ES2297910T3 - Estabilizacion de liquidos biologicos mediante adicion de esteres estearicos. - Google Patents

Abstract

Estabilización de disoluciones biológicas, especialmente fluidos corporales, utilizando derivados de éster de estearina. Los derivados de éster de estearina (I) se utilizan en disoluciones biológicas para estabilización a largo plazo. Los derivados de éster de estearina de fórmula (I) se utilizan en disoluciones biológicas para estabilización a largo plazo. n = 1-200; R{sup,1} = estearina y R{sup,2} = anillo alifático o aromático de 4-8C (que opcionalmente contiene al menos un N, S u O, o que contiene un alquilo de 0-12C). Se incluye una reivindicación independiente para un reactivo que comprende una matriz natural o artificial, al menos una sustancia diagnósticas y una estearina de fórmula (I) (0,05-5% en peso).

Description

Estabilización de líquidos biológicos mediante adición de ésteres esteáricos.

La presente invención se refiere a la utilización de ésteres esteáricos para la estabilización de larga duración de líquidos biológicos, especialmente de aquellos que se obtienen por liofilización y subsiguiente reconstrucción.

En todos los trabajos con líquidos biológicos, especialmente en aquellos o con ayuda de los cuales hay que realizar ensayos que deben ser evaluados, se plantea el problema de la turbidez. El origen de estas turbideces no es siempre detectable, frecuentemente son segregaciones de proteínas o lípidos de la solución. Se hacen corresponsables de estas inestabilidades las macromoléculas de lipoproteínas que se encuentran en los líquidos corporales, las cuales en virtud de su contenido en fosfolípidos insolubles en agua presentan per se una tendencia a la aglomeración.

Si se almacenan soluciones protéicas lábiles se puede llegar igualmente a enturbiamientos o a la adsorción de las proteínas a las paredes de los vasos, los cuales empeoran considerablemente la calidad de estos productos.

Las inestabilidades anteriormente citadas se potencian aun más si los líquidos biológicos se liofilizan para su estabilización. Ejemplos de líquidos biológicos son suero, plasma, líquido cefalorraquídeo, exudados pleurales o ascitis de origen humano o animal.

En el sentido de la invención, estos líquidos biológicos pueden ser también soluciones compuestas sintéticamente a partir de una matriz líquida artificial o también natural, en sí conocida por el experto en la material (por ejemplo suero o una solución de NaCl tamponada con fosfato) y sustancias biológicas añadidas, las cuales a su vez se pueden haber preparado por tecnología genética.

Estas sustancias compuestas sintéticamente se utilizan frecuentemente como sueros de control o sueros estándar.

Por sueros de control se han de entender sueros de origen humano o animal con una composición eventualmente diferente, pero parecida a la del suero, que contienen componentes del suero, por ejemplo proteínas, enzimas, sustratos determinables enzimáticamente y electrolitos, en concentración conocida y que son adecuados para el control de métodos de determinación de estos componentes séricos.

Para garantizar la capacidad de conservación de componentes lábiles tales como, por ejemplo, enzimas o lipoproteínas, los líquidos biológicos se pueden almacenar liofilizados y/o a baja temperatura, de modo preferido por debajo de -18ºC. Efectos secundarios no deseados de una liofilización son las turbideces que aparecen después de la reconstrucción de los sueros de control por modificación del comportamiento a la disolución sobre todo de las lipoproteínas. Estas turbideces molestan frecuentemente para los métodos espectrofotométricos, de manera que, por ejemplo, se requiere adicionalmente un valor ciego de la muestra.

Puesto que los problemas por turbidez aparecen con frecuencia, también se emprendieron ya numerosos ensayos para su eliminación. Aun cuando ya se encontraron soluciones, estas se restringían por el momento a campos de aplicación y condiciones estrechamente limitados.

En el documento DE-P 31 07 060 se describe la adición de sustancias orgánicas, no de tipo azúcar, tales como metanol, alanina, trietilenglicol, valina, acetato, lactato o 2-hidroximetilbutirato de sodio. Una adición de este tipo puede provocar, por ejemplo en el caso de alanina y metilbutirato, perturbaciones de reacciones enzimáticas. Una adición de metanol es en general peligrosa para la salud. Si se utiliza acetato de sodio, el suero de control ya no se puede emplear como suero de control universal para determinaciones electrolíticas. Una adición de compuestos de amonio perturba en el caso de determinaciones de urea. Otras sustancias pueden provocar perturbaciones generales en los ensayos.

Otro procedimiento para evitar turbideces se ha prescrito en el documento DE-OS 33 29 952 por adición de prolina y desoxicolato de Na. Sin embargo, esta adición tiene la desventaja a que conduce, por ejemplo, a artefactos en el caso de la separación de proteínas, y dificulta la separación de la albúmina con ácido tricloroacético, por ejemplo en la determinación de creatinina.

Por lo tanto, la presente invención tenía por objeto encontrar un procedimiento que se pudiera aplicar en general para la estabilización de larga duración de líquidos biológicos.

Sorprendentemente, por adición de ésteres esteáricos a líquidos biológicos se podía conseguir una estabilización incluso en presencia de lipoproteínas. También después de la liofilización de líquidos corporales con contenidos de lipoproteínas a los que se añadieron ésteres esteáricos se obtiene, después de su disolución, un producto transparente.

Sorprendentemente se comprobó también que soluciones protéicas lábiles, que tienden al enturbiamiento o cuyas proteínas se adsorben fácilmente a las paredes vasculares, se estabilizan por adición de ésteres esteáricos.

Sorprendentemente se encontró, que también se pueden preparar sueros de control reconstruidos de forma más homogénea, especialmente de turbidez más escasa, si antes de la liofilización de añade al suero de control un éster esteárico. Por ello, el suero no sólo se vuelve en general más homogéneo sino que también mejora la precisión de las determinaciones de concentración y actividad de los parámetros contenidos en el suero de control, es decir que facilita al usuario de sueros de control de calidad, la recuperación de los valores nominales declarados.

Los ésteres esteáricos pertenecen a la clase de sustancias esteroideas (derivados de gonanos) que se caracterizan en general por un grupo hidroxi en la posición 3\beta. Las diferencias esenciales se encuentran en la cadena lateral situada en la posición 17(20). Las estearinas representan una amplia clase (BEYER et al. (1981), Lehrbuch der organischen Chemie, págs. 649-664 "Steroide"(esteroides). Los experimentos llevados a cabo con diferentes representantes de esta clase -por ejemplo vitamina D3, estrona, colesterol y estigmasterina- demuestran que se garantiza una capacidad de aplicación general. Particularmente ventajosos son los derivados del colesterol.

Los ésteres esteáricos conformes a la invención poseen, además, un grupo polietilenglicol acoplado a través de un ácido dicarboxílico. En principio, se pueden utilizar todos los ácidos dicarboxílicos conocidos, puesto que para la función conforme a la invención esencialmente es decisiva la reactividad bifuncional. De manera ventajosa, se pueden utilizar los siguientes ácidos dicarboxílicos: ácido succínico, ácido adípico, ácido sebácico.

En esencia, el grupo PEG (polietilenglicol) debe garantizar la solubilidad del éster esteárico, de manera que el experto en la materia pueda determinar fácilmente la longitud óptima, eventualmente por un experimento. Conforme a la experiencia, son ventajosas las siguientes longitudes de cadena: polietilenglicol 600, polietilenglicol 900 o polietilenglicol 3000.

Como medida del efecto de estabilización sirve ventajosamente el comportamiento de la turbidez medida en un procedimiento nefelométrico. Con ayuda de la presente invención es fácil para el experto en la materia emplear otro procedimiento correspondiente.

Por consiguiente, es objeto de la invención un procedimiento para la estabilización de líquidos biológicos, así como los líquidos así estabilizados.

Para la estabilidad de larga duración de líquidos biológicos se prefiere en este caso la utilización de ésteres esteáricos de la fórmula general I

Fórmula IR_{1}-O-(O)C-R_{2}-C(O)-O-[CH_{2}-CH_{2}-O]_{n}-CH_{2}-CH_{2}-OH

en la cual son

n =

1-200, y

R_{1} =

estearina

R_{2} =

un anillo alifático o aromático con 4 a 8 átomos de C, de los cuales al menos uno puede ser reemplazado por N, S u O, o representa un cadena lineal o ramificada con 0 a 12 átomos de C, de modo particular se prefiere la utilización de un éster esteárico en el cual R_{1} sea un compuesto de la fórmula general II:

2

R_{4} y R_{5} pueden ser H o -CH_{3}

R_{6}

puede ser una cadena lineal o ramificada con 1 a 12 átomos de C, un grupo -OH o un grupo =O,

los anillos A, B, C y D, cada uno por sí mismo, pueden ser saturados, insaturados o aromáticos,

y cuando R_{4} = -C(19)H_{3}, el anillo B entre C(9) y C(10) puede ser abierto bajo la formación de un enlace doble entre C(9) y C(19).

Muy particularmente preferida es la utilización de ésteres esteáricos cuando el radical esteárico procede de colesterol, de vitamina D3, de estigmasterina o de estrona.

De manera ventajosa, el éster esteárico se añade en una cantidad tal que la concentración en el líquido biológico sea 0,05 - 5% en peso, preferentemente 0,1 - 3% en peso y, de modo particularmente preferido, 0,5 - 1,5% en peso.

Preferentemente, el líquido biológico se liofiliza según procedimientos en sí conocidos por el experto en la materia, y se reconstruye para su empleo.

El líquido biológico también se puede guardar congelado hasta su empleo, ventajosamente hasta \leq -18ºC.

Objeto de la invención es también un reactivo, constituido esencialmente por una matriz natural o artificial, de una sustancia diagnósticamente relevante (analito) y de un éster esteárico de la fórmula general I en una concentración de 0,05 a 5% en peso.

Para conseguir el efecto conforme a la invención, los ésteres esteáricos conformes a la invención se pueden combinar también con los estabilizantes conocidos, especialmente con detergentes.

Particularmente ventajosas son en este caso las combinaciones de ésteres esteáricos con detergentes no iónicos y/o híbridos. En estas combinaciones se puede reducir ventajosamente la concentración de éster esteárico.

Líquidos biológicos en el sentido de esta invención se han descrito ya más delante.

La expresión de estabilidad de larga duración depende también, entre otros, del procedimiento de medición y de los analitos. Fundamentalmente, la estabilidad debería ser sin embargo de al menos 6 meses, preferentemente de al menos 12 meses y, de modo particularmente preferido, de al menos 18 meses. Un líquido biológico se califica como estable en el sentido de la presente invención cuando la turbidez medida a 546 nm frente a la turbidez del líquido de partida no se ha incrementado en más del 300%.

Los siguientes ejemplos ilustran la invención, sin limitarla.

Ejemplo 1

Plasma-citrato de un donante sano se mezcló con diferentes concentraciones de colesterol-PEG9000 (FLUKA CH-9471 Buchs/Suiza, art. nº 26735) (CP) y, después, se liofilizó según procedimientos en sí conocidos por el experto en la materia.

Para la documentación de la turbidez, después de la reconstrucción del liofilizado se midieron el valor ciego en el nefelómetro de Behring (BNA, Dade Behring Marburg GmbH, D-35001 Marburg/Alemania) y la extinción a
546 nm.

\vskip1.000000\baselineskip

3

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 2

Suero humano se mezcló con diferentes concentraciones de colesterol-PEG900 (CP) y se almacenó a diferentes temperaturas (2-8ºC, -20ºC) o, respectivamente, se liofilizó.

Para la documentación de la turbidez se midieron el valor ciego en el nefelómetro de Behring (BNA) y la extinción a 546 nm.

4

Claims (9)

1. Utilización de ésteres esteáricos de la fórmula general I

R_{1}-O-(O)C-R_{2}-C(O)-O-[CH_{2}-CH_{2}-O]_{n}-CH_{2}-CH_{2}-OH

en la cual son

n =

1-200, y

R_{1} =

estearina

R_{2} =

un anillo alifático o aromático con 4 a 8 átomos de C, de los cuales al menos uno puede ser reemplazado por N, S u O, o representa un cadena lineal o ramificada con 0 a 12 átomos de C

para la estabilización de líquidos biológicos.

2. Utilización conforme a la reivindicación 1, siendo R_{1} un compuesto de la fórmula general II:

6

R_{4} y R_{5} pueden ser H o -CH_{3}

R_{6}

puede ser una cadena lineal o ramificada con 1 a 12 átomos de C, un grupo -OH o un grupo =O,

los anillos A, B, C y D, cada uno por sí mismo, pueden ser saturados, insaturados o aromáticos,

y cuando R_{4} = -C(19)H_{3}, el anillo B entre C(9) y C(10) puede ser abierto bajo la formación de un enlace doble entre C(9) y C(19).

3. Utilización conforme a la reivindicación 1, seleccionándose R_{1} del grupo: colesterol, vitamina D3, estigmasterina y estrona.

4. Utilización conforme a la reivindicación 1, caracterizada por el éster esteárico se añade en una concentración tal que la concentración en el líquido biológico sea 0,05% en peso a 5% en peso.

5. Utilización conforme a una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque el líquido biológico se liofiliza y para su empleo se reconstruye.

6. Utilización conforme a una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque hasta su empleo el líquido biológico se conserva congelado, ventajosamente a \leq -18ºC.

7. Utilización conforme a una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque la duración de la estabilización es de al menos 6 meses.

8. Utilización conforme a la reivindicación 7, caracterizada porque la duración de la estabilización es de al menos 12 meses.

9. Utilización conforme a la reivindicación 7, caracterizada porque la duración de la estabilización es de al menos 18 meses.