ES2291295T3 - Construccion con enlace gpib-lipido y su uso. - Google Patents

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Abstract

Un conjugado que comprende GPIb y un lípido, que están unidos mediante poli(óxido de alquileno) (PAO), en el que la GPIb es (i) una propia GPIb, (ii) una cadena a de GPIb, o (iii) un fragmento de una región de unión a Factor de von Willebrand (vWF) de una cadena a de GPIb.

Description

Construcción con enlace GPIb-lípido y su uso.
Campo técnico
La presente invención se refiere a un conjugado de una GPIb y un lípido unidos mediante un poli(óxido de alquileno) (también se hará referencia a él en lo sucesivo como un conjugado de GPIb-lípido), a un complejo de lípido que contiene el conjugado y a un lípido libre, y al uso de los mismos.
Técnica fundamental
Diversas glicoproteínas (a las que se hace referencia en lo sucesivo como GP) están presentes en la superficie de una membrana de plaquetas, y están implicadas en la expresión de funciones de plaquetas. De tales glicoproteínas de membrana de plaquetas, son conocidas GPIb, GPIIb, GPIIIa, GPIIIb, GPIV, GPIX y similares. De éstas, la GPIb funciona como un receptor del Factor de von Willebrand (al que se hace referencia en adelante como vWF). La GPIb es un heterodímero que tiene un peso molecular de 160.000, en el que una cadena \alpha y una cadena \beta están unidas mediante un enlace disulfuro (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 84, págs 5615-5619, 1987, Hematology & Oncology, Vol. 31, Nº 1, págs. 5-10, 1995 y similares).
Cuando se causan daños vasculares, las plaquetas se adhieren rápidamente a la lesión vascular y forman un trombo de plaquetas por agregación y similares. En la formación del trombo de plaquetas, el vWF juega un papel importante como proteína adhesiva. Se considera que la GPIb se une con vWF como su receptor y activa o promueve la adhesión y agregación de plaquetas mediante vWF en dicha lesión vascular. Además, la unión de vWF y GPIb funciona deteniendo la hemorragia en la lesión vascular, pero también forma un trombo patológico. Así, se espera el uso eficaz de GPIb para el examen y diagnosis de lesión vascular, detección de trombo patológico y tratamiento de los mismos.
No obstante, no se ha probado que tenga éxito el uso de GPIb aislada en la expresión artificial de la actividad fisiológica como se ha mencionado antes. En otras palabras, se necesita alguna idea en el aspecto de formulación de preparaciones farmacéuticas para usar prácticamente GPIb como un agente o reactivo farmacéutico.
Los presentes inventores encontraron primero más pronto que podía expresarse la actividad fisiológica de GPIb preparando un complejo de lípido que contiene un conjugado de GPIb y un lípido particular, y un lípido general (documentos WO97/29128, JP-A9-208599, USP-6177059 y EP-894807-A).
Zalipsky et al., Bioconjugate Chemistry, (1997), 111-118, describen liposomas injertados con PEG con ligandos de oligopéptidos u oligosacáridos.
Descripción de la invención
A la vista de la situación mencionada antes, los presentes inventores han estudiado adicionalmente, y como resultado, encontrado que puede prepararse un conjugado de GPIb-lípido que muestra una propiedad de retención superior en la sangre introduciendo poli(oxido de alquileno) (al que se hace referencia en adelante como PAO) entre la GPIb y el lípido, y han estudiado además intensamente para completar la presente invención.
Por consiguiente, la presente invención se refiere a
(1) un conjugado que comprende GPIb y un lípido que están unidos mediante poli(óxido de alquileno) (PAO) (al que se hace referencia también en adelante como un conjugado de GPIb-lípido), en el que la GPIb es
(i)
una propia GPIb,
(ii)
una cadena \alpha de GPIb, o
(iii)
un fragmento de una región de unión a Factor de von Willebrand (vWF) de una cadena \alpha de GPIb;
(2) el conjugado de (1) anterior, en el que el fragmento de (iii) es un fragmento de la cadena \alpha de GPIb que carece de un lugar transmembrana;
(3) el conjugado de (1) anterior, en el que el lípido tiene un grupo funcional que es un grupo amino, un grupo carboxilo, un grupo tiol o un grupo aldehído;
(4) el conjugado de (3) anterior, en el que el lípido que tiene un grupo funcional es un fosfolípido, un glicolípido, un ácido graso, un glicérido, un colesterol o un líquido anfipático;
(5) el conjugado de (1) anterior, en el que el PAO es polietilenglicol, polipropilenglicol o un glicol obtenido copolimerizando óxido de etileno y óxido de propileno;
(6) el conjugado de (1) anterior, en el que el PAO tiene un peso molecular medio numérico de 100-100000;
(7) el conjugado de (3) anterior, en el que la GPIb y el PAO, y el PAO y el lípido que tiene un grupo funcional, están unidos respectivamente químicamente por un agente de reticulación;
(8) el conjugado de (3) anterior, en el que la relación molar de GPIb:PAO es 1:1-1:20 y la relación molar del PAO:lípido que tiene un grupo funcional es 1:1;
(9) un complejo que comprende el conjugado de (1) y un lípido libre (al que se hace también referencia en adelante como un complejo de GPIb lípido);
(10) el complejo de (9) anterior, que está en forma de un liposoma;
(11) el complejo de (9) anterior, en el que el lípido libre es un fosfolípido, un glicolípido, un colesterol, un ácido graso o un derivado de ellos;
(12) el complejo de (9) anterior, en el que la relación molar de GPIb:lípido libre es 1:10-1:1000;
(13) el complejo de (9) anterior, en el que el complejo es agregable en presencia de ristocetina;
(14) el complejo de (9) anterior, en el que se prepara el conjugado que comprende GPIb y el lípido unido mediante PAO y se prepara después el complejo de dicho conjugado y un lípido libre;
(15) una composición farmacéutica que contiene el complejo de (9) anterior;
(16) la composición farmacéutica de (15) anterior, que es un sustituto de plaquetas;
(17) la composición farmacéutica de (16) anterior, que es un agente para la profilaxis o tratamiento de un trastorno vascular, un daño vascular o trombosis;
(18) un agente farmacéutico para examen o diagnosis que comprende, como ingrediente activo, una sustancia de marcado y el complejo de (9) anterior;
(19) el agente farmacéutico de (18) anterior, en el que la sustancia de marcado es un radioisótopo, un metal paramagnético para MRI, un compuesto yoduro para formación de imagen de rayos X, una sustancia fluorescente o un pigmento;
(20) una composición que contiene fármaco que comprende un fármaco y el complejo de (9) anterior como ingredientes activos, en la que el fármaco es un agente hemostático, un vasoconstrictor, un agente antiinflamatorio, un agente trombolítico, un anti-coagulador de la sangre o un agente anti-plaquetas;
La presente invención se describe con detalle en lo que sigue.
(I) Conjugado consistente en GPIb-PAO-lípido (conjugado de GPIb-lípido)
El conjugado de GPIb-lípido de la presente invención es un conjugado en el que (A) GPIb y (B) un lípido están unidos mediante (C) PAO.
(A) GPIb
La GPIb a usar en la presente invención puede ser cualquiera en tanto en cuanto tenga capacidad de unión con vWF, e incluye la propia GPIb natural, una cadena \alpha de GPIb o un fragmento de una región de unión a Factor de von Willebrand (vWF) de una cadena \alpha de GPIb.
Los ejemplos específicos incluyen fragmentos de GPIb tales como cadena \alpha [His(1)-Leu(610)] de GPIb, un fragmento de una región de unión a vWF de la cadena \alpha (a lo que se hace también referencia en adelante como un fragmento de cadena \alpha de GPIb) y similares, fragmentos de GPIb en los que se ha suprimido el lugar transmembrana y similares. En la presente invención, se usan más preferiblemente fragmentos de GPIb sin el lugar transmembrana.
Los fragmentos de cadena \alpha de GPIb más específicos incluyen His(1)-Cys(485), His(1)-Pro(340), His(1)-Thr(304), His(1)-Ala(302), His(1)-Arg(293) [documentos JP-A-1-221394, EP-317278-A], Ala(165)-Leu(184), Gln(180)-Phe(199), His(195)-Leu(214), Asn(210)-Val(229), Glu(225)-Ala(244) y Thr(240)-Tyr(259) [documento JP-A-1-100196], Asn(61)-Thr(75), Gln(71)-Ser(85), Thr(81)-Leu(95), Gln(97)-Arg(111), Leu(136)-Leu(150), Asn(210)-Ala(224), Gln(221)-Asp(235) y Ser(241)-Asp(255) [Solicitud de Patente Japonesa bajo PCT abierta a inspección por el público bajo kohyo Nº 5-503708, documento WO91/09614] y similares. Los ejemplos del sustituto incluyen un fragmento de cadena \alpha de GPIb consistente en His(1)-Ala(302), en el que Gly(223) o Met(239) está sustituido con Val, y similares [documento WO93/16712]. Estos fragmentos de cadena \alpha de GPIb carecen todos de lugar transmembrana. El lugar transmembrana en la cadena \alpha de GPIb es Leu(486)-Gly(514) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 84, págs. 5615-5619, 1987).
La GPIb puede prepararse por cualquier método, y se ponen como ejemplos un método que comprende extracción y aislamiento de membrana de plaquetas, un método que usa cultivo de células y un método de producción que usa ingeniería genética.
(B) Lípido
El lípido que está unido a GPIb mediante PAO tiene un grupo funcional unible directa o indirectamente a PAO. Son ejemplos de tal grupo funcional un grupo amino (NH_{2}), un grupo carboxilo (COOH), un grupo tiol (SH), un grupo aldehído (CHO) y similares. En tanto en cuanto el grupo funcional pueda formar un enlace directo o indirecto con PAO, no está limitado a los puestos como ejemplo.
Son ejemplos de la clase del lípido fosfolípido, glicolípido, ácido graso, glicérido, colesteroles y similares, dándose preferencia los anfipáticos.
Son ejemplos del lípido fosfatidiletanolamina (a la que se hace referencia en adelante como PE) y fosfatidiltioetanol (por ejemplo, 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidiltioetanol) para fosfolípido. Como glicolípido, por ejemplo, se mencionan ceramida, cerebrosida, esfingosina, sulfatida, gangliósidos y gliceroglicolípidos (por ejemplo, galactosildiacilglicerol) y similares. Es ejemplo de ácido graso un ácido graso saturado o insaturado que tenga de 12 a 18 átomos de carbono, que puede ser, por ejemplo, ácido palmítico, ácido oleico o ácido láurico. Como glicérido, se mencionan, por ejemplo, monoglicérido, diglicérido, triglicérido y similares. Los colesteroles incluyen colesterol, éster de colesterol y alocolesterol. El grupo funcional en estos lípidos puede estar en forma de un haluro de ácido, un anhídrido de ácido o un éster activo, para aumentar la reactividad con PAO y los agentes de reticulación a mencionar más tarde.
Para una unión indirecta de un lípido y PAO, puede usarse también uno obtenido haciendo reaccionar un agente de reticulación (es decir, espaciador o enlazador) con el grupo funcional de un lípido de antemano. Los ejemplos de tal agente de reticulación incluyen un ácido dicarboxílico, un ácido aminocarboxílico, un compuesto de bismaleimida, un compuesto de bishalocarbonilo, un compuesto de halocarbonilmaleimida, ditiomaleimida, un ácido ditiocarboxílico, un ácido maleimidocarboxílico y similares. Estos agentes de reticulación tienen preferiblemente de 2 a 10 átomos de carbono. Estos agentes de reticulación y el grupo funcional de un lípido se hacen reaccionar según un método convencional.
Son ejemplos del fosfolípido formado haciendo reaccionar dicho agente de reticulación con el grupo funcional PE-N-carbonilamina (por ejemplo, PE-N-caproilamina, PE-N-dodecanilamina, PE-N-glutarilamina y similares), PE-N-carbonilo (por ejemplo, PE-N-succinilo, PE-N-glutarilo (NGPE), PE-N-dodecanilo (NDPE) y similares), PE-N-ditioacilato (por ejemplo, PE-N-3-(2-piridilditio)propionato), PE-N-maleimidoacilato (por ejemplo, PE-N-4-(p-maleimidofenil)butirato y similares), PE-biotinilo y similares.
(C) PAO (poli(óxido de alquileno))
PAO está presente entre (A) GPIb y (B) un lípido, y une a los dos. El PAO es igual que polialquilenglicol y tiene como ejemplos polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol, un glicol obtenido por copolimerización de óxido de etileno y óxido de propileno, y similares. PAO tiene un peso molecular medio numérico alto de aproximadamente 100-100.000, preferiblemente alrededor de 1.000-10.000.
Como PAO, además, puede usarse también uno obtenido haciendo reaccionar uno o ambos de los términos de PAO con un agente de reticulación (es decir, espaciador, enlazador) de antemano. Los ejemplos del agente de reticulación incluyen un ácido dicarboxílico, un ácido aminocarboxílico, un compuesto de bismaleimida, un compuesto de bishalocarbonilo, un compuesto de halocarbonilmaleimida, ditiomaleimida, un ácido ditiocarboxílico, un ácido maleimidocarboxílico y similares. Estos agentes de reticulación y PAO se hacen reaccionar según un método convencional.
(D) Preparación de conjugado de GPIb-lípido
La unión entre GPIb y PAO, y la unión entre PAO y un lípido que tiene un grupo funcional, se forman químicamente directa o indirectamente, es decir, mediante o no mediante un grupo derivado de un agente de reticulación. En la presente invención, se prefiere una unión indirecta. La relación molar de mezclado de GPIb:PAO o un lípido que tiene un grupo funcional es aproximadamente 1:1-1:20, preferiblemente alrededor de 1:1-1:10.
Cuando el enlace químico entre GPIb o un lípido que tiene un grupo funcional y PAO no puede formarse directamente, puede emplearse un método que comprende hacer reaccionar el grupo funcional de un lípido o PAO con el agente de reticulación mencionado antes, o pueden usarse un agente de condensación conocido, un agente de activación que activa el grupo funcional en el lípido, un agente de reticulación divalente y similares. Los ejemplos del agente de condensación y el agente de activación incluyen carbodiimidas (por ejemplo, N,N'-diciclohexilcarbodiimida, 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) y similares), succinimidas (por ejemplo, N-hidroxisuccinimida, N-hidroxisulfosuccinimida (NHSS) y similares), un compuesto usado para reacción de intercambio de grupo tiol (por ejemplo, ácido 5,5'-ditiobis(2-nitrobenzoico), 2,2'-ditiobispiridina y similares), y similares.
El agente de reticulación divalente puede ser un agente de reticulación que tenga la misma o diferente reactividad. Los ejemplos del agente de reticulación que tiene la misma reactividad incluyen adipimidato de dimetilo, suberato de disuccinimidilo y similares, y los ejemplos del agente de reticulación que tiene diferente reactividad incluyen 3-(2-piridilditio)propionato de succinimidilo, N-(6-maleimidocaproiloxi)succinimida, 6-maleimidohexanoato de
N-succinimidilo y similares.
Como unión directa de GPIb o lípido y PAO, se mencionan -COO- [por ejemplo, obtenido por enlace éster del grupo carboxilo de GPIb o lípido (por ejemplo, ácido graso) y el grupo hidroxilo de PAO], -O- (por ejemplo, obtenido por enlace éter del grupo hidroxilo de GPIb o lípido y el grupo hidroxilo de PAO], -CONH- (por ejemplo, obtenido por enlace amida del grupo carboxilo de GPIb o lípido y el grupo amino introducido en PAO), -CH=N- (por ejemplo, obtenido por enlace de Schiff del grupo aldehído en la cadena de azúcar de GPIb o el grupo aldehído introducido en el lípido y el grupo amino introducido en PAO), -CH_{2}NH- (obtenido por reducción adicional de enlace de Schiff), -NH- y similares.
De los métodos específicos para unir indirectamente GPIb o lípido y PAO, son ejemplos del modo de unión del agente de reticulación (incluyendo el agente de reticulación divalente, en adelante el mismo) y PAO -COO-, -O-,
-CONH-, -CH=N-, -CH_{2}NH-, -NH- y similares, como los mencionados antes. Como modo de unión de GPIb o lípido y el agente de reticulación, se mencionan, además de los similares a los mencionados antes, -S-S- [obtenido por enlace disulfuro del grupo tiol de GPIb o lípido (por ejemplo, fosfatidiltioetanol) y el resto ditio del agente de reticulación tal como ditiomaleimida, compuesto de ditiocarbonilo y similares], -S- (obtenido por unión del grupo tiol de GPIb o lípido y el agente de reticulación tal como compuesto de maleimida, compuesto de halocarbonilo y similares, por alquilación reductora), -NH- (por ejemplo, obtenido haciendo reaccionar el grupo amino de GPIb o lípido (por ejemplo, PE) y el resto maleimida del agente de reticulación, tal como ácido maleimidocarboxílico y similares), -CO- y similares.
El conjugado de GPIb-lípido puede prepararse en presencia de un tensioactivo. El tensioactivo no está limitado particularmente siempre que solubilice el lípido. Es preferible el uso de un tensioactivo no iónico, de manera que no se influya en la estructura de la GPIb. En particular, es preferible un tensioactivo no iónico que tenga una alta concentración de micelas crítica (CMC), tal como una CMC de no menos de 1 mM. Los ejemplos de ellos incluyen octil glucósido (por ejemplo, n-octil-\beta-D-glucósido, octil tioglucósido (por ejemplo, n-octil-\beta-D-tioglucósido), 3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]propanosulfato (CHAPS) y N,N-bis(3-D-gluconamidopropil)desoxicolamida (desoxi-BIGCHAP). La relación de mezclado de lípido:tensioactivo es preferiblemente de alrededor de 0,01:1-0,1:1 por mol.
(E) Lípido activado consistente en sustituyente reactivo-PAO-lípido (al que se hace también referencia en adelante simplemente como un lípido activado)
Como un compuesto intermedio para sintetizar un conjugado (conjugado de GPIb-lípido) consistente en GPIb-PAO-lípido, puede usarse un lípido activado consistente en sustituyente reactivo-PAO-lípido. Según se usa aquí, por el "lípido activado" se entiende un producto unido de PAO y lípido que tiene un sustituyente reactivo en el terminal de PAO. El PAO y el lípido están unidos químicamente directa o indirectamente mediante o no mediante un grupo derivado de un agente de reticulación. El sustituyente reactivo no está sujeto a limitación particular en tanto en cuanto tenga la acción de activar un enlace con una proteína. Por ejemplo, puede obtenerse haciendo reaccionar succinimida, maleimida y similares con el terminal de PAO. El modo del enlace entre el sustituyente reactivo y PAO, y el PAO y un lípido
en el lípido acivado es como se ha mostrado en la (D) Preparación de conjugado de GPIb-lípido mencionada antes.
Uniendo directa o indirectamente lípido activado y GPIb químicamente, es decir, mediante o no mediante un agente de reticulación, puede obtenerse un conjugado de GPIb-lípido.
Como lípido activado, se ponen como ejemplo específicamente los siguientes compuestos. Estos lípidos activados son conocidos y pueden producirse según un método conocido. Alternativamente, pueden usarse productos disponibles comercialmente.
DSPE-34HCSI:
diestearoilfosfatidil-N-(succinimidilsuccinil-polioxietilen-succinil)etanolamina. El peso molecular medio numérico de PEG es 3400.
DSPE-20HMAL:
diestearoilfosfatidil-N-(maleimidopropionilamino-polioxietilen-oxicarbonil)etanolamina. El peso molecular medio numérico de PEG es 2000.
(F) Propiedad del conjugado de GPIb-lípido
El conjugado de GPIb-lípido de la presente invención comprende GPIb y PAO o lípido en una relación molar constituyente de aproximadamente 1:1-1:20. La relación molar constituyente de PAO y lípido es 1:1.
(II) Complejo de conjugado de GPIb-lípido y lípido libre (complejo de GPIb lípido)
El complejo de la presente invención que contiene el conjugado de GPIb-lípido mencionado antes y lípido libre puede tomar la forma de un liposoma, micela o emulsión de lípido, prefiriéndose un liposoma. Como ejemplo del complejo de la presente invención, se explica un complejo de GPIb lípido en forma de un liposoma. La explicación del siguiente complejo de GPIb lípido es de aplicación a otras formas además de liposoma.
(A) Lípido libre
El lípido a usar aquí está exento de limitación en tanto en cuanto pueda tomar la forma de un complejo de lípido, tal como un liposoma, y puede usarse solo o en combinación con otro lípido. Los ejemplos de tal lípido incluyen fosfolípido, glicolípido, colesterol, ácido graso y derivados de ellos. El lípido libre a usar en la presente invención para formar el complejo puede ser cualquier lípido no tóxico siempre que sea aceptable fisiológicamente y metabolizable. Nótese que un lípido libre significa un lípido distinto de un lípido que constituye el conjugado de GPIb-lípido, y puede ser homólogo o heterólogo con el lípido que constituye el conjugado de GPIb-lípido.
Los ejemplos del fosfolípido incluyen fosfatidilcolina (a la que se hace referencia en adelante como PC), fosfatidilserina, ácido fosfatídico, fosfatidilglicerol, fosfatidilinositol, esfingomielina, fosfato de dicetilo, cardiolipina, lisofosfatidilcolina y similares. Estos lípidos pueden extraerse y purificarse de un material natural tal como aceite de soja o yema de huevo, o prepararse por hidrogenación de ellos para saturar el ácido graso constituyente (fosfolípido hidrogenado), u obtenerse sustituyendo el ácido graso constituyente con un ácido graso específico, tal como ácido palmítico y ácido mirístico (por ejemplo, diacilfosfatidilcolina, diacilfosfatidilglicerol y similares). Sus ejemplos específicos incluyen lecitina de yema de huevo purificada, lecitina de soja purificada hidrogenada, fosfatidilcolina originada de yema de huevo, dipalmitoilfosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilglicerol, diestearilfosfatidilcolina, dimiristilfosfatidilcolina y similares.
El glicolípido puede ser, por ejemplo, ceramida, cerebrosida, esfingosina, sulfatida, gangliósidos o gliceroglicolípidos.
Los colesteroles incluyen colesterol, éster de colesterol y alocosterol.
Son ejemplos del ácido graso ácido oleico, ácido láurico, ácido mirístico, ácido palmítico y ácido esteárico. Los ejemplos del derivado de lípido incluyen derivado de polioxietileno que tiene fosfatidiletanolamina y ácido graso, y derivado de polisacárido que tiene ácido graso y colesterol. Específicamente, puede ser diestearil-N-(monometoxipolieti-
lenglicolsuccinil)-fosfatidiletanolamina, poli(palmitato de oxietileno), N-[2-(estearoilcarboxiamino)etil]carbamoilmetilmanan o N-[2-(colesterilcarboxiamino)etil]carbamoilmetilpluran.
(B) Formación de complejo
Como relación de mezclado de conjugado de GPIb-lípido:lípido libre, la relación molar de mezclado de GPIb:lípido libre es aproximadamente 1:10-1:1000, preferiblemente alrededor de 1:50-1:200.
Puede prepararse un complejo de GPIb lípido (por ejemplo, liposoma) mediante, por ejemplo, método de separación de tensioactivo, método de hidrato, ultrasonicación, método de evaporación en fase inversa, método de congelación-descongelación, método de inyección de etanol, método de extrusión o emulsionamiento a alta presión. El método de separación de tensioactivo es generalmente filtración en gel, diálisis o ultrafiltración. En la presente invención, es más preferible un método que comprende formar un complejo después de unir GPIb y un lípido mediante PAO, o formar un complejo de lípido después de preparar un conjugado de GPIb-lípido. También es posible preparar un complejo de GPIb lípido añadiendo GPIb después de preparar un complejo de lípido (por ejemplo, liposoma) consistente en el lípido de (I)(B) y el lípido libre de (II)(A), para unir por ello el lípido de (I)(B) y GPIb mediante PAO. El complejo de GPIb lípido puede aislarse y purificarse por un método conocido per se, tal como centrifugación y filtración en gel.
Se pone como ejemplo en lo que sigue el método de producción del complejo de GPIb lípido.
(i) Método para formar un complejo de GPIb lípido después de preparar un conjugado de GPIb-lípido
Un lípido [(I)(B)] se solubiliza con un tensioactivo y se une con PAO para dar un producto unido. Este producto unido, GPIb y un lípido libre [(II)(A)] se mezclan en un disolvente acuoso adecuado para permitir la unión de GPIb y el líquido [(I)(B)] mediante PAO, y se separa después el tensioactivo para formar un complejo de GPIb lípido. Alternativamente, un producto unido del lípido [(I)(B)] y PAO y GPIb se mezclan en presencia de un tensioactivo para preparar un conjugado de GPIb-lípido, se mezcla un lípido libre [(II)(A)] y se separa el tensioactivo, para dar por ello un complejo de GPIb lípido. La GPIb no reaccionada, el lípido [(I)(B)], el lípido libre [(II)(A)] y similares pueden separarse y retirarse para dar un producto purificado. El tensioactivo es el mismo que los mencionados antes. La relación de mezclado (lípido libre [(II)(A)]:tensioactivo) es aproximadamente 0,001:1-0,1:1 (relación molar).
(ii) Método para unir GPIb tras la preparación de un complejo de lípido (por ejemplo, liposoma) para dar complejo de GPIb lípido
El producto unido de lípido [(I)(B)] y PAO, y lípido libre [(II)(A)], se disuelven y mezclan en un disolvente orgánico tal como cloroformo y etanol, y el disolvente orgánico se separa para dar una membrana de lípido delgada. Se añade un disolvente acuoso adecuado y se trata la mezcla por un método conocido, tal como sacudidas y agitación, para dar un complejo de lípido. Se añade GPIb para formar un enlace de GPIb y el lípido mediante PAO, por lo que se forma un complejo de GPIb lípido.La GPIb no reaccionada, el lípido y similares pueden separarse y retirarse para dar un producto purificado.
Para este método, se usa un lípido libre [(II)(A)] que no reacciona/se une con GPIb. Especialmente, se usan fosfatidilcolina, lisofosfatidilcolina y similares.
La proporción de GPIb a lípido libre [(II)(A)] en el complejo de GPIb lípido obtenido es 0,01-10 partes en peso, preferiblemente 0,1-5 partes en peso, por parte en peso del lípido libre [(II)(A)].
El complejo de GPIb lípido obtenido tiene un tamaño de partículas de aproximadamente 50-500 nm, preferiblemente alrededor de 100-400 nm. El número de moléculas de GPIb por partícula es 100-10000, preferiblemente 250-3000, y la densidad superficial de GPIb es 10^{10}-10^{13}, preferiblemente 10^{11}-10^{12}.
El complejo de GPIb lípido (por ejemplo, liposoma) tiene una estructura de vesícula multilaminar (MLV), pequeña vesícula unilaminar, gran vesícula unilaminar y similares. Puede estar revestido con un polímero hidrófilo tal como polietilenglicol (PEG), pluronic (marca comercial registrada) (copolímero de bloques de polioxietileno polioxipropileno) y similares.
Cuando sea necesario, el complejo de GPIb lípido obtenido se lava con una solución acuosa aceptable fisiológicamente, se esteriliza por filtración, se dispensa y formula en una preparación líquida, de glóbulos o en suspensión.
El complejo puede elaborarse por un método conocido para ser utilizable para la preparación de productos farmacéuticos. Las preparaciones mencionadas antes pueden proporcionarse como preparaciones liofilizadas congelando una preparación líquida y secándola bajo presión reducida. Para liofilización, pueden añadirse monosacáridos (por ejemplo, glucosa), disacáridos (por ejemplo, sacarosa) y similares.
Las preparaciones de complejo de GPIb lípido pueden contener, como estabilizante, un polímero seleccionado entre albúmina, dextrano, polímero vinílico, gelatina e hidroxiletil almidón.
El polímero puede incorporarse a los huecos presentes en dicho complejo de lípido junto con un fármaco. Alternativamente, el polímero puede añadirse o contenerse en dicha preparación de complejo de lípido que contiene un fármaco. Esto significa que el polímero puede añadirse o incorporarse fuera del liposoma. Es innecesario decir que puede incorporarse dentro y fuera del complejo de lípido.
El estabilizante se añade en una cantidad de 0,5-10 partes en peso, preferiblemente 1-5 partes en peso, por parte en peso del lípido libre [(II)(A)].
(III) Uso de complejo de GPIb lípido como producto farmacéutico
El complejo de GPIb lípido de la presente invención puede realizarse como diagnóstico de la localización de lesión vascular o formación de trombo, deficiencia de Factor de von Willebrand y similares añadiendo una sustancia de marcado (denominada un marcador). Los ejemplos de tal sustancia de marcado incluyen RI (radioisótopo), metal paramagnético para MRI, compuesto yoduro para formación de imagen de rayos X, sustancia fluorescente y pigmento.
Son ejemplos de RI ^{3}H, ^{14}C, ^{99m}Tc, ^{123}I, ^{125}I, ^{131}I, ^{87m}Sr, ^{113m}In, ^{197}Hg y similares. Los ejemplos de metal paramagnético para MRI son ion divalente e ion trivalente de un metal paramagnético de cromo (Cr), gadolinio (Gd), manganeso (Mn), hierro (Fe), cobalto (Co), niquel (Ni), praseodimio (Pr), neodimio (Nd), samario (Sm), iterbio (Yb), terbio (Tb), disprosio (Dy), holmio (Ho), erbio (Er), cobre (Cu) y similares, prefiriéndose un ion divalente y un ion trivalente de gadolinio, terbio, disprosio, holmio, erbio e hierro.
El compuesto yoduro para formación de imagen de rayos X puede ser un compuesto conocido para formación de imagen de rayos X. Los ejemplos de él incluyen adipiodona, ácido amidotrizoico, ácido iotalámico, ácido iopanoico, ácido iobenzámico, iopodato, ácido tiropanoico, iopidol, iopidona, propiliodona, iodamida y sales de ellos (por ejemplo, sal sódica y sal de meglumina). La sustancia fluorescente puede ser, por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína (FITC), carboxifluoresceína (CF) y similares.
Estas sustancias de marcado pueden encapsularse en un complejo de lípido (por ejemplo, liposoma) por un método conocido. Por ejemplo, pueden encerrarse en un complejo de lípido en forma de una sal o después de quelación con un agente de quelación tal como ácido etilendiaminatetraacético (EDTA) y ácido dietilentriaminapentaacético (DTFA). En el caso de ^{99m}Tc, por ejemplo, pueden usarse pertecnato sódico, polifosfato de tecnecio o ^{99m}Tc DTPA.
El agente farmacéutico para examen o diagnosis, que contiene una sustancia de marcado y el complejo de GPIb lípido de la presente invención, puede ser un complejo de GPIb lípido de la presente invención, que se prepara según un método mencionado antes y usando GPIb marcada con una sustancia de marcado (por ejemplo, RI).
El complejo de GPIb lípido de la presente invención es acumulativo en la lesión vascular, y así, puede formarse en una composición que contenga un fármaco (vehículo de fármaco). El fármaco a contener está exento de cualquier limitación particular siempre que se pruebe eficaz fisiológica y farmacológicamente por acumulación del mismo en la lesión vascular, y puede ser, por ejemplo, un agente hemostático, un vasoconstrictor, un agente antiinflamatorio, un agente trombolítico, un anti-coagulador de la sangre, un agente anti-plaquetas y similares.
Son ejemplos del agente hemostático carbazocromo, factor de coagulación de sangre (FVIII, FIX), trombina, agente antiplasmina (por ejemplo, ácido \varepsilon-aminocaproico y ácido tranexámico), sulfato de protamina, etamsilato, fitonadiona y estrógeno conjugado (por ejemplo, sulfato de sodio y estrona y sulfato de sodio y equilina) y similares.
Son ejemplos del vasoconstrictor noradrenalina, norfenefrina, fenilefrina, metaraminol, metoxamina, prostaglandina F_{1} \alpha, prostaglandina F_{2} \alpha, tromboxano A_{2} y similares. Son ejemplos del agente antiinflamatorio un agente antiinflamatorio esteroidal (por ejemplo, dexametasona, hidrocortisona, prednisolona, betametasona, triamcinolona, metilprednisolona y similares), un agente antiinflamatorio no esteroidal (por ejemplo, indometacina, acemetacina, flurbiprofeno, aspirina, ibuprofeno, ácido flufenámico, cetoprofeno y similares) y similares.
Son ejemplos del agente trombolítico plasmina, activador de plasminógeno de tejidos, uroquinasa, precursores de ellos y derivados de ellos. Son ejemplos del anti-coagulador de la sangre monopolisacárido ácido (por ejemplo, heparina), anti-coagulador de la sangre de cumarina, extracto natural (por ejemplo, hirudina) y derivados de ellos, sustancias activas fisiológicamente (por ejemplo, trombomodulina, proteína activa C y similares) y similares. Son ejemplos del agente anti-plaquetas aspirina, ticlopidina, cilostazol, prostaciclina y similares. Estos fármacos pueden encapsularse en un complejo de lípido por un método conocido.
El complejo de GPIb lípido de la invención se administra en una cantidad de aproximadamente 0,001-1000 mg como GPIb por día. La dosis puede cambiarse apropiadamente dependiendo del sexo, la edad y los síntomas de los pacientes.
El complejo de GPIb lípido se administra más preferiblemente parenteralmente. Para ser específico, se administra por inyección intravascular (intraarterial o intravenosa), goteo intravenoso, administración subcutánea, administración local, administración intramuscular y similares.
La composición farmacéutica que contiene el complejo de GPIb lípido de la invención es útil como sustituto de plaquetas, un producto farmacéutico para la profilaxis o tratamiento de angiopatía, daños vasculares y trombosis, un diagnóstico para deficiencia de vWF y similares, un reactivo biológico o médico, un reactivo para examinar supresor de la agregación de plaquetas o antitrombosis, y similares. También es útil para un diagnóstico para encontrar la localización de lesión vascular o formación de trombo, o un agente terapéutico de ellos.
Ejemplos
La presente invención se explica con más detalle en lo que sigue mediante Ejemplos y Ejemplos experimentales, que no han de considerarse como limitativos. La GPIb sometida a los Ejemplos y Ejemplos experimentales de la presente invención era un fragmento de cadena \alpha de GPIb [His(1)-Arg(293), peso molecular 45000, documento JP-A-9-208559] producida por ingeniería genética usando una célula CHO.
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Ejemplo 1
Se añadió a solución salina fisiológica (100 \mul) que contenía GPIb (100 mg/ml) fosfatidilcolina de yema de huevo (EPC) (221 mg), colesterol (45,4 mg) y octil glucósido (OG) (2,33 g), disueltos en agua para inyección (1,5 ml). La cantidad de EPC correspondía a una relación molar de 100 veces de GPIb. Se añadió después DSPE-34HCSI (comprado de NOF Corporation) disuelto en tampón HEPES (pH 8,0) que contenía 0,1% de OG. La cantidad de DSPE-34HCSI añadida era una cantidad molar de 10 veces de GPIb. Después de reaccionar a 4ºC durante 16 h, se separó OG por filtración en gel (el vehículo fue Sephadex G-75, Pharmacia Biotech) para dar un liposoma. El liposoma de GPIb se recuperó por separación centrífuga por el método de gradiente de densidad de CsCl. Las condiciones para ello fueron como sigue. Se disolvió CsCl en una muestra (1-1,5 ml) hasta una concentración del 35%, y se estratificaron sobre ella 0,5 ml de CsCl del 25% y 0,1 ml de solución salina fisiológica, y se trataron a 214000 x g durante 10 min. La fracción que contenía liposoma se recuperó y dializó durante la noche frente a una membrana de diálisis (peso molecular de la fracción 10.000 daltons, Slide-A-Lyzer 10K, Pierce Biotechnology, Inc.) usando solución salina fisiológica. El liposoma de GPIb preparado tenía una concentración de PC de 0,61 mg/ml, una concentración de GPIb de 0,24 mg/ml y un tamaño medio de partículas de 0,25 \mum.
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Ejemplo 2
Se añadió a 1,3,4,6-tetracloro-3\alpha,6\alpha-difenilglicourilo (200 \mug) solución de Na^{125}I (448 MBq/ml, 30 \mul) y después solución salina fisiológica (100 \mul) que contenía GPIb (100 mg/ml), y la mezcla se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 10 min. Se añadió NaI 25 mM (100 \mul) y la mezcla se sometió a filtración en gel (MicroSpin
G-25, Pharmacia Biotech) y ultrafiltración (Ultrafree-MC10K, Millipore Corporation) para dar GPIb marcada con yodo (^{125}I-GPIb).
La operación siguió la del Ejemplo 1 excepto que se usó la ^{125}I-GPIb mencionada antes en lugar de GPIb. El liposoma de GPIb preparado tenía una concentración de PC de 3,54 mg/ml, una concentración de GPIb de 1,00 mg/ml,
un tamaño medio de partículas de 0,33 \mum y una radioactividad de 9,3 x 10^{7} cpm/ml.
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Ejemplo experimental 1
Se confirmó la capacidad de agregación del liposoma de GPIb. El liposoma de GPIb preparado en el Ejemplo 1 se ajustó a una concentración de PC de 0,2 mg/ml. Se añadieron a la solución (200 \mul) 2 mg/ml de una solución de vWF (25 \mul) y la mezcla se incubó y agitó a 37ºC. Después de 2 min, se mezclaron 15 mg/ml de una solución de ristocetina (25 \mul). El agregado se midió durante el total de 15 min desde inmediatamente antes de la incubación usando un agregómetro (AG-10, Kowa Company, Ltd.). Se calculó el total de los valores de número de agregados multiplicado por la intensidad de dispersión y se usó como índice del grado de formación de agregados. Los resultados se muestran en la Tabla 1.
Se realizó un experimento similar usando, como testigo, un liposoma de GPIb (descrito en el Ejemplo 1 del documento JP-A-9-208599) sin PEG. Los resultados se muestran en la Tabla 2.
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TABLA 1
1 
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TABLA 2
2
El liposoma de GPIb de la presente invención reaccionó específicamente con vWF en presencia de ristocetina y formó un agregado. Esto ha demostrado que el liposoma de GPIb es útil como sustituto de plaquetas. Además, se ha clarificado que el liposoma de GPIb de la presente invención tiene la capacidad de agregación mejorada en comparación con el testigo.
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Ejemplo experimental 2
Se confirmó la hemodinámica del liposoma de GPIb. El liposoma de GPIb marcado con yodo preparado en el Ejemplo 2 se administró a cobayas Hartley (n = 3) con la dosis de 1 mg/kg de peso corporal de GPIb en la vena femoral. Se extrajo la sangre de la orbital con un lapso de tiempo durante 60 min después de la administración y se contó la radioactividad de la sangre (100 \mul) en un contador gamma (1 min). Se realizó un experimento similar usando, como testigo, un liposoma de GPIb (descrito en el Ejemplo 1 del documento JP-A-9-208599) sin PEG. Los resultados se muestran en la Tabla 3.
TABLA 3
3
Se ha clarificado que el liposoma de GPIb de la presente invención tiene una propiedad de retención en sangre mejorada en comparación con el testigo.
Aplicabilidad industrial
El complejo de GPIb lípido de la presente invención puede unirse con vWF y formar un agregado. Así, se espera que tenga potencial para uso práctico en un amplio intervalo como sustituto de plaquetas, agente farmacéutico para la profilaxis o tratamiento de angiopatía, daño vascular y trombosis, diagnóstico para deficiencia de vWF y similares, reactivo biológico o médico, reactivo para examen de supresor de la agregación de plaquetas o antitrombosis, y similares. El complejo de GPIb lípido de la presente invención también es útil como diagnóstico para encontrar la localización de una lesión vascular o formación de trombo, o un agente terapéutico de lo mismo, porque se acumula específicamente en lesiones vasculares. Además, el complejo de GPIb lípido de la presente invención también es superior en propiedad de retención en sangre, lo que permite la expresión continua de una acción farmacológica.
El conjugado de GPIb-lípido de la presente invención es altamente utilizable como ingrediente activo del complejo de GPIb lípido de la presente invención.

Claims (21)

1. Un conjugado que comprende GPIb y un lípido, que están unidos mediante poli(óxido de alquileno) (PAO), en el que la GPIb es
(i)
una propia GPIb,
(ii)
una cadena \alpha de GPIb, o
(iii)
un fragmento de una región de unión a Factor de von Willebrand (vWF) de una cadena \alpha de GPIb.
2. El conjugado de la reivindicación 1ª, en el que el fragmento de (iii) es un fragmento de cadena \alpha de GPIb que carece de un lugar transmembrana.
3. El conjugado de la reivindicación 1ª, en el que el lípido tiene un grupo funcional que es un grupo amino, un grupo carboxilo, un grupo tiol o un grupo aldehído.
4. El conjugado de la reivindicación 3ª, en el que el lípido que tiene un grupo funcional es un fosfolípido, un glicolípido, un ácido graso, un glicérido, un colesterol o un lípido anfipático.
5. El conjugado de la reivindicación 1ª, en el que el PAO es polietilenglicol, polipropilenglicol o un glicol obtenido copolimerizando óxido de etileno y óxido de polipropileno.
6. El conjugado de la reivindicación 1ª, en el que el PAO tiene un peso molecular medio numérico de 100-100000.
7. El conjugado de la reivindicación 3ª, en el que la GPIb y el PAO, y el PAO y el lípido que tiene un grupo funcional, están unidos químicamente respectivamente por un agente de reticulación.
8. El conjugado de la reivindicación 3ª, en el que la relación molar de GPIb:PAO es 1:1-1:20, y la relación molar de PAO:lípido que tiene un grupo funcional es 1:1.
9. Un complejo que comprende el conjugado de la reivindicación 1ª y un lípido libre.
10. El complejo de la reivindicación 9ª, que está en forma de un liposoma.
11. El complejo de la reivindicación 9ª, en el que el lípido libre es un fosfolípido, un glicolípido, un colesterol, un ácido graso o un derivado de ellos.
12. El complejo de la reivindicación 9ª, en el que la relación molar de la GPIb:lípido libre es 1:10-1:1000.
13. El complejo de la reivindicación 9ª, en el que el complejo es agregable en presencia de ristocetina.
14. El complejo de la reivindicación 9ª, en el que se prepara el conjugado que comprende GPIb y el lípido unidos mediante PAO y se prepara después un complejo de dicho conjugado y un lípido libre.
15. Una composición farmacéutica que comprende el complejo de la reivindicación 9ª.
16. La composición farmacéutica de la reivindicación 15ª, que es un sustituto de plaquetas.
17. La composición farmacéutica de la reivindicación 15ª, que es un agente para la profilaxis o tratamiento de un trastorno vascular, un daño vascular o trombosis.
18. Un agente farmacéutico para examen o diagnosis, que comprende, como ingrediente activo, una sustancia de marcado y el complejo de la reivindicación 9ª.
19. El agente farmacéutico de la reivindicación 18ª, en el que la sustancia de marcado es un radioisótopo, un metal paramagnético para MRI, un compuesto yoduro para formación de imagen de rayos X, una sustancia fluorescente o un pigmento.
20. Una composición que contiene fármaco que comprende un fármaco y el complejo de la reivindicación 9ª como ingredientes activos, en la que el fármaco es un agente hemostático, un vasoconstrictor, un agente antiinflamatorio, un agente trombolítico, un anti-coagulador de la sangre o un agente anti-plaquetas.
21. El uso de un complejo de la reivindicación 9ª para preparar un sustituto de plaquetas o un medicamento para la profilaxis o tratamiento de un trastorno vascular, un daño vascular o trombosis.
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Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000062813A2 (en) * 1999-04-20 2000-10-26 The University Of British Columbia Cationic peg-lipids and methods of use
WO2004037310A2 (en) * 2002-10-21 2004-05-06 Allvivo, Inc. Surface coating comprising bioactive compound
WO2004045583A1 (ja) * 2002-11-15 2004-06-03 Nipro Corporation リポソーム
KR20050111583A (ko) * 2003-02-06 2005-11-25 각고호우징 게이오기주크 펩티드 결합체
JP2006248978A (ja) * 2005-03-10 2006-09-21 Mebiopharm Co Ltd 新規なリポソーム製剤
JP5216219B2 (ja) * 2006-01-06 2013-06-19 真司 武岡 薬物運搬体
US7887837B2 (en) * 2006-01-06 2011-02-15 Shinji Takeoka Drug delivery material
US20080015145A1 (en) * 2006-07-11 2008-01-17 Maria Gyongyossy-Issa Mimotope receptors and inhibitors for platelet-platelet and platelet-endothelium interactions
CA2600220C (en) * 2006-09-07 2014-12-09 Canadian Blood Services Surface cross-linked lipidic particles, methods of production and uses therefor
WO2008121721A2 (en) * 2007-03-28 2008-10-09 Portola Pharmaceuticals, Inc. Targeted delivery and expression of procoagulant hemostatic activity
CN109996809A (zh) 2016-11-14 2019-07-09 诺华股份有限公司 与促融合蛋白minion相关的组合物、方法和治疗用途
JP7395353B2 (ja) 2018-10-17 2023-12-11 東レ株式会社 止血材
EP3868740A4 (en) 2018-10-17 2022-07-20 Toray Industries, Inc. CARBOXYLIC ACID LIPID, LIPID PARTICLE AND LIPID MEMBRANE CONTAINING CARBOXYLIC ACID LIPID

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5200510A (en) 1987-06-16 1993-04-06 Zymogenetics, Inc. Method for purifying factor viii:c, von willebrand factor and complexes thereof
US5340727A (en) 1987-11-17 1994-08-23 The Scripps Research Institute GPIbα fragments and recombinant DNA expression vectors
DE69632303T2 (de) * 1995-08-17 2005-05-12 Crucell Holland B.V. Poly(organo)phosphazene in synthetischen transfektions-systemen
JP3735921B2 (ja) * 1996-02-07 2006-01-18 三菱ウェルファーマ株式会社 ＧＰＩｂ・脂質複合体およびその用途
US6056973A (en) * 1996-10-11 2000-05-02 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic liposome composition and method of preparation
US6210707B1 (en) * 1996-11-12 2001-04-03 The Regents Of The University Of California Methods of forming protein-linked lipidic microparticles, and compositions thereof

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Publication number Publication date
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