ES2298815T3 - Uso de xenon con hipotermia para tratar asfixia neonatal. - Google Patents

Abstract

Uso de xenón en la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de asfixia neonatal en un sujeto neonato, en el que dicho medicamento es para uso en combinación con hipotermia.

Description

Uso de xenón con hipotermia para tratar asfixia neonatal.

La presente invención se refiere al tratamiento de la asfixia neonatal.

Antecedentes de la invención

La asfixia neonatal (o perinatal), también conocida como hipoxia-isquemia (HI), es una dolencia que surge de la entrada inadecuada de oxígeno en un bebé durante el parto, el alumbramiento, o el período inmediatamente posterior al nacimiento. La asfixia neonatal sigue siendo una causa importante de morbilidad neurológica crónica y mortalidad aguda en el neonato (Balduini et al, 2000; Vannucci et al, 1997), y conduce habitualmente a encefalopatía hipóxica-isquémica.

Los estudios han mostrado que la asfixia neonatal (hipoxia) durante un período de tiempo tan corto como seis minutos puede conducir a daño neurológico permanente. Se ha demostrado la pérdida de tejido cerebral en primates neonatos asfixiados, y se ha correlacionado con la disfunción de memoria y parálisis espástica (Windle, WF, 1969).

Aproximadamente 14,6% de todas las muertes en el nacimiento están provocadas por asfixia neonatal. En el Mundo Occidental, aproximadamente 0,9% (es decir, 100-130.000) de los neonatos sufren asfixia neonatal. Aproximadamente 15-20% mueren, y, de los que sobreviven, el 25% quedan gravemente minusválidos debido a complicaciones a largo plazo, tales como retraso mental, parálisis cerebral, espasticidad, dificultades en el aprendizaje y/o epilepsia (Law et al, 1993; Perlman et al, 1999). Además, cada vez se reconoce más que los niños con asfixia más bien leve, que parecen recuperarse inicialmente sin complicaciones, tienen problemas de comportamiento en la niñez, lo cual puede tener su origen en este ataque neonatal. La asfixia neonatal satisface los criterios de una indicación de medicamentos sin interés comercial, puesto que afecta a menos de 5 pacientes por 10.000 habitantes, y es una enfermedad debilitante grave, potencialmente mortal, sin una terapia consolidada.

Se ha demostrado en modelos de HI de animales neonatos que los mecanismos de muerte celular implicados en este tipo de lesión cerebral implican una combinación de daño excitotóxico (o necrosis), provocado por la excesiva activación de receptores de glutamato, particularmente receptores de N-metil-D-aspartato (NMDA), puesto que son los más sensibles a la neurotoxicidad durante períodos de sinaptogénesis (Jevtovic-Todorovic y Olney, 2003), y por la neurodegeneración apoptótica (Ikonomidou et al, 1989; Pohl et al, 1999). El tipo de daño está relacionado con la gravedad del ataque hipóxico (Jevtovic-Todorovic y Olney, 2003), y también con la variación en la vulnerabilidad de las diferentes regiones del cerebro (Northington et al, 2001). Actualmente, no existe una terapia eficaz para combatir la muerte celular neuronal aguda provocada por HI, aunque hay una variedad de intervenciones tanto farmacológicas como no farmacológicas bajo investigación experimental (Vannucci y Perlman, 1997).

La presente invención busca proporcionar un tratamiento para la asfixia neonatal.

Declaración de la invención

Un primer aspecto de la invención se refiere al uso de xenón en la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de asfixia neonatal, en el que dicho medicamento es para uso en combinación con hipotermia.

Un segundo aspecto de la invención se refiere al tratamiento de la asfixia neonatal en un mamífero que lo necesite,

(a) administrando al mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de xenón;

(b) sometiendo al mamífero a hipotermia.

Un tercer aspecto de la invención se refiere al tratamiento de la asfixia neonatal en un mamífero que lo necesite, administrando al mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de xenón en combinación con hipotermia.

Un cuarto aspecto de la invención se refiere al uso de xenón en la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de asfixia neonatal, en el que dicho tratamiento comprende administrar, simultanea, secuencial o separadamente a un sujeto, xenón en combinación con hipotermia.

Un quinto aspecto de la invención se refiere al uso de xenón, en combinación con hipotermia, para el tratamiento de asfixia neonatal.

Descripción detallada Fisiología normal del SNC inmaduro

Los aminoácidos excitadores (EAA) glutamato y aspartato son los mediadores principales de la transmisión sináptica excitadora en el sistema nervioso central (SNC) maduro (Dingledine y McBain, 1999). También desempeñan un papel central en la ontogenia del SNC inmaduro, en la que están implicados en un número de procesos fisiológico tales como la sinaptogénesis, la supervivencia neuronal, la plasticidad sináptica, y la estructura dendrítica y axonal. Sin embargo, la activación excesiva de estos receptores de aminoácidos durante el desarrollo puede producir lesión neuronal y muerte. Esto se denomina "excitotoxicidad".

El glutamato es el más abundante de los EAA (Dingledine y McBain, 1999). Se almacena en vesícula sinápticas, y provoca la despolarización de la membrana, dependiente de calcio, de membranas postsinápticas cuando se libera de los terminales presinápticos. El glutamato ejerce su efecto excitador en una variedad de subtipos de receptores, que se pueden dividir en tipos de N-metil-D-aspartato (NMDA) y no NMDA, pero, en el SNC en desarrollo, es el subtipo del receptor de NMDA el que se ha encontrado que desempeña el papel principal en la lesión cerebral asociada con HI (Ikonomidou et al, 1989; Komuro, 1993; MacDonald et al, 1986).

El receptor de NMDA es una subclase importante de receptor de glutamato, y se cree que el glutamato es el neurotransmisor excitador más importante en el sistema nervioso central de los mamíferos. De forma importante, se ha mostrado que la activación del receptor de NMDA es el suceso central que conduce a la excitotoxicidad y a la muerte neuronal en muchas enfermedades, así como a un resultado de hipoxia e isquemia tras el trauma de cabeza, la apoplejía, y tras el ataque cardíaco.

El receptor de NMDA es un receptor ionotrópico encontrado de forma ubicua en todo el SNC, localizado en la superficie de las membranas tanto postsinápticas como extrasinápticas (Riccio y Ginty, 2002; Settler et al, 2000). Está acoplado a un canal catiónico que es permeable tanto a iones Na^{+} como Ca^{2+}, y, en condiciones fisiológicas normales, está bloqueado por Mg^{2+} a un potencial de membrana en reposo negativo. Se desbloquea en la despolarización de la membrana celular, permitiendo así un influjo de Ca^{2+} a través del canal, y permitiendo que el receptor ejerza sus efectos intracelulares (Hardingham y Bading, 2003).

Los receptores de NMDA son vitales para la función cerebral normal, y su importancia en la fisiología normal está demostrada por su papel central en la memoria y en el aprendizaje (Bliss y Collingridge, 1993). Por el contrario, la activación patológica de los receptores de NMDA por un exceso de glutamato es la causa principal de muerte celular neuronal tras un ataque isquémico al cerebro, debido a la interrupción de la regulación de Ca^{2+} intracelular. Esto enfatiza el papel central desempeñado por los receptores de NMDA en HI.

Lesión hipóxica-isquémica en el neonato

A fin de que el cerebro funcione, necesita un suministro continuo de oxígeno y glucosa, y depende así de un suministro adecuado de sangre (Choi y Rothman, 1990). Si se interrumpe el suministro de sangre, como es el caso en la asfixia neonatal, le seguirá en minutos el daño hipóxico-isquémico al área, aguas abajo. En estas condiciones de agotamiento del oxígeno, el metabolismo celular pasa de ser aerobio a anaerobio (Vannucci y Perlman, 1997), lo cual es menos eficaz a la hora de satisfacer los requisitos energéticos de la célula. Esto conduce a un agotamiento de las reservas energéticas, que afecta particularmente a las reservas de fosfato de alta energía, tales como ATP, en los compartimientos de células neuronales y de gliocitos (Dingledine y McBain, 1999). Hay una acumulación concomitante de iones
H^{+}, conduciendo a acidosis, y una liberación de radicales libres que contribuyen al daño posterior de las células.

En condiciones fisiológicas, la concentración extracelular de glutamato se mantiene en niveles bajos por la acción de transportadores de glutamato localizados en células neuronales, pero expresados preferentemente en gliocitos (Dingledine y McBain, 1999). Hay varios tipos diferentes de portador captador de glutamato, pero esencialmente todos funcionan de la misma manera, transportando dos cationes de Na^{+} y un anión de glutamato hacia el interior de la célula, a la vez que transportan un catión de K^{+} y un anión de OH^{-} fuera de la célula y hacia el espacio extracelular (Dingledine y McBain, 1999). Estas bombas iónicas actúan frente a un gradiente electroquímico, y de este modo confían en la energía en forma de ATP a fin de funcionar correctamente. Por lo tanto, la capacidad de estas bombas para mantener el potencial de membrana en reposo disminuye por la reducción de la concentración de ATP que resulta de HI. En consecuencia, el fallo de la bomba dependiente de ATP conduce a la despolarización de la membrana, y a una inversión en la dirección de bombeo (Eilers y Bickler, 1996; Kauppinen et al, 1988). De este modo, el glutamato se transporta fuera de la célula, y se acumula en el espacio extracelular una concentración en exceso de glutamato. No sólo aumenta la concentración de glutamato debido a una disminución de la captación, sino también se produce un aumento de la liberación de glutamato desde los terminales presinápticos, ya que la despolarización de la membrana crea un potencial de acción (Dingledine y McBain, 1999). Los ejemplos de estos procesos que conducen a un exceso de glutamato extracelular se han observado tanto in vitro (Bosley et al, 1983; Hauptman et al, 1984; Pellegrino-Giampietro et al., 1990) como in vivo (Erecinska et al, 1984; Graham et al, 1990; Ikeda et al. 1989).

La excitotoxicidad se produce cuando el exceso de glutamato extracelular activa continuamente receptores postsinápticos (particularmente receptores de NMDA), y el influjo de calcio resultante crea un gradiente osmótico bajo el cual se mueve el agua, provocando que las células se hinchen. Los sistemas enzimáticos dependientes de calcio también se activan dentro de las células, y estos dos procesos dan como resultado la muerte celular neuronal aguda (Choi y Rothman, 1990).

Mecanismos de muerte celular

Siempre se ha pensado que la muerte celular neuronal surge de uno de dos mecanismos: necrosis y apoptosis, según la hipótesis de Wyllie et al (Wyllie et al, 1980). Sin embargo, recientemente, estas categorías se han cuestionado, ya que han aparecido más signos que sugieren que la muerte celular se debería de dividir en dos categorías: la muerte celular excitotóxica y la apoptosis (Olney, 2003). La muerte celular excitotóxica se ha descrito como un proceso necrótico (Gwag et al, 1997; Katja y Green, 2001), un proceso apoptótico, y un continuo de los dos (Leist y Nicotera, 1998; Nakajima et al, 2000). La apoptosis y la necrosis se distinguen habitualmente por sus aspectos morfológicos distintamente diferentes. La apoptosis requiere ATP y la síntesis de nuevas proteínas, y se identifica por el arrugamiento celular, el agrupamiento de la cromatina con marginación y formación de cuerpos apoptóticos encerrados en la membrana, mientras que la necrosis se reconoce por el arrugamiento nuclear con cambios nucleares cariorrécticos y picnóticos (Hill et al, 1995).

Se ha encontrado que la muerte celular por HI implica un período inicial de necrosis, seguido de una onda retrasada de muerte celular apoptótica (Northington et al, 2001). El tipo de lesión que sigue parece depender tanto del tiempo como de la localización, estando la lesión necrótica inicial confinada en el prosencéfalo ipsilateral en un modelo de HI de rata neonata, y produciéndose la lesión apoptótica retrasada en el tálamo (Northington et al, 2001). Esto sugiere que las diferentes regiones del cerebro pueden expresar una vulnerabilidad diferencial a cada tipo de muerte celular, a tiempos diferentes, tras HI.

En el desarrollo normal, la apoptosis es un suceso regular mediante el cual las neuronas indeseadas o dañadas "cometen suicidio" (Ikonomidou et al, 2001). En HI, la muerte celular excitotóxica inicial está mediada por la excesiva activación de receptores de NMDA, dando como resultado la liberación incontrolada de glutamato, que daña las neuronas circundantes. La respuesta natural al daño durante la sinaptogénesis es, para las neuronas, iniciar la muerte celular programada (Olney, 2003), y se piensa que esto es un mecanismo que se activa para proteger el tejido vecino (Leist y Nicotera, 1998).

Xenón como neuroprotector

Se sabe en la técnica que el receptor de NMDA desempeña un papel importante en la plasticidad sináptica que subyace en muchas funciones cognitivas superiores, tales como la memoria y el aprendizaje, así como en ciertas rutas nocirreceptivas y en la percepción del dolor (Collingridge et al., The NMDA Receptor, Oxford University Press, 1994). Además, ciertas propiedades de los receptores de NMDA sugieren que pueden estar implicados en el procesamiento de la información en el cerebro, que subyace en la propia conciencia.

Los antagonistas de receptores de NMDA son valiosos terapéuticamente por un gran número de razones. En primer lugar, los antagonistas de receptores de NMDA confieren una profunda analgesia, un componente muy deseable de la anestesia general y sedación. En segundo lugar, los antagonistas de receptores de NMDA son neuroprotectores en muchas circunstancias clínicamente relevantes (incluyendo isquemia, trauma cerebral, estados de dolor neuropático, y ciertos tipos de convulsiones). En tercer lugar, los antagonistas de receptores de NMDA confieren un grado valioso de amnesia.

Dada la importancia de los receptores de NMDA en la patogénesis de HI, es apropiado que los antagonistas de NMDA se hayan investigado como posibles agentes neuroprotectores. Se ha mostrado que muchos antagonistas de NMDA tales como MK-801 y quetamina son neuroprotectores en modelos tanto in vitro como in vivo (Albers et al, 1989; Arias et al, 1999; Choi et al, 1988; Kudo et al, 2001). Sin embargo, a pesar de estos resultados alentadores, también se ha mostrado que los antagonistas de receptores de NMDA tienen efectos secundarios psicotomimético en seres humanos (Krystal et al., 1994), y provocan daño al cíngulo posterior (PC) y a las cortezas retroesplénicas (RS) (Olney et al, 1991). Además, muchos antagonistas convencionales de receptores de NMDA conducen a la producción de movimientos involuntarios, a la estimulación del sistema nervioso simpático, a la inducción de neurotoxicidad a dosis elevadas (lo que es pertinente puesto que los antagonistas de receptores de NMDA tienen bajas potencias como anestésicos generales), a la depresión del miocardio, y a proconvulsiones en algunos modelos epileptogénicos, por ejemplo "activación propagada" (Wlaz P et al., Eur. J. Neurosci. 1994; 6:1710-1719). También ha habido dificultades considerables a la hora de desarrollar nuevos antagonistas de receptores de NMDA que sean capaces de atravesar la barrera hematoencefálica.

El xenón es un gas apolar inerte, que es un potente antagonista de NMDA (Franks et al, 1998). Al igual que otros antagonistas de NMDA, también se ha mostrado que es neuroprotector frente a muchas formas de lesión neuronal, tanto in vitro (Petzelt et al, 2003) como in vivo (Homi et al, 2003; Wilhelm et al, 2002). Sin embargo, a diferencia de muchos de los otros antagonistas de receptores de NMDA, el xenón no es neurotóxico (Ma et al, 2002). Una ventaja adicional del uso de xenón como un antagonista de NMDA es que la molécula es un gas inerte volátil, que se puede eliminar fácilmente vía la respiración.

El xenón tiene muchas otras propiedades favorables. Desde su primer uso en cirugía (Cullen SC et al., Science 1951; 113:580-582), un número de grupos de investigación ha mostrado que tiene un excelente perfil farmacológico, incluyendo la ausencia de subproductos metabólicos, una profunda analgesia, un comienzo y recuperación rápidos, y mínimos efectos sobre el sistema cardiovascular ((Lachmann B et al., Lancet 1990; 335:1413-1415; Kennedy RR et al., Anaesth. Intens. Care 1992; 20:66-70; Luttropp HH et al., Acta Anaesthesiol. Scand. 1994; 38:121-125; Goto T et al., Anesthesiology 1997; 86:1273-1278; Marx T et al., Br. J. Anaesth. 1997; 78:326-327). Además, puesto que el xenón es un átomo pequeño, sin carga, pasa fácilmente a través de la barrera hematoencefálica, produciendo así un comienzo de acción rápido (Nakata et al., 2001). También tiene un coeficiente de reparto sangre:gas muy bajo, prestándose a una rápida salida de la anestesia por xenón (Goto et al., 1997). Además de estas ventajas, el xenón es no explosivo, no tóxico y no es reactivo (Shichino et al., 2002), y esto hace al xenón un candidato ideal para uso como un neuroprotector en el neonato.

Como se usa en la presente memoria, el término "neuroprotector" significa un agente que es capaz de proporcionar neuroprotección, es decir, que protege una entidad neuronal, tal como una neurona, de una lesión continuada debida, por ejemplo, a una lesión isquémica o a una lesión traumática.

Hipotermia como neuroprotector

Talbot demostró en primer lugar, en 1941, las propiedades neuroprotectoras de la hipotermia para uso quirúrgico (Talbot, 1941). Actualmente, el único uso normal de la hipotermia es durante la derivación cardiopulmonar, para proteger el cerebro de la isquemia intraoperativa. Sin embargo, hay varias publicaciones que demuestran el efecto terapéutico de la hipotermia en otros modelos de lesión cerebral. Por ejemplo, existen numerosas publicaciones que muestran el efecto beneficioso de la hipotermia en modelos tanto in vitro (Onitsuka et al., 1998) como in vivo de asfixia neonatal (Debillon et al., 2003; Treschera et al., 1997). Se ha demostrado que existe una correlación directa entre la lesión tisular y el grado de enfriamiento del cerebro (Towfighi et al., 1994), y, en condiciones normóxicas, cada disminución de 1ºC en la temperatura corporal conduce a una disminución del 5% en la velocidad metabólica cerebral (Yager y Asselin, 1996).

Aún se ha de elucidar el mecanismo mediante el cual la hipotermia ejerce su efecto neuroprotector, pero se han postulado muchas teorías. Los estudios han sugerido que los mecanismos mediante los cuales la hipotermia es protectora dependen de la temperatura y del tiempo, y pueden actuar en más de un punto a lo largo de la cascada de sucesos que conducen a la lesión por HI (Yager y Asselin, 1996). Esto está apoyado por el hecho de que se ha demostrado que una temperatura moderada de 31ºC es neuroprotectora disminuyendo el metabolismo energético cerebral, mientras que una hipotermia suave de 34ºC, aunque también es neuroprotectora, no tiene ningún efecto sobre el metabolismo energético y, por lo tanto, debe de actuar vía un mecanismo diferente (Yager y Asselin, 1996). Otro estudio de Taylor et al. (Taylor et al., 2002) demostró que la hipotermia iniciada después del ataque de HI fue más eficaz que la hipotermia intraisquémica, y sugirió que esto puede ser debido a una disminución de los efectos nocivos que se producen durante el período de recuperación. Un ejemplo de dicho mecanismo podría ser que la hipotermia disminuye el daño excitotóxico que sigue durante la reperfusión (Taylor et al., 2002). Se han sugerido muchos otros mecanismos de protección mediante hipotermia, incluyendo la reducción de especies oxigenadas reactivas (Taylor et al., 2002), una reducción en la acidosis tisular (Chopp et al., 1989), y la atenuación de la apoptosis neuronal después de HI (Xu et al, 2002).

Xenón e hipotermia en combinación

Como se ha mencionado anteriormente, un primer aspecto de la presente invención se refiere al uso de xenón en la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de asfixia neonatal en un sujeto neonato, en el que dicho medicamento es para uso en combinación con hipotermia.

Como se usa en la presente memoria, el término "hipotermia" se refiere a someter a un sujeto particular (en este caso, un sujeto neonato) a condiciones hipotérmicas, por ejemplo reduciendo la temperatura corporal, preferentemente en 3-5ºC, mediante técnicas pasivas o activas. Típicamente, el someter a condiciones hipotérmicas conduce a una disminución del metabolismo de los tejidos corporales del sujeto, disminuyendo de ese modo la necesidad de oxígeno.

Como se ha mencionado anteriormente, el uso de hipotermia en el tratamiento de asfixia neonatal se ha documentado bien en la técnica (véase, por ejemplo, Volpe, 2001; Gunn et al., 2000). Sin embargo, hasta la fecha no ha habido ninguna enseñanza o sugerencia en la técnica de que la hipotermia se pudiese usar en combinación con la administración de xenón. Tampoco ha habido ninguna sugerencia de que dicha terapia de combinación conduciría a dicha potenciación sorprendente e inesperada del efecto neuroprotector resultante.

Los estudios previos han revelado que el xenón tiene propiedades neuroprotectores. En particular, el documento WO 01/08692, cuyos contenidos se incorporan a la presente memoria como referencia, se refiere al uso de xenón como un neuroprotector y/o como un inhibidor de la plasticidad sináptica. Sin embargo, no hay ninguna enseñanza o sugerencia en la técnica anterior de que el xenón sería eficaz como un neuroprotector en el contexto de la invención actualmente reivindicada.

En una forma de realización preferida de la invención, el xenón se administra con un diluyente, excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable.

Los ejemplos de dichos excipientes adecuados para las diversas formas diferentes de composiciones farmacéuticas descritas en la presente memoria se pueden encontrar en ``Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2ª Edición, (1994), Editado por A Wade y PJ Weller.

Los vehículos o diluyentes aceptables para uso terapéutico son bien conocidos en la técnica farmacéutica, y se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985). Los ejemplos de vehículos adecuados incluyen lactosa, almidón, glucosa, metilcelulosa, estearato de magnesio, manitol, sorbitol, y similares. Los ejemplos de diluyentes adecuados incluyen etanol, glicerina y agua.

La elección del vehículo, excipiente o diluyente farmacéutico se puede realizar con respecto a la vía de administración pretendida y a la práctica farmacéutica estándar. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender, como vehículo, excipiente o diluyente, o además de ellos, cualquier aglutinante o aglutinantes, lubricante o lubricantes, agente o agentes de suspensión, agente o agentes de revestimiento, agente o agentes solubilizantes adecuados.

Los ejemplos de aglutinantes adecuados incluyen almidón, gelatina, azúcares naturales tales como glucosa, lactosa anhidra, lactosa que fluye libremente, beta-lactosa, edulcorantes de maíz, gomas naturales y sintéticas, tales como goma arábiga, de tragacanto, o alginato de sodio, carboximetilcelulosa y polietilenglicol.

Los ejemplos de lubricantes adecuados incluyen oleato de sodio, estearato de sodio, estearato de magnesio, benzoato de sodio, acetato de sodio, cloruro de sodio, y similares.

En la composición farmacéutica se pueden proporcionar conservantes, estabilizantes y colorantes. Los ejemplos de conservantes incluyen benzoato de sodio, ácido sórbico, y ésteres de ácido p-hidroxibenzoico. También se pueden usar antioxidantes y agentes de suspensión.

La presente invención también es aplicable al tratamiento de animales. A este respecto, la invención se refiere además al uso de xenón en combinación con un diluyente, excipiente o vehículo veterinariamente aceptable.

Para uso veterinario, el xenón se administra típicamente según la práctica veterinaria normal, y el cirujano veterinario determinará el régimen de dosificación y la vía de administración que serán los más apropiados para un animal particular.

El xenón también se puede administrar en combinación con otro agente farmacéuticamente activo. El agente puede ser cualquier agente farmacéuticamente activo adecuado, incluyendo agentes anestésicos o sedantes que promuevan la actividad GABAérgica. Los ejemplos de dichos agentes GABAérgicos incluyen isoflurano, propofol y benzodiazapinas.

En una forma de realización preferida, el xenón se administra en combinación con un agente anestésico volátil, preferentemente isoflurano, seboflurano o desflurano.

El xenón también se puede administrar en combinación con otros ingredientes activos, tales como bloqueantes de canales de calcio de tipo L, bloqueantes de canales de calcio de tipo N, antagonistas de la sustancia P, bloqueantes de canales de sodio, bloqueantes de receptores purinérgicos, o sus combinaciones.

El xenón se puede administrar mediante cualquier mecanismo de suministro adecuado, o mediante dos o más mecanismos de suministro adecuados.

En una forma de realización particularmente preferida, el xenón se administra mediante perfusión. En el contexto de la presente invención, el término "perfusión" se refiere a la introducción de una mezcla de oxígeno/xenón en, y la eliminación de dióxido de carbono de, un paciente que usa un sistema de circulación extracorporal especializado. En términos generales, el sistema de circulación extracorporal sustituye la función del corazón y de los pulmones, y proporciona al cirujano un campo quirúrgico sin sangre y sin movimiento. El perfusionista ventila la sangre del paciente para controlar el nivel de oxígeno y de dióxido de carbono. En el contexto de la presente invención, el perfusionista también introduce xenón en la sangre del paciente. El perfusionista propulsa entonces la sangre nuevamente hacia el interior del sistema arterial, para proporcionar un caudal sanguíneo nutriente a todos los órganos y tejidos vitales del paciente durante la cirugía.

En una forma de realización particularmente preferida, el medicamento está en forma gaseosa.

En otra forma de realización muy preferida, el xenón se administra mediante inhalación. Más preferentemente, el xenón se administra mediante inhalación de una mezcla 70-30% v/v de xenón/oxígeno.

Más preferentemente, el xenón se administra en forma de una mezcla de 20-70% v/v de xenón/aire.

En aún otra forma de realización preferida de la invención, el medicamento está en forma de un líquido o disolución.

Preferentemente, el líquido se administra en forma de una disolución o una emulsión preparada a partir de disoluciones estériles o esterilizables, que se pueden inyectar intravenosa, intraarterial, intratecal, subcutánea, intradérmica, intraperitoneal o intramuscularmente.

En una forma de realización particularmente preferida, el xenón se administra en forma de una emulsión lipídica. La formulación intravenosa contiene típicamente una emulsión lipídica (tal como las emulsiones Intralipid®10, Intralipid®20, Intrafat®, Lipofundin®S o Liposyn® comercialmente disponibles, o aquella especialmente formulada para maximizar la solubilidad), que aumenta suficientemente la solubilidad del xenón para lograr el efecto clínico deseado. En G. Kleinberger y H. Pamperl, Infusionstherapie, 108-117 (1983) 3, se puede encontrar información adicional sobre emulsiones lipídicas de esta clase.

La fase lipídica de la presente invención, que disuelve o dispersa el gas, está formada típicamente de ésteres de ácidos grasos de cadenas largas y medias, saturados e insaturados, que contienen 8 a 30 átomos de carbono. Estos lípidos forman liposomas en disolución acuosa. Los ejemplos incluyen aceite de pescado, y aceites vegetales tales como aceite de haba de soja, aceite de cardo o aceite de semilla de algodón. Las emulsiones lipídicas de la invención son típicamente emulsiones de aceite en agua, en las que la proporción de grasa en la emulsión es convencionalmente 5 a 30% en peso, y preferentemente 10 a 20% en peso. Las emulsiones de aceite en agua de este tipo se preparan a menudo en presencia de un agente emulsionante, tal como un fosfátido de soja.

Los lípidos que forman los liposomas de la presente invención pueden ser naturales o sintéticos, e incluyen colesterol, glucolípidos, esfingomielina, glucolípidos, glucoesfingolípidos, fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilglicerina, fosfatidilinositol.

Las emulsiones lipídicas de la presente invención también pueden comprender componentes adicionales. Estos pueden incluir antioxidantes, aditivos que hacen a la osmolaridad de la fase acuosa que rodea a la fase lipídica isotónica con la sangre, o polímeros que modifican la superficie de los liposomas.

Se ha establecido que se pueden añadir cantidades apreciables de xenón a una emulsión lipídica. Incluso por el medio más simple, a 20ºC y presión normal, el xenón se puede disolver o dispersar en concentraciones de 0,2 hasta 10 ml o más por ml de emulsión. La concentración de gas disuelto depende de un número de factores, incluyendo la temperatura, la presión y la concentración del lípido.

Las emulsiones lipídicas de la presente invención se pueden cargar con xenón gaseoso. En general, se rellena un dispositivo con la emulsión y anestésicos a medida que los gases o vapores pasan a través de burbujeadores de vidrio sinterizado sumergidos en la emulsión. La emulsión se deja equilibrar con el gas o vapor anestésico, a una presión parcial elegida. Cuando se almacenan en recipientes herméticos a gases, estas emulsiones lipídicas muestran una estabilidad suficiente para que el anestésico no se libere como un gas durante períodos de almacenamiento convencionales.

Las emulsiones lipídicas de la presente invención se pueden cargar de forma que el xenón esté en el nivel de saturación. Como alternativa, el xenón puede estar presente en concentraciones más bajas, con la condición de que, por ejemplo, la administración de la emulsión produzca la actividad farmacéutica deseada.

La concentración de xenón empleado en la invención puede ser la concentración mínima requerida para lograr el efecto clínico deseado. Es habitual que el médico determine la dosis real que será la más adecuada para una paciente individual, y esta dosis variará con la edad, el peso y la respuesta del paciente particular. Por supuesto, puede haber casos individuales en los que sean ventajosos intervalos de dosificaciones mayores o menores, y estos están dentro del alcance de esta invención.

Preferentemente, el medicamento está en una forma adecuada para el suministro intravenoso, neuraxial o transdérmico.

Preferentemente, el xenón se administra simultáneamente, en combinación, secuencial o separadamente con hipotermia.

Como se usa en la presente memoria, "simultáneamente" se usa para significar que el xenón se administra concurrentemente con hipotermia, mientras que la expresión "en combinación" se usa para significar que el xenón se administra, si no simultáneamente, entonces "secuencialmente" dentro de un marco de tiempo en el que tanto el xenón como la hipotermia muestran un efecto terapéutico, es decir, ambos están disponibles para actuar terapéuticamente dentro del mismo marco de tiempo. De este modo, la administración "secuencialmente" puede permitir que se administre el xenón 5 minutos, 10 minutos o unas horas antes de la hipotermia, con la condición de que la semivida circulatoria del xenón sea tal que esté presente en una cantidad terapéuticamente eficaz cuando el sujeto neonato se exponga a condiciones hipotérmicas.

En otra forma de realización preferida de la invención, el neonato se somete a hipotermia antes del tratamiento con xenón.

Contrariamente a "en combinación" o "secuencialmente", "separadamente" se usa en la presente memoria para querer decir que el lapso entre la administración del xenón y la exposición del sujeto neonato a hipotermia es significativo, es decir, el xenón puede que ya no esté presente en el torrente sanguíneo en una cantidad terapéuticamente eficaz cuando el sujeto neonato se exponga a condiciones hipotérmicas.

En una forma de realización preferida, el xenón se administra secuencialmente con hipotermia.

Más preferentemente, el xenón se administra secuencialmente antes de la hipotermia.

En otra forma de realización preferida, el xenón se administra separadamente antes de la hipotermia.

En una forma de realización preferida, el xenón se administra secuencialmente después de la hipotermia.

En otra forma de realización preferida, el xenón se administra separadamente después de la hipotermia.

Más preferentemente, el xenón se administra secuencial o simultáneamente con hipotermia, más preferentemente de forma simultánea.

En una forma de realización preferida de la invención, el xenón se administra en una cantidad terapéuticamente eficaz.

En otra forma de realización preferida, el xenón se administra en una cantidad subterapéuticamente eficaz. En otras palabras, el xenón se administra en una cantidad que sería insuficiente para producir el efecto terapéutico deseado si se administrase en ausencia de condiciones hipotérmicas.

Incluso más preferentemente, la combinación de xenón e hipotermia tiene un efecto sinérgico, es decir, la combinación es sinérgica.

En una forma de realización particularmente preferida, el xenón se administra antes del ataque hipóxico. De este modo, en una forma de realización preferida, el xenón se administra al neonato, vía la madre, antes del nacimiento, por ejemplo, administrándolo a la madre antes o durante el parto. Preferentemente, el xenón se administra a la madre durante un tiempo de hasta aproximadamente 48 ó 24 horas antes del nacimiento, más preferentemente hasta aproximadamente 12 horas, más preferentemente hasta aproximadamente 6 horas o 3 horas o 1 hora antes del nacimiento. Después del nacimiento, el neonato se somete entonces a condiciones hipotérmicas.

Otro aspecto de la invención se refiere al tratamiento de asfixia neonatal en un mamífero que lo necesite,

(a)

administrando una cantidad terapéuticamente eficaz de xenón a la madre del mamífero antes y/o durante el parto; y

(b)

sometiendo al mamífero a hipotermia después del nacimiento.

Preferentemente, la hipotermia se mantiene durante un período de al menos aproximadamente 6 horas, más preferentemente al menos aproximadamente 12 horas, después del ataque hipóxico-isquémico (HI).

En una forma de realización preferida, la hipotermia se mantiene durante un período desde aproximadamente 6 hasta aproximadamente 24 horas después del ataque hipóxico-isquémico (HI).

Preferentemente, la hipotermia se mantiene durante un período de al menos aproximadamente 6 horas, más preferentemente al menos aproximadamente 12 horas, después del nacimiento.

En una forma de realización preferida, la hipotermia se mantiene durante un período desde aproximadamente 6 hasta aproximadamente 24 horas después del nacimiento.

Preferentemente, el tratamiento según la invención se inicia aproximadamente 6 horas del ataque hipóxico-isquémico (HI), y más preferentemente aproximadamente 2 horas del ataque hipóxico-isquémico.

La hipotermia se puede producir de forma pasiva, permitiendo que la temperatura baje, y no sosteniendo adrede la temperatura corporal. Al ser poiquilotérmicos, los neonatos adoptan rápidamente la temperatura de su entorno. Como alternativa, al paciente se le puede llevar de forma activa al estado hipotérmico, reduciendo deliberadamente su temperatura ambiente.

Un segundo aspecto de la invención se refiere al tratamiento de la asfixia neonatal en un mamífero que lo necesite:

(a)

administrando una cantidad terapéuticamente eficaz de xenón al mamífero; y

(b)

sometiendo al mamífero a hipotermia, o a condiciones hipotérmicas.

En una forma de realización preferida, el mamífero es un sujeto neonato en las primeras cuatro semanas después del nacimiento. Más preferentemente, el mamífero se encuentra en las primeras dos semanas, aún más preferentemente, la primera semana después del nacimiento.

Preferentemente, el mamífero es un ser humano.

Preferentemente, el mamífero se somete a condiciones de hipotermia suave. Como se usa en la presente memoria, la expresión "hipotermia suave" se refiere típicamente a una disminución en la temperatura interna desde 37ºC hasta aproximadamente 33ºC.

En una forma de realización preferida, la temperatura del mamífero se mantiene a una temperatura desde aproximadamente 31ºC hasta aproximadamente 36ºC.

Más preferentemente, la temperatura del mamífero se mantiene a una temperatura desde aproximadamente 32ºC hasta aproximadamente 36ºC, más preferentemente desde aproximadamente 32ºC hasta aproximadamente 35ºC, aún más preferentemente desde aproximadamente 33ºC hasta aproximadamente 35ºC.

Las formas de realización preferidas para el segundo aspecto de la invención son las mismas que las descritas anteriormente con respecto al primer aspecto.

Otro aspecto de la invención se refiere al tratamiento de la asfixia neonatal en un mamífero que lo necesite administrando una cantidad terapéuticamente eficaz de xenón al mamífero, en combinación con hipotermia.

Aún otro aspecto de la invención se refiere al uso de xenón en la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de asfixia neonatal, en el que dicho tratamiento comprende administrar a un sujeto simultánea, secuencial o separadamente xenón en combinación con hipotermia.

Un aspecto adicional de la invención se refiere al uso de xenón, en combinación con hipotermia, para el tratamiento de asfixia neonatal.

Estudios in vivo

Usando un modelo de HI con animales, se expusieron ratas neonatas a tratamiento con xenón e hipotermia, independientemente entre sí. Se demostró que el xenón es neuroprotector frente a HI en el neonato mediante la reducción de la cantidad de muerte celular apoptótica, mientras que la hipotermia parece ser menos eficaz. En combinación, el xenón y la hipotermia fueron neuroprotectores vía un mecanismo antiapoptótico (Figura 17). Se encontró que su efecto combinado es sinérgico.

El modelo de HI de rata neonata está muy consolidado y se ha validado para uso en un número de estudios previos (Levine, 1960; Rice et al., 1981). Se ha encontrado que la edad de las ratas usadas en este modelo corresponden a la madurez cerebral de la expresión neonato humano (Clancy et al., 2001; Ikonimidou et al., 1989), y de este modo se puede hacer una comparación razonablemente exacta entre los dos.

Durante los experimentos de hipotermia, la temperatura de las crías de rata se monitorizó usando una sonda que se insertó en la corteza de una de las crías. La sonda tomó aproximadamente 15 minutos para equilibrarse, y esto se permitió retrasando el tiempo de comienzo del experimento hasta que la sonda comenzó a registrar la temperatura correcta. Hubo fluctuaciones de la temperatura aproximadamente el valor medio, pero éstas se controlaron mediante monitorización continua y ajuste manual del baño de agua según era necesario. Sólo se monitorizó la temperatura de una rata por grupo, a fin de minimizar el trauma provocado a las ratas y también el daño infligido a la corteza mediante la sonda; las ratas con la sonda insertada no se pudieron usar para el análisis histológico.

Se ha mostrado que el gas anestésico xenón muestra neuroprotección en varios modelos de lesión neuronal de adultos. Actualmente, no existen datos publicados para confirmar el mismo efecto neuroprotector del xenón en neonatos. Los resultados de este estudio corroboran los hallazgos previos de que el xenón tiene propiedades neuroprotectoras significativas, y además sugieren que esta neuroprotección se extiende a modelos de lesión cerebral inducida por hipoxia-isquemia en neonatos.

Desde hace mucho se sabe que la activación del subtipo de NMDA de receptores de glutamato es necesaria para sufrir lesión neuronal continua y muerte en HI, y está bien documentado que el xenón ejerce su efecto analgésico y anestésico vía el bloqueo de estos receptores, y de este modo se ha postulado que las propiedades neuroprotectoras del xenón son un resultado de este antagonismo. Previamente, otros diversos antagonistas de NMDA han demostrado neuroprotección en estudios in vitro, pero han fracasado subsiguientemente cuando se utilizan en escenarios clínicos (Muir y Lees, 1995). Se desconoce la razón que está detrás de estos fracasos clínicos; sin embargo, es posible que el bloqueo del subtipo de receptores de glutamato sea insuficiente para proteger frente a la lesión, lo que podría implicar que el xenón ejerce su efecto neuroprotector a través de otros mecanismos.

En el presente estudio, se ha demostrado que el xenón protege significativamente frente a HI neonatal vía un mecanismo antiapoptótico. Tanto la apoptosis como la necrosis son componentes importantes de la pérdida neuronal después de la lesión por HI, pero la apoptosis parece ser el tipo más importante de muerte celular a la hora de determinar el resultado neonatal (Taylor et al., 1999). La muerte apoptótica a menudo está precedida de la activación de muchos genes (incluyendo factores de transcripción), que pueden ser proapoptóticos o antiapoptóticos. Puesto que parece que el xenón interfiere con la muerte celular apoptótica, es posible que pueda ejercer su efecto sobre uno de estos genes, o en algún punto a lo largo de la ruta apoptótica. Actualmente, hay signos de dos rutas de apoptosis diferentes: la ruta extrínseca, y la ruta intrínseca. La ruta extrínseca (también denominada como la "ruta de receptores de la muerte") implica la unión de citoquinas a receptores de la muerte que activan caspasa-8, y esta a su vez activa la "caspasa ejecutora", caspasa-3, que continúa para inducir la muerte celular apoptótica (Mehmet, 2000). La ruta intrínseca depende muchísimo de las mitocondrias, e implica un incremento de la permeabilidad de la membrana mitocondrial, provocada por la proteína proapoptótica bax. Esto conduce a la liberación de citocromo c, a la formación de un complejo de citocromo c, Apaf-1 (factor 1 activador de la proteasa de la apoptosis) y caspasa-9, y a la activación subsiguiente de caspasa-3. Es totalmente posible que el xenón actúe sobre una de estas rutas, pero hay signos para sugerir que la neurodegeneración apoptótica inducida por HI está mediada vía la ruta mitocondrial y el inicio de cambios mitocondriales dependientes de bax (Taylor et al., 1999). Además de esto, se ha mostrado que el antagonista de NMDA quetamina protege frente a la isquemia cerebral incompleta y a la reperfusión, mediante la modulación temprana del balance entre las proteínas pro- y antiapoptóticas, a saber, inhibiendo el incremento de bax inducido por HI (Engelhard et al., 2003). De este modo, es posible que el xenón pudiese inhibir la apoptosis haciendo disminuir bax. Bcl-2 es una proteína antiapoptótica que actúa para disminuir la permeabilidad de las mitocondrias y, por tanto, para inhibir la liberación de citocromo c. Se ha mostrado que su sobreexpresión disminuye el daño neuronal provocado por isquemia cerebral global transitoria en gerbos (Engelhard et al., 2003). Por lo tanto, el aumento de bsl-2 es otra diana potencial para el xenón. Puesto que el xenón es apolar y soluble en grasas, es capaz de distribuirse ampliamente por todo el cuerpo. Puede penetrar membranas y, en consecuencia, también puede tener un efecto en el núcleo, alterando la transcripción génica para regular beneficiosamente las rutas de supervivencias, o inhibir la síntesis de ARN y de proteínas de moléculas proapoptóticas.

Se mostró que la antinecrosis mediante xenón era estadísticamente significativa en la corteza a las 48 h, pero no en el giro (Figura 16). En todos los otros grupos de tiempo, el xenón no fue antinecrótico. Una posible explicación para esto es que, según un estudio previo (Northington et al., 2001), hay una onda secundaria de muerte celular necrótica a 48 h, que sólo es aparente en la corteza. Esto explicaría el incremento del porcentaje de células necróticas presentes en los controles positivos a las 48 h, en comparación con 16 y 24 h. Aunque no se sabe ciertamente cómo ejerce el xenón un efecto antinecrótico en la corteza a las 48 h, puede ser que aunque el xenón es incapaz de evitar la necrosis que se produce antes de su administración (como en los grupos de 16 y 24 h), en cierto modo es capaz de combatir la onda necrótica secundaria que se produce después de su administración. La necrosis inicial se produce tan temprano como a las 3h después del ataque de HI (Northington et al., 2001), y en este punto aún no se ha administrado el xenón. Por lo tanto es improbable que sea capaz de detener o invertir un proceso que ya ha ocurrido. Sin embargo, la onda necrótica secundaria se produce en un momento en el que el xenón ha estado presente en el cerebro durante 48 h, y esto sugiere que la presencia de xenón en el advenimiento de la necrosis debe ser capaz de disminuir este tipo de muerte celular. Se ha de llevar a cabo un trabajo adicional para averiguar el mecanismo exacto de esta interacción.

Los estudios previos han demostrado que la hipotermia suave de 33ºC es neuroprotectora frente a la lesión neuronal isquémica (Busto et al., 1987). Otros estudios han sugerido que esta neuroprotección se logra vía un mecanismo antiapoptótico (Xu et al., 2002). Los experimentos mostraron que no hubo neuroprotección a 16 ó 24 h (Figuras 13 y 15, respectivamente).

Sin embargo, a 48 h, se logró una neuroprotección significativa tanto en la corteza como en el giro, pero mediante mecanismos diferentes. En la corteza, la hipotermia es antinecrótica, y, en el giro, es antiapoptótica (Figura 16). Los datos en este estudio no explican este efecto, pero una posible justificación podría ser que las diferentes regiones del cerebro expresan una vulnerabilidad diferencial (Northington et al., 2001). En la corteza, la onda necrótica secundaria (explicada más arriba) se produce en un momento en el que ya se ha administrado la hipotermia, y esto puede hacerla más eficaz. Sin embargo, en el giro, no hay necrosis retrasada, y de este modo no se observa ningún efecto antinecrótico. La antiapoptosis parece ser el mecanismo neuroprotector en esta región, y es posible que el efecto neuroprotector antiapoptótico esperado de la hipotermia, que no es evidente en los intervalos de tiempo más tempranos, pueda presentarse después de períodos más prolongados.

Los resultados demostraron que, cuando se usan en combinación, un 20% de xenón y una hipotermia de 35ºC proporcionaron un nivel asombroso de neuroprotección. Puesto que estos valores no proporcionaron neuroprotección cuando se usó cada agente solo, ese resultado no se podía explicar por un mecanismo aditivo, sino que en su lugar tuvo que ser debido a una interacción sinérgica entre los dos agentes.

A título de resumen, el presente estudio ha mostrado el uso de un modelo de rata in vivo para mostrar que el xenón es neuroprotector en el neonato, y protege significativamente frente a la apoptosis inducida por la lesión hipóxica-isquémica. Los datos en este estudio también sugieren que cuando se usan xenón e hipotermia en combinación en el mismo modelo, interactúan sinérgicamente para disminuir drásticamente la muerte celular apoptótica. En consecuencia, esta combinación puede representar un tratamiento eficaz para proteger frente a las consecuencias neurológicas devastadoras de la asfixia neonatal.

La presente invención se describe adicionalmente por medio de ejemplos, y con referencia a las siguientes figuras, en las que:

La Figura 1 muestra la relación entre el daño, medido por la pérdida de peso cerebral (relación de hemisferio derecho/izquierdo), y la duración del período hipóxico (en minutos) en ratas Sprague-Dawley.

La Figura 2 muestra secciones cerebrales de ratas Sprague-Dawley que han sufrido 90 minutos de lesión por hipoxia-isquemia.

La Figura 3 muestra el principal daño celular que es evidente en ratas Sprague-Dawley 24 horas después de 90 minutos de hipoxia-isquemia.

La Figura 4 muestra la dependencia, con respecto de la concentración, de la neuroprotección por xenón (relación de peso de hemisferio derecho/izquierdo frente a la concentración de xenón).

La Figura 5 muestra el efecto de 70% de xenón sobre funciones neurológicas evaluadas remotamente tras el ataque hipóxico-isquémico (HI).

La Figura 6 compara el efecto neuroprotector (relación de hemisferio derecho/izquierdo) observado con N_{2} y xenón respectivamente, cuando el xenón se administra 2 horas después del ataque de HI.

La Figura 7 muestra el efecto de hipotermia suave sobre el efecto neuroprotector de xenón (liberación de LDH frente a la concentración de xenón, % atm).

La Figura 8 muestra una gráfica de van't Hoff del logaritmo natural de la liberación de LDH representado frente a la inversa de la temperatura absoluta.

La Figura 9 muestra una fotografía de las cámaras herméticas al aire, construidas para este fin, usadas para el suministro de gas. También se presentan el baño de agua y el sistema de suministro de xenón de circuito cerrado.

La Figura 10 muestra una línea de tiempo esquemática del método usado. El tiempo tomado para la cirugía de n = 12 crías es 60 minutos. Los períodos de recuperación se llevaron a cabo en el alojamiento. Las intervenciones usadas fueron: animales tratados de forma simulada, controles positivos, 75% de xenón (resto oxígeno), hipotermia de 33ºC, 20% de xenón (25% de oxígeno, 55% de nitrógeno), hipotermia de 35ºC, y una combinación de hipotermia de 35ºC y de 20% de xenón. Excepto que se indique de otro modo, los animales se mantuvieron a 37ºC y respiraron una mezcla gaseosa de 25% de oxígeno, siendo el resto nitrógeno. Los animales tratados de forma simulada fueron sometidos a incisión, pero no a ligación ni a HI, y los controles positivos fueron sometidos tanto a cirugía como a HI. Los animales en cada grupo se dividieron por igual entre los períodos de recuperación variable (16, 24 y 48 h) antes de sacrificarlos. Abreviaturas: HI, hipoxia-isquemia.

La Figura 11 muestra la sección sagital (A) de un cerebro de rata modificado de la página web: faculty.virginia.
edu/.../RatBrainLabels.jpg. La línea discontinua representa el área del cerebro a partir de la que se tomaron secciones coronarias (B), aproximadamente -3,6 mm del bregma. (B) muestra una sección coronaria teñida con violeta de cresilo. Las cajas indican las áreas en las que se colocaron los marcos de recuento y se analizaron las células - la caja superior indica la corteza, y la inferior el giro. X se encuentra sobre un orificio que se creó intencionadamente con un pasador de seguridad a fin de demostrar el hemisferio no ligado (contralateral).

La Figura 12 muestra una fotomicrografía de la corteza (teñida con violeta de cresilo), tomada con una lente de emersión en aceite de 100x y una cámara digital Axiocam, que demuestra la diferencia del aspecto morfológico entre una célula apoptótica, necrótica y viable. Las células viables se tiñen de forma menos intensa que cualquier tipo de muerte celular, y por lo tanto tienen un citoplasma más pálido, mientras que las células muertas se tiñen de forma más oscura. Las células necróticas y apoptóticas se diferencian en base a sus aspectos nucleares diferentes - los núcleos necróticos son grandes y con formas irregulares, mientras que los núcleos apoptóticos son pequeños, arrugados y con forma esférica.

La Figura 13 muestra que el xenón es neuroprotector a 16 h vía un mecanismo antiapoptótico. Más específicamente, la Figura 13 muestra gráficas para la muerte neuronal apoptótica y necrótica inducida por hipoxia-isquemia, y muestra los efectos de 75% de xenón e hipotermia de 33ºC sobre dicha muerte celular, a 16 h, en (A) la corteza y (B) el giro. En ambas áreas cerebrales, el xenón aumentó significativamente el porcentaje de células viables, así como disminuyó el porcentaje de células apoptóticas, en comparación con los animales del control positivo. En la corteza, la hipotermia disminuye el porcentaje de células apoptóticas, aunque no aumenta el número de células viables, y por lo tanto no se puede considerar neuroprotectora. Los resultados son la media \pm SD (n = 3). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 frente a controles positivos.

La Figura 14 muestra una fotomicrografía que demuestra la corteza y el giro en los animales tratados de forma simulada, en los animales del control positivo y en los animales tratados con 75% de xenón, a las 16 horas. El grupo del 75% es más similar en aspecto al grupo tratado de forma simulada que al grupo del control positivo. Esto confirma el efecto neuroprotector del xenón a las 16 horas. El giro del grupo de control tiene una forma distorsionada debido al aumento de la cantidad de muerte celular y vacuolación.

La Figura 15 muestra que el xenón es neuroprotector a las 24 h, vía un mecanismo antiapoptótico. Más específicamente, la Figura 15 muestra gráficas para la muerte neuronal apoptótica y necrótica inducida por hipoxia-isquemia, y muestra los efectos de 75% de xenón e hipotermia de 33ºC sobre dicha muerte celular, a las 24 h, en (A) la corteza y (B) el giro. En ambas áreas cerebrales, el xenón provocó un aumento significativo del porcentaje de células viables debido a una disminución del número de células necróticas. Los resultados son las medias \pm SD (n = 3). *p < 0,05 frente a controles positivos.

La Figura 16 muestra que el xenón es neuroprotector a las 48 h, vía un mecanismo antiapoptótico. Más específicamente, la Figura 16 muestra gráficas para la muerte neuronal apoptótica y necrótica inducida por hipoxia-isquemia, y muestra los efectos de 75% de xenón e hipotermia de 33ºC sobre dicha muerte celular, a las 48 h, en (A) la corteza y (B) el giro. El xenón es neuroprotector vía un mecanismo antiapoptótico, tanto en la corteza como en el giro. Además, el xenón tiene un efecto antinecrótico en la corteza. La hipotermia de 33ºC parece ser neuroprotectora en ambas áreas del cerebro, pero mediante un mecanismo diferente - es antinecrótica en la corteza, y antiapoptótica en el giro. Los resultados son la media \pm SD (n = 3). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 frente a controles positivos.

La Figura 17 muestra que una combinación de xenón e hipotermia interactúa sinérgicamente para producir neuroprotección antiapoptótica. Más específicamente, la Figura 17 muestra gráficas para la muerte neuronal apoptótica y necrótica inducida por hipoxia-isquemia, y muestra el efecto de una combinación de 20% de xenón e hipotermia de 35ºC sobre dicha muerte celular, a las 16, 24 y 48 h, en (A) la corteza y (B) el giro. No se observó ninguna diferencia cuando el grupo de 20% de xenón y el grupo de hipotermia de 35ºC se compararon con los controles positivos; de este modo, a estos valores, no hay neuroprotección. Sin embargo, cuando estos valores se usan en combinación, hay un drástico incremento del porcentaje de células viables, debido a una disminución significativa en el número de células apoptóticas, en comparación con los animales del control positivo. En el giro, la combinación proporciona un efecto antinecrótico adicional a las 24 h. Los resultados son la media \pm SD (n = 3). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 frente a controles positivos.

En la siguiente sección de Ejemplos se puede encontrar una discusión más detallada de estas figuras.

Ejemplos Ejemplo 1 Modelo de asfixia neonatal

Se sometieron ratas Sprague-Dawley postnatales de siete días a ligación de la arteria carótida común derecha bajo anestesia quirúrgica (isoflurano al 1%-1,5% en oxígeno puro). Después de la ligación, los animales se devolvieron a sus madres y se colocaron en un área especialmente diseñada con temperatura ambiente (23ºC) y humedad (48%) constantes. Una hora después de la cirugía, las ratas neonatas se colocaron en una cámara especialmente diseñada, con 8% de oxígeno combinado con 0, 20, 40, 60 ó 70% de xenón (siendo el resto nitrógeno), durante 90 minutos a 37ºC (temperatura mantenida mediante un baño de agua que funciona fuera de las cámaras). En el día 7 después del experimento, las ratas (14 días) se sacrificaron, y se retiraron los cerebros. Se calculó la relación del peso del hemisferio derecho frente al izquierdo (relación R/L). En algunos grupos, se permitió que las crías de rata viviesen hasta 30 días después del nacimiento, en cuyo momento se evaluaron su función y su coordinación neuromotora con protocolos consolidados (ensayo neuromotor y ensayo del tambor giratorio).

Los resultados indican que, al incrementar los tiempos de hipoxia, el daño (según se mide por la pérdida de peso cerebral) es sólo evidente cuando la hipoxia supera 90 minutos (Figura 1). Por tanto, el período estándar de lesión hipóxica se estableció en 90 minutos.

En la Figura 2 se muestran secciones cerebrales de animales que sufrieron 90 minutos de lesión por hipoxia-isquemia. Con mayor detalle, la Figura 2 (centro) muestra un deterioro anatómico enorme (en el lado del cerebro que sufrió la lesión - en esta vista, el lado izquierdo), en comparación con los animales del control (izquierda). Las rodajas cerebrales a la derecha proceden de animales que han sufrido la misma hipoxia-isquemia, pero que han estado respirando 70% de xenón durante el período hipóxico. Estos cerebros tienen un aspecto bastante similar a los normales, mostrando la extraordinaria neuroprotección proporcionada por el xenón.

En la Figura 3 se muestra el principal daño celular, que es evidente 24 horas después de 90 minutos de hipoxia-isquemia.

En la Figura 4 se muestra la dependencia con la concentración de la neuroprotección del xenón (relación de peso del hemisferio derecho/izquierdo frente a la concentración de xenón). Con mayor detalle, la Figura 4 muestra las relaciones del peso hemisférico ipsilateral/contralateral del cerebro de ratas de 14 días después de la hipoxia/isquemia con o sin diversas concentraciones de xenón, a los 7 días de nacer. La neuroprotección es evidente incluso a concentraciones subanestésicas. Los animales del control se sometieron a ligación de la carótida, pero no se les sometió a hipoxia. Los resultados son la media \pm SEM (n = 5-8). *P < 0,01 frente a 8% de O_{2}.

En la Figura 5 se muestra el efecto de 70% de xenón sobre las funciones neurológicas evaluadas remotamente tras el ataque hipóxico-isquémico (HI). En el día 7 después del nacimiento, se ligó la arteria carótida derecha, y las crías de rata se expusieron a un entorno hipóxico (8% de oxígeno + 70% de xe, y el resto nitrógeno) durante 90 min. Treinta días después del ataque, las ratas se evaluaron para determinar la función neuromotora (A) usando un panel que incluyó ensayos de tracción prensil, resistencia, y comportamiento de equilibrio nivelado (graduado en una escala de 0-9), y (B) el equilibrio en un tambor giratorio Rotarod, un ensayo estándar de la función neuromotora y de equilibrio. El punto de dato de una rata individual es la suma de tres ensayos. Las barras horizontales indican la mediana para cada grupo.

En la Figura 6 se muestra el efecto neuroprotector (relación de hemisferio derecho/izquierdo) observado con N_{2} y xenón, respectivamente, cuando el xenón se administra 2 horas después del ataque de HI. Con mayor detalle, los datos muestran que el xenón es eficaz proporcionando neuroprotección incluso si se administra 2 horas después del final del período hipóxico. Las relaciones del peso hemisférico ipsilateral/contralateral de cerebro de rata de 14 días después de 90 minutos de ataque hipóxico-isquémico y después de 2 h de recuperación tras la exposición con 70% de N_{2} o 70% de Xe + 30% de O_{2} durante 90 minutos, a los 7 días después de nacer. Los resultados son la media \pm SEM
(n = 6).

En la Figura 7 se muestra el efecto de la hipotermia suave sobre el efecto neuroprotector de xenón (liberación de LDH frente a la concentración de xenón,% atm). Una hipotermia modesta produce una potenciación muy grande e inesperada de la neuroprotección por xenón. El enfriamiento en 4 grados potencia enormemente la potencia del xenón a la hora de bloquear la liberación de LDH. Con mayor detalle, esta figura muestra el efecto de una combinación de xenón e hipotermia sobre la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) inducida por privación de oxígeno-glucosa (OGD). La Figura 7 muestra los resultados de la exposición de cultivos neuronales a 75 minutos de OGD en presencia de concentraciones crecientes de xenón, ya sea a 37ºC (rojo), o a 33ºC (azul). Los valores de ED_{50} para xenón a 37ºC frente a xenón a 33ºC fueron 35,9 +/- 2,15% y 11,5 +/- 2,0% (media +/- SEM), respectivamente. La lesión neuronal se expresa como un porcentaje de la liberación máxima de LDH después de 75 minutos de OGD y 6 horas de recuperación en ausencia de xenón o de hipotermia. Los puntos representan valores medios, indicando las barras de error los errores estándar.

En la Figura 8 se muestra el grado de la dependencia del proceso con la temperatura, figura la cual muestra una gráfica de van't Hoff del logaritmo natural de la liberación de LDH representada frente a la temperatura absoluta recíproca. A partir de la pendiente de dicha gráfica, se puede calcular el cambio de entalpía del proceso, siendo su tamaño una medida de la dependencia de la temperatura. Los datos en rojo muestran el efecto de la temperatura sobre la liberación de LDH en ausencia de xenón. La reducción de liberación, a medida que se reduce la temperatura, es la esperada, pero es modesta. Cuando está presente 12,5% de xenón, la dependencia con la temperatura es muy grande e inesperada. Por lo tanto, parece que la hipotermia potencia enormemente los efectos neuroprotectores de xenón. En consecuencia, los resultados sugieren que la hipotermia y el xenón actúan sinérgicamente como neuroprotectores.

En el Ejemplo 2 se resumen más estudios detallados.

Ejemplo 2 Materiales y métodos

Este estudio cumple el Acta United Kingdom Animals (Scientific Procedures) Act de 1986, y fue aprobado por el Home Office (U.K.).

Modelo animal de hipoxia-isquemia

Este estudio usó un modelo de HI focal con ratas de 7 días (p7), en el que el patrón de lesión cerebral se asemejó al de la lesión hipóxica-isquémica en la expresión neonato humano (Johnston, 1983).

Crías de rata Sprague-Dawley de p7 (que pesan entre 10 y 14 g), procedentes de Harlan, U.K., se sometieron a un modelo de lesión por HI descrito previamente (Levine, 1960; Rice et al., 1981). De forma breve, las crías de rata se anestesiaron con isoflurano al 2% antes de sufrir la ligación unilateral permanente de la arteria carótida común derecha, usando una incisión en la línea central del cuello y una sutura de seda de 5,0. Una vez que la cirugía estuvo terminada, las crías se recuperaron de la anestesia y después se devolvieron al alojamiento hasta el momento de la experimentación.

Después de 1 hora tras la cirugía, las crías se expusieron a hipoxia colocándolas en cámaras herméticas al aire, construidas para dicho fin, que se sumergieron parcialmente en un baño de agua a 37ºC (Figura 9). Se escogió un período hipóxico de 90 minutos, ya que experimentos preliminares indicaron que el daño hipóxico-isquémico, medido mediante el peso del hemisferio, es máximo después de este tiempo. La hipoxia se indujo mediante un flujo continuo de 8% de oxígeno húmedo, siendo el resto nitrógeno, y esta mezcla se monitorizó cada 15 minutos mediante un aparato Datex Ohmeda (Bradford, U.K.). (Todos los gases fueron suministrados por BOC).

Tratamientos experimentales

Tras HI, las crías se devolvieron al alojamiento durante 4 h para la recuperación, después de lo cual se sometieron a 90 minutos de una de las intervenciones experimentales a continuación. Los datos de experimentos preliminares demostraron que el tiempo óptimo en el que aplicar la intervención fue concurrentemente con HI o 4 h después. No existió diferencia significativa entre los dos períodos de tiempo, y de este modo se escogió un período de 4 h tras el ataque como el tiempo para aplicar la intervención, ya que se pensó que es el clínicamente más pertinente.

Las crías se devolvieron a sus madres hasta el sacrificio a las 16, 24 y 48 h después del tratamiento (Northington et al., 2001) (Figura 10).

Controles

Los grupos de control estaban constituidos por (a) compañeros de camada no tratados, que sufrieron incisión pero no ligación (es decir, animales tratados de forma simulada), usados como controles negativos, y (b) compañeros de camada expuestos a HI, pero no a la intervención experimental, para que actuasen como controles positivos. Estos animales se sometieron a 90 minutos a 37ºC y a una mezcla gaseosa constituida por 25% de oxígeno y el resto nitrógeno.

Ratas experimentales

Tras HI y la recuperación, las ratas experimentales se trataron con 90 minutos de una de las cinco intervenciones experimentales a continuación. Cada uno de los cinco tratamientos se llevó a cabo en grupos separados de ratas.

Tratamiento con hipotermia

Las crías de rata se sometieron a 90 minutos de tratamiento con hipotermia suave (33ºC). Se seleccionó una cría al azar, y se insertó en la corteza una sonda de temperatura (Mini-Mitter Co. Inc., Bend, OR, U.S.A.) bajo anestesia local e isoflurano, y se mantuvo en el sitio con pegamento Superglue. Todas las crías se colocaron entonces en las cámaras herméticas al aire (como antes), y se bombeó a su través una mezcla de 25% de oxígeno y el resto de nitrógeno. Las cámaras se sumergieron parcialmente en un baño de agua que se mantuvo para conservar la temperatura cortical de las crías a exactamente 33ºC, según se mide mediante la sonda de temperatura y mediante el programa de ordenador Vital View. Esta temperatura se escogió puesto que representa la hipotermia "suave", y de este modo se pensó que era clínicamente pertinente, proporcionando un buen equilibrio entre efectos secundarios y beneficio. Después de 90 minutos de tratamiento, las crías se recuperaron con su madre hasta el tiempo del sacrificio. La cría con la sonda de temperatura colocada en el lugar se sacrificó inmediatamente después del experimento, y su cerebro no se usó para el análisis.

Tratamiento con xenón

Se siguió el mismo modelo experimental para el tratamiento con xenón, pero, en lugar de hipotermia, el baño de agua se mantuvo a 37ºC, y la mezcla gaseosa se cambió a 25% de oxígeno y 75% de xenón durante 90 minutos. El gas se suministró en un sistema cerrado construido a propósito, para minimizar la pérdida de xenón (Figura 9). Una vez más, las crías se devolvieron a sus madres hasta el sacrificio.

Protocolo de combinación

En el modelo de combinación, se sometió a las ratas tanto a hipotermia como a xenón concurrentemente durante 90 minutos. Nuevamente, las crías se colocaron en cámaras herméticas al aire, pero en esta ocasión sus temperaturas se mantuvieron a 35ºC, y la mezcla gaseosa consistió en 25% de oxígeno, sólo 20% de xenón y el resto fue nitrógeno. Se mostró en experimentos preliminares que esta temperatura y concentración de xenón no confieren beneficio neuroprotector al cerebro en desarrollo, cuando se usan independientemente. De este modo, usando estos valores, cualquier beneficio neuroprotector es en absoluto indicativo de sinergia entre los dos agentes. Tras el tratamiento, las crías se devolvieron a sus madres hasta el sacrificio.

A fin de demostrar que los valores usados en el grupo de combinación no confieren neuroprotección cuando se usan independientemente, se emplearon dos grupos más de ratas experimentales: se sometió un grupo a hipotermia (como antes) a 35ºC, y el otro grupo se expuso a xenón a una concentración de 20%.

Preparación de tejidos Recogida de cerebros

Los cerebros se recogieron a 16, 24 y 48 h después del final del protocolo experimental.

Los animales se sacrificaron con una sobredosis de pentobarbital (100 mg/kg) intraperitonealmente, y después se desangraron con 2,5 u/ml de heparina en PBS, vía perfusión transcardíaca a través del ventrículo izquierdo. A esto le siguió la perfusión con 20 ml de paraformaldehído al 4% en PBS, y la retirada subsiguiente de los cerebros. Los cerebros se fijaron entonces toda la noche en el mismo fijador. Para cada grupo de tiempo, se dividió por igual el número de cerebros del control o de cerebros experimentales, y se cortaron como secciones congeladas para inmunohistoquímica, o se embebieron en parafina para el análisis histológico. A fin de distinguir entre los hemisferios ipsilateral y contralateral, se usó un sujetapapeles para realizar un orificio en el hemisferio contralateral, no afectado (izquierdo), antes del corte en rodajas.

Inmersión en parafina

Después de la fijación posterior, los cerebros para histología se deshidrataron usando un procesador de inmersión de tejidos Histokinette 2000 (Leica U.K. Ltd., Milton Keynes, U.K.), y después se embebieron en bloques de cera de parafina. Los cerebros embebidos en parafina se cortaron en secciones en corona, con un grosor de 5 \mum, usando un microtomo (Leica, Alemania). La Figura 10.3 ilustra el área del cerebro a partir de la cual se tomaron las rodajas. Se tomaron aproximadamente 20 rodajas de cada cerebro en la región del hipocampo (puesto que ésta es el área más vulnerable a la lesión por HI), aproximadamente -3,6 mm desde el bregma.

Secciones congeladas

Una vez que los cerebros se han fijado toda la noche, se crioprotegieron en sacarosa al 30% en PBS (ésta también contenía 2 mg/ml de azida sódica), y se almacenaron en el frigorífico durante 48 h, o hasta que se hundiesen hasta el fondo del tubo. Los cerebros se congelaron entonces en compuesto O.C.T. (BDH, Poole, Inglaterra), a -22ºC, y se cortaron secciones en corona, a 30 \mum, en un criostato deslizante (Bright Instrument Company Ltd., Huntingdon, U.K.). Los cerebros en rebanadas se almacenaron en el frigorífico en pocillos que contienen 0,1 M de PBS y 1 mg/ml de azida sódica, antes de teñirlos para inmunohistoquímica (véase más abajo).

Procedimientos de tinción Histología

Las secciones embebidas en parafina se montaron en portaobjetos, y se tiñeron con violeta de cresilo para la histología, según se describió previamente (Wilhelm et al., 2002).

Análisis neuropatológico de necrosis y apoptosis Microscopía de la histología

La lesión neuronal se evaluó mediante análisis histológico de rodajas de cerebro en parafina teñidas con violeta de cresilo. El violeta de cresilo es un tinte básico que se une a componentes ácidos del citoplasma neuronal, tales como ribosomas ricos en ARN, y también a los núcleos y nucléolos de células nerviosas. Esta técnica se usó para evaluar la viabilidad celular, y si las células no viables mostraban apoptosis o necrosis en base a criterios morfológicos validados (Nakajima et al., 2000).

Cada grupo experimental estaba constituido por tres grupos de tiempo (16, 24, 48 h), y cada grupo de tiempo contenía tres animales (de este modo hubo nueve animales en total por cada grupo experimental). Se escogieron tres portaobjetos por animal a partir del área del cerebro que estaba a -3,6 mm del bregma (Figura 11). Los portaobjetos se repartieron entonces en los grupos de tiempo, y el examinador no estuvo presente en la intervención.

Se analizaron dos áreas del lado ipsilateral de cada cerebro, usando un microscopio de luz BX60 (Olympus,
Southall, U.K.) - una en la corteza y una en el giro del hipocampo (Figura 11). Se usó una lente de objetivo de 40x con una rejilla, para contar el número total de células que aparecían en la rejilla. Las células se puntuaron como viables, apoptóticas, o necróticas, basándose en su aspecto morfológico, y el porcentaje de cada tipo celular se anotó para cada una de las áreas cerebrales. Se usó una cámara digital Axiocam (Zeiss, Göttingen, Alemania), junto con el microscopio, para hacer microfotografías de las rodajas de los cerebros.

Los criterios para asignar las células a cada categoría fueron los siguientes (Figura 12):

1.

Las células que sufren cualquier tipo de muerte celular (apoptosis o necrosis) se tiñeron con violeta de cresilo de forma más intensa que las células viables, que tenían una forma regular con un citoplasma pálido, y un núcleo claramente visible, más oscuro.

2.

Las células clasificadas como apoptóticas tuvieron núcleos teñidos de forma muy oscura, arrugados, con una forma esférica, y una membrana celular intacta, a menudo con un área circundante de vacuolación.

3.

Las células necróticas, por otro lado, aunque también teñidas de forma muy intensa, tuvieron núcleos alargados, con formas muy irregulares. El número de células apoptóticas, necróticas y viables se expresó como un porcentaje del número total de células, y se anotó para cada portaobjetos. Entonces se calculó un porcentaje medio para cada animal a partir de los tres portaobjetos, de forma que cada uno de los tres animales en un grupo de tiempo tuvieron un solo valor. Se tomó una media adicional a partir de estos tres animales, a fin de obtener un solo valor para cada grupo de tiempo, y se registró la desviación estándar.

Análisis estadístico

El análisis de los datos se realizó usando ANOVA de una vía, seguido de Student-Newman-Keuls cuando fuese apropiado. Se consideró que un valor p < 0,05 era estadísticamente significativo.

Resultados Xenón e hipotermia como agentes independientes Xenón es neuroprotector en el neonato mediante un mecanismo antiapoptótico

El análisis microscópico de las regiones cerebrales corticales y del hipocampo demostró las propiedades neuroprotectoras de xenón, mediante el aspecto morfológico similar de cerebros tratados con xenón en comparación con cerebros tratados de forma simulada, y demostró la diferencia de aspecto cuando se comparan con cerebros de ratas que no fueron tratados con xenón (Figura 14). La neuroprotección profunda frente a la lesión hipóxica-isquémica en la rata neonata se logró mediante el uso de xenón a su máxima concentración (75%), y esto se cuantificó mediante análisis histológico de rodajas de cerebro teñidas con violeta de cresilo. El uso independiente de esta concentración de xenón disminuyó significativamente la muerte celular apoptótica, y aumentó el número de células viables. A 16 h, la apoptosis en la corteza se redujo de 36,5% \pm 2,5% en los controles positivos hasta 8,5% \pm 1,6% (p < 0,001), y el número de células viables aumentó desde 52,9% \pm 2,3% en los controles positivos hasta 80,6% \pm 0,2% (p < 0,001) (Figura 13A). En el giro, la apoptosis disminuyó desde 33,6% \pm 1,8% en los controles positivos hasta 13,9% \pm 2,4% (p < 0,01), y el número de células viables aumentó desde 56,5% \pm 2,6% en los controles positivos hasta 77,1% \pm 3,3% (p < 0,01) (Figura 13B). Los grupos de 24 y 48 h (Figuras 15 y 16, respectivamente) mostraron resultados similares al grupo de 16 h, mostrando el xenón una apoptosis estadísticamente significativa cuando se compara con los animales del control positivo, tanto en la corteza como en el giro.

Se mostró que la antinecrosis por xenón es estadísticamente significativa en la corteza a 48 h, donde disminuyó la necrosis desde 16,6% \pm 0,2% en controles positivos hasta 10,7% \pm 0,4% (p < 0,01) (Figura 16A). Sin embargo, el xenón no fue antinecrótico en el giro a 48 h (Figura 16B). En todos los otros grupos de tiempo (16 y 24 h), el xenón no fue antinecrótico.

90 minutos de hipotermia de 33ºC después de HI moderada son ineficaces

No se observó neuroprotección con hipotermia de 33ºC a 16 ó 24 h (Figuras 13 y 15, respectivamente). A 16 h, la hipotermia pareció tener un efecto antiapoptótico significativo en la corteza, pero puesto que el número de células viables no fue estadísticamente diferente al de los animales del control positivo, se puede concluir que esta intervención no proporcionó neuroprotección. Sin embargo, a 48 h, la hipotermia fue neuroprotectora vía un mecanismo antinecrótico en la corteza, reduciendo el número de células necróticas desde 16,6% \pm 0,2% en los controles positivos hasta 12% \pm 2,3%, y aumentando el número de células viables desde 43% \pm 3,4% hasta 52,3% \pm 3,1% (Figura 16A). En el giro, a 48 h, la hipotermia proporcionó neuroprotección de una manera antiapoptótica (Figura 16B).

Xenón e hipotermia en combinación El tratamiento con 20% de xenón solo no mostró neuroprotección

Contrariamente a los resultados obtenidos con 75% de xenón, 20% de xenón no ejerce ningún efecto neuroprotector. Observando la Figura 17, se puede ver que el porcentaje de apoptosis encontrado en la corteza del grupo de 20% de xenón, a 16 h, es 36% \pm 5,7%, en comparación con 37% \pm 2,5% en los animales del control positivo (p > 0,05), y el porcentaje de viabilidad es 51% \pm 7,8% en comparación con 53% \pm 2,3% respectivamente (p > 0,05), (es decir, no hay ninguna diferencia estadística entre los grupos del 20% y del control positivo). Los datos procedentes del giro produjeron resultados muy similares.

El tratamiento con hipotermia de 35ºC sola no mostró neuroprotección

La hipotermia de 35ºC usada sola es ineficaz frente a HI, y no muestra diferencia estadística en ningún área cerebral cuando se compara con los controles positivos. El porcentaje de apoptosis es 48% \pm 10,1% frente a 37% \pm 2,5% en controles positivos, y el porcentaje de viabilidad celular es 44% \pm 10,3% frente a 53% \pm 2,3%.

El tratamiento con una combinación de 20% de xenón + hipotermia de 35ºC demuestra una neuroprotección sinérgica vía un mecanismo antiapoptótico. Usando intervenciones ineficaces demostradas de xenón (20%) o hipotermia (35ºC) en combinación, se demostró una profunda neuroprotección sinérgica en ambas áreas del cerebro, y a lo largo de los tres grupos de tiempo (16, 24 y 48 h), vía un mecanismo antiapoptótico. La aplicación post-isquémica del tratamiento de combinación redujo significativamente el grado de muerte celular apoptótica, e incrementó la proporción de células viables (véase la Figura 17). A 16 h, en la corteza, se encontró que la reducción de la apoptosis debido a la terapia de combinación era de 35,8% \pm 5,7% y 47,6% \pm 10,1% en los grupos de 20% de xenón y de hipotermia de 35ºC, respectivamente, hasta solamente 7,2% \pm 2% en el grupo de combinación (p < 0,01 y p < 0,001, respectivamente), mientras que las células viables aumentaron desde 51% \pm 7,8% y 43,7% \pm 10,3% hasta 82,3% \pm 4,9% (p < 0,01 en ambos grupos). Los datos del giro produjeron resultados similares (Figura 17B), excepto para el grupo de 24 h, que pareció proporcionar una protección antinecrótica así como también antiapoptótica.

Considerando el hecho de que no se proporcionó neuroprotección mediante los agentes individuales, los resultados de la combinación son asombrosos, y ciertamente muy superiores que los que se habían anticipado. El nivel de neuroprotección proporcionado por la combinación de dos intervenciones individualmente ineficaces demuestra que existe sinergia in vivo entre el xenón y la hipotermia.

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Claims (22)

1. Uso de xenón en la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de asfixia neonatal en un sujeto neonato, en el que dicho medicamento es para uso en combinación con hipotermia.

2. Uso según la reivindicación 1, en el que el xenón se mezcla con un diluyente, excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable.

3. Uso según la reivindicación 1 ó 2, en el que el medicamento está en forma gaseosa.

4. Uso según la reivindicación 3, en el que el medicamento está destinado a ser administrado mediante inhalación.

5. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el xenón está destinado a ser administrado en forma de una mezcla de xenón/aire de 20 a 70% v/v.

6. Uso según la reivindicación 1 ó 2, en el que el xenón está destinado a ser administrado mediante perfusión.

7. Uso según la reivindicación 1 ó 2, en el que el medicamento está en forma de un líquido o disolución.

8. Uso según la reivindicación 7, en el que el medicamento está en forma de una emulsión lipídica.

9. Uso según la reivindicación 7 u 8, en el que el medicamento está en una forma adecuada para el suministro intravenoso, neuraxial o transdérmico.

10. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el xenón está destinado a ser administrado simultánea, secuencial o separadamente con hipotermia.

11. Uso según la reivindicación 10, en el que el xenón está destinado a ser administrado simultáneamente con hipotermia.

12. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el xenón está destinado a ser administrado a la madre del sujeto neonato antes del nacimiento.

13. Uso según la reivindicación 12, en el que el xenón está destinado a ser administrado a la madre del sujeto neonato antes o durante el parto.

14. Uso según la reivindicación 13, en el que el xenón está destinado a ser administrado a la madre del sujeto neonato durante un tiempo de hasta aproximadamente 24 horas antes del nacimiento.

15. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la hipotermia está destinada a ser mantenida durante un período de al menos aproximadamente 6 horas después del ataque hipóxico-isquémico (HI).

16. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la hipotermia está destinada a ser mantenida durante un período desde aproximadamente 6 hasta aproximadamente 24 horas después del ataque hipóxico-isquémico (HI).

17. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el xenón está destinado a ser administrado en una cantidad terapéuticamente eficaz.

18. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que el xenón está destinado a ser administrado en una cantidad subterapéuticamente eficaz.

19. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el xenón está destinado a ser administrado en combinación con un anestésico seleccionado de entre isoflurano, sevoflurano y desflurano.

20. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el sujeto neonato es un mamífero, y la temperatura del mamífero está destinada a ser mantenida a una temperatura desde aproximadamente 32ºC hasta aproximadamente 36ºC.

21. Uso según la reivindicación 20, en el que la temperatura del mamífero está destinada a ser mantenida a una temperatura desde aproximadamente 33ºC hasta aproximadamente 35ºC.

22. Uso de xenón en la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de asfixia neonatal, en el que dicho tratamiento comprende administrar a un sujeto, simultánea, secuencial o separadamente, xenón en combinación con hipotermia.