209-1F2L).
Esimerkiksi modifioituja gplOO-peptidej ä, jotka ovat peräisin immunogeenisestä gplOO-peptidistä YLEPGPVTA 5 (G9-280; SEQ ID -numero 40) voidaan myös modifioida niin, että niiden sitoutuminen MHC luokan I -molekyyleihin, suositeltavasti HLA-A2-molekyyliin ja sen alatyyppeihin, tehostuu .
Modifioiduilla peptideillä voi olla yleinen kaava 10 X1X2X3PGPVTX4 (SEQ ID -numero 125), jossa; Χλ voi olla mikä tahansa aminohappo, suositeltavasti mikä tahansa hydrofobinen alifaattinen aminohappo tai aromaattinen aminohappo. Esimerkit aminohapoista, joita voidaan käyttää sisältävät, mutta eivät ole rajoittuneet, 15 leusiinin, metioniinin, alaniinin, isoleusiinin, valiinin, treoniinin, glysiinin, lysiinin, fenyylialaniinin, tryp-tofäänin tai tyrosiinin, asparagiinihapon tai seriinin; X2 voi olla mikä tahansa hydrofobinen aminohappo, suositeltavasti alifaattinen hydrofobinen aminohappo. Esi-20 merkit aminohapoista, joita voidaan käyttää sisältävät, mutta eivät ole rajoittuneet, leusiinin, metioniinin, ala-niinin, isoleusiinin, valiinin, treoniinin tai glysiinin; X3 voi olla mikä tahansa aminohappo, suositeltavasti mikä tahansa hydrofobinen alifaattinen aminohappo tai aro-25 maattinen aminohappo. Esimerkit aminohapoista, joita voidaan käyttää sisältävät, mutta eivät ole raj oittuneet, cm leusiinin, metioniinin, alaniinin, isoleusiinin, valiinin, ° treoniinin, glysiinin, lysiinin, fenyylialaniinin, tryp- ^ tofäänin, tyrosiinin, asparagiinihapon tai seriinin; i cd 30 X4 voi olla mikä tahansa hydrofobinen aminohappo, x suositeltavasti alifaattinen hydrofobinen aminohappo. Esi - cc “ merkit aminohapoista, joita voidaan käyttää sisältävät, o mutta eivät ole raj oittuneet, leusiinin, metioniinin, ala- o !£ niinin, isoleusiinin, valiinin, treoniinin tai glysiinin.
δ C\1 54
Esimerkit modifioiduista peptideistä, jotka ovat peräisin peptidistä YLEPGPVTA (G9-280; SEQ ID -numero 40), on esitetty taulukossa 17. Suositeltava modifioitu peptidi on YLEPGPVTV (G9-280-9V)(SEQ ID -numero 104).
5 Tämä keksintö sisältää edelleen näiden modifioitu jen peptidien analogit, jotka ovat peräisin tässä kuvatuista gplOO-sekvensseistä (kuvio 5A; SEQ ID -numero 27, ja kuvio 7Ά; SEQ ID -numero 121). Termin analogi tarkoitetaan sisältävän minkä tahansa peptidin, joka sisältää näi-10 den yllä kuvattujen modifioitujen peptidien toiminnalliset ominaisuudet. Nämä modifioidut peptidit voidaan tuottaa tavanomaisin synteettisin tai yhdistelmä-DNA-menetelmin.
Toisessa suoritustavassa gplOO-aminohapposekvensseistä tai modifioiduista gplOO-peptideistä, jotka on esi-15 tetty taulukoissa 15 - 17, tai niiden analogeista peräisin olevia irnmunogeenisia peptidejä voidaan käyttää rokotteena joko terapeuttisesti tai profylaktisesti. Kun annetaan profylaktisesta, rokote annetaan etukäteen silloin, kun havaitaan mikä tahansa todiste melanoomasta. Näiden pepti-20 dien profylaktisen annon tulisi toimia ehkäisten tai lievittäen melanoomaa nisäkkäässä.
Suositeltavassa suoritustavassa nisäkkäitä, suositeltavasta ihmisiä, joilla on suuri riski saada melanooma, hoidetaan profylaktisesti näillä rokotteilla. Vaihtoehtoi-25 sesti rokote voidaan antaa terapeuttisesti potilaan oman immuunivasteen tehostamiseksi kasvainantigeenia vastaan määrättynä melanoomaan tai metastasoivaan melanoomaan, o cn Rokote, joka toimii immunogeeninä, voi olla solu, soluly- o saatti soluista, jotka on transfektoitu rekombinanttieks- $£ 30 pressiovektorilla, joka sisältää nukleiinihapposekvenssit, x jotka koodittavat immunogeenistä gplOO-peptidiä, tai vil- j elmäsupernatantti , j oka sisältää ekspressortuneen protein o iinin. Ekspressiovektorit, j oihin näitä immunogeenisiä ^ peptidej ä koodittavat nukleiinihapposekvenssit voidaan * ^ 35 viedä sisään ovat samoja kuin ne, jotka on yllä kuvattu 55 MART-1-sekvenssiä varten. Vaihtoehtoisesti immunogeeni on osittain tai oleellisesti puhdistettu gplOO-rekombinant-tipeptidi tai sen analogi.
Samalla, kun on mahdollista, että immunogeeni anne-5 taan puhtaassa tai oleellisesti puhtaassa muodossa, on suositeltavaa antaa se farmaseuttisissa koostumuksissa, formulaatioissa tai valmisteissa, kuten yllä on kuvattu MART-1-sekvenssille. Rokotus voidaan suorittaa tavanomaisin menetelmin, kuten aiemmin yllä on kuvattu MART-l-sek-10 venssille.
Immunogeenisia gplOO-peptidejä ja niitä koodittavia nukleiinihapposekvensseja voidaan käyttää immuunitesteissä tai muodostettaessa vasta-aineita samalla tavalla tai keinolla kuin yllä on kuvattu MART-1-sekvenssille.
15 Vielä eräässä tämän keksinnön mukaisessa suoritus tavassa esitetään monivalenttiset rokotteet yhtä tai useampaa me1anooma-antigeeniä vastaan. Sellaiset monivalenttiset rokotteet voivat sisältää koko MART-1-proteiinisek-venssin tai osan siitä, MART-1-peptidit tai modifioidut 20 MART-1-peptidit tai gpl00-peptidit tai modifioidut gplOO- peptidit tai niiden yhdistelmät.
Aiemmissa melanooma-antigeeneja koodittavien geenien tunnistamisissa on käytetty PBL-soluja, jotka on eristetty antigeeneillä immunisoiduista tai niillä esihoide-25 tuista melanoomapotilaista [Van Der Bruggen et ai. (1991) Science 254: 1643 - 1647; Brichard et ai. (1993) J. Exp.
™ Med. 178: 489 - 495; Traversari, C. et ai. (1992) J. Exp.
o ^ Med. 176: 1453 - 1457]. Suositeltava strategia on tunnis- o taa geenit, jotka koodattavat sellaisia kasvainantigeene- 30 ja, jotka kasvaimen sisältävien potilaiden TIL-solut tun-nistavat silloin, kun mainittuja potilaita ei ole im-
CL
munisoitu. Sellainen strategia tehostaa sitä mahdollisuut-
LO
§ ta, että tunnistetut geenit koodattavat antigeenejä, jotka >- ottavat osaa luonnolliseen immuunivasteeseen kasvavaa syö- S 35 pää vastaan. Näin ollen tämä keksintö esittää myös mene- 56 telmän melanooma-antigeenejä koodittavien geenien tunnistamiseksi , joka sisältää vaiheen, jossa käytetään cDNA-ekspressiokloonausta käyttäen kasvaimeen tunkeutuvia lymfosyyttejä (TIL), jotka on eristetty melanoomaa sairasta-5 vien potilaiden kasvaimesta. Menetelmä sisältää seuraavat vaiheet, joissa: (a) eristetään kasvaimeen tunkeutuvat lymfosyytit sellaisen nisäkkään kasvaimesta, jolla on melanooma; (b) viedään melanooma-cDNA-kirjasto nisäkässolu-linjaan; (c) altistetaan mainitut nisäkässolut mainituille 10 TIL-soluille; (d) seulotaan mainitun cDNA:n koodittämän antigeenin ekspression suhteen mainituissa nisäkässoluissa, jotka mainitut TIL-solut tunnistavat; ja (e) eristetään mainittu cDNA, joka vastaa mainittua antigeeniä. Vaiheen (a) kasvaimeen tunkeutuvat lymfosyytit voidaan eris-15 tää potilaista, jotka sairastavat melanoomaa sisältäen, mutta ei rajoittuen, melanoomavaurion, ihonalaiskudoksen tai sisäelimet. Esimerkit soluista, joita voidaan käyttää cDNA-kirj aston valmistuksessa vaiheessa (b) sisältävät, mutta eivät ole rajoittuneet, tuoreet tai viljellyt mela-2 0 noomasolut. Suositeltavasti cDNA-kirjasto viedään sisään sellaisiin nisäkässoluihin, jotka eivät ekspressoi mela-nooma-antigeeneja. Jos vaiheessa (b) käytetään sellaisia muun nisäkkään kuin ihmisen .soluja tai ihmisen soluja, jotka eivät ekspressoi haluttua HLA-haplotyyppiä, jonka 25 TIL-solut tunnistavat, sellaiset solut voidaan yhteis-transfektoida HLA-geenillä, kuten alla on kuvattu. Esimer- C\J .
g kit soluista, joita voidaan käyttää vaiheessa (b) sisältä- ^ vät, mutta eivät ole rajoittuneet, kasvainsolulinjat, ku- Γ·'' o ten rmtasyöpäsolulinjan MDA 231 (ATCC # HTB26) , tai COS 7 $5 30 -solut (ATCC #CRL 1651) . Esimerkit MHC-geeneistä, joita S voidaan käyttää sisältävät, mutta eivät ole rajoittuneet, ^ HLA-A-, HLA-B- ja HLA-C-geenit, suositeltavasti HLA-A2- § geenin ja sen alatyypit (Zemmour, J. et ai. (1992) Tissue ^ Antigens 40: 221 - 228]. Sopiva käytettävä MHC-geeni mää- cvj 35 ritetaan niiden kasvainsolujen haplotyypin mukaan, jotka 57 olivat cDNA-kirjaston lähteenä. Standardimenetelmiä voidaan käyttää eristettyjen TIL-solujen tunnistaman haplo-tyypin määrittämiseksi [ASHI Laboratory Manual (2. painos, 1990)] . Esimerkit siitä, kuinka arvioidaan niiden solujen 5 tunnistus, jotka sisältävät TIL-solujen tunnistamaa antigeeniä ekspressoivan cDNA-kloonin sisältävät, mutta eivät ole rajoittuneet, gamma-interferonitestit, TNF-erityksen [Van de Bruggen et ai. (1991) Science 254: 1643 - 1647] tai sellaisten solujen lyysin, jotka on transfektoitu 10 cDNA-molekyylillä, joka koodittaa tunnistettua antigeeniä.
Sellaiset testit suoritetaan alan asiantuntijan tuntemin tavanomaisin menetelmin. Melanooma-antigeenit voidaan eristää tai pelastaa PCR-menetelmällä käyttäen aluketta, joka on spesifinen sille vektorin kohdalle, joka sijaitsee 15 cDNA-molekyylin vieressä. Esimerkit siitä, kuinka eristää TIL-soluj en tunnistamaa antigeeniä vastaava cDNA sisältävät, mutta eivät ole rajoittuneet, PCR-menetelmän.
Kun geenit j a nukleiinihapposekvenssit, jotka koo-dittavat melanooma-antigeeneja, on tunnistettu, seuraava 2 0 vaihe on määrittää näiden geenien koodittaman proteiinin antigeeninen osa tai epitooppi. Sen vuoksi vielä eräs tämän keksinnön suoritustapa on menetelmä, joka esitetään sellaisten peptidien immunogeenisyyden määrittämiseksi, jotka ovat peräisin MART-1-proteiinin ennustetusta amino-25 happo s ekvens s i s t ä (kuvio 1; SEQ ID -numero 2) tai gplOO- proteiinin ennustetusta aminohapposekvenssistä (kuvio 5A ja kuvio 7A; SEQ ID -numero 27 ja SEQ ID -numero 121) .
^ Menetelmä sisältää vaiheet, joissa: (a) valmistetaan user id 9 ta peptidej ä perustuen MART-1-aminohapposekvenssiin (kuvio
CD
>- 30 1; SEQ ID -numero 2) tai gpl 0 0 - aminohapposekvenssiin (ku- i vio 5A j a kuvio 7A; SEQ ID -numero 27 j a SEQ ID -numero ^ 121) ; (b) inkuboidaan ainakin yhtä mainittua peptidiä ni- o säkässolulinjan kanssa; (c) altistetaan mainitut nisäkäs-
LO
^ solut, joita on inkuboitu mainitun peptidin kanssa, kas- o ^ 35 vaimeen tunkeutuvilie lymfosyyteille (TIL) ; ja (d) seulo- 58 taan mainitun peptidin kanssa inkuboidut mainitut solut TIL-solujen tunnistuksen suhteen. On suositeltavaa, että käytetään noin 25-5 aminohapon pituisia peptidejä, suositeltavammin 20 - 10 aminohapon pituisia ja suositelta-5 vimmin 9-10 aminohapon pituisia. Esimerkit soluista, joita voidaan käyttää vaiheessa (b) sisältävät, mutta eivät ole rajoittuneet, T2-solut [Cerundolo, V. et ai.
(1990) Nature 345: 449 - 452] tai EBV-transformoidut B- solulinjat [Topalian et ai. (1989) J. Immunol. 142: 3714 -10 3725] . Esimerkit siitä, kuinka määritetään peptidin kanssa inkuboitujen solujen tunnistus sisältävät, mutta eivät ole rajoittuneet, sytotoksisen 51Cr-vapautustestin [Cerundolo, V. et ai. (1990) Nature 345: 449 - 452] tai lymfokiinites-tit, kuten gamma-IFN- tai TNF-erityksen [Schwartzentruber, , 15 D. et ai. (1991) J. of Immunology 146: 3674 - 3681] .
T-solut tunnistavat antigeenin, joka on muodostanut kompleksin MHC luokan I -molekyylien kanssa. MHC-lokus kaikissa nisäkäsiaj eissa sisältää useita geenej ä j a on erittäin polymorfinen. Erilaiset MHC-molekyylit tai haplo-20 tyypit sitovat erilaisia antigeeneja. Ihmisillä HLA-kompleksi sisältää HLA-A-, HLA-B- j a HLA-C-geenilokukset, jotka koodittavat luokan I -molekyylejä. Lymfosyytit tunnistavat kasvainantigeenit HLA luokan I -molekyylin yhteydessä . Jos solut, jotka sisältävät MART-1-rekombinanttieks-25 pressiovektorin, seulotaan TIL-soluilla, mutta ne eivät ole ihmissoluja vaan esimerkiksi COS-soluja tai jos ne ^ eivät ekspressoi haluttua haplotyyppiä, voidaan soluihin
^ viedä sisään myös ekspressiovektori, joka sisältää MHC
o luokan I -geenin (katso esimerkki 1). Tämä edustaa vielä 30 toista vaihtoehtoista keksinnön suoritustapaa. Solut, jot-^ ka ekspressoivat MART-1-antigeeneja ja HLA-antigeeneja,
CL
voidaan seuloa TIL-soluilla niin, että tunnistetaan kas-
LO
o vainantigeenien läsnäolo spesifisen MHC luokan I -restrik-
LO
^ tiotyypin yhteydessä. Sopiva haplotyyppi määritetään sen o CVJ 35 kasvaimen haplotyypin perusteella, josta kirjasto on pe- 59 räisin. Esimerkit MHC luokan I -geeneistä, joita voidaan käyttää sisältävät, mutta eivät ole rajoittuneet, HLA-A-, HLA-B- ja HLA-C-geenit. Esimerkit suositeltavista MHC-spe-sifisyyksistä tai restriktiotyypeistä sisältävät, mutta 5 eivät ole rajoittuneet, HLA-A1-, HLA-A2-, kuten HLA-A2.1-alatyypin, tai HLA-A24-tyypin [Zemmour, J. et ai. (1992) Tissue Antigens 40: 221 - 228]. Suositeltavin on HLA-A2.1-geeni.
Eläinlääketieteellisten käyttöjen on myös tarkoi-10 tettu sisältyvän tässä kuvattuihin koostumuksiin ja terapeuttisiin sovelluksiin.
Kaikki kirjat, artikkelit ja patentit, joihin tässä on viitattu, on liitetty tähän viitteiksi kokonaisuudessaan . Seuraavat esimerkit kuvaavat keksinnön eri näkökoh-15 tia eikä niiden ole millään tavoin tarkoitettu rajoittavan sen piiriä.
Autologisten kasvaimiin tunkeutuvien T-solujen tunnistamaa ihmisen yhteistä melanooma-antigeeniä koodit tavan geenin kloonaus 2 0 Esimerkki 1
Sytotoksisten T-lymfosyyttien (CTL) muodostaminen ja solulinjojen viljely CTL-solut muodostettiin irrotetuista kasvainnäytteistä viljelemällä solususpensiota niin, että läsnä oli 25 6 000 IU IL-2-proteiinia/ml (Cetus-Oncology Division,
Chiron Corp., Emeryville, CA), 30 - 70 vuorokautta, kuten ovat kuvanneet Kawakami, Y. et ai. (1988) J. Exp. Med. o ™ 168: 2183 - 2191. TIL501- ja TIL1235-solut olivat pääasi- rö cp assa CD8 -soluja ja ne olivat peräisin sellaisten potilai- $5 30 den kasvainnäytteistä, joilla oli edistynyt metastasoiva melanooma. CD8 + -T-soluklooni TIL501.A42 muodostettiin ra-
CL
joittavalla laimennosmenetelmällä ja sitä viljeltiin niin,
LO
§ että läsnä oli 120 IU IL-2-proteiinia/ml j a säteilytettyj ä
ID
^ (kerran viikossa 4-6 kertaa) autologisia kasvainsoluj a.
δ c\j 60
Melanoomasolulinjat 397mel, 501mel, 526mel, 537mel, 624mel, 888mel, 952mel ja Epstein-Barr-viruksella (EBV) transformoidut B-solulinjat 501EBVB, 836EBVB muodostettiin laboratoriossamme ja niitä viljeltiin RPMI1640-alustassa 5 (GIBCO/Life Technologies, Grand Island, N.Y.), joka sisäl si 10 % naudan sikiön seerumia (FCS)(Biofluids, Rockville, MD) [Topalian et ai. (1989) J. Immunol. 142: 3714 - 3725]. Normaalit viljellyt melanosyytit NHEM483, NHEM493, NHEM527, NHEM529, NHEM530, NHEM533, NHEM616 ja NHEM680 10 hankittiin valmistajalta Clonetics, San Diego, CA, solu-linjat FM725, FM801 ja FM902 saatiin M. Herlyn'lta, Wistar Institute, Philadelphia, PA, solulinja HA002 saatiin R. Halaban'lta, Yale University, New Haven, CT, ja niitä viljeltiin melanosyyttikasvualustässä (MGM, Clonetics). Me-15 lanoomasolulinjat C32, RPMI7951, WM115, A375, HS695T,
Malme3M, paksusuolisyöpälinjat Collo, SW480, WiDr, rin-tasyöpäsolulinjat MDA231, MCF7, HS578, ZR75, neuroblastoo-masolulinja SK-N-SH, glioomasolulinjat U13 8MG, HS683, H4, sarkoomasolulinja 143B, sikiön munuaissolulinja 293, joka 20 oli transformoitu adenovirustyypillä 5, hankittiin ATCC-kokoelmasta, Rockville, MD. Munuaissyöpäsolulinjat UOK10 8 ja UOK117 saatiin M. Linehan'Itä, NIH, Bethesda, MD. Pien-solukeuhkosyöpälinj a H1092 saatiin J.D. Minna'lta, University Texas Southwestern, Dallas, TX. Ewingin sarkoomasolu-25 linj at TC71, RD-ES, 6647 saatiin M. Tsokos'lta, NIH, Bethesda , MD. Neuroblastoomasolulinja SK-N-AS saatiin O.M. El ^ Badry'lta, NIH, Bethesda, MD. Plasmasytoomasolulinja HMY- o C1R ja fibroblastisolulinja Ml saatiin W. Biddison'lta, o NIH, Bethesda, MD. Munuaisen epiteelisolut ΚΆΜ, WLC saa- $£ 30 tiin D.J. Hazen-Martin'lta j a D.A. Sens'lta, Medical Uni- x versity of South Carolina, Charleston, SC. Apinan munuais solulinj a COS7 saatiin W. Leonard'lta, NIH, Bethesda, MD. m § Sytotoksisuustesti LO E Ί >- Cr-vapautustestit suoritettiin, kuten ovat kuvan- ° 35 neet Kawakami, Y. et ai. (1988) J. Exp. Med. 168 : 2183 - 61 2191, Lyhyesti, 5 000 kohdesolua, jotka oli leimattu 51Cr- leimalla, sekoitettiin eri määrien kanssa effektorisoluja ja niitä inkuboitiin viisi tuntia (h). Sitten supernatan-tit kerättiin, radioaktiivisuus mitattiin ja spesifinen 5 lyysiprosentti laskettiin.
IFN-gamma-vapautustesti 5 x 104 - 105 responssisolua ja 4 x 104 - 105 stimu-laattorisolua sekoitettiin 300 μΐ:ssa AIM-V-alustaa, joka sisälsi 120 IU IL-2-proteiinia/ml/kuoppa 96-kuoppaisella 10 mikrotiitterilevyllä, jossa kuopan pohjat oli tasaiset.
Kun oli inkuboitu 20 tuntia, 100 μΐ supernatantteja kerättiin ja ne lisättiin entsyymivälitteiselle immuunitestilevylle (ELISA)(Immunoplate MaxiSorp, Nunc, Tanska), joka oli päällystetty monoklonaalisella anti-ihmis -IFN-gamma-15 vasta-aineella (mAb) (Biosource, Camerillo, CA) . Kun oli inkuboitu yli yön 4 °C:ssa, levyt pestiin kolme kertaa ja lisättiin 100 μΐ 1:2 000 laimennosta kanin polyklonaalista anti - ihmis -IFN-gamma-vasta-ainetta (Ab) (Biosource, Camerillo, CA) j a inkuboitiin 37 °C:ssa kaksi tuntia. Levyt 20 pestiin kolme kertaa ja lisättiin 100 μΐ 1:2 000 laimennosta alkalisella fosfataasilla konjugoitua vuohen polyklonaalista anti-kani-IgG-vasta-ainetta (Ab)(BoehrInger Mannheim, Indianapolis, IN). Kun oli inkuboitu yksi tunti 37 °C:ssa, lisättiin 100 μΐ p-nitrofenyylifosfaattia 25 (Sigma, St. Louis, MO), jonka konsentraatio oli 4 mg/ml, inkuboitiin 10 - 20 minuuttia huoneenlämpötilassa pimeässä j a lisättiin 25 (il 1 N NaOH: ia reaktion lopettamiseksi. o cvJ Mitattiin optinen tiheys 405 nm aallonpituudella j a las- o kettiin IFN-gamma-konsentraatio verrattuna rekombinantti- 30 IFN-gamma-standardeihin (Biogen, Cambridge, MA) , jotka x mitattiin samassa testissä.
g cDNA-ekspressiokloonaus
LO
§ HLA-A2 -melanoomasolulinjan SOlmel poly A RNA - tuolein kyyleistä valmistettiin cDNA-kirj asto, kuten on kuvattu ^ 35 [Miki, T. et ai. (1989) Gene 83 : 137 - 146; Miki et ai.
62 (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 5167 - 5171]. Lyhyesti , cDNA-molekyylin ensimmäinen juoste syntetisoitiin linkkerialukkeella GGACAGGCCGAGGCGGCC(T)40 (SEQ ID -numero 42), jota seurasi toisen cDNA-juosteen synteesi. Kun oli 5 käsitelty T4 DNA ligaasilla, cDNA-molekyylin päähän ligoi-tiin Sfil-adaptor!, joka muodostui kahdesta oligonukleo-tidista, CCAATCGCGACC(SEQ ID -numero 43) ja GGTCGCGATTGG-TAA (SEQ ID -numero 44) . cDNA digestoitiin S f iI-ent syymi 1-lä ja digestoitu fragmentti eristettiin viemällä se spin-10 pylvään läpi. Sitten cDNA sekoitettiin bakteriofaagi lamb-dapCEV27-vektorin [Miki, T. et ai. (1991) Proc. Natl. cad. Sci. USA 88 : 5167 - 5771] käsivarsien kanssa, jotka oli valmistettu Sfil-digestiolla j a suoritettiin in vitro pakkaus .
15 Melanooma-antigeenien seulomiseksi 10 μg amplifi- oitua cDNA-kirjastoa, joka sisälsi noin 107 kloonia, trans-fektoitiin HLA-A2+-antigeeniä ekspressoimattorniin solulin-joihin MDA231 klooni 7 ja A375 klooni 1-4 käyttäen modifioitua kalsiumfosfaattimenetelmää (Mammalian Transfection 20 Kit -käyttöpakkaus, Stratagene) . Kun oli selektoitu G418-yhdisteellä (BRL, Gaithersburg, MD) , yksittäiset pesäkkeet eristettiin j a niitä vilj etiin 96-kuoppaisilla mikrotiit -terilevyillä ja valmistettiin kopiomaljat. Seos, jossa oli 5 x 104 TIL1200-solua ja 5 x 104 TIL1235-solua, lisättiin 25 mikrotiitterilevyn kuoppiin, joissa oli kasvavat transfek- tantit, jotka olivat lähes konfluenttej a, ja niitä inku-cm boitiin 20 tuntia. Supernatantit kerättiin ja IFN-gamma ° mitattiin ELISA-menetelmällä.
^ Suoritettiin polymeraasiketjureaktio (PCR) trans- cd 30 fektoituj en geenien pelastamiseksi positiivisten transfek- χ tanttien genomisesta DNA:sta käyttäen SP6- j a T7-alukkei- cr , ta, jotka si j aitsivat msertoi tune iden geenien vieressä .
o Amplifioituneet tuotteet kloonattiin pCRII-vektoriin (In- o !£ vitrogen, San Diego, CA) . cDNA-kloonien 22 ja 23 tapauk- o 35 sessa, täyspitkän cDNA-molekyylin sisältävä HindiII-XhoI- 63 fragmentti jatkokloonattiin ekspressiovektoriin pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA).
Sen testaamiseksi, koodittavatko kloonatut cDNA-molekyylit kasvainantigeeneja, kloonatut geenit sisältävä 5 pcDNA3 transfektoitiin lyhytaikaisesti COS7-solulinjaan DEAE-dekstraanimenetelmällä [Seed, B. ja Aruffo, A. (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84: 3365 - 3369] . Lyhyesti, 3 x 105 solua/kuoppa inkuboitiin 6-kuoppaisilla levyillä 37 °C:ssa neljä tuntia (h) 0,75 ml:ssa DMEM-alustaa, joka 10 sisälsi 100 /ig DEAE-dekstraania (Sigma), 0,1 mM klorokii-nia ja 1 μg pcDNA3-DNA-molekyylejä, joka sisälsi kloonatut geenit, ja/tai pcDNA-HLA-A2.1-DNA-molekyylejä [Zemmour, J. et ai. (1992) Tissue Antigens 40: 221 - 228] . Kun alusta oli poistettu, lisättiin HBSS-puskurissa olevaa 10 % DMSO-15 liuosta ja inkuboitiin kaksi minuuttia. Solut pestiin kerran PBS-liuoksella ja niitä inkuboitiin DMEM-alustassa, joka sisälsi 7,5 % FCS:ia, kaksi vuorokautta. 293-solulin-j a transfektoitiin lyhytaikaisesti käyttäen lipofektamiinia (BRL, Gaithersburg, MD) valmistaj an ohj eiden mukaises-2 0 ti. Inkubaation j älkeen määritettiin transfektoituj en C0S7 - tai 2 93-soluj en kyky välittää IFN-gamma-vapautus TIL-soluista. HLA-A2-geenin ekspressio testattiin virtaus-sytometrialla. Stabiilit transfektantit valmistettiin kai -siumfosfaattimenetelmällä ja yksittäiset pesäkkeet ja yh-25 distetyt transfektantit testattiin reaktiivisuuden suhteen TIL-soluja kohtaan sytotoksisuus- ja IFN-gamma-vapautus-cm testeissä.
^ Kloonattujen geenien DNA-sekvensointi suoritettiin ^ dideoksinukleotideja käyttävällä ketjulopetusmenetelmällä i cd 3 0 käyttäen dGTP- j a 7-deaza-dGTP-nukleotideja. DNA- ja pro- x teiinisekvenssit analysoitiin GCG-ohj elmalla GeneBank-j a cc EMBL-kirjastojen Data Library -nukleotiditietokannoissa ja o SWISS-PROT-, PIR-, GenPept-, Brookhaven Protein Data Bank o !£ -proteiinitietokannoissa.
δ
CM
64
Northern blot -analyysi
Kokonais-RNA eristettiin guanidiini-isotiosyanaat-ti-kesiumkloridisentrifugaatiomenetelmällä [Chirgwin, J.M. et ai (1979) Biochemistry 18: 5294]. Normaalikudoksen ko-5 konais-RNA hankittiin valmistajalta Clontech (Palo Aito, CA) . 10-20 μg kokonais-RNA-molekyylejä altistettiin elektroforeesille 1 % agaroosi-formaldehydigeelissä ja siirrettiin naiionmembraanilie (Duralon-UV-membraanit, Stratagene, La Jolla, CA) . Sali-entsyymillä digestoitu 10 fragmentti, joka sisälsi kloonin 22 täyspitkän cDNA-mole-kyylin, ja β-aktiini-cDNA (Clontech) leimattiin satunnais-alukkeilla ja niitä käytettiin koettimina. Hybridisaatio koettimellä suoritettiin QuikHyb-mene te1män mukaisesti (Stratagene) 68 °C:ssa 2-16 tuntia. Membraanit pestiin 15 kaksi kertaa liuoksella, j oka oli 2 x SSC/0,1 % SDS, 60 °C:ssa 15 minuuttia (min) ja kerran 0,1 x SSC-liuoksel-la 60 °C:ssa 30 minuuttia ja sitten suoritettiin autoradi-ografia.
Melanoomapotilaiden viljeltyjen TIL-solujen karak-20 terisointi
Muodostettiin useita TIL-linjoja HLA-A2 + -me1anooma-potilaista j a ne testattiin HLA-A2 + - ja HLA-A2'-potilaiden melanoomasolulinjojen lyysiksen suhteen. Potilaiden HLA-tyypitys suoritetaan tavanomaisilla HLA-tyypitysmenetel-25 millä. HLA-A2 valittiin, koska se on useimmin ekspressoi-tuva luokan I MHC -antigeeni (noin 50 % yksilöistä) ja sen on soitettu olevan dominantti restriktioelementti me1anoo- o ^ ma-antigeenien tunnistamisessa [Crowley, N.J. et ai.
0 (1991) J. Immunol. 146: 1692 - 1694]. TIL501-, TIL1235-ja $5 30 TIL1200-solut sisälsivät yhteisten melanooma-antigeenien 1 spesifisen tunnistuksen HLA-A2-molekyylin rajoittamalla Q_ tavalla . TIL501.A42 oli T-soluklooni, joka muodostettiin m § TIL501-soluista raj oittavalla laimennoksella. Nämä TIL-
LO
T- solut aiheuttivat lyysiksen tai sytokiinien, sisältäen ° 35 IFN-gamma - , TNFce- ja GM-CSF-proteiinit, vapautumisen sil- 65 loin, kun niitä viljeltiin yhdessä erilaisten HLA-A2+-melanooma- tai -melanosyyttisolulinjojen kanssa, mutta ei silloin, kun niitä viljetiin yhdessä HLA-A2”-melanoomalin-j oj en tai muiden HLA-A2 +-soluiinj oj en kuin melanoomasolu-5 linj oj en kanssa sisältäen rintasyöpäsolulinj an MDA231. Kaksi edustavaa koetta on esitetty taulukossa 1. Näin ollen nämä CTL-solut tuntuivat tunnistavan ei-mutatoituneen peptidin, j oka oli peräisin melanosyyttilinj alle spesifisestä antigeenistä.
10 T-solujen tunnistamien melanooma-antigeenien cDNA- molekyylien kloonaus HLA-A2 + -melanoomasolulinj an 5 01mel cDNA-kirj asto transfektoitiin kahteen erittäin transfektoituvaan HLA-A2.l + -syöpäsolulinjaan, MDA231 j a A3 75. Nämä solulinj at 15 eivät lyysautuneet melanoomaspesifisten TIL-solujen toimesta, mutta ne lyysautuivat HLA-A2-restriktoituneiden influenssa Ml -spesifisten CTL-solujen toimesta sen jälkeen, kun oli inkuboitu Ml58_66-peptidillä [GILGFVFTL; yk-sikirj ainkoodi (SEQ ID -numero 45)], joka oli peräisin 20 influenssaviruksen matriksiproteiinista, tai sen jälkeen, kun infektoitiin rekombinanttivacciniaviruksella, joka sisälsi Ml-geenin (tuloksia ei esitetty). Näin ollen nämä solulinj at sisälsivät normaalin antigeeniä prosessoivan j a esittävän kyvyn, mutta ne eivät lyysautuneet näiden mela-25 noomaspesifisten TIL-soluj en toimesta, koska niistä puuttui asiaankuuluvien melanooma-antigeenien ekspressio. Kun oli selektoitu G418-yhdisteellä, noin 6 700 transfektoitua o cm kloonia kustakin solulinjasta eristettiin ja niitä kasva- 0 tettiin mikrotiitterilevyillä. Käyttäen IFN-gamma-vapau-30 tustestiä eristettiin 21 MDA231- ja 27 A375-positiivista 1 kloonia ja ne seulottiin uudelleen. Näistä klooneista kah-
DC
deksan MDA231- ja seitsemän A375-kloonia olivat positii-
LO
o visia toisessa seulontatestissä.
^ Integroituneiden geenien pelastamiseksi suoritet- ° 35 tiin PCR-reaktio käyttäen näiden positiivisten transfek- 66 tanttien genomista DNA:ta ja SP6- ja T7-alukkeita, jotka sijaitsivat insertoituneiden geenien vieressä. Kahdeksan geeniä, jotka amplifioitiin seitsemästä transfektantista, jotka osoittivat 1-2 terävää rintamaa, sisältäen 1,6 kb 5 rintaman MDA-22- j a MDA-2 3-transfektanteista, j atkokloo-nattiin pCRII-kloonausvektoriin j a sitten kloonattiin edelleen eukaryoottiseen pcDNA3-ekspressiovektoriin. Northern blot -analyysissä cDNA 22 -koettimella tunnistettu 1,6 kb rintama antoi ehdottaa, että tämä fragmentti oli 10 täyspitkä cDNA.
Ekspressiovektorin pcDNA3, joka sisälsi cDNA-mole-kyylit klooneista 22 tai 23, lyhytaikainen transfektio joko COS7- tai 293-soluihin yhdessä HLA-A2.1-geenin kanssa muodosti reaktiivisuuden TIL1235- ja TIL501.A42-soluille, 15 jonka osoitti IFN-gamma-proteiinin spesifinen vapautuminen (taulukko 2, kokeet 1 ja 2) . Näiden cDNA-fragmenttien stabiili transfektio MDA231- tai A375mel-solulinjoihin muodosti myös reaktiivisuuden TIL1235- ja TIL501.A42-soluille (taulukko 2, koe 3). TIL501.A42 voi lyysata MDA231-solut, 20 jotka on stabiilisti transfektoitu cDNA 22 -DNA-molekyy- lillä (tuloksia ei esitetty). Nämä tulokset osoittivat, että nämä cDNA-molekyylit koodittavat nisäkkään melanooma-antigeenia, jonka HLA-A2-restriktoidut TIL-solut tunnistavat melanoomapotilaista. Toisen kloonin, MDA25, transfek-25 tio stimuloi interferoni-gamma-proteiinin vapautumista ainoastaan TIL1200-soluista.
C\1 δ
(M
1^ o
CD
X
cc
CL
LO
O
O
LO
δ C\1 67 ♦ W 'ίο^ΟΟΟΟΟΟ-.®®® “ είΛ^ΛίηςηΐΛΐΛΐη^^,Τ;^
1/¾ *>«. y O y y y y V V W V ΙΛ V
#4 >«“ S-4
M
h m * ►5 nv®rSn*rt“vi'
W CH
η a f4 -r
I - SSKSSskPPsSK
“ S
u-i »4 *H £ in r* & pi, (ö S 3 ·{—» m ^ , if I i i rt » I d
Li Jr 4-84-4- + 4--1--4-4-84 p5CN OJ p p 'Ο <0 0 Ή m p 3 r-4 -Φ r~4 r~l r-4 Q d JS Sx o < ^ o o h a) q -h ^ cu ^ m ft * m m Φ B rt -h
^ fö fdPHrtsE HCD
•H £ 5 « Ο ε H π3 0) -U
£ -HI O ^ in O H o *p Ep O p O O G >4 0 H ^ ^ , d K ,_l AJ β ·Η H p rH ^ ft 2 «H 4J U rt -H fH rt S ' 2 3 > 5 ^ rt d H «H g rt |3 i Π3 o « H fnf^omu? 22 4) ^ H W ^ -H p 3 ^ rH *J rH O h rt fi N ^ *4 ® 2 E 11 ,. E -^Ö Ή1 ns ►>, 0½ u d ^ «n ίίΜΛ ^ vft J ^ ^ i *r-> f-, 4 p O -rl rf e » 5,' =JSSSSSd|||| g pj * tj S 3 ö Sd tn „ SSzzäziEEziS ' ^ n £ * * 0 * -H u
£ ® '* £H O "β -rt " -H SS
rn >r* ·· ,r\ *""1 ,{rt H W S
•H * «»mmoMr-mr-o» S"ö w ti lii C 01 0 J S 3
§ - s -3 SI s S “ S
$ Ϊ -5 S 3 3 S 1 I S 8 d ft „ « 3 * “ I -S p -H iss tn - i , .h rT -H *j S ^ λ 3 a " ~ £ -H '2 S Ö rt c 'g | K S | oi i? h -j " S S w τ' 3 n rn P rt r m d 4J -h o rH “ 8 * -H · eSrt 4) -rt
O C o - -H « _ri E rt '5? ® <U -H
to ” NftCjjrHHte 0 C n <D
' S u ε -S « -7* S1 o '5* 5 u g OJ £ s ‘ i S N O ° S < i > ., ->-1 t m -Ί , »4. ω 3 « rt g Q 4J S s C\J H-l ._;►« aiPOcQUI-^^M^Srt
_ M μ_| IH
IT H Zj E?sH^^iM^r»iMgsMd ° ω « π ί h 3 0 ' S " 4 ^ ί <U «P «*3 j f g ^ - o S s i -n Ή p.< h t> V mr-y mu iS-r-idiiJa 1^ ,'m * a * + * + ♦ + + + + · ♦ H γ| ΰΒ “ ti β Pi 2 ^ 9 H s g = - 3 ·“ 16 s ί λ g 5 3 o « ^ u „ ^»'gl^^sis-sogs doö >> ^ ·™ 1 > i rt S S ° S “ H ö
-t- »4 O R k. φ *, ,1 il ii u r- ΙΛ 4^ Π 8 0 , rH Jjl ® f—i , λ R
± H ΙΛ (Ö S rS ISrcp HHmEN ^ m V
? ^ h ^ S ° ^ S u 'd 0 J M1 b " ii J! ^ rri i_I oi ® o onns/s cnO-X^ffsQ in ό rt d ·ο P β ^ fc4 t. P* -y H H E < « SKS££o*£:rr,B ^ ^ o -S , rt S o ^ + rt ^ LO (-1 <-t E t a r-i l Tiu-iC+ϊ Etd
O O LO
δ C\l 68 Tämän cDNA-molekyylin karakterisointi paljasti sen olevan samanlainen, mutta erillinen kuin aiemmin kuvattu melanooma-antigeeni gplOO, jonka tunnistaa monoklonaalinen vasta-aine HMB45, Tämä klooni kuvataan yksityiskohtaisemmin esi-5 merkissä 3.
Kloonien 22 ja 23 cDNA-sekvenssit olivat identtisiä lukuunottamatta yhden emäksen muutosta, jonka uskottiin olevan PCR-reaktion aiheuttama muutos. Kaksi toisistaan riippumattomasti amplifioitunutta fragmenttia sekvensoi-10 tiin myös tämän alueen selventämiseksi j a konsensussek-venssi on esitetty kuviossa 1. Tämän geenin pisin avoin lukuraami sisältää 354 emästä, jotka vastaavat 118 aminohapon pituista proteiinia, jonka massa on 13 kd. Tämä sekvenssi ei osoittanut merkittävää samankaltaisuutta minkään 15 täydellisten tietokannoissa olevien nukleotidi - tai proteiini sekvenssien kanssa. Aminohapot 27 - 47 muodostavat hydrofobisen alueen, joka voi sisältää HLA-A2-proteiiniin sitoutuvat peptidit [Falk, K. et ai. (1991) Nature 351: 290 - 296; Hunt, D.F. et ai. (1992) Science 255: 1261 - 20 1263; Ruppert, J. et ai. (1993) Cell 74: 929 - 93 7;
Nijman, H.W. et ai. (1993) Eur. J. Immunol. 23: 1215 - 1219]. cDNA-kloonien 22 ja 23 koodittamalle antigeenille annettiin nimi MART-1-antigeeni (Melanoma Antigen Recognized by T cells-1). Kymmenestä muodostetusta HLA-A2-25 restriktoituneesta TIL-linjasta yhdeksän tunnisti MART-1-proteiinin ja neljä tunnisti tässä eristetyn ja kuvatun gplOO-muodon (katso esimerkki 3) eikä yksikään tuntunut dj tunnistavan MAGE-1-proteiinia [Zakut, R. et ai. (1993) i ^ Cancer Res. 53: 5 - 8; tuloksia ei esitetty].
i
CD
X
cc
CL
m o o m δ c\j 69 tn _ m #-¾ q m !A O O Ii% €3 9-i n “oeoo" mSSgS SmmMmn rt jrmmmrn; o ίΐΐϊ ° v v f· v h J Ovvvv“ rt V V V " rt
P
e •v.
S
?· P *“* ns ö - j β φ rö i d röii »r-ι 4) iti <D (U O *γί in (ti M Ή *5 ♦ f^OO^O-rpTaraö-mXPd έ mo : moooort * p a p p t; mmr in«> HOHfUO—- H «S rt •h 4J JJ ommmmr' BfcEE» °vvu>»n o -π -a e -n „ O d -a 3 M S o V V V V P- K rt κ β μ rt fi ‘rt a 3
<—i OJ Jrt I -H O Ö -rt 1-1 I B
o>M rj p rl p ( |H rl p ^ ,ra * 5 C H3P4ni3-aHH.ni I C M BrHUMraiiiHod tn (d o > 3 o m -a m a CrataraBgnjra <n u 9 < m χ i g 3 ,¾ ,¾ H ^nfiälrlij^y J>, ►a.η m K Ό m -X q H H - <N P 1 (N ^ rt -n jj η o “ ί ^ ? -S <f “g I ______ _____ ______ 5!is siä s js i -gis?s;s i < § U -a M m <j 5 • Ss^idrtrt » c · u ^ C Η^1)(η3^ί)ιΙΐΐΡ οφ n S a " ; -n h a ΰ “3 ·ρ -h -a S « k ’d S o h o -a d 0 e -H ra -u V Ö o 2 -n -a a -a Ε-*Β a) jj rt Λ ™ u Λ! -a .a ui P u •H ÖO ti J > CfliJfÖHdHa) !?d 5^ipi-H*Hd9«fad
ia C p -au N id S .5 a !> S
a ° -h M « 6 1 J i H g -ja S "cp J3 aa <u +" S β C e + Cg * BBC c I M -g 1 « u + ' f O > c g -¾ äss-, - sm ^ Mg g i «I ! ΐ ii ΐ ? n 'n - 3 is S SSS? s ssa | Ϊ53 S ΠI 3 a 3 S h: i i s w s 5 aasisi sseim^ h « § ä ^ s | β § | g S-Γ > a w 1 * 1 3 S -rt -g o A -a- Ö3 « •ua» r-ι Ij -a a H 11 J -j P a g rt « _ o a f rt lrl o ί u v § <U ^ o O 4; 4J H H |j <N JJ ^ I 'H? *d n ti Oi 3 1» O ft ^ M O ^ rt ri (Ö Q 0 Sj 8 ^ V-t
? > * g -a 3 I ” -g J3 I 05 I ?· TJ
cvj - g - a s rsl^rl rr , ^ o M d -rt « B I t -rt 'n ? 3 3 rt rt £ O 3 £ -g 3 3 - « "rtrtrtrt C C rt rt g o -a YM £ ri 11 § I ia I-KSSK .5 li—s .S «!§££ 13 ! Il 1 _ 11»s« O ΒΗΛΪ01 £ ® S S U O 8 8 W SSSSn S »nlS^ B O Λ -nu i! n a «. m +
CD
X
X
X
m o o m δ
CVJ
70 ,,, , ((1 11 * I · · 1 ' 1 '
JfO
a . s£ CX rt ί«ΰ IO 0 cx ω >λ fö ο ιο o m bo o ^ « J~ pl O M 3 3 φ icö u ai *-i Q) rH CX V} (Λ O ^ O ΙΟ flj CÖ W P » j #rl 3 S?rt 5 3S-S I !o “-r o » » - rt M ^zä rSee? ö^-S^c ΐ s .sss gsg gg J I s
*Ö [j n jS 'H n U tt o! a? |g£ id > CJ Ω ^ nj 300 *H»-h {S il W
S Ph 5 S ί (^ § £ S N p; cflWW^KW) m H 0P« £ ° § K ’H
o ;s § s ° I s 3 ,3 H g 3 g g | d n «s 5 g £ £ ° U) O O >, >1 m o ω i i % M a “3 m h >, r-i ö 2 M ** ϊ Φ ij O «
•h 1C <o S E rH
0] Oi 05*H OH rt! <
Il M C Ή 4J gi E
ii O 4) <0 4) 3 p, g d 3 op ta m gH -H m ,<d P m 3 W!>-H > Ai o u -n <->“ a· rH ta e μ ta e tn rae o m m -h ta 3 ai ouE'H «m η*3.η
5 rH 34 C R Ai CU 3 1 K a m rH oi fndaJ
H <d 0 3 0 Ή e (Λ ra! 3 3 5 S g X> -H C d Γ, <0 ® cö Ai^Aiiacöta ojAico coh Hhusb o « Ai *3 « <ri "g e oAicra j3 ie s e ® «'Hu B o Ä e o-a . u u R 3 <u d u “ .5 M > M M 3Ai R R i-ί >Ai 3 O «33 K 3 t, h ui -Q C S U H g S '£? 3 O -H Φ-Η ® li 3 O) ffl-H-H 3 0 I hh 1«Ιθη -H rl 32a OnOJt’ ™ K ORMgSR «KiMgC H |r |-, Wfl £ ui b X 33 Sk* 0
•3 7 N *J
u g ·« td -n e> s -M tö I i « s ^ S id R g g
?] rt .h rt flJ
S + + **♦♦*.·· + + ♦ * + + -*+ + ♦+ O R * g Q, Ai tu " I 2 & «o l .H Ä -S “ 5 '1 “ ä g g g
«led b Ϊ o S H
^ 5? o X m · g m m «o o -H ,g JS
° Ιέ ί i iuiiirs5p| ΐ!ί11 lililll ·|'ϊ ' 2 S «a j o«« ««Βη«·55ί J*"i s! EzEzeEi o >. td a) 1^ SS SK ia m« S ou w u a * rt se n m m m K, z s κ ι κ κ * H Λ jj >
O H S
CD
X
X
X
m o o m δ c\j «s 71 MÄRT-l-proteiinin ekspressio
Eri solulinjojen, sisältäen melanooma-, melanosyyt-ti- ja muita syöpäsolulinjoja kuin melanoomalinjoja, ja normaalikudosten Northern blot -analyysi suoritettiin 5 MART-1-proteiinia kodittavan geenin ekspression arvioimi-seksi (taulukko 3) . Seitsemän kymmenestä testatusta HLA-A2 + -melanoomasolulinj asta, kaikki neljä testattua HLA-A2 ~-melanoomasolulinj aa ja kaikki seitsemän testattua melano-syyttisolulinjaa olivat positiivisia MART-1-RNA-molekyyIin 10 ekspression suhteen. Tässä Northern analyysissä kaikki HLA-A2 + -melanoomasolulinjat, jotka äskettäin on muodostettu laboratoriossamme, ekspressoivat MART-l-RNA-molekyyliä. Oli olemassa täydellinen korrelaatio MART-1-ekspression ja TIL501.A42-solujen aiheuttaman lyysiksen välillä kymmenes-15 sä HLA-A2 + -melanoomalinjassa, jotka on esitetty taulukossa 3. TIL501.A42-solut, jotka tunnistivat MART-1-antigeenin, lyysasivat 13 HLA-A2 + -melanoomasolulinj aa 17 testatusta (76 %) (tuloksia ei esitetty). Kymmenestä mRNA-ekspression suhteen Northern blot -analyysillä tutkitusta normaalista 20 ihmisen kudoksesta ainoastaan verkkokalvo oli positiivinen. Mitään positiivisutta ei havaittu missään solulin-joissa, jotka olivat peräisin T-, B-, munuaisen epiteeli-tai fibroblastisoluista tai 19 muussa kasvaimessa kuin melanoomassa. Näin ollen tuntuu siltä, että MART-1 on ai-25 emmin kuvaamaton antigeeni, jota ekspressoidaan ihon ja verkkokalvon melanosyyttilinjan soluissa, jota myös eks- ^1 pressoidaan melanoomasoluissa.
o c\J Tutkimukset, ]oissa käytettiin T-solukloonien ja o immuuniselektoitujen melanoomakloonien paneelia [Knuth, A.
^5 30 et ai. (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 2804 - 2808; x Wolfel, T. et ai. (1987) J. Exp. Med. 170: 797 - 810] kuin
CC
myös tutkimukset, joissa analysoitiin melanoomasolujen m o HPLC-fraktioituja peptidej ä [Slingluff, C.L. et ai. (1993) ί J. Immunol. 150: 2955 - 2963; Storkus, W.J. et ai. (1993) 35 J. Immunol. 151: 3719 - 3727] antavat ehdottaa, että mela- 72 noomissa on useita antigeenisiä peptidejä, jotka voivat herättää immuunivasteen. cDNA-kloonauksella on tunnistettu kaksi geeniä, jotka koodittavat melanooma-antigeenej a; MART-1- (kuvio 1; SEQ ID -numero 1) ja gpl00-geeni (katso 5 esimerkki 3; kuviot 4A ja 4B; SEQ ID -numero 26). MART-1 -proteiini ja tässä kuvattu gpl00-muoto (kuviot 4Ä ja 5A; SEQ ID -numero 26 ja 27) molemmat tunnistetaan HLA-A2.1-restriktoituneiden TIL-soluj en toimesta . MART-1-antigeeni on 118 aminohapon pituinen proteiini, jonka massa on noin 10 13 kd. MART- 1-geeniä j a sen aminohapposekvenssiä ei ole aiemmin kuvattu.
MART-1-RNA ekspressoitui 11 HLA-A2.1-positiivisessa tai negatiivisessa melanoomalinj assa 14 melanoomalinj asta ja seitsemässä melanosyyttilinjassa seitsemästä linjasta. 15 Lukuunottamatta verkkokalvokudosta, MART-1-ekspressiota ei havaittu missään testatussa normaalikudoksessa, T-solulin-j assa, B-solulinj assa, munuaisen epiteelilinj assa, fibroblast il in j assa tai 19 kasvainsolulinj assa, jotka olivat peräisin paksusuolen-, rinta-, aivo-, munuais-, keuhko-2 0 tai luusyövästä.
Toinen melanooma-antigeeni, MAGE-1, on kuvattu, jonka tunnistavat sellaiset T-solut, jotka on saatu perifeerisen veren lymfosyyteistä toistuvien in vivo tai in vitro immunisaatioiden jälkeen [Van Der Bruggen et ai. 25 (1991) Science 254: 1643 - 1647].
Niiden geenien tunnistus, jotka liittyvät melanoo-£! makasvaimen antigeeneihin, avaa uusia mahdollisuuksia ak- ^ tiivisiin spesifisiin immunisaatiolähestymistapoihin syö- i 0 päpotilaiden immunoterapiassa, jotka perustuvat näiden i ^5 30 geenien viemiseen virus- tai bakteerivektorisysteemeihin.
1 On olemassa mahdollisuus, että melanosyytti-melanooma-lin- ^ jän antigeenejä, kuten MART-1-antigeeniä, vastaan indusoi-
LO
o dut immuunireaktiot voivat muodostua normaalisoluja vas- ^ taan. Valkopälven, j oka luultavasti j ohtuu anti-melano- 35 syytti-immuunireaktioista, on julkaistu assosioituvan 73 edulliseen prognoosiin potilailla, joilla on melanooma [Nordlund, J,J. et ai. (1983) J. Am. Aead. Dermatol. 9: 689 - 695; Bystryn, J-C. et ai. (1987) Arch. Dermatol.
123: 1053 - 1055] ja sen on julkaistu esiintyvän myös po-5 t ilaissa, jotka respondoivat kernoimmuno terapia an [Richards, J.M. et ai. (1992) J. Clin. Oncol. 10: 1338 - 1343] . TIL-soluja, joilla on anti-melanosyyttireaktiivi-suuksia, on annettu potilaille, joilla on edennyt melanooma [Rosenberg, S.A. et ai. (1988) N. Engl. J. Med. 319: 10 1676 - 168 0; Rosenberg, S. A. et ai. J. Clin. Oncol. 10: 180 - 199] j a vaikka näillä potilailla on havaittu sporadista valkopälvisyyttä, mitään haitallisia silmävaikutuk-sia, jotka liittyvät näiden me1ano syyt t i ant igeenien mahdolliseen ekspressioon verkkokalvosoluissa, ei ole havait-15 tu.
Koska HLA-A2-proteiinia on läsnä noin 50 % yksilöistä ja HLA-A2-restriktoitunut MART-l-antigeeni tuntuu olevan- myös laajasti ekspressoitunut melanoomissa, immuni-saatio MART-1-antigeenillä voi olla erityisen käyttökel-20 poista aktiivisten immunoterapioiden kehittämiseksi.
Esimerkki 2 MART-1-proteiinin immunogeenisten epitooppien karakterisointi
Melanoomaspesifisten CTL-linjojen ja TIL-kloonin 25 muodostus
Melanoomaspesifiset CTL-linjat muodostettiin vil- £! jelemällä yksisolususpensiota, joka valmistettiin metas- oj tasoivasta melanoomasta niin, että läsnä oli 6 000 IU IL- o 2-proteiinia/ml (Cetus-Oncology Division, Chiron Corp., co 3o Emeryville, CA) , kuten aiemmin on julkaistu [Kawakami, Y.
x et ai . (1988) J. Exp. Med. 168 : 2183] . T-soluklooni A42 cc muodostettiin raj oittavalla laimennusmenetelmällä poti-
LO
g laasta 501.
LO
O
C\1 74 CTL-solujen antigeenin tunnistuksen määrittäminen
Sytotoksiset 51Cr-vapautustestit ja sytokiinivapau-tustestit käyttäen ELISA-menetelmää IFN-gamma-, GM-CSF- ja TNF-a-proteiinin mittaamiseksi suoritettiin TIL-soluj en S reaktiivisuuden analysoimiseksi, kuten ovat kuvanneet Kawakami, Y. et ai. (1988} J. Exp. Med. 168: 218 (katso esimerkki 1). Melanoomasolulinjat muodostettiin laboratoriossa . Tunnettujen antigeenien tunnistuksen analysoimiseksi TIL-soluj en toimesta COS7-soluiinjaa, j oka oli 10 transfektoitu cDNA-molekyylillä, j oka kooditti j oko MART-1-, gplOO-tai tyrosinaasille sukua olevaa proteiinia (gp75) [Cohen, T. et ai. (1990) Nucleic Acids Research 18: 2807] yhdessä HLA-A2.1-cDNA-molekyylin kanssa, inkuboitiin TIL-solujen kanssa 20 tuntia j a supernatanttiin erittyneen 15 IFN-gamma-proteiinin määrä mitattiin ELISA-menetelmällä, kuten on kuvattu esimerkissä 1. Plasmidissa pcDNA3 (Invit-rogen, San Diego, CA) olevat MART-1- (katso esimerkki 1) tai gpl0 0-proteiinia (katso esimerkki 3} koodittavat cDNA-molekyylit kloonattiin 501mel-melanooma-cDNA-kirjastosta 2 0 seulomalla TIL1235- tai TIL1200-soluilla, vastaavasti (katso esimerkki 1). Plasmidissa pCEV27 oleva tyrosinaasille sukua olevaa proteiinia (gp75) koodittava cDNA eristettiin 501mel-melanooma-cDNA-kirjastosta käyttäen koetin-ta, joka muodostettiin PCR-menetelmällä, joka perustui 25 julkaistuun gp75-sekvenssiin [Cohen et ai. (1980) Nucleic Acids Research 18: 2807].
cm Peptidisynteesi ja antigeenisten peptidien tunnisti tus
Peptidit syntetisoitiin kiinteätaasimenetelmällä co 30 käyttäen Gilson AMS 422 -monipeptidisyntetisaattoria. Pep- tidit puhdistettiin HPLC-menetelmällä Vydac C-4 -pylväässä cc 0,05 % TFA/vesi-asetonitriili-liuoksella. Antigeenisten g peptidien tunnistamiseksi T2-solulinjojen, joita oli esi- o LO inkuboitu kaksi tuntia kunkin peptidin kanssa, lyysi TIL- δ C\1 75 solujen toimesta mitattiin käyttäen sytotoksista 51Cr-va-pautustestiä.
HLA-A2-proteiinin suhteen restriktioituneet melanooma spesifiset TIL-solut 5 HLA-A2-restriktoituneet melanoomaspesifiset CTL- linjat ja A42-klooni muodostettiin lymfosyyteistä, jotka tunkeutuivat 10 melanoomapotilaan kasvaimiin. Nämä TIL-solut tunnistivat autologiset ja useimmat allogeeniset tuoreet tai viljellyt melanoomasolut, jotka ekspressoivat 10 HLA-A2-proteiinia, mutta eivät tunnistaneet HLA-A2“-melanoomia tai muita HLA-A2 + -solulinjoja kuin melanoomasolulin-jat [Kawakami et ai. (1992) J. Immunol. 148: 638]. Ne tunnistivat myös normaalit viljellyt HLA-A2+-melanosyytit, jotka olivat peräisin vastasyntyneen ihosta [katso esi-15 merkki 1 ja Kawakami, Y. et ai. (1993) J. Immunotherapy 14: 88]. Näin ollen nämä TIL-solut tunnistivat ei-mutatoi-tuneet omat peptidit, jotka olivat peräisin proteiineista, jotka ekspressoituivat melanoomassa j a melanosyyteissä HLA-A2-proteiinin yhteydessä.
20 Muiden melanoomaproteiinien tunnistus TIL-solujen toimesta
Neljän eristetyn melanoomaproteiinin, sisältäen MART-1-proteiinin, yhden gpl00-muodon (kuvio 5A; SEQ ID -numero 26, katso esimerkki 3) j a tyrosinaasille sukua 25 olevan proteiinin (gp75), tunnistusfrekvenssin arvioimiseksi testattiin TIL-solujen reaktiivisuus COS7-soluja ™ kohtaan solulinjoilla, jotka oli transfektoitu cDNA-mole- o c\i kyylilla, joka kooditti naita kolmea proteiinia mm, että o läsnä oli HLA-A2.1-proteiinia koodittava cDNA tai sitä ei i & 30 ollut. Yksi useista yhdeksällä TIL-linj alla tehdyistä koin keistä on esitetty taulukossa 4. Kahdeksan yhdeksästä HLA- A2 -restriktoituneesta melanoomaspesif isestä TIL-linj asta m o eritti IFN-gamma-proteiinia, kun niitä mkuboitiin COS7- ^ solujen kanssa, jotka oli yhteistransfektoitu MART-1- ja ^ 35 HLA-A2.1-sekvensseillä. Ainoastaan TIL1200-linja, joka on 76 suhteellisen oligoklonaalinen CTL-linj a [Shilyansky, J. et ai. (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91: 2829], ei res-pondoinut tälle COS-transfektantille. Neljä TIL-linjaa (620, 660, 1 143, 1 200) tunnistivat gpl00-proteiinin, kun 5 transfektoitiin yhdessä HLA-A2.1-sekvenssin kanssa. TIL-1200-solut erittivät suuria määriä IFN-gamma-proteiinia verrattuna TIL620-, TIL660- ja TIL1143-soluihin antaen ehdottaa, että ainoastaan pieni alaryhmä T-soluja näissä jälkimmäisissä kolmessa TIL-linjassa tunnisti gpl00-pro-10 teiinin. Yksikään näistä TIL-soluista ei tunnistanut gp75-proteiinia tätä testiä käytettäessä. Näin ollen MART-1 on yleinen melanooma-antigeeni, jonka tunnistavat useimmat HLA-A2-restriktoituneet TIL-solut, jotka ovat peräisin melanoomapotilaista.
15 TIL-solujen tarvitsemien MART-l-epitooppien tunnis tus MART-1-epitooppien tunistamiseksi näille TIL-so-luilie, valittiin 23 peptidiä perustuen tunnettuihin motiiveihin, joilla peptidit sitoutuvat HLA-A2.1-proteiiniin 20 [Falk, K. et ai. (1993) Nature 351: 290; Hunt, D.F. et ai.
(1992) Science 255 : 12 61; Ruppert, J. et ai. (1993) Cell 74: 929], ne syntetisoitiin (> 90 % puhtaus) ja seulottiin testaamalla HLA-A2.1 + -T2-solulinj an lyysi TIL-soluj en toimesta sen jälkeen, kun T2-linjaa oli inkuboitu kunkin pep-25 tidin kanssa (taulukko 5) . T2-solulinjan [Cerundolo, V. et ai. (1990) Nature 345: 449 - 452] solut lyysautuivat hyvin kaikilla neljällä testatulla HLA-A2-restriktoidulla mela-o noomaspesifisellä TIL-linj alla, kun esi-inkuboitiin joko li. peptidillä M9-2 , M10-3 tai M10-4 . Molemmat kymmenen amino- o ^ 3 0 hapon pituiset peptidit, M10-3 j a M10-4, sisältävät M9-2- sekvenssin niin, että M10-3 sisältää sen N-päässä lisäglu-£ tamiinihapon ja M10-4 sisältää ylimääräisen isoleusiinin g sen C-päässä. Nämä peptidit sijaitsevat MART-1-proteiinin § hydrofobisessa mahdollisesti membraanin läpi menevässä o 35 domeenissa. Sama lyysi havaittiin, kun kohteeksi valittiin
C\J
77 muita näiden peptidien kanssa inkuboituja HLA-A2+-restrik-toituneita soluja, sisältäen K4B-solut [saatiin tohtori William Biddson'lta, NIH; Storkus, W. et ai. (1993) J. of Immunology 151: 3719 - 3727] ja Epstein-Barr-viruksella 5 transfektoidut 501EBVB-B-solut [Topalian et ai. (1989) J. Immunol. 142 : 3 714 - 3725] tai HMY-C1R-B-solut [tohtori
William Biddson, NIH; Storkus, W. et ai. (1993) J. of
Immunol. 151: 3719 - 3727] , jotka oli transfektoitu HLA-A2.1-geenillä (tuloksia ei esitetty).
C\J
δ c\j N- o
CO
X
IX
o.
LO
O
o
ID
δ
C\J
78 m oo oo o o o mmo J m m v m Γ4 c- t"
I-, H
o ωο oo o o o OHO
Jörn θ'
HO! Γ* OI
H h rt V· O VO M Ί· O ^ΗΓ- J If m rt rt rt to N1 H rt rt rt £-* rt j ltd ! ' " I Ή ! 1 ! (¾ 03 .-·, MO OO O O O MOO fxlBlNd-Urtrtff-Hr-^ , J (N rt f" UI «;m>i-H3-H0rtrtMrt ,' m η Cm ιαίΛΗΗΐΛ K m o o H h rtTiDdo (d^-HU-n X m d'rtooooootooo K >. ο π) I h iJ ·π (U μ h jco^m M , j f Ϊ d C ° i μ ΰ 3 ä GS “ ^ " g S g B H 3 n h 3 » 3 S rt1 ^ 0 P -H , y td H O rt 's!
f* v -h oo oo o a o in o H fluu'doiii»dH
Ϊ gS Ϊ S S S 1 2 S ί ϋ 1 1 g S S
S Hrt ί S-sSiiJ!3P
| ä; ; s° 00 ss° a a s .5 . j s .5 μ s % 3 , f-“ li “ H Γ ; ί ϋ ss s * «! h u ^•πΒ^^ρη’Ι ^i?!2 •s S dS S° 00 000 S2° S rt § O o I s 1 7 y s rt rt ^ ^ H « s S « .H u ^ , 3 , +j U J rt rt O OO OOO OOO udrtft > 8 rt rt rt S' |s ps " K SK°f^ic°rtöSg
? -o y :2 S " ra ϋ S π H s a S
3 h ^ E ω -U id ^ S m ' ^ ΐ ί ίο f rt O U! -H u -H ^ I 2-¾
ί ? < 4,,+ ,,,+ + + g -rt ^ « ί J H S β S
jb I & 18 g f^te a s 3
m S Jo § g I h V g « f Γ -S y I
Is 1 SS >h-So3"« ? 3 .5 3 rt
-B rt + + + y ω P te I 7 ‘D Ö rt -H 5 -H
d S I dc PS srt rt rt H ’ Sertraey-rtglHCOo, 51 n X :ro :ro :co . ... 0 O ä) Η Π Ö P u -rt, 1 -h a a> m iro ;ra pj H m n N ιβκμΚ^;>ο,0 o rtm rt “ u u 3 V q ti Λ et ro rt ι p, „ _ >«S H o
SS m 3 -rt -rt rt rt ' ° rt rt «. ra -H H 6) -rt td ‘rt P -n p< ' H
51 PSrt<< gg 0i fcSS raUM44HJJ'*Jrta<i S& tno ns -H SI “i S n n o 5 J rtCOUOrtrt.Heiragöi .? S rt O o -rt rt rt j S B<5 rt J H rapu ra -H 0 ra g w Π 5 h rt υ w w w K Ztncn ϊε K K rt rt ra,rtEBrtdgSrt
en e μ e 3! '5 « λ « 5 S J
5¾ nsoaJol-Mfiäs^ os^i»
_ , rtt , e I rtrtrt-r-iSrtPrtAit-H
CVJ ^ i E rt | ijiSa ^03!««j5(!u I— OPC ro s pj-h -h - H s e ra G m m OS S S ro h . _, rtNKSirop-rtiH'Qrt 5 S HO •y rt OrtHrH.rtlPÖMH ΡΌ
e VJ q 2 y peons 0)« _ _ ^ ^ ^ r» atoHHrtAi-Hrt-rtHO
B b d g rt ή EE e~ f Ht-r- r» r~ r· pjjaj.HrtpootNirooo ' d “ S -h Mp v t~ ui m m m m m m m wumr-iiu^iMXft> mx 1^ 3 d S μ o *h o o\ oo ooo ppo
cp BSrt mij rt ra n UO DUO UUU
CD
X
X
X
m o o m δ
CVJ
79
Taulukko 5
Synteettisillä MART-1-peptideillä esi-inkuboitujen T2-solujen lyysi
5 TIL TIL TIL
Kohde Peptidi A42 1235 660 1074
Spesifinen lyysi-% 50lmel Ei mitään 47 30 31 41 397mel Ei mitään 1012 T2 Ei mitään "2 -3 -1 1 T2 M9-1 TTAEEAAGI -10 -5 -5 . -4 T2 M9-2 MGTrTT ^ 64 Θ0 40 56 T2 M3 - 3 ÖIGILTVIL IB 20 0 10 T2 M9-4 GILTVILGV 1 -1 -3 2 T2 M9-5 ILTVILGVL -2 -1 -5 -1 15 T2 M9-6 LTVILGVLL 10 10 T 2 M9-7 TVILGVLLL -2 -3 -2 1 T2 M9-8 VILGVLLLI 1 5 -2 -2 T2 M9-9 ALMDKSLHV -1 -4 -8 0 T2 M3 -10 SLHVGTQCA -1 1 -8 4 T2 M3-11 PWPNAPPA -2 0 4 -1 T2 M9-12 NAJPPAYEKL 1-2 0 6 20 T2 M10-1 YTTAEEAAGI -4 -2 -3 3 T2 M10-2 TAEEAAGIGI 7 11 12 15 T2 M10-3 EAAGIGTLTV 55 66 31 51 T2 M10-4 AAGTGILTVI 34 68 29 21 T2 M10-5 GILTVILGVL -1 2 7 10 T2 M10-6 ILTVILGVLL 1667 T2 HIO-7 LTVILGVLLL -2 -1 -1 2 T2 M10-8 TVILGVLLLI -6 -1 -1 11 2 5 T2 M10-9 RALMDKSLHV 3 5 8 11 T2 M10-10 SLHVGTQCAL -2 -8 2 9 T2 M10-11 SLQEKNCEPV 3 2 2 9 ' (M _ '________ δ , 23 peptidiä (SEQ ID -numerot 3 - 25) (12 9-mer- ja 11 10-mer-peptidiä) - S- O (> 90 % puhtaus) syntetisoitiin ja lyysautuvuus TIL-kloonin A42, TIL- ^® linjojen TIL1235, TIL660 ja TIL1074, jotka olivat peräisin eri poti- χ laista, suhteen testattiin HLA-A2+-T2-soluja vastaan, joita esi-inku- £ boitiin kullakin peptidillä (10 /ig/ml) neljän tunnin pituisessa syto- m toksisessa 51Cr-vapautustestissä niin, että E:T oli 20:1 A42-soluille o O ja 40:1 muille TIL-linjoille. T2-solut lyysautuivat hyvin, kun niitä ^ inkuboitiin peptidien M9-2, M10-3 ja M10-4 kanssa. Peptidit M10-3 ja o 3 5 .......
cvj M10-4 sisältävät koko M9-2-sekvenssin (alleviivattu) .
80
Peptidit M9-1, M9-2, M9-3, M10-2, M10-3, M10-4 ja M10-5 puhdistettiin edelleen ja ne titrattiin, j otta kyettiin arvioimaan niiden suhteellinen kyky herkistää T2-soluja lyysille MART-1-reaktiivisten TIL1235-soluj en tai T-5 solukloonin A42 toimesta (kuvio 2). Puhdistettujen peptidien M9-2, M10-3 ja M10-4 tarvittava minimikonsentraatio oli 1 ng/ml, 100 ng/ml ja 1 000 ng/ml, vastaavasti. TIL-•klooni A42 ei tunnistanut puhdistettua M10-4-peptidiä edes silloin, kun sitä käytetiin konsentraationa 10 μ$/ν\1, kulo ten on esitetty kuviossa 2. M9-1-, M9-3-, M10-2- ja M10-5-peptidej ä ei tunnistettu A42- tai TIL123 5~soluj en toimes- t cl MART-l-peptidien tunnistus HLA-A2-restriktoitunei-den eri potilaista muodostettujen TIL-solujen toimesta 15 Sen arvioimiseksi, tunnistavatko erilaiset HLA-A2- restriktoituneet MART-1-spesifiset TIL-solut samat vai eri epitoopit MART-1-antigeenissä, kunkin peptidin kanssa esi-inkuboituj en T2-solujen [Cerundolo, V. et ai (1990) Nature 345: 449 - 452] lyysi testattiin sellaisten TIL- 20 solujen kanssa, jotka olivat peräisin 10 melanoomapoti-laasta. Edustava koe 10 TIL-linjalla on esitetty taulukossa 6. M9-2- ja M10-3-peptidit tunnisti yhdeksän kymmenestä TIL-linjasta (ainoastaan TIL1200-solut olivat negatiivisia) kuin myös A42-klooni niin, että lyysikuvio oli saman-25 lainen kuin COS7-soluilla, jotka oli yhteistransfektoitu cDNA-molekyyleillä, jotka koodittivat MART-1- j a HLA-A2.1-£! proteiinia. Ainoastaan TIL620- ja TIL088-solut sisälsivät ° alhaisen tason epäspesifisen T2-solujen lyysin ilman pep- i o tidej ä tai sen j älkeen, kun oli lisätty a s i aankuu1uma11o- 30 mi a peptidejä, mutta osoittivat merkittävän kohoamisen x sellaisten T2-solujen lyysissä, joita esi-inkuboitiin M9-
2 - , M10 -3 - j a M10-5-peptidien kanssa . M10-4-peptidin tUn-IO
0 nistus erosi TIL-solujen joukossa, mutta oli samanlainen 1 verrattuna T-solukloonin A42 tai T-solulinjan TIL1235 eri-
° 35 laiseen reaktiivisuuteen Ml0-4-peptidiä kohtaan (kuviot 2A
81 ja 2B) . Korkeammat konsentraatiot (1 pg/ml) M10-4-peptidiä tarvittiin lyysiin kuin tarvittiin M9-2- tai M10-3-pepti-diä. Nämä 10 TIL-linjaa ja klooni A42 erittivät myös syto-kiinejä, sisältäen IFN-gamma-, GM-CSF- j a TNF-a-proteii-5 nit, kun inkuboitiin sellaisten T2-solujen kanssa, joita oli esi-inkuboitu M9-2- tai M10-3-peptidin kanssa (tuloksia ei esitetty). Sen vuoksi M9-2 - tai M10-3-peptidit ovat yleisiä epitooppeja, jotka useimmat HLA-A2-restriktoitu-neet melanoomaspesifiset TIL-solut tunnistavat.
(M
δ
(M
ri o
CD
X
cc 0-
LO
O
O
LO
’ O (M
82
Taulukko 6 MART-1-peptidien tunnistus HLA-A2-restriktoituneiden me1anoomaspesifisten TIL-solujen toimesta TIL TIL TIL TIL TIL TIL TIL TIL TIL TIL Klooni Kohde Veptiai SOI 620 660 1074 ΙΟββ 1128 HU 2200 1235 1363 A«2 3 lug/ml)
Spesifinen lyysi-% SOlmel El mitään 42 49 35 32 31 19 24 41 32 43 41 3S7mel Ei mitään 3166 1 1 4 3 3 34 1 T2 Ei mitään 0 η -s η ·β .η ·β η . / -6 Τ2 Μ9-1 (1) 4 15 -4 1 31 1-5-1 1 4 3 10 Τ2 Μ9-2 11) 66 75 73 79 96 30 36 2 92 82 91 Τ2 Μ9-2 (0,001) S2 49 23 32 81 9 6 1 10 41 63 Τ2 Μ9-3 (1) 5 25 0 1 19 0 1 -2 0 -2 -4 Τ2 Μ10-2 (1) 10 22 5 8 21 6 3 7 7 7 6 Τ2 Μ10-3 (1) 84 68 68 73 79 24 27 1 42 67 62 Τ2 Μ10-3 (0,001) 91 50 33 25 86 13 14 0 14 39 1 Τ2 Μ10-4 (1) 83 47 16 35 80 6 3 1 14 53 0 Τ2 Μ10-4 (0,001) 0 11 3 0 14 4 -1 -1 2 -3 -3 15 Τ2 Μ10-5 (1) 4 14 1 4 13 2 3 0 3 0 2
Sellaisten T2-solujen, joita oli esi-inkuboitu puhdistettujen peptidien M9-1/ M9-2, M9-3, M10-2, M10-3, M10-4 ja M10-5 kanssa, lyysautuvuus TIL-kloonilla A42 ja kymmenestä potilaasta peräisin olevilla TIL-lin-joilla testattiin neljän tunnin pituisessa 5,Cr-vapautustestissä niin, 9 Π ώ että E:T-suhde oli 20:1 A42-soluille ja 40:1 muille TIL-linjoille.
Yhdeksän kymmenestä TIL-linjasta lyysasi T2-solut, joita oli inkuboitu peptidien M9-2 tai M10-3 kanssa. Seitsemän kymmenestä TIL-linjasta lyysasi T2-solut, joita oli inkuboitu peptidin M10-4, jonka konsent-raatio oli 1 μg/ml, kanssa.
CM
δ
CM
Γ-ί ο
CD
X
X
0-
LO
O
O
LO
δ
CM
83
Tunnettujen melanoomaproteiinien tunnistuksen suhteellinen frekvenssi sellaisten T-solujen toimesta, jotka ovat peräisin kymmenen melanoomapotilaan TIL-soluista, on tutkittu. MART-1-antigeenin yleiset epitoopit, M9-2 ja 5 M10-3, jotka yhdeksän näistä TIL-soluista pääasiassa tun nisti, on myös tunnistettu. MART-1-proteiinia koodittava cDNA eristettiin cDNA-ekspressiokloonauksella käyttäen TIL1235-soluja seulontatesteissä (katso esimerkki 1). MART-1 on 118 aminohapon pituinen proteiini, joka sisältää 10 yksittäisen membraanin läpi menevän domeenin ja jota eks-pressoidaan useimmissa melanoomasoluissa kuin myös viljellyissä melanosyyteissä ja verkkokalvossa niin, että cDNA-molekyylin ekspressiokuvio on samanlainen kuin esimerkissä 3 kuvatulla gplOO-muodolla. Neljä kymmenestä TIL-solusta 15 tunnistaa gplOO-proteiinin.
Annosresponssianalyysiin perustuen peptidi M9-2 herkisti tehokkaimmin T2-solut lyysille (kuvio 2) antaen ehdottaa, että tämä peptidi voi olla luonnollisesti prosessoitu ja on esillä kasvainsoluissa. M9-2-peptidin tun-20 nistavat T-solut voivat reagoida peptidin M10-3 tai M10-4 kanssa, koska jälkimmäiset 10-mer peptidit sisältävät peptidin M9-2 yhdeksän aminohapon sekvenssin. Eri TIL-solut tunnistavat hiukan eri lailla nämä kolme peptidiä. Esimerkiksi M10-4-peptidin tunnisti huonosti T-soluklooni A42, 25 mutta sen tunnisti hyvin jotkin TIL-linjat, vaikkakin korkeampi M10-4-peptidin konsentraatio oli tarpeen lyysin c\J havaitsemiseksi . Tämä voi johtua variaatiosta TCR-af fini- oj teetissa M9-2- ja Ml0-4-peptidejä kohtaan HLA-A2-proteii- i nin yhteydessä, tai vaihtoehtoisesti TIL-linjat voivat cd 30 sisältää erilaisia T-solukloonej a, jotka tunnistavat aino- x astaan joko M9-2- tai M10-4-peptidin. Peptidit M10-3 ja
CC
M10-4 voivat myös olla luonnollisesti prosessoituj a j a o esillä kasvainsoluissa. Useiden me1anooma-antigeenien läs- !£ näolo HLA-A2-proteiinissa on aiemmin ehdotettu analysoi- ° 35 maila melanoomasolukloonien tunnistusta eri T-solukloonien 84 toimesta [Knuth, A. et ai. (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 2804; Wolfel, T. et ai. (1989) J. Exp. Med. 170: 797] tai analysoimalla HPLC-peptidifraktioita, jotka eristettiin HLA-A2-melanoomasoluista [Slingluff, G.L. Jr. et 5 ai. (1993) J. Immunol. 150 : 2 95 5; Storkus, W.J. et ai.
(1993) J. Immunol. 151: 3719].
Se havainto, että useimmat me1anoomapot i1ai s t a peräisin olevat HLA-A2-restriktoidut TIL-solut tunnistavat yleiset MART-1-peptidit, mutta eivät gp75-proteiinia antaa 10 ehdottaa, että M9-2- tai M10-3-MART-1-peptidit voivat olla immunogeenisempia indusoimaan T-soluvasteen in vivo kuin muut tunnetut melanooma-antigeenit. Jotkin tässä tutkimuksessa käytetyt TIL-solut injektoitiin yhdessä IL-2-prote-iinin kanssa autologisiin potilaisiin ja mielenkiintoista 15 oli, että kaikki neljä TIL-linj aa (620, 660, 1 074, 1 200), jotka tunnistivat gpl00-proteiinin (kuvio 5A; SEQ ID -numero 27), indusoivat tehokkaasti kasvaimen regression (yli 50 prosenttinen kasvaimen pienentyminen). Kaikki muut, paitsi TIL1200-linja, myös tunnistivat MART-l-prote-2 0 iinin.
Esimerkki 3
Kasvaimeen tunkeutuvien lymfosyyttien tunnistaman ihmisen toisen melanooma-antigeenin, joka assosioituu kasvaimen hyljintään in vivo, tunnistus 25 Melanooma-antigeenimuotoa, jonka nimi on gplOO, koodattava cDNA25-klooni kloonattiin samanlaisilla mene-c\J telmillä kuin on kuvattu esimerkissä 1 ja julkaisussa ° Miki, T. et ai. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 5167
^ - 5171. Lyhyesti, rintasyöpäsolulinja MDA231 (ATCC
i co 30 #HTB26), joka oli transfektoitu lambdapCEV27-vektorissa x olevalla cDNA-kirjastolla, joka oli tehty 501mel-melanoo-
IX
“ masolulinjasta, seulottiin antigeenin positiivisuuden suh- o teen mittaamalla interferoni-lambda (IFN-gamma) eritystä !£ silloin, kun viljeltiin yhdessä TIL1200-solujen kanssa, o 35 TIL1200-solut muodostettiin, kuten on kuvannut Kawakami, 85 Y. (1988) J. Exp. Med. 168: 2183 - 2191. Integroitunut cDNA otettiin talteen positiivisten transfektanttien geno-misesta DNA:sta PCR-menetelmällä ja kloonattiin nisäkäs-ekspressioplasmidiin pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA) .
5 cDNA25-molekyylin täyspitkä cDNA eristettiin 501mel lamb-daCEV27 -kirjastosta käyttäen cDNA25-koetinta. Täyspitkän cDNA2 5-molekyylin sisältävä lambda-faagi digestoitiin XhoI-entsyymi11ä ja sitten ligoitiin itsensä kanssa kiinni T4 DNA ligaasilla niin, että muodostettiin plasmidi 10 pCEV27-FL25. Vaihtoehtoisesti PCR-menetelmällä, jossa käytettiin gplOO-sekvenssille spesifisiä alukkeita, eristetty täyspitkä CDNA25 kloonattiin pCRII-vektoriin (Invitrogen) ja sitten se kloonattiin pcDNA3-vektoriin (pcDNA3-FL25). Sen testaamiseksi, koodittiko tämä cDNA melanooma-antigee-15 nia, se transfektoitiin uudelleen COS7-, A375- tai MDA231-soluihin, ja tuloksena syntyneet transfektantit testattiin TIL1200-solujen stimulaation suhteen. Plasmidikloonin pCEV27-FL-25 DNA-sekvenssi määritettiin automaattisella DNA-sekvensoijalla (malli 373A; Applied Biosystems, Inc.) 20 käyttäen Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing -käyttö-pakkausta valmistajan ohjeiden mukaisesti (Applied Biosystems, Inc.).
Peptidisynteesi ja antigeenisten peptidien tunnistus 25 Peptidit syntetisoitiin kiinteäfaasimenetelmällä käyttäen Gilson AMS 422 -monipeptidisyntetisaattoria. Pep- ™ tidit puhdistettiin HPLC-kromatografiällä Vydac C-4 -pyi- o cm väässä 0,05 % TFA/vesi-asetonitriili-liuoksessa. Antigeeni nisten peptidien tunnistamiseksi T2 RET -solujen, joita 30 esi-inkuboitiin peptidien kanssa kaksi tuntia (h) , lyysi x TIL-solujen toimesta mitattiin käyttäen sytotoksista 51Cr- vapautustestiä.
LO
O
O
LO
δ C\1 86
Metastasoivaa melanoomaa sairastavan potilaan hoito käyttäen TIL1200-soluja 29-vuotiasta miespotilasta, jolle annettiin poti-lasnumero 1200, jolla oli laajalle levinnyt metastasoiva 5 melanooma, jonka kemoterapia ja säteilytysterapia oli aiemmin epäonnistunut, hoidettiin yhdellä preparatiivisel-la annoksella, joka oli 25 mg syklofosfamidia/kg, jonka jälkeen annettiin suonensisäisellä infuusiolla 1,6 x 1011 TIL-solua (sisältäen 9,1 x 109 indium-111-leimalla leimat -10 tua TIL-solua) ja seitsemän annosta IL-2-proteiinia niin, että joka 8, tunti annettiin 720 000 IU/kg. Toinen hoito-kierros TIL-soluilla ja IL-2-proteiinilla annettiin kolme viikkoa myöhemmin. Radionuklidiskandeeraukset osoittivat TIL-solujen paikantumisen kasvainesiintymiin (kuvio 3A) . 15 Ihonalaisten kasvainten biopsiat vuorokausina 8 ja 11 hoidon jälkeen osoittivat merkittävän TIL-solujen paikantumisen kasvaimeen (injektoidun materiaalin määrän suhde kasvaimessa grammaa kohti verrattuna normaalikudoksen vastaavaan oli 14,9 ja 14,0, vastaavasti) . Potilaan syöpä reg-2 0 ressoitui nopeasti hoidon ensimmäisen kierroksen jälkeen. Kolme kuukautta hoidon jälkeen kaksi kolmesta maksavauriosta oli kadonnut ja kolmas vaurio pieneni 50 prosentilla. Useat ihonalaiset metastaasit regressoitulvat täysin, kuten on esitetty kuviossa 3B (yksittäisten vaurioiden koh-25 tisuoran halkaisijan mitta on esitetty) .
TIL1200-solujen in vitro toiminnan karakterisointi ^ Useat HLA-A2 + -me1anoomapotHaista muodostetut TIL- o linjat lyysasivat melanoomasolulinjoja luokan I MHC -rest- isl riktiotuneella tavalla [Kawakami, Y. et ai. (1992) J.
o ^ 30 Immunol. 148 : 638 - 643] ja niiden osoitettiin vapauttavan ^ IFN-gamma-proteiinia, kasvaimen nekroositekij ä-alfa-pro- x £ teiinia (TNF-a) tai granulosyytti-makrofagien pesäkekasvua g stimuloivaa tekijää (GM-CSF), kun viljeltiin yhdessä samo- § j en kasvainsolulinj oj en kanssa [Horn, S . S . et ai. (1993 ) J.
£ 35 Immunother. 13: 18 - 30] . CD8 + -CTL-linj a TIL1200 , j oka muo- c\j 87 dostettiin potilaan 1 200 metastasoivasta ihonalaisesta kasvainmassasta, lyysasi tuoreita autologisia melanoomaso-luja kuin myös kymmenen viidestätoista allogeenisestä HLA-A2+-melanoomasolulinjasta, mutta ei lyysannut kuuttatoista 5 HLA-A2_-melanoomasolulinjaa kahdeksastatoista linjasta tai kuutta HLA-A2+~solulinjaa kahdeksasta, jotka olivat muita kuin melanoomasolulinjoja [Shilyansky, J. et ai. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91: 2829 - 2833, julkaisemattomia tuloksia]. Taulukossa 7 esitetään sytotoksisuustesti 10 viittä edustavaa HLA-A2 + -melanoomasolulinjaa vastaan, jotka lyysautuivat TIL1200-soluilla, neljää edustavaa HLA-A2+-melanoomasolulinjaa vastaan, jotka eivät lyysautuneet TIL1200-solujen toimesta ja yhtä HLA-A2'-melanoomasolulin-jaa vastaan. TIL1200-solut erittivät myös IFN-gamma-prote-15 iinia, kun niitä viljeltiin yhdessä normaalien viljeltyjen HLA-A2 + ~melanosyyttien kanssa, jotka oli muodostettu vastasyntyneen esinahasta, kun myös silloin, kun niitä viljeltiin yhdessä HLA-A2 + -melanoomasolulinjojen kanssa (taulukko 8). Sen vuoksi TIL1200-solut tuntuivat tunnistavan ei-mu-20 tatoituneen oman peptidin, jota useimmat melanoomat ja viljellyt vastasyntyneen melanosyytit ekspressoivat HLA-A2-restriktoituneella tavalla.
T-solujen tunnistamaa melanooma-antigeeniä kooditta van cDNA-molekyylin kloonaus 25 HLA-A2 + -50Imel-melanoomasolulinjan, jonka useimmat HLA-A2-restriktoituneet melanoomaspesifiset TIL-solut lyy-sasivat, cDNA-kirj asto lambdapCEV27-vektorissa transfek~ ° toitiin stabiilisti erittäin transfektoituvaan HLA-A2+-me- i q lanooma-antigeeninegatiiviseen MDA231-klooniin 7 tai A375- i 30 klooniin 1-4. G418-resistentit solut valittiin j a noin x 6 700 yksittäistä transfektanttia kustakin solulinjasta “ eristettiin ja ne seulottiin perustuen niiden kykyyn sti-
LO
o muloida IFN-gamma-eritystä TIL1200-soluista. Kuusi DNA- fragmenttia eristettiin PCR-menetelmällä käyttäen SP6/T7-^ 35 alukkeita, jotka olivat integroituneen DNA-sekvenssin vie- 88 ressä, neljästä MDA231- ja yhdestä A375-transfektantista, jotka olivat positiivisia toisessa seulonnassa, ja ne kloonattiin nisäkäsekspressiovektoriin peDNA3 (Invitro-gen) .
5 Näitä pcDNA3-vektorissa olevia fragmentteja eks- pressoitiin lyhytaikaisesti C0S7-soluissa niin, että läsnä oli pcDNA3-HLA-A2.1 tai sitä ei ollut. Yhden testatun cDNA-molekyylin, CDNA25, transfektio C0S7-soluihin yhdessä HLA-A2.1-DNA-molekyylin kanssa tuotti toistettavasti kyvyn 10 stimuloida TIL1200-solujen IFN-gamma-eritystä. cDNA25-molekyylin stabiili transfektio A375-soluihin stimuloi myös IFN-gamma-vapautusta TIL1200-soluista (taulukko 9, kokeet 1 ja 2) . Melanooman Northern blot -analyysissä, jossa käytettiin cDNA2 5 -koetinta, havaittu 2,2 kb rintama antoi 15 ehdottaa, että kloonattu 1,6 kb fragmentti ei ollut täys-pitkä cDNA. Kolmen cDNA25-kloonin, jotka amplifioitiin toisistaan riippumattomasti PCR-menetelmällä, konsensus-DNA-sekvenssin vertailu GenBank-tietokantaan paljasti, että CDNA25 oli erilainen kuin kaksi aiemmin julkaistua 20 geeniä, gplOO (GenBank-koodinumero M77348) ja Pmell7 [Kwon, B.S. et ai. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 9228 - 9232]. cDNA25 erosi GenBank-tietokannassa olevasta gplOO-sekvenssistä (koodinumero M77348, tunnetaan myös nimellä gp95) kahden nukleotidin suhteen, Pmell7-sekvens-25 sistä [Kwon et ai. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 58: 9228 - 9232] kolmen emäksen ja 21 emäsparin deleetion suh-teen (kuvio 5B) .
δ
C\J
i n- o
CO
X
cc
CL
m o o m δ
(M
89
Taulukko 7 TIL1200-solujen antigeenin tunnistusspesifisyys: HLA-A2+, gpl00+ -melanoomasolujen lyysi
5 Kohde HLA-A2 crolOO TIL1200 LAK
FACS Northern (spesifinen lyysi-%) 50lmel + + + 46 78 10 526mel + + + 39 74 624mel + + + 33 76 952mel + + + 25 76
Malme3M + + + 43 70 C32 + -/+* 6 82 15 * RPMI7951 + - 9 67 WM115 + - 5 68 HS695T + 3 87 397mel + + 0 70 20 Viiden tunnin (h) 51Cr-vapautustesti suoritettiin solusyto-toksisuuden mittaamiseksi niin, että effektori:kohde-suhde oli 40:1, kuten aiemmin on kuvattu [Kawakami, Y. et ai. (1988) J. Exp. Med. 168: 2183 - 2191]. HLA-A2- ja gplOO-molekyylien, jotka tunnistaa monoklonaalinen vasta-aine 25 HMB45 (Enzo Diagnostics, New York, NY), ekspressio mitattiin virtaussytometrialla (FACS). gplOO-RNA-molekyylin c\i ^ ekspressio analysoitiin Northern blot -analyysissä käytta- ^ en cDNA25-koetinta.
r" * S5 ± osoittaa hyvin heikkoa positiivista, co
X
DC
CL
LO
O
O
LO
O
C\1 90
Taulukko 8 TIL1200-solujen antigeenin tunnistusspesifisyys: vastasyntyneen HLA-a-a2+-melanosyyttien tunnistus
Stimu- 5 laattori HLA-A2 TIL1200 TIL888 (pglFN-y/ml) SOlmel + 562 0 624mel 439 0 10 397mel - 00 888mel - 0 1970 NHEM493 - 441 0 NHEM527 + 418 0 NHEM530 + 164 0 15 NHEM616 + 53 0 FM725 + 107 0 FM801 + 250 343 NHEM483 - 0 0 NHEM6B0 - 0 0 20 HA002 - 0 0 TIL-solujen IFN-gamma-eritys mitattiin ELISA-menetelmällä, kuten aiemmin on kuvattu esimerkissä 1. TIL-kloonin yksinään erittämän IFN-gamma-proteiinin määrä (88 pg/ml TIL-25 888-soluilla ja ei mitään TIL1200-soluilla) vähennettiin.
TIL888-solut ovat luokan I MHC -proteiinin suhteen rest-c\j ^ riktoituneita melanoomaspesifisiä CTL-soluja, jotka eivät
^ ole restriktoituneet HLA-A2-proteiinin suhteen. NHEM, FM
t'- S5 ja HA viittaavat normaaleihin viljeltyihin me1anosyy11i-
CD
30 soluiinjoihin, kaikki muut ovat melanoomasolulinjoja.
X
cc
CL
LO
O
O
LO
δ C\l 91
Taulukko 9 cDNA25-molekyylin transfektio A375- ja COS7-soluihin
Eritys
Stimulaatio- Transfektoidut HLA-A2 tili200- _risolut_geenit _soluista 5 Koe 1 (pjtFNY/ml) 501mc! Ei mitään + 987 397mel Ei mitään - 0 A375 Ei mitään + 0 10 A375 pcDNA3-25 + 230
Koe 2 SOiroel Ei mitään + 662 397mel Ei mitään - 0 15 COS7 Ei mitään „ - 0 COS7 HLA-A2.1 + 0 COS7 pcDNA3-25 - 0 COS7 HLA-A2.1 +pcDNA3-25 + 310 20 Koe 3 SOlmel Ei mitään + 908 397mel Ei mitään * 0 COS7 Ei mitään · 0 COS7 HLA-A2.1 + 0 25 COS7 pCEV27-FL25 - 0 C\1 £ COS7 HLA-A2.1 +pCEV27-FL25 + 742
(M
COS7 . pcDNA3-Fl25 - 0 cp cd COS7 HLA-A2.1 +pcDNA3-FL25 + 801 >- 30 Ϊ TIL1200-solut erittivät IFN-gamma-proteiinia silloin, kun ^ niitä inkuboitiin yhdessä HLA-A2 + -A375-soluj en kanssa, jot- o ka oli stabiilisti transfektoitu pcDNA3-vektorilla, joka ^ sisälsi lyhentyneen cDNA25-molekyylin (pcDNA3-25)(koe 1), o oj 35 tai yhdessä C0S7-solujen kanssa, jotka oli lyhytaikaisesti 92 transfektoitu joko pcDNA3-25-molekyylillä (koe 2), pcDNA3-vektorilla, j oka sisälsi täyspitkän cDNA2 5-molekyylin (ocDNA3-FL25) tai pCEV27-vektorilla, joka sisälsi täyspitkän cDNA25-molekyylin (pCEV27-FL25)(koe 3) yhdessä pcDNA3-5 vektorilla, joka sisälsi HLA-A2.1-molekyylin (HLA-A2.1). HLA-A2-ekspressio määritettiin virtaussytometrialla ja interferoni-gamma-eritys määritettiin ELISA-menetelmällä.
Täyspitkä cDNA25 (FL25) eristettiin kahteen plas- midiin, pCEV27-FL25 tai pcDNA3-FL25. Jomman kumman plas-10 midin transfektio C0S7-soluihin yhdessä pcDNA3-HLA-A2.1-DNA-molekyylin kanssa antoi C0S7-soluille kyvyn indusoida TIL12 00-soluj en IFN-gamma-erityksen. Täyspitkällä cDNA-molekyylillä ja HLA-A2.1-DNA-molekyylillä transfektoitujen C0S7-solujen stimuloiman IFN-gamma-erityksen määrä oli 15 samanlainen kuin se, jonka 501mel-solut stimuloivat ja korkeampi kuin se, jonka lyhennetyllä CDNA25-molekyylillä transfektoidut C0S7-solut stimuloivat johtuen ehkä parantuneesta translaatiosta, joka alkoi normaalista AUG-aloi-tuskodonista (taulukko 9, kokeet 2 ja 3). Vaihtoehtoisesti 20 lyhennetystä cDNA25-molekyylistä puuttuva 5'-alue voi si sältää muita epitooppeja, jotka TIL120 0-kloonit tunnistivat . HLA-A2.1-ekspression vaatimus IFN - gamma - vapaut uks e 11 e TIL1200-soluista ja se tosiasia, että transfektoidut solut eivät stimuloineet IFN-gamma-eritystä asiaankuulumattomis-25 ta TIL-soluista (tuloksia ei esitetty) osoitti, että cDNA-25 kooditti antigeeniä, jonka TIL1200-solut tunnistivat cvj HLA-A2.1-molekyylin yhteydessä, eikä koodittanut molekyyli liä, joka epäspesifisesti indusoi IFN-gamma-vapautuksen T- ^ soluista.
i co 3 0 Lyhentyneen cDNA25-molekyylin j a täyspitkän cDNA25 - x molekyylin, jotka kloonattiin SOlmel-cDNA-kirj astosta seu- cc lomalla cDNA2 5 - koe tt imellä (kuvio 5A) , nukleotidi- j a vas- o taavia aminohapposekvenssejä verrattiin GenBank-tietokan- o !£ nassa oleviin Pmell7-sekvensseihin, jotka oli eristetty o 35 normaaleista melanosyyteistä, j a gplOO-sekvensseihin, jot- 93 ka oli eristetty melanoomasolulinjasta MEL-1 (kuvio 5B) . Täyspitkä cDNA25 erosi gpl00-aminohapposekvenssistä kohdalla 162. Tämä aminohappoero johtuu luultavasti polymorfiasta tai mutaatiosta kasvaimessa. cDNA25-molekyylillä 5 oli kahden aminohapon ero kohdissa 162 ja 274 verrattuna Pmell7-sekvenssiin eikä se sisältänyt niitä seitsemää aminohappoa, jotka sijaitsivat Pmel17-sekvenssissä kohdilla 588 - 594. Lyhentyneen cDNA25-molekyylin, joka eristettiin alkuperäisestä MDA231-transf ektantista, aminohapposekvens -10 sillä oli erilainen sekvenssi 3'-päässä (kohdasta 649 loppuun asti) johtuen lukuraamin muutoksesta, jonka aiheutti yksi ylimääräinen sytidyylihappo. Ei ole selvää, johtuuko tämä ero todellisesta alleelisesta erosta vai mutaatiosta, joka on tapahtunut DNA:n manipulaation aikana. Oli miten 15 oli, TIL1200-solut tuntuivat tunnistavan ei-mutatoituneet peptidit, jotka sijaitsevat kohtien 236 ja 648 välissä. cDNA25-sekvenssillä oli myös 87 % samankaltaisuus RPE1-cDNA-molekyylin aminohapposekvenssin kanssa [Kim, R. ja Wistow, G. J. (1992) Exp. Eye Res. 55: 657 - 662], jota 20 spesifisesti ekspressoidaan naudan verkkokalvon pigmentin epiteelissä, ja 60 % samankaltaisuus MMP115-cDNA-molekyylin kanssa, joka koodittaa melanosomin matriksiproteiinia, joka on eristetty kanan pigmentoituneista epiteelisoluista [Shilyansky, J. et ai. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 25 91: 2829 - 2833] .
Tiedettiin, että gpl00-proteiinin tunnistaa mono- klonaalinen vasta-aine HMB45 [Adema et ai. (1993) Am. J.
° Pathology 143: 1579 - 1585]. Täyspitkällä cDNA25-molekyy- o Iillä transfektoidut COS7-solut arvioitiin virtaussytomet- 30 rialla käyttäen tätä monoklonaalista vasta-ainetta. Kun x oli lyhytaikaisesti ekspressoitu joko pCEV27-FL25- tai pcDNA3 -FL25 -plasmidia, COS7-solut ekspressoivat antigee-ln g nia, jonka HMB45-vasta-aine tunnisti (tuloksia ei esitet- tn - ty) .
o c\j 94 cDNA25-RNA-molekyylin ekspressio
Northern blot -analyysi suoritettiin cDNA25-koet-timella tämän geenin kudosspesifisen ekspression arvioimiseksi. Kymmenen 15:stä melanoomasolulinjasta ja kuusi 5 kuudesta melanosyyttisolulinj asta olivat positiivisia CDNA25-molekyylin suhteen (kuviot 6A ja 6B). Monista testatuista normaalikudoksista ainoastaan verkkokalvo oli positiivinen (kuvio 6C) . Seitsemän solulinjaa T-soluista (TILA, B) , B-soluista (501EBVB, 836EBVB) ja fibroblasteis-10 ta (Ml) ja 20 muuta kasvainsolulinjaa kuin melaanomasolu-linjaa (paksusuolensyöpä, Collo, SW480, WiDr; rintasyöpä, MDA231, MCF7, HS578, ZR75; neuroblastooma, SK-N-AS, SK-N-SH; Ewingin sarkooma, TC75, RD-ES, 6647; sarkooma 143B; gliooma, U138MG, HS683; munuaissolusyöpä, UOK108, U0K117; 15 piensolukeuhkosyöpä, H1092; Burkittin lymfooma, Daudi; myelooma HMY) olivat kaikki negatiivisia cDNA25-molekyylin suhteen (tuloksia ei esitetty) . Sen vuoksi tämä geeni tuntui olevan spesifisesti ekspressoituneena melanosyyttilin-jan soluissa, joka on yhdenmukaista aiemmin eristettyjen 20 gpl00-proteiinin muotojen ekspression kanssa, kun niitä analysoitiin monoklonaalisillä vasta-aineilla HMB45, NKI/ betab tai HMB-50 [Adema, G.J. et ai. (1993) Am. J. Pathology 143 : 1579 - 1585; Gown, A.M. et ai. (1986) Am. J.
Pathol. 123: 195 - 203; Colombari, R. et ai. (1988) Virc-25 hows Archiv A Pathol Anat. 413: 17 - 24; Vennegoor, C. et ai. (1988) Am. J. Pathol. 130: 179 - 192; Vogel, A.M. ja c\j Esclamado, R.M. (1988) Cancer Res. 48: 1286 - 1294] . Vil- ° jellyissä vastasyntyneen melanosyyttisolulinjoissa cDNA25- ^ koettimella tunnistetun RNA-molekyylin ekspressiotaso oli co 30 merkittävästi alempi kuin melanoomasolulinjojen vastaava.
x Oli olemassa täydellinen korrelaatio Northern blot -ana- cr o- lyysillä havaitun gplOO-ekspression ja cDNA25-molekyylin o välillä sekä HMB45-vasta-ainella tehdyn virtaussytometrian o « j a TIL1200-solujen aiheuttaman melanoomalyysiksen välillä δ , c\j 95 kymmenessä HLA-A2 + -melanoomasolulinjassa, kuten on esitetty taulukossa 7.
gplOO-proteiinin epitoopin tunnistus
Perustuen lyhentyneen cDNA25-muodon aminohapposek-5 venssin vertailuun tunnettuihin HLA-A2.1-proteiinin sitou-tumismotiiveihin [Falk, K. et ai. (1992) Nature 351: 290 -296; Hunt, D.F. et ai. (1992) Science 255: 1261 - 12 63;
Ruppert, J. et ai. (1993) Cell 74: 929 - 9937], cDNA2 5 - molekyylistä syntetisoitiin 30 peptidiä, jotka olivat pi-10 tuudeltaan 9 tai 10 aminohappoa. TIL1200-solut lyysasivat HLA-A2 + - soluiinj an T2 ainoastaan silloin, kun sitä inkuboi-tiin peptidin LLDGTATLRL (sekvenssin SEQ ID -numero 27 jäännökset 457 - 486, kuvio 5A, SEQ ID -numero 33) kanssa, mutta ei silloin, kun inkuboitiin muiden 29 peptidin kans-15 sa (taulukko 10, kuvio 5A). Ainoastaan peptidi LLDGTATLRL (SEQ ID -numero 33) kykeni stimuloimaan myös IFN-gamma-eritystä TIL1200-solujen toimesta (tuloksia ei esitetty).
Monet melanoomaspesifiset CTL-solut, jotka ovat peräisin TIL-soluista, tuntuvat tunnistavan ei-mutatoitu-20 neet omat peptidit, jotka ovat peräisin melanosyytti-mela-noomalinjalle spesifisistä proteiineista, koska nämä TIL-solut tunnistavat useimmat melanoomasolulinjat ja normaalit vilj ellyt melanosyytit, joissa on sopiva restriktio-elementti [Anichini, A. et ai. (1993) J. Exp. Med. 177: 25 989 - 998; Kawakami, Y. et ai. (1993) J. Immunother. 14: 88 - 93] . Yritettäessä eristää j a tunnistaa sellaiset me- lanooma-antigeenit, jotka olisivat arvokkaita melanooma-o cm potilaiden immunoterapiassa, käytettiin TIL-soluj a o TIL1200, jotka siirrettyinä potilaaseen, jolla oli metas- 30 tasoiva syöpä, paikantuivat kasvaimen kohtaan ja assosioi-x tuivat dramaattiseen kasvaimen regressioon. On osoitettu, että päinvastoin kuin ei-aktivoidut lymfosyytit j a lymfo-
LO
g kiinin aktivoimat tappajasolut, autologiset TIL-solut pai- ^ kantuvat kasvainkohtiin. Tämä paikantuminen korreloi näi- 35 den TIL-solujen kykyyn välittää kasvaimen regressiota (tu- 96 loksia ei esitetty). TIL1200, joka oli useita CTL-lajeja sisältävä TIL-linja, tunnisti kasvainantigeenin HLA-A2-proteiinin yhteydessä, joka on useimmin ekspressoitu luokan I MHC -antigeeni (noin 50 % yksilöistä) ja jonka on 5 osoitettu olevan dominantti restriktioelementti melanoo-maspesifisten CTL-solujen induktiossa [Crowley, N.J. et ai. (1991) J. Immunol. 146: 1692 - 1699].
cDNA-ekspressiokloonauksella, jossa käytettiin T-solutunnistusta seulontaan, TIL12Q0-solujen tunnistamaa 10 antigeeniä, jonka on tunnistettu olevan yksi gplOO-muoto, joka on membraaniglykoproteiini, jonka tunnistavat myös monoklonaaliset vasta-aineet HMB45, HMB50 tai NKl/betab [Adema, G. J. et ai. (1993) Am. J. Pathology 143: 1579 - 1585; Gown, A. M. et ai. (1986) Am. J. Pathol. 123: 195 -15 203; Colombari, R. et ai. (1988) Virchows Archiv A Pathol
Anat. 413 : 17 - 24; _Vennegoor, C. et ai. (1988) Am. J.
Pathol. 130 : 179 - 192; Vogel, A.M. ja Esclamado, R.M.
(1988) Cancer Res. 48: 1286 - 1294] , koodittava cDNA on tunnistettu (kuviot 4A j a 4B; SEQ ID -numero 26) . Nämä 20 vasta-aineet ovat erittäin spesifisiä melanosyyttilinjan kudoksille ja värjäävät vahvasti useimmat melanoomasolut. NKl/betab reagoi myös aikuisen melanosyyttien kanssa normaalissa ihossa [Vennegoor, C. et ai. (1988) Am. J. Pathol. 130: 179 - 192]. Immunoelektronimikroskooppiset tut-25 kimukset, joissa käytettiin joko HMB45- tai NKI/beetab-vasta-ainetta paljastivat, että gplOO-proteiini sijaitsi
™ pääasiassa membraanilla ja sytoplasmassa vaiheen I ja II
o c\i melanosomien filamenttimatriksissa [Vennegoor, C. et ai.
0 (1988) Am. J. Pathol. 130: 179 - 192; Schaumburg-Lever, G.
30 et ai. 81991) J. Cutan. Pathol. 18: 432 - 435] . Täysin 1 riippumattomalla menetelmällä eristettiin myös toinen cDNA, joka kooditti toista gplOO-muotoa, seulomalla kanin m o polyklonaalisella gplOO-antiseerumilla [Adema, G.J. et ai.
(1993) Am. J. Pathology 143: 1579 - 1585], ja TIL1200-SO-£3 35 lut lyysasivat HLA-A2+-soluiinjat, jotka oli transfektoitu 97 tällä cDNA-klooni 11a [Bakker, A.B.H. et ai. (1994) J. Exp, Med. 179: 1005 - 1009].
Taulukko 10 5 HLA-A2+-T2-soluiinjän, jota oli käsitelty peptidillä LLDGTATLRL kanssa, lyysl T1L1200-soluilla
Kohde HLA-A2 Peptidi TIL1200 TIL1235 + 4· 4< (ug/ml) (spesifinen lyysi-%) 10 501mel + 0 66 51 397mel 0 10 T2 + 0 2 1 T2 + 40 28 ND+ + T2 + 10 32 0
15 T2 + 1 24 ND
T2 + 0,1 6 ND
T2 + 0,01 0 ND
T2 + 0,001 2 ND
20 TlL1200-solut lyysasivat T2-solut, joita oli lyhytaikaisesti käsitelty 10-mer-peptidillä LLDGTATLRL (457 - 466), mutta ei silloin, kun niitä oli käsitelty muilla 29 peptidillä sekvenssistä SEQ ID -numero 27 (jäännökset 273 - 281, 297 - 306, 373 - 381, 399 - 407, 399 - 408, 409 - 25 418, 456 - 464, 463 - 471, 465 - 473, 476 - 485, 511 - 520, 519 - 528, 544 - 552, 544 - 553, 570 - 579, 576 -
CM
5 584, 576 - 585, 585 - 593, 592 - 600, 597 - 605, 597 -
CM
^ 606, 602 - 610, 602 - 611, 603 - 611, 605 - 614, 606 - ° 614, 606 - 615, 619 - 627, 629 - 638) co 30 + TIL1235-solut ovat HLA-A2-restriktoituneita melanoomaspe- £ sifisiä CTL-soluja, jotka eivät tunnista gpl00-proteiinia.
LO ** E : T on 50:1.
o g ++ ND, ei tehty.
^ Sellaisten T-solujen, jotka reagoivat gplOO-oma- ^ 35 antigeenin kanssa, läsnäolo kasvaimissa ja näiden T-solu- 98 jen mahdollinen rikastuminen kasvaimen kohtaan spesifisen akkumulaation ja antigeenireaktiivisten solujen lisääntymisen mahdollisena seurauksena [Sensi, M. et ai. (1993) J. Exp. Med. 178: 1231 - 1246] nostaa esiin tärkeän kysymyk-5 sen oma-antigeeneja vastaan tapahtuvan immuunivasteen luonteesta kasvavissa syövissä ja immunologisen toleranssin mekanismeista oma-antigeenejä vastaan. gplOO-proteii-nin kohonnut ekspressio melanoomasoluissa verrattuna mela-nosyyttien vastaavaan, joka osoitettiin Northern blot 10 -analyysillä, tai ne uniikit tulehdusolosuhteet, jotka voivat olla läsnä kasvaimen kohdassa, jotka voivat liittyä sytokiinien eritykseen ja kostimulatoristen molekyylien ekspressioon solun pinnalle, voivat murtaa toleranssin gplOO-proteiinia vastaan. Depigmentaation on julkaistu 15 liittyvän hyvään ennusteeseen [Nordlund, J.J. et ai.
(1983) J. Am. Acad. Dermatol. 9: 689 - 695; Bystryn, J-C. et ai. (1987) Arch. Dermatol. 123: 1053 - 1055] ja kliiniseen kemoimmunoterapian vasteeseen [Richards, J.M. et ai. (1992) J. Clin. Oncol. 10: 1338 - 1343] melanoomapo- 20 tilailla. Sporadista valkopälveä on havaittu potilailla, jotka ovat saaneet melanoomaspesifisiä TIL-soluja, mutta haitallisia silmävaikutuksia, jotka voivat liittyä mela-nosyyttien tuhoon, ei ole havaittu. Potilaalle 1 200 ei kehittynyt valkopälveä tai mitään silmäsivuvaikutuksia.
25 gpl0 0-proteiini (kuvio 5A; SEQ ID -numero 27) ja tunnistettu 10 aminohapon pituinen peptidi voivat edustaa c\j ihmisen kasvaimen hyi j intäantigeenia, koska TIL1200-solu- ° jen ja IL-2-proteiinin siirto potilaaseen 1 200 liittyi ^ syövän regressioon. TIL1200-solujen kulkeutuminen kasvain- i co 30 esiintymiin in vivo ja kasvaimen vastaisen vaikutuksen x nopeus ovat luonteenomaisia TIL-soluterapiavasteelle,
CC
vaikka IL-2-proteiini on myös voinut ottaa osaa kasvaimen o hyljintään. Kolmen muun TIL-linjan, jotka tunnistivat o !£ gplOO-proteiinin kuin myös MART-1-proteiinin, adoptiivinen δ
C\J
99 siirto välitti myös kasvaimen regression (tuloksia ei esi- tetty).
Tyrosinaasi [Brichard, V. et ai. (1993) J. Exp. Med. 178: 489 - 495] ja MART-1-proteiini (katso esimerkki 5 1) on tunnistettu melanooma-antigeeneiksi, jotka HLA-A2- restriktoituneet CTL-solut tunnistavat. Toinen antigeeni, MAGE-1, tunnistetaan HLA-Al-restriktoituneiden melanooma-spesifisten CTL-solujen toimesta ja se ekspressoituu erilaisissa syöpäsoluissa kuin myös kiveksissä [Van Der 10 Bruggen, P. et ai. (1991) Science 254: 1643 - 1647]. Kuitenkaan, yksikään juuri kehitetystä kymmenestä HLA-A2-restriktoituneesta TIL-linj asta ei tuntunut tunnistavan MAGE-1-proteiinia [Zakut, R. et ai. (1993) Cancer Res. 53: 5 - 8] .
15 gplOO-proteiinien laaja ekspressio melanoomissa, peptidin tunnistus kasvaimeen tunkeutuvien T-solujen toimesta, sen restriktio HLA-A2-proteiinin toimesta, jota on läsnä 50 prosentilla yksilöitä, ja gplOO-proteiinin vastaisen reaktiivisuuden liittyminen syövän regressioon po- 20 tilaalla 1200 vihjaavat, että gplOO-antigeeni, erikoisesti uudet immunogeeniset peptidit, jotka ovat peräisin gplOO-aminohapposekvenssistä (kuvio 5A; SEQ ID -numero 27), voivat olla erikoisen käyttökelpoisia kehitettäessä aktiiviset immunoterapiat melanoomapotilaille.
25 Esimerkki 4
Useiden kasvainten in vivo regressioon liittyvien £! TIL-solujen tunnistamien ihmisen melanooma-antigeenin epi- o c\j tooppien tunnistus i o Materiaalit ja menetelmät i 30 CTL-solujen muodostus TIL-soluista ja metastasoivaa x melanoomaa sairastavien potilaiden hoito
Melanoomaspesifiset CTL-solut indusoitiin ja kas-
LO
0 vatettnn TIL-soluista alustassa, joka sisälsi 6 000 IU
1 IL-2-proteiinia/ml, kuten on aiemmin kuvattu [Kawakami et ° 35 ai. (1988) J. Exp. Med. 168: 2183] . Kaikkia saatavissa 100 olevia HLA-A2-restriktoituneita melanoomaspesifisiä CTL-soluja, jotka annettiin autologisille potilaille Surgery Branch -laitoksessa, NCI, käytettiin tässä tutkimuksessa. TIL-solut annettiin suonensisäisesti yhdessä IL-2-prote-5 iinin kanssa autologisille potilaille, joilla oli metas-tasoiva melanooma, kuten aiemmin oli julkaistu [Rosenberg, S.A. et ai. (1988) N. Engl. J. Med. 319: 1676; Rosenberg, S.A. et ai. (1994) J. NCI 86: 1159] . Fisherin eksaktia nelikenttätestiä käytettiin määrittämään gpl00-proteiinin 10 TIL-solujen aiheuttaman tunnistuksen assosiaatio kliiniseen vasteeseen TIL-hoidolle; samalla tavalla tehtiin MART-1-tunnistuksen suhteen.
Peptidien synteesi
Peptidit syntetisoitiin kiinteätaasimenetelmällä 15 käyttäen peptidisyntetisaattoria (malli AMS 422; Gilson Co. Inc., Worthington, OH) (> 90 % puhtaus) . Syntetisoitavat peptidit valittiin julkaistusta ihmisen gplOO-sekvenssistä perustuen HLA-A2.1-sitoutumismotiiveihin [Falk, K. (1991) Nature 351 : 2 90; Hunt, D.F. et ai. (1992) Science 20 255: 12 61; Ruppert, J. et ai. (1993) Cell 74: 92 9; Kubo, R.T. et ai. (1994) J. Immunol. 152: 3913]. Seuraavat peptidit testattiin: kahdeksan 8-mer-peptidiä (jäännösten alkaessa kohdista -199, 212, 218, 237, 266, 267, 268, 269; katso kuvio 7A), 84 9-mer-peptidiä, joiden jäännökset al-25 koivat kohdista -2, 4, 11, 18, 154, 162, 169, 171, 178, 199, 205, 209, 216, 241, 248, 250, 255, 262, 266, 267, ™ 268, 273, 278, 280, 273, 286, 287, 298, 290, 309, 316, ^ 332, 335, 350, 354, 358, 361, 371, 373, 384, 389, 397, o 399, 400, 402, 407, 408, 420, 423, 425, 446, 449, 450, 30 456, 463, 465, 485, 488, 501, 512, 536, 544, 563, 570, x 571, 576, 577, 578, 583, 585, 590, 592, 595, 598, 599, 601, 602, 603, 604, 606, 607, 613, 619, 648; katso kuvio
ID
§ 7A) ja 77 10-mer-peptidiä, joiden jäännökset alkoivat köhii dilta -9, 17, 57, 87, 96, 154, 161, 169, 177, 197, 199, oj 35 200, 208, 216, 224, 232, 240, 243, 250, 266, 267, 268, 101 272, 285, 287, 289, 297, 318, 323, 331, 342, 350, 355, 357, 365, 380, 383, 388, 391, 395, 399, 400, 406, 407, 409, 415, 432, 449, 453, 457, 462, 476, 484, 489, 492, 511, 519, 536, 543, 544, 548, 568, 570, 571, 576, 577, 5 5 84, 590, 595, 598, 599, 601, 6 02, 603, 605, 611, 62 9; katso kuvio 7A) syntetisoitiin. Ensimmäisessä seulonnassa mahdollisesti tunnistetut epitoopit puhdistettiin edelleen HPLC-kromatografiällä C-4-pylväässä (VYDAC, Hesperia, CA) (> 98 % puhtaus) ja peptidien molekyylipainot varmis-10 tettiin massaspektrometriamittauksilla, kuten aiemmin on kuvattu (esimerkki 3; Kawakami, Y. et ai. (1994) J. Exp. Med. 18 0; 34 7; Kawakami, Y. et ai. (199 4) P ir o c * Natl.
Acad. Sei. USA 91: 6458].
Peptidin sitoutumistesti HLA-A2.1-proteiiniin 15 Liukoista HLA-A2.1-raskasketjua, ihmisen beeta-2- mikroglobuliinia, radioaktiiviseksi leimattua peptidiä HBCi8_27 (FLPSDYFPSV) ja eri konsentraatioita näytepeptidiä inkuboitiin yhtäaikaa proteaasi-inhibiittorien läsnä ollessa kaksi vuorokautta huoneenlämpötilassa, kuten aiemmin 20 on kuvattu [Ruppert, J. et ai. (1993) Cell 74: 929; Kubo, R.T. et ai. (1994) J. Immunol. 152: 3913; Sett, A. et ai.
(1994) Molecular Immunol. 31: 813] . HLA-A2.1-proteiiniin sitoutuneen leimatun peptidin prosenttimäärä laskettiin sen j älkeen, kun oli erotettu geelisuodatuksella, j a las-25 kettiin se näytepeptidin konsentraatio, joka tarvittiin aiheuttamaan leimatun peptidin sitoutumisen 50 % inhibi- tio. Peptidien suhteellinen affiniteetti HLA-A2.1-protect ^ Unille laskettiin myös suhteena (se konsentraatio o HBCis_27-standardipeptidiä, joka tarvittiin inhiboimaan 50- $£ 30 prosenttisesti leimatun peptidin sitoutuminen/se näytepe- x ptidin konsentraatio, joka tarvittiin inhiboimaan 50-pro- Q_ senttisesti leimatun peptidin sitoutuminen), kuten aiemmin
LO
§ on kuvattu [Sett, A. et ai. (1994) Molecular Immunol. 31:
LO
>- 813] . Peptidin sitoutuminen määriteltiin korkeaksi (50 % ° 35 inhibitio konsentraatiossa < 50 nM, suhde > 0,1), keski- 102 tasoiseksi (50 - 500 nM, suhde 0,1 - 0,01) tai heikoksi (> 500 nM, suhde < 0,01) [Ruppert, J. et ai. (1993) Cell 74: 929; Kubo, R.T. et ai. (1994) J. Immunol. 152: 3913; Sett, A. et ai. (1994) Molecular Immunol. 31: 813].
5 Täyspitkän gplOO-cDNA-molekyylin sisältävä pcDNA3- plasmidi (esimerkki 3; Kawakami, Y. et ai. (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91: 6458] digestoitiin XhoI- ja Xbal-entsyymeillä. Alfafosforotioaattideoksinukleosiditrifos-faatin inkorporaation jälkeen Xbal-kohtaan suoritettiin 10 standardi eksonukleaasi III -sisäkkäisdeleetiosarja käyttäen Exo Size Deletion Kit -käyttöpakkausta (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA). Deletoituneet kloonit ligoi-tiin itsensä kanssa ja amplifoltiin. Kunkin kloonin tarkka deleetio varmistettiin DNA-sekvenssoinnilla. Epitoopit 15 sisältävän alueen tunnistamiseksi pcDNA3-plasmidit (Invit-rogen, San Diego, CA) , jotka sisälsivät cDNA-fragmentit (D3, D5, D4, C3), jotka oli muodostettu deleetiosarjalla eksonukleaasi 11a täyspitkän gplOO-cDNA-molekyylin 3 ' -päästä kuin myös lyhennetystä gplOO-cDNA-molekyylistä, josta 20 puuttui koodittava 5'-alue (25TR)[esimerkki 63; Kawakami, Y. (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91: 6458], transfek- toitiin COS7-soluihin yhdessä HLA-A2.1-cDNA-molekyylin kanssa ja transfektoituneiden COS-solujen tunnistus TIL-solujen toimesta arvioitiin käyttäen IFN-gamma-vapautus-25 testej ä (esimerkki 1; Kawakami, Y. (1994) Proc. Natl.
Acad. Sei. USA 91 : 3515] .
c\j T-solujen antigeeni tunnistuksen arviointi ° T-soluj en antigeenitunnistuksen määrittämiseksi ^ suoritettiin 51Cr- tai IFN-gamma-vapautustestit, kuten i co 3 0 aiemmin on kuvattu (esimerkki 1 j a 2; Kawakami, Y. et ai.
x (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91: 3 515; Kawakami, Y.
et ai. (1988) J. Exp. Med. 168 : 2183] . Joko C0S7-soluja, o jotka oli transfektoitu melanooma-antigeeneja koodittaval- o !£ la cDNA-molekyylillä j a HLA-A2.1-cDNA-molekyylillä, tai , o 35 T2-soluj a, joita esi-inkuboitiin peptidien kanssa, käytet- 103 tiin stimulaattoreina IFN-gamma-vapautustestissä. Peptideillä käsiteltyjä T2-soluja käytettiin myös kohteina sy-totoksisuustesteissä [Kawakami, Y. (1994) J. Exp. Med. 180: 347].
5 gplOO-proteiinin tunnistus TIL-solujen toimesta korreloi TIL-hoidon kliinisen vasteen kanssa
Neljä 14:stä HLA-A2-restriktoituneesta melanooma-spesifisestä CTL-linjasta, jotka olivat peräisin TIL-so-luista, tunnisti gplOO-proteiinin, kun taas 13 tunnisti 10 MART-1-proteiinin (kolme tunnisti sekä gplOO- että MART-1-proteiinin). Yksikään ei tunnistanut tyrosinaasia tai gp75-proteiinia, joka määritettiin TIL-solujen reaktiivisuutena sellaisia COS7-soluja kohtaan, jotka oli transfek-toitu cDNA-molekyy1i11ä, joka kooditti näitä melanooma-15 antigeenejä, yhdessä HLA-A2.1-cDNA-molekyylin kanssa [esimerkki 2; Kawakami, Y. et ai. (1994) J. Exp. Med. 180: 347]. Näiden neljän gplOO-proteiinin kanssa reagoivan CTL-linj an HLA-A2-restriktio- ja -tunnistusspesifisyys on osoitettu aiemmin [esimerkit 1 -3; Kawakami, Y. et ai. 20 (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91: 6458,- Kawakami, Y.
et ai. (1992) J. Immunol. 148: 63 8; O'Neil, B.H. et ai.
(1993) J. Immunol. 1410: 1418; Shilyansky, J. et ai.
(1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91: 2829] . Kymmenen näistä 14:stä CTL-linjasta annettiin autologisille poti- 25 laille yhdessä IL-2-proteiinin kanssa. Kuten taulukon 11 yhteenveto esittää, kaikkien neljän potilaan, joita oli ^ käsitelty sellaisilla CTL-soluilla, jotka kykenivät tun- oj nistamaan gplOO-proteiinin, hoito johti objektiiviseen o osittaiseen vasteeseen (> 50 % kasvaimen regressio). TIL- co 30 hoidon kliininen vaste liittyi TIL-solujen reaktiivisuu- x teen gplOO-proteiinille (p = 0,0048), mutta ei MART-l-pro- teiinille (p = 0,4). Nämä tulokset antoivat ehdottaa, että o gplOO-proteiini voi sisältää epitoopit, jotka kykenevät ί välittämään kasvaimen in vivo regression.
δ c\j 104
Niiden TIL-solujen, jotka ovat reaktiivisia gplOO-prote-iinille, epitooppien tunnistus
Niiden epitooppien tunnistamiseksi, jotka nämä neljä gplOO-reaktiivista CTL-linjaa tunnistivat, syntetisoi-5 tiin 169 peptidiä, jotka sisälsivät HLA-A2.1-sitoutumismo-tiivit. Peptiditunnistus arvioitiin testaamalla näiden CTL-solujen reaktiivisuus HLA-A2.1 + -T2-soluja vastaan, joita oli esi-inkuboitu kunkin peptidin kanssa, käyttäen sekä sytotoksisuus- että IFN-gamma-vapautustestejä. Kuten tau-10 lukossa 12 on esitetty, gplOO-reaktiiviset TIL-solut tunnistivat seitsemän peptidiä sytotoksisuustesteissä. Samalla aikaa suoritettujen IFN-gamma-vapautustestien tulokset olivat yhdenmukaisia sytotoksisuustestien tulosten kanssa. Erilaiset TIL620-solujen jatkoviljelmät (620-1, 620-2) tai 15 TIL660-solujen jatkoviljelmät (660-1, 660-2, 660-3) kasvatettiin TIL-viljelmästä, joka annettiin autologiselle potilaalle, mutta ne viljeltiin erikseen ja niiden spesifisyydet olivat hiukan erilaisia johtuen todennäköisesti eri kloonien in vitro kasvusta. Peptidit G9209 (ITDQVPFSV)(SEQ 20 ID -numero 48) ja G10208 (TITDQVPFSVj (SEQ ID -numero 49) , jossa on ylimääräinen treoniini peptidin G9209 N-päässä, tunnistettiin ainoastaan TIL620-solujen toimesta. Peptidit G9i54 (KTWGQYWQV) (SEQ ID -numero 46) ja G10154 (KTWGQYWQVL) (SEQ ID -numero 47) , jossa on ylimääräinen 25 leusiini peptidin G9154 C-päässä, tunnistettiin TIL1200-, TIL620-2- ja TIL660-2-solujen toimesta. Peptidin G10-4 cvj (LLDGTATLRL) (SEQ ID -numero 33) tunnistivat TIL1200-solut, oj kuten on osoitettu (esimerkki 3) . Peptidin G9280 (YLEPGPVTA)(SEQ ID -numero 40) tunnistivat TIL660- ja co 30 TIL1143-solut. TIL660-3-solut tunnistivat myös peptidin x G10-5 (VLYRYGSFSV) (SEQ ID -numero 34) kuin myös peptidin cr “ G928q· Sellaisten T2-solujen lyysi, joita oli esi-inkuboitu o peptidin G10-5 kanssa, oli toistuvasti alhainen johtuen
O
!£ ehkä siitä, että pieni T-solukloonien alaryhmä oli spesi- ^ 35 finen tälle epitoopille.
105
Epitooppitunnistuksen täydentämiseksi käyttäen tunnettuja HLA-A2.1-sitoutumismotiiveja, käytettiin myös toista menetelmää sellaisten alueiden tunnistamiseksi, jotka ehkä sisälsivät epitoopit. Viisi gplOO-cDNA-frag-5 menttia, jöistä neljä muodostettiin eksonukleaasideleeti-olla cDNA-molekyylin 3' -päästä (D3, D4, D5, C4) , kuin myös osittainen cDNA-klooni, j osta puuttui ensimmäiset 705 emäsparia koodittavalta 5'-alueelta (25TR), insertoitiin pcDNA3-plasmidiin ja transfektoitiin COS7-soluihin yhdessä 10 HLA-A2.1-cDNA-molekyylin kanssa. Fragmenttien sijainnit on esitetty kuviossa 7A. Näiden transfektanttien tunnistus neljän gplOO-reaktiivisen TIL-linjan toimesta arvioitiin käyttäen IFN-gamma-vapautustestiä (kuvio 7B). TIL12Q0-SO-lut tunnistivat COS-solut, jotka oli transfektoitu 25TR-, 15 D5-, D4- tai C4-fragmenteilla, mutta ei D3-fragmentilla transfektoituja, joka antoi ehdottaa, että ainakin kaksi epitooppia oli läsnä aminohappojäännösten 146 - 163 ja 236 - 661 alueilla. Peptidit G9154 ja G10154 olivat ainoat peptidit, jotka sisälsivät HLA-A2.1-sitoutumismotiivit 20 alueella 146 - 163, ja TIL1200-solut tunnistivat ne molemmat . Peptidi G10-4 sij aitsi alueella 236 - 661 j a sen tunnistivat TIL1200-solut. TIL620-1-solut tunnistivat COS- solut, jotka oli transfektoitu C4-fragmenti11a, mutta ei D3-, D5-, D4- tai 25TR-fragmentilla transfektoituja, joka 25 antoi ehdottaa, että epitooppi oli läsnä jäännöksissä 187 - 270. TIL620-l-solujen tunnistamat peptidit G9209 j a ^ G10208 sijaitsivat tällä alueella. TIL620-2, joka oli o ^ TIL62 0- solu]en toinen jatkoviljelmä, tunnisti myös sellai- o set COS-solut, jotka oli transfektoitu D5- ja D4-fragmen- 30 teillä, mutta ei D3-f ragment i11a transfektoituj a, j a tun- x nisti peptidit G9154 ja G10154 alueella 147 - 163, jotka myös TIL1200-solut tunnistivat. TIL660-1- ja TIL1143-solut m § tunnistivat sellaiset COS-solut, jotka oli transfektoitu
LO
>- C4 - tai 2 5TR-fragment il la, mutta ei D3 - , D5- tai D4-frag- ° 35 mentilla transfektoituja, joka antoi ehdottaa, että epi- 106 toopit olivat läsnä kahdella alueella, 187 - 270 ja 236 -661. Peptidi G9280> joka sijaitsi fragmentissa 25TR, mutta ei fragmentissa C4, tunnistettiin TIL660- ja TIL1143-solujen toimesta.
5 Melanoomaepitooppien sitoutumisaffiniteetti HLA- A2.1-proteiiniin in vitro
Lukuunottamatta peptidiä G10-4, jota tarvittiin konsentraatio 1 μ^/ταί herkistämään T2-solut CTL-lyysiksel-le [esimerkki 3; Kawakami, Y. et ai. (1994) Proc. Natl. 10 Acad. Sei. USA 91: 6458], kaikki tässä tutkimuksessa tunnistetut gplOO-epitoopit kykenivät herkistämään T2-solut CTL-lyysille konsentraatiossa 1 ng/ml (kuviot 8A - 8D).
Peptidi G10-5 ilmeni olevan inhibitorinen CTL-solujen sy-totoksiselle aktiivisuudelle konsentraatiossa, joka oli 15 suurempi kuin 10 ng/ml, koska T2-soluj en, joita inkuboi-tiin peptidin G10-5 kanssa suuremmassa konsentraatiossa kuin 10 ng/ml, lyysi oli toistuvasti alempi kuin konsentraatiossa 1-10 ng/ml tässä testiolosuhteessa, jossa peptidi oli läsnä alustassa koko 4 tunnin sytotoksisuustestin 20 ajan (kuvio 8D) . Näiden epitooppien suhteellinen sitoutumisaf f ini teet ti HLA-A2.1-proteiiniin mitattiin myös käyttäen kompetetiivista in vitro sitoutumistestiä (taulukko 13). Peptidillä G9154 oli korkeampi sitoutumisaffiniteetti (standardipeptidin 50 % inhibitio konsentraatiossa 11 nM) 25 HLA-A2.1-molekyyliin kuin peptidillä G10154 (1010 nM) , joka sisältää ylimääräisen leusiinin peptidin G9154 C-päässä, ja ^ se pystyi herkistämään T2-solut alemmissa konsentraatiois- o ^ sa kuin peptidi G10154 (kuvio 8A) . Peptidi G9209 sitoutui o myös HLA-A2.1-proteiiniin korke amma11a affiniteetilla $£ 30 (84 nM) kuin peptidi G10208 (2080 nM) , joka sisältää yli- x määräisen treoniinin N-päässä, ja voi herkistää T2-solut
CL
alemmissa peptidin konsentraatloissa kuin peptidi G10208 § (kuvio 8B). Näin ollen 9-mer-peptidit olivat ylivoimaisia
LO
>- vastaaviin 10-mer-peptideihm verrattuna T2-soluj en her- ^ 35 kistämisessä CTL-lyysille, ja niillä oli myös korkeammat 107 sitoutumisaffiniteetit HLA-A2.1-proteiiniin. Näin oli myös tunnistettujen MART-1-proteiinin 9 ja 10 aminohapon peptidien tapauksessa (M9-2, M10-3, M10-4) [esimerkki 2;
Kawakami, Y. et ai. (1994) J. Exp. Med. 180: 347]. T2-lyy-5 sitestin peptidititraustulokset korreloivat HLA-A2.1-sitoutumisaf f initeetti tuloksi in mitattuna in vitro sitoutumistestillä. Muilla gplOO-epitoopeilla, G9280, G10-4 tai G10-5, oli sellaiset sitoutumisaffiniteetit HLA-A2.1-proteiinille , että 50 % inhibitioarvot olivat konsentraati-10 oissa 95 nM, 483 nM tai 13 nM, vastaavasti. Aiemmin tunnistettujen HLA-A2.1-restriktoituneiden MART-1-proteiinin melanoomaepitooppien [esimerkki 2; Kawakami, Y. et ai. (1994) J. Exp. Med. 180: 347] ja tyrosinaasin [Wolfel, T.
(1994) Eur. J. Immunol. 24: 75 9; SEQ ID -numero 31 j a 32] 15 HLA-A2.1-sitoutumisaffiniteetit mitattiin myös [M9-2 (397 nM) , M10-3 (2272 nM) , M10-4 (5555 nM) , Ί91 (333 nM) , T9369 (40 nM) ] . Lukuunottamatta 10-mer-peptidejä (G10154, G10208, M10-3, M10-4), joille oli olemassa päällekkäin menevät 9-mer-epitoopit (G9154, G9209, M9-2), kaikki me1anoo-20 maepitoopit sisälsivät joko korkean (G9154, G10-5, T9369) tai keskivahvan (G9209/ G9280, G10-4, M9-2, T9-JJ sitoutumisaf f initeetin HLA-A2.1-proteiiniin.
Keskustelua Tässä tutkimuksessa on tunnistettu useita epitoop-25 peja ihmisen melanooma-antigeenissa gplOO, jotka tunnistettiin neljän TIL-linjan toimesta, jotka liittyivät kas- £! vaimen regressioon, kun ne siirrettiin adoptiivisesti au- o c\i tologisnn potilaisiin. Tässä tutkimuksessa kuvattujen o viiden epitoopin joukossa G9154- tai G10154-epitoopit tunto 30 tuivat olevan yleisimmin tunnistettuja, koska kolme nelin jästä gplOO-reaktiivisesta TIL-linjasta, jotka olivat pe- räisin eri potilaista, tunnisti nämä. Vaikka peptidin G9280
LO
o julkaistiin olevan tunnistettu kaikkien viiden CTL-lmian o -1 toimesta, jotka olivat peräisin eri potilaiden PBL-soluis-^ 35 ta [Cox, A.L. et ai. (1994) Science 264: 716], sen tunnis- 108 ti ainoastaan kaksi neljästä gplOO-reaktiivisesta TIL-lin-jasta tässä tutkimuksessa. Tämä ero voi johtua käytettyjen T-solujen lähteestä (TIL-solut vastaan PBL-solut).
On ymmärrettävä, että MART-l-peptidi M9-2 voidaan 5 nimetä myös peptidiksi M927, MART-1-peptidi M10-3 voidaan nimetä myös peptidiksi M1026 ja MART-1-peptidi M10-4 voidaan nimetä myös peptidiksi M1027- On myös ymmärrettävä, että gplOO-peptidi G10-4 voidaan myös nimetä peptidiksi G10457 ja gplOO-peptidi G10-5 voidaan myös nimetä peptidik-10 sx G10476.
c\j δ c\j i 1^ o
CD
X
cc
CL
LO
O
O
LO
O
C\l 109
M
m g ♦ Sg ' * -1 -H i 1
pj — ti O H
a> m tn β rö -π n * sJÖ P Λ H m Z * '»ttigÖ 0 t* ti -H tt)
« „ 4-1 -H
1 C -H (d M
β _ V X u o , H . * + 0\ t i 'MW pj
B iC Jp H 0) -H D) O
^ 3 s - ό e > -h g ti ^ -h -h y S ' 0 4-) "H -H Λ 5 ti n a O pj o -h “ m ·' <u H ft Λ! | •H fnsg * ·♦ «rv * * Q* 5^ O g
M-ι wl * i "ö ö S
-h 2 — a Ö <ö « en *? O g b 4) ~ N- M ti J -H 03 ft « rrt :(d iS ti a M 03 · ^ S !(β d > *
1 H s · *1 B S Ϊ -31S
§ a « g 3 g- | 5 g ' *£ * ’ ? g a r “ s §5 H S ϊ •s « ~ % ά s x * « 2 * *1 *a - * 5 “ ϊ 1 § 3 a S · £ 3 ä s a ' ^ i* - „ „ ti ö 0) 3 O «> 0 -1*? 2 8* (fl ti -H 1/1 -
£ S g · Äs * £ ' * i 5 > 5 * I
U ti S2« - g -h ti -h a) - ti -ti E d (U h pj —'
in w ·Η — "ΐ rt i ti <u ti M nJ
<u a) o p< *5 · ^ 9 in ω nj ω
Mg M βί ft * ,¾ * a · · S ti -H g J> W
1¾ m & O »m O X ^ . (h " S
MP O 2 —' — '"ti -H 'dg «s ti ti σ' -H -H M s e 1 01 »H ®™® * ti rH ti* cl ti
1¾ -H ft .. + 9 'H J! I -H M
I g s « «s · «o » * · s ϊ „ s 5 a
ί o? a “ .h ss gitiä^S-S
ti -H pj M o id m -H
o <u ti ia» I "ft s oJ n o _ . rM > 0) -HO) ,_1 ·Η — I o -H -n
ftj a ti <U pj <» bO o . ffl-H o o ft ^ *H
-i- ti ra tn ·Γ+κ ti -h 5 h PS m ho v id h ra
O H 0) -rl -H ti tn ti “ K N B — H M S -H
c\j ti ti ti h <u cd ti a s ,-^2 ft m ft ft ra m , w d f> -¾ m X Hti tn O bi "" ti * λ: o
CD
X
X
X
m o o m δ c\j 110
Taulukko 12 gplOO-peptidien tunnistus TIL-solujen toimesta
Kohde- Peptidi TIL
5 solut (spesifinen lyysi-%, kun E:T = 40:1) ΊΖΠ " “ 620 -TT2cT~ 6 6.0' -1 ΤΪΙΙΓΙΪΙΙΙΙΙΐΐΙΙ £24mel Ei mitään 32 36 47 20 77 11 397mel Ei mitään 2 3 0 0 0 0 T2 Ei mitään 0 5 3 1 0 2 T2 M9-2 19 84 68 49 1 66 10 T2 G91J4 0 21 4 0 100 0 T2 G10lJ4 3 19 7 4 75 2 T2 G9JW 45 21 0 3 0 0 T2 GIOjoi 42 36 7 4 2 3 T2 G9„0 2 7 43 11 0 0 T2 G10-4 0 7 6 0 15 0 T2 G10-5 2 7 2 1 7 '0 15 Koe 2 620-1 620-2 660-2 1113-\2Q0 U25.
624mel Ei mitään 60 65 74 49 82 18 337mei Ei mitään 2 6 0 0 0 0 T2 Ei mitään 1 12 1 0 12 T2 M9-2 36 85 50 39 0 60 T2 G9,m 5 27 32 1 78 5 20 T2 G10IW 4 31 30 2 85 3 T2 GSm 22 74 5 4 1 3 T2 G10,M 35 80 7 10 1 5 T2 G9}l0* 2 9 75 34 1 2
Koe 3 660-3 1143_12Q° 1223.
624mel Ei mitään 52 15 66 40 397mel Ei mitään 5 3 7 4 T2 Ei mitään 7374 ^ T2 MS - 2 50 62 4 94 o T2 G9II0 99 37 9 '5 , T2 G10-4 0 0 50 0 £ T2 G10-5 14 2 6 5
CD
^ 30 m Sellaisten T2-solujen lyysi TIL-solujen toimesta, joita ^ esi-inkuboitiin MART-l-epitoopilla M9-2 (AAGIGILTV) ja o gplOO-epitoopeilla G9154 (KTWGQYWQV), G10154 (KTWGQYWQVL), ^ G9209 (ITDQVPFSV) , G10208 (TITDQVPFSV) , G9280 (YLEPGPVTA) ( ™ 35 G10-4 (LLDGTATLRL), G10-5 (VLYRYGSFSV) konsentraatiossa
Ill 1 μg/ml (* 1 ng/ml), mitattiin neäjän tunnin pituisilla 51Cr-vapautustesteillä. TIL620-1-, TIL620-2- tai TIL660-1-, TIL660-2- ja TIL660-3-solut kasvatettiin samoista TIL-so- luista, jotka annettiin autologiselle potilaalle, mutta ne 5 viljeltiin erikseen. 624mel on HLA-A2+ gpl00+ MART-l+-me- lanoomasolulinj a, 397mel on HLA-A2"~melanoomasolulinja . T2 -solut ovat HLA-A2+-T-solu-B-solu-hybridoomia. Lihavoitu teksti: tilastollisesti merkittävä lyysi.
10 Taulukko 13
Ihmisen melanoomaepitooppien suhteellinen sitoutumisaffi- ' niteetti HLA-A2.1-proteiiniin 50 % inhi- Suhde standar-
Protelinl Peptidi Sekvenssi bitio diin^ 15 1 ................- - “ ------------- -— gplOO G9154 KTWGQYWQV 11 0,45 G101S4 KTWGQYWQVL_ 1010 0,005 G920S ITDQVPFSV 84 0,06 GIOjoi TITDQVPFSV 2080 0.0024 G9jao YLEPGPVTA 95 0,053 G10-4 LLDGTATLRL 483 0,01 20 G1Q-5 VLYRYGSFSV 13 0,38 MART-1 M9-2 AAGIGILTV 395 0,013 M10-3 EAAGIGILTV 2272 0,0022 M10-4 AAGIGILTVI 5555 0,0009
Tyroslnaasi T9l MLLAVLYCL 333 0,015 T9J(S YMNGTMSQV 40 0,13 25 c\j δ , a Se näytepeptidin konsentraatio, joka tarvittiin radioak- 9 tiiviseksi leimatun standardipeptidin HBC18-27 50-prosent-
CD
3 0 ti seksi inhiboimiseksi.
ir b Näytepeptidin sitoutumisaf f initeetin suhde standardipep- ^ tidin vastaavaan (50 % inhibitio konsentraatiossa 5 nM) .
o Peptidit merkitään vahvasti (50 % inhibitio konsentraati- ^ ossa, joka on < 50 nM, suhde > 0,1), keskitasoisesti (50 - o
C\J
112 500 nM, suhde 0,1 - 0,01) ja heikosti (> 500 nM, suhde < 0,01) sitoutuviksi peptideiksi.
Esimerkki 5
Melanoomaepitooppien modifiointi parantunutta ixnmu-5 nogeenisyyttä varten
Materiaalit ja menetelmät
Peptidisynteesi ja HLA-A2.1-sitoutumistesti
Peptidit syntetisoitiin kiinteäfaasimenetelmällä käyttäen monipeptidisyntetisaattoria ja puhdistettiin 10 HPLC-kromatografiällä, kuten aiemmin on kuvattu [Rivolti- ni, L. et ai. (1995) Journal of Immunology 154: 2257 - 2265] . Peptidien suhteellinen sitoutuminen HLA-A2.1-proteiiniin, perustuen radioaktiiviseksi leimatun standardipep-tidin sitoutumisen inhibitioon detergentillä liuotettuihin 15 MHC-molekyyleihin suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [Rivoltini, L. et ai. (1995) Journal of Immunology 154: 2257 - 2265]. Lyhyesti, eri annoksia testipeptidejä (välillä 100 μΜ - 1 nM) inkuboitiin yhdessä 5 nM kanssa radioaktiiviseksi leimattua peptidiä Hbc 18 - 27 (FLPSDY- 20 FPSV) (SEQ ID -numero 125) ja HLA-A2.1-raskasketjun ja β- mikroglobuliinin kanssa kaksi vuorokautta huoneenlämpötilassa proteaasi-inhibiittorien läsnäollessa. MHC-molekyyliin sitoutuneen radioaktiivisuuden prosenttimäärä määritettiin geelisuodatuksella ja 50 % inhibitorinen annos 25 laskettiin kullekin peptidille.
Peptidispesifisten CTL-solujen induktio PBMC-solut erotettiin perifeerisestä verestä HLA-oj A2 + -melanoomapotilailta j a normaaleilta luovuttaj ilta sen- i o trifugoimalla Ficoll-Hypaque-gradienteissa ja niitä käyte 30 tettiin tuoreina tai jäädytyssäilytettyinä näytteinä. Pepit tidispesifiset CTL-linjat muodostettiin seuraavasti. Vuo- rokautena 0 PBMC-solut maljattiin konsentraationa 1,5 x 106 o solua/ml 24-kuoppaisille maljoille (2 ml/kuoppa) Iscove- 'i? alustaan, joka sisälsi 10 % ihmisen AB-seerumia, L-gluta- ^ 35 miinia, antibiootit (CM) ja niin, että läsnä oli 1 μg pep- 113 tidiä/ml. Kaksi vuorokautta myöhemmin viljelmiin lisättiin 12 IU interleukiini 2 -proteiinia (IL-2)/ml (Chiron Co., Emeryville, CA). Sitten lymfosyytit stimuloitiin uudelleen viikoittain seuraavasti. Respondoivat solut kerättiin, 5 pestiin kerran j a malj attiin uudelleen 24-kuoppaisille maljoille konsentraationa 2,5 x 105 solua/ml CM:ien läsnä ollessa. Sitten autologiset PBMC-solut sulatettiin, pestiin kahdesti PBS:ssä, suspensoitiin uudelleen konsentraationa 5 - 8 x 106 solua/ml CM:ien läsnä ollessa ja käsitel-10 tiin peptidillä, jonka konsentraatio oli 1 μ<^ peptidiä/ml, 15 ml kartiopohj aisissa koeputkissa (5 ml/putki) kolme tuntia 37 °C:ssa. Sitten näitä PBMC-soluja (stimulaatto-rit) säteilytettiin 3 000 radilla, pestiin kerran PBS:llä ja lisättiin respondoivien solujen joukkoon niin, että 15 respondoivien ja stimulaattorien suhde oli välillä 1:3 ja 1:10. Seuraavan päivänä vilj elmiin lisättiin 12 IU IL-2 -proteiinia/ml. Näiden CTL-solujen aktiivisuus testattiin sytotoksisuustesteissä ainakin kahden peptidistimulaatio-kierroksen (14 vuorokautta) jälkeen. CTL-solujen muodosta-20 miseksi TIL-viljelmistä hajotettua kasvainsuspensiota viljeltiin 1-2 vuorokautta niin, että läsnä oli 10 % FCS:ia, RPMI-1640-alustassa niin, että sallittiin kasvain-solujen kiinnittyminen. Ei-kiinnittyneestä fraktiosta talteen otettuja lymfosyyttejä käytettiin peptidispesifisten 25 CTL-solujen indusoimiseen, kuten yllä on kuvattu.
CTL-solujen antigeenitunnistuksen määrittäminen Sytotoksiset 51Cr-vapautustestit suoritettiin pepti-^ din ja melanoomasolujen CTL-solujen toimesta tapahtuneen o tunnistuksen havaitsemiseksi. Peptidin tunnistuksen analy- co 30 soimiseksi T2-solulinj oj a esi-inkuboitiin kaksi tuntia x 37 °C: ssa niin, että peptidiä oli läsnä 1 μ9/τη1, pestiin
CC
ja niitä käytettiin kohdesoluina sytotoksisessa 51Cr-vapau-
LO
o tustestissä. Melanoomalinja 624 mel muodostettiin labora- o !£ toriossamme (katso esimerkki 1) .
δ
C\J
114
Luonnollisia melanoomaepitooppeja immunogeeni sempi- en peptidien valmistamiseksi melanooman vastaisten T-solu-jen indusoimiseksi erilaiset peptidit, joissa ainakin yksi aminohappo oli muutettu perustuen sellaisten peptidien 5 konsensusmotiiveihin, jotka sitoutuvat spesifiseen MHC luokan I -alleeliin [Falk et ai. (1991) Nature 351: 290; Kubo et ai. (1994) J. Immunol. 152: 3913; Parker, K. et ai. (1992) Journal of Immunology 149: 3580; Ruppert, J. et ai. (1993) Cell 74: 929 - 937](taulukot 14, 15, 16 ja 17). 10 Vaikka useimmat aiemmin eristetyistä virusepitoopeista ja luonnollisesti prosessoiduista HLA-A2.1-proteiiniin sitoutuvista peptideistä sisälsivät leusiinin tai metioniinin toisessa pääasiallisessa ankkuripaikassa ja valiinin viimeisessä pääasiallisessa ankkuripaikassa (dominantit ank-15 kuriaminohapot) ja sisälsivät korkean sitoutumisaffiniteetin HLA-A2.1-proteiiniin, eristetyt MART-1- tai gplOO-me-lanoomaepitoopit sisältävät ei-dominantit aminohapot pääasiallisissa ankkuri kohdissa, kuten alaniinin (epitoopin M9-2 2. kohta, epitoopin G9-280 9. kohta) ja treoniinin 20 (epitoopin G9-154 ja G9-209 2. kohta) . Epitoopit M9-2, G9-209 j a G9-280 eivät ole korkea-affiinisia sitojia. Muuttamalla aminohappo kohdassa 1, 2, 3 tai 9, jotka ovat tärkeitä peptidin sitoutumiselle HLA-A2-proteiiniin, mutta vähemmän tärkeitä T-solureseptorien tunnistukselle, voi-25 daan muodostaa keinotekoiset peptidit, jotka voivat sitoutua HLA-A2.1-proteiiniin korkeammalla affiniteetilla j a cvj jotka vielä voidaan tunnistaa luonnolliselle epitoopille oj spesifisten T-solujen toimesta.
^ Modifioitujen M9-2-, G9-280-, G9-209-, G9-154-pep- i CO 30 tidien joukossa peptideillä M9-2-2L, M9-2-1F, M9-2-3Y, G9- x 280-9V, G9-280-9L, G9-280-9I, G9-280-1F, G9-209-2L, G9- 209-2M, G9-209-2I, G9-209-1F, G9-209-1Y, G9-209-1W2L, G9-o 209-1F2L, G9-209-1Y2L oli suurempi sitoutumisaffiniteetti !£ ja ne tunnistettiin alkuperäisten melanoomareaktiivisten o 35 T-soluj en toimesta (taulukot 14, 15, 16 ja 17) . Autologi- 115 silla PBMC-soluilla, joita käsiteltiin peptideillä G9-154-21, G9-209-1F2L tai G9-280-9V, stimuloidut PBL-solut (taulukot 18, 19 ja 20) tunnistivat ja lyysasivat, ei ainoastaan alkuperäisiä epitooppeja, vaan myös me1anoomakasvai n - 5 soluja (624mel) paremmin kuin sellaiset PBL-solut, joita stimuloitiin luonnollisilla epitoopeilla (G9-154, G9-209, G9-280) .
Nämä tulokset osoittivat, että modifioituja peptide j ä voidaan käyttää kasvaimen vastaisten T-solujen indu-10 soimiseksi luonnollisten epitooppien sijasta. Muut peptidit , joita tietyt tutkimuksessamme käytetyt T-solut eivät tunnistaneet, mutta joilla oli korkeampi sitotumisaffini-teetti HLA-A2.1-proteiiniin, voivat indusoida erilaisen T-soluryhmän, joka kykenee tunnistamaan alkuperäiset mela-15 noomaepitoopit in vitro tai in vivo. Näitä modifioituj a peptidejä voidaan käyttää melanooman vastaisten T-solujen indusoimiseksi in vitro ja potilaiden immunisoimiseen sellaisten potilaiden, joilla on melanooma, hoitamiseksi tai melanooman ehkäisemiseksi.
c\j δ c\j i 1^ o
CD
X
X
CL
m o o m δ c\j ¢.
116
Taulukko 14
Modifioidut MART-1 M9-2 -peptidit
Peptidi Sekvenssi Sitoutu- Tunnistus- 5 misaffi- peptidin niteetti M9-2 kans-HLA-A2.1- sa reagoi-proteii- van T-solun niin (nM) toimesta 10 M9-2-emopept. AAGIGILTV (SEQ ID N0:4) 1064 + M9-2-2L ALGIGILTV (SEQ ID NO:50) 10 + M9-2-2M AMGIGILTV (SEQ ID NO;51) 14 M9-2-2I AIGIGELTV (SEQ Π) NO:52) 77 M9-2-1W WAGIGILTV (SEQ ID NO:53) 1351 + M9-2-1F FAGIGELTV (SEQ ID NO:54) 244 + M9-2-1Y YAGIGELTV (SEQ ID NO:55) 136 15 M9-2-3W AAW1GDLTV (SEQ ID NO:56) 65 M9-2-3F AAFIGELTV (SEQ ID NO:57) 67 M9-2-3Y AAYIGELTV (SEQ ID NO:58) 102 + M9-2-1K2L KLGIGELTV (SEQ ID NO:59) 14 M9-2-1K2M KMGIGILTV (SEQ ID NO:60) 27 M9-2-1K2I KJGIGELTV (SEQ ID NO:61) 94 2 0 M9-2-1W2L WLGIGELTV (SEQ ID NO:62) 11 M9-2-1F2L FLGIGELTV (SEQ ID NO:63) 1,8 M9-2-IY2L YLGIGELTV (SEQ ID NO:64) 3,2 M9-2-2L3W ALWIGILTV (SEQ ID NO: 65) 5,5 M9-2-2L3F ALFIGELTV (SEQ ID NO:66) 1,4 M9-2-2L3Y ALYIGILTV (SEQ ID NO:67) 3,7 25 --— — ——— — ---— ___
C\J
δ c\j cp
CO
X
X
Q.
LO
o o
LO
δ
C\J
117
Taulukko 15
Modifioidut gplOO G9-154 -peptidit
Tunnistus-
Peptidi Sekvenssi Sitoutu- peptidin 5 misaffi- G9-154 niteetti kanssa HLA-A2.1 reagoivan proteii- T-solun niin (nM) toimesta G9-154-emopept. KTWGQYWQV (SEQ ID NO:46) 5,7 + 10 G9-154-2L KLWGQYWQV (SEQ ID NO:68) 2 + G9-154-2M KMWGQYWQV (SEQ ID NO:69) 6,5 + G9-154-21 KIWGQYWQV (SEQ ID NO:70) 3 + G9-154-1W WTWGQYWQV (SEQ ID NO:71) 60 G9-154-1F FTWGQYWQV (SEQ ID NO:72) 1,6 G9-154-1Y YTWGQYWQV (SEQ ID NO:73) 2,5 15 G9-154-1A ATWGQYWQV (SEQ ID NO:74) 5,2 + G9-154-1L LTWGQYWQV (SEQ ID NO:75) 3,4 + G9-I54-3Y KTYGQYWQV (SEQ ID NO:76) 30 + G9-I54-3F KTFGQYWQV (SEQ ID NO:77) 21 + G9-154-1A2L ALWGQYWQV (SEQ ID NO:78) 2,3 + G9-154-1L2L LLWGQYWQV (SEQ ID NO:79) 1,6 + G9-154-1W2L WLWGQYWQV (SEQ ID NO:80) 2,8 G9-154-1F2L FLWGQYWQV (SEQ ID NO:81) 2,6 G9-154-1Y2L YLWGQYWQV (SEQ ID NO:82) 1,7 C\1 δ
(M
|4- cp
CO
X
DC
CL
LO
o o
LO
δ C\1 118
Taulukko 16
Modifioidut gplOO G9-209 -peptidit
Tunnis- tuspep-
Peptidi Sekvenssi Sitoutu- tidin misaffi- G9-209 ·.
b niteetti kanssa HLA-A2.1- reagoi-proteii- van T-niin (nM) solun toimesta 10 G9-209 emopept. ITDQVPFSV (SEQ ID NO:48) 172 + G9-209-2L EDQVPFSV (SEQ ED NO:83) 3,3 + G9-209-2M IMDQVPFSV (SEQ ID NO: 84) 19 + G9-209-2I HDQVPFSV (SEQ ID NO:85) 40 + G9-209-1F FTDQVPFSV (SEQ ED NO:86) 61 + G9-209-1W WTDQVPFSV (SEQ ID NO: 87) 711 + G9-209-1Y FTDQVPFSV (SEQ ID NO:88) 85 + 15 G9-209-3W ITWQVPFSV (SEQ ID NO:89) 34 G9-209-3F ITFQVPFSV (SEQ ID NO:90) 66 G9-209-3Y ITYQVTFSV (SEQ ID NO:91) 33 G9-209-3A ITAQVPFSV (SEQ ID NO:92) 95 G9-209-3M ITMQVPFSV (SEQ ID NO:93) 40 G9-209-3S ITSQVPFSV (SEQ ID NO:94) 649 2o G9-209-2L3W ELWQVPFSV (SEQ ID NO:95) 1,7 G9-209-2L3F ILFQVPFSV (SEQ ID NO:96) 2 G9-209-2L3Y ILYQVPFSV (SEQ ED NO:97) 5 G9-209-2L3A ELAQVPFSV (SEQ ID NO:98) 11 G9-209-2L3M ILMQVPFSV (SEQ ID NO:99) 7,6 G9-209-2L3S ELSQVPFSV (SEQ ID NO: 100) 20 G9-209-1W2L WLDQVPFSV (SEQ ID NO: 101) 12 + 25 G9-209-1F2L FLDQVPFSV (SEQ ID NO: 102) 2,2 + G9-209-1Y2L YUDQVPFSV (SEQ ID NO: 103) 2,3 +
CVJ
O ~ ————— —— ———_ —, ; - —"" ______ .
C\J if M , , , Se naytepeptidm konsentraatio, joka tarvittiin radioak- r- 9 tiiviseksi leimatun standardipeptidin HBC18-27 50-prosent- co , .....
f- 30 tiseksi inhiboimiseksi. Peptidit merkitään vahvasti (50 % | inhibitio konsentraatiolla, joka on < 50 nM) , keskivahvaa- ^ ti (50 - 500 nM) ja heikosti (> 500 nM) sitoutuviksi pep- o tideiksi (katso esimerkki 4).
LO
δ C\1 119
Taulukko 17
Modifioidut gplOO G9-280 -peptidit
Sitoutu- Tunnis- ^ Peptidi Sekvenssi misaffi- tuspep- niteetti tidin HLA-Ä2.1 G9-280 proteii- kanssa niin (nM) reagoivan T-solun ..................................... ... toimesta G9-280-emopept. YLEPGPVTA (SEQ ID NO:40) 455 + G9-280-9V YLEPGPVTV (SEQ ID NO: 104) 48 + G9-280-9L YLEPGPVTL (SEQ ID NO: 105) 88 + G9-280-9I YLEPGPVTI (SEQ ID NO: 106) 65 + G9-280-1F FLEPGPVTA (SEQ ID NO: 107) 125 -f 15 G9-280-1W WLEPGPVTA (SEQ ID NO: 108) 833 + G9-280-3Y YLYPGPVTA (SEQ ED NO: 109) 17 G9-280-3W YLWPGPVTA (SEQ ID NO: 110) 3,2 G9-280-3F YLFPGPVTA (SEQ ED NO: 111) 3,2 G9-280-3M YIMPGPVTA (SEQ ID NO: 112) 4,3 G9-280-3S YLSPGPVTA (SEQ ID NO: 113) 42 G9-280-3A YLAPGPVTA (SEQ ID NO: 114) 9,3 G9-280-3M9V YLMPGPVTV (SEQ ID NO: 115) 12 G9-280-3S9V YLSPGPVTV (SEQ ID NO: 116) 23 G9-280-3A9V YLAPGPVTV (SEQ ID NO: 117) 15 G9-280-3Y9V YLYPGPVTV (SEQ ID NO: 118) 8,9 G9-280-3F9V YLFPGPVTV (SEQ ID NO: 119) 5,8 G9-280-3W9V YLWPGPVTV (SEQ ID NO: 120) 7,4 25 ______ c\j δ c\j i 1^ o
CO
X
tr
CL
LO
O
O
LO
δ C\l 120
Taulukko 18
Melanooman vastaisten CTL-solujen induktio modifioitua G9-154-peptidiä käyttäen
Effektori-T-solut 5
Kohde Peptidillä Peptidillä G9-154 stimu- G9-154-2I sti- loidut PBL- muloidut PBL- ___solut solut
Spesifinen lyysi-% (E:T = 40:1) 10 T2 11 1 T2+G9-154 14 37 T2+G9-154-2I 8 38 15 624mel 5 23
Cr-vapautustesti suoritettiin nelinkertaisen peptidien kanssa esi-inkuboiduilla autologisilla PBMC-soluilla suoritetun stimulaation jälkeen.
20
Taulukko 19
Melanooman vastaisten CTL-solujen induktio modifioitua G9-209-peptidiä käyttäen
Effektori-T-solut 25
Kohde Peptidillä Peptidillä
cm G9-209 stimu- G9-209-1F2L
5 loidut PBL- stimuloidut ^ solut PBL-solut ri o ____
CD
30 Spesifinen lyysi-% (E:T = 40:1) x
DC
w T2 0 0 o S T2+G9-209 6 85 ° 35 T2+G9-209-1F2L 1 86 624me! 4 63 121
Cr-vapautustesti suoritettiin nelinkertaisen peptidien kanssa esi-inkuboiduilla autologisilla PBMC-soluilla suo-ritetun stimulaation jälkeen. ‘ 5 Taulukko 2 0
Melanooman vastaisten CTL-solujen induktio modifioitua G9-280-peptidiä käyttäen,
Effektori-T-solut 1Q Kohde Peptidillä Peptidillä G9-280 sti- G9-280-9V muloidut stimuloidut PBL-solut PBL-solut
Spesifinen lyysi-% (E:T = 40:1) 15 T2 3 0 T2+G9-280 11 87 T2+G9-280-9V 8 58 624mcl 11 71 2 0 ______——
Cr-vapautustesti suoritettiin nelinkertaisen peptidien kanssa esi-inkuboiduilla autologisilla PBMC-soluilla suoritetun stimulaation jälkeen.
25 Esimerkki 6 MART-1-rokotteet melanooman hoitamiseksi nisäkkäil- c\J , ..
la o ^ MART-1-rokotteet voivat olla tehokkaita hoidettaes- 9* sa nisäkkäitä, joilla on melanooma. MART-1-rokotteet voi- ^ 30 daan esimerkiksi antaa yksilöille. Nisäkkäät voidaan immu- nisoida tässä kuvatuilla MART-1-proteiineilla, peptideillä
CL
tai modifioiduilla peptideillä niin, että niiden määrä on
LO
o välillä noin 1 mg - noin 100 mg. Vaihtoehtoisesti nisäk in käät, suositeltavasti ihmiset, voidaan immunisoida MART-1-o c\j 35 nukleiinihapposekvenssillä, joka on insertoitu virusvekto- 122 riin, kuten vacciniavirus-, adenovirus- tai linturokkovi-rusvektoriin. Noin 106 - noin 1011 viruspartikkelia, joissa on MART-l-nukleiinihapposekvenssit, jotka vastaavat immu-nogeenisiä MART-1-peptidejä tai niiden modifioituja pepti-5 dejä tai analogeja, voidaan antaa per nisäkäs, suositeltavasta ihminen. Nisäkkäitä tarkkaillaan antigeeniä vastaan olevien vasta-aineiden suhteen tai sellaisten sytotoksis-ten lymfosyyttien (CTL) määrän kohoamisen suhteen, jotka tunnistavat immunogeenin, tavanomaisin menetelmin tai ak-10 tiivisen taudin kliinisten merkkien ja oireiden 1levenemisen avulla. Spesifiset määritettävät parametrit sisältävät sellaisten immuunisolujen tuoton, jotka tunnistavat roko-teantigeenin, tai kasvaimen regression. Sellaiset rokotteet voidaan antaa joko profylaktisesti tai terapeuttises-15 ti . Nisäkkäät voidaan immunisoida myös gplOO-nukleiinihap-posekvenssillä, joka on insertoitu retrovirusvektoriin, tai immunogeenisilla gpl00-peptideillä tai niiden modifioiduilla peptideillä tai analogeilla. Retroviruksissa olevan antigeenin ehdotetut annosrajat, joita voidaan käyt-20 tää, ovat noin 106 - noin 1011 viruspartikkelia per nisäkäs, suositeltavasti ihminen. Retrovirusrokotteiden vaste ja tehokkuus määritetään, kuten on kuvattu yllä.
Esimerkki 7
Melanooma-antigeeneista peräisin oleville iiratvuno-25 geenisille peptideille herkistettyjen lymfosyyttien käyttö melanoomaa sairastavien nisäkkäiden terapeuttiseksi hoita-cvj mi seksi
Melanooma-antigeenille esi-herkistetyt T-lymfosyy- tit voivat olla tehokkaita sellaisten nisäkkäiden tera- co 30 peuttiseksi hoitamiseksi, joilla on melanooma. T-lymfosyy- x tit eristetään perifeerisen veren lymfosyyteistä tai kas te vaimeen tunkeutuvista lymfosyyteistä ja ne altistetaan in o vitro MART-1-proteiinille tai -peptidille. T-lymfosyytit o « eristetään perifeerisestä verestä tai melanoomakasvainsus- o 35 pensioista j a niitä viljellään in vitro [Kawakami, Y. et 123 a,l (1988) J· ExP · Med. 168: 2183 - 2191] . T-lymfosyytit altistetaan MART-1-peptidille AAGIGILTV noin 1-16 tunnin ajaksi niin, että peptidin konsentraatio on noin 1 - noin 10 mg/ml /uitigeenille altistetut T-lymfosyytit annetaan 5 nisäkkäälle, suositeltavaati ihmiselle niin, että noin 1q9 _ noin i012 lymfosyyttiä annetaan per nisäkäs. Vaihtoehtoisesti T-lymfosyytit voidaan altistaa modifioiduille MÄRT-l-peptideille. Lymfosyytit voidaan antaa joko suonensisäisesti, vatsaontelonsisäisesti tai vaurionsisäisesti. 10 Tämä hoito voidaan antaa yhtäaikaa muiden terapeuttisten hoitojen, kuten sytokiinien, säteilytyshoidon, melanooma-vaurioiden leikkaushoidon ja kemoterapeuttisten lääkkeiden, adoptiivisen T-lymfosyyttiterapian kanssa. Vaihtoehtoisesti T-lymfosyytit voidaan altistaa immunogeenisille 15 gpl0 0-peptideille tai tässä kuvatuille immunogeeni sille modifioiduille peptideille.
Esillä olevan keksinnön piiriä ei rajoita talletetut nukleiinihapposekvenssit, koska talletettujen suori-tustapojen on tarkoitettu olevan yksittäinen kuvaus kek-20 sinnon näkökohdista ja kaikki sekvenssit, jotka ovat toi minnallisesti ekvivalentteja, kuuluvat tämän keksinnön piiriin. Todellakin, erilaiset keksinnön modifikaatiot tässä esitettyjen ja kuvattujen lisäksi tulevat ilmeisiksi alan asiantuntijoille edellä olevasta kuvauksesta ja muka-25 na seuraavista kuvioista. Sellaisten modifikaatioiden on tarkoitettu kuuluvan lisättyjen patenttivaatimusten pii-cvj riin.
δ c\j i 1^ o
CD
X
tr
CL
LO
O
O
LO
O
C\1
Sekvenssi!, is taus 124 (1) Yleiset tiedot (i) Hakija (A) Nimi; Yhdysvaltojen hallitus, jota edustaa ministeri, Department of Health and Human Services -osasto (B) Katu: 6011 Executive Boulevard-Box 13 (C) Kaupunki: Rockville (D) Valtio: Maryland
(E) Maa: USA
(F) Postinumero: 20852 (ii) Keksinnön otsikko: Melanooma-antigeenit ja niiden käyttö diagnostisissa ja terapeuttisissa menetelmissä (iii) Sekvenssien määrä: 126 (iv) Yhteydenpito-osoite: (A) Vastaanottaja: Morgan & Finnegan (B) Katu: 345 Park Avenue (C) Kaupunki: New York (D) Valtio: New York
(E) Maa: USA
(F) Postinumero: 10154 (v) Tietokoneella luettava muoto: (A) Alustatyyppi: levyke (B) Tietokone: IBM PC -koneen kanssa yhteensopiva
(C) Käyttöjärjestelmä: PC-DOS/MS-DOS
(D) Ohjelma: ASCII
(vi) Nykyiset hakemustiedot: (A) Hakemusnumero: (B) Reskisteröintipäivämäärä: 21.4.1995 (C) Luokitus: (vii) Aiemmat hakemustiedot: (A) Hakemusnumero: US/08/417 174 (B) Rekisteröintipäivämäärä: 5.4.1995 (vii) Aiemmat hakemustiedot: (A) Hakemusnumero: US/08/231 565 (B) Rekisteröintipäivämäärä: 22.4.1994 (C) Luokitus: (viii) Asianaj aj an/asiamiehen tiedot: (A) Nimi: William S. Feiler (B) Rekisterinumero: 26 728 (C) Viite/luettelonumero: 2026-4124 125 (ix) Teleliikennetiedot: (A) Puhelin: (212) 758-4800 (B) Telefax: (212) 751-6849 (C) Telex: 421792 {2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 1: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 1559 (B) Tyyppi: nukleotidi (C) Juosteisuus: kaksijuosteinen (D) Topologia: tuntematon
(ii) Molekyylityyppi: cDNA
(xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 1: AGCAGACAGA GGACTCTCAT TAAGGAAGGT GTCCTGTGCC 40 CTGACCCTAC AAGATGCCAA GAGAAGATGC TCACTTCATC 80 TATGGTTACC CCAAGAAGGG GCACGGCCAC TCTTACACCA 120 CGGCTGAAGA GGCCGCTGGG ATCGGCATCC TGACAGTGAT 160 CCTGGGAGTC TTACTGCTCA TCGGCTGTTG GTATTGTAGA 200 AGACGAAATG GATACAGAGC CTTGATGGAT AAAAGTCTTC 240 ATGTTGGCAC TCAATGTGCC TTAACAAGAA GATGCCCACA ' 280 AGAAGGGTTT GATCATCGGG ACAGCAAAGT GTCTCTTCAA- 320 GAGAAAAACT GTGAACZTGT GGTTCCCAAT GCTCCACCTG 360 CTTATGAGAA ACTCTCTGCA GAACAGTCAC CACCACCTTA 400 TTCACCTTAA GAGC2AGCGA GACACCTGAG ACATGCTGAA 440 ATTATTTCTC TCACACTTTT GCTTGAATTT AATACAGACA 480 TCTAATGTTC TCCTTTGGAA TGGTGTAGGA AAAATGCAAG 520 CCATCTCTAA TAATAAGTCA GTGTTAAAAT TTTAGTAGGT 560 CCGCTAGCAG TACTAATCAT GTGAGGAAAT GATGAGAAAT 600 ATTAAATTGG GAAAACTCCA TCAATAAATG TTGCAATGCA 640 TGATACTATC TGTGCCAGAG GTAATGTTAG TAAATCCATG 680 GTGTTATTTT CTGAGAGACA GAATTCAAGT GGÖTATTCTG 720 126 GGGCCATCCA ATTTCTCTTT ACTTGAAATT TGGCTAATAA 760
CAAACTAGTC AGGTTTTCGA ACCTTGACCG ACATGAACTG BOO
TACACAGAAT TGTTCCAGTA CTATGGAGTG CTCACAÄAGG 840 ATACTTTTAC AGG7TAAGAC AAAGGGTTGA CTGGCCTATT 880 TATCTGATCA AGAACATGTC AGCAATGTCT CTTTGTGCTC ’ 920 TAAAATTCTA TTATACTACA ATAATATATT GTAAAGATCC 960 TATAGCTCTT TTTTTTTGAG ATGGAGTTTC GCTTTTGTTG 1000 CCCAGGCTGG AGTGCAATGG CGCGATCTTG GCTCACCATA 1040 ACCTCCGCCT CCCAGGTTCA AGCAATTCTC CTGCCTTAGC 1080 CTCCTGAGTA GCTGGGATTA CAGGCGTGCG CCACTATGCC 1120 TGACTAATTT TGTAGTTTTA GTAGAGACGG GGTTTCTCCA 1160 TGTTGGTCAG GCTGGTCTCA AACTCCTGAC CTCAGGTGAT 1200 CTGCCCGCCT CAGCCTCCCA AAGTGCTGGA ATTACAGGCG 1240 TGAGCCACCA CGCCTGGCTG GATCCTATAT CTTAGGTAAG 1280 ACATATAACG CAGTCTAATT ACATTTCACT TCAAGGCTCA 1320 ATGCTATTCT AACTAATGAC AAGTATTTTC TACTAAACCA 1360 GAAATTGGTA GAAGGATTTA AATAAGTAAA AGCTACTATG 1400 TACTGCCTTA GTGCTGATGC CTGTGTACTG CCTTAAATGT 1440 ACCTATGGCA ATTTAGCTCT CTTGGGTTCC CAAATCCCTC 1480 TCACAAGAAT GTGCAGAAGA AATCATAAAG GATCAGAGAT 1520 TCTGAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAA 1559 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 2: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 118 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (il) Molekyylityyppi: proteiini 127 (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 2:
Met Pro Arg Glu Asd Ala Hi s Phe Ile Tyr Gly Tyr Pro Lys 1 5 10
Lys Gly His Gly His Ser Tyr Thr Thr Ala Glu Glu Ala Ala 15 20 25
Gly Ile Gly Ile Leu Thr Vai Ile Leu Gly Vai Leu Leu Leu 30 35 40
Ile Gly Cys Trp Tyr Cys Arg Arg Arg Asn Gly Tyr Arg Ala 45 50 55
Leu Met Asp Lys Ser Leu His Vai Gly Thr Gin Cys Ala Leu 60 65 70
Thr Arg Arg Cys Pro Gin Glu Gly Phe Asp His Arg Asp Ser 75 80
Lys Vai Ser Leu Gin Glu Lys Asn Cys Glu Pro Vai Vai Pro 85 90 95
Asn Ala Pro Pro Ala Tyr Glu Lys Leu Ser Ala Glu Gin Ser 100 105 . 110
Pro Pro Pro Tyr Ser Pro 115 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 3: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 • (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 3:
Thr Thr Ala Glu Glu Ala Ala Gly Ile 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 4: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 4:
Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Vai 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 5: 128 (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 5:
Gly Ile Gly Ile Leu Thr Vai Ile Leu 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 6: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 6:
Gly Ile Leu Thr Vai Ile Leu Gly Vai 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 7: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 7:
Ile Leu Thr Vai Ile Leu Gly Vai Leu 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 8: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi : peptidi 129 (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 8:
Leu Thr Val lie Leu Gly Val Leu Leu 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 9: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 9:
Thr Vai Ile Leu Gly Vai Leu Leu Leu 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 10: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 10:
Vai Ile Leu Gly Vai Leu Leu Leu Ile 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 11: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 11:
Ala Leu Met Asp Lys Ser Leu His Vai 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 12: 130 (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 12;
Ser Leu His Vai Gly Thr Gin Cys Ala 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 13: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus; tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 13:
Pro Vai Vai Pro Asn Ma Pro Pro Ala 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 14: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 14:
Asn Ma Pro Pro Ala Tyr Glu Lys Leu 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 15: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 10 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 15: 131
Tyr Thr Thr Ala Glu Glu Ala Ala Gly He 15 10 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 16: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 10 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 16:
Thr Ala Glu Glu Ala Ala Gly Ile Gly Ile 1 5 10 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 17: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 10 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 17t
Glu Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Vai 1 5 10 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 18: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 10 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 18:
Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Vai Ile 15 10 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 19: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 10 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi 132 (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 19;
Gly Ile Leu Thr Vai Ile Leu Gly Vai Leu 1 · S 10 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 20: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 10 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 20:
Ile Leu Thr Vai Ile Leu Gly Vai Leu Leu 1 S 10 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 21: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 10 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 21:
Leu Thr Vai Ile Leu Gly Väl Leu Leu Leu 1 5 10 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 22: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 10 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 22:
Thr Vai .le Leu Gly Vai Leu Leu Leu Ile 1 5 10 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 23: 133 (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 10 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 23:
Arg Ma Leu Met Asp Lys Ser Leu His Vai 1 5 10 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 24: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 10 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 24:
Ser Leu His Vai Gly Thr Gin Cys Ala Leu 1 5 10 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 25: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 10 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 25: Ser Leu Gin Giu Lys Asn Cys Glu Pro Vai 1 5 10 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 26: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 2172 (B) Tyyppi: nukleotidi (C) Juosteisuus: kaksijuosteinen (D) Topologia: tuntematon
(ii) Molekyylityyppi: cDNA
(xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 26: 134 GTCGACG5CC ATTACCAATC GCGACCGGGA AGAACACAAT GGATCTGGTG CTAAAAAGAT GCCTICTTCA TTTGGCTGTG 80 ATAGGTGCTT TGCTGGCTGT GGGGGCTACA AAAGTACCCA 120 GAAACCAGGA CTGGCTTGGT GTCTCAAGGC AACTCAGAAC 160 CAAAGCCTGG AACAGGCAGC TGTATCCAGA GTGGACAGAA 200 GCCCAGAGAC TTGACTGCTG GAGAGGTGGT CAAGTGTCCC 240 TCRAGGTCAG TAATGATGGG CCTACACTGA TTGGTGCÄAA 280 TGCCTCCTTC TCTATTGCCT TGAACTTCCC TGGAAGCCAA 320 AAGGTATTGC CAGATGGGCA GGTTATCTGG GTCAACAATA 360 CCATCATCAA TGGGAGCCAG GTGTGGGGAG GACAGCCAGT 400 GTATCCCCAG GAAACTGACG ATGCCTGCAT CTTCCCTGAT 440 GGTGGACCTT GCCCATCTGG CTCTTGGTCT CAGAAGAGAA 480 GCTTTGTTTA TGTCTGGAAG ACCTGGGGCC AATACTGGCA 520 ATTTCTAGGG GGCCCAGTGT CTGGGCTGAG CATTGGGACA 560 GGCAGGGCAA TGCTGGGCAC ACACACCATG GAAGTGACTG 600 TCTACCATCG CCGGGGATCC CGGAGCTATG TGCCTCTTGC 640 TCATTCCAGC TCAGCCTTCA CCATTACTGA CCAGGTGCCT 680 TTCTCCGTGA GCGTGTCCCA GTTGCGGGCC TTGGATGGAG 720 GGAACAAGCA CTTCCTGAGA AATCAGCCTC TGACCTTTGC 760 CCTCCAGCTC CRTGACCCCA GTGGCTATCT GGCTGAAGCT · 800 GACCTCTCCT ACACCTGGGA CTTTGGAGAC AGTAGTGGAA 840 CCCTGATCTC TCGGGCACTT GTGGTCACTC ATACTTACCT 880 GGAGCCTGGC CCAGTCACTG CCCAGGTGGT CCTGCAGGCT 920 GCCATTCCTC TCACCTGCTG TGGCTCCTCC CCAGTTCCAG 960 GCACCACAGÄ TGGGCACAGG CCAACTGCAG AGGCCCCTAA 1000 CACCACAGCT GGCCAAGTGC CTACTACAGA AGTTGTGGGT 1040 ACTACACCTG GTCAGGCGCC AACTGCAGAG CCCTCTGGAA 1080 CCACATCTGT GCAGGTGCCA ACCACTGAAG TCATAAGCAC 1120 135 TGCACCTGTG CAGATGCCAA CTGCAGAGAG CACAGGTATG 1160 ACACCTGAGA AGGTGCCAGT TTCAGAGGTC ATGGGTACCA 1200 CACTGGCAGA GATGTCAACT CCAGAGGCTA CAGGTATGAC 1240 ACCTGCAGAG GTATCAATTG TGGTGCTTTC TGGAACCACA 1280 GCTGCACAGG TAACAACTAC AGAGTGGGTG GAGACCACAG 1320 CTAGAGAGCT ACCTATCCCT GAGCCTGAAG GTCCAGATGC 1360 CAGCTCAATC ATGTCTACGG AAAGTATTAC AGGTTCCCTG 1400 GGCCCCCTGC TGGATGGTAC AGCCACCTTA AGGCTGGTGA 1440 AGAGACAAGT CCCCCTGGAT TGTGTTCTGT ATCGATATGG 1480 TTCCTTTTCC GTCACCCTGG ACATTGTCCA GGGTATTGAA 1520 AGTGCCGAGA TCCTGCAGGC TGTGCCGTCC GGTGAGGGGG 1560 ATGCATTTGA GCTGACTGTG TCCTGCCAAG GCGGGCTGCC 1600 CAAGGAAGCC TGCATGGAGA TCTCATCGCC AGGGTGCCAG 1640 CCCCCTGCCC AGCGGCTGTG CCAGCCTGTG CTACCCAGCC 1680 CAGCCTGCCA GCTGGTTCTG CACCAGATAC TGAAGGGTGG 1720 CTCGGGGACA TACTGCCTCA ATGTGTCTCT GGCTGATACC 1760 AACAGCCTGG CAGTGGTCAG CACCCAGCTT ATCATGCCTG 1800 GTCAAGAAGC AGGCCTTGGG CAGGTTCCGC TGATCGTGGG 1840 CATCTTGCTG GTGTTGATGG CTGTGGTCCT TGCATCTCTG _ 1880 ATATATAGGC GCAGACTTAT GAAGCAAGAC TTCTCCGTAC 1920 CCCAGTTGCC ACATAGCAGC AGTCACTGGC TGCGTCTACC 1960 CCGCATCTTC TGCTCTTGTC CCATTGGTGA GAACAGCCCC 2000 CTCCTCAGTG GGCAGCAGGT CTGAGTACTC TCATATGATG 2040 CTGTGATTTT CCTGGAGTTG ACAGAAACAC CTATATTTCC 2080 CCCAGTCTTC CCTGGGAGAC TACTATTAAC TGAAATAAAT 2120 ACTCAGAGCC TGAAAAAAAA ΤΑΑΑΆΆΆΛΛΆ AAAAAAAÄAA 2160 AAAAMAAAA AA 2172 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 27: 136 (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 661 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon > (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: proteiini (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 27:
Met Asp Leu Vai Leu Lys Arg Cys Leu Leu His Leu 1 5 10
Ala Vai Ile Gly Ala Leu Leu Ala Vai Gly Ala Thr 15 20
Lys Vai Pro Arg Asn Gin Asd Trp Leu Gly Vai Ser 25 30 * 35
Arg Gin Leu Arg Thr lys Ala Trp Asn Arg Gin Leu 40 45
Tyr Pro Glu Trp Thr Glu Ala Gin Arg Leu Asp Cys 50 55 60
Trp Arg Gly Gly Gin Vai Ser Leu Lys Vai Ser Asn 65 70
Asp Gly Pro Thr Leu Ile Gly Ala Asn Ala Ser Phe 75 _ 80
Ser Ile Ala Leu Asn Phe Pro Gly Ser Gin Lys Vai 85 90 95
Leu Pro Asp Gly Gin Vai Ile Trp Vai Asn Asn Thr 100 105
Ile Ile Asn Gly Ser Gin Vai Trp Gly Gly Gin Pro 110 115 120
Vai Tyr Pro Gin Glu Thr Asp Asp Ala Cys Ile Phe 125 130
Pro Asp Gly Gly Pro Cys Pro Ser Gly Ser Trp Ser 135 140
Gin Lys Arg Ser Phe Vai Tyr Vai Trp Lys Thr Trp 145 150 155
Gly Gin Tyr Trp Gin Phe Leu Gly Gly Pro Vai Ser 160 . 165
Gly Leu Ser Ile Gly Thr Gly Arg Ala Met Leu Gly 170 175 180
Thr His Thr Met Glu Vai Thr Vai Tyr His Arg Arg 185 190
Gly Ser Arg Ser Tyr Vai Pro Leu Ala His Ser Ser 195 , 200
Ser Ala Phe Thr Ile Thr Asp Gin Vai Pro Phe Ser 205 210 215
Vai Ser Vai Ser Gin Leu Arg Ala Leu Asp Gly Gly 220 225
Asn Lys His Phe Leu Arg Asn Gin Pro Leu Thr Phe 230 235 240 137
Ala Leu Gin Leu Kis Asd Pro Ser Gly Tyr Leu Ala 245 250
Glu Ala Asd Leu Ser Tyr Thr Trp Asp Phe Gly Asp 255 “ 260
Ser Ser Gly Thr Leu He Ser Arg Ala Leu Vai Val 260 265 270
Thr His Thr Tyr Leu Glu Pro Gly Pro Val Thr Ala 275 280
Gin Val Val Leu Gin Ala Ala He Pro Leu Thr Ser 285 290 295
Cys Gly Ser Ser Pro Val Pro Gly Thr Thr Asp Gly 300 305
His Arg Pro Thr Ala Glu Ala Pro Asn Thr Thr Ala 310 315
Gly Gin Val Pro Thr Thr Glu Val Val Gly Thr Thr 320 325 330
Pro Gly Gin Ala Pro Thr Ala Glu Pro Ser Gly Thr 335 340
Thr Ser Val Gin Val Pro Thr Thr Glu Val He Ser 345 350 355
Thr Ala Pro Val Gin Met Pro Thr Ala Glu Ser Thr 360 365
Gly Met: Thr Pro Glu Lys Val Pro Val Ser Glu Val 370 375
Met Gly Thr Thr Leu Ala Glu Met Ser Thr Pro Glu 380 385 390
Ala Thr Gly Met Thr Pro Ala Glu Val Ser He Val 395 400
Val Leu Ser Gly Thr Thr Ala Ala Gin Val Thr Thr 405 410 415
Thr Glu Trp Val Glu Thr Thr Ala Arg Glu Leu Pro 420 425
He Pro Glu Pro Glu Gly Pro Asp Ala Ser Ser He 430 435
Met Ser Thr Glu Ser He Thr Gly Ser Leu Gly Pro 440 445 450
Leu Leu Asd Gly Thr Ala Thr Leu Arg Leu Val Lys 455 ' 460
Arg Gin Val Pro Leu Asd Cys Val Leu Tyr Arg Tyr 465 * 470 475
Gly Ser Phe Ser Val Thr Leu Asp lie Val Gin Gly 480 490 ·
Ile Glu Ser Ala Glu He Leu Gin Ala Val Pro Ser 495 500
Gly Glu Gly Asp Ala Phe Glu Leu Thr Val Ser Cys 505 510 515
Gin Gly Gly Leu Pro Lys Glu Ala Cys Met Glu He 520 . 525
Ser Ser Pro Gly Cys Gin Pro Pro Ala Gin Arg Leu 530 535 540
Cys Gin Pro Val Leu Pro Ser Pro Ala Cys' Gin Leu 545 550
Val Leu His Gin He Leu Lys Gly Gly Ser Gly Thr 555 5:60 138
Tyr Cys Leu Asn Val Ser Leu Ala Asp Thr Asn Ser 565 570 575
Leu Ala Val Val Ser Thr Gin Leu lie Met Pro Gly 580 585
Gin Glu Ala Gly Leu Gly Gin Val Pro Leu lie Val 590 595 600
Gly lie Leu Leu Val Leu Met Ala Val Val Leu Ala 605 610
Ser Leu lie Tyr Arg Arg Arg Leu Met Lys Gin Asp 615 620
Phe Ser Val Pro Gin Leu Pro His Ser Ser Ser His 625 630 635
Trp Leu Arg Leu Pro Arg He Phe Cys Ser Cys Pro 640 645
He Gly Glu Asn Ser Pro Leu Leu Ser Gly Gin Gin 650 655 660
Val (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 28: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 7 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: proteiini (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 28:
Vai Pro Gly Ile Leu Leu Thr 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 29: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 7 (B) Tyyppi: aminohappo 1 (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: proteiini (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 29:
Leu Leu Ser Gly Gin Gin Vai 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 30: 139 (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 12 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: proteiini (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 30:
Pro Pro Gin Trp Ala Ala Gly Leu Ser Thr Leu Ile 15 10 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 31: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 31:
Met Leu Leu Ma Vai Leu Tyr Cvs Leu 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 32: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 32:
Tyr Met Asn Gly Thr Met Ser Gin Vai 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 33: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 10 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 33: 140
Leu Leu Asp Gly Thr Ala Thr Leu Arg Leu 1 5 10 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 34: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 10 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 34:
Vai Leu Tyr Arg Tyr Gly Ser Phe Ser Vai 15 10 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 35: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 10 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 35:
Ma Leu Asp Gly Gly Asn Lys His Phe Leu 1 5 10 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 36: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 36:
Vai Leu Lys Arg Cys Leu Leu His Leu 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 37: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 10 (B) Tyyppi; aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon 141 (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 37:
Vai Leu Pro Ser Pro Ala Cys Gin Leu Vai 1 5 10 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 38: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 10 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 38:
Ser Leu Ala Asp Thr Asn Ser Leu Ala Vai 15 10 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 39: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 39:
Ser Vai Ser Vai Ser Gin Leu Arg Ala 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 40: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 40:
Tyr Leu Glu Pro Gly Pro Vai Thr Ala 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 41: 142 (i) Sekvenssin ominaisuudet; (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 41:
Leu Asn Vai Ser Leu Ala Asp Thr Asu 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 42: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 58 (B) Tyyppi: nukleotidi (C) Juosteisuus: kaksijuosteinen (D) Topologia: tuntematon
(ii) Molekyylityyppi: cDNA
(xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 42: GGACAGGCCG AGGCGGCCTT ΤΓΊΤΤΤΤΤΤΤ TTTTTTTTTT 40 ΤΤΠΤΠΤΤΤ TTTTTTTT 58 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 43: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 12 (B) Tyyppi: nukleotidi (C) Juosteisuus: kaksijuosteinen (D) Topologia: tuntematon
(ii) Molekyylityyppi: cDNA
(xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 43: CCAATCGCGA CC 12 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 44: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 14 (B) Tyyppi: nukleotidi (C) Juosteisuus: kaksijuosteinen (D) Topologia: tuntematon
(ii) Molekyylityyppi: cDNA
(xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 44: 143 GGTCGCGATTG gtaa 14 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 45: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 45:
Gly Ile Leu Gly Phe Vai Phe Thr Leu 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 46: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 46:
Lys Thr Trp Gly Gin Tyr Trp Gin Vai 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 47: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 10 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 47: hys Thr Trp Gly Gin Tyr Trp Gin Vai Leu 1 5 io (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 48: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon 144 (ii) Molekyylityyppi : peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero. 48: Ile Thr Asp Gin Vai Pro Phe Ser Vai 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 49: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 10 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 49:
Thr Ile Thr Asp Gin Vai Pro Phe Ser Vai 1 5 ,,10 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 50: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 50:
Ala Leu Gly Ile Gly Ile Leu Thr Vai 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 51: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 51:
Ala Met Gly Ile Gly Ile Leu Thr Vai 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 52: 145 (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon {ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 52:
Ala Ile Gly Ile Giy Ile Leu Thr Vai 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 53: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 53:
Trp Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Vai 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 54: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 54:
Phe Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Vai 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 55: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 55:
Tyr Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Vai 1 5 146 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 56: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 56:
Ala Ala Trp Ile Gly Ile Leu Thr Vai 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 57: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 57: Ala Ala Phe Ile Gly Ile Leu Thr Vai 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 58: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 58: Λ
Ala Ala Tyr Ile Gly Ile Leu Thr Vai 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 59: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi 147 (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 59:
Lys Leu Gly lie Gly lie Leu Thr Val 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 60: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 60:
Lys Met Gly Ile Gly Ile Leu Thr Vai 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 61: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B| Tyyppi: aminohappo |C) Juosteisuus: tuntematon iDi Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 61:
Lys Ile Gly Ile Gly Ile Leu Thr Vai 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 62: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 62:
Trp Leu Gly Ile Gly Ile Leu Thr Vai 1 5 * (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 63: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (G) Juosteisuus: tuntematon 148 (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 63:
Phe Leu Gly Ile Gly Ile Leu Thr Vai 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 64: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 64: Tyr Leu Gly Ile Gly Ile Leu Thr Vai 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 65: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 65:
Ala Leu Tm Ile Gly Ile Leu Thr Vai 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 66: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 66:
Ala Leu Phe Ile Gly Ile Leu Thr Vai 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 67: 149 (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 67:
Ala Leu Tyr lie Gly lie Leu Thr Vai 1 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 68: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 68:
Lys Leu Trp Gly Gin Tyr Trp Gin Vai 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 69: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 69:
Lys Met Trp Gly Gin Tyr Trp Gin Vai 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 70: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus; tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 70: 150
Lys Ile Trp Gly Gin Tyr Trp Gin Val 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 71: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 71:
Trp Thr Trp Gly Gin Tyr Trp Gin Vai 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 72: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 72:
Phe Thr. Trp Gly Gin Tyr Trp Gin Vai 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 73: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) .Pituus : 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 73:
Tyr Thr Trp Gly Gin Tyr Tro Gin Vai 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 74: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon 151 (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 74:
Ma Thr Trp Glv Gin Tyr Tro Gin Vai 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 75: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 75:
Leu Thr Trp Gly Gin Tyr Trp Gin Vai 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 76: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 76:
Lys Thr Tyr Gly Gin Tyr Trp Gin Vai 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 77: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 77:
Lys Thr Phe Gly Gin Tyr Trp Gin Vai 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 78: 152 (ί) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 78:
Ma Leu Tip Gly Gin Tyr Trp Gin Vai 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 79: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 79:
Leu Leu Trp Gly Gin Tyr Trp Gin Vai 1 ' 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 80: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 80;
Trp Leu Trp Gly Gin Tyr Trp Gin Vai 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 81: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 81: 153
Phe Leu Tm Gly Gin Tyr Trp Gin Val 1 * 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 82: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 82:
Tyr Leu Trp Gly Gin Tyr Trp Gin Vai 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 83: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 83:
Ile Leu Asd Gin Vai Pro Phe Ser Vai 1 * 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 84: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 84:
Ile Met Asp Gin Vai Pro Phe Ser Vai 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 85: 154 (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 85:
Ile Ile Asp Gin Vai Pro Phe Ser Vai 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 86: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 86:
Phe Thr Asp Gin Vai Pro Phe Ser Vai 1 s (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 87: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 87:
Trp Thr.AsD Gin Vai Pro Phe Ser Vai 1 ‘ 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 88: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi i (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 88: 155
Tyr Thr Asp Gin Val Pro Phe Ser Val 1*5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 89: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 89 s
Ile Thr Trp Gin Vai Pro Phe Ser Vai 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 90: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 90:
Ile Thr Phe Gin Vai Pro Phe Ser Vai 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 91: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 91:
Ile Thr Tyr Gin Vai Pro Phe Ser Vai 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 92: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon 156 (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 92: lie Thr Ala'Gin Vai Pro Phe Ser Vai 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 93: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 93:
Ile Thr Met Gin Vai Pro Phe Ser Vai 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 94: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 94:
Ile Thr Ser Gin Vai Pro Phe Ser Vai 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 95: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 95:
Ile Leu Trp Gin Vai Pro Phe Ser Vai 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 96: 157 (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 96: lie Leu Phe Gin Vai Pro Phe Ser Vai 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 97: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 97: lie Leu Tyr Gin Vai Pro Phe Ser Vai 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 98: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 98:
Ile Leu Ala Gin Vai Pro Phe Ser Vai 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 99: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 99: 158
Ile Leu Men Gin Vai Pro Phe Ser Vai 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 100: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 100:
Ile Leu Ser Gin Vai Pro Phe Ser Vai 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 101: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 101:
Trp Leu Asp Gin Vai Pro Phe Ser Vai 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 102: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 102:
Phe Leu Asp Gin Vai Pro Phe Ser Vai 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 103: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon 159 (ii) Molekyylityyppi : peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 103:
Tyr Leu Asp Gin Vai Pro Phe Ser Vai 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 104: (i) Sekvenssin ominaisuudet: {A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 104:
Tyr Leu Glu Pro Gly Pro Vai Thr Vai 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 105: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 105:
Tyr Leu Glu Pro Gly Pro Vai Thr Leu 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 106: (i) Sekvenssin ominaisuudet; (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 106:
Tyr Leu Glu Pro Gly Pro Vai Thr Ile 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 107: 160 (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 107:
Phe Leu Glu Pro Gly Pro Vai Thr Ala 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 108: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 108:
Trp Leu Glu Pro Gly Pro Vai Thr Ala 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 109: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 109:
Tyr Leu Tyr Pro Gly Pro Vai Thr Ala 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 110: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 110: 161
Tyx Leu Trp Pro Gly Pro Val Thr Ala 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 111; (i) Sekvenssin ominaisuudet; (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 111:
Tyr Leu Phe Pro Gly Pro Vai Thr Ala l 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 112: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 112:
Tyr Leu Met Pro Gly Pro Vai Thr Ala 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 113: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) ‘Bekvönssin kuvaus: SEQ ID -numero 113: ryr Leu Ser Pro Gly Pro Vai Thr Ala 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 114: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon 162 (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 114:
Tyr Leu Ala Pro Gly Pro Vai Thr Ala 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 115: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 C B) Tyyppi: aminohappo {C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 115:
Tyr Leu Met Pro Gly Pro Vai Thr Vai 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 116: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 116:
Tyr Leu Ser Pro Gly Pro Vai Thr Vai 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 117: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 117:
Tyr Leu Ala Pro Gly Pro Vai Thr Vai 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 118: 163 (i) Sekvenssin ominaisuudet; (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 118:
Tyr Leu Tyr Pro Gly Pro Vai Thr Vai 1*5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 119: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (xi) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 119:
Tyr Leu Phe Pro Gly Pro Vai Thr Vai 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 120: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 120:
Tyr Leu Trp Pro Gly Pro Vai Thr Vai 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 121; (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 661 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: proteiini (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 121: 164
Met Asp Leu Vai Leu Lys Arg Cys Leu Leu His Leu 15 10
Ala Val lie Gly Ala Leu Leu Ala Val Gly Ala Thr 15 20
Lys Val Pro Arg Asn Gin Asd Trp Leu Gly Val Ser 25 30 35
Arg Gin Leu Arcr Thr Lys Ala Trp Asn Arg Gin Leu 40 45
Tyr Pro Glu Tro Thr Glu Ala Gin Arg Leu Asp Cys 50 ' 55 60
Tro Arg Gly Gly Gin Val Ser Leu Lvs Val Ser Asn 65 ‘ 70
Asp Gly Pro Thr Leu lie Gly Ala Asn Ala Ser Phe 75 80
Ser lie Ala Leu Asn Phe Pro-'Gly Ser Gin Lys Val 85 90 95
Leu Pro Asp Gly Gin Val lie Trp Val Asn Asn Thr 100 105 lie lie Asn Gly Ser Gin Val Tro Gly Gly Gin Pro 110 115 120
Val Tyr Pro Gin Glu Thr Asp Asp Ala Cys He Phe 125 ‘ 130
Pro Asp Gly Gly Pro Cys Pro Ser Gly Ser Trp Ser 135 140
Gin Lys Arg Ser Phe Val Tyr Val Trp Lys Thr Trp 145 150 ‘ 155
Gly Gin Tyr Trp Gin Vnl Leu Gly Gly Pro Val Ser 16Ö 165
Gly Leu Ser He Gly T;:r Gly Arg Ala Met Leu Gly 170 175 180
Thr His Thr Met Glu Val Thr Val Tyr His Arg Arg ies iso
Gly Ser Arg Ser Tyr Val Pro Leu Ala His Ser Ser 195 200
Ser Ala Phe Thr He Thr Asp Gin Val Pro Phe Ser 205 210 215
Val Ser Val Ser Gin Leu Arg Ala Leu Asp Gly Gly 220 225
Asn Lys His Phe Leu Arg Asn Gin Pro Leu Thr Phe 230 235 240
Ala Leu Gin Leu His Asp Pro Ser Gly Tyr Leu Ala 245 250
Glu Ala Asp Leu Ser Τ'/r Thr Trp Asp Phe Gly Asp 255 260
Ser Ser Gly Thr Leu Z~- Ser Arg Ala Leu Val Val 260 265 270
Thr His Thr Tyr Leu Glu Pro Gly Pro Val Thr Ala 275 280
Gin Val Val Leu Gin Ala Ala He Pro Leu Thr Ser 205 290 295
Cys Gly Ser Ser Pro Val Pro Gly Thr Thr Asp Gly 300 305 ±65
His Arg Pro Thr Ala Giu Ala Pro Asn Thr Thr Ala 310 315
Gly Gin Val Pro Thr Thr Glu Vai Val Gly Thr Thr 320 325 330
Pro Gly Gin Ala Pro Thr Ala Glu Pro Ser Gly Thr 335 340
Thr S«^ Val Gin Val Pro Thr Thr Glu Val lie Ser 345 350 355 'rhr Ala P^o Val Gin Met Pro Thr Ala Glu Ser Thr 360 365
Giv M»*- Pro Glu Lvs Val Pro Val Ser Glu Val ‘ “ 370 ‘ 375
Met Gly Thr Thr Leu Ala Glu Met Ser Thr Pro Glu 380 385 390
Ala Thr Gly Met Thr Pro Ala Glu Val Ser lie Val 395 400
Val Leu Ser Gly Thr Thr Ala Ala Gin Val Thr Thr 405 410 415
Thr Glu Tro Val Glu Thr Thr Ala Arg Glu Leu Pro 420 425 lie Pro Glu Pro Glu Gly Pro Asp Ala Ser Ser lie 430 435
Met Ser Thr Glu Ser lie Thr Gly Ser Leu Gly Pro 440 445 450
Leu Leu Asp Gly Thr Ala Thr Leu Arg Leu Val Lys 455 460
Arg Gin Val Pro Leu Asp Cys Val Leu Tyr Arg Tyr 465 470 475
Gly Ser Phe Ser Val Thr Leu Aso lie Val Gin Gly 480 * 490
Ile Glu Ser Ala Glu He Leu Gin Ala Val Pro Ser 495 500
Gly Glu Glv Aso Ala Phe Glu Leu Thr Val Ser Cys 505 ‘ ’ 510 515
Gin Gly Gly Leu Pro Lys Glu Ala Cys Met Glu He 520 525
Ser Ser Pro Gly Cys Gin Pro Pro Ala Gin Arg Leu 530 535 540
Cys Gin Pro Val Leu Pro Ser Pro Ala Cys Gin Leu 545 550
Val Leu His Gin He Leu Lys Gly Gly Ser Gly Thr 555 560
Tyr Cys Leu Asn Val Ser Leu Ala Asp Thr Asn Ser 565 570 575
Leu Ma Val Val Ser Thr Gin Leu He Met Pro Gly 580 585
Gin Glu Ala Gly Leu Gly Gin Val Pro Leu He Val 590 595 600
Gly He Leu Leu Val Leu Met Ala Val Val Leu Ala 605 610
Ser Leu He Tyr Arg Arg Arg Leu Met Lys Gin Asp 615 ’ 620
Phe Ser Val Pro Gin Leu Pro His Ser Ser Ser His 625 . 630 635
Trp Leu Arg Leu Pro Arg He Phe Cys Ser Cys Pro 640 645
He Gly Glu Asn Ser Pro Leu Leu Ser Gly Gin Gin 650 655 660
Val 166 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 122: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 122:
Xaa Xaa Xaa Ile Gly Ile Leu Thr Xaa 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 123: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 123:
Xaa Xaa Xaa Gly Gin Tyr Trp Gin Xaa 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 124: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 124:
Xaa Xaa Xaa Gin Vai Pro Phe Ser Xaa 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 125: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 9 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi 167 (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 125:
Xaa Xaa Xaa Pro Gly Pro Val Thr Xaa 1 5 (2) Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 126: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 10 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteisuus: tuntematon (D) Topologia: tuntematon (ii) Molekyylityyppi: peptidi (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 126:
Phe Leu Pro Ser Asp Tyr Phe Pro Ser Vai 1 5 ' 10
Claims (26)
1. Immunogeeninen peptidi, tunnettu siitä, että se 5 (a) koostuu aminohapposekvenssistä, joka valitaan ryhmästä, joka koostuu seuraavista: VLKRCLLHL (SEQ ID NO: 36), SVSVSQLRA (SEQ ID NO: 39), LNVSLÄDTN (SEQ ID NO: 41), ITDQVPFSV (SEQ ID NO: 48) ja TITDQVPFSV (SEQ ID NO: 49), tai 10 (b) sillä on kaava, joka valitaan ryhmästä, joka koostuu seuraavista: X1X2X3GQYWQX4, X1X2X3QVPFSX4 ja XiX2X3PGPVTX4, jolloin Xi on mikä tahansa aminohappo; X2 on mikä tahansa hydrofobinen alifaattinen aminohappo; X3 on mikä 15 tahansa aminohappo; ja X4 on hydrofobinen alifaattinen aminohappo ja jolloin peptidi ei käsitä seuraavia: KTWGQYWQV (SEQ ID NO: 46} , KTWGQYWQVL (SEQ ID NO: 47), YIjEPGPVTA (SEQ ID NO: 40), YIEPGPVTA (SEQ ID NO: 127), ITDQVPFSV (SEQ ID NO: 48) tai TITDQVPFSV (SEQ ID NO: 49).
2 0 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen immunogeeninen peptidi, tunnettu siitä, että kohdan (a) mukainen peptidi sisältää yhdestä nelj ään aminohapposubstituutiota peptidisekvenssissä.
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen immunogeeninen 25 peptidi, tunnettu siitä, että aminohapposubstituut io sijaitsee asemassa, joka valitaan ryhmästä, joka koostuu c\j q seuraavista: (i) ensimmäinen asema, (il) toinen asema, c\j ^ (lii) kolmas asema, (iv) yhdeksäs asema, (v) kymmenes ase- ? ma ja (vi) vähintään kahden kohdista (i) - (v) yhdistelmät CD 30 peptidin sekvenssissä.
£ 4. Patenttivaatimuksen 1 muka inen peptidi, tun- ^ n e t t u siitä, että kohdassa (b) aminohappo Xi: lie vali- o o taan ryhmästä, joka koostuu metioniinista, leusiinista, ^ alaniinista, glysiinistä, treoniinista, isoleusiinista, ^ 35 valiinista, tyrosiinistä, seriinistä, tryptofaanista, f e- nyy1ia1aniinistä, lysiinistä j a asparagiinihaposta. 169
5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen peptidi, tunnettu siitä, että kohdassa (b) X2 valitaan ryhmästä, jo ka koostuu metioniinista, leusiinista, alaniinista, gly-siinistä, isoleusiinista, valiinista ja treoniinista.
6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen peptidi, tunnettu siitä, että kohdassa (b) X3 valitaan ryhmästä, jo ka koostuu metioniinista, leusiinista, alaniinista, gly-siinistä, treoniinista, isoleusiinista, tyrosiinistä, valiinista, tryptofäänistä, fenyylialaniinista, seriinistä, 10 lysiinistä ja asparagiinihaposta.
7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen peptidi, tunnettu siitä, että kohdassa (b) X4 valitaan ryhmästä, jo ka koostuu metioniinista, leusiinista, alaniinista, gly-siinistä, isoleusiinista, valiinista ja treoniinista.
8. Jonkin patenttivaatimuksen 1-7 mukainen immu- nogeeninen peptidi, tunnettu siitä, että peptidin tunnistavat HLA-A2-restriktoituneet kasvaimeen tunkeutuvat lymfosyytit.
9. Jonkin patenttivaatimuksen 1-8 mukainen immu-20 nogeeninen peptidi, tunnettu siitä, että peptidi on luonnollinen, synteettinen tai rekombinantti peptidi.
10. Farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että se käsittää jonkin patenttivaatimuksen 1-9 mukaista peptidiä ja hyväksyttävän täyteaineen, laimentimen tai 25 kantajan.
11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen farmaseuttinen C\1 q koostumus käytettäväksi suojaavien vasta-aineiden tai im- c\j ^ muunisolujen tuotannon stimulaatiossa. S5
12. Rokote nisäkkään immunisoimiseksi, tunnet- co ·- 30 tu siitä, että se sisältää jonkin patenttivaatimuksen jr 1-9 mukaista peptidiä farmakologisesti hyväksyttävässä ^ kantajassa, o
13. Puhdistettu ja eristetty nukleiinihapposek- ^ venssi, tunnettu siitä, että se koodaa jonkin patent- o ^ 35 tivaatimuksen 1-9 mukaista peptidiä. 170
14. Rekombinantti ekspressiovektori, tunnettu siitä,, että se käsittää patenttivaatimuksen 13 mukaisen nukleiinihapposekvenssin.
15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen ekspressiovek-5 tori, tunnettu siitä, että ekspressiovektori on euka- ryoottinen ekspressiovektori tai prokaryoottinen ekspressiovektori .
16. Isäntäsolu, tunnettu siitä, että se on transformoitu tai transfektoitu patenttivaatimuksen 14 tai 10 15 mukaisella rekombinantilla ekspressiovektorilla tavalla, joka sallii rekombinantin ekspressiovektorin koodaaman proteiinin ilmentymisen.
17. Vasta-aine, tunnettu siitä, että se reagoi spesifisesti jonkin patenttivaatimuksen 1-9 mukaisen im- 15 munogeenisen peptidin kanssa.
18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen vasta-aine, tun nettu siitä, että vasta-aineet ovat monoklonaalisia.
19. Patenttivaatimuksen 17 mukainen vasta-aine, tunnettu siitä, että vasta-aineet ovat polyklonaalisia.
20. Menetelmä gpl00-proteiinia koodaavien geenien tunnistamiseksi käyttäen kasvaimeen tunkeutuvia lymfosyyttejä (TIL) , tunnettu siitä, että menetelmässä: (a) eristetään kasvaimeen tunkeutuvia lymfosyytte-jä melanoomaa sairastavan nisäkkään kasvaimesta; 25 (b) viedään melanooma-cDNA-kirj asto nisäkässolu- linjaan; C\J ^ (c) altistetaan nisäkässolut (vaiheesta b) TIL:llle; ^ (d) seulotaan jonkin patenttivaatimuksen 1-9 mu- 9* kaisen peptidin ekspression suhteen nisäkässoluissa, j onka co >- 30 TIL: t tunnistavat; j a En (e) eristetään antigeeniä vastaava cDNÄ. Q_
^ 21. Patenttivaatimuksen 20 mukainen menetelmä, t u n - o n e t t u siitä, että solut vaiheessa (b) valitaan ryhmästä, joka koostuu kasvainsolulinj öistä j a COS 7 -soluista. o ^ 35
22. Menetelmä peptidien immunogeenisyyden määrit tämiseksi, tunnettu siitä, että menetelmässä: 171 (a) valmistetaan joukko jonkin patenttivaatimuksen 1-9 mukaisia peptidejä; (b) inkuboidaan vähintään yhtä peptideistä nisä-kässolulinjan kanssa; 5 (c) altistetaan peptidin kanssa inkuboidut nisä- kässolut kasvaimeen tunkeutuville lymfosyyteille (TIL); ja (d) seulotaan peptidin kanssa inkuboidut solut TIL:n tunnistamisen suhteen.
23. Patenttivaatimuksen 22 mukainen menetelmä, tun- 10 nettu siitä, että peptidit kohdassa (a) sisältävät noin 9-10 aminohappoa.
24. Patenttivaatimuksen 22 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että solut kohdassa (b) valitaan ryhmästä, j onka muodostavat COS-solut, T2-solut ja EBV-transfor- 15 moidut B-solulinjat.
25. Jonkin patenttivaatimuksen 1-9 mukainen im-munogeeninen peptidi, patenttivaatimuksen 14 tai 15 mukainen rekombinantti ekspressiovektori tai patenttivaatimuksen 13 mukainen nukleiinihapposekvenssi käytettäväksi 20 lääkkeen valmistamiseksi.
26. Jonkin patenttivaatimuksen 1-9 mukainen im-munogeeninen peptidi, patenttivaatimuksen 14 tai 15 mukainen rekombinantti ekspressiovektori tai patenttivaatimuksen 13 mukainen nukleiinihapposekvenssi käytettäväksi me- 25 lanooman hoidossa tai ennalta ehkäisyssä. C\1 δ (M ri o CO X cc CL m o o m δ c\j 17 2
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/231,565 US5874560A (en) | 1994-04-22 | 1994-04-22 | Melanoma antigens and their use in diagnostic and therapeutic methods |
| US23156594 | 1994-04-22 | ||
| US08/417,174 US5844075A (en) | 1994-04-22 | 1995-04-05 | Melanoma antigens and their use in diagnostic and therapeutic methods |
| US41717495 | 1995-04-05 | ||
| US9505063 | 1995-04-21 | ||
| PCT/US1995/005063 WO1995029193A2 (en) | 1994-04-22 | 1995-04-21 | Melanoma antigens |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI20115005A FI20115005A (fi) | 2011-01-04 |
| FI123050B true FI123050B (fi) | 2012-10-15 |
Family
ID=22869773
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI20115005A FI123050B (fi) | 1994-04-22 | 2011-01-04 | Melanooma-antigeeni |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (6) | US5874560A (fi) |
| EP (1) | EP2311952A3 (fi) |
| JP (1) | JP2010178739A (fi) |
| CA (1) | CA2722364C (fi) |
| FI (1) | FI123050B (fi) |
Families Citing this family (116)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5856091A (en) * | 1993-03-18 | 1999-01-05 | Ludwig Institute For Cancer Research | Isolated nucleic acid sequence coding for a tumor rejection antigen precursor processed to at least one tumor rejection antigen presented by HLA-A2 |
| ES2224113T5 (es) * | 1994-02-16 | 2009-05-01 | The Government Of The Usa, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Polipeptido antigenico asociado al melanoma, epitopos del mismo y vacunas contra melanoma. |
| US6660276B1 (en) | 1994-02-16 | 2003-12-09 | The University Of Virginia Patent Foundation | Peptides recognized by melanoma-specific cytotoxic lymphocytes, and uses therefor |
| JPH10505481A (ja) * | 1994-04-22 | 1998-06-02 | アメリカ合衆国 | メラノーマ抗原 |
| US5874560A (en) | 1994-04-22 | 1999-02-23 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Melanoma antigens and their use in diagnostic and therapeutic methods |
| ATE244300T1 (de) * | 1996-01-17 | 2003-07-15 | Imp College Innovations Ltd | Immunotherapie mit verwendung von zytotoxischen t lymphozyten (ctl) |
| US7015312B1 (en) * | 1996-02-09 | 2006-03-21 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Antibodies to the protein product encoded by ORF3 of the TRP-1 gene and compositions and kits thereof |
| US20040156861A1 (en) | 1996-07-11 | 2004-08-12 | Figdor Carl Gustav | Melanoma associated peptide analogues and vaccines against melanoma |
| US20020164318A1 (en) * | 1997-02-18 | 2002-11-07 | Houghton Alan N. | Cell lines and vectors for stimulation of an immune response to a differentiation antigen stimulated by an altered antigen |
| US6025470A (en) * | 1997-06-23 | 2000-02-15 | Ludwig Institute For Cancer Research | Isolated nona- and decapeptides which bind to HLA molecules, and the use thereof |
| US6326200B1 (en) * | 1997-06-23 | 2001-12-04 | Ludwig Institute For Cancer Research | Isolated nona-and decapeptides which bind to HLA molecules, and the use thereof |
| US6872518B2 (en) * | 1997-09-22 | 2005-03-29 | University Of Rochester | Methods for selecting polynucleotides encoding T cell epitopes |
| US6451840B1 (en) | 1997-12-05 | 2002-09-17 | Medical College Of Georgia Research Institute, Inc. | Regulation of T cell-mediated immunity by tryptophan |
| US20030138808A1 (en) * | 1998-02-19 | 2003-07-24 | Simard John J.L. | Expression vectors encoding epitopes of target-associated antigens |
| AU759765B2 (en) * | 1998-03-20 | 2003-05-01 | Genzyme Corporation | Compositions and methods for antigen-specific vaccination |
| US6465180B1 (en) * | 1999-03-17 | 2002-10-15 | The Regents Of The University Of California | Detection of premalignant melanocytes |
| GB9908263D0 (en) * | 1999-04-13 | 1999-06-02 | Binding Site The Limited | Eliciting improved immune responses |
| CA2382774A1 (en) * | 1999-05-25 | 2000-11-30 | Human Genome Sciences, Inc. | Meth1 and meth2 polynucleotides and polypeptides |
| WO2001023577A2 (en) * | 1999-09-30 | 2001-04-05 | Institut Pasteur | Hybrid or chimeric polynucleotides, proteins, and compositions comprising hepatitis b virus sequences |
| GB9924351D0 (en) | 1999-10-14 | 1999-12-15 | Brennan Frank | Immunomodulation methods and compositions |
| EP1964573B1 (en) | 1999-10-22 | 2014-11-26 | Aventis Pasteur Limited | Method of inducing and/or enhancing an immune response to tumor antigens |
| JP2003528111A (ja) * | 2000-03-20 | 2003-09-24 | ジェンザイム・コーポレーション | 治療的抗黒色腫化合物 |
| FR2806727A1 (fr) * | 2000-03-23 | 2001-09-28 | Pf Medicament | Molecule d'interet pharmaceutique comprotant en son extremite n-terminale un acide glutamique ou une glutamine sous forme de sel d'addition d'acide fort physiologiquement acceptable |
| US20030194696A1 (en) * | 2000-03-28 | 2003-10-16 | University Of Rochester | Methods of producing a library and methods of selecting polynucleotides of interest |
| EP1268763A2 (en) * | 2000-03-28 | 2003-01-02 | University Of Rochester | Methods of producing a library and methods of selecting polynucleotides |
| NZ521715A (en) * | 2000-04-28 | 2008-01-31 | Mannkind Corp | Method of identifying and producing antigen peptides and use thereof as vaccines |
| US20030215425A1 (en) * | 2001-12-07 | 2003-11-20 | Simard John J. L. | Epitope synchronization in antigen presenting cells |
| US6861234B1 (en) | 2000-04-28 | 2005-03-01 | Mannkind Corporation | Method of epitope discovery |
| US7851212B2 (en) * | 2000-05-10 | 2010-12-14 | Sanofi Pasteur Limited | Immunogenic polypeptides encoded by MAGE minigenes and uses thereof |
| AU2001264764A1 (en) * | 2000-05-31 | 2001-12-11 | Genzyme Corporation | Therapeutic anti-melanoma compounds |
| JP2004525072A (ja) * | 2000-08-04 | 2004-08-19 | ジェンザイム、コーポレーション | 抗黒色腫治療化合物 |
| EP1222928A3 (en) * | 2001-01-16 | 2003-11-05 | Universität Zürich Institut für Medizinische Virologie | Pharmaceutical compositions for treating or preventing cancer, especially melanoma |
| US20020177547A1 (en) * | 2001-01-16 | 2002-11-28 | Karin Molling | Pharmaceutical compositions for treating or preventing cancer |
| EP1359937A4 (en) * | 2001-02-14 | 2004-07-28 | Genzyme Corp | CHANGED PEPTIDE LIGANDS |
| US20040071671A1 (en) * | 2001-02-20 | 2004-04-15 | Leturcq Didier J. | Cell therapy method for the treatment of tumors |
| DK2016930T3 (en) * | 2001-02-20 | 2014-12-08 | Janssen Pharmaceuticals Inc | CD8 cell suspension for use in the treatment of melanomas |
| US7723111B2 (en) * | 2001-03-09 | 2010-05-25 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Activated dual specificity lymphocytes and their methods of use |
| CN1280307C (zh) * | 2001-04-03 | 2006-10-18 | 宝生物工程株式会社 | 细胞毒性t淋巴细胞 |
| EP1752160A3 (en) | 2001-04-06 | 2007-05-30 | Mannkind Corporation | Epitope sequences |
| WO2003008537A2 (en) | 2001-04-06 | 2003-01-30 | Mannkind Corporation | Epitope sequences |
| AU2002305138A1 (en) * | 2001-04-09 | 2002-10-21 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Methods and materials for cancer treatment |
| DE60233231D1 (de) * | 2001-05-15 | 2009-09-17 | Ortho Mcneil Janssen Pharm | Ex-vivo-priming zur erzeugung cd40-ligand spezifischer zytotoxischer t-lymphozyten zur behandlung von autoimmun- und allergischen erkrankungen |
| US20080220015A1 (en) * | 2001-08-03 | 2008-09-11 | Nokad, S.A. | Method of modulating neutralizing antibodies formation in mammals, and uses thereof in gene therapy, animal trangenesis and in functional inactivation of endogenous proteins |
| US20030113919A1 (en) * | 2001-08-17 | 2003-06-19 | Aventis Pasteur, Ltd. | Immunogenic targets for melanoma |
| AU2002331704A1 (en) | 2001-08-22 | 2003-03-10 | The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health A | Peptides of melanoma antigen and their use in diagnostic, prophylactic and therapeutic methods |
| CN1313617C (zh) * | 2001-11-07 | 2007-05-02 | 曼康公司 | 编码靶相关抗原表位的表达载体及其设计方法 |
| US6783944B2 (en) | 2002-01-04 | 2004-08-31 | The Regents Of The University Of California | Genetic changes in atypical nodular proliferations in congenital melanocytic nevi |
| DE10229872A1 (de) * | 2002-07-03 | 2004-01-29 | Curevac Gmbh | Immunstimulation durch chemisch modifizierte RNA |
| US20040018622A1 (en) * | 2002-07-17 | 2004-01-29 | Mitchell Lloyd G. | Spliceosome mediated RNA trans-splicing for correction of skin disorders |
| US20040223949A1 (en) * | 2002-10-22 | 2004-11-11 | Sunnybrook And Women's College Health Sciences Center Aventis Pasteur, Ltd. | Vaccines using high-dose cytokines |
| US20060210588A1 (en) * | 2003-03-26 | 2006-09-21 | Cytos Biotechnology Ag | Hiv-peptide-carrier-conjugates |
| US7537767B2 (en) * | 2003-03-26 | 2009-05-26 | Cytis Biotechnology Ag | Melan-A- carrier conjugates |
| EP1606398A1 (en) * | 2003-03-26 | 2005-12-21 | Cytos Biotechnology AG | Melan-a peptide analogue-virus-like-particle conjugates |
| US7598287B2 (en) | 2003-04-01 | 2009-10-06 | Medical College Of Georgia Research Institute, Inc. | Use of inhibitors of indoleamine-2,3-dioxygenase in combination with other therapeutic modalities |
| US20050186289A1 (en) * | 2003-04-01 | 2005-08-25 | Medical College Of Georgia Research Institute, Inc. | Regulation of T cell-mediated immunity by D isomers of inhibitors of indoleamine-2,3-dioxygenase |
| US7178491B2 (en) * | 2003-06-05 | 2007-02-20 | Caterpillar Inc | Control system and method for engine valve actuator |
| EP1641491B1 (en) | 2003-06-11 | 2008-01-02 | University of Chicago | Increased t-cell tumor infiltration by mutant light |
| US7811983B2 (en) * | 2003-06-11 | 2010-10-12 | The University Of Chicago | Increased T-cell tumor infiltration and eradication of metastases by mutant light |
| WO2004112825A2 (en) * | 2003-06-17 | 2004-12-29 | Mannkind Corporation | Combinations of tumor-associated antigens for the treatment of various types of cancers |
| US7696322B2 (en) * | 2003-07-28 | 2010-04-13 | Catalent Pharma Solutions, Inc. | Fusion antibodies |
| EP1670513B1 (en) * | 2003-10-06 | 2013-01-23 | Cedars-Sinai Medical Center | Cox-2 inhibitors and dendritic cells for use in the treatment of cancer. |
| JP4547538B2 (ja) * | 2003-10-10 | 2010-09-22 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | ダイオキシン結合材料及びダイオキシンの検出又は定量方法 |
| US7803533B2 (en) * | 2003-10-29 | 2010-09-28 | Kumamoto Technology & Industry Foundation | Diagnostic agent for malignant melanoma |
| US7858323B2 (en) | 2004-06-09 | 2010-12-28 | The Regents Of The University Of Michigan | Phage microarray profiling of the humoral response to disease |
| US20060008468A1 (en) * | 2004-06-17 | 2006-01-12 | Chih-Sheng Chiang | Combinations of tumor-associated antigens in diagnostics for various types of cancers |
| AU2005265182B2 (en) * | 2004-06-17 | 2012-06-21 | Mannkind Corporation | Epitope analogs |
| US20060159689A1 (en) * | 2004-06-17 | 2006-07-20 | Chih-Sheng Chiang | Combinations of tumor-associated antigens in diagnostics for various types of cancers |
| US20070154889A1 (en) * | 2004-06-25 | 2007-07-05 | Veridex, Llc | Methods and reagents for the detection of melanoma |
| WO2006037059A2 (en) | 2004-09-27 | 2006-04-06 | The Johns Hopkins Universtiy | Point-of-care mass spectrometer system |
| EP1835932A2 (en) * | 2004-12-29 | 2007-09-26 | Mannkind Corporation | Methods to elicit, enhance and sustain immune responses against mhc class i-restricted epitopes, for prophylactic or therapeutic purposes |
| US20060159694A1 (en) * | 2004-12-29 | 2006-07-20 | Chih-Sheng Chiang | Combinations of tumor-associated antigens in compositions for various types of cancers |
| US20100080792A1 (en) * | 2005-06-16 | 2010-04-01 | Dorothee Herlyn | Method for Identifying a MHC Class II-Dependent Tumor-Associated T Helper Cell Antigen |
| WO2006138568A2 (en) * | 2005-06-17 | 2006-12-28 | Mannkind Corporation | Multivalent entrain-and-amplify immunotherapeutics for carcinoma |
| EP2385060A3 (en) | 2005-06-17 | 2012-02-15 | Mannkind Corporation | Methods and compositions to elicit multivalent immune responses against dominant and subdominant epitopes, expressed on cancer cells and tumor stroma |
| EP2371851A3 (en) * | 2005-06-17 | 2012-08-01 | Mannkind Corporation | Epitope analogues |
| CA2523032A1 (en) | 2005-10-07 | 2007-04-07 | Immunovaccine Technologies Inc. | Vaccines for cancer therapy |
| US20070178113A1 (en) * | 2005-11-22 | 2007-08-02 | Backstrom B T | Superantigen conjugate |
| DE102006035618A1 (de) * | 2006-07-31 | 2008-02-07 | Curevac Gmbh | Nukleinsäure der Formel (I): GlXmGn, insbesondere als immunstimulierendes Adjuvanz |
| JP2010507361A (ja) | 2006-07-31 | 2010-03-11 | キュアバック ゲーエムベーハー | 具体的には免疫刺激剤／アジュバントとしての、一般式（Ｉ）：ＧｌＸｍＧｎ、または一般式（ＩＩ）：ＣｌＸｍＣｎで表される核酸 |
| CA2700573C (en) * | 2006-09-26 | 2016-11-22 | Cedars-Sinai Medical Center | Cancer stem cell antigen vaccines and methods |
| CA2700436C (en) | 2006-09-28 | 2017-04-18 | John S. Yu | Cancer vaccines and vaccination methods |
| US20090093429A1 (en) * | 2007-02-08 | 2009-04-09 | Yang-Xin Fu | Combination therapy for treating cancer |
| EP2650018A3 (en) | 2007-05-14 | 2014-09-03 | The University of Chicago | Antibody-LIGHT fusion products for cancer therapeutics |
| EP2152890A1 (en) * | 2007-05-23 | 2010-02-17 | MannKind Corporation | Multicistronic vectors and methods for their design |
| WO2009030254A1 (en) | 2007-09-04 | 2009-03-12 | Curevac Gmbh | Complexes of rna and cationic peptides for transfection and for immunostimulation |
| EP2197497B1 (en) | 2007-09-27 | 2016-06-01 | ImmunoVaccine Technologies Inc. | Use of liposomes in a carrier comprising a continuous hydrophobic phase for delivery of polynucleotides in vivo |
| US9226959B2 (en) | 2008-01-31 | 2016-01-05 | Curevac Ag | Nucleic acids comprising formula (NuGlXmGnNv)a and derivatives thereof as immunostimulating agent/adjuvant |
| CN102056622B (zh) | 2008-06-05 | 2016-04-06 | 免疫疫苗技术有限公司 | 包含脂质体、抗原、多核苷酸和含疏水物质的连续相的载体的组合物 |
| EP2328923B1 (en) * | 2008-09-02 | 2016-01-13 | Cedars-Sinai Medical Center | Cd133 epitopes |
| WO2010037408A1 (en) | 2008-09-30 | 2010-04-08 | Curevac Gmbh | Composition comprising a complexed (m)rna and a naked mrna for providing or enhancing an immunostimulatory response in a mammal and uses thereof |
| MX2011004467A (es) * | 2008-10-31 | 2011-07-28 | Biogen Idec Inc | Moleculas de objetivo light y usos de las mismas. |
| WO2010088393A2 (en) * | 2009-01-28 | 2010-08-05 | Antigen Express, Inc. | Li-kay hybrid peptides that modulate the immune response to influenza |
| ES2618573T3 (es) | 2009-05-07 | 2017-06-21 | ImmunoCellular Therapeutics,Ltd | Epítopos de CD133 |
| US20110053829A1 (en) | 2009-09-03 | 2011-03-03 | Curevac Gmbh | Disulfide-linked polyethyleneglycol/peptide conjugates for the transfection of nucleic acids |
| US20110274723A1 (en) | 2009-10-23 | 2011-11-10 | Mannkind Corporation | Cancer immunotherapy and method of treatment |
| EP2548025A4 (en) | 2010-03-17 | 2013-09-25 | Univ Michigan | USE OF PHOTOEPITOPES FOR PROFILING AN IMMUNE REACTION |
| US9314516B2 (en) | 2010-05-04 | 2016-04-19 | Cassian Yee | Conditional superagonist CTL ligands for the promotion of tumor-specific CTL responses |
| EP2449113B8 (en) | 2010-07-30 | 2015-11-25 | CureVac AG | Complexation of nucleic acids with disulfide-crosslinked cationic components for transfection and immunostimulation |
| US9040046B2 (en) | 2011-01-31 | 2015-05-26 | Kai Xu | Sodium pump antibody agonists and methods of treating heart disease using the same |
| EP3613852A3 (en) | 2011-07-22 | 2020-04-22 | President and Fellows of Harvard College | Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity |
| BR112014007927B1 (pt) | 2011-10-06 | 2021-04-13 | Immunovaccine Technologies Inc | Composições de lipossoma compreendendo um adjuvante e usos das referidas composições e usos das referidas composições |
| EP2768534A4 (en) * | 2011-10-20 | 2015-04-01 | Neostem Oncology Llc | APC VACCINE AGAINST CANCER |
| CN104284680A (zh) | 2011-12-15 | 2015-01-14 | 芝加哥大学 | 使用对受体的亲和力增加的突变型light分子用于癌症治疗的方法和组合物 |
| WO2013113326A1 (en) | 2012-01-31 | 2013-08-08 | Curevac Gmbh | Pharmaceutical composition comprising a polymeric carrier cargo complex and at least one protein or peptide antigen |
| US20150150821A1 (en) | 2012-07-09 | 2015-06-04 | The Regents Of The University Of California | Vault Immunotherapy |
| EP2956544B1 (en) | 2013-02-14 | 2017-11-01 | Immunocellular Therapeutics Ltd. | Cancer vaccines and vaccination methods |
| EP2970369B1 (en) | 2013-03-14 | 2023-11-22 | TheraSyn Sensors, Inc. | Cholestosome vesicles for incorporation of molecules into chylomicrons |
| US20150044192A1 (en) | 2013-08-09 | 2015-02-12 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for identifying a target site of a cas9 nuclease |
| MX369469B (es) | 2013-08-21 | 2019-11-08 | Curevac Ag | Vacuna contra el virus respiratorio sincitial. |
| WO2015149944A2 (en) | 2014-04-01 | 2015-10-08 | Curevac Gmbh | Polymeric carrier cargo complex for use as an immunostimulating agent or as an adjuvant |
| WO2018027078A1 (en) | 2016-08-03 | 2018-02-08 | President And Fellows Of Harard College | Adenosine nucleobase editors and uses thereof |
| US20190175515A1 (en) * | 2016-08-23 | 2019-06-13 | Jerome J. Schentag | Cholesteryl ester vesicles loading peptides, proteins and nucleic acids into chylomicrons and body cells |
| WO2018165631A1 (en) * | 2017-03-09 | 2018-09-13 | President And Fellows Of Harvard College | Cancer vaccine |
| EP3592853A1 (en) | 2017-03-09 | 2020-01-15 | President and Fellows of Harvard College | Suppression of pain by gene editing |
| US11319532B2 (en) | 2017-08-30 | 2022-05-03 | President And Fellows Of Harvard College | High efficiency base editors comprising Gam |
| EP4146804A1 (en) | 2020-05-08 | 2023-03-15 | The Broad Institute Inc. | Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence |
Family Cites Families (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5990052A (ja) * | 1982-11-16 | 1984-05-24 | Katsu Taniguchi | モノクロ−ナル特異抗体を用いたメラノ−マ診断薬 |
| JPS6147500A (ja) | 1984-08-15 | 1986-03-07 | Res Dev Corp Of Japan | キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法 |
| EP0173494A3 (en) | 1984-08-27 | 1987-11-25 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Chimeric receptors by dna splicing and expression |
| GB8422238D0 (en) | 1984-09-03 | 1984-10-10 | Neuberger M S | Chimeric proteins |
| JPS61134325A (ja) | 1984-12-04 | 1986-06-21 | Teijin Ltd | ハイブリツド抗体遺伝子の発現方法 |
| US5262177A (en) * | 1986-02-07 | 1993-11-16 | Oncogen | Recombinant viruses encoding the human melanoma-associated antigen |
| US5679511A (en) * | 1986-10-06 | 1997-10-21 | Donald Guthrie Foundation For Medical Research, Inc. | CDNA clones for a regulatory protein in the melanin-production pathway |
| DE3990927D2 (en) | 1988-08-08 | 1991-06-06 | Iffiu Michael Attila | Klappbares sesselrad mit stromlinienfoermiger, in drei geteilter und faltbarer verkleidung |
| CA2016841C (en) | 1989-05-16 | 1999-09-21 | William D. Huse | A method for producing polymers having a preselected activity |
| US5342774A (en) * | 1991-05-23 | 1994-08-30 | Ludwig Institute For Cancer Research | Nucleotide sequence encoding the tumor rejection antigen precursor, MAGE-1 |
| WO1992021767A1 (en) * | 1991-06-05 | 1992-12-10 | Bristol-Myers Squibb Company | Me20: monoclonal antibodies and antigen for human melanoma |
| WO1993014189A1 (en) * | 1992-01-21 | 1993-07-22 | Ludwig Institute For Cancer Research | Method for determining cytolytic t cell precursors |
| EP0563485A1 (en) | 1992-03-30 | 1993-10-06 | Schering-Plough | In vitro generation of human dendritic cells and uses thereof |
| AU687733B2 (en) | 1992-04-01 | 1998-03-05 | Rockefeller University, The | Method for in vitro proliferation of dendritic cell precursors and their use to produce immunogens |
| US5856091A (en) | 1993-03-18 | 1999-01-05 | Ludwig Institute For Cancer Research | Isolated nucleic acid sequence coding for a tumor rejection antigen precursor processed to at least one tumor rejection antigen presented by HLA-A2 |
| US5620886A (en) | 1993-03-18 | 1997-04-15 | Ludwig Institute For Cancer Research | Isolated nucleic acid sequence coding for a tumor rejection antigen precursor processed to at least one tumor rejection antigen presented by HLA-A2 |
| US6001975A (en) | 1993-03-18 | 1999-12-14 | Ludwig Institute For Cancer Research | Precursor processed to at least one tumor rejection antigen presented by HLA-A2 |
| WO1994023067A1 (en) * | 1993-03-31 | 1994-10-13 | Abbott Laboratories | Tumor-associated antigens recognized by t cells and the uses of these antigens |
| ES2224113T5 (es) | 1994-02-16 | 2009-05-01 | The Government Of The Usa, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Polipeptido antigenico asociado al melanoma, epitopos del mismo y vacunas contra melanoma. |
| US6660276B1 (en) | 1994-02-16 | 2003-12-09 | The University Of Virginia Patent Foundation | Peptides recognized by melanoma-specific cytotoxic lymphocytes, and uses therefor |
| JPH10505481A (ja) | 1994-04-22 | 1998-06-02 | アメリカ合衆国 | メラノーマ抗原 |
| US5874560A (en) | 1994-04-22 | 1999-02-23 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Melanoma antigens and their use in diagnostic and therapeutic methods |
| US5837476A (en) | 1995-03-03 | 1998-11-17 | Ludwig Institute | Methods for determining disorders by assaying for a non-tyrosinase, tumor rejection antigen precursor |
| US20040156861A1 (en) | 1996-07-11 | 2004-08-12 | Figdor Carl Gustav | Melanoma associated peptide analogues and vaccines against melanoma |
-
1994
- 1994-04-22 US US08/231,565 patent/US5874560A/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-04-05 US US08/417,174 patent/US5844075A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-04-21 EP EP10010559A patent/EP2311952A3/en not_active Withdrawn
- 1995-04-21 CA CA2722364A patent/CA2722364C/en not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-01-16 US US09/007,961 patent/US5994523A/en not_active Expired - Lifetime
-
2007
- 2007-10-31 US US11/932,255 patent/US7803614B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2010
- 2010-02-16 JP JP2010031273A patent/JP2010178739A/ja active Pending
- 2010-08-06 US US12/851,729 patent/US8030280B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2011
- 2011-01-04 FI FI20115005A patent/FI123050B/fi not_active IP Right Cessation
- 2011-07-28 US US13/192,804 patent/US8273724B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20080233637A1 (en) | 2008-09-25 |
| CA2722364C (en) | 2013-12-31 |
| EP2311952A2 (en) | 2011-04-20 |
| US5844075A (en) | 1998-12-01 |
| EP2311952A3 (en) | 2011-06-01 |
| US20110287043A1 (en) | 2011-11-24 |
| CA2722364A1 (en) | 1995-11-02 |
| JP2010178739A (ja) | 2010-08-19 |
| US8273724B2 (en) | 2012-09-25 |
| US7803614B2 (en) | 2010-09-28 |
| US20110027299A1 (en) | 2011-02-03 |
| US8030280B2 (en) | 2011-10-04 |
| US5994523A (en) | 1999-11-30 |
| FI20115005A (fi) | 2011-01-04 |
| US5874560A (en) | 1999-02-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI123050B (fi) | Melanooma-antigeeni | |
| FI121710B (fi) | Melanooma-antigeeni | |
| Wang et al. | Utilization of an alternative open reading frame of a normal gene in generating a novel human cancer antigen. | |
| AU749544B2 (en) | Tumor antigen peptides originating in cyclophilin B | |
| WO2007150077A2 (en) | Cytotoxic t-lymphocyte-inducing immunogens for prevention, treatment, and diagnosis of cancer | |
| EP0871725B1 (en) | P15 melanoma antigens and their use in diagnostic and therapeutic methods | |
| EP1103561B1 (en) | Hla-a2 restraint tumor antigen peptide originating in sart-1 | |
| EP1303287A1 (en) | Mhc peptides over-expressed on prostate cancer cells and methods of use |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG | Patent granted |
Ref document number: 123050 Country of ref document: FI Kind code of ref document: B |
|
| MA | Patent expired |