ES2298789T3 - Dispositivo de aferesis. - Google Patents

Abstract

Dispositivo de aféresis con un soporte sólido que puede entrar en contacto con el flujo de sangre o de plasma, caracterizado porque el soporte sólido comprende un receptor que se une a la proteína precursora de a-amiloide (APP).

Description

Dispositivo de aféresis.

La presente invención se refiere a un dispositivo de aféresis, que comprende un soporte sólido que puede entrar en contacto con el flujo de sangre o de plasma.

Por aféresis se entienden métodos de tratamiento cuyos efectos terapéuticos se basan en la eliminación extracorpórea de proteínas patógenas, sustancias patógenas unidas a proteínas, sustancias patógenas libres o células patógenas de la sangre. Si la proteína patógena puede eliminarse solamente del plasma libre de células, del plasma se eliminan anteriormente las células sanguíneas por medio de un separador de plasma de membrana (separación de plasma) o por medio de una hemocentrífuga. En el intercambio de plasma no selectivo (plasmaféresis), el plasma del paciente intercambiado se separa en su totalidad, eliminando, además de las sustancias patógenas, también todas las otras proteínas vitales. Esto hace necesaria una substitución del plasma eliminado con electrolitos, albúmina humana o plasma fresca. En los métodos de aféresis de plasma selectivos, es posible eliminar las proteínas de plasma separado de forma completamente específica por medio de adsorción, precipitación o filtración, permitiendo la re-infusión del plasma sin pérdida sustancial del volumen una vez realizada la eliminación. Dichos métodos selectivos presentan la ventaja de que se puede prescindir de una solución de substitución. En los métodos de aféresis selectivos de la sangre entera, las proteínas patógenas se adsorben específicamente y sin separación de plasma anterior directamente a partir de la sangre sin tratamiento previo, con lo cual - al contrario de los métodos de separación de plasma - puede prescindirse tanto de la separación de plasma como de la adición de una solución de substitución. Otra forma subordinada de la aféresis es la citaféresis, en la que se eliminan células de la sangre. Esto permite la obtención selectiva de leucocitos, eritrocitos, trombocitos, granulocitos o incluso células madre.

A pesar de que en la actualidad la aféresis (por ejemplo en forma de plasmaféresis o citaféresis) se utiliza predominantemente para la obtención de plasma de donante (como conserva de plasma, para el aislamiento de fracciones de plasma distintas o para la obtención de productos sanguíneos), los métodos de aféresis se hacen cada vez más importantes también en el campo terapéutico. Así, en la actualidad, se están tratando toda una serie de enfermedades metabólicas con los métodos de aféresis (por ejemplo hipercolesterinemia (familial), enfermedad coronaria progrediente con incremento (aislado) de Lp(a), síndrome de quilomicronemia, insuficiencia de hígado, ...), enfermedades renales (síndrome Good Pasture, lupus eritematoso sistémico con nefritis por lupus, granulomatosis de Wegener, síndrome hemolítico-urémico, glomerulonefritis focal-esclerosante idiopática, síndromes asociados a la paraproteinemia, púrpura crioglobulinémica, sensibilización HLA en los trasplantes renales, ...) enfermedades del sistema nervioso central (miastenia gravis, síndrome de Guillain-Barri, poliradiculoneutritis demielinisante crónica, polineuropatía paraproteinémica, síndrome de Lambert-Eaton, síndrome de Refsum, ...), enfermedades del sistema inmune (artritis reumatoide, hemofilia de inhibidores, pemfigus, ...), enfermedades de la circulación sanguínea y de la microcirculación (síndrome de hiperviscosidad, síndrome de anticuerpos antifosfolípidos, microangiopatía trombótica tras un implante de medula de hueso, degeneración de la mácula dependiente de la edad, caída de oído, disfunciones periféricas de la microcirculación, cardiomiopatía dilatativa idiopática, vasculapatía de transplante tras un trasplante de corazón, hipercolesterinemia familial homocigoto, glomeruloesclerosis focal segmentaaria, síndrome hemolítico-urémico, ...), intoxicaciones, insuficiencia de hígado aguda, neoplasmas, hiperhidratación, tireotoxicosis, etc., (ver Psycherembel (257ª Edición) término "Plasmaféresis"; www.nephrologie.de/172Apharese.htm).

La enfermedad de Alzheimer (EA) es una perturbación neurológica, progresiva para la que no existe en la actualidad un tratamiento eficaz. El aspecto típico de dicha enfermedad son las placas cerebrales que contienen el péptido \beta-amiloide y estructuras neuronales en forma de filamentos constituidas por la proteína TAU asociado al microtúbulo. Aunque tanto el \beta-amiloide y TAU se consideran relevantes para la patogénesis, los resultados de investigación más recientes parecen indicar que el \beta-amiloide es el agente predominante en la patogénesis. Por tanto, se están desarrollando cada vez más terapéuticos cuyo objetivo es impedir la producción de \beta-amiloide, la agregación de \beta-amiloide o los eventos neurotóxicos causados por dichos agregados. Una reseña detallada de las estrategias terapéuticas tomadas hasta la actualidad para EA puede encontrarse en el artículo sinóptico de Wolfe (Nature Review Drug Discovery 1 (2002) 859-866).

Las placas de \beta-amiloide se forman a partir de la denominada proteína precursora \beta-amiloide (APP), que es una proteína transmembrana integral (para la cual tampoco existe una función fisiológica documentada; sin embargo, los resultados de investigación más recientes hacen suponer que la APP funciona como el denominado receptor Cargo de membrana para quinesina I). La APP es degradada proteolíticamente por las denominadas secretasas, formando fisiológicamente en particular un péptido A\beta de 40 aminoácidos (A\beta_{40}). Otras formas más cortas y más largas del péptido A\beta se forman tambien, en particular una versión de 42 aminoácidos (A\beta_{42}), que presenta una alta capacidad de agregación. Por tanto, dicha forma A\beta_{42} es la forma predominante en las placas amiloideas. Las secretas responsables de dichas degradaciones distintas (\alpha-, y en particular \beta, y gamma-secretasa) son las dianas de ataque primarias de una posible estrategia de tratamiento de EA. Por tanto, se ha intentado utilizar moduladores o inhibidores para dichas enzimas para el tratamiento de EA (tales como por ejemplo benzodiazepinas, sulfonamidas, benzocaprolactamas.

Otro gen asociado a la EA es la apolipoproteína E, para la que existen tres variantes alelas (APOE2, APOE3 y APOE4). Se ha hallado las personas con una o dos copias de la APOE4 presentan un mayor riesgo de EA, mientras que los portadores de APOE2 presentan un menor riesgo en comparación con la población total. También se ha hallado que las personas que toman estatinas, es decir, medicamentos que inhiben la biosíntesis de colesterinas, presentan un riesgo sustancialmente reducido de EA. Por tanto, otra estrategia de tratamiento de EA se centra en la inhibición de la biosíntesis de colesterinas, precisamente por medio de por ejemplo estatinas.

Otro planteamiento para el tratamiento de EA se refiere a la inhibición de la agregación de amiloides en las placas cerebrales, que podría llevarse a cabo también por medio de inhibidores de secretas, entre otros. Además, se ha propuesto reducir el contenido de cinc, puesto que cinc es capaz de inducir la agregación de A\beta al estar presente en concentraciones fisiológicamente relevantes.

Finalmente, se han descrito también estrategias inmunológicas, por ejemplo una inmunización con A\beta42, que, sin embargo, tuvo que pararse dentro de un estudio clínico debido a los efectos secundarios graves (Willke, Bild der Wissenschaft, 9 (2003), 24-28).

Otras estrategias de tratamiento de EA propuestas en el estado de la técnica se refieren a la prevención de la expresión de APP y al aumento del aclaramiento (clearance) A\beta, buscándose para la primera sustancias que interactúan con la región de APP Promoter. Con relación al aclaramiento A\beta, se ha propuesto un aumento de la actividad de proteasas determinadas, tal como la enzima que degrada la insulina y la neprolisina o la aplicación periférica de anticuerpos anti-A\beta (De Mattos et al., PNAS 98 (15) (2001), 8850-8855). Finalmente, se ha intentado también volver a disolver las placas amiloideas ya existentes por ejemplo por medio de la reducción del nivel de \beta-amiloide en el suero de pacientes de EA. En esto contexto, se ha propuesto también reducir los depósitos de plaque de las proteínas \beta-amiloide en el cerebro por medio de métodos de aféresis (US nº 6 551 266, en la que se ha propuesto la eliminación de macromoléculas con un peso molecular de más de 500 kD por aféresis), sin que haya podido demostrarse su eficacia para EA. Sin embargo, los métodos de aféresis no son capaces de disolver directamente las placas ya existentes en las células del cerebro (la barrera sangre/cerebro es insuperable para las placas y para las moléculas con más de 500 kD).

Por tanto, el objetivo de la presente invención es proporcionar una nueva estrategia de tratamiento y prevención para la enfermedad de Alzheimer.

De este modo, la presente invención proporciona un dispositivo de aféresis, que comprende un soporte sólido que puede hacer contacto con la sangre o el plasma, tal como conocido por ejemplo por el documento US-A-4 770 774, que presenta un receptor que se une a la proteína precursora de \beta-amiloide (APP). El dispositivo de aféresis presente permite realizar de forma selectiva en los pacientes de EA o las personas con alto riesgo de EA un aclaramiento de APP o productos de degradación de APP, en particular A\beta40 o A\beta42, por medio de aféresis. Es conocido que existe un equilibrio dinámico de A\beta42 entre el sistema nervioso central (SNC) y el plasma. Se ha podido demostrar en un modelo de ratón (DeMattos PNAS 2001, ver arriba) que la aplicación periférica de anticuerpos anti-A\beta afecta al "aclaramiento" A\beta_{42} del SNC y del plasma y reduce la carga de A\beta_{42} en el cerebro, sin que los anticuerpos anti-A\beta superen la barrera sangre/cerebro. Estos resultados fueron confirmados por Matsuoka et al. (Journal of Neuroscience 2003: 29-33) por medio de la aplicación periférica de otras moléculas que se unen a A\beta42 (gelsolin y GM1). Esto significa que el proceso de formación de las placas en el cerebro puede suprimirse captando A\beta_{42} en la sangre. En este proceso, no es crítico si los receptores presentes en el dispositivo de aféresis y contactados con la sangre o el plasma del paciente son específicos para A\beta_{42} u otras formas de degradación de APP, lo único importante es que esta adsorción específica elimine APP y sus productos de degradación (proteolíticos), en particular A\beta_{42}, de la sangre, para que no tenga lugar una degradación de proteína "incorrecta" (es decir dando A\beta42). De este modo, la presente invención se basa en un planteamiento de aplicación para la aféresis completamente distinto de la patente US nº 6.551.g266, es decir, en la eliminación de los elementos constituyentes potenciales de plaque y no de las placas finales. Por cierto, la eliminación de las placas por medio de aféresis es descartada desde el principio como método eficaz para el tratamiento de EA, puesto que la aféresis de la sangre ni siquiera puede llegar a las regiones del cerebro donde se forman las placas.

Por otro lado, frente a los métodos que producen una reducción de la concentración de A\beta en el cuerpo mismo (tal como por ejemplo en DeMattos et al., PNAS 98 (15) (2001), 8850-8855 con anticuerpos anti-A\beta periféricos), la aféresis según la invención presenta la ventaja decisiva de que no se pueden disparar respuestas autoinmunes. Además, según la invención, tampoco hay que administrar al paciente sustancias que no pueden actuar hasta que lleguen dentro del cuerpo (posiblemente no hasta que sean transportadas a un sitio determinado), sino que se elimina el agente patógeno selectivamente, es decir, se separa la causa de la enfermedad de forma específica y extracorpórea, sin que tengan que eliminarse los productos de reacción en el cuerpo.

Esto permite, según la invención, adaptar los dispositivos de aféresis ya existentes y conocidos en todas sus formas de realización fácilmente a la presente invención. En particular, la selección del soporte sólido (y del dispositivo de aféresis) debería tener en cuenta su aptitud médica. Soportes, procedimientos y dispositivos de este tipo se han descrito, entre otros, en el documento WO 97/48483 A, y las patentes US nº 5.476.715, nº 6.036.614, nº 5.817.528 ó nº 6.551.266. Los aparatos de aféresis comerciales correspondientes se venden, entre otras, en las empresas Fresenius, Affina, Plasmaselect, ASAHI, Kaneka, Braun, etc., tales como por ejemplo el LDL-Therasorb®, el Immunosorba®, el Prosorba®, el Globaffin®, el Ig-Therasorb®, el Immusorba®, el Liposorba®, el HELP®, el DALI®, el Absorber BR-350 de bilirrubina/ácido gállico, el destoxificador Prometheus®, el MARS®, el sistema ADAsorb de Medicap o el sistema Plasma FLO. Todos estos sistemas - aunque en su forma comercial no sean dirigidos en primer lugar a la eliminación específica de una sola proteína - pueden ser adaptados por un experto en la materia de aféresis sin más a la presente invención, por ejemplo como inmunaféresis y/o instalando el soporte sólido según la invención (por ejemplo como columna) en el dispositivo de aféresis.

Por tanto, la expresión "receptores que se unen a APP" se refiere según la invención también a todas las sustancias que presenten una afinidad para el ligando APP y sus productos secundarios biológicos, en particular A\beta_{42}, y que son capaces de eliminar dichos polipéptidos de la sangre o del plasma de pacientes de EA o de personas con un riesgo de EA. Dichos receptores para APP o A\beta_{42} pueden ser preferentemente anticuerpos (poli- o monoclonales), proteínas, péptidos, gangliósidos o ácidos nucleicos.

Se prefieren en particular anticuerpos anti-APP, anticuerpos anti-A\beta40, o anticuerpos anti-A\beta_{42} proteínas que se unen a APP, en particular gelsolin, apoJ, o apoE, péptidos que se unen a APP, gangliósidos que se unen a APP, en particular G_{M1}, o ácidos nucleicos que se unen a APP, en particular aptámeros) o mezclas de dichos receptores.

Entre los ejemplos de anticuerpos de este tipo, se incluyen 3D6 (A\beta_{1-5}), 2H3 (A\beta_{1-12}), 2G3 (A\beta_{33-40}), 21F12 (A\beta_{33-42}), 12H7 (A\beta_{33-42}) (Johnson-Wood et al., PNAS 1997:1550-1555), 10D5, 16C11 (Bard et al., Nature Medicine 2000:916-919), los anticuerpos (m266, m243) descritos por DeMattos et al. (2001) así como los anticuerpos de la misma especificidad. Los anticuerpos de este tipo se obtienen por ejemplo al inmunizar mamíferos con formulaciones de vacunas que contienen APP, A\beta42 o fragmentos o variantes de las mismas, seguido, si se desea, de fusión celular y protocolos de selección de clones (en caso de anticuerpos monoclonales).

Gelsolin (Matsuoka et al 2003, ver arriba), apoJ y apoE (DeMattos et al 2001, ver lo expuesto anteriormente) son otros ejemplos de receptores de proteína que se unen a APP. GM1 es un ejemplo de un receptor de gangliósido que se une a APP (Matsuoka et al 2003, ver arriba).

Otros ejemplos de proteínas que se unen a APP son la CETP (proteína de transferencia de ésteres de colesterol) y la proteína ERAB (con un tamaño de 261 AA; He et al., JBC 273 (17) (1998), 10741-10746; Lustbader et al., Science 304 (2004), 448-452; en particular AA 1-186 o 1-158). Ejemplos de péptidos que se unen a APP son los fragmentos que se unen a APP y son derivados de las proteínas que se unen a APP. Ejemplos concretos de los péptidos que se unen a APP son KTYNLKKGQT-C ("Péptido 4077"), GIAVASKTYNLKKGQTHTLEDFQRVLDV (ERAB 93-120), SKTYNLKKG-QTHT (ERAB 98-110), C-HQKLVFFAED ("Péptido 1323"), C-EVHHQKLVFFAEDVGS ("Péptido 1324"), C-HQKIVFFAED ("Péptido 1325"), y FGFPEHLLVDFLQSLS-C ("Péptido 1208") (o también todos los demás fragmentos ERAB, CETP o \beta-breaker que contienen las zonas que se unen a APP) (las cisteinas terminales de dichos péptidos no forman parte de la secuencia de proteína nativa, sino que se incluyen para acoplar los péptidos).

Los péptidos que funcionan como receptores que se unen a APP pueden componerse de D- o L-aminoácidos o combinaciones de D- y L-aminoácidos y pueden haberse modificado, si se desea, por modificaciones adicionales, cierre de anillos o formación de derivados. Los receptores de péptidos adecuados para por ejemplo A\beta_{42} pueden ser proporcionados por bibliotecas de péptidos, que están disponibles en el mercado. Preferentemente, dichos péptidos presentan una longitud de por lo menos 5, preferentemente 6, aminoácidos, en particular por lo menos 8 aminoácidos, cuyas longitudes preferidas pueden extenderse hasta 11, preferentemente hasta 14 ó 20, aminoácidos. Sin embargo, según la invención, pueden utilizarse como receptores que se unen a APP también sin más péptidos más largos. Además, entre los receptores adecuados, se incluyen oligómeros (tales como por ejemplo polietilenimina y polilisina).

Naturalmente, para la preparación de los receptores de este tipo que se unen a APP, también son aptas bibliotecas de fagos, bibliotecas de péptidos, por ejemplo producidas por la química combinatoria por medio de técnicas de throughput-screening para una amplia gama de estructuras (ver, por ejemplo, en Phage Display: A Laboratory Manual by Carlos F. Barbas (Editor), et al; Willats WG, Phage Display: Practicalities and Prospects, Plant Mol Biol. 2002 Dec; 50(6): 837-54; http://www.microcollections.de/showpublications.php#). Además de las bibliotecas de fagos a base de randomización, también son aptas bibliotecas que utilizan un display ribosomal o un display bacteriano. Las bibliotecas correspondientes y los procedimientos para su generación son conocidos por los expertos en la materia y se han descrito, entre otros, en los documentos US 2004/0110281 A, WO 00/72880 A y WO 02/059148 A.

Además, pueden utilizarse también los receptores que se unen a APP a base de ácidos nucleicos ("aptámeros"; pero también oligodesoxinucleótidos "decoy" (oligonucleótidos ds que, a base de su secuencia, constituyen sitios de unión para los factores de transcripción), que pueden encontrarse también por medio de una amplia gama de bibliotecas (de oligonucleótidos) (por ejemplo los que presentan 2-180 radicales de ácido nucleico (por ejemplo Burgstaller et al., Curr. Opin. Drug Discov. Dev. 5 (5) (2002), 690-700; Famulok et al., Acc. Chem. Res. 33 (2000), 591-599; Mayer et al., PNAS 98 (2001), 4961-4965, y muchos otros). El esqueleto de ácido nucleico puede encontrarse por ejemplo por medio de los compuestos de fosfodiéster, pero también por medio de fosforotioatos o combinaciones o variaciones químicas (por ejemplo como PNA), en las que, según la invención, pueden utilizarse como bases en particular U, T, A, C, G, H y mC. Los radicales 2' de los nucleótidos que pueden utilizarse según la invención son preferentemente H, OH; F, Cl, NH_{2}, O-metilo, O-etilo, O-propilo u O-butilo en los que los ácidos nucleicos pueden estar modificados también de otra manera, es decir, pueden proveerse por ejemplo de grupos protectores tales como se utilizan normalmente en la síntesis de oligonucleótidos. Por tanto, para los fines de la presente invención, los aptámeros que se unen a APP también constituyen moléculas de afinidad preferidas que se unen a APP.

Los aptámeros para APP pueden encontrarse por ejemplo utilizando el procedimiento descrito a continuación. Se contacta APP inmovilizada (u otra de las formas descritas anteriormente) con una mezcla de ácidos nucleicos, separando los ácidos nucleicos que se unen con alta afinidad de los ácidos nucleicos que se unen con baja afinidad o no se unen en absoluto. Las mezclas de los ácidos nucleicos son típicamente bibliotecas de ácidos nucleicos, que se prepararon por ejemplo por la ruta de la química combinatoria. Una biblioteca de ácidos nucleicos contiene un gran número de ácidos nucleicos distintos uno del otro, en los que por lo menos en una parte de la secuencia se ha establecido una randomización (con nucleótidos naturales y/o no naturales). Puede, pero no debe, haberse previsto una parte de la secuencia conservada. Una randomización en n posiciones con m nucleótidos distintos produce una biblioteca con nm elementos.

Con el fin de encontrar ácidos nucleicos de afinidad específicos de APP, se llevan a cabo las siguientes etapas: a) una columna se carga (por el interior) con APP (etc.), y APP (etc.) se inmoviliza dentro de la columna, b) la mezcla de ácidos nucleicos se introduce por un extremo de la columna, habiéndose establecido un caudal definido de la sustancia portadora, que va del primer extremo al segundo extremo de la columna, c) los ácidos nucleicos se unen a APP con afinidad descendiente para APP (etc.) a una distancia ascendiente del primer extremo de la columna y se inmovilizan, d) el caudal de la sustancia portadora por la columna se termina tras un tiempo de marcha definido, e) la columna se separa en segmentos de columna por medio de una pluralidad de divisiones y a cada segmento se asigna una coordenada de camino transcurrido, f) de por lo menos un segmento se desorben los ácidos nucleicos inmovilizados de manera no específica y se obtienen asignando la coordenada de camino transcurrido al segmento. El término por el interior de la columna significa dentro de un lumen en toda su generalidad. El término columna debería comprender cualquier
tipo de sistemas de soportes sólidos, por ejemplo también sistemas de soporte que no estén completamente encerrados.

La inmovilización de APP (etc.) puede realizarse según los métodos convencionales de la cromatografía en columna. El término columna se refiere a cualquier constructo mecánico que presente un lumen con dos extremos. Entre los materiales estructurales aptos, se incluyen todos los materiales convencionales para columnas, tales como metales, vidrio y/o plásticos. Por su interior, la columna puede estar provista de una matriz que se une a APP (etc.) y/o el material estructural puede ser apto o haberse preparado para la unión directa de las moléculas de destino. Una mezcla de ácidos nucleicos se denomina biblioteca de ácidos nucleicos de típicamente 10^{6} a 10^{22} /mol, en particular de 10^{10} a 10^{21}/mol, de especies de ácidos nucleicos ácidos nucleicos distintas una de otra. En la biblioteca introducida en la columna, cada especie de ácido nucleico está representada estadísticamente con un número de típicamente 10 a 10^{17}, en particular de 100 a 10^{13}, moléculas. La sustancia portadora es normalmente un líquido en la que la biblioteca de ácidos nucleicos es soluble y estable. Aptos para esto son todos los tampones convencionales para bibliotecas de ácidos nucleicos y similares. El caudal de la sustancia portadora puede ajustarse antes de aplicar la biblioteca de ácidos nucleicos. A continuación, la biblioteca de ácidos nucleicos se adiciona al caudal de la sustancia portadora por el lado de entrada de la columna. Sin embargo, también es posible introducir la biblioteca de ácidos nucleicos directamente. Tras un tiempo de marcha determinado por la estructura de la columna y el caudal ajustado, el "tapón" aplicado por medio de la biblioteca de ácidos nucleicos sale por el lado de salida de la columna (ampliado por pliegue con la difusión), lo cual separa los ácidos nucleicos ligados del "tapón" y los inmoviliza en la columna. Ventajosamente, el caudal se ajusta a un flujo poco o no turbulento, preferentemente laminar (suma de los vectores de aceleración de la sustancia portadora sobre el volumen de la columna, en particular sobre la sección transversal, a un mínimo, en el caso ideal 0). El número total de las moléculas de APP en la columna es típicamente de 10^{2} a 10^{16} más, en particular 10^{3} a 10^{15} más, que el número de las moléculas de los ácidos nucleicos de una sola especie en la biblioteca de ácidos nucleicos aplicada. La unión de los ácidos nucleicos a las moléculas de APP se realiza preferentemente en las condiciones que corresponden a la utilización posterior de los ácidos nucleicos durante la aféresis, por ejemplo en un tampón adecuado, adaptado de forma adecuada con relación a la temperatura, fuerza iónica, valor pH y las condiciones de tampón. La sustancia portadora así como el disolvente de la biblioteca de ácidos nucleicos deben seleccionarse entonces de forma adecuada con relación a sus componentes. La división de la columna en una pluralidad de segmentos de la columna puede realizarse cortando la columna, realizándose los cortes preferentemente ortogonalmente al vector del caudal. Sin embargo, la columna puede haberse compuesto también anteriormente por segmentos de la columna, en cuyo caso un segmento de columna se enfila estrechamente con el próximo segmento de columna preferentemente en la dirección del vector de caudal (sección transversal de junta ortogonal al vector de caudal). En este caso, la división puede realizarse deshaciendo el conjunto de segmentos de columna formado anteriormente. La desorción no específica puede llevarse a cabo por elución con un ligando lo suficientemente fuerte por desplazamiento, formación de complejos, modificación y/o destrucción de APP fisicoquímica o térmicamente. Métodos mecánicos, por ejemplo ultrasonido, pueden utilizarse también para la desorción o para reforzar la desorción. Pueden aplicarse también combinaciones de los métodos de desorción citados anteriormente. Se da por entendido que los ácidos nucleicos no deben ser destruidos por los métodos de desorción utilizados.

Las etapas descritas anteriormente se basan en el hallazgo de que una biblioteca de ácidos nucleicos puede separarse espacialmente por cromatografía de afinidad de forma análoga a una mezcla de proteínas según su afinidad para la molécula de destino, en el caso descrito aquí para APP (etc.). La invención se basa asimismo en el hallazgo de que un mezclado de los ácidos nucleicos desorbidos de afinidades distintas obtenido como resultado de la desorción no específica puede evitarse dividiendo la columna que contiene los ácidos nucleicos unidos a la misma, antes la desorción no específica, por decir así en secciones de afinidad, lo que permite desorber de forma no específica los ácidos nucleicos unidos a las secciones de afinidad o segmentos de columna así obtenidos fácilmente y sin interferencias por acoplamiento de ligandos por ejemplo dentro de una PCR o RT-PCR y también amplificarlos de forma igualmente no específica. De esta manera, se eviten los artefactos de selección subsiguientes. Tampoco se necesitan ligandos, en particular altas concentraciones de ligandos, para la desorción. Finalmente, todas las moléculas de los ácidos nucleicos unidas y después desortas están disponibles para una amplificación. Esto permite trabajar con bajas concentraciones de ácidos nucleicos. En principio, ya es suficiente si cada especie está representada en la biblioteca de ácidos nucleicos en el promedio estadístico con una molécula. Si el número de las moléculas de APP en un segmento de columna es estadísticamente 1, es posible separar incluso especies de ácidos nucleicos individuales según su afinidad para la molécula de destino.

Una ventaja particular de dicho procedimiento se ilustrará a continuación. De la separación de los ácidos nucleicos según su afinidad resulta que los ácidos nucleicos en un segmento de columna presentan una afinidad similar, pero una especificidad diferente (se unen a regiones diferentes de APP o las mismas son sitios de unión para los ácidos nucleicos de afinidad para APP).

En principio, es suficiente si un segmento al que se ha asignado la afinidad deseada se somete (aislado) a un procesamiento ulterior por desorción. Sin embargo, esto supone - excepto cuando la afinidad es máxima, en cuyo caso se somete el primer segmento de columna (relativo al vector de caudal) a un procesamiento ulterior - que se tenga una idea de la distribución de afinidad de la biblioteca de ácidos nucleicos aplicada. Por tanto, por lo general, es preferido que se desorban los ácidos nucleicos inmovilizados por separado de cada segmento y se obtengan asignando en cada caso las coordenadas del camino transcurrido de cada segmento a los ácidos nucleicos obtenidos del mismo.

En principio, cualquier tipo de desorción es posible. Preferentemente, la desorción no específica se realizará por medio de los métodos fisicoquímicos o térmicos convencionales. La desorción térmica se efectúa calentando el segmento de columna o de la solución contenida en el mismo. El calentamiento puede realizarse por ejemplo por calentamiento eléctrico o irradiación con microondas o IR. Son aptas en particular las técnicas de calentamiento de la tecnología PCR. Naturalmente, además de la amplificación de ácidos nucleicos o aptámeros por medio de polimerasa, pueden aplicarse también otros métodos de amplificación, tal como por ejemplo por medio de ligasa. La desorción no específica puede ser asistida por modificación química de APP, por ejemplo oxidación con periodato sódico o similares, o por formación de complejo no específica, por ejemplo por medio de borato o similar para bloquear los enlaces de cis-trans-diol en carbohidratos.

Por tanto, se prefiere realizar la desorción no específica por desorción térmica en una fase de alta temperatura, preferentemente alargada, de una PCR o RT-PCR. Esto produce un efecto sinérgico, puesto que por lo general, en particular cuando se trabaja con bibliotecas de ácidos nucleicos a bajas concentraciones de la especie de ácido nucleico, es necesaria de todas formas una amplificación. Para aumentar el rendimiento, se trabajará por ejemplo con entre 5 y 60, preferentemente entre 20 y 60, más preferentemente entre 45 y 55, ciclos. Dentro de la amplificación, es posible trabajar por lo menos con un cebador marcado. El cebador puede comprender por lo menos un punto de corte de endonucleasa. Un punto de corte de este tipo sirve por ejemplo para eliminar la mayor parte de la secuencia del cebador del amplificado. Los elementos constituyentes de ácido nucleico, o bien en el cebador o bien en los ácidos nucleicos a seleccionar, pueden ser marcados por ejemplo con colorantes fluorescentes. Como ejemplos de colorantes fluorescentes pueden citarse: Alexa TM Fluor 488, Fluor 532, Fluor 546, Fluor 568, Fluor 594, Oregon Green 488, fluoresceína, rodaminas 6G, tetrametilrodaminas, rodaminas B y Texas Red. El amplificado puede ser marcado también con dos modificaciones químicas distintas por extremos distintos, siempre que los grupos introducidos por la modificación sean aptos cada uno para unirse como ligando a una matriz de afinidad distinta.

Para la separación segura de los ácidos nucleicos no afines o poco afines, se recomienda incorporar etapas de lavado entre etapas adecuadas del procedimiento. En particular, se prefiere llevar a cabo por lo menos una etapa de lavado entre las etapas del procedimiento d) y e). Apto para el lavado es por ejemplo el disolvente o el medio de la biblioteca de ácidos nucleicos o la sustancia portadora.

Es preferido realizar el recubrimiento de la columna por el interior con APP (etc.) y su inmovilización por medio de enlaces covalentes, preferentemente tras activación con grupos de alta reactividad química (por ejemplo cloruro de tresilo, cianobromuro y/o periodato) o a través de compuestos espaciadores bifuncionales tras modificación con grupos de baja reactividad química (por ejemplo amino, hidroxi, keto y/o carboxilo). Entre los ejemplos de los compuestos espaciadores aptos para los esqueletos espaciadores se incluyen: grupos C2-C10-alquilo substituidos y no substituidos, grupos C2-C10-alquenilo substituidos y no substituidos, grupos C2-C10-alquinilo substituidos y no substituidos, grupos C4-C7-carbocicloalquilo substituidos y no substituidos, grupos C4-C7-carbocicloalquenilo substituidos y no substituidos grupos C7-C14-aralquilo substituidos y no substituidos, una molécula heterocíclica con heteroátomos seleccionados entre nitrógeno, oxígeno, azufre, en los que dichas sustituciones pueden consistir en alquilo, alquenilo, alquinilo, alcoxi, tiol, tioalcoxi, hidroxi, arilo, bencilo, fenilo, nitro, halógeno, grupos éter con entre 2 y 10 átomos de carbono entre 1 y 4 átomos de oxígeno o azufre, polialquilglicol, halógeno, hidroxi, tiol, keto, carboxilo, amidas, compuestos de éter, tioéter, derivados de arnidina, derivados de guanidina, derivados de glutamilo, nitrato (ONO_{2}), Nitro (NO_{2}), nitrilo, trifluorometilo (-CF_{3}), trifluorometoxi (-OCF_{3}), O-alquilo, S-alquilo, NH-alquilo, N-dialquilo, O-aralquilo, S-aralquilo, NH-aralquilo, amino, azido (N_{3}), hidrazino (NHNH_{2}), hidroxilamino (ONH_{2}), sulfóxidos (SO), sulfonas (SO_{2}), sulfuros (S-), disulfuros (S-S), sililo. Típicamente, los compuestos espaciadores son bifuncionales, en los que las funcionalidades pueden ser iguales o diferentes y están seleccionadas por ejemplo del grupo constituido por "N-hidroxisuccinimido y hidrazidas".

Para reducir la variedad dentro de los ácidos nucleicos obtenibles de un segmento de columna, se prefiere que cada segmento de columna contenga en el promedio estadístico 0,1 a 10^{3}, preferentemente 1 a 10^{2}, de forma más preferida 1 a 10, moléculas de APP (etc.). Adaptada a esto, la biblioteca de ácidos nucleicos, tal como se ha aplicado, puede contener en el promedio estadístico 0,1 a 10^{3}, preferentemente 1 a 10^{2}, de forma más preferida 1 a 10, moléculas de ácido nucleico de una especie.

Los materiales que son aptos para el material estructural de la columna son básicamente todos los materiales conocidos por ejemplo de la cromatografía de afinidad. Entre ellos se incluyen gel de sílice o polímeros, tales como polietileno tras activación por formación de derivados química o activación por plasma. Ventajosamente, la longitud de los segmentos de columna se sitúa en el intervalo comprendido entre 0,1 \mum y 1 mm, preferentemente entre 0,1 y 100 \mum, de forma más preferida entre 0,05 y 10 \mum. Cortes de este tipo son fáciles de preparar por ejemplo por medio de un micrótomo. Ventajosamente, el diámetro interno de la columna está comprendido entre 0,5 y 1 mm, preferentemente entre 0,1 y 0,5 mm, de forma más preferida entre 0,2 y 0,4 mm.

Es ventajoso eliminar los ácidos nucleicos no deseados antes de la separación propiamente dicha (unión o separación mecánica). Los ácidos nucleicos no deseados son por ejemplo los ácidos nucleicos que se unen a las superficies internas libres de APP. En este caso, una columna libre de APP puede conectarse corriente arriba y la biblioteca de ácidos nucleicos puede pasarse primero por la misma.

En los procedimientos citados anteriormente, puede trabajarse de forma continua, es decir, conectando las columnas por ejemplo en serie, o de forma discontinua, recogiendo el eluado en el entretanto por ejemplo de la columna anterior.

Para conseguir otra mejora de la separación por afinidad, es básicamente posible proceder de maneras distintas. Así, los ácidos nucleicos que han sufrido desorción de uno o más segmentos, si se desea tras una amplificación, pueden someterse de forma repetida al procedimiento según la invención, y/o la elutropia de las condiciones de desorción puede aumentarse (temperatura, fuerza iónica, valor pH, condiciones de tampones). Alternativamente, puede disminuirse la densidad espacial de la APP y por consiguiente de los ácidos nucleicos unidos, es decir, el número de las moléculas de APP, en un segmento de columna.

Por tanto, para los objetivos de la presente invención, los aptámeros que se unen a APP (que incluyen, según la invención, tal como se ha definido anteriormente, también los aptámeros que se unen a A\beta42) son también receptores preferidos que se unen a APP.

Por tanto, según la invención, los receptores que se unen a APP, constituidos preferentemente por péptidos, anticuerpos o ácidos nucleicos, se utilizan unidos a un material de soporte, para la eliminación extracorpórea de APP y de sus productos de degradación del cuerpo de los pacientes (a riesgo) de Alzheimer.

La aplicación de la presente invención a la práctica rutinaria de médica requiere que el portador sea estéril y libre de pirógeno, con lo cual cualquier sustancia portadora o cualquier combinación de receptor/portador que cumple con dichas características es preferida según la invención (ver, por ejemplo, las patentes US nº 6.030.614 o US nº 5.476.715). Entre los ejemplos que son aptos, se incluyen homopolímeros porosos, co- o terpolímeros de monómeros que contienen vinilo (por ejemplo ácido acrílico, tales como por ejemplo TSK Toyopearl, Fractogel TSK), portadores con modificaciones (activaciones) con compuestos que contienen oxirano (por ejemplo epiclorhidrina) y, dado el caso, otras reacciones con compuestos que contienen NH_{3}, amino o carboxilo, o adsorbentes de CNBr o CNCl, tal como se ha descrito en los documentos EP 110 409 A y DE 36 17 672 A. Los materiales adsorbentes particularmente preferidos para fines terapéuticos son aptos para evitar una pérdida de células sanguíneas, no activan el sistema de complemento o sólo en menor grado y, si es posible, retardan la formación de agregados en el circuito extracorpóreo. Además, los materiales de soportes deberían ser también en forma acoplada a los receptores preferentemente lo suficientemente estables frente a las medidas de esterilización, en particular frente a la saturación con óxido de etileno, saturación con glutaraldehído, irradiación gamma, tratamiento con vapor, tratamiento UV, tratamiento con disolventes y/o tratamiento con detergente, etc. Por ejemplo, pueden utilizarse también productos a base de sefarosa, agarosa, acrilo, vinilo, dextrano, etc., que preferentemente ya contienen, en su forma disponible en el mercado, grupos funcionales que son aptos para enlazar con los receptores que se unen a APP. Entre los portadores adicionales aptos, se incluyen también monolitos (portadores a base del polímero metacrilato de glicidilo/co-dimetacrilato de etilenglicol) Subpol (Poschalko et al., J Am Chem Soc. 2003 Nov 5; 125 (44): 13415-26).

Para el acoplamiento de los receptores a los portadores aptos, puede utilizarse la química conocida por los expertos en la materia (por ejemplo Bioconjugate Techniques, Greg T Hermanson, Ed., Academic Press, Inc, San Diego, CA, 1995, 785 pp).

Según otro aspecto, la presente invención se refiere a la utilización del dispositivo según la invención para proporcionar un dispositivo para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer o para la prevención de una enfermedad de este tipo preparando el dispositivo para ser apto para el tratamiento del paciente respectivo. El tratamiento se realiza conectando un paciente al aparato de aféresis durante un periodo de tiempo suficiente para una eliminación eficaz de los polipéptidos de APP y contactando el flujo de la sangre o del plasma del paciente con el soporte sólido que comprende el receptor que se une a APP, lo cual da lugar a la unión de APP y/o de los productos de degradación proteolíticos de APP, en particular A\beta42. En el transcurso del tratamiento de aféresis, hay que asegurar naturalmente el acceso a las venas periféricas o centrales o fístulas arterio-venosas, y también una anti-coagulación suficiente, así como registrar los datos de cuantificación y de medición. Además, en la mayoría de los procedimientos de aféresis será necesario realizar una separación primaria de las células sanguíneas y del plasma antes del tratamiento del plasma propiamente dicho. Las personas especiales para las que es necesaria una medida preventiva son las personas con antecedentes familiares, personas mayores (>50, >60 o >70 años) o personas con otro factor de riesgo para EA, en particular factores genéticos.

A continuación, la invención se ilustrará con mayor detalle haciendo referencia a los siguientes ejemplos así como a las figuras de los dibujos, a los cuales no estará naturalmente limitado, en los que:

La Fig. 1 muestra el enlace de A\beta_{42} con el péptido 1208 (acoplado con BSA y aplicado a una placa ELISA);

La Fig. 2 muestra el enlace del péptido 1208 (y de 1208-BSA) con A\beta_{42} (aplicado a una placa ELISA);

La Fig. 3 muestra la unión competitiva de A\beta_{42} en 1208-BSA.

1. Preparación del soporte que lleva el receptor de APP 1.1 Columna monolítica

Una columna CIM® Epoxy Monolithic (BIA Separations, SI) se equilibra según las especificaciones del fabricante con un tampón de fosfato sódico 0,5 M a un pH de 8,0, y se activa un anticuerpo monoclonal contra el péptido A\beta también según las especificaciones del fabricante y se acopla a la columna CIM. La columna se lava varias veces con el tampón de fosfato (+ NaCl 1 M) y cualquier grupo epoxi presente en exceso se bloquea.

Se asegura la calidad mediante un control en el eluado de equlibración y lavado, utilizándose sólo las columnas sin grupos epoxi activos y sin fugas de anticuerpos en el eluado para el procesamiento posterior, instalándose en un aparato de aféresis.

1.2 Columna de sefarosa

Un material de agarosa a granel (Sepharose CL4B) se introduce de forma aséptica en un recipiente estéril y libre de pirógeno, y el material se lava de forma aséptica, secando el material de gel completamente al vacío entre cada etapa de lavado. A continuación, la sefarosa se esteriliza al vapor de agua en una autoclave a 115ºC durante 30 minutos.

Tras la esterilización, la sefarosa se introduce en acetona/agua al 60% en un recipiente estéril y se activa con CNBr y trietilamina (14 g de CNBr por 96 ml de acetona; 30 ml de trietilamina en 66,2 ml de acetona al 87%). A continuación, se adicionó una solución de acetona/HCl (392 ml de agua estéril, libre de pirógeno; 16,3 ml de HCl 5 N, 408 ml de acetona). La sefarosa activada se lava y se somete a la reacción de acoplamiento dentro de 2 h, con el fin de impedir la hidrólisis de los grupos activados.

Una solución de anticuerpo filtrada en condiciones estériles (m266 o m243) se introduce en el recipiente de reacción y se agita durante por lo menos 90 min. Finalmente, la solución de reacción se lava cuidadosamente (con un tampón de fosfato isotónico) hasta que ya no se detecten productos de la reacción en el eluado, y la sefarosa acoplada a los anticuerpos se introduce en columnas de vidrio estériles y depirogenizadas de vidrio sinterizado y se somete a un control de calidad final (análisis del eluado con respecto a los productos de reacción, metales pesados, etc.; análisis de partículas, pirogenicidad; esterilidad).

2. Modelo animal para el tratamiento aferético de pacientes de Alzheimer

En el Instituto Para Diabetes "Gerhard Katsch", se ha desarrollado un sistema miniaturizado extracorpóreo para la aplicación de la terapia de aféresis en el modelo de animales pequeño rata. Un sistema de prueba aferético de este tipo está disponible por todo el mundo sólo de forma limitada. El tratamiento aferético repetido en el mismo animal de prueba y las investigaciones subsiguientes en la fase de observación posterior para la evaluación del éxito terapéutico son de gran valor novedoso y no han sido descritos en las publicaciones internacionales.

La aféresis es un método de terapia alternativa, en el que se eliminan de la sangre fuera del cuerpo las sustancias que provocan enfermedades. En la medicina humana, la aféresis se ha utilizado hasta la actualidad para el tratamiento de más de 100 enfermedades. La aféresis ha permitido eliminar por lo menos parcial- o totalmente de la sangre sustancias relevantes de enfermedades, entre otros, en las enfermedades autoinmunes, tales como artritis reumatoide, miastenia grave, oftalmopatía endocrina, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, síndrome Stiff-Man y diabetes tipo 1. Sin embargo, hasta la actualidad la aféresis está reconocida sólo como un método alternativo para el tratamiento de enfermedades crónicas resistentes a la terapia y asociadas a gran estrés y a una restricción sustancial de la calidad de vida de los pacientes involucrados. Un motivo principal de esto es el hecho de que hasta la actualidad no están disponibles conocimientos detallados referentes a los mecanismos de acción de una terapia de la aféresis eficaz.

La utilización de los modelos animales reconocidos, tales como por ejemplo los para la diabetes tipo 1 y la artritis reumatoide, permite tanto elucidar más los mecanismos de acción de los procedimientos de aféresis como ensayar preclínicamente nuevos tipos de indicación para el tratamiento aferético. Para realizar los tratamientos, los animales de prueba fueron provistos primero con catéteres vasculares crónicos. A continuación, por el circuito extracorpóreo se separaron los componentes plasmáticos y celulares de la sangre pasándolos por filtros de plasma. Mientras que los componentes celulares son devueltos inmediatamente al animal, el plasma puede purificarse, antes de ser devuelto, por medio de métodos de adsorción distintos (adsorción inmune u otros). La buena compatibilidad de los tratamientos aferéticos repetidos de este tipo ya ha sido documentada para distintas especies de ratas (peso corporal, hematocrito, condición general). El sistema de prueba aferético ha sido ensayado con éxito en animales con un peso mínimo de 250 g
y ha sido utilizado en los modelos de ratas para las enfermedades autoinmunes (diabetes tipo I, artritis inducida por colágeno tipo II).

El sistema extracorpóreo para la plasmaféresis en el modelo de animales pequeños puede utilizarse para tipos diferentes de adsorción. La aplicación de dicho sistema de prueba a los modelos para las enfermedades crónicas permite (A) ensayar nuevos estrategias de tratamiento y prevención, (B) la elucidación de los mecanismos de acción de diferentes tecnologías aferéticas y (C) la determinación del tipo de indicación para los procedimientos de terapia aferéticos. El IDK es su socio competente para el ensayo preclínico de los procedimientos aferéticos recién desarrollados y puede contribuir sustancialmente a transferir e introducir en el mercado nuevos procedimientos terapéuticos desde la fase de desarrollo hasta la prueba experimental en animales y la aplicación clínica en el paciente (http://www.praeklinik.de).

Antes de comenzar la terapia aferética experimental, los animales están provistos de los catéteres arteriales y venosos o se utilizan ratas crónicamente cateterizadas (catéteres vasculares aptos para la administración de sustancias de prueba y para la toma de muestras de sangre así como para la realización de la terapia aferética y las investigaciones Clamp en el modelo animal). En un primer paso de la aféresis, primero se separan las células sanguíneas del plasma mediante un filtro de plasma. Mientras que las células sanguíneas se devuelven inmediatamente al animal por difusión (mediante el catéter venoso), el plasma obtenido por la separación se pasa por el agente de adsorción preparado en el Ejemplo 1 (separando los ligandos del plasma uniéndolos a los péptidos de afinidad inmovilizados), antes de devolverlo al animal.

3. Aptámeros de A\beta42 3.1 Activación de una columna de gel de sílice con cloruro de tresilo

Por la columna se pasa una corriente de acetona. Para su activación, se pasa una solución anhidra (2 ml de acetona, 1 ml de cloruro de tresilo, algunas gotas de piridina) por la columna (diez veces el volumen de la columna) y la misma se incuba sobre hielo durante la noche. A continuación, se pasa una corriente de acetona al 100% (anhidra) con veinte veces el volumen de la columna. La columna activada puede guardarse en HCl 1 mM.

3.2 Activación de una columna de polietileno

Por un tubo de polietileno se pasa una solución (permanganato de potasio al 2% (KMnO_{4}) (p/v) en ácido sulfúrico concentrado (H_{2}SO_{4})) con 20 veces el volumen de la columna y luego la columna se lava con una corriente de agua destilada. Para el acoplamiento adicional de la superficie de la columna, pueden utilizarse para la reticulación moléculas bi- o polivalentes que contienen por lo menos un grupo aldehídico reactivo (por ejemplo 1% de glutaraldehído). Dichas moléculas se pasan por la columna a 4ºC durante 1 h. A continuación, la reacción se estabiliza por condiciones reductoras (por ejemplo utilizando cianoborohidruro sódico (0,00025% p/v en NaCl 0, 15 M, pH 3,9).

3.3 Acoplamiento de A\beta42 a la columna de gel de sílice activado

Por la columna activada por cloruro de tresilo, se pasa una corriente de Na_{2}CO_{3} 0,1 M (pH 8,5). Para el acoplamiento, se pasa repetidamente un péptido o proteína (2 mg/ml de Na_{2}CO_{3} 0,1 M, pH 8,5) a 37ºC durante 2 h y a continuación sobre hielo por la columna durante 4 h. A continuación, para bloquear los sitios de unión libres de la columna, se pasa un exceso de glicina 0,2 M, pH 8, para la columna.

3.4 Acoplamiento de una glicoproteína a la columna de polietileno activada

Por la columna activada, se pasa una corriente de Na_{2}CO_{3} 0,1 M (pH 8,5). Para el acoplamiento se pasa A\beta_{42} de (2 mg/ml de Na_{2}CO_{3} 0,1 M, pH 8,5) varias veces por la columna a 37ºC durante 2 h y a continuación sobre hielo durante 4 h. Para bloquear los sitios de unión libres, se pasa a continuación un exceso de glicina 0,2 M, pH 8, por la columna. Para mejorar la reacción, es posible adicionar 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC), al 5% p/v.

3.5 Preparación de una columna para eliminar moléculas no deseadas

Por la columna activada por cloruro de tresilo se pasa una corriente de Na_{2}CO_{3} 0,1 M (pH 8,5). Si se desea eliminar una molécula con una o más aminas primarias o secundarias, dicha molécula o la mezcla (2 mg/ml de Na_{2}CO_{3} 0,1 M, pH 8,5) se pasa por la columna repetidas veces a temperatura ambiente durante la noche. Para bloquear los sitios de unión libres de la columna, se pasa a continuación un exceso de glicina 0,2 M, pH 8, por la columna. Si no se desea una eliminación de moléculas determinadas con una o más aminas primarias o secundarias, todos los sitios de unión de la columna se bloquean con glicina.

Otros procedimientos para la formación de derivados pueden encontrarse por ejemplo en las siguientes referencias: Patterson, W. J., National Aeronautics and Space Administration, Technical Memorandum, NASA TMX-73311, U.S. Government Printing Office, Washington D.C., 1976, Ma, S. M., Gregonis D. E., von Wagenen, R. A., and Andrade, J. D., en "Hydrogels for Medical and Related Applications" (J. D. Andrade, Ed.), Amer. Chem. Soc. Symp. Series, Vol. 31, p. 241, 1976, Harris, J. M., Struck, E. C., Case, M. G., Paley, M. S., Van Alstine, J. M., and Brooks, D. E., J. Polymer Sci., Polymer Chem. Ed., 22, 341 (1984), Regnier and Noel, Regnier, F. E., and Noel, R. J., J. Chromatog. Sci., 14 (1976), Yalpani, M. and Brooks, D. E., J. Polymer Sci., Polymer Chem. Ed., 23, 395 (1985).

3.6 Realización del contacto de los ácidos nucleicos con A\beta_{42} y separación de la columna

Las columnas recubiertas se conectan en serie sin fuga, primero las columnas para la eliminación de las moléculas no deseadas y entonces la columna de A\beta_{42}. Para la equilibración, se pasa un tampón adecuado, por ejemplo una solución de tampón (Tris-HCl 10 mM, KCl 50 mM, MgCl_{2} 1,5 mM y gelatina al 0,001% (p/v), pH 8,3) sobre hielo por la columna durante 1 h. Los ácidos nucleicos de la biblioteca de ácidos nucleicos combinatoria se introducen en 1 ml del mismo tampón y, para fundir las dobles hebras, se calientan a 95ºC durante 10 min y, a continuación, se pasan repetidas veces (4-30 veces) por la columna. A continuación, las columnas se separan y se lavan sobre hielo con el tampón seleccionado (ver arriba) durante la noche. La separación de la columna en dirección del flujo se efectúa con una herramienta de corte adecuada.

4. Estudios de la unión de A\beta_{42} al péptido 1208 (FGFPEHLLVDFLQSLS-C)

Para el análisis de la unión de beta-amiloide al péptido 1208, se acopló el péptido en primer lugar a una proteína portadora (BSA), siendo la concentración del péptido de 500 \mumol (aproximadamente 1 mg/ml). El 1208 conjugado con BSA se unió a una placa ELISA, uniéndose 100 ng de péptido por pozo. La placa ELISA se saturó con PBS, BSA al 1% y, a continuación, la unión de beta-amiloide (1-42) se analizó en un intervalo de concentraciones de 8 a 1000 ng/pozo. El beta-amiloide unido se detectó con un anticuerpo específico de ratón. Utilizando un anticuerpo anti-ratón biotinilado y peroxidasa acoplada a estreptavidina, se determinó finalmente la cantidad del beta-amiloide unido. El substrato utilizado era ABTS, que se analizó en un lector ELISA a una longitud de onda de 405 nm. (Fig. 1).

Para analizar la unión del péptido 1208, se unió beta-amiloide (1-42) a una placa ELISA (500 ng por pozo). A continuación, la placa ELISA se saturó con PBS, BSA al 1% y entonces se adicionó el péptido 1208 libre o el 1208 conjugado con BSA (1,6-50 ng). El péptido unido se detectó con un anticuerpo monclonal específico. Para la cuantificación final, se utilizó un anticuerpo anti-ratón biotinilado y peroxidasa acoplada a estreptavidina. El substrato utilizado era ABTS, que se analizó en un lector ELISA a una longitud de onda de 405 nm. (Fig. 2).

El 1208 conjugado con BSA se unió a una placa ELISA (100 ng de péptido por pozo), y la placa ELISA se saturó con PBS, BSA al 1%. A continuación, la unión de beta-amiloide (1-42) (1000 ng por pozo) se analizó en presencia del péptido 1208 libre o del péptido de control (intervalo de concentración 30-2000 ng/pozo). La detección del beta-amiloide unido se realizó tal como se ha descrito. (Fig. 3).

Claims (4)

1. Dispositivo de aféresis con un soporte sólido que puede entrar en contacto con el flujo de sangre o de plasma, caracterizado porque el soporte sólido comprende un receptor que se une a la proteína precursora de \beta-amiloide (APP).

2. Dispositivo según la reivindicación 1, caracterizado porque el receptor que se une a APP se ha seleccionado de entre anticuerpos anti-APP, anticuerpos anti-A\beta_{40}, anticuerpos anti-A\beta_{42}, proteínas que se unen a APP, en particular gelsolin, apoJ o apoE, péptidos que se unen a APP, gangliósidos que se unen a APP, en particular GM1, o ácidos nucleicos que se unen a APP, en particular aptámeros o mezclas de dichos receptores.

3. Dispositivo según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el soporte es una columna estéril y libre de pirógeno.

4. Utilización de un dispositivo según una de las reivindicaciones 1 a 3, para proporcionar un dispositivo de tratamiento destinado al tratamiento de la enfermedad de Alzheimer o para la prevención de la misma.