ES2299490T3 - Procedimiento para producir un transplante o implante de tejido especifico del receptor. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para producir un trasplante de tejido o implante de tejido específico del receptor a partir de una matriz de tejido y de células compatibles con el receptor colonizadas sobre la misma, caracterizado porque la colonización de la matriz de tejido con las células compatibles con el receptor se lleva a cabo con la participación de células adicionales, que producen mediadores, factores o co-factores y los entregan al medio ambiente, que fomentan una regeneración del tejido.

Description

Procedimiento para producir un trasplante o implante de tejido específico del receptor.

La invención se refiere a un procedimiento para producir un trasplante de tejido o implante de tejido específico del receptor a partir de una matriz de tejido y de células compatibles con el receptor colonizadas sobre la misma.

En la medicina de trasplantes existe una gran necesidad de trasplantes apropiados, que provoquen en la menor medida posible reacciones adversas del receptor del trasplante Sólo en determinados casos es posible extraer el trasplante desde el propio cuerpo del receptor y trasplantarlo. Desde el punto de vista inmunológico estos trasplantes son los más inimaginables; en el caso de determinados vasos u órganos así como en el caso de zonas de epidermis a sustituir de gran tamaño no existe sin embargo esta posibilidad. Para determinados órganos actualmente sólo se contemplan prácticamente trasplantes alógenos de donantes externos o - muy frecuente en el campo ortopédico - implantes sintéticos de materiales sintéticos, metales, cerámica, et. o diferentes materiales compuestos. En el caso de usarse materiales alógenos, como por ejemplo órganos de donante, se precisa una inmunosupresión constante que ejerza una carga sobre el organismo del receptor. Sin embargo, con frecuencia se producen reacciones de rechazo como primeras complicaciones. También los materiales artificiales pueden conducir a reacciones de rechazo y procesos de inflamación, que estropean el resultado de la operación.

Por diferentes motivos se intenta actualmente con frecuencia utilizar material xenógeno (de procedencia animal). Aquí es sobre todo ventajosa la mejor disponibilidad de este material con relación a materiales (donantes) alógenos. También aquí un "material biológico" de este tipo es más flexible que un material artificial y se adapta mejor a ciertos puntos del cuerpo del receptor. El material de trasplante xenógeno es sin embargo problemático debido a que es muy antígeno.

Por ello se intenta desde hace tiempo hacer que materiales de trasplante xenógenos, alógenos o sintéticos, es decir tejidos de diferente tipo previstos para un trasplante, sean compatibles con el receptor. Para esto se intenta con frecuencia colonizar mediante acelularización con células compatibles con el receptor tejidos xenógenoso alógenos o materiales matriciales sintéticos (por ejemplo de biopolímeros que pueden desintegrarse biológicamente), en gran medida neutralizados inmunológicamente para el receptor, para de este modo llegar a un trasplante o implante que el receptor en lo posible no reconozca como extraño al cuerpo o al menos se tolere mejor a causa de las células propias del cuerpo disponibles, autológenas.

En el documento DE 19828726 A1 se describe por ejemplo un procedimiento para producir un trasplante bioartificial, en el que en primer lugar se extraen células nativas del tejido conjuntivo intersticial del trasplante La matriz se coloniza después de nuevo con células compatibles para el receptor, con preferencia autológenas, de tal modo que se obtiene un biotransplante específico del receptor.

Para fomentar el crecimiento similar al natural de las células utilizadas para la nueva colonización y la renovación celular permanente y continua, es ventajoso que al cultivo se alimenten determinados mediadores celulares o incluso factores, que estimulen las células crecientes para determinados procesos. Si las células aplicadas específicas del receptor comprenden fibroblastos, entonces es posible por ejemplo con ayuda de mediadores/factores adecuados activar la nueva formación de colágenos y, de este modo, apoyar la conversión de la matriz de tejido en otra autológica para el receptor. Numerosos factores actúan quimiotácticamente o acelerando el crecimiento, en donde el experto conoce básicamente los efectos de los factores aislados en lo que se ha investigado hasta ahora. Mediante la adición de los factores se activan, aceleran y se controlan mediante la clase y la función de los factores los procesos citados.

En el caso del modo de funcionamiento conocido en el estado de la técnica existe el inconveniente de que los factores utilizables son muy caros. Esto limita el abanico aplicativo de los procedimientos antes citados, ya que la producción de trasplantes o implantes específicos del receptor mediante la colonización de determinados cuerpos básicos de trasplante con células compatibles con el receptor ya son muy caros y el procedimiento se encarece todavía más, mediante el uso de mediadores aislados naturales o sintéticos.

Otro problema consiste en la dosificación exacta de los mediadores/factores y co-factores y en el control de su uso óptimo en cuanto a tiempo y posición.

La tarea de la invención consiste por ello, en un procedimiento para producir un trasplante de tejido o implante de tejido específico del receptor a partir de una matriz de tejido y de células compatibles con el receptor colonizadas sobre la misma, en simplificar, abaratar y controlar mejor la alimentación de mediadores, factores, co-factores al cultivo de tejido. Al mismo tiempo se quiere que el procedimiento haga posible una configuración todavía más natural del trasplante o implante obtenido específico del receptor.

Para solucionar este problema se ha previsto conforme a la invención que, en el caso de un procedimiento para producir un trasplante de tejido o implante de tejido específico del receptor a partir de una matriz de tejido y de células compatibles con el receptor colonizadas sobre la misma, la colonización de la matriz de tejido con las células compatibles con el receptor se lleve a cabo con la participación de células adicionales, que producen mediadores, factores o co-factores y los entregan al medio ambiente, que fomentan una regeneración del tejido.

Por una "participación" de células adicionales que entregan mediadores o factores debe entenderse aquí que éstas, adicionalmente a las células compatibles con el receptor utilizadas para la colonización, o bien se introducen directamente en el cultivo de tejido y mediante interacción con las células específicas del receptor se activan para la entrega de los mediadores y factores (de tal modo que accedan directamente al proceso de colonización, es decir que participan) o se cultiven al mismo tiempo en paralelo al cultivo del trasplante o implante de tejido dentro del mismo dispositivo de cultivo (biorreactor) o en un aparato específico (co-cultivo), en donde los productos precipitados en el cultivo paralelo por las células utilizadas conforme a la invención (mediadores, factores, co-factores) se alimentan directamente al cultivo de tejido. A los mediadores pertenecen también mediadores que activan las inflamaciones.

En el caso de un cultivo paralelo de las células que entregan mediadores o factores esto puede producirse en un medio de cultivo habitual, apropiado para el cultivo de la respectiva clase de célula.

Por "células que entregan mediadores o factores" se entienden en el marco de esta invención aquellas que, en comparación, pueden activarse, es decir, excitarse bien para la entrega de mediadores, factores o co-factores que fomentan una regeneración de tejido. Entre éstas se cuentan entre otras macrófagos, determinadas células inmunocompetentes, etc. La activación puede realizarse con preferencia mediante un estímulo (por ejemplo detritus celular) procedente de las células de colonización, alternativamente también mediante la adición de sustancias químicas o pequeñas partículas externas.

Por una regeneración de tejido se entienden procesos reparadores así como procesos de desintegración y transformación del tejido. Las células que entregan mediadores estimulan las células circundantes hacia conversiones en cada caso fenotípicas, y fomentan procesos neosintéticos y regeneración de tejido.

Como células que entregan mediadores o factores pueden utilizarse células autológicas del receptor de trasplante Se han previsto en especial: leucocitos, como linfocitos, macrófagos, granulocitos, células dentríticas, células madre, en especial células madre pluripotentes o células madre somáticas o mezclas de estas células. La utilización de macrófagos se considera actualmente especialmente ventajosa.

En especial en el caso de una co-cultura de las células que entregan mediadores o factores, pero también en el caso de la adición directa al cultivo de tejido de trasplante, estas células pueden activarse mediante la adición de determinadas sustancias para la producción de determinados mediadores, factores o co-factores o para una producción intensificada de estos productos celulares. Para activar las células puede utilizarse entre otras cosas detritus celular procedente del cultivo de tejido.

El procedimiento se controla con preferencia de tal modo que las células que entregan mediadores o factores se alimentan directamente durante la colonización, al menos temporalmente, a un medio de cultivo utilizado para la colonización y/o a la matriz de tejido.

La colonización de la base del tejido con células compatibles con el receptor para formar un trasplante o implante de tejido puede realizarse de una forma conocida en sí misma, por ejemplo como se indica con detalle en el documento DE 198 28 726. La base del tejido o matriz de tejido - por ejemplo una matriz de colágeno natural o sintética, acelular o nativa o un tejido sintético, como una estructura biopolimérica fibrosa o reticular - se encuentra aquí normalmente en un medio de cultivo al que pueden alimentarse diferentes aditivos (llamado también medio acondicionador, queriendo indicar el acondicionamiento del tejido para la colonización). El medio de cultivo puede moverse por ejemplo sobre el tejido o hacerse circular en un circuito sobre el tejido. El medio de cultivo puede adicionarse también en intervalos y dejarse después durante un tiempo sobre el cultivo; las condiciones óptimas se basan entre otras cosas según la clase de tejido a colonizar.

Como medio de cultivo o medio acondicionador puede utilizarse un medio nutritivo usual, que dado el caso puede estar dotado de diferentes aditivos. Los medios nutritivos apropiados para ello son conocidos por el experto.

En el medio se introducen células específicas del receptor, ya sea al principio de la colonización, continuamente o en varios lotes. Por células específicas del receptor se entienden para el receptor células autológenas, elegidas lo más compatibles posible inmunológicamente para el receptor (compatibles) alógenas o alógenas o xenógenas, genéticamente modificadas. Las células pueden considerarse compatibles inmunológicamente si se han clasificado como similares al receptor mediante pruebas o si se han adaptado al receptor en especial mediante modificación
genética.

También pueden alimentarse en diferentes momentos de la colonización o manipulación diferentes clases de células, de tal modo que sobre el tejido puedan instalarse diferentes capas celulares de células de diferentes clases. Asimismo pueden aplicarse localmente diferentes células, por ejemplo diferentes células sobre la superficie y la cara inferior de un trasplante de epidermis o diferentes células sobre la cara interior y la cara exterior de un vaso tubular. Como células compatibles con el receptor se contemplan básicamente todas las clases de células corporales por ejemplo:

Células de tejido conjuntivo (entre otras fibroblastos, fibrocitos), células musculares (miocitos), células endoteliales, células de la epidermis (entre otras queratinocitos), células diferenciadas en células de órganos (células del corazón, células del riñón, etc.), con preferencia en órganos estructurados con armadura colágena, en general todas las células que pueden ofrecerse de forma conveniente para la transformación de un tejido determinado, previsto para el implante.

En el caso del trasplante de tejido puede tratarse fundamentalmente de cualquier tejido transplantable. Entre estos se cuentan en especial: vasos generales, como aortas y venas, válvulas aórticas, válvulas del corazón, partes de órganos y órganos enteros, trozos de epidermis, fibras, córneas, cartílagos, huesos, laringe, corazón, tráqueas, nervios, menisco, disco intervertebral, uréteres, uretra, vejiga, etc.

Los implantes sobre la base de matrices o armaduras sintéticas son apropiadas, entre muchas otras posibilidades, para venas, válvulas del corazón, córneas, vejigas y epidermis.

Las células que entregan mediadores o factores pueden alimentarse a continuación, como se ha descrito anteriormente, durante la colonización al menos temporalmente al medio de cultivo de tejido y/o a la matriz de tejido. Aquí es posible aplicar directamente sobre la matriz de tejido células que entregan mediadores o factores al principio de la colonización, de una vez o junto con las células compatibles con el receptor. Las células que entregan mediadores o factores pueden alimentarse también con el medio de cultivo por lotes o continuamente, en donde también puede producirse un cambio entre medio de cultivo sin y con células que entregan mediadores o factores.

En un perfeccionamiento de la invención está también previsto que para alimentación de las células que entregan mediadores o factores se utilice sangre, que contenga por naturaleza las células que entregan mediadores o factores deseadas, con preferencia sangre propia del receptor del trasplante o implante. Esta sangre puede concentrarse con relación a los componentes deseados o pueden separarse componentes sanguíneos y utilizarse aquí.

De forma más preferida las células activables para la entrega de mediadores o factores pueden mantenerse en un cultivo, que está unido de tal modo al tejido durante la colonización que los mediadores/factores entregados por el cultivo celular se alimentan al tejido durante la colonización. Como se ha descrito anteriormente este co-cultivo de células que entregan mediadores o factores es posible como cultivo paralelo por fuera o dentro del dispositivo para el cultivo de tejido.

El cultivo de células que entregan mediadores o factores, por ejemplo un cultivo de macrófagos, puede realizarse en un biorreactor que está unido de forma adecuada al reactor, en el que se cultiva y manipula el trasplante o implante específico del receptor. Los factores extraídos del biorreactor pueden alimentarse en la cantidad adecuada al medio de cultivo acondicionador, periférico o que se alimenta por lotes.

Alternativamente puede mantenerse separado del medio acondicionador el cultivo de macrófagos o el cultivo de otras células que entregan mediadores o factores o células que entregan una mezcla de mediadores o factores, durante los pasos de la manipulación con células compatibles con el receptor mediante una lámina, membrana o pared de separación permeable a los mediadores y/o factores celulares, de tal modo que los mediadores y/o factores formados pueden entregarse continuamente al medio acondicionador.

La manipulación del tejido previsto para el trasplante tendrá lugar normalmente en un biorreactor, en el que el medio de cultivo se poner a disposición y hace circular dentro de un espacio determinado. Dentro de este espacio puede configurarse con una pared de separación meable un espacio de cultivo para el cultivo de las células o macrófagos utilizados conforme a la invención, de tal modo que los mediadores y/o factores celulares formados pueden derivar continuamente al medio acondicionador.

Como células que entregan mediadores o factores pueden utilizarse en especial: células de la familia de los leucocitos, pero también células madre periféricas o centrales (de sangre, tejido graso, órganos y médula ósea), con preferencia células madre pluripotentes, como por ejemplo todas las formas de los glóbulos blancos, granulocitos, linfocitos, macrófagos, monocitos, células de médula ósea, células de bazo, células memory, células thymus.

Para la colonización con ayuda de células compatibles con el receptor se seleccionan en cada caso células o mezclas de células, que se ajustan al respectivo tipo de tejido. Las células compatibles con el receptor, con preferencia células autológenas o alógenas o xenógenas, modificadas genéticamente y por medio de esto adaptadas específicamente al receptor, comprenden aquellas células que son adecuadas para estructurar el tejido deseado, y a elección además aquellas que pueden estimular y/o controlar también la transformación de tejido, como por ejemplo células que producen factores celulares y/o células que influyen quimiotácticamente, incluyendo las células que entregan mediadores o factores citadas anteriormente.

Una ventaja de la invención, es decir de la participación de células que producen mediadores, factores y co-factores y los entregan al medio de cultivo acondicionador, para el cultivo de un trasplante o implante colonizado con células compatibles con el receptor, estriba en que para la finalidad respectiva pueden producirse también mediadores/factores especialmente adecuados durante un paso de cultivo necesario de todas formas, de tal modo que puede prescindirse de la utilización de factores adicionales caros y menos específicos.

Mediante la prefijación de células determinadas que pueden activarse para la entrega de mediadores o factores y, dado el caso, una activación adecuada de estas células puede influirse en la entrega de los mediadores/factores y de este modo controlarse o acelerarse la instalación del tejido.

Como matriz de tejido puede utilizarse - según el caso aplicativo - por ejemplo una matriz de tejido sintética, que puede comprender por ejemplo uno o más de los siguientes materiales: poliglactin, polidioxanon, poliéster desintegrable biológicamente, poliuretano, poliacril, colágenos, fibrinógenos. Alternativamente pueden utilizarse también, como ya se ha descrito anteriormente, matrices de tejido xenógenos o alógenos nativos o acelularizados.

A continuación se describe la invención con base en ejemplos:

Transformación acelerada de polímeros técnicos y biológicos como sustancias portadoras (matriz de tejido) para nuevos tejidos bioartificiales

Se utilizan polímeros desintegrables biológicamente como materiales de matriz sintéticos. En el caso de los materiales sintéticos puede tratarse de materiales enriquecidos de origen biológico. Estos materiales se conforman en matrices "sintéticas" en comparación con tejidos biológicos acelularizados).

La desintegración polimérica puede realizarse hidrolíticamente o enzimáticamente.

Pueden usarse polímeros biodegradables como poliglactin, polidioxanon, poliéster, poliuretano, poliacril, polímeros biológicos especiales y (bio)macromoléculas, como colágenos o fibrinógenos, los componentes clásicos de una matriz extracelular.

De forma correspondiente a un procedimiento usual se coloniza una base sintética de tejido (por ejemplo una válvula de corazón sintética) con las células elegidas específicas del receptor. El cultivo se realiza en un medio habitual para ello (por ejemplo DMBM; WE). Durante la colonización se enjuaga el implante de tejido temporalmente, a intervalos, con sangre propia del receptor del implante, sangre propia concentrada o con medio de cultivo alternado con componentes sanguíneos. En esta fase se adhieren macrófagos selectivamente a la matriz expuesta. Los linfocitos y macrófagos reciben estímulos inmunoestimulantes mediante los productos de desdoblamiento de los polímeros y se activan, para activar los miofibroblastos autológenos a través de activadores endógenos y sintetizar la matriz. Esto es especialmente importante, ya que después puede producirse de forma acelerada por ejemplo la desintegración hidrolítica de los polímeros, de tal modo que ésta es considerablemente más corta de lo que era posible hasta ahora. Esto hace posible a su vez el implante de un producto más acabado en vivo sin polímeros residuales existentes, que en vivo podrían provocar inestabilidades indeseadas en el caso de una descomposición repentina acelerada o incluso reacciones de cuerpos extraños.

Alternativamente a un cultivo en sangre pueden co-cultivarse preparaciones de plaquetas sanguíneas (preparación con unos 3.000 g y glóbulos blancos 1.800 g) por separado en regiones diferentes del biorreactor o sincrónicamente en un aparato específico. En este último caso se alimentan los productos de cultivo así recibidos al cultivo de tejido en el verdadero biorreactor de tejido.

Inducción de un remodelado en válvulas de corazón para formar un perfil celular-fisiológico normal

La fase de preexpansión de las células vasculares del receptor precisa unos 10 días en los procedimientos habituales. Las válvulas de corazón se introducen después en un biorreactor y se colonizan luminalmente como es habitual mediante el uso de los fibroblastos preexpandidos, células de músculos lisos (SMC) y endoteliales. En paralelo a esto se aplican mediante una jeringa sobre y en la matriz, como pool conjunto, células madre de médula ósea obtenidas recientemente. Allí tiene lugar, bajo la micropresión ambiental local de la posición espacial de la matriz extracelular, un control diferenciador de las células madre. El estado de activación de las células madre se activa adicionalmente mediante productos de descomposición celular matriciales y locales. Mediante el uso de células endotélicas vasculares y células de músculos lisos del receptor tiene lugar una influencia recíproca con las células madre. Asimismo se generan localmente por medio de esto las células específicas del tejido. Esto significa que a causa de las tomas biópsicas, por ejemplo durante la creación de válvulas de corazón de la aorta, tiene que utilizarse tejido que no puede obtenerse directamente del tejido objetivo. Esto implica por ejemplo material venoso, que posee otra diferenciación molecular y fenotípica como células arteriales de la válvula de aorta. Asimismo faltan diferentes tipos de células, que por ejemplo sólo se presentan en cúspides de válvula, como por ejemplo sistemas celulares neuronales.

Las células madre diferencian bajo la micropresión ambiental local los parámetros matriciales disponibles en la válvula (idealmente de una matriz de válvula de aorta por ejemplo alógena) en tipos de células específicos de la posición, incluyendo sistemas celulares neuronales que son responsables de procesos locales de inervación. Después del implante en vivo las células madre pueden hacer también posible la repoblación con las células arteriales. Las EC son sin embargo también importantes, ya que en el sistema vascular se reduce la trombogenicidad. Mediante las FB y SMC, también de origen venoso, se consigue al menos una iniciación del proceso de remodelación en la matriz específica del receptor, que mediante los pools celulares reclutados de las células madre se reconduce, corrige y termina.

Claims (13)

1. Procedimiento para producir un trasplante de tejido o implante de tejido específico del receptor a partir de una matriz de tejido y de células compatibles con el receptor colonizadas sobre la misma, caracterizado porque la colonización de la matriz de tejido con las células compatibles con el receptor se lleva a cabo con la participación de células adicionales, que producen mediadores, factores o co-factores y los entregan al medio ambiente, que fomentan una regeneración del tejido.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque las células entregan mediadores o factores que activan inflamaciones.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque las células que entregan mediadores o factores comprenden células autológicas del receptor de trasplante, en especial leucocitos, células dentríticas, macrófagos o mezclas de estas células.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque las células que entregan mediadores o factores comprenden células precursoras o células madre.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque las células que entregan mediadores o factores se alimentan durante la colonización, al menos temporalmente, a un medio de cultivo utilizado para la colonización y/o a la matriz de tejido.

6. Procedimiento según la reivindicación 5, caracterizado porque la alimentación se realiza mediante la adición de sangre propia o componentes de sangre propia del receptor del trasplante o implante.

7. Procedimiento según la reivindicación 5 ó 6, caracterizado porque las células que entregan mediadores o factores se mantienen en un cultivo que está unido al tejido durante la colonización, de tal forma que los mediadores/factores entregados por el cultivo de las células se alimentan al tejido durante la colonización.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, caracterizado porque puede mantenerse separado del medio el cultivo de las células que entregan mediadores o factores, con preferencia un cultivo de macrófagos, durante la colonización o manipulación con células compatibles con el receptor mediante una lámina, membrana o pared de separación permeable a los mediadores y/o factores celulares, y los mediadores y/o factores formados se entregan continuamente al medio de cultivo de tejido-trasplante.

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque como matriz de tejido se utiliza una matriz de tejido sintética.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, caracterizado porque la matriz de tejido utilizada comprende uno o más de los siguientes materiales: poliglactin, polidioxanon, poliéster desintegrable biológicamente, poliuretano, poliacril, colágenos, fibrinógenos.

11. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque como matriz de tejido se utiliza una matriz de tejido nativa o acelularizada, xenógena o alógena.

12. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque las células compatibles con el receptor utilizadas son células autológicas del receptor de trasplante o implante.

13. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque las células compatibles con el receptor utilizadas para el receptor son células elegidas como compatibles, alógenas o alógenas modificadas genéticamente.