ES2293002T3 - Vacunas de polisacarido y glucoconjugado mejoradas. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento de conjugación que implica las etapas siguientes: A. activación de un antígeno de polisacárido exento de endotoxina contra un polisacárido polifuncional mediante un espaciador de diamino-alquilo introducido mediante: A1. desacoplamiento del O-de-hidrógeno obtenido mediante la introducción de grupos carbonilo reactivos con un agente oxidante para generar grupos aldehído en presencia de iones borato cuando se realiza la reacción en disolvente acuoso; reaccionando a continuación dichos grupos con el espaciador diamino-alquilo en presencia de un agente reductor, o mediante
Description
Vacunas de polisacárido y glucoconjugado
mejoradas.
Las vacunas de glucoconjugados datan su
desarrollo industrial para utilización humana después de 1990,
basándose en estudios teóricos y modelos moleculares originalmente
descritos entre 1929 y 1940. Estos estudios fueron reevaluados y
puestos de manifiesto a nivel molecular en la década de 1980 a 1990,
aprovechándose de las metodologías más recientes en desarrollo en
la era biotecnológica.
La estrategia de utilizar como vacuna un
antígeno semisintético que conlleva un carbohidrato unido por enlace
covalente a una proteína portadora, ha tenido la base experimental
en la demostración de que el sistema inmunitario de lactantes
humanos no está completamente maduro hasta los 2 años de edad, de
modo que los antígenos de polisacárido muy purificados no son
reconocidos de manera eficaz como antígenos extraños por el
hospedador humano. Como resultado, una cantidad adecuada de
anticuerpo IgG funcional y no anestésico no sigue a la inyección de
varias inyecciones de polisacárido. La proteína portadora no
desempeña la función de activar propiamente y reforzar la población
de linfocitos T cooperadores del sistema inmunitario del hospedador
que da como resultado a continuación la expansión de anticuerpos
IgG del suero que segregan linfocitos B con memoria específicos para
el polisacárido transportado así como para la proteína portadora.
El impacto de las vacunas de glucoconjugado en la Salud Pública
desde el principio de los noventa, ha sido inapreciable ya que han
salvado millones de vidas de niños en situación de riesgo de
infecciones agudas mortales, como la meningitis medular debida a
bacterias Gram-positivas y
Gram-negativas (S. pneumoniae, H. influenzae
o N. meningitidis).
Varias estrategias de conjugación química son
conocidas para preparar industrialmente un antígeno de conjugado
proteína-carbohidrato. Las técnicas conocidas no son
satisfactorias en cuanto a rendimientos cuantitativos.
El documento EP 0306607A da a conocer la
desintoxicación de LPS por hidrólisis del lípido A que produce
polisacárido exento de lípido A. El polisacárido obtenido de este
modo y la proteína se activan a continuación y se acoplan para
producir vacunas para bacterias Gram-negativas.
Según un aspecto, la presente solicitud se
refiere a un procedimiento de preparación que proporciona:
- A)
- la utilización de antígenos de polisacárido rigurosamente exentos de endotoxina (exentos de LPS), para conjugarse con una proteína portadora, con una pureza mejorada de los antígenos así como para su mejor comportamiento de seguridad;
- B)
- un rendimiento cuantitativo de cada etapa de reacción implicada en el proceso, que produce a continuación un rendimiento total del antígeno de glucoconjugado cuantitativo con respecto a ambos componentes del conjugado, es decir la proteína portadora y el carbohidrato transportado;
- C)
- un procedimiento de conjugación flexible. Específicamente, el procedimiento de conjugación permite la síntesis de glucoconjugados como antígenos mono, bi o polivalentes capaces de expresar simultáneamente características inmunógenas mono, bi o polivalentes.
Según un aspecto, la presente invención
proporciona procedimientos de purificación y/o conjugación como se
describe a continuación en la presente memoria y se reivindica en
las reivindicaciones adjuntas. En particular, una forma de
realización de la presente invención proporciona un procedimiento de
conjugación que implica las etapas siguientes:
- A.
- activación del antígeno de polisacárido exento de endotoxina contra un polisacárido polifuncional mediante un espaciador de diamino-alquilo introducido mediante:
- A1.
- desacoplamiento del O-de-hidrógeno obtenido mediante la introducción de grupos carbonilo reactivos con un agente oxidante para generar grupos aldehído en presencia de iones borato cuando se realiza la reacción en disolvente acuoso; reaccionando a continuación dichos grupos con el espaciador diamino-alquilo en presencia de un agente reductor,
- A2.
- enlace del espaciador diamino-alquilo con los restos carbonilo reactivos ya presentes en forma de grupos carboxilo por carbodiimida insoluble en agua, en presencia de disolventes orgánicos,
- B.
- activación de la proteína inmunógena portadora por el éster bis-succinimidílico de un ácido bicarboxílico alifático, que produce una proteína polifuncional mediante los ésteres de monosuccinimidilo de los restos de lisina,
- C1.
- acoplamiento de la proteína portadora polifuncional activada con el polisacárido activado polifuncional exento de endotoxina, mediante los ésteres monosuccinimidílicos introducidos en los restos de lisina de la proteína y los grupos amino introducidos en el polisacárido; o, alternativamente,
- C2.
- acoplamiento del polisacárido aminoactivado polifuncional a la proteína portadora mediante un éster bis-succinimidílico de un ácido bicarboxílico alifático que reacciona sucesivamente, en la misma mezcla de reacción, con los grupos amino del polisacárido amino-activado y con los grupos epsilon-amino de los restos de lisina de la proteína.
Preferentemente los antígenos de polisacárido se
purifican mediante un procedimiento que implica la eliminación de
la endotoxina contaminante mediante el enlace por afinidad de la
fracción lípido A de LPS con los péptidos
anti-endotoxina sintéticos (SAEP) con secuencias de
aminoácido retroinvertidas, que producen un polisacárido que tiene
un contenido de endotoxina convenientemente inferior a 0,125
unidades de endotoxina/\mug de polisacárido, equivalente a menos
de 0,00125% (p/p), citado en las reivindicaciones como polisacárido
exento de endotoxina.
Esta etapa produce un antígeno de polisacárido
de pureza excepcionalmente elevada, que impide la posibilidad real
de conjugarse con la proteína portadora, además de con el
polisacárido, el LPS contaminante. De hecho, las preparaciones
utilizadas actualmente de polisacáridos que se originan a partir de
la cápsula de las bacterias Gram-negativas, pueden
contener una cantidad de LPS igual o inferior a 25 UE/\mug de
polisacárido (unidades de endotoxina/mCg). Este límite es requerido
por las Farmacopeas Oficiales que emiten las especificaciones del
producto. Dado que 1 UE/ml detectada por el análisis del LAL
(Limulus Amoebocyte Lysate) iguala a una media de 100 pg/ml
de LPS purificada, en 1 \mug de antígeno de polisacárido existe
una cantidad de LPS contaminante de 2,5 ng. Dado el hecho de que la
dosis inmunizante para personas está comprendida en el intervalo
entre 25 y 50 \mug para el polisacárido capsular purificado y
entre 10 a 25 \mug para el polisacárido capsular conjugado, se
puede calcular que el hospedador está recibiendo entre 62,5 y 125 ng
de LPS/dosis de polisacárido capsular en la vacuna anterior y entre
25 y 62,5 ng de LPS/dosis de polisacárido conjugado en la vacuna
última.
Estas concentraciones de impurezas de LPS
presentes en los productos disponibles en el mercado, cuando se
expresan en peso para lactantes y niños (de 4 a 8 kg
de peso corporal medio entre los 3 y 24 meses de edad) que son las
poblaciones destinatarias de las vacunas glucoconjugadas,
corresponden y superan el umbral de pirogenicidad determinado
recientemente para LPS en personas (concentraciones de suero entre
1 y 2 ng de LPS/kg de peso corporal después de la administración
i.v.). La inyección de una dosis de 25 a 50 \mug de vacuna de
polisacárido, que contiene entre 62,5 y 125 ng de LPS contaminante,
introduce realmente en el hospedador humano del lactante una
cantidad de LPS contaminante comprendida en el intervalo entre 15 y
30 ng/kg. En el caso de un glucoconjugado, estas cifras se calculan
en el intervalo entre 6 y 15 ng/kg.
Esta observación explica la razón de por qué se
describen efectos pirógenos, esporádicos, aunque detectables,
después de la inmunización con vacunas de polisacárido capsular (en
forma de polisacárido libre o polisacárido conjugado), aunque los
efectos secundarios generales de las vacunas estén mitigados por las
vías de administración s.c. e i.m.
La purificación completa de un polisacárido
capsular para ser utilizado en la preparación de una vacuna
conjugada, se da a conocer en la presente solicitud preferentemente
por eliminación de la afinidad del LPS contenido en la preparación
de polisacárido utilizando un soporte sólido (membrana filtrante o
esferas de vidrio o medio cromatográfico en gel) al que se unen por
enlace covalente los péptidos de antiendotoxina sintéticos dados a
conocer en la patente US nº 5.589.459 (concedida el 31 de diciembre
de 1996).
SAEP3-RIS, como ejemplo, es un
péptido cíclico con la secuencia de aminoácidos retroinvertida:
que hace que el péptido sea
resistente a la actividad de las serina proteasas durante el proceso
de purificación. SAEP3 está unido por enlace covalente a una
membrana filtrante que lleva un grupo amino por un procedimiento
conocido que puede incluir el éster
bis-succinimidílico del ácido adípico del espaciador
bifuncional.
\newpage
En un experimento típico, una membrana filtrante
activada por SAEP3-RIS (poros de 0,45 \mum y una
densidad de 51,6 nmoles de SAEP3/cm^{2} de membrana) se utiliza
como herramienta para eliminar los LPS de la solución de
polisacárido del Grupo A (PsA) de N. meningitidis (100 mg/ml)
en PBS pH = 7,20. La cantidad eliminada de LPS después del ciclo de
filtración excede de 2,0 logs con respecto a la cantidad contenida
en el material de partida (25 UE LPS/\mug de PsA antes de la
filtración por afinidad en comparación con inferior a 0,125
UE LPS (el nivel de sensibilidad de la prueba de coagulación de
LAL)/\mug PsA después de la filtración por afinidad, equivalente
a inferior a 0,00125% expresado en peso. De este modo,
incluso si se utiliza polisacárido filtrado por afinidad a la dosis
humana máxima administrable de 25 \mug como Ps conjugada o 50
\mug de Ps pura, no puede alcanzar el umbral de
pirogenicidad expresado en peso a medida que la concentración de
endotoxina existente disminuye entre 0,06 y 0,15 ng/kg,
respectivamente, en lactantes y niños de 4 a 8 kg de peso corporal
medio. A este nivel de pureza, la vacuna de polisacárido o
glucoconjugado no produce pirógenos incluso si se inyectara por vía
intravenosa.
Una PsA filtrada por afinidad presenta, por
consiguiente, un perfil más seguro con respecto a los polisacáridos
recomendados actualmente para la vacunación como Ps libre o Ps
conjugada que, aunque purificada en grandes concentraciones,
conserva todavía una cantidad no despreciable de LPS
contaminante.
Las estructuras de polisacárido que presentan
grupos amino no potencialmente reactivos para ser utilizadas para
estrategias de conjugación directa con un portador de proteína dado,
deben activarse previamente mediante reacciones químicas. Es bien
sabido en química orgánica clásica que los grupos hidroxilo
adyacentes presentes en estructuras de mono o polisacárido pueden
activarse con grupos aldehído reactivos, mediante la utilización de
reactivos oxidantes como peryodato sódico en presencia de un agente
reductor que estabiliza la base de Schiff formada (reacción clásica
conocida por los químicos como "aminación reductora"). En los
procedimientos patentados anteriores, esta reacción se ha utilizado
para conjugar directamente una Ps oxidada con peryodato con
una proteína portadora dada (Jennings 1980 y Anderson, 1982). El
límite de este procedimiento es que el rendimiento de la reacción
está penalizado por el impedimento estérico de dos moléculas grandes
que deben interactuar, que es la Ps y la Proteína.
Según una forma de realización del presente
procedimiento se utiliza la reacción de "aminación reductora"
clásica para activar selectivamente la estructura Ps en "zonas
seleccionadas", introduciendo un grupo amino reactivo que
preferentemente está espaciado del carbohidrato mediante un
espaciador alquilo (alquil diamina) necesario solo para derivar el
fenómeno del impedimento estérico que se produce en la etapa de
conjugación siguiente. Esta estrategia consigue de manera
cuantitativa la activación de la estructura Ps. Las "zonas
seleccionadas" de la estructura Ps están convenientemente
representadas por los restos oxidrilo, exentos de
O-acetilo, adyacentes forzados a asumir la
conformación en cis mediante la presencia de iones boro que
forman complejos solamente con el OH en cis adyacente y no
con el OH en trans. De tal manera, la reacción oxidativa y la
reducción consiguiente de la base de Schiff formada, que conduce a
la introducción de grupos amino reactivos en las zonas
seleccionadas de la estructura Ps, tendrá lugar preferentemente en
las posiciones OH en cis de la estructura de Ps.
Una estrategia alternativa de lo anteriormente
descrito, para introducir grupos aldehído adyacentes en un
polisacárido que presenta grupos OH adyacentes, comprende
convenientemente la reacción del antígeno de polisacárido con el
reactivo tetraacetato de plomo. En este caso, el disolvente acuoso
se sustituye por un disolvente orgánico.
Según otra forma de realización, en los casos en
que las posiciones OH próximas están presentes en la naturaleza
como derivados de éster de grupos acetilo (grupos
O-acetilo), la
des-O-acetilación puede conseguirse
de manera selectiva y cuantitativa por hidrólisis con hidrazina
anhidra. A continuación, sigue la activación de los grupos
O-desacetilados adyacentes según el procedimiento
descrito anteriormente.
Según otra forma de realización, en los casos en
los que los grupos carbonilo están ya presentes en la estructura de
polisacárido, en forma de grupos carbonilo, la transformación de los
grupos amino reactivos se realiza mediante la utilización de la
diamina espaciada por alquilo mencionada anteriormente, por reacción
con carbodiimida (DCC o EDAC) en un disolvente apropiado.
En los procedimientos de activación para un
antígeno de carbohidrato, es importante que no haya concentraciones
contaminantes significativas de endotoxina (lipopolisacárido, LPS)
con objeto de impedir la reacción paralela de activación de la
cadena de carbohidrato de esta molécula y a continuación conjugarla
con la proteína portadora, con el resultado obvio de tener un
antígeno conjugado polisacárido-proteína que está
asociado a los efectos tóxicos que presenta el conjugado
LPS-proteína en el momento de la inyección en el
hospedador humano.
A título de ejemplo se ilustran los
procedimientos preferidos para introducir en grupos carbonilo con
estructura de polisacárido en forma de restos de aldehído para ser
transformados a continuación en grupos amino reactivos.
En un ejemplo típico de activación de una
estructura de polisacárido mediante grupos amino primarios, PsA (un
homopolímero de 1,6 fosfato de N,O-acetil manosamina
purificada procedente de grupos A de N. meningitidis, que ha
sido utilizada como tal o ha sido parcialmente
des-O-acetilada previamente con la
cantidad estequiométrica deseada de hidrazina anhidra en
tetrahidrofurano durante 5 a 120 minutos a 37ºC, a continuación ha
sido recuperada por precipitación con acetona anhidra y lavada tres
veces) se hace reaccionar con uno u otro de los reactivos
siguientes:
Reactivo A
Peryodato sódico en una cantidad por lo menos
equimolar con el 0,5 a 5% de monosacáridos que presenta grupos -OH
vecinos, estimada en la estructura PsA por análisis RMN (Resonancia
Magnética Nuclear).
En la PsA natural existe una cantidad
experimentalmente estimada de grupos -OH adyacentes que llevan
monosacárido comprendidos entre 10 y 30% de los restos de
monosacárido total.
La reacción se lleva a cabo de manera
conveniente en presencia de tampón borato 0,25 a 0,50 M, pH = 8,20,
15 a 30 minutos a 4ºC. Esta reacción produce de manera ventajosa la
activación cuantitativa (100%) a grupos aldehído del 0,5 al 5% de
los restos de monosacáridos que presentan grupos -OH adyacentes, que
están presentes en la estructura de PsA; o:
Reactivo B
Tetraacetato de plomo en las mismas condiciones
descritas anteriormente, excepto que la reacción se realiza en
disolvente orgánico en lugar de tampón (p. ej.: sulfóxido de
dimetilo o dimetilformamida). En este caso, la Ps activada por
aldehído insoluble se recupera por centrifugación a baja g y
se lava tres veces con acetona.
Tras la selección de una de las dos etapas
anteriores, se realiza la adición del espaciador bifuncional (1,4
di-amino)-n-butano,
(como ejemplo entre una variedad de bis-alquil amina
tal como 1,2-etilamina,
1,3-propilamina, 1,4 butilamina), a un exceso molar
de cinco a diez veces la cantidad de grupos -CHO reductores
introducidos en la estructura de PsA por oxidación selectiva. El
complejo piridina borano, necesario para reducir de manera eficaz y
por consiguiente estabilizar la base de Schiff formada, se añade
típicamente en una cantidad molar dos a cinco veces mayor con
respecto al 1,4-diamino-butano
utilizado en la reacción; la mezcla se mantiene convenientemente en
agitación magnética durante 18 horas (durante la noche) a 4ºC, pH =
8,20 en tampón de borato 0,25 a 0,50 M. Por último, se añade
borohidruro sódico (la misma cantidad molar del complejo
piridina-borano) a la mezcla de reacción, durante 1
hora. La reacción oxidativa y la aminación reductora pueden
realizarse como un procedimiento de una sola etapa.
El rendimiento de la reacción es cuantitativo
(100%) con respecto al 0,5 al 5% de los restos de monosacárido que
presentan grupos -OH vecinos, que están presentes en la estructura
de PsA. En este punto del procedimiento, por consiguiente, la PsA
presenta una estructura multipunto, activada por el grupo amino
primario. Dado un PM medio de 2,5 \times 10^{5} para PsA,
referido al tamizado molecular seguido por espectrometría
MALDI-TOF o cualquier otro procedimiento para la
determinación de masas, PsA contendría aproximadamente 1.000 restos
de monosacárido de 1,6-fosfato de
N-acetil-manosamina.
Dependiendo del intervalo de estequiometría
anterior utilizado en la reacción, un número medio de 5 a 50 restos
de monosacáridos resulta activado por el grupo amino primario
"espaciado ad hoc", en una media de 1.000 restos de
monosacárido. El polisacárido activado por amino se purifica en
reactivos de bajo peso molecular por diafiltración utilizando una
membrana con NMWL de 10^{4} y tampón borato 0,25 M, pH 8,20 o por
cromatografía de permeación en gel utilizando Sepharose
G-50. Este producto intermedio puede liofilizarse y
almacenarse a -20ºC o inferior.
El mismo solicitante ha dado a conocer en la
patente US nº 5.306.492 anterior concedida el 26 de abril de 1994
la activación de polisacáridos de S. pneumoniae mediante su
único resto de monosacárido que reduce el extremo. En este
caso, la reacción de aminación reductora se consiguió a un
rendimiento significativo "desplazando" el equilibrio de la
forma de acetal (anillo cerrado) del resto de monosacárido que
reduce el extremo (R'-CHOH) con la forma de cadena
abierta R'-CHO (semiacetal), utilizando temperatura
elevada (100ºC). Esta reacción produjo oligosacáridos activados por
el grupo amino primarios en un extremo útil para acoplarse a
una proteína portadora. Según esta estrategia, el modelo
glucoconjugado conseguido fue el correspondiente al oligosacárido
de un extremo, unido por enlace covalente, sin ninguna posibilidad
de reticulación (puntos múltiples de enlace covalente) entre el
oligosacárido y la proteína portadora.
Procedimiento ejemplar para introducir grupos
amino reactivos en una estructura de polisacárido que contiene
grupos carbonilo en forma de restos carbonilo:
Los polisacáridos que presentan en su
estructuras grupos carbonilo en forma de restos carbonilo (p. ej.:
la Ps capsular de S. typhi, conocida como antígeno Vi, que
es un homopolímero del ácido N,O-acetil
galacturónico) se activan con los grupos amino reactivos de la
forma siguiente: el polisacárido Vi se disuelve en DMSO (otros
polisacáridos pueden solubilizarse también en DMF o dioxano
dependiendo de su estructura) y se añade al espaciador bifuncional
1,4-diamino-n-butano
(como ejemplo) en cantidad estequiométrica con el 0,5 a 5% del -COOH
presente en la estructura de polisacárido. El reactivo DCC
(diciclohexil carbodiimida) insoluble en agua se añade en una
cantidad por lo menos equimolar con el espaciador bifuncional. La
mezcla de reacción se realiza de 2 a 4 horas a 37ºC. Durante la
reacción, se forma un mol de diciclohexilurea insoluble por mol de
resto de monosacárido activado por el grupo amino que lleva
originalmente un resto -COOH. Dado que la reacción es cuantitativa
con respecto al 0,5 a 5% de los restos de monosacárido que llevan
restos -COOH, la misma cantidad cuantitativa se transformará en
grupos amino reactivos espaciados. Después de descargar la
diciclohexilurea insoluble, el polisacárido Vi activado por amino
se purifica a continuación a partir de los reactivos de bajo peso
molecular mediante la precipitación con Et-OH del
50 al 75% (v/v) o se dializa por filtración a través de una membrana
filtrante con NMWL de 10^{4}, tras la dilución con PBS 0,1
M
pH = 7,20.
pH = 7,20.
Una activación apropiada de la proteína
portadora para la reacción de acoplamiento final con el polisacárido
activado, es una estrategia que permite el aumento significativo
del rendimiento de esta reacción. La principal razón para esta
observación experimental es que una molécula espaciadora pequeña y
muy reactiva puede derivar eficazmente el fenómeno del impedimento
estérico que ocurre cuando dos moléculas grandes (polisacárido y
proteína) se llegan a poner en contacto muy íntimo para reaccionar
para formar un enlace covalente. En el caso específico de esta
solicitud, se utiliza un éster bis-succinimidílico
obtenido mediante un ácido bicarboxílico como el
1,3-carboxil propiónico,
1,4-carboxil butanoico, 1,5-carboxil
pentanoico y 1,6-carboxil hexanoico.
Se solubiliza la vacuna antitetánica de la
proteína inmunógena, como ejemplo, en la mezcla sulfóxido de
dimetilo (DMSO): tampón PBS (o acetato) 0,1 M pH = 7,2 (50:50 v/v)
a la concentración de 10 mg/ml o más. La cantidad de grupos epsilon
amino reactivos de los restos de lisina presentes en la proteína se
estima mediante un procedimiento químico convencional (p. ej.:
reactividad al reactivo TNBS) o una alícuota de la mezcla de
reacción. La mezcla de reacción se añade a continuación del
espaciador bifuncional éster bis-succinimidílico del
ácido adípico (ácido 1,6-carboxil hexanoico) en
cantidad molar equivalente con respecto a la cantidad de grupos
amino estimados por mol de PsA activada que debe conjugarse. La
reacción se deja 1 hora a 37ºC. El producto de reacción es el
derivado monosuccinimidílico de la vacuna antitetánica que presenta
la transformación cuantitativa de los grupos epsilon amino de los
restos de lisina en ésteres monosuccinimidílicos muy reactivos del
ácido adípico. En estas condiciones, no se produce ninguna
reticulación proteína-proteína, ya que el equilibrio
entre las características próticas/polares del disolvente es
crucial para favorecer la reacción del derivado frente a la
reacción de reticulación. La Proteína activada está lista entonces
para el acoplamiento inmediato a la PsA activada ya que la
estabilidad de este compuesto intermedio dura no más de 30 a 60
minutos, para una recuperación cuantitativa de ésta.
De manera conveniente, el Polisacárido activado
por el grupo espaciador (en los ejemplos dados anteriormente PsA o
PsVi) se hace reaccionar con la Proteína activada por el espaciador
éster succinimidílico. En este caso, la naturaleza nucleófila del
reactivo activado anterior estará complementada químicamente por el
grupo éster lábil y electrofílico del último reactivo. El producto
formado es un conjugado reticulado de
polisacárido-proteína de alto PM. La reacción puede
llevarse a cabo también simultáneamente con Polisacáridos
heterólogos activados para que se conjuguen con la misma
Proteína portadora (p. ej.: tanto PsA como PsVi). Las condiciones de
reacción continúan siendo las mismas. En dicho caso se sintetiza
una formulación de vacuna polivalente, que utiliza una única
proteína portadora para transportar varios antígenos del
Polisacárido capsular diferentes (p. ej.: Haemophilus
influenzae tipo b; Neisseria meningitidis Grupo A, C, Y,
W135; Streptococcus pneumoniae tipo 4, 6A y 6B, 9N, 14, 18c,
19F, 23F; S. typhi Vi; K. pneumoniae etc.).
Además, la misma estrategia y las mismas
condiciones pueden aplicarse a la conjugación de moléculas de
carbohidrato que presentan su estructura molecular, grupos amino
primarios relacionados con la presencia de un azúcar
N-amino no sustituido (p. ej.: glucosamina o
manosamina o galactosamina en lugar de N-acetil
glucosamina o o N-acetil manosamina o
N-acetil galactosamina, etc.) así como a la
presencia de restos de etanolamina. Este es el caso del
lipopolisacárido (LPS o endotoxina) que, en las formas
desintoxicadas como LPS lípido
A-de-O-acilado o
LPS desprovisto de lípido A o complejo LPS-péptido
sintético anti endotoxina pueden utilizarse como entidad inmunógena
después de la conjugación con una proteína portadora
seleccionada.
Una solución orgánica acuosa que contiene la
vacuna antitetánica activada por el éster monosuccinimidílico se
mezcla con la solución orgánica acuosa que contiene la PsA activada
por amino. La solución final está compuesta por DMSO: tampón PBS (o
acetato) 0,1 M pH = 7,2 (50:50 v/v). La composición molar de los
reactivos es tal que existe equimolaridad entre la cantidad total
de grupos éster mono-succinimidílicos presentes en
la vacuna antitetánica y la cantidad total de grupos amino
presentes en la PsA (o la cantidad total de grupos amino presentes
en los polisacáridos múltiples y heterólogos como PsA y PsVi). La
reacción tiene lugar 2 a 4 horas a 4ºC, con un rendimiento que es
cuantitativo para ambos (o múltiples) reactivos.
El antígeno conjugado HMW se recupera a
continuación por precipitación con Et-OH del 25 al
50% (v/v) o por tamizado molecular a través de una columna
Sepharose-6B. En este último caso, el conjugado HMW
se recupera cuantitativamente (100%) en el volumen vacío de la
columna mientras que el disolvente residual (DMSO) presente en la
mezcla se conserva en el Vi de la columna y a continuación se
descarta.
Alternativamente, la purificación del conjugado
del disolvente (DMSO) puede llevarse a cabo por diálisis mediante
filtración utilizando una membrana filtrante con NMWL de
10^{4}.
Procedimiento alternativo de acoplamiento, que
combina las etapas 3 y 4 para llevar a cabo la reacción de
conjugación en una sola etapa.
El control minucioso del equilibrio entre la
polaridad y las características protónicas del disolvente utilizando
como medio de reacción, permite la posibilidad de "conducir"
con eficacia la reacción de acoplamiento entre el polisacárido
activado por el enlazador amino y la Proteína portadora mediante un
enlazador bifuncional como los ésteres
bis-succinimidílicos de un ácido bicarboxílico. En
particular, un grupo éster es estable durante varias horas en un
disolvente polar y no prótico como DMSO mientras que se hidroliza
rápidamente en presencia de un disolvente polar y prótico como el
agua. Dado que la solubilidad y la retención de antigenicidad de
los Polisacáridos y varias Proteínas en una mezcla apropiada de
DMSO/agua no representa ningún problema, la selección de un sistema
disolvente bien equilibrado se hace crucial para una termodinámica
eficaz de la reacción de acoplamiento. En condiciones oportunas de
estabilidad del reactivo éster bifuncional y para varios antígenos
de polisacárido y proteína es entonces posible conseguir el
acoplamiento de las dos entidades moleculares (Polisacárido y
Proteína) en una sola
etapa.
etapa.
El Polisacárido activado por el enlazador amino
se solubiliza a 4ºC en DMSO/tampón acetato 0,1 M pH = 7,0 (75%:25%
v/v) a la concentración de 5 a 10 mg/ml y se añade al éster
bis-succinimidílico del espaciador bifuncional del
ácido adípico (como ejemplo) en una cantidad comparable a la
requerida estequiométricamente por la cantidad molar total de
grupos amino presentes en su estructura (p. ej.: determinada por la
reacción con TNBS). La proteína portadora, previamente disuelta a
4ºC en DMSO/tampón acetato 0,1 M pH = 7,0 (50% : 50% v/v) a la
concentración de 5 a 10 mg/ml, se añade a continuación a la mezcla
de reacción en un espacio de tiempo de 15 a 60 minutos a partir de
la adición del espaciador bifuncional. La cantidad total de
Polisacárido activado por el enlazador y la cantidad total de la
proteína portadora presente en la mezcla de reacción están
comprendidas en un intervalo de la relación (p/p) entre 1:1 y 1:5 y
aún superior, dependiendo del PM de los dos reactivos y de la
cantidad de grupos amino por mol de cada uno de los reactivos. La
reacción se mantiene a 4ºC, en agitación suave, durante 4 a 6 horas
adicionales. El producto glucoconjugado se recupera
cuantitativamente (100% para ambos componentes) según el
procedimiento descrito en la Etapa 4 anterior, con objeto de
eliminar los compuestos LMW presentes en la reacción, es decir la
N-hidroxi-succinimida liberada
durante la reacción de los grupos éster con los grupos amino, el
disolvente DMSO y los iones acetato.
\newpage
El enlazador resultante interpuesto entre la
proteína y los antígenos del polisacárido contiene dos enlaces
amídicos y un enlace imina reducido. El enlace anterior se encuentra
en las proteínas naturales y puede escindirse solamente en
condiciones duras como temperatura superior a 100ºC en presencia de
HCl 3 M. Este último es resistente incluso en condiciones severas
en las que se escinde el anterior. Por consiguiente, el
glucoconjugado preparado según el procedimiento anterior resulta
ser un producto muy estable. Por encima de todo, el procedimiento
de glucosilación también produce una proteína portadora más estable
para la proteólisis por las serina proteasas como tripsina y
quimiotripsina. Sin embargo, dado que la estabilidad de un
glucoconjugado se refiere también a la estructura de polisacárido
como tal, una estructura Ps dada puede presentar diferentes
requisitos para el almacenaje a largo plazo de otras estructuras.
Por esta razón, se recomienda el almacenaje de un producto similar
de cualquier modo como forma liofilizada a -20ºC o inferior, en
presencia de un soporte inerte (p. ej.: lactosa o manitol, 5%
p/v).
El conjugado resultante del procedimiento
descrito es una entidad reticulada, polidispersa y de alto peso
molecular que eluye de un tamizador molecular como Sepharose
2B-CL con una curva de forma monomodal o bimodal en
el intervalo de Kd = 0,1-0,8. Las características de
elución prueban que la entidad del conjugado es un sistema
polidisperso desde el punto de vista del peso molecular. El
conjugado purificado presenta una relación molar media
Proteína : Polisacárido en el intervalo entre 0,75 y 1,25 (mol/mol). Sin embargo, esta relación puede variar considerablemente (en el intervalo 0,5 a 2,0 mol/mol o superior) dependiendo del PM de la Proteína y del Polisacárido utilizados en la reacción de conjugación. Transferido a bases en peso, el valor de esta relación puede oscilar de manera significativa según el PM de los componentes en el conjugado. En los ejemplos dados anteriormente utilizando PsA y vacuna antitetánica según la estequiometría de la reacción descrita, la media de la relación (p/p) Proteína: Polisacárido puede ser tan alta como 3 con un valor SD que disminuye dentro del 25% del valor.
Proteína : Polisacárido en el intervalo entre 0,75 y 1,25 (mol/mol). Sin embargo, esta relación puede variar considerablemente (en el intervalo 0,5 a 2,0 mol/mol o superior) dependiendo del PM de la Proteína y del Polisacárido utilizados en la reacción de conjugación. Transferido a bases en peso, el valor de esta relación puede oscilar de manera significativa según el PM de los componentes en el conjugado. En los ejemplos dados anteriormente utilizando PsA y vacuna antitetánica según la estequiometría de la reacción descrita, la media de la relación (p/p) Proteína: Polisacárido puede ser tan alta como 3 con un valor SD que disminuye dentro del 25% del valor.
Dicho conjugado contiene menos de 0,125
UE/\mug de producto (o menos de 12,5 pg de LPS)/\mug de
conjugado, que corresponde a menos de 0,00125% p/p) cuando se
ensaya por coagulación de LAL.
El rendimiento total del proceso completo es
cuantitativo referido a ambos componentes del conjugado.
La reacción de síntesis es muy flexible, porque
una de las dos vacunas de glucoconjugado monovalente o polivalente
puede prepararse en la misma etapa de conjugación. Una lista de
vacunas polivalentes que puede prepararse mediante la presente
invención incluye, pero no se limita a las siguientes:
una vacuna de glucoconjugado del grupo A, C,
W135, Y, meningocócica tetravalente preparada por acoplamiento de
cada polisacárido activado por amino por separado a la misma
proteína portadora.
una vacuna de glucoconjugado del grupo 4, 6, 9,
14, 18, 19, 23, neumocócica polivalente preparada por acoplamiento
de cada polisacárido activado por amino por separado a la misma
proteína portadora.
una vacuna de glucoconjugado, meningocócica y
neumocócica polivalentes preparada por acoplamiento de cada
polisacárido activado por amino por separado a la misma proteína
portadora.
Como ejemplo para demostrar la inmunogenicidad
de un glucoconjugado sintetizado con el nuevo procedimiento
industrial, se inmunizaron grupos de ratones Swiss Webster de 8
semanas de vida por vía subcutánea, intramuscular o intraperitoneal
con tres dosis de la vacuna de glucoconjugado TT-PsA
en el intervalo de dosis de 1 a 10 \mug/ratón, dos semanas aparte
(semana 0, 2 y 4). Dos semanas después de cada inyección (semana 0,
2, 4 y 6), se extrajo sangre a los ratones y se analizaron los
sueros por ELISA con objeto de cuantificar la concentración de
anticuerpo IgG con isótopo producida de manera específica contra el
polisacárido A transportado y la proteína portadora TT.
\newpage
La tabla 1 siguiente presenta los títulos de
anticuerpo obtenidos:
\vskip1.000000\baselineskip
* Los títulos se expresan como media de la
dilución recíproca (punto final) del grupo de sueros de grupos de
cinco ratones cada uno, de tres experimentos diferentes. La SD de
los títulos medios está comprendida dentro del 20% de los valores
indicados. La funcionalidad biológica de los anticuerpos está
indicada entre paréntesis y se refiere a la actividad bactericida
dependiente del complemento (PsA) así como a la actividad
neutralizante de la vacuna contra el tétanos. La PsA inyectada como
referencia en el intervalo de dosis 5 a 10 \mug/ratón, no produjo
ninguna cantidad significativa de anticuerpos IgG específicos para
PsA (títulos de punto final < 200).
** La dosis de conjugado contiene los dos
componentes en la misma cantidad (2,5 \mug de cada uno) ya que su
relación en peso es 1,0.
Como ejemplo adicional de inmunización, se
inyectó a grupos de ratones comparables otra preparación de
glucocojugado TT-PsA, utilizando un adyuvante
mineral AlPO_{4}:
\vskip1.000000\baselineskip
* Títulos de ELISA expresados como en la Tabla
1. La PsA inyectada como referencia a la misma dosis no produjo
títulos significativos de anticuerpos IgG específicos para PsA
(títulos de punto final <200)
** La dosis de conjugado contiene los dos
componentes en la relación w/w Proteína : Polisacárido = 3,0
La dosis de polisacárido en la forma de vacunas
de glucoconjugado preparadas según el procedimiento de conjugación
descrito, puede oscilar preferentemente entre 0,5 y 10 \mug o más
en lactantes y niños y hasta 25 ó 50 \mug o más en adultos,
cuando se desea la vacuna para la protección frente a un antígeno Ps
transportado (formulación monovalente). En los casos de
formulaciones polivalentes, es decir cuando se transportan antígenos
Ps múltiples por la misma proteína portadora o están asociados como
glucoconjugados heterólogos monovalentes; la dosis puede aumentarse
de acuerdo con la composición de amplio espectro de la vacuna,
teniendo en consideración el intervalo de dosis indicado
anteriormente. Los expertos en materia de experimentación clínica
pueden encontrar propiamente la dosis de inmunización óptima.
De manera conveniente, la dosis de vacunas de
polisacárido purificadas según el procedimiento descrito puede
oscilar entre 5 y 50 \mug en niños. Las mismas consideraciones
anteriores indicadas para las formulaciones polivalentes de
glucoconjugados pueden aplicarse a las vacunas de polisacárido. Dado
que los lactantes no responden de manera adecuada a los antígenos
de polisacárido, éstos pueden utilizarse para reforzar la
inmunización después que se ha llevado a cabo la inmunización
básica utilizando vacunas de glucoconjugado. Asimismo, ya sea las
formulaciones monovalentes o las polivalentes de vacunas de
polisacárido y glucoconjugado pueden estar asociadas a otras
vacunas pediátricas disponibles en el mercado con o sin la presencia
de adyuvantes minerales que pueden contribuir a la inmunogenicidad
de la formulación completa.
Claims (22)
1. Procedimiento de conjugación que implica las
etapas siguientes:
- A.
- activación de un antígeno de polisacárido exento de endotoxina contra un polisacárido polifuncional mediante un espaciador de diamino-alquilo introducido mediante:
- A1.
- desacoplamiento del O-de-hidrógeno obtenido mediante la introducción de grupos carbonilo reactivos con un agente oxidante para generar grupos aldehído en presencia de iones borato cuando se realiza la reacción en disolvente acuoso; reaccionando a continuación dichos grupos con el espaciador diamino-alquilo en presencia de un agente reductor, o mediante
- A2.
- enlace del espaciador diamino-alquilo con los restos carbonilo reactivos ya presentes en forma de grupos carboxilo por carbodiimida insoluble en agua, en presencia de disolventes orgánicos,
- B.
- activación de la proteína portadora inmunógena por el éster bis-succinimidílico de un ácido bicarboxílico alifático, que produce una proteína polifuncional mediante los ésteres bis-succinimidílicos de los restos de lisina,
- C.
- acoplamiento de la proteína portadora polifuncional activada con el polisacárido polifuncional exento de endotoxina activada, mediante los ésteres bis-succinimidílicos de los restos de lisina de la proteína y los grupos amino del polisacárido
2. Procedimiento de conjugación según la
reivindicación 1, en el que dicho antígeno del polisacárido exento
de endotoxina se prepara mediante la eliminación de la endotoxina
contaminante mediante el enlace por afinidad de la fracción lípido
A de LPS con péptidos anti-endotoxina sintéticos
(SAEP) que presentan secuencias de aminoácido retroinvertidas.
3. Vacuna que contiene uno o más antígenos de
glucoconjugado preparados según la reivindicación 1, que se
administra por vía s.c., i.m. o i.d. en la dosis comprendida entre
0,1 y 100 \mug, en una sola o múltiples inyecciones.
4. Formulación para vacuna que contiene uno o
más antígenos de glucoconjugado preparados según la reivindicación
1.
5. Procedimiento para preparar un antígeno de
polisacárido exento de endotoxina (LPS) conjugado con una proteína
portadora que comprende las etapas siguientes:
- A.
- activación del antígeno de polisacárido exento de endotoxina (exento de PLS) mediante la introducción de grupos amino reactivos,
- B.
- activación de la proteína portadora inmunógena,
- C.
- acoplamiento de la proteína portadora activada con el polisacárido activado polifuncional exento de endotoxina.
6. Procedimiento según la reivindicación 5, en
el que dicha etapa A comprende el desacoplamiento
O-de-hidrógeno mediante la
introducción de grupos carbonilo reactivos con un agente oxidante
para generar grupos aldehído en presencia de iones borato,
reaccionando a continuación dichos grupos con un espaciador
diamino-alquilo en presencia de un agente
reductor.
7. Procedimiento según la reivindicación 5, en
el que dicha etapa A comprende un enlace del espaciador
diamino-alquilo con los restos carbonilo reactivos
en forma de grupos carboxilo por carbodiimida insoluble en agua, en
presencia de un disolvente orgánico.
8. Procedimiento según la reivindicación 5, en
el que la activación de la proteína inmunógena portadora de la
etapa B es llevada a cabo mediante los ésteres monosuccinimidílicos
de los restos de lisina de la proteína.
9. Procedimiento según la reivindicación 5, en
el que el acoplamiento de la etapa C se lleva a cabo mediante los
ésteres monosuccinimidílicos de los restos de lisina de la proteína
y los grupos amino del polisacárido.
10. Procedimiento según la reivindicación 5, en
el que el acoplamiento de la etapa C se lleva a cabo mediante un
éster bis-succinimidílico de un ácido bicarboxílco
alifático que reacciona sucesivamente con 1) un grupo amino del
polisacárido amino-activado y 2) con los grupos
epsilon-amino de los restos de lisina de la
proteína.
11. Conjugado de un antígeno de polisacárido
exento de endotoxina (LPS) con una proteína portadora, que puede
obtenerse mediante el procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10.
12. Vacuna que comprende un conjugado de un
antígeno de polisacárido exento de endotoxina (LPS) con una proteína
portadora según la reivindicación 11.
13. Vacuna según la reivindicación 12, en la que
los polisacáridos tienen un contenido en endotoxina inferior a
0,125 unidades de endotoxina/\mug de polisacárido, equivalente a
menos de 0,00125 (p/p).
14. Vacuna según la reivindicación 12, que
comprende un antígeno glucoconjugado específico para Neisseria
meningitidis del grupo A.
15. Vacuna según la reivindicación 12, que
comprende un antígeno glucoconjugado específico para Neisseria
meningitidis del grupo C.
16. Vacuna según la reivindicación 12, que
comprende un antígeno glucoconjugado específico para Neisseria
meningitidis del grupo W135.
17. Vacuna según la reivindicación 12, que
comprende un antígeno glucoconjugado específico para Neisseria
meningitidis del grupo Y.
18. Vacuna según la reivindicación 12, que
comprende múltiples antígenos glucoconjugados específicos para
Neisseria meningitidis de los grupos A, C, W135 e Y.
19. Vacuna según la reivindicación 12, que
comprende múltiples antígenos glucoconjugados específicos para
Streptococcus pneumoniae de los grupos 3, 4, 6, 7, 9, 11,
12, 14, 18, 19 ó 23.
20. Vacuna según la reivindicación 12, que
comprende un antígeno glucoconjugado específico para Haemophilus
influenzae de tipo B.
21. Vacuna según la reivindicación 12, que
comprende un antígeno glucoconjugado específico para Salmonella
typhi.
22. Vacuna según la reivindicación 12, que
comprende un antígeno glucoconjugado específico para Vibrio
cholerae.
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