JPH11349598A

JPH11349598A - 血管内皮細胞増殖抑制因子およびその用途

Info

Publication number: JPH11349598A
Application number: JP10162037A
Authority: JP
Inventors: Naoyuki Taniguchi; 直之谷口; Shigeki Higashiyama; 繁樹東山
Original assignee: Ono Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Ono Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1998-06-10
Filing date: 1998-06-10
Publication date: 1999-12-21

Abstract

(57)【要約】【構成】エンドレギュリン、その精製方法、その抗
体、それらを含有する薬学的組成物およびその作動剤ま
たは拮抗剤のスクリーニング方法。【効果】本発明のエンドレギュリンは、マクロファー
ジが産生する因子であり、血管平滑筋には作用すること
なく、血管内皮細胞の増殖を特異的に抑制する。エンド
レギュリンを含めたエンドレギュリンの作動剤は、血管
の内皮細胞の増殖を抑制するため、固形ガンの成長、ガ
ン転移、糖尿病性網膜症、アテローム性動脈硬化症、新
生血管性緑内障、リューマチ性関節炎の予防／治療に用
いることができる。また、エンドレギュリンの抗体は、
血管新生を促すので、排卵、胎盤形成および創傷治癒に
おいて起こる異常を正常化させることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規な血管内皮細
胞増殖抑制因子に関する。更に詳細に述べると、新規な
血管内皮細胞増殖抑制因子、その抗体、その因子または
抗体を含有する薬学的組成物、その因子の作動剤および
拮抗剤のスクリーニング方法に関する。

【０００２】

【発明の背景】血管内皮細胞の増殖は、増殖因子と増殖
阻害因子のバランスによって厳密に制御されている（Sc
ience, 235, 442 (1987)およびAnnu. Rev. Physiol. 5
3, 217(1991)）。血管内皮細胞により新しい血管が形成
される過程、すなわち血管新生は多くの生理的な現象に
関っている。血管新生は、正常な状態では排卵、胎盤形
成および創傷治癒過程において起こるが、固形ガンの成
長、ガン転移、糖尿病性網膜症、アテローム性動脈硬化
症、新生血管性緑内障、リューマチ性関節炎などの種々
の臨床過程においても重要な役割を果たしている（Nat.
Med. 1, 27-31 (1995)およびCell 86, 353 (1996)）。

【０００３】血管内皮細胞増殖制御のバランスは、通
常、抑制性に傾いているので、線維芽細胞成長因子−１
（ＦＧＦ−１）、線維芽細胞成長因子−２（ＦＧＦ−
２）、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）等の血管新生
因子が広範囲に分布しているにも関わらず、成熟組織に
おいて血管内皮細胞は静止状態にある。加えて、多くの
タンパクが培養内皮細胞の増殖を抑制することが示され
ている。これらはＴＧＦ（トランスフォーミング成長因
子）−β１、ＴＮＦ（腫瘍え死因子）−α、血小板因子
４、インターフェロン−γ、軟骨由来阻害因子（ＣＤ
Ｉ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、トロンボスポンディ
ン−１、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、アンジオスタチ
ン、エンドスタチン等である。またインテフリンαｖβ
３抗体も内皮細胞の増殖を抑制することが知られてい
る。

【０００４】マクロファージは、通常、創傷などのよう
に生理的に血管新生が生じる部位、さらには固形ガン、
アテローム性動脈硬化プラークなどのように病的に血管
新生が生じる部位に存在している。そのため、マクロフ
ァージは可溶性メディエーターの産生を通して血管新生
（内皮細胞の増殖）を制御していると考えられている
（J. Leukocyte Biol. 39, 233(1986), Arch. Dermato
l. 121, 1018(1985), LabInvest. 51, 635(1984)）。

【０００５】また、マクロファージはＦＧＦ−２、ＰＤ
ＧＦ（血小板由来成長因子）、ＶＥＧＦなどの多くの血
管新生因子を産生・放出することに加えて、細胞外マト
リックス構成成分を調節することなどにより血管新生過
程に影響を与えることが知られている（Biochem. Bioph
ys. Res. Commun. 126, 358(1985), J. Clin. Invest.
78, 61(1986)およびMol. Biol. Cell 3, 211(1992)）。

【０００６】

【発明の概要】先の研究によってＵ−９３７細胞株（マ
クロファージ由来）はＯＳＭ、ＬＩＦ（白血球遊走阻止
因子）、ＴＧＦ−β１およびＴＮＦ−αのような血管内
皮細胞成長阻害因子、ＶＥＧＦのような血管内皮細胞成
長因子を産生することが報告されている。本発明者等
は、マクロファージが内皮細胞増殖因子と増殖阻害因子
のバランスを生み出しているとの仮説に基づき、Ｕ−９
３７細胞株の培養上清を詳細に分析した。すなわち、フ
ォルボールエステル処理したヒトマクロファージ様Ｕ−
９３４細胞株の培養上清液から、血管内皮細胞増殖抑制
因子を単離・精製した。精製には、銅親和性、ヘパリン
親和性、陽イオン交換樹脂および逆相クロマトグラフィ
ーを用いた。その結果、還元条件下、非還元条件下とも
に６５ｋＤａのバンドを示すタンパクでかつ、新規な配
列を有する血管内皮細胞阻害因子（以下、本因子をエン
ドレギュリンと称する。）が得られた。

【０００７】トリプシン消化による断片のアミノ酸配列
分析およびＢＬＡＳＴ検索の結果から、この血管内皮阻
害因子は既知タンパクと相同性が全くない、新規なアミ
ノ酸配列を有することが明らかになった。精製されたタ
ンパク（エンドレギュリン）は、血管内皮細胞の増殖を
容量依存的に阻害し、一方平滑筋細胞の増殖には影響を
与えなかった。この因子は、線維芽細胞成長因子−２
（ＦＧＦ−２）あるいは血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧ
Ｆ）で誘発された血管内皮細胞の増殖をともに阻止し
た。また、この因子はＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β１よりも
強力に血管内皮細胞の増殖を阻害した。本発明者は以上
の知見に基づいて本発明を完成した。

【０００８】

【発明の構成】本発明は、（１）エンドレギュリン、
（２）その抗体、（３）それらを含有する薬剤および
（４）エンドレギュリンを用いるエンドレギュリン作動
剤または拮抗剤のスクリーニング方法に関する。

【０００９】本発明は、実質的に精製されたエンドレギ
ュリンに関する。ここで、実質的に精製されたエンドレ
ギュリンとは、一般に精製時のポリペプチドの９０％以
上、例えば９５、９８または９９％が目的とするエンド
レギュリンであることを意味する。

【００１０】さらに、本発明には本発明のエンドレギュ
リンの単離・精製方法も含まれる。単離・精製方法は、
以下の手順で行なわれる。１）細胞の培養ヒト組織リンパ細胞腫株をウシ胎児血清培地で培養す
る。培養細胞をフラスコに播種し、１２−ｏ−テトラデ
カノイルフォルボール−１３−アセテート(TPA,phorbol
ester)の存在下、インキュベーションする。処理後、
血清無添加のＲＰＭＩ／ＰＳ（Roswell Park Memorial
Institute／ペニシリン、ストレプトマイシン）に培地
を交換し、数日間培養する。

【００１１】２）培養液上清培養液を遠心分離により、細胞残渣と上清に分離する。

【００００】３）増殖阻害活性の測定内皮細胞および血管平滑筋をダルベッコ改変イーグル培
養液で培養し、マイクロプレートに一定細胞数になるよ
うに播種する。インキュベーション後、培養液を新鮮な
ものに交換し、サンプルを加えて一定時間インキュベー
ションを行なう。［³Ｈ］チミジンを添加し、チミジン
の取り込み量（ＤＮＡ合成量）から細胞の増殖阻害（抑
制）活性を計算する。

【００１２】４）限外ろ過２）で得た培養上清液を限外ろ過により濃縮する。５）銅キレートカラムによる精製平衡化させた銅キレートセファロースカラムに濃縮液を
かけ、結合したタンパクを溶出させる。

【００１３】６）ヘパリン親和性カラムによる精製５）で得たタンパク液をヘパリン親和性カラムにかけ、
結合したタンパクを溶出させる。７）陽イオン交換樹脂カラムによる精製６）で得たタンパク液をイオン交換樹脂カラムにかけ、
結合タンパクを塩化ナトリウムの濃度勾配による溶出に
より分画し、阻害活性を有する画分を集める。

【００１４】８）フェニル逆相カラムによる精製７）で得た画分をフェニル逆相カラムにかけ、結合タン
パクをアセトニトリルの濃度勾配による溶出により分画
し、阻害活性を有する画分を集める。９）Ｃ４逆相カラムによる精製８）で得た画分をＣ４逆相カラムにかけ、結合タンパク
をアセトニトリルの濃度勾配による溶出により分画し、
阻害活性を有する画分を集める。１０）電気泳動によるバンドの確認９）で得られたエンドレギュリン画分を電気泳動によ
り、分子量約６５ｋＤａの単一バンドであることを確認
する。

【００１５】本発明は、本発明におけるエンドレギュリ
ンの抗体も含む。さらに本発明におけるエンドレギュリ
ンの抗体の製造方法をも含む。抗体は、宿主動物（例え
ば、ラットやウサギ等）に本発明のエンドレギュリンを
接種し、免疫血清を回収する通常の方法により製造する
ことができる。

【００１６】本発明には、本発明のエンドレギュリン、
その抗体と薬学的に許容される賦形剤および／または担
体を含有する薬学的組成物も含まれる。本発明には、さ
らに本発明のエンドレギュリンを用いたエンドレギュリ
ンの作動剤または拮抗剤のスクリーニング方法も含まれ
る。スクリーニングは、例えばバッファー中に本願のエ
ンドレギュリンとスクリーニングしようとする化合物を
共存させ、合成基質に発色剤をつけたもの等を用いて、
吸光度等から生物活性を測定することにより行なわれ
る。

【００１７】

【発明の効果】本発明のエンドレギュリンは、マクロフ
ァージが産生する因子であり、血管平滑筋には作用する
ことなく、血管内皮細胞の増殖を特異的に抑制する。本
発明のエンドレギュリンの作動剤、拮抗剤を得るための
スクリーニングを行なう上で、エンドレギュリンは必須
のものである。エンドレギュリンを含めたエンドレギュ
リンの作動剤は、血管の内皮細胞の増殖を抑制するた
め、固形ガンの成長、ガン転移、糖尿病性網膜症、アテ
ローム性動脈硬化症、新生血管性緑内障、リューマチ性
関節炎の予防／治療に用いることができる。

【００１８】本発明のエンドレギュリンの抗体は、上記
疾患の診断のために用いることができる。本発明のエン
ドレギュリンの抗体を用いることにより、生体における
本発明エンドレギュリンの定量が行なえ、これによって
本発明エンドレギュリンと疾患との関係の研究あるいは
疾患の診断等に利用することができる。抗体はエンドレ
ギュリンあるいはその断片を抗原として用い、常法によ
り作製することができる。さらに、本発明のエンドレギ
ュリンを用いることにより本ポリペプチドと結合するタ
ンパク（受容体）の精製あるいはその遺伝子をクローニ
ングすることができる。また、本発明エンドレギュリン
の作動剤、拮抗剤の検索にも用いることができる。ま
た、エンドレギュリンの拮抗剤および抗体は血管新生を
促すので、排卵、胎盤形成および創傷治癒において起こ
る異常を正常化させることができる。

【００１９】

【医薬品への適用】本発明のエンドレギュリンまたはそ
の抗体は通常、全身的または局所的に投与される。本発
明のエンドレギュリンまたはその抗体を投与する際に
は、経口投与のための固体組成物、液体組成物およびそ
の他の組成物、非経口投与のための注射剤、外用剤、坐
剤等として用いられる。経口投与のための固体組成物に
は、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤等が含まれ
る。カプセルには、ソフトカプセルおよびハードカプセ
ルが含まれる。

【００２０】投与量は、年齢、体重、症状、治療効果、
投与方法、処理時間等により異なるが、通常、成人一人
あたり、一回につき、１００μｇから１００ｍｇの範囲
で、一日一回から数回経口投与されるかまたは、成人一
人当り一回につき１０μｇから１００ｍｇの範囲で、一
日一回から数回非経口投与される。もちろん前記したよ
うに、投与量は種々の条件により変動するので、上記投
与量より少ない量で十分な場合もあるし、また範囲を超
えて必要な場合もある。

【００２１】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に
説明するが、これらは本発明の範囲を制限するものでは
ない。実施例において使用したウシ大動脈血管内皮細胞
および血管平滑筋（ＳＭＣ）はNature 227, 680 (1970)
に記載の方法により、ウシの胸部大動脈から取り出し
た。ＦＧＦ−２、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ−β１およびＴＮＦ
−αは、シグマーアルドリッチ社より購入した。

【００２２】実施例１：Ｕ−９３７細胞培養上清液の調
製ヒト組織リンパ細胞腫株Ｕ−９３７をアメリカンタイプ
カルチャーコレクション(American Type Culture Colle
ction)社から購入し、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、
ペニシリン（１００単位／ｍｌ）および硫酸ストレプト
マイシン（１００μｇ／ｍｌ）を加えたＲＰＭＩ−１６
４０培地で培養した。Ｕ−９３７細胞をＴ−１５０フラ
スコに１×１０⁸個／５０ｍｌの密度で播種し、１２−
ｏ−テトラデカノイルフォルボール−１３−アセテート
(TPA, phorbol ester)（６０ｎＭ）の存在下、１０％ウ
シ胎児血清（ＦＣＳ）、ペニシリン（１００単位／ｍ
ｌ）および硫酸ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍ
ｌ）を加えたＲＰＭＩ−１６４０を用いて、２４時間イ
ンキュベーションした。ＴＰＡ２４時間処理後、培養液
を血清無添加のＲＰＭＩ／ＰＳに交換した。培養上清液
を５〜７日間４８時間毎に採取し、新鮮培養液と交換し
た。集められた培養液を10,000ｒｐｍで１０分間遠心分
離し、細胞残渣を除去した。タンパク分解を防ぐため
に、上清に塩酸ベンザミジン（シグマ−アルドリッチ
社）を終濃度１ｍＭとなるように添加した。上清は精製
までの間、−２０℃で保存した。

【００２３】実施例２：増殖阻害の測定ウシ動脈内皮細胞および血管平滑筋を１０％ウシ胎児血
清およびペニシリン（１００単位／ｍｌ）および硫酸ス
トレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を添加したダル
ベッコ改変イーグル培養液（Ｄ−ＭＥＭ）で培養した。
細胞数アッセイのために、Ｄ−ＭＥＭ／１０％ＦＣＳ／
ＰＳに再懸濁した細胞を６穴マイクロプレートに２×１
０³細胞／２ｍｌ／ウェルの濃度で播種した。プレート
を３７℃で２４時間インキュベートした後、培養液をＤ
−ＭＥＭ／５％ＦＣＳ／ＰＳに交換した。３時間後、阻
害活性を測定するサンプルを培養液に添加した。７２時
間のインキュベーション後、細胞を採取し、コールター
カウンター(Coulter electronics社)で細胞数を計測し
た。ＤＮＡ合成のアッセイのために、内皮細胞をＤ−Ｍ
ＥＭ／１０％ＦＣＳ／ＰＳに再懸濁し、９６穴マイクロ
プレートに２×１０³セル／２００μｌ／ウェルの濃度
で播種した。プレートを３７℃で、２４時間インキュベ
ーションした後、培養液をＤ−ＭＥＭ／５％ＦＣＳ／Ｐ
Ｓに交換した。

【００２４】３時間後、阻害活性を測定するためにサン
プルおよび／または成長因子（４ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−
２あるいは１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ）を添加した。２
４時間のインキュベーション後、１０μｌ（0.2μキュ
リー）の［³Ｈ］チミジンを添加し、さらに６時間培養
を続けた。ＤＮＡに取り込まれる［³Ｈ］チミジン量を
液体シンチレーションカウンター（１４５０マイクロベ
ータトリラックス、アマーシャムファルマシアバイオテ
ック社）を用いて測定した。取り込まれた［³Ｈ］チミ
ジン量、すなわちＤＮＡ合成量をコントロールサンプル
と比較して増殖阻害活性を調べた。

【００２５】実施例３：内皮細胞増殖阻害因子の精製１）限外ろ過および銅キレートカラムクロマトグラフィ
ーＵ−９３７細胞株の血清フリーの培養上清（５０リッタ
ー）を限外ろ過(S1Y210 spiral-wound membrane, molec
ular weight cut off 10,000；アミコン社)により1,800
ｍｌに濃縮した。硫酸銅で飽和し、塩化ナトリウム（0.
5Ｍ）を加えたトリス塩酸バッファー（２０ｍＭ、ｐＨ
8.0）で平衡化させた銅キレートセファロースカラム
（５０×５０ｍｍ；アマーシャムファーマシアバイ
オテク社）に濃縮液をかけた。平衡用バッファーでカラ
ムを十分洗浄した後、結合しているタンパクを、塩化ナ
トリウム（0.5Ｍ）およびイミダゾ−ル（６０ｍＭ）含
有のトリス塩酸バッファー（２０ｍＭ、ｐＨ8.0）で溶
出させた。

【００２６】２）ヘパリン親和性カラムクロマトグラフ
ィーこの溶出液を、塩化ナトリウム（0.15Ｍ）含有のトリス
塩酸バッファー（２０ｍＭ、ｐＨ7.2）で平衡化させた
ＡＦ−ヘパリントヨパール６５０Ｍカラム（５０×１
００ｍｍ；トーソー社）にかけた。平衡用バッファーで
十分洗浄し、続けて0.15Ｍ塩化ナトリウム含有の２０ｍ
ＭＭＥＳ（ｐＨ6.0）で洗浄した後、結合タンパクを
１Ｍ塩化ナトリウム含有の２０ｍＭＭＥＳ（ｐＨ6.
0）で溶出させた。

【００２７】３）イオン交換樹脂カラムクロマトグラフ
ィー溶出液をｐＨ6.0のＭＥＳ（２０ｍＭ）で５倍に希釈
し、ＦＰＬＣシステム（アマーシャムファルマシアバイ
オテック社）を用いて、ＭＥＳ（２０ｍＭ、ｐＨ6.0）
で平衡化させたＳ−セファロースＨＰカラム（１６×１
００ｍｍ；アマーシャムファルマシアバイオテック社）
にかけた。カラムを平衡用バッファーにて洗浄し、ＭＥ
Ｓ（２０ｍＭ、ｐＨ6.0）に０〜1.5Ｍ塩化ナトリウムを
直線濃度勾配で加えた溶液１２０ｍｌを毎分２ｍｌの速
度で流すことにより、結合タンパクを溶出した。溶出分
画を1.5ｍｌずつ集め、各分画の２μｌを阻害試験に供
した。各分画のＵＶ吸光度（実線）とＤＮＡ合成量
（●）を調べた結果、図１に示すクロマトグラフを得
た。図中、横軸はフラクション番号、右縦軸はＵＶ吸光
度および塩化ナトリウム濃度、左縦軸はＤＮＡ合成量を
［³Ｈ］チミジンのカウント数を示す。これらの分画か
ら、ＵＶ吸光度が高くＤＮＡ合成量が低下している分画
を集めた。

【００２８】４．逆相カラムクロマトグラフィー前記で集めた試料を、ＬＣ−１０Ａ高速液体カラムクロ
マトシステム（島津製作所）を用いて、５％アセトニト
リル含有のトリフルオロ酢酸（0.05％）で平衡化したフ
ェニル逆相カラム（１０×２５０ｍｍ、ナカライテック
社）にかけた。カラムを平衡用緩衝液で十分洗浄し、ト
リフルオロ酢酸溶液（0.05％）に１５〜５０％アセトニ
トリルを直線濃度勾配で加えた溶液７５ｍｌを毎分２ｍ
ｌの速度で流すことにより、結合タンパクを溶出した。
溶出は、２８０ｎｍおよび２１４ｎｍの紫外吸収をモニ
ターしながら行なった。溶出分画を1.5ｍｌずつ集め、
各分画の２μｌを阻害試験に供した。その結果、図２に
示すクロマトグラフを得た（図２の縦横軸は、右横軸の
塩化ナトリウム濃度（図中の点線の説明）がアセトニト
リル濃度に変った以外は図１に同じ。）。

【００２９】５．逆相カラムクロマトグラフィー図２に示したグラフからＤＮＡ合成量が低下している分
画（内皮細胞増殖阻害活性を示した分画）をプールし、
0.05％のトリフルオロ酢酸を含有する蒸留水（２回蒸留
＋ろ過）で２倍希釈した。この溶液を５％アセトニトリ
ルを含有するトリフルオロ酢酸溶液（0.05％）で平衡化
したＣ４逆相カラム（4.6×２５０ｍｍ、ビダック社）
にかけた。カラムを平衡用緩衝溶液で十分洗浄し、トリ
フルオロ酢酸溶液（0.05％）に２０〜４０％アセトニト
リルを直線濃度勾配で加えた溶液６０ｍｌを毎分１ｍｌ
の速度で流すことにより、結合タンパクを溶出した。溶
出分画を１ｍｌずつ集め、各分画の２μｌを阻害試験に
供した。その結果、図３に示すようなクロマトグラフを
得た（図中の縦横軸のは図２に同じ）。ＤＮＡ合成量が
低下している分画（活性分画）を集め、希釈後、Ｃ４カ
ラムで再度分離した。トリフルオロ酢酸溶液（0.05％）
に２５〜４０％アセトニトリルを直線濃度勾配で加えた
溶液９０ｍｌにより、結合タンパクを溶出した。溶出分
画を１ｍｌずつ集め、各分画の２μｌを阻害試験に供し
た。その結果を図４に示す（図中の説明は、図２の説明
で記した通りである。）。非特異的な吸着による活性の
消失を避けるために、チューブはすべてシグマコート
（シグマ−アルドリッチ社）でシリコンコートしたもの
を用いた。

【００３０】実施例４：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動１５％ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動および
銀染色用キット（ナカライテスク社）を用いて実施例３
で得られた試料（フラクションＮｏ．８３〜８７）を分
析した。図５に示すように、還元下（Ａ）および非還元
下（Ｂ）による電気泳動の結果、ともに６５ｋＤａに相
当する単一のバンドが得られ、エンドレギュリンは一本
鎖ポリペプチドであることが示唆された（フラクション
Ｎｏ．８６）。銀染色法により見積もった結果、約２μ
ｇの精製エンドレギュリンが得られた。

【００３１】実施例５：トリプシン消化および配列解析２回目のＣ４カラムクロマトで得た増殖阻害活性画分を
乾燥し、４Ｍの塩酸グアニジンを含有する0.1Ｍのトリ
ス塩酸バッファー（ｐＨ8.0）１５０ｍｌに再懸濁し
た。終濃度２０ｍＭになるようにジチオスレイトールを
添加し、反応混合液を３７℃で６０分間インキュベート
した。固形のヨード化アセトアミドを終濃度２５ｍＭに
なるように添加し、室温で３０分間インキュベーション
することによりアルキル化を行った。タンパクをＣ１８
逆相高速液体クロマト（4.6×２５０ｍｍ、ナカライテ
スク社、溶出溶媒：１０〜４０％アセトニトリルを濃度
勾配で加えたトリフルオロ酢酸（0.05％））を用いて脱
塩した後、乾燥し、炭酸水素アンモニウム溶液（１５０
ｍｌ、0.1Ｍ）に再懸濁した。懸濁液にトリプシン（0.4
ｍｇ、ベーリンガーマンハイム社）を加え、２７℃で２
時間インキュベートした。さらにトリプシン（0.3ｍ
ｇ）を加え、２７℃で２時間インキュベートした。消化
生成物をＣ１８高速液体クロマト（溶出溶媒：３〜６３
％アセトニトリルを濃度勾配で加えたトリフルオロ酢酸
溶液（0.05％））で分画した。

【００３２】強い吸収を示した２つのフラクションを集
め、ヒューレットパッカードシークエンシングシステム
（ＨＰＧ１００５Ａ）に供した。内部アミノ酸配列を
調べるために、精製エンドレギュリンの残りをトリプシ
ン消化し、Ｃ１８逆相カラムを用いた高速液体クロマト
グラフィーにより、展開・分画した。ピークＩおよびII
の主要ピークを分離し、アミノ酸配列の解析を行なっ
た。ピークＩのペプチドのアミノ酸配列は検出されなか
ったことより、Ｎ末端断片がブロックされている可能性
が示唆された。一方、ピークIIペプチドは、Ｃ．エレガ
ンスコスミドＦ３２Ｂ５（Nature 368, 32(1994)）と８
７％相同性のある部分配列（配列番号１） Gln Ser Arg Val Gln Ile Ser Try を示したが、ＦＡＳＴＡ３サーチによるタンパクデータ
ベース中には相同性のあるタンパクは見られなかった。

【００３３】実施例６：増殖抑制活性内皮細胞と平滑筋細胞の細胞増殖制御におけるエンドレ
ギュリンの関与を調べた。結果を図６に示す。図６中の
横軸は反応系に添加したエンドレギュリンの濃度を示
し、縦軸は細胞数を示す。図から明らかなように、エン
ドレギュリンは、内皮細胞の増殖を濃度依存的に阻害し
た（●）が、ウシ動脈平滑筋細胞の増殖に対しては、阻
害も刺激もしなかった（○）。また、エンドレギュリン
処理した内皮細胞は、生存を続け、アポトーシス（計画
死）もネクローシス（壊死）もみられなかった。このこ
とより、内皮細胞に対する増殖阻害作用は細胞の生存能
力を下げたことによるものではないことが示唆された。
これらのデータは、エンドレギュリンがある特異性を有
した増殖抑制因子として機能していることを示唆してい
る。

【００３４】実施例７：増殖阻害活性内皮細胞に対するエンドレギュリンの増殖阻害活性の強
度を評価するため、既知の内皮細胞増殖阻害剤であるＴ
ＮＦ−αおよびＴＧＦ−β１と阻害活性を比較した。そ
の結果を図７に示す。図７中の横軸は反応系に添加した
各種阻害剤の濃度を示し、縦軸はＤＮＡ合成量を示す。
ＴＮＦ−α（○）およびＴＧＦ−β１（黒三角）は共
に、約１ｎｇ／ｍｌで約５０％の阻害活性を示し、両者
は類似の阻害パターンを示した。１〜１０ｎｇ／ｍｌの
用量においても、それ以上の効果は観察されなかった。
エンドレギュリン（●）は、ＴＮＦ−αおよびＴＧＦ−
β１と異なる阻害パターンを示し、約２ｎｇ／ｍｌでは
約５０％のより強力な内皮細胞増殖阻害作用を示した。
これらの知見は、エンドレギュリンによる内皮細胞増殖
阻害の分子機序がＴＮＦ−αやＴＧＦ−β１のそれと異
なることを示唆している。

【００３５】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：８配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間部フラグメント

【図面の簡単な説明】

【図１】陽イオン交換カラムクロマトグラフィー精製
における塩化ナトリウムの濃度勾配、ＤＮＡ合成および
ＵＶ吸光の関係を表わしたグラフである。

【図２】フェニル逆相カラムクロマトグラフィー精製
における塩化ナトリウムの濃度勾配、ＤＮＡ合成および
ＵＶ吸光の関係を表わしたグラフである。

【図３】Ｃ４逆相カラムクロマトグラフィー精製にお
ける塩化ナトリウムの濃度勾配、ＤＮＡ合成およびＵＶ
吸光の関係を表わしたグラフである。

【図４】Ｃ４逆相カラムクロマトグラフィー精製にお
ける塩化ナトリウムの濃度勾配、ＤＮＡ合成およびＵＶ
吸光の関係を表わしたグラフである。

【図５】還元下（Ａ：図４中分画８６）および非還元
下（Ｂ：図４中画分８６）のエンドレギュリンのＳＤＳ
−ＰＡＧＥ分析後、銀染色によって検出した泳動図（写
真）である。

【図６】エンドレギュリンの血管内皮細胞（●）およ
び血管平滑筋細胞（○）に対する増殖抑制作用を表わす
図である。

【図７】エンドレギュリン（●）、ＴＮＦ−α（○）
およびＴＧＦ−β１（黒三角）による増殖阻害効果を示
す図である。

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【手続補正書】

【提出日】平成１０年６月１６日

【手続補正１】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図５

【補正方法】変更

【補正内容】

【図５】

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】実質的に精製されたエンドレギュリン。
【請求項２】ヒト由来である請求項１に記載のエンド
レギュリン。
【請求項３】マクロファージの培養上清を、銅親和性
カラムクロマトグラフィー、ヘパリン親和性カラムクロ
マトグラフィー、陽イオン交換樹脂カラムクロマトグラ
フィーおよび逆相クロマトグラフィーを用いて、単離精
製して得られる分子量６５ｋＤａである請求項１または
２記載のエンドレギュリン。
【請求項４】血管内皮細胞の増殖抑制作用を有するこ
とを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載のエン
ドレギュリン。
【請求項５】請求項１乃至４のいずれかに記載のエン
ドレギュリンの抗体。
【請求項６】請求項１乃至４のいずれかに記載の記載
のエンドレギュリンまたは請求項５に記載の抗体および
薬学的に許容される賦形剤および／または担体を含有す
ることを特徴とする薬学的組成物。
【請求項７】請求項１乃至６のいずれかに記載のエン
ドレギュリンを用いることを特徴とするエンドレギュリ
ン作動剤または拮抗剤のスクリーニング方法。