ES2252755T3 - Uso de emulsiones que comprenden fluorocarbonos liquidos encapsulados en lipidos para procedimientos de diagnostico dirigidos in vivo. - Google Patents
Uso de emulsiones que comprenden fluorocarbonos liquidos encapsulados en lipidos para procedimientos de diagnostico dirigidos in vivo.Info
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Abstract
UN METODO PARA LA UNION BASADA EN LIGANDO DE PARTICULAS DE LIPIDOS ENCAPSULADAS A EPITOPOS MOLECULARES EN UNA SUPERFICIE IN VIVO O IN VITRO COMPRENDE LA ADMINISTRACION SECUENCIAL DE (A) LIGANDO ESPECIFICO DE SITIO ACTIVADO CON UN AGENTE ACTIVADOR DE BIOTINA; (B) UN AGENTE ACTIVADOR DE AVIDINA; Y (C) PARTICULAS LIPIDICAS ENCAPSULADAS ACTIVADAS CON UN AGENTE ACTIVADOR DE BIOTINA, EN EL QUE EL LIGANDO ESTA CONJUGADO A PARTICULAS A TRAVES DE LA INTERACCION AVIDINA TANTE SE UNE A LOS EPITOPOS MOLECULARES EN DICHA SUPERFICIE. EL CONJUGADO ES EFICAZ PARA LA OBTENCION DE IMAGENES POR RAYOS X, ULTRASONIDOS, RESONANCIA MAGNETICA O TOMOGRAFIA DE EMISION DE POSITRONES. SE DESCUBREN COMPOSICIONES PARA SU USO EN LA OBTENCION DE IMAGENES DIAGNOSTICAS DE SUPERFICIES NATURALES O SINTETICAS POR ULTRASONIDOS Y PARA LA ESTIMULACION DE LA REFLEXION ACUSTICA DE LAS MISMAS.
Description
Uso de emulsiones que comprenden fluorocarbonos
líquidos encapsulados en lípidos para procedimientos de diagnóstico
dirigidos in vivo.
Esta invención se refiere a un sistema de unión
novedoso específico de sitio y a composiciones novedosas, y más
particularmente, a tal sistema y composiciones que son útiles en
métodos mejorados para la obtención de imágenes de ultrasonido, la
administración del fármaco o el agente quimioterápico y los ensayos
diagnósticos y los sistemas de detección.
Hasta ahora, con respecto a la obtención de
imágenes de ultrasonido, aunque se ha demostrado que los agentes de
contraste ultrasónicos basados en la tecnología de "burbujas"
desarrollan un desajuste de impedancia acústica en virtud del gas
encapsulado o bien en proteínas (Feinstein et al., J. Am.
Coll. Cardiol. 1990; 16:316-324 y Keller et
al., J. Am. Soc. Echo. 1989; 2:48-52),
polisacáridos (Corday et al., J. Am. Coll. Cardiol. 1984;
3:978-85) polímeros biodegradables (Schneider et
al., Invest. Radiol., 1993; 27:134-139 y Bichon
et al., solicitud de patente europea número 890810367.4:
1990) o lípidos (D’Arrigo et al., J. Neurormag., 1991;
1:134-139; Simon et al., Invest. Radiol.,
1992; 27:29-34; y Unger et al., Radiology
1992; 195:453-456), no se conocen pruebas
experimentales de selección como objetivo específica de sitio de un
agente de obtención de imágenes o contraste acústico con cambios
resultantes en las propiedades acústicas del tejido, superficie o
soporte seleccionado como diana. Esta falta de resultados se ha
producido a pesar de los numerosos métodos descritos en la
bibliografía para modificar tales agentes para fines de selección
como objetivo y el fracaso de los enfoques anteriores de la
selección como objetivo puede deberse a la naturaleza química de los
agentes, a las limitaciones del proceso de producción o a las
inestabilidades de las partículas.
Se han descrito agentes de contraste acústicos no
gaseosos incluyendo emulsiones lipídicas (Fink et al.,
Ultrason. Imaging, 1985 7:191-197), liposomas
(Lanza et al., J. Am. Coll. Cardiol., 1992 (resumen); 19 (3
Supl. A) 114A), y emulsiones perfluorocarbononadas (Mattrey et
al., Radiology 1982; 145: 759-762 y Mattrey
et al., Ultrasound Med. 1983; 2:173-176).
Como con los agentes de contraste tratados anteriormente, no se ha
notificado ninguna demostración de emulsión o liposoma dirigida al
sitio. De nuevo, tal fracaso puede reflejar la inestabilidad de las
partículas, las incompatibilidades del proceso o la naturaleza
química del agente de contraste. Las emulsiones lipídicas se
evaluaron por Fink et al., citado anteriormente y no
mostraron ecogenicidad adecuada en estudios que examinaban la
obtención de imágenes hepáticas. Se sugirió que una única
formulación química de liposomas descrita por Lanza et al.,
citado anteriormente, tenía la posibilidad de ser un contraste
ultrasónico que se podía dirigir, pero esto no se ha demostrado
hasta la fecha. Las emulsiones perfluorocarbonadas, Perflubron
(bromuro de perfluorooctilo, P100) y Flusol (perfluorodecalina y
perfluorotripropilamina, F20) se han utilizado como agentes de
contraste ultrasónicos y se ha notificado que se acumulan en el
hígado, el bazo y tumores derivados de la captación fagocítica de
partículas de emulsión en estos sitios (Mattrey et al. 1983,
citado anteriormente). Estas emulsiones perfluorocarbononadas
también se ha observado que potencian las señales Doppler y que
vuelven opacas las luces. Los fluorocarbonos y las emulsiones
fluorocarbonadas para su uso como agentes de contraste se describen
en las patentes de los EE.UU. números 4.927.623, 5.077.036,
4.838.274, 5.068.098, 5.114.703, 5.362.477, 5.362.478, 5.171.755,
5.304.325, 5.350.571 y 5.403.575. Sin embargo, no se ha notificado
ninguna demostración de emulsiones perfluorocarbonadas como un
sistema de contraste acústico dirigido a un ligando.
Las descripciones anteriores de tejido u órgano
que se selecciona como objetivo en los equipos ultrasónicos
biomédicos se referían al conjunto de partículas acústicamente
reflectantes dentro de o alrededor de anomalías tisulares
estructurales. La mejora acústica localizada de las patologías
tisulares (por ejemplo, cánceres) no se ha dirigido al ligando,
sino que más bien ha dependido de las tasas dinámicas diferenciales
de la captación y/o el aclaramiento de las partículas entre los
tejidos normales y los cancerosos. Tales agentes de contraste han
incluido disoluciones acuosas (Ophir et al., Ultrason.
Imaging 1979, 1:265-279; Ophir et al.,
Ultrasound Med. Biol. 1989, 15:319-333; y Tyler
et al., Ultrason. Imaging, 3:323-329),
emulsiones (Fink et al. Ultrason. Imaging, 1985,
7:191-197), y suspensiones (Mattrey et al.
1982 citado anteriormente y Mattrey et al., Radiology, 1987,
163:339-343). Aunque se ha sugerido la posibilidad
de contraste ultrasónico dirigido al ligando que selecciona como
objetivo con liposomas acústicamente reflectantes, no se han
notificado aplicaciones satisfactorias de este concepto (Lanza
et al. 1992, citado anteriormente y Valentini et al.,
J. Am. Coll. Cardiol., 1995, 25:16A). Enfoques anteriores a la
selección como objetivo in vivo de partículas han incluido la
conjugación directa de un ligando (por ejemplo, anticuerpo
monoclonal) con una vesícula mediante una variedad de métodos
(véase, por ejemplo, Torchlin et al., Biochem. Biophys. Res.
Commun. 1978, 85:983-990; Endoh et al., J.
Immunol. Methods, 1981, 44:79-85; Hashimoto et
al., J. Immunol. Methods, 1983, 62:155-162 y
Martin et al., Biochemistry, 1981,
20:4229-4238).
Sigue habiendo una necesidad de metodologías
nuevas y mejoradas para sistemas de unión basados en ligandos que
pueden adaptarse como un sistema de contraste ultrasónico que
permita la detección de restos moleculares, tales como péptidos,
hidratos de carbono o ácidos nucleicos, y cuyos usos pueden oscilar
desde ensayos diagnósticos de laboratorio similares a ELISA basados
en utrasonidos en sistemas en fase líquida y sólida y en cultivos
celulares; sistemas de detección electroforéticos, cromatográficos y
de hibridación para la detección de trombos, infecciones, cánceres
e infartos en pacientes con la utilización de métodos de obtención
de imágenes de ultrasonido convencionales.
Entre los diversos objetos de la invención, puede
observarse la provisión de un método novedoso para la unión basada
en ligandos de partículas encapsuladas lipídicas a epítopos
moleculares en una superficie in vivo o in vitro, la
provisión de un método tal en el que el ligando se conjuga con las
partículas encapsuladas lipídicas mediante una interacción
avidina-biotina y el conjugado resultante se une a
epítopos moleculares sobre una superficie; la provisión de un
método tal que sea útil para mejorar la reflectividad acústica de
una superficie biológica para la obtención de imágenes de
ultrasonido; la provisión de un método de este tipo, en el que el
conjugado formado es efectivo para la obtención de imágenes por
rayos X, ultrasonidos, resonancia magnética o tomografía por
emisión de positrones; la provisión de composiciones para su uso en
la obtención de imágenes de ultrasonido de una superficie biológica
y para mejorar la reflectividad acústica de tal superficie; la
provisión de agentes de contraste ultrasónicos que llegan a ser
altamente reflectantes cuando se unen al sitio o a la superficie
biológica deseados mediante el sistema de unión basado en ligandos
de la invención; y la provisión de tales métodos y composiciones
que pueden seleccionar como objetivo y alterar las propiedades
ecogénicas de una superficie tisular para la identificación mejorada
y específica de procesos patológicos. Otros objetos formarán parte
evidente y en parte se indican más adelante en el presente
documento.
En resumen, en su realización más amplia, la
presente invención se refiere al uso de una composición que
comprende una emulsión de partículas encapsuladas lipídicas que
comprenden fluorocarbono líquido, estando dichas partículas
acopladas a un agente para la unión basada en ligandos de dichas
partículas a un receptor o epítopo molecular, para la preparación
de una formulación para un procedimiento diagnóstico dirigido in
vivo, en el que dicho procedimiento diagnóstico comprende la
obtención de imágenes de dicho objetivo en presencia de dicha
emulsión de partículas encapsuladas lipídicas que comprenden
fluorocarbono líquido, con la condición de que el fluorocarbono
gaseoso no esté presente como agente de contraste.
¿?agente de activación de biotina, por lo que el
ligando se conjuga con las partículas mediante una interacción
avidina-biotina y el conjugado resultante se une a
los epítopos moleculares sobre tal superficie. El conjugado es
efectivo para la obtención de imágenes mediante rayos X,
ultrasonidos, resonancia magnética o tomografía por emisión de
positrones. En una realización más específica, la invención se
refiere a un método para mejorar la reflectividad acústica de una
superficie biológica mediante la administración secuencial de los
componentes observados anteriormente, por lo que el conjugado
resultante se une a una superficie natural o sintética para mejorar
la reflectividad acústica de la misma para la obtención de imágenes
de ultrasonido. La invención también se refiere a composiciones
para su uso en la obtención de imágenes de ultrasonido de tales
superficies y para mejorar la reflectividad acústica de las
mismas.
La figura 1 es un gráfico que muestra los cambios
en el tamaño de partícula de los agregados de emulsiones
perfluorocarbonadas biotinilada y control con concentración
creciente de avidina;
la figura 2 muestra imágenes de ultrasonidos de
emulsiones perfluorocarbonadas control y biotinilada antes y
después de la adición de avidina;
la figura 3 es una ilustración gráfica de
imágenes de los tubos de diálisis y la región de colocación de
interés para análisis en escala de grises;
la figura 4 es un gráfico que muestra cambios en
la escala de grises de píxeles promedio asociados con la adición de
avidina a las emulsiones perfluorocarbonadas control o
biotinilada.
la figura 5 es un gráfico que muestra el efecto
de las emulsiones perfluorocarbonadas control y biotinilada sobre
la función de transferencia de retrodispersión aparente y la
retrodispersión integrada de membranas de nitrocelulosa tratadas
con avidina;
La figura 6 es un gráfico que muestra la función
de transferencia de retrodispersión aparente de emulsiones
perfluorocarbonadas biotinilada y control dirigidas al dímero D
conjugado covalentemente con membranas de nitrocelulosa;
la figura 7 es un gráfico que muestra la función
de transferencia de retrodispersión aparente (dB) de emulsiones
perfluorocarbonadas biotinilada y control a frecuencias ultrasónicas
bajas;
la figura 8 es un gráfico que muestra la función
de transferencia de retrodispersión aparente de emulsiones
perfluorocarbonadas biotinilada y control de tamaño de partícula
grande dirigidas a membranas de nitrocelulosa tratadas con
avidina;
la figura 9 muestra imágenes de ultrasonidos de
trombos plasmáticos antes y después de la exposición a emulsiones
control o biotinilada;
la figura 10 es un gráfico que muestra el nivel
de la escala de grises de píxeles promedio de trombos plasmáticos
preseleccionados como objetivo con un anticuerpo monoclonal
anti-fibrina y expuestos a emulsiones
perfluorocarbonadas control o biotinilada;
la figura 11 muestra imágenes ultrasónicas de
trombos en la arteria femoral mejoradas acústicamente con emulsión
perfluorocarbonada biotinilada in vivo;
la figura 12 es un gráfico que muestra el cambio
neto en la función de transferencia de retrodispersión aparente de
emulsiones perfluorocarbonadas biotinilada y control dirigidas a un
antígeno específico de la próstata en el carcinoma prostático con
relación a las regiones normales;
la figura 13 es un gráfico que muestra el cambio
neto en la retrodispersión integrada entre el estroma prostático
normal y regiones con cáncer para emulsiones perfluorocarbonadas
control frente a biotinilada;
la figura 14 es un gráfico que muestra el cambio
neto en la función de transferencia de retrodispersión aparente de
emulsiones perfluorocarbonadas biotinilada y control dirigidas al
antígeno OC-125 en el carcinoma ovárico con
relación a las regiones normales;
la figura 15 es un gráfico que muestra el cambio
neto en la retrodispersión integrada entre tejido ovárico normal y
regiones con carcinoma para emulsiones perfluorocarbonadas control
frente a biotinilada;
la figura 16 muestra imágenes ultrasónicas y
ópticas de amígdala utilizando contraste perfluorocarbonado y
peroxidasa de rábano dirigida al epitelio con anticuerpos
anti-citoqueratina;
la figura 17 muestra imágenes ultrasónicas con
detección de picos del epitelio de la amígdala mejoradas
acústicamente con emulsión perfluorocarbonada dirigida con el
anticuerpo anti-citoqueratina;
la figura 18 es un gráfico que muestra curvas de
titulación con avidina para tres emulsiones perfluorocarbonadas
biotiniladas que incorporan diversas concentraciones de gadolinio
-DTPA-BOA;
La figura 19 muestra la mejora de la
reflectividad acústica de coágulos plasmáticos tratados con
contraste de RMN y ultrasónico dual con perfluorocarbonos dirigido;
y
La figura 20 muestra un trombo de la arteria
femoral detectado mediante resonancia magnética y ultrasonidos.
Según la presente invención, se ha encontrado
ahora que puede lograrse un sistema de unión basado en ligandos que
tiene una aplicación amplia, mediante la unión basada en ligandos de
partículas encapsuladas lipídicas a epítopos moleculares sobre una
superficie in vivo o in vitro mediante la
administración secuencial de (a) un ligando específico de sitio
activado con un agente de activación de biotina; (b) un agente de
activación de avidina; y (c) partículas encapsuladas lipídicas
activadas con un agente de activación de biotina, por el que el
ligando se conjuga con las partículas encapsuladas lipídicas
mediante una interacción o complejación de
avidina-biotina y el conjugado resultante se une a
los epítopos moleculares sobre la superficie. El sistema de unión
basado en ligandos de la presente invención permite de esta manera
la detección de restos moleculares, tales como péptidos, hidratos
de carbono o ácidos nucleicos con una sonda de ligando específica
(por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo) complejado o
conjugado con avidina y biotina, portándose está última por las
partículas encapsuladas lipídicas (por ejemplo liposoma o emulsión
encapsulada lipídicas biotinilados). El sistema de unión basado en
ligandos de la invención puede emplearse en un sistema de agente de
contraste ultrasónico, sistema diagnóstico de laboratorio similar a
ELISA basado en ultrasonidos en sistemas en fase líquida y sólida y
en cultivos celulares, sistemas de detección electroforéticos,
cromatográficos y de hibridación, y para la detección de trombos,
infecciones, cánceres e infartos en pacientes, con el uso de métodos
de obtención de imágenes ultrasónicos convencionales. La invención
también puede aplicarse para fines terapéuticos mediante la
administración de agentes o fármacos quimioterápicos a los sitios
deseados debido a la especificidad del sistema de unión acoplado
con la capacidad para monitorizar el progreso del tratamiento
terapéutico mediante la obtención repetida de imágenes en tales
sitios. A este respecto, la conjugación anteriormente nombrada del
ligando con las partículas encapsuladas lipídicas mediante una
interacción o complejación de avidina-biotina es
efectiva para la obtención de imágenes por rayos X, ultrasonidos,
resonancia magnética o tomografía por emisión de positrones.
La invención puede ser útil en un método para
mejorar la reflectividad de una superficie biológica mediante la
administración secuencial a la superficie de (a) un ligando
específico de sitio activado con un agente de activación de
biotina; (b) un agente de activación de avidina; y (c) partículas
encapsuladas lipídicas activadas con un agente de activación de
biotina; por el que el ligando se conjuga con las partículas
encapsuladas lipídicas mediante una interacción de
avidina-biotina y el conjugado resultante se une a
la superficie biológica para mejorar la reflectividad acústica de
la misma para la obtención de imágenes ultrasónica. Este enfoque
trifásico novedoso utiliza una interacción
avidina-biotina para permitir la administración del
ligando que selecciona el objetivo separado de las partículas
encapsuladas lipídicas. En una aplicación específica del método se
va a administrar primero un ligando biotinilado a un paciente para
seleccionar previamente como objetivo la superficie tisular o
biológica de interés y para hacerlo circular durante un periodo de
tiempo necesario o suficiente para optimizar el porcentaje de
unión. En la segunda fase, se administra avidina, se hace circular
y se une al ligando biotinilado unido al tejido o superficie
objetivo y a cualquier ligando residual, libre, en circulación. La
reticulación de la avidina aumenta la avidez y la estabilidad del
ligando sobre el tejido o superficie objetivo, mientras que
potencia el rápido aclaramiento de los complejos de
avidina-ligando circulantes mediante el sistema
reticuloendotelial. En la tercera fase, se administran las
partículas encapsuladas lipídicas biotiniladas, se unen a la
avidina mediante sitios de unión a biotina no ocupados y se confiere
un aumento del contraste acústico a la superficie tisular
seleccionada como objetivo. Puede realizarse la administración
secuencial repetida de avidina y partículas encapsuladas lipídicas
biotiniladas para aumentar el efecto del contraste acústico de las
partículas encapsuladas lipídicas unidas a la superficie
seleccionada como objetivo.
En la práctica de la invención, el ligando
empleado puede estar constituido, por ejemplo, por anticuerpos
monoclonales o policlonales, virus, agentes quimioterápicos,
agonistas y antagonistas de receptores, fragmentos de anticuerpos,
lectina, albúmina, péptidos, hormonas, aminoazúcares, lípidos,
ácidos grasos, ácidos nucleicos y células, preparados o aislados a
partir de fuentes naturales o sintéticas. En resumen, puede
utilizarse cualquier ligando específico de sitio para cualquier
receptor o epítopo molecular para detectarse mediante la práctica
de la invención.
El ligando se activa con un agente de activación
de biotina. Tal como se emplea en el presente documento, el término
"agente de activación de biotina" o "biotinilado" engloba
biotina, biocitina u otros análogos de la biotina, tales como éster
de N-hidroxicuccinimida de amidocaproato de biotina,
ácido biotina-4-amidobenzoico,
hidrazida caproílica de biotinamida y otros derivados y conjugados
de la biotina. Otros derivados incluyen
biotina-dextrano, éster de
N-hidroxisuccinimida de disulfuro de biotina,
biotina-6 amidoquinolina, hidrazida de biotina,
éster de N-hidroxisuccinimida de
d-biotina, biotina-maleimida, éster
de p-nitrofenilo de d-biotina,
nucleótidos biotinilados y aminoácidos biotinilados tales como
Ne-biotinil-l-lisina.
En la segunda fase, tal como se mencionó
anteriormente, se administra un agente de activación de avidina.
Tal como se emplea en el presente documento, el término "agente de
activación de avidina" o "tratado con avidina", engloba
avidina, estreptavidina y otros análogos de avidina, tales como
conjugados de estreptavidina o avidina, especies fraccionadas y
altamente purificadas de avidina o estreptavidina, y variantes no o
parcialmente aminoacídicas, análogos de avidina recombinantes o
químicamente sintetizados con aminoácidos o sustituciones químicas
que todavía se ajustan a la unión biotina.
Las partículas encapsuladas lipídicas o el agente
de contraste empleado en la tercera fase pueden estar constituidos,
por ejemplo, por un liposoma o emulsión biotinilados que contengan
líquido. En un ejemplo específico, las partículas encapsuladas
lipídicas pueden estar constituidas por una emulsión
perfluorocarbonada, teniendo incorporadas las partículas de la
emulsión en su recubrimiento externo un resto compatible lipídico
biotinilado, tal como un fosfolípido, un ácido graso, colesterol,
lipolípido, esfingomielina, tocoferol, glucolípido, estearilamina,
cardiolipina un lípido con ácidos grasos con enlaces éter o éster, o
un lípido polimerizado. Por tanto, el agente de contraste
biotinilado que constituye las partículas encapsuladas lipídicas
puede producirse mediante la incorporación de fosfatidiletanolamina
biotinilada en la monocapa lipídica exterior de una emulsión
perfluorocarbonada.
Las emulsiones perfluorocarbonadas son
particularmente adecuadas para aplicaciones biomédicas y para su uso
en la práctica de la presente invención. Se sabe que son estables,
biológicamente inertes y fácilmente metabolizadas, principalmente
por la evaporación transpulmonar de los alvéolos. Además, su pequeño
tamaño de partícula se ajusta fácilmente al paso transpulmonar y su
semivida circulatoria (4 - 8 horas) supera ventajosamente a la de
otros agentes. Además, los perfluorocarbonos se han utilizado hasta
la fecha en una amplia variedad de aplicaciones biomédicas,
incluyendo el uso como sustitutos de sangre artificial. Para su uso
en la presente invención, pueden emplearse diversas emulsiones
fluorocarbonadas, incluyendo aquellas en las que el fluorocarbono
es un fluorocarbono hidrocarbonado, un éter, poliéter o éter corona
perfluoroalquilado. Emulsiones perfluorocarbonadas útiles se
describen en las patentes de los EE.UU. números 4.927.623,
5.077.036, 5.114.703, 5.171.755, 5.304.325, 5.350.571, 5.393.524 y
5.403.575 e incluyen aquellas en las que el compuesto
perfluorocarbonado es perfluorotributilamina, perfluorodecalina,
bromuro de perfluorooctilo, perfluorodiclorooctano, perfluorodecano,
perfluorotripropilamina, perfluorotrimetilciclohexano u otros
compuestos perfluorocarbonados. Además pueden incorporarse mezclas
de tales compuestos perfluorocarbonados en las emulsiones
utilizadas en la práctica de la invención. Como ejemplo específico
de una emulsión perfluorocarbonada útil en la invención puede
mencionarse una emulsión de perfluorodiclorooctanto, en la que el
recubrimiento lipídico de la misma contiene entre aproximadamente el
50 y el 99,5 por ciento molar de lecitina, preferiblemente
aproximadamente del 55 al 70 por ciento molar de lecitina, del 0 al
50 por ciento molar de colesterol, preferiblemente aproximadamente
del 25 al 45 por ciento molar de colesterol y aproximadamente del
0,5 al 10 por ciento molar de fosfatidiletanolamina biotinilada,
preferiblemente aproximadamente del 1 al 5 por ciento molar de
fosfatidiletanolamina biotinilada. Otros fosfolípidos tales como
fosfatidilserina, pueden biotinilarse, grupos acilo grasos tales
como estearilamina pueden conjugarse con biotina, o colesterol u
otros compuestos químicos solubles en grasas pueden biotinilarse e
incorporarse en el recubrimiento lipídico para las partículas
encapsuladas lipídicas. La preparación de un perfluorocarbono
biotinilado ejemplo para su uso en la práctica de la invención se
describe más adelante en el presente documento según procedimientos
conocidos.
Cuando las partículas encapsuladas lipídicas
están constituidas por un liposoma, en lugar de por una emulsión,
tal liposoma puede prepararse tal como se describe generalmente en
la bibliografía (véase, por ejemplo, Kimelberg et al., CRC
Crit. Rev. Toxicol. 6,25 (1978) y Yatvin et al., Medical
Physics, Vol. 9, No. 2, 149 (1982)). Los liposomas se conocen en la
técnica y generalmente comprenden materiales lipídicos incluyendo
lecitina y esteroles, fosfatidilcolina del huevo, ácido fosfatídico
del huevo, colesterol y alfa-tocoferol.
Con respecto al tamaño de partícula de las
partículas encapsuladas lipídicas constituidas por una emulsión
perfluorocarbonada o liposoma, el tamaño de partícula puede oscilar
entre aproximadamente 0,05 hasta 5 micras y preferiblemente entre
aproximadamente 0,05 y 0,5 micras. Por tanto, se prefieren las
partículas de pequeño tamaño porque circulan más y tienen a ser más
estables que las partículas más grandes.
Tal como se indica, el ligando se conjuga con las
partículas encapsuladas lipídicas o emulsión perfluorocarbonada
mediante una interacción avidina-biotina. El ligando
también puede conjugarse con la emulsión directa o indirectamente
mediante grupos químicos intermedios o conjugados directa o
indirectamente con biotina o un análogo de biotina mediante grupos
químicos intermedios, tales como una molécula espaciadora de alcano
u otro espaciador hidrocarbonado. El uso de moléculas espaciadoras
entre el ligando y la biotina o entre la biotina y la emulsión no es
necesario pero ayuda a hacer que la biotina esté más disponible
para unirse a la avidina.
Alternativamente, pero menos preferiblemente, el
uso basado en ligandos de la invención puede llevarse a cabo
mediante la administración secuencial de un ligando específico de
sitio activado con una biotina o agente de activación de avidina y
partículas encapsuladas lipídicas activadas con una biotina o agente
de activación de avidina, utilizándose un agente de activación de
biotina cuando se empleó un agente de activación de avidina en la
primera etapa y utilizándose un agente de activación de avidina
cuando se empleó un agente de activación de biotina en la primera
etapa. La conjugación directa del ligando con una emulsión
perfluorocarbonada, por ejemplo, es menos preferible, puesto que
puede acelerar el aclaramiento in vivo del agente de
contraste de emulsión.
En la práctica de la invención, se ha encontrado
inesperadamente que los componentes individuales de los agentes de
contraste ultrasónicos, tal como se describió anteriormente, son
escasamente reflectantes o tienen ecogenicidad baja en el torrente
circulatorio, pero llegan a ser altamente reflectantes cuando se
forma el complejo de
ligando-avidina-emulsión in
vivo en el sitio o superficie biológica deseados y mejora así
sustancialmente la reflectividad acústica de la misma para la
obtención de imágenes de ultrasonido. Esto está en marcado contraste
con los agentes de contraste sonográficos conocidos anteriormente
que son intrínsecamente brillantes o de alta reflectividad en el
torrente sanguíneo. La reflectividad acústica mejorada lograda
mediante la presente invención proporciona la ventaja de potenciar
la razón señal - ruido, porque el contraste de fondo de partículas
encapsuladas lipídicas en la sangre es mínima. Por tanto, la
presente invención ofrece un método no invasivo mejorado para
formar un agente de contraste acústico que puede seleccionarse como
objetivo in vitro o in vivo y que cuando se une a un
sitio deseado específico altera la reflectividad acústica de una
superficie tisular o medio de soporte de una manera detectable por
los transductores ultrasónicos adecuados para las aplicaciones
biomédicas y diagnósticas dentro de un intervalo de frecuencia de al
menos 5 a 50 MHz (las frecuencias nominales centrales pueden
oscilar más ampliamente basándose en el conocimiento de que son
transductores de banda ancha). El método de la invención
proporciona ventajosamente un medio práctico para detectar cualquier
epítopo o receptor molecular para el que está disponible un
anticuerpo monoclonal biotinilado u otro ligando sin necesidad de
utilizar radiación ionizante con o sin procedimientos invasivos
asociados en diversas aplicaciones clínicas y, mientras se emplea
tecnología ultrasónica habitual disponible comercialmente. La
presente invención no emplea agentes o sistemas de contraste
ultrasónicos para delinear el flujo sanguíneo como en la técnica
anterior, sino más bien para detectar acontecimientos fisiológicos y
patológicos mediante la detección de la acumulación del agente de
contraste en sitios de unión específicos.
En la aplicación de la invención a ensayos
diagnósticos, tales como ensayos diagnósticos de laboratorio tipo
ELISA basados en ultrasonidos en sistemas en fase líquida y sólida,
la superficie sobre la que se produce la unión basada en ligandos
de las partículas encapsuladas lipídicas a los epítopos moleculares
puede ser, por ejemplo, nylon, membranas de nitrocelulosa o un gel,
así como una superficie biológica.
El sistema de unión basado en ligandos de la
invención también puede aplicarse para proporcionar sistema de
administración de terapia génica o agente quimioterápico combinado
con obtención de imágenes de ultrasonido. Por ejemplo, agentes
quimioterápicos o fármacos de activación inmunitaria, tales como el
activador del plasminógeno tisular, adriamicina, vincristina,
urocinasa, estreptocinasa, metotrexato, citarabina, tioguanina,
doxorrubicina, 5-fluorouracilo, cisplatino,
etopósido, ifosfamida, asparginasa, desoxicoformicina,
hexametilmelamina e incluyendo agentes radiactivos, pueden
incorporarse en las partículas encapsuladas lipídicas y llegar a
formar parte del conjugado unido a un sitio de superficie biológica
específico para la acción terapéutica. La presente invención
también permitiría ventajosamente que se obtuvieran imágenes
ultrasónicas del sitio con el fin de monitorizar el progreso del
tratamiento en el sitio y de realizar ajustes deseados en la dosis
del agente terapéutico dirigido al sitio. La invención proporciona
por tanto, medios no invasivos para la detección y el tratamiento
terapéutico de trombos, infecciones, cánceres e infartos en
pacientes, mientras se emplean sistemas de obtención de imágenes de
ultrasonido convencionales.
Los ejemplos siguientes ilustran la práctica de
la invención.
El procedimiento para preparar una emulsión de
perfluorodiclorooctano encapsulada lipídica biotinilada para su uso
en la obtención de imágenes de ultrasonido es tal como sigue.
La emulsión de perflurodiclorooctano (PFDCO)
lipídica biotinilada está comprendida de los siguientes componentes:
PFDCO (40% v/v), aceite de cártamo (2,0% p/v), una
co-mezcla de tensioactivo (2,0% p/v) y glicerina
(1,7% p/v). La co-mezcla de tensioactivo está
compuesta de aproximadamente el 64% molar de lecitina, el 35% molar
de colesterol y el 1% molar de
N-(6-biotinoil)amino)hexanoil)dipalmitoil-L-alfa-fosfatidiletanolamina.
Estos componentes se pesan juntos en un tubo de ensayo y se
disuelven en cloroformo. El cloroformo se extrae del material y la
mezcla de tensioactivo resultante se seca a 50ºC en una estufa a
vacío durante la noche. La comezcla se dispersa en agua mediante
sonicación, dando como resultado una suspensión de liposomas. La
suspensión se transfiere a un recipiente de mezclado de 30 mL de
capacidad (Dynamics Corporation of America, New Hartford, CT) junto
con el PFDCO y el aceite. La mezcla se combina durante 30 - 60
segundos hasta obtener una preemulsión. La muestra preemulsionada
se transfiere al depósito de un microfluidizador, modelo S110
(Microfluidics, Newton, MA), y se emulsiona durante tres minutos a
69,95 MPa. Para evitar que la emulsión se caliente excesivamente
durante la homogeneización, la válvula de corte y el serpentín de
mezclado del microfluidizador están sumergidos en un baño de agua a
temperatura ambiente durante el procesamiento. La temperatura final
de la emulsión es de aproximadamente 35ºC. La emulsión terminada se
envasa en viales con 10 mL de suero, se cubre con gas nitrógeno y
se sellan con tapón/cierre de engarce. El tamaño promedio de
partícula del producto terminado, medida mediante un dispositivo
para la determinación del tamaño de partícula por difusión de láser
luminoso (Brookhaven Instruments Corporation, Holtsville, NY), es
de 250 nm.
La incorporación de fosfatidiletanolamina
biotinilada en la monocapa lipídica de encapsulación de la emulsión
perfluorocarbonada se lleva a cabo tal como se describe en el
ejemplo 1 y se demuestra que el tamaño de partícula del agregado
aumenta en presencia de concentraciones valoradas de avidina
(Pierce, Rockford, IL 61105). Se prepara una emulsión control
preparada idénticamente que incorpora fosfatidiletanolamina no
biotinilada en la monocapa lipídica externa de la emulsión
perfluorocarbonada. La avidina se resuspende en solución salina
tamponada con fosfato isotónica (PBS, Fisher Inc., Fair Lawn, NJ).
Dentro de una cubeta de poliestireno, se prepara una mezcla de
reacción de 3,0 ml que contiene PBS, emulsión perfluorocarbonada
control o biotinilada (20 \mul) y avidina, a 0,0, 0,5, 1,0, 1,5 ó
2,0 \mug/ml. Los contenidos se mezclaron mediante inversión suave
y se hicieron reaccionar durante treinta minutos a temperatura
ambiente. Los tamaños de partícula de la emulsión se determinan por
triplicado con un analizador del tamaño de partícula Brookhaven
BI-90 (Holtsville, NY) a 37ºC. El tamaño de
partícula del agregado de la emulsión biotinilada aumentó
progresivamente desde un nivel inicial de 263 \pm 2,54 nm hasta
más de 2000 nm con el aumento de concentración de avidina (figura
1). Se observó floculación y sedimentación marcadas cuando las
concentraciones de avidina sobrepasaban 2,0 \mug/ml. El tamaño de
partícula de la emulsión control es de 234 \pm 3,81 nm de diámetro
y la adición de 2,0 \mug de avidina a la mezcla de reacción no
afecta al tamaño de partícula. Estos resultados demuestran
claramente que la fosfatidiletanolamina biotinilada se incorpora y
se orienta apropiadamente en la monocapa lipídica externa de la
emulsión perfluorocarbonada y que las biotinas de la superficie
están adecuadamente disponibles para la avidina en el medio.
Múltiples sitios de unión a biotina en la molécula de avidina, así
como múltiples residuos de biotina sobre la superficie de la
emulsión progresan hacia una rápida complejación de las partículas
in vitro.
Partículas de emulsión perfluorocarbonada
biotinilada, de aproximadamente 250 nm de diámetro, con baja
reflectividad acústica independiente, se complejan con avidina en
disolución, lo que produce la agregación y mejora la ecogenicidad.
Se preparan las emulsiones perfluorocarbonadas biotinilada y control
(200 \mul) tal como se describió anteriormente y se diluyen en
PBS (15 ml) y se colocan dentro de tubos de diálisis (Spectra/Por 4,
25 mm, MWCO 12,000-14,000, Spectrum Medical
Industries, Inc., Los Angeles, CA), se obtienen imágenes
ultrasónicamente dentro de un baño de agua y PBS a temperatura
ambiente utilizando un transductor focalizado de 7,5 MHz y un
sistema de obtención de imágenes con alineamiento en fase (Phased
Array Imaging System) de Hewlett Packard (HP) Sonos 2500 (Andover,
MA). Las imágenes en tiempo real se registran en una cinta de vídeo
SVHS para el análisis posterior de la imagen. Se evalúa la escala
de grises de píxeles y la homogeneidad en las imágenes congeladas
seleccionadas utilizando NIH Image 1.47 (Institutos Nacionales de
Salud). Se añade avidina (30 \mug/ml) a cada suspensión de
emulsión, se mezcla mediante inversión suave y se deja que se
compleje durante 30 minutos. Las suspensiones de emulsión son
ópticamente opacas, pero no se detectan ultrasónicamente antes de la
adición de avidina. La complejación de la emulsión
perfluorocarbonada biotinilada se garantiza rápidamente con la
adición de avidina y pronto aparece un precipitado floculante
blanco. La avidina no induce cambios en la suspensión de la emulsión
control. La insonación de las suspensiones revela que las
partículas de la emulsión perfluorocarbonada biotinilada opacifican
los tubos de diálisis; mientras, las partículas control no se
aprecian acústicamente (figura 2). El análisis de la intensidad del
eco de la de escala de grises en las imágenes congeladas de las
suspensiones de las emulsiones control y biotinilada antes y
después de la avidina se resume en las figuras 3 y 4. El aumento
del nivel de la escala de grises promedio de la suspensión de
emulsión biotinilada (71,3 \pm 22,1) con relación a su nivel de
escala de grises de píxeles antes de la avidina (2,2 \pm 4,4)
demuestra que se logra la mejora acústica. Los niveles promedio de
la escala de grises de píxeles de la emulsión control antes (3 \pm
7,33) y después (1,0 \pm 1,3) de la adición de avidina son
similares. Estos resultados demuestran la baja reflectividad
acústica de la emulsión perfluorocarbonada cuando se obtienen
imágenes como partículas independientes, en comparación con la
mejora de la naturaleza ecogénica de las partículas biotiniladas
agregadas. La falta de cambio acústico en la suspensión de emulsión
control en presencia de avidina confirma la especificidad del
ligando de la emulsión biotinilada.
La emulsión perfluorocarbonada biotinilada, de
aproximadamente 250 nm de diámetro, se dirige específicamente a
avidina, se une covalentemente a una membrana de nitrocelulosa
modificada y aumenta la reflectividad acústica de la superficie de
membrana a altas frecuencias ultrasónicas (de 30 a 60 MHz). En
resumen, se conjugaron membranas de nitrocelulosa (S+S NC^{MR},
Schleicher & Schuell, Keane, NH) con avidina utilizando una
molécula espaciadora de diaminohexano (Sigma Chemical Co., St.
Louis, MO) y activación con glutaraldehído (Sigma Chemical Co., St.
Louis, MO), tal como se describe por Másson et al.
(Electrophoresis 1993, 14, 860-865). Discos de
nitrocelulosa (2 cm de diámetro) se sumergen en diaminohexano al
2,5% disuelto en agua desionizada durante 60 minutos con agitación
rotatoria lenta constante. Las membranas se lavan con ácido acético
1 M durante 6 - 7 horas, seguido por un lavado de 18+ horas con
agua desionizada con agitación constante. Las membranas se colocan
en glutaraldehído al 1% en tampón bicarbonato de sodio 0,1 M, pH
10,0 durante 15 minutos, después se lavan durante tres horas con
agua desionizada. Las membranas de nitrocelulosa se almacenan y se
secan a 4ºC hasta su utilización; el almacenamiento no sobrepasa
los tres días.
Se añaden gota a gota cincuenta (50) \mul de
avidina (250 \mug) en el centro de seis membranas con una
microjeringa y se deja que se sequen. Cada membrana se lava
exhaustivamente con Tween-20 al 0,1% (Sigma Chemical
Co., St. Louis, MO) en PBS, luego se coloca en albúmina sérica
bovina al 3% (BSA, cristalizada, Sigma Chemical Company, St. Louis,
MO), se disuelve en PBS - Tween-20 al 0,1% durante
20 minutos para bloquear los sitios de unión a proteínas no
específicos alrededor de la periferia del disco. Tras el bloqueo por
BSA, cada disco se lava exhaustivamente con PBS y se coloca en 300
\mul de emulsión perfluorocarbonada biotinilada o control
suspendida en 4 ml de PBS durante 20 minutos. La emulsión no unida
se elimina con lavados de PBS consecutivos. Cada disco se vuelve a
exponer a avidina y a la emulsión control o biotinilada para
garantizar la cobertura saturada de la superficie de nitrocelulosa.
Los discos de nitrocelulosa se lavan y se almacenan en PBS a 4ºC
hasta la obtención de imágenes con microscopía acústica.
Para la obtención de imágenes microscópicas
acústicas, cada disco de nitrocelulosa se coloca plano encima de
una placa de acero inoxidable pulida en un soporte de poliestireno
con una ventana central de 2 X 2 cm eliminada. La muestra preparada
se sumerge en PBS a temperatura ambiente para la insonación
ultrasónica. Para la insonación se utiliza un microscopio acústico
de diseño a la medida, utilizando un transductor piezoeléctrico de
línea retardadora, focalizado, con ancho de banda de 50 MHz
(frecuencia nominal), (6,35 mm de diámetro, 12,70 mm de longitud
focal, Modelo V390, Panametrics Co., Waltham, MA) que se hace
funcionar en el modo de eco por impulsos. Se recogen los datos de
radiofrecuencia (RF) retrodispersada y se digitalizan a 500
megamuestras por segundo utilizando un osciloscopio de
digitalización Tektronix DSA 601 (Beaverton, OR) con resolución de
8 bits. Se utiliza un sistema de ganancia variable para aumentar el
intervalo dinámico efectivo de este digitalizador. Se obtienen los
datos de radiofrecuencia de aproximadamente 100 sitios
independientes de cada región de interés con resolución de
incremento lateral de 100 micras.
Un barrido con detección de picos en
radiofrecuencia de los datos se convierte en un mapa de escala de
grises (0 = dispersión inferior, 255 = dispersión superior) para
permitir la selección de las regiones de interés para el análisis
de retrodispersión integrada. Los datos ultrasónicos de
radiofrecuencia (RF) se almacenan en un formato de exploración por
trama y se analizan con un software diseñado a la medida. Se
controla el paso de los segmentos de las líneas de RF para el
análisis de retrodispersión integrada para englobar las superficies
delantera y posterior del disco de nitrocelulosa. Los datos se
multiplican mediante una ventana rectangular y sus espectros de
potencia se determinan mediante transformación de Fourier rápida. Se
calculan los espectros de potencia para las muestras relacionadas
con el espectro de potencia devuelto desde un reflector plano de
acero inoxidable casi perfecto y la función de transferencia de
retrodispersión dependiente de la frecuencia a través del ancho de
banda útil del transductor (de 30 a 60 MHz) y se expresan en
decibelios con relación a la dispersión acústica desde el reflector
de placa de acero inoxidable casi perfecto (Wong et al.,
Ultrasound in Med & Biol. 1993; 19: 365-374). La
retrodispersión integrada (IB) se calcula como el promedio de la
función de la transferencia de retrodispersión dependiente de la
frecuencia a través del ancho de banda útil del transductor.
Los discos incubados con emulsión
perfluorocarbonada biotinilada tienen regiones centrales con alta
dispersión acústica, en relación con las regiones periféricas (es
decir, de fondo) del mismo disco. Los discos de nitrocelulosa
incubados con la emulsión control no tienen regiones centrales de
alta dispersión y no se detectan diferencias en el carácter
acústico mediante cambios en la firma RF entre las regiones central
y periférica del disco. La IB de la región de emulsión biotinilada,
localizada centralmente (17,8 \pm 0,2 dB) es 6,3 \pm 0,1 dB (4
veces) mayor (p < 0,05) que la IB de la región análoga en el
disco control (-24,1 \pm 0,2 dB). La variación dependiente de la
frecuencia en la función de la transferencia de retrodispersión
aparente (media \pm EEM) de las regiones con gotas de avidina de
los discos con emulsión biotinilada y control se presentan en la
figura 5. Se observa una respuesta acústica homogénea y
consistentente mayor a través del espectro de frecuencia, debido a
la emulsión biotinilada unida. Estos resultados demuestran la
efectividad de la emulsión perfluorocarbonada biotinilada para
seleccionar como objetivo específicamente un antígeno unido a una
superficie y modificar radicalmente la reflectividad acústica de la
superficie con el medio de baño, aumentando la potencia
retrodispersada ultrasónica a frecuencias altas.
La emulsión perfluorocarbonada biotinilada (250
nm de diámetro) dirige específicamente al dímero D unido
covalentemente a una membrana de nitrocelulosa modificada
utilizando un complejo de fragmento F(_{ab})
anti-dímero D biotinilado - avidina y da como
resultado un marcado aumento en la potencia acústica reflejada desde
la superficie. El dímero D se une covalentemente a los discos de
nitrocelulosa modificados con una molécula espaciadora de
diaminohexano y activados con glutaraldeído, tal como se describió
anteriormente en el ejemplo 4. Se añaden gota a gota cincuenta (50)
\mug del dímero D con una microjeringa en el centro de tres de
seis membranas y se deja que se sequen al aire. El dímero D no
unido se lava exhaustivamente de las membranas con solución salina
tamponada con fosfato (PBS) - Tween-20 al 0,1%. Los
sitios de unión a proteínas no específicos de todas las membranas
se bloquean con albúmina sérica bovina (BSA) al 3% en PBS -
Tween-20 al 0,1% durante 20 minutos, seguido por
lavados consecutivos con PBS. Las membranas con gotas de dímero D se
incuban con 12,5 \mug de anticuerpo F(ab)
anti-dímero B biotinilado en 4,0 ml de BSA al 3%
durante 2 horas, se lavan con tampón PBS y después se incuban con
250 \mug de avidina en 4 ml de PBS durante 30 minutos. Tras
eliminar la avidina no unida con lavados de PBS, los discos se
exponen a emulsión perfluorocarbonada biotinilada o control (300
\mul) en 4,0 ml de PBS durante 20 minutos. El exceso de emulsión
se elimina con lavados con tampón PBS. Los discos se vuelven a
exponer a avidina y emulsión perfluorocarbonada, tal como se
describió anteriormente y las membranas se almacenan en PBS a 4ºC
hasta la obtención de imágenes.
Para la obtención de imágenes microscópicas
acústicas, cada disco de nitrocelulosa se coloca plano encima de
una placa de acero inoxidable pulida en un soporte de poliestireno,
se sumerge en PBS a temperatura ambiente y se realiza la insolación
con un microscopio acústico de diseño a la medida, utilizando un
transductor piezoeléctrico de línea retardadora, focalizado, con
ancho de banda de 50 MHz (frecuencia nominal), (6,35 mm de diámetro,
12,70 mm de longitud focal, Modelo V390, Panametrics Co., Waltham,
MA) que se hace funcionar en el modo de eco por impulsos. Se
recogen los datos de radiofrecuencia (RF) retrodispersada y se
digitalizan a 500 megamuestras por segundo utilizando un
osciloscopio de digitalización Tektronix DSA 601 (Beaverton, OR) con
resolución de 8 bits. Se utiliza un sistema de ganancia variable
para aumentar el intervalo dinámico efectivo de este digitalizador.
Se obtienen los datos de radiofrecuencia de aproximadamente 100
sitios independientes de cada región de interés con resolución de
incremento lateral de 100 micras.
Un barrido con detección de picos en
radiofrecuencia de los datos se convierte en un mapa de escala de
grises (0 = dispersión inferior, 255 = dispersión superior) para
permitir la inspección visual y la selección de las regiones de
interés para el análisis de retrodispersión integrada (IB). Los
datos ultrasónicos de radiofrecuencia (RF) se almacenan en un
formato de exploración por trama y se analizan con un software
diseñado a la medida. Se controla el paso de los segmentos de las
líneas de RF para el análisis de retrodispersión integrada para
englobar las superficies delantera y posterior del disco de
nitrocelulosa. Los datos se multiplican mediante una ventana
rectangular y sus espectros de potencia se determinan mediante
transformación de Fourier rápida. Se calculan los espectros de
potencia para las muestras relacionadas con el espectro de potencia
devuelto desde un reflector plano de acero inoxidable casi perfecto
y la función de transferencia de retrodispersión dependiente de la
frecuencia a través del ancho de banda útil del transductor (de 30 a
60 MHz) y se expresan en decibelios con relación a la dispersión
acústica desde el reflector de placa de acero inoxidable casi
perfecto (Wong et al., Ultrasound in Med & Biol. 1993;
19: 365-374). La retrodispersión integrada se
calcula como el promedio de la función de la transferencia de
retrodispersión dependiente de la frecuencia a través del ancho de
banda útil del transductor.
El fragmento F(_{ab})
anti-dímero D biotinilado se une específicamente a
la región central de los discos con gotas de dímero D y se retícula
con la avidina mediante su resto de biotina. Al igual que en los
ejemplos anteriores, la emulsión perfluorocarbonada biotinilada se
une específicamente a la avidina unida al anticuerpo; mientras, la
unión no específica de la emulsión control no tiene unión y no se
detecta acústicamente. La IB de la nitrocelulosa recubierta con la
región de emulsión biotinilada (-18,0 \pm 0,2 dB) fue mayor en 4,6
\pm 0,1 dB (p < 0,05) que la del disco control (-22,6 \pm
0,1 dB) en el intervalo de frecuencia de 30 a 60 mHz. La variación
dependiente de la frecuencia en la función de la transferencia de
retrodispersión aparente (media \pm EEM) de los discos con
emulsión biotinilada y control se presentan en la figura 6. Se
observa una respuesta acústica homogénea y consistentemente mayor a
través del espectro de frecuencia, debido a la emulsión biotinilada
unida. Estos datos confirman y amplían los hallazgos del ejemplo 4
con la avidina sola, demostrando que la emulsión perfluorocarbonada
biotinilada unida mediante un sistema de ligando como selección de
objetivo específico puede aumentar significativamente la
retrodispersión acústica de una superficie de soporte sólida.
La emulsión perfluorocarbonada biotinilada (250
nm de diámetro), se dirige específicamente a avidina conjugada con
discos de nitrocelulosa y se somete a insonación a frecuencias
clínicamente relevantes (de 5 a 15 MHz) y aumenta
significativamente la retrodispersión acústica de la membrana. En
resumen, se conjugaron membranas de nitrocelulosa (S+S NC^{MR},
Schleicher & Schuell, Keane, NH) con avidina utilizando una
molécula espaciadora de diaminohexano (Sigma Chemical Co., St.
Louis, MO) y activación con glutaraldehído (Sigma Chemical Co., St.
Louis, MO), tal como se describe por Másson et al.
(Electrophoresis 1993, 14, 860-865). Discos de
nitrocelulosa (2 cm de diámetro) se sumergen en diaminohexano al
2,5% disuelto en agua desionizada durante 60 minutos con agitación
rotatoria lenta constante. Las membranas se transfieren y se lavan
con ácido acético 1 M durante 6 - 7 horas, seguido por un lavado
continuado en agua desionizada durante al menos de 18 horas
adicionales con agitación constante. Las membranas se colocan en
glutaraldehído al 1% en tampón bicarbonato de sodio 0,1 M, pH 10,0
durante 15 minutos. Una vez completa la activación con
glutaraldehído, las membranas se lavan con agitación continua
durante tres horas. Las membranas de nitrocelulosa se almacenan y se
secan a 4ºC hasta su utilización; el almacenamiento no sobrepasa
los tres días.
Se añaden gota a gota cincuenta (50) \mul de
avidina (250 \mug) en el centro de una membrana de nitrocelulosa
con una microjeringa y se deja que se seque. Cada membrana se lava
con Tween-20 al 0,1% (Sigma Chemical Co., St.
Louis, MO) en solución salina tamponada con fosfato (PBS), luego se
coloca en albúmina sérica bovina al 3% (BSA, cristalizada, Sigma
Chemical Company, St. Louis, MO), se disuelve en PBS -
Tween-20 al 0,1% durante 20 minutos para bloquear
los sitios de unión a proteínas no específicos alrededor de la
periferia del disco. Tras el bloqueo por BSA, cada disco se lava
con PBS y se coloca en 300 \mul de emulsiones perfluorocarbonadas
biotinilada o control suspendidas en 4 ml de PBS durante 20 minutos
con agitación suave y rotatoria. La emulsión no unida se elimina
con lavados de PBS. Cada disco se vuelve a exponer a avidina, se
lava con PBS, se vuelve a exponer a la emulsión control o
biotinilada y se vuelve a lavar con PBS, tal como se describió
anteriormente. Los discos de nitrocelulosa se almacenan en PBS a
4ºC hasta la obtención de imágenes con el microscopio acústico.
Para la obtención de imágenes microscópicas
acústicas, cada disco de nitrocelulosa se coloca plano encima de
una placa de acero inoxidable pulida en un soporte de poliestireno
con una ventana central de 2 X 2 cm eliminada. La muestra preparada
se sumerge en PBS a temperatura ambiente para la insonación
ultrasónica. Para la insonación se utiliza un microscopio acústico
de diseño a la medida, utilizando un transductor piezoeléctrico de
línea retardadora, focalizado, con ancho de banda de 50 MHz
(frecuencia nominal), (12,70 mm de diámetro, 50,80 mm de longitud
focal, Modelo V311, Panametrics Co., Waltham, MA) que se hace
funcionar en el modo de eco por impulsos. Se recogen los datos de
radiofrecuencia (RF) retrodispersada y se digitalizan a 500
megamuestras por segundo utilizando un osciloscopio de
digitalización Tektronix DSA 601 (Beaverton, OR) con resolución de
8 bits. Se utiliza un sistema de ganancia variable para aumentar el
intervalo dinámico efectivo de este digitalizador. Se obtienen los
datos de radiofrecuencia de aproximadamente 100 sitios
independientes de cada región de interés con resolución de
incremento lateral de 250 micras.
Un barrido con detección de picos en
radiofrecuencia de los datos se convierte en un mapa de escala de
grises (0 = dispersión inferior, 255 = dispersión superior) para
permitir la inspección visual y la selección de las regiones de
interés para el análisis de retrodispersión integrada. Los datos
ultrasónicos de radiofrecuencia se almacenan en un formato de
exploración por trama y se analizan con un software diseñado a la
medida. Se controla el paso de los segmentos de las líneas de RF
para el análisis de retrodispersión integrada para englobar las
superficies delantera y posterior del disco de nitrocelulosa. Los
datos se multiplican mediante una ventana rectangular y sus
espectros de potencia se determinan mediante transformación de
Fourier rápida. Se calculan los espectros de potencia para las
muestras relacionadas con el espectro de potencia devuelto desde un
reflector plano de acero inoxidable casi perfecto y la función de
transferencia de retrodispersión dependiente de la frecuencia a
través del ancho de banda útil del transductor (de 5 a 15 MHz) y se
expresan en decibelios con relación a la dispersión acústica desde
el reflector de placa de acero inoxidable casi perfecto (Wong et
al., Ultrasound in Med & Biol. 1993; 19:
365-374). La retrodispersión integrada (IB) se
calcula como el promedio de la función de la transferencia de
retrodispersión dependiente de la frecuencia a través del ancho de
banda útil del transductor.
Los discos incubados con emulsión
perfluorocarbonada biotinilada tienen regiones centrales con alta
dispersión acústica, en relación con las regiones periféricas del
mismo disco o las regiones centrales del disco con la emulsión
control. Los discos de nitrocelulosa incubados con la emulsión
control no tienen regiones de alta dispersión. La IB de la
nitrocelulosa recubierta con la emulsión biotinilada (0,5 \pm 0,5
dB) fue mayor en 9,6 \pm 0,1 dB (8 veces) (p < 0,05) que la
del disco control (-9,2 \pm 0,5 dB) en el intervalo de frecuencia
de 5 a 10 MHz. La variación dependiente de la frecuencia en la
función de la transferencia de retrodispersión aparente (media
\pm EEM) de los discos con emulsión biotinilada y control se
presentan en la figura 7. Se observa una respuesta acústica
homogénea y consistentemente mayor a través del espectro de
frecuencia, debido a la emulsión biotinilada unida. Estos datos
confirman y amplían los hallazgos de los ejemplos 4 y 5 con la
avidina y el dímero D, demostrando que la emulsión
perfluorocarbonada biotinilada unida mediante un sistema de ligando
como selección de objetivo específico puede aumentar
significativamente la retrodispersión acústica de una superficie de
soporte sólida y que esta retrodispersión acústica mejorada se
detecta a frecuencias ultrasónicas bajas, clínicamente útiles (de 5
a 15 MHz), así como a frecuencias altas (de 30 a 60 MHz).
El contraste perfluorocarbonado biotinilado, de
aproximadamente 300 nm de diámetro, se dirige específicamente a
avidina conjugada con discos de nitrocelulosa y se somete a
insonación a frecuencias clínicamente relevantes (al menos de 5 a
15 MHz de ancho de banda). En resumen, se conjugaron membranas de
nitrocelulosa (S+S NC^{MR}, Schleicher & Schuell, Keane, NH)
con avidina utilizando una molécula espaciadora de diaminohexano
(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) y activación con glutaraldehído
(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), tal como se describe por
Másson et al. (Electrophoresis 1993, 14,
860-865). Discos de nitrocelulosa (2 cm de diámetro)
se sumergen en diaminohexano al 2,5% disuelto en agua desionizada
durante 60 minutos con agitación rotatoria lenta constante. Las
membranas se transfieren y se lavan con ácido acético 1 M durante 6
- 7 horas, después se transfieren para un lavado continuado en agua
desionizada durante al menos 18 adicionales con agitación constante.
Las membranas se colocan en glutaraldehído al 1% en tampón
bicarbonato de sodio 0,1 M, pH 10,0 durante 15 minutos. Una vez
completa la activación con glutaraldehído, las membranas se lavan
con agitación continua durante tres horas. Las membranas de
nitrocelulosa se almacenan y se secan a 4ºC hasta su utilización; el
almacenamiento no sobrepasa los tres
días.
días.
Se añaden gota a gota cincuenta (50) \mul de
avidina (250 \mug) en el centro de dos de cuatro membranas con una
microjeringa y se deja que se sequen. Cada membrana se lava con
Tween-20 al 0,1% (Sigma Chemical Co., St. Louis,
MO) en solución salina tamponada con fosfato (PBS), luego se coloca
en albúmina sérica bovina al 3% (BSA, cristalizada, Sigma Chemical
Company, St. Louis, MO), se disuelve en PBS -
Tween-20 al 0,1% durante 20 minutos para bloquear
los sitios de unión a proteínas no específicos alrededor de la
periferia del disco. Tras el bloqueo por BSA, cada disco se lava
con PBS y se coloca en 300 \mul de las emulsiones
perfluorocarbonadas biotinilada o control, de aproximadamente 3000
nm de tamaño de partícula, suspendidas en 4 ml de PBS durante 20
minutos con agitación suave y rotatoria. La emulsión no unida se
elimina con lavados de PBS consecutivos. Cada disco se vuelve a
exponer a avidina, se lava con PBS, se expone a la emulsión
perfluorocarbonada y se vuelve a lavar con PBS, tal como se
describió anteriormente. Los discos de nitrocelulosa se almacenan en
PBS a 4ºC hasta la obtención de imágenes con el microscopio
acústico.
Para la obtención de imágenes con el microscopio
acústico, cada disco de nitrocelulosa se coloca plano encima de una
placa de acero inoxidable pulida en un soporte de poliestireno con
una ventana central de 2 X 2 cm eliminada. La muestra preparada se
sumerge en PBS a temperatura ambiente para la insonación
ultrasónica. Para la insonación se utiliza un microscopio acústico
de diseño a la medida, utilizando un transductor piezoeléctrico de
línea retardadora, focalizado, con ancho de banda de 10 MHz
(frecuencia nominal), (12,70 mm de diámetro, 50,80 mm de longitud
focal, Modelo V311, Panametrics Co., Waltham, MA) que se hace
funcionar en el modo de eco por impulsos. Se recogen los datos de
radiofrecuencia (RF) retrodispersada y se digitalizan a 500
megamuestras por segundo utilizando un osciloscopio de
digitalización Tektronix DSA 601 (Beaverton, OR) con resolución de
8 bits. Se utiliza un sistema de ganancia variable para aumentar el
intervalo dinámico efectivo de este digitalizador. Se obtienen los
datos de radiofrecuencia de aproximadamente 100 sitios
independientes de cada región de interés con resolución de
incremento lateral de 250 micras.
Un barrido con detección de picos en
radiofrecuencia de los datos se convierte en un mapa de escala de
grises (0 = dispersión inferior, 255 = dispersión superior) del
disco para permitir la inspección visual y la selección de las
regiones de interés para el análisis de retrodispersión integrada.
Los datos ultrasónicos de radiofrecuencia se almacenan en un
formato de exploración por trama y se analizan con un software
diseñado a la medida. Se controla el paso de los segmentos de las
líneas de RF para el análisis de retrodispersión integrada (IB) para
englobar las superficies delantera y posterior del disco de
nitrocelulosa. Los datos se multiplican mediante una ventana
rectangular y sus espectros de potencia se determinan mediante
transformación de Fourier rápida. Se calculan los espectros de
potencia para las muestras relacionadas con el espectro de potencia
devuelto desde un reflector plano de acero inoxidable casi perfecto
y la función de transferencia de retrodispersión dependiente de la
frecuencia a través del ancho de banda útil del transductor (de 5 a
15 MHz) y se expresan en decibelios con relación a la dispersión
acústica desde el reflector de placa de acero inoxidable casi
perfecto (Wong et al., Ultrasound in Med & Biol. 1993;
19: 365-374). La retrodispersión integrada se
calcula como el promedio de la función de la transferencia de
retrodispersión dependiente de la frecuencia a través del ancho de
banda útil del transductor.
Los discos incubados con emulsión
perfluorocarbonada biotinilada tienen regiones centrales con alta
dispersión acústica, en relación con las regiones periféricas del
mismo disco. Los discos de nitrocelulosa incubados con la emulsión
control no tienen regiones centrales de alta dispersión y no se
detectan diferencias en el carácter acústico entre las regiones
central y periférica del disco. La IB de la nitrocelulosa recubierta
con la emulsión biotinilada (-2,4 \pm 0,7 dB) fue mayor en 8,8
\pm 0,3 dB (aproximadamente 8 veces) mayor (p < 0,05) que la
del disco control (-11,2 \pm 0,4 dB) en el intervalo de frecuencia
de 5 a 15 MHz. La variación dependiente de la frecuencia en la
función de la transferencia de retrodispersión aparente (media \pm
EEM) de los discos con emulsión biotinilada y control se presentan
en la figura 8. Se observa una respuesta acústica homogénea y
consistentemente mayor a través del espectro de frecuencia, debido a
la emulsión biotinilada unida. Estos datos confirman y amplían los
hallazgos de los ejemplos 4, 5 y 6 con la avidina y el dímero D,
demostrando que las emulsiones perfluorocarbonadas biotiniladas con
tamaño de partícula grande pueden unirse mediante un sistema de
ligando como selección de objetivo específico y aumentar
significativamente la retrodispersión acústica de una superficie de
soporte sólida. Esta retrodispersión acústica mejorada se detecta a
frecuencias ultrasónicas clínicamente relevantes, de 5 a 15
MHz.
La emulsión perfluorocarbonada biotinilada se
dirige a trombos plasmáticos utilizando anticuerpos monoclonales
anti-fibrina biotinilados (NIB1H10; Tymkewycz et
al. 1993. Blood Coagulation and Fibrinolysis
4:211-221) y avidina. En un estudio representativo
(1 de 5), se obtiene sangre completa porcina y se añade un
anticoagulante (9:1, v/v) con citrato sódico estéril. La sangre se
centrifuga a 1500 RPM a temperatura ambiente y la fracción
plasmática se obtiene y se almacena a 4ºC. Se producen dos trombos
plasmáticos porcinos mediante combinación de plasma, cloruro
cálcico 100 mM (3:1 v/v) y 2 - 5 U de trombina en un tubo de
plástico a través del cual se hace pasar hilo de sutura Vicryl
5-0. Se deja que los trombos coagulen a temperatura
ambiente.
Un trombo se incuba con 150 \mug de anticuerpo
monoclonal anti-fibrina y 10 ml de PBS con albúmina
sérica bovina (BSA) al 1% (BSA) durante dos horas y se incuba un
segundo trombo control en PBS con BSA al 1%. El trombo tratado con
anticuerpo se incuba entonces con 0,5 mg de avidina en 10 ml de PBS
con BSA al 1% durante 30 minutos. El trombo control se deja en PBS
con BSA al 1%. Ambos trombos se lavan exhaustivamente con PBS. Cada
trombo se incuba con 300 \mul/10 ml de PBS de emulsión
biotinilada o control durante 30 minutos. Todos los trombos se
vuelven a exponer a la emulsión dos veces para garantizar la
cobertura uniforme y la insonación ultrasónica (figura 9). La
obtención de imagen ultrasónica se lleva a cabo utilizando un
transductor con alineamiento en fase lineal de 7,5 MHz y un sistema
de obtención de imágenes de Hewlett Packard Sonos 2500 (Hewlett
Packard, Inc., Andover, MA). Todos los registros ultrasónicos se
producen con niveles de compensación de ganancia de tiempo y
compensación de ganancia fija y se registran en una cinta de vídeo
SVHS para el análisis posterior de la imagen. Se tomó como muestra
la escala de grises de píxeles promedio en una región amplia de
interés para 21 imágenes congeladas independientes para cada trombo
utilizando NIH Image 1.47 (Institutos Nacionales de Salud; figura
10). Se encuentra que la emulsión perfluorocarbonada biotinilada
proporciona una mejora acústica marcada de la superficie. Los
niveles de la escala de grises de píxeles promedio del trombo con
emulsión biotinilada son de 79,5 \pm 2,5, mientras que el brillo
del control fue marcadamente inferior (34,8 \pm 2,2, p < 0,05).
Estos resultados demuestran la capacidad de la emulsión
perfluorocarbonada biotinilada para seleccionar como objetivo y
mejorar la capacidad acústica de un tejido biológico (es decir, el
trombo) in vitro.
La emulsión perfluorocarbonada biotinilada
dirige, mediante anticuerpos anti-fibrina
biotinilados (NIB5F3 y
NIB1H10, Tymkewycz et al. 1993. Blood Coagulation and Fibrinolysis 4:211-221), a un trombo aislado de la arteria femoral en seis perros sin raza conocida. El perro sin raza conocida se anestesia con inducción de pentobarbital sódico y anestesia de halotano. Se aísla la arteria femoral derecha y todas las ramificaciones al nivel de la rama safena. Se inserta un cable de cobre plateado unido a la punta de una aguja en ángulo recto de calibre 22, aislado tubos de plástico (polietileno P-240), en la arteria femoral y se asegura con hilo de sutura Plene 4-0. Se aplica una corriente de 200 - 400 \muA durante hasta dos horas. La formación del trombo se monitoriza con sistema Doppler a ondas continuas y se interrumpe tras observar un aumento de aproximadamente el 50% en la velocidad de circulación en relación distal a la lesión eléctrica. Se aprecia decoloración accidental derivada de la corriente en relación proximal con el punto de entrada del cable. Se inserta un catéter de calibre 20 en una rama proximal de la arteria femoral y se asegura con hilo de sutura de seda 4-0. Se une un goteo presurizado de NaCl al 0,9% mediante una llave de paso de tres vías al catéter. El flujo de sangre en el segmento aislado se interrumpo mediante una ligadura de lazo proximal. El exceso de sangre se elimina por lavado del segmento arterial para inhibir la formación adicional de trombos mediante la infusión de solución salina durante 15 minutos. Las ramificaciones con drenaje distal de la arteria femoral se ligan o se atrapan con hilo de sutura. Se inyecta anticuerpo monoclonal anti-fibrina biotinilado (50 \mug/1,0 ml de PBS) mediante el catéter y se elimina por lavado con algunas gotas de solución salina. Se permite que el anticuerpo se incube durante una hora, después se libera la ligadura de lazo en relación distal con la inserción del cable y el exceso de anticuerpo se elimina por lavado con solución salina durante cinco minutos. La arteria femoral distal se vuelve a ocluir y se infunde avidina (250 \mug/1,0 ml de PBS) y se incuba durante 30 minutos. La ligadura distal se libera de nuevo y el exceso de avidina se elimina por lavado con solución salina durante cinco minutos. Se restablece la ligadura distal y la emulsión perfluorocarbonada biotinilada se infunde y se incuba durante 30 minutos. Tras la exposición inicial del trombo a la emulsión, la emulsión no unida se elimina por lavado con disolución salina. Los trombos se exponen a avidina y la emulsión perfluorocarbonada biotinilada, tal como se describió anteriormente. En tres animales, también se aísla la arteria contralateral, se ocluye parcialmente con trombos inducidos eléctricamente y se expone a una emulsión perfluorocarbonada control análoga a la administración de emulsión biotinilada descrita anteriormente. Se obtienen imágenes ultrasónicas de las arterias femorales expuestas a la emulsión perfluorocarbonada control o biotinilada a 7,5 MHz con un transductor centralizado, con alineamiento en fase lineal y un sistema de obtención de imágenes ultrasónico de Hewlett-Packard Sonos 2500, antes y después de la administración de contraste. Los trombos plenamente formados, seleccionados como objetivo para el contraste y el control, no se aprecian ultrasónicamente. Para 6 de las 6 arterias femorales, los trombos parcialmente oclusivos están marcadamente potenciados utilizando el contraste perfluorocarbonado bitotinilado seleccionado como objetivo por anti-fibrina. En 3 de los 3 trombos de arterias femorales, la exposición a la emulsión control perfluorocarbonada no acentúa su reflectividad acústica y estos trombos siguen siendo ultrasónicamente indetectables. La figura 11 revela un ejemplo representativo de un sitio de formación de trombo en la arteria femoral tras la inducción eléctrica antes y después de la exposición al anticuerpo anti-fibrina y al contraste biotinilado. En la imagen antes del contraste, se observa la arteria femoral con un ánodo en la punta del cable ecogénico brillante que sobresale hacia la luz, pero no se aprecia trombo. Tras el tratamiento con la emulsión de contraste biotinilada, se observa claramente un gran trombo parcialmente ocluido mediante el aumento de la reflectividad acústica (figura 11). De nuevo, no se observa la formación de trombos en la arteria control antes o después de la exposición a la emulsión control. Estos resultados demuestran el concepto de utilizar la emulsión perfluorocarbonada unida para mejorar acústicamente las superficies biológicas, tales como tejido trombótico, in vivo para permitir la detección con un sistema de obtención de imágenes por ultrasonidos comercialmente disponible.
NIB1H10, Tymkewycz et al. 1993. Blood Coagulation and Fibrinolysis 4:211-221), a un trombo aislado de la arteria femoral en seis perros sin raza conocida. El perro sin raza conocida se anestesia con inducción de pentobarbital sódico y anestesia de halotano. Se aísla la arteria femoral derecha y todas las ramificaciones al nivel de la rama safena. Se inserta un cable de cobre plateado unido a la punta de una aguja en ángulo recto de calibre 22, aislado tubos de plástico (polietileno P-240), en la arteria femoral y se asegura con hilo de sutura Plene 4-0. Se aplica una corriente de 200 - 400 \muA durante hasta dos horas. La formación del trombo se monitoriza con sistema Doppler a ondas continuas y se interrumpe tras observar un aumento de aproximadamente el 50% en la velocidad de circulación en relación distal a la lesión eléctrica. Se aprecia decoloración accidental derivada de la corriente en relación proximal con el punto de entrada del cable. Se inserta un catéter de calibre 20 en una rama proximal de la arteria femoral y se asegura con hilo de sutura de seda 4-0. Se une un goteo presurizado de NaCl al 0,9% mediante una llave de paso de tres vías al catéter. El flujo de sangre en el segmento aislado se interrumpo mediante una ligadura de lazo proximal. El exceso de sangre se elimina por lavado del segmento arterial para inhibir la formación adicional de trombos mediante la infusión de solución salina durante 15 minutos. Las ramificaciones con drenaje distal de la arteria femoral se ligan o se atrapan con hilo de sutura. Se inyecta anticuerpo monoclonal anti-fibrina biotinilado (50 \mug/1,0 ml de PBS) mediante el catéter y se elimina por lavado con algunas gotas de solución salina. Se permite que el anticuerpo se incube durante una hora, después se libera la ligadura de lazo en relación distal con la inserción del cable y el exceso de anticuerpo se elimina por lavado con solución salina durante cinco minutos. La arteria femoral distal se vuelve a ocluir y se infunde avidina (250 \mug/1,0 ml de PBS) y se incuba durante 30 minutos. La ligadura distal se libera de nuevo y el exceso de avidina se elimina por lavado con solución salina durante cinco minutos. Se restablece la ligadura distal y la emulsión perfluorocarbonada biotinilada se infunde y se incuba durante 30 minutos. Tras la exposición inicial del trombo a la emulsión, la emulsión no unida se elimina por lavado con disolución salina. Los trombos se exponen a avidina y la emulsión perfluorocarbonada biotinilada, tal como se describió anteriormente. En tres animales, también se aísla la arteria contralateral, se ocluye parcialmente con trombos inducidos eléctricamente y se expone a una emulsión perfluorocarbonada control análoga a la administración de emulsión biotinilada descrita anteriormente. Se obtienen imágenes ultrasónicas de las arterias femorales expuestas a la emulsión perfluorocarbonada control o biotinilada a 7,5 MHz con un transductor centralizado, con alineamiento en fase lineal y un sistema de obtención de imágenes ultrasónico de Hewlett-Packard Sonos 2500, antes y después de la administración de contraste. Los trombos plenamente formados, seleccionados como objetivo para el contraste y el control, no se aprecian ultrasónicamente. Para 6 de las 6 arterias femorales, los trombos parcialmente oclusivos están marcadamente potenciados utilizando el contraste perfluorocarbonado bitotinilado seleccionado como objetivo por anti-fibrina. En 3 de los 3 trombos de arterias femorales, la exposición a la emulsión control perfluorocarbonada no acentúa su reflectividad acústica y estos trombos siguen siendo ultrasónicamente indetectables. La figura 11 revela un ejemplo representativo de un sitio de formación de trombo en la arteria femoral tras la inducción eléctrica antes y después de la exposición al anticuerpo anti-fibrina y al contraste biotinilado. En la imagen antes del contraste, se observa la arteria femoral con un ánodo en la punta del cable ecogénico brillante que sobresale hacia la luz, pero no se aprecia trombo. Tras el tratamiento con la emulsión de contraste biotinilada, se observa claramente un gran trombo parcialmente ocluido mediante el aumento de la reflectividad acústica (figura 11). De nuevo, no se observa la formación de trombos en la arteria control antes o después de la exposición a la emulsión control. Estos resultados demuestran el concepto de utilizar la emulsión perfluorocarbonada unida para mejorar acústicamente las superficies biológicas, tales como tejido trombótico, in vivo para permitir la detección con un sistema de obtención de imágenes por ultrasonidos comercialmente disponible.
La emulsión perfluorocarbonada biotinilada, de
aproximadamente 250 nm de diámetro, se dirige a un carcinoma
prostático utilizando anticuerpos monoclonales específicos para la
próstata (PSA) y se detecta acústicamente utilizando microscopía
acústica polar, de alta frecuencia y alta resolución. Ejemplos
representativos de tejidos humanos con carcinoma prostático se
tratan de manera habitual mediante la fijación por inmersión en
formalina tamponada neutra al 10% y se embeben en parafina. Se
preparan cortes de veinte micras para la microscopía acústica; se
utilizan cortes de 5 micras para los estudios ópticos. Todos los
cortes histológicos se preparan en portaobjetos de vidrio limpiados
con ácido que se han recubierto con
poli-L-lisina. Todos los cortes
preparados se calientan a 55ºC durante 1 hora en una estufa.
Antes de la inmunotinción, se elimina la cera de
todos los cortes en tres cambios de Americlear, y se deshidratan en
cambios sucesivos de etanol al 95% y al 100%. La actividad de la
peroxidasa endógena se bloquea sólo en los cortes preparados para
los estudios ópticos mediante la inmersión en metanol absoluto que
contiene peróxido de hidrógeno al 0,6% (v/v) durante 30 minutos.
Estos y todos los cortes para la microscopía acústica se rehidratan
entonces mediante etanoles graduales y agua destilada y se colocan
en PBS isotónico (pH 7,4). Todos los cortes se incuban con
anticuerpos monoclonales específicos dirigidos.
Los cortes de próstata se incuban con anticuerpos
monoclonales primarios anti-PSA, siguiendo las
recomendaciones del vendedor, durante 18 horas a 4ºC en cámaras de
atmósfera húmeda. Tras la incubación primaria, los cortes se
enjuagan con PBS isotónica, después se recubren con una
inmunoglobulina policlonal de caballo biotinilada
anti-ratón (VectaStain Elite Kits, Vector
Laboratories, Burlingame, CA) durante 1 hora a temperatura ambiente.
Tras enjuagar en PBS, se prepara un corte de 30 micras para la
microscopía acústica. Un corte para microscopía óptica (5 micras)
se incuba con complejo de
avidina-biotina-peroxidasa
(VectaStain Elite Kit, Vector Lab) durante 1 hora a temperatura
ambiente. Este corte se enjuaga en tampón fosfato (pH 7,6) y se
sumerge en una disolución de tetracloruro de
3,3'-diaminobencidina (Sigma Chemicals, St. Louis,
MO; 0,5 mg/ml en tampón fosfato, pH 7,6, que contiene el 0,003%
[v/v] de peróxido de hidrógeno) durante aproximadamente diez
minutos. El precipitado cromogénico se mejora ópticamente mediante
una breve inmersión de los cortes teñidos en tetróxido de osmio al
0,125% (p/v). El corte se enjuaga entonces en agua del grifo, se
somete a tinción de contraste en hematoxilina de Harris, se
deshidrata en etanoles graduales y Americlear, y se prepara en un
medio de preparación sintético.
Una vez que se ha incubado y lavado el segundo
anticuerpo, se incuban los portaobjetos para microscopía acústica
en avidina (1,0 mg/-20 cc de PBS) utilizando un baño sobre una mesa
giratoria durante 30 minutos. El exceso de avidina se lava con
tampón de PBS isotónica, pH 7,4-7,5 en lavados de
tres minutos. Los portaobjetos se incuban con emulsión
perfluorocarbonada biotinilada o control durante veinte minutos (0,5
cc/-20,0 ml de PBS), se lavan brevemente con PBS isotónica 3X
durante 5 minutos cada una y se vuelven a incubar con avidina (1,0
mg/\sim20 cc) durante 15 minutos. El exceso de avidina se elimina
mediante enjuagado con tres lavados de 5 minutos en PBS. El
portaobjetos se vuelve a incubar entonces a las concentraciones
anteriores con emulsión perfluorocarbonada biotinilada o control
durante 20 minutos. La emulsión no unida se elimina mediante lavado
en tres cambios de PBS (5 minutos cada uno) y los portaobjetos se
transfieren al microscopio acústico para su análisis.
Las muestras preparadas se sumergen cada una en
solución salina tamponada con fosfato isotónica a temperatura
ambiente para la insonación ultrasónica. Se utiliza un microscopio
acústico diseñado a la medida para recoger los datos ultrasónicos.
El microscopio consiste en un transductor piezoeléctrico de línea
retardadora, focalizado, con ancho de banda de 50 MHz (6,35 mm de
diámetro, 12,70 mm de longitud focal, 62 micras de diámetro del haz,
Modelo V390, Panametrics Co., Waltham, MA) que se hace funcionar en
el modo de eco por impulsos. Se utiliza un osciloscopio de
digitalización Tektronix DSA 601 (Beaverton, OR) para digitalizar
los datos de radiofrecuencia (rf) retrodispersada polar de 35
grados a 500 megamuestras por segundo con resolución de 8 bits. Se
utiliza un sistema de ganancia variable para aumentar el intervalo
dinámico efectivo de este digitalizador. Se obtienen los datos de
radiofrecuencia de aproximadamente 100 sitios independientes de cada
muestra con resolución de incremento lateral de 50 micras.
Los datos de rf se almacenan en un formato de
exploración por trama de baja resolución y se analizan con un
software diseñado a la medida. Se controla el paso de los segmentos
de las líneas de rf para el análisis de retrodispersión integrada
para englobar a la superficie delantera (es decir, excluyendo la
pared posterior). Los datos cuyo paso se ha controlado se
multiplican mediante una ventana Hamming y sus espectros de potencia
se determinan mediante transformación de Fourier rápida. Los
espectros de potencia dentro de un corte de tejido se comparan
directamente sin hacer referencia a la placa de acero. La
retrodispersión integrada (IB) se calcula como el promedio de la
función de la transferencia de retrodispersión dependiente de la
frecuencia a través del ancho de banda útil del transductor (de 30
a 55 MHz). Los tejidos inmunoteñidos se revisan utilizando un
microscopio Nikon Optiphot-2 para las regiones de
tinción positiva de PSA y se comparan las características
acústicas.
El cambio neto en la función de transferencia de
retrodispersión aparente entre el estroma prostático normal y las
regiones con carcinoma está claramente aumentado en las secciones
tratadas con emulsión perfluorocarbonada biotinilada dirigida a
PSA, frente a la control a través del espectro de frecuencia (de 30
a 55 MHz; figura 12). La emulsión perfluorocarbonada biotinilada
aumenta (p < 0,05) la retrodispersión integrada de las regiones
de cáncer prostático (47,17 \pm dB) frente a las del estroma
normal (40,79 \pm 1,18 dB) en 6,38 dB (aproximadamente 4 veces).
En los cortes de tejido control, la retrodispersión integrada de la
región de carcinoma prostático (39,63 \pm 1,63 dB) fue mayor (p
< 0,05) que la de las zonas de estroma normal (36,13 \pm 2,17
dB) en aproximadamente 3,5 dB (2 veces), lo que refleja las
diferencias inherentes en el carácter acústico entre el tejido
prostático normal y el canceroso. Sin embargo, la emulsión
perfluorocarbonada biotinilada dirigida amplificó (p < 0,05)
estas diferencias inherentes en aproximadamente 2 veces (2,87 dB;
figura 13). Estos resultados demuestran claramente la capacidad de
la emulsión perfluorocarbonada biotinilada dirigida al sitio para
mejorar específicamente la detección acústica del cáncer de
próstata
in vitro.
in vitro.
La emulsión perfluorocarbonada biotinilada, de
aproximadamente 250 nm de diámetro, se dirige a carcinoma ovárico
utilizando anticuerpos monoclonales específicos para el antígeno
OC-125 y se detectó acústicamente utilizando
microscopía acústica polar, de alta frecuencia y alta resolución.
Ejemplos representativos de tejidos humanos con carcinoma ovárico
se tratan de manera habitual mediante la fijación por inmersión en
formalina tamponada neutra al 10% y se embeben en parafina. Se
preparan cortes de veinte micras para la microscopía acústica; se
utilizan cortes de 5 micras para los estudios ópticos. Todos los
cortes histológicos se preparan en portaobjetos de vidrio limpiados
con ácido que se han recubierto con
poli-L-lisina. Todos los cortes
preparados se calientan a 55ºC durante 1 hora en una estufa.
Antes de la inmunotinción, se elimina la cera de
todos los cortes en tres cambios de Americlear, y se deshidratan en
cambios sucesivos de etanol al 95% y al 100%. La actividad de la
peroxidasa endógena se bloquea sólo en los cortes preparados para
los estudios ópticos mediante la inmersión en metanol absoluto que
contiene peróxido de hidrógeno al 0,6% (v/v) durante 30 minutos.
Estos y todos los cortes para la microscopía acústica se rehidratan
entonces mediante etanoles graduales y agua destilada y se colocan
en PBS isotónico (pH 7,4). Todos los cortes se incuban con
anticuerpos monoclonales específicos dirigidos.
Los cortes de ovario se incuban con anticuerpos
monoclonales primarios anti-OC-125,
siguiendo las recomendaciones del vendedor, durante 18 horas a 4ºC
en cámaras de atmósfera húmeda. Tras la incubación primaria, los
cortes se enjuagan con PBS isotónica, después se recubren con una
inmunoglobulina policlonal de caballo biotinilada
anti-ratón (VectaStain Elite Kits, Vector
Laboratories, Burlingame, CA) durante 1 hora a temperatura ambiente.
Tras enjuagar en PBS, se prepara cortes de 30 micras por duplicado
para la microscopía acústica. Los cortes para microscopía óptica (5
micras) se incuban con complejo de
avidina-biotina-peroxidasa
(VectaStain Elite Kit, Vector Lab) durante 1 hora a temperatura
ambiente. Estos cortes se enjuagan en tampón fosfato (pH 7,6) y se
sumergen en una disolución de tetracloruro de
3,3'-diaminobencidina (Sigma Chemicals, St. Louis,
MO; 0,5 mug/ml en tampón fosfato, pH 7,6, que contiene el 0,0003%
[v/v] de peróxido de hidrógeno) durante aproximadamente diez
minutos. El precipitado cromogénico se mejora ópticamente mediante
una breve inmersión de los cortes teñidos en tetróxido de osmio al
0,125% (p/v). Los cortes se enjuagan entonces en agua del grifo, se
somete a tinción de contraste en hematoxilina de Harris, se
deshidratan en etanoles graduales y Americlear, y se preparan en un
medio de preparación sintético.
Una vez que se ha incubado y lavado el segundo
anticuerpo biotinilado, se incuban los portaobjetos en avidina (1,0
mg/\sim20 cc de PBS) utilizando un baño sobre una mesa giratoria
durante 30 minutos. El exceso de avidina se lava con tampón de PBS
isotónica, pH 7,4-7,5 en tres lavados de 5 minutos.
Los portaobjetos preparados se incuban con emulsión
perfluorocarbonada biotinilada o control durante veinte minutos (0,5
cc/\sim20,0 ml de PBS), se lavan brevemente con PBS isotónica 3X
durante 5 minutos cada una y se vuelven a lavar con avidina (1,0
mg/\sim20 cc) durante 15 minutos. El exceso de avidina se elimina
mediante enjuagado con tres lavados de 5 minutos en PBS. Los
portaobjetos se vuelven a incubar entonces a las concentraciones
anteriores con emulsión perfluorocarbonada biotinilada o control
durante 20 minutos. La emulsión no unida se elimina mediante lavado
en tres cambios de PBS (5 minutos cada uno) y los portaobjetos se
transfieren al microscopio acústico para su análisis.
Las muestras preparadas se sumergen cada una en
solución salina tamponada con fosfato isotónica a temperatura
ambiente para la insonación ultrasónica. Se utiliza un microscopio
acústico diseñado a la medida para recoger los datos ultrasónicos.
El microscopio consiste en un transductor piezoeléctrico de línea
retardadora, focalizado, con ancho de banda de 50 MHz (6,35 mm de
diámetro, 12,70 mm de longitud focal, 62 micras de diámetro del haz,
Modelo V390, Panametrics Co., Waltham, MA) que se hace funcionar en
el modo de eco por impulsos. Se utiliza un osciloscopio de
digitalización Tektronix DSA 601 (Beaverton, OR) para digitalizar
los datos de radiofrecuencia (rf) retrodispersada polar de 35
grados a 500 megamuestras por segundo con resolución de 8 bits. Se
utiliza un sistema de ganancia variable para aumentar el intervalo
dinámico efectivo de este digitalizador. Se obtienen los datos de
radiofrecuencia de aproximadamente 100 sitios independientes de cada
muestra con resolución de incremento lateral de 50 micras.
Los datos de rf se almacenan en un formato de
exploración por trama de baja resolución y se analizan con un
software diseñado a la medida. Se controla el paso de los segmentos
de las líneas de rf para el análisis de retrodispersión integrada
para englobar a la superficie delantera (es decir, excluyendo la
pared posterior). Los datos cuyo paso se ha controlado se
multiplican mediante una ventana Hamming y sus espectros de potencia
se determinan mediante transformación de Fourier rápida. La
retrodispersión integrada se calcula a partir del promedio de la
función de la transferencia de retrodispersión dependiente de la
frecuencia a través del ancho de banda útil del transductor (de 30
a 55 MHz). Los espectros de potencia de las muestras se refieren al
espectro de potencia devuelto desde un portaobjetos de vidrio para
microscopio. La IB se expresa en decibelios con relación a la
dispersión acústica desde el portaobjetos de vidrio. Los tejidos
inmunoteñidos se revisan utilizando un microscopio Nikon
Optiphot-2 para las regiones de tinción positiva
para PSA y se comparan las características acústicas.
El cambio neto en la función de transferencia de
retrodispersión aparente entre el estroma ovárico normal y las
regiones con carcinoma está claramente aumentado en las secciones
tratadas con emulsión perfluorocarbonada biotinilada dirigida a
OC-125, frente a la control a través del espectro de
frecuencia (de 30 a 55 MHz; figura 14). La emulsión
perfluorocarbonada biotinilada aumenta (p < 0,05) la
retrodispersión integrada de las regiones de cáncer ovárico (-28,19
\pm 1,39 dB) frente a las del estroma normal (-38,75 \pm 0,84
dB) en 10,57 dB (mayor de 8 veces). En los cortes de tejido
control, la retrodispersión integrada de la región de carcinoma
ovárico (-33,49 \pm 0,86 dB) fue mayor (p < 0,05) que la de las
zonas de estroma normal (-40,21 \pm 0,61 dB) en aproximadamente
6,72 dB (4 veces), lo que refleja las diferencias inherentes en el
carácter acústico entre el tejido ovárico normal y el canceroso.
Sin embargo, la emulsión perfluorocarbonada biotinilada dirigida
amplificó (p < 0,05) estas diferencias inherentes en
aproximadamente 2 veces (3,84 dB; figura 15). Estos resultados
demuestran claramente la capacidad de la emulsión perfluorocarbonada
biotinilada dirigida al sitio para mejorar específicamente la
detección acústica del cáncer de ovario
in vitro.
in vitro.
La emulsión perfluorocarbonada biotinilada, de
aproximadamente 250 nm de diámetro, se dirige a la cápsula
epitelial de la amígdala utilizando anticuerpos monoclonales
específicos para citoqueratina y los antígenos
CD-20 y BCL-2 y se detectan
acústicamente utilizando microscopía acústica polar, de alta
frecuencia y alta resolución. Ejemplos representativos de amígdala
humana se tratan de manera habitual mediante la fijación por
inmersión en formalina tamponada neutra al 10% y se embeben en
parafina. Se preparan cortes de veinte micras para la microscopía
acústica; se utilizan cortes de 5 micras para los estudios ópticos.
Todos los cortes histológicos se preparan en portaobjetos de vidrio
limpiados con ácido que se han recubierto con
poli-L-lisina. Todos los cortes
preparados se calientan a 55ºC durante 1 hora en una estufa.
Antes de la inmunotinción, se elimina la cera de
todos los cortes en tres cambios de Americlear, y se deshidratan en
cambios sucesivos de etanol al 95% y al 100%. La actividad de la
peroxidasa endógena se bloquea sólo en los cortes preparados para
los estudios ópticos mediante la inmersión en metanol absoluto que
contiene peróxido de hidrógeno al 0,6% (v/v) durante 30 minutos.
Estos y todos los cortes para la microscopía acústica se rehidratan
entonces mediante etanoles graduales y agua destilada y se colocan
en PBS isotónico (pH 7,4). Todos los cortes se incuban con
anticuerpos monoclonales específicos dirigidos.
Los cortes de amígdala se incuban con una mezcla
de anticuerpos monoclonales primarios
anti-CD-20, BCL-2 y
citoqueratina siguiendo las recomendaciones del vendedor, durante 18
horas a 4ºC en cámaras de atmósfera húmeda. Tras la incubación
primaria, los cortes se enjuagan con PBS isotónica, después se
recubren con una inmunoglobulina policlonal de caballo biotinilada
anti-ratón (VectaStain Elite Kits, Vector
Laboratories, Burlingame, CA) durante 1 hora a temperatura
ambiente. Tras enjuagar en PBS, se prepara cortes de 30 micras por
duplicado para la microscopía acústica. Los cortes para microscopía
óptica (5 micras) se incuban con complejo de
avidina-biotina-peroxidasa
(VectaStain Elite Kit, Vector Lab) durante 1 hora a temperatura
ambiente. Los cortes se enjuagan en tampón fosfato (pH 7,6) y se
sumergen en una disolución de tetracloruro de 3,3'diaminobencidina
(Sigma Chemicals, St. Louis, MO; 0,5 mg/ml en tampón fosfato, pH
7,6, que contiene el 0,003% [v/v] de peróxido de hidrógeno) durante
aproximadamente diez minutos. El precipitado cromogénico se mejora
ópticamente mediante una breve inmersión de los cortes teñidos en
tetróxido de osmio al 0,125% (p/v). Los cortes se enjuagan entonces
en agua del grifo, se someten a tinción de contraste en
hematoxilina de Harris, se deshidratan en etanoles graduales y
Americlear, y se preparan en un medio de preparación sintético.
Una vez que se ha incubado y lavado el segundo
anticuerpo biotinilado, se incuba un portaobjetos en avidina (1,0
mg/-20 cc de PBS) utilizando un baño sobre una mesa giratoria
durante 30 minutos. El exceso de avidina se lava con tampón de PBS
isotónica, pH 7,4-7,5 en tres lavados de 5 minutos.
El portaobjetos preparado se incuba con emulsión perfluorocarbonada
biotinilada durante veinte minutos (0,5 cc/\sim20,0 ml de PBS), se
lava brevemente con PBS isotónica 3X durante 5 minutos cada una y
se vuelve a lavar con avidina (1,0 mg/\sim20 cc) durante 15
minutos. El exceso de avidina se elimina mediante enjuagado con tres
lavados de 5 minutos en PBS. Los portaobjetos se vuelven a incubar
entonces a las concentraciones anteriores con emulsión
perfluorocarbonada biotinilada durante 20 minutos. La emulsión no
unida se elimina mediante lavado en tres cambios de PBS (5 minutos
cada uno) y el portaobjetos se transfiere al microscopio acústico
para su análisis.
La muestra preparada se sumerge en solución
salina tamponada con fosfato isotónica a temperatura ambiente para
la insonación ultrasónica. Se utiliza un microscopio acústico
diseñado a la medida para recoger los datos ultrasónicos. El
microscopio consiste en un transductor piezoeléctrico de línea
retardadora, focalizado, con ancho de banda de 50 MHz (6,35 mm de
diámetro, 12,70 mm de longitud focal, 62 micras de diámetro del haz,
Modelo V390, Panametrics Co., Waltham, MA) que se hace funcionar en
el modo de eco por impulsos. Se utiliza un osciloscopio de
digitalización Tektronix DSA 601 (Beaverton, OR) para digitalizar
los datos de radiofrecuencia (rf) retrodispersada polar de 35
grados a 500 megamuestras por segundo con resolución de 8 bits. Se
utiliza un sistema de ganancia variable para aumentar el intervalo
dinámico efectivo de este digitalizador. Se obtienen los datos de
radiofrecuencia de la totalidad de la muestra y se crea una imagen
detectada del pico del corte y se compara con la imagen de tejido
inmunoteñido.
El tejido inmunoteñido se examina y se obtiene
una imagen utilizando un microscopio Nikon
Optiphot-2 con un acoplamiento de cámara Javlin
Chromachip II. Las imágenes se encaminan a través de un mezclador
digital de Panasonic modelo WJ-AVE5 para grabadores
de vídeo SVHS de Panasonic, modelos AG-1960 o
AG-1970 y se visualiza en un monitor Sony
Trinitron. Las imágenes se capturan utilizando software NuVista
(Truevision, Inc., Indianapolis, IN 46256) que se ejecuta en un
microordenador Macintosh LCIII.
La figura 16 compara la imagen obtenida
acústicamente de la amígdala como un barrido de detección de picos
en radiofrecuencia a una resolución de incremento lateral de 100
micras (a) con una imagen obtenida ópticamente del corte
inmunoteñido con peroxidasa de rábano (b). La cápsula epitelial
seleccionada como objetivo por una mezcla de anticuerpos
anti-citoqueratina se tiñe claramente con la
peroxidasa de rábano y las regiones homólogas en la imagen acústica
se "vuelven más brillantes" por el contraste acústico
biotinilado dirigido. En la figura 17, se mejora la imagen acústica
mediante detección de picos en radiofrecuencia a una resolución de
incremento lateral de 100 micras (a) hasta una resolución de
incremento lateral de 50 micras. Se observa claramente que el
contraste de perfluorocarbono biotinilado dirigido mejora
acústicamente el borde epitelial de la amígdala, de forma análoga a
la imagen óptica inmunoteñida. Este ejemplo demuestra claramente la
fidelidad del contraste perfluorocarbonado biotinilado que se
dirige para mejorar el contraste acústico de los tejidos, tales como
los ganglios linfáticos.
El agente de contraste perfluorocarbonado
biotinilado se produjo incorporando fosfatidiletanolamina
biotinilada en la monocapa lipídica externa de una microemulsión
perfluorocarbonada. En resumen, la emulsión estaba comprendida de
perfluorodiclooctano (40%, v/v, PFDCO, Minnesota Manufacturing and
Mining, St. Paul, MN), aceite de cártamo (2,0% p/v), una
co-mezcla de tensioactivo (2,0% p/v) y glicerina
(1,7% p/v). La co-mezcla de tensioactivo incluía
del 50 al 70% molar de lecitina (Pharmacia Inc., Clayton, NC), del 0
al 35% molar de colesterol (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO) y del
0,5 al 1% molar de
N-(6(biotinoil)amino)hexanoil)-dipalmitoil-L-alfa-fosfatidiletanolamina
(Pierce, Rockford, IL) y del 0 al 30% de bis(oleilamida) del
ácido dietilenetriaminopentaacético - gadolinio,
(Gd-DTPA-BOA), (Gateway Chemical
Technology, St. Louis, MO) que se disuelven en cloroformo. La mezcla
cloroformo - lípido se evaporó a presión reducida, se secó en una
estufa a vacío a 50ºC durante la noche y se dispersó en agua
mediante sonicación, dando como resultado una suspensión de
liposomas. La suspensión de liposomas se transfirió a un recipiente
de mezclado (Dynamics Corporation of America, New Hartford, CT) con
perfluorodiclorooctano, aceite de cártamo y agua destilada y
desionizada y se emulsionó durante de 30 a 60 segundos. La mezcla
emulsionada se transfirió a un microfluidizador, modelo S110
(Microfluidics, Newton, MA), y se procesó continuamente a 69,95 MPa
durante tres minutos. La emulsión completa se introdujo en un vial,
se cubrió con nitrógeno y se selló con tapón/cierre de engarce
hasta su uso. Se preparó una emulsión control de manera idéntica,
excepto porque la fosfatidiletanolamina biotinilada se sustituyó en
la co-mezcla de tensioactivo. Se determinaron los
tamaños de partícula de la emulsión perfluorocarbonada biotinilada y
control por triplicado a 37ºC con un analizador del tamaño de
partícula por difusión de luz láser Brookhaven BI-90
(Brookhaven Instruments Corporation, Holtsville, NY).
Se añadieron emulsiones perfluorocarbonadas
biotiniladas de gadolinio-DTPA (30 \mul) a 2,97 ml
de solución salina tamponada con fosfato (PBS) isotónica, pH 7,4, y
avidina en una cubeta de poliestireno. La avidina (Pierce, Inc.,
Rockford, IL) se disolvió en PBS y estuvo presente en la cubeta a
concentraciones finales de 0 a 10 \mug/ml. Todas las muestras se
prepararon por duplicado, se mezclaron por inmersión suave y se
agitaron continuamente a baja velocidad en una tabla giratoria
durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se determinaron los
tamaños de partícula de la emulsión por triplicado a 37ºC con un
analizador del tamaño de partícula submicrométrico por difusión de
láser luminoso Brookhaven BI-90 (Brookhaven
Instruments Corporation, Holtsville, NY). La figura 18 revela que
el tamaño de partícula inicial para las tres emulsiones que
incorporan gadolinio se mantuvo en torno a 250 nm. La adición de
avidina aumentó el tamaño de partícula de una manera relacionada con
la dosis. Los aumentos incrementales en el tamaño de partícula
fueron ligera, pero no perjudicialmente más pequeños para las
concentraciones más altas de incorporación de gadolinio.
Se obtuvo sangre completa humana fresca y se
añadió un anticoagulante (9:1, v/v) con citrato sódico estéril. En
una serie de ensayos, se produjeron coágulos plasmáticos (6)
combinando el plasma y cloruro cálcico 100 mM (3:1 v/v) con 5
unidades de trombina (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) en un
molde de plástico sobre una superficie de nitrocelulosa. Se
permitió que el plasma coagulara suavemente a temperatura ambiente.
La mitad de los coágulos (3) se incubaron individualmente con 150
\mug de anticuerpo monoclonal anti-fibrina
biotinilado (NIB 5F3; NIBSC, Herts, Reino Unido) en 10 ml de PBS
durante dos horas; los coágulos restantes (3) se mantuvieron en
PBS. Los coágulos tratados con anticuerpos se incubaron entonces con
avidina (50 \mug/ml de PBS) durante 30 minutos seguido por
gadolinio al 10%, emulsión perfluorocarbonada biotinilada (30
\mul/ml de PBS) durante 30 minutos. Los coágulos control se
trataron de forma similar con emulsión perfluorocarbonada control
(30 \mul/ml de PBS). Los coágulos dirigidos y control se
volvieron a tratar con avidina y con emulsión perfluorocarbonada
dirigida o control, respectivamente, para optimizar la saturación de
la superficie antes de la interrogación ultrasónica. Los coágulos
en discos de nitrocelulosa se colocaron en un baño de agua y se
obtuvieron imágenes con catéteres intravasculares a 30 MHz (Boston
Scientific Corporation, Maple Grove, MN) y un escáner ultrasónico
convencional con un transductor en fase lineal a 7,5 MHz (Hewlett
Packard Inc.) Las imágenes ultrasónicas se grabaron en una cinta de
vídeo Super-VHS para el análisis posterior de la
imagen. La figura 19 demuestra claramente la mejora en la
reflectividad acústica de la superficie del coágulo plasmático con
el contraste acústico de dirección que no se aprecia en el control.
Estos resultados demuestran que se conservaba la capacidad de
selección como objetivo y la mejora en los efectos de reflectividad
acústica de la emulsión perfluorocarbonada biotinilada.
Se prepararon emulsiones biotiniladas que
incorporan gadolinio-DTPA a concentraciones globales
del 0,2, 0,4 y 0,6% en moles en la membrana lipídica externa, tal
como se describe en el ejemplo 13. Las partículas de contraste dual
se diluyeron en serie con PBS en tubos de plástico de 3 cc y se
realizó la obtención de imágenes mediante resonancia magnética
utilizando un Philips Gyroscan S15 ACS-NT (1,5 T).
Se utilizó una secuencia de impulsos de RM de
Look-Locker para obtener un mapa de la curva de
relajación longitudinal. Brevemente, se aplicó un impulso de
inversión, seguido por la adquisición de una serie de imágenes con
pequeños ángulos de inclinación ("flip angles") y un corto
espaciado entre imágenes. Los cambios de intensidad de la señal
entre imágenes estaban relacionados directamente con la curva de
relajación real, y se determinó T1 (el tiempo de relajación de
espín-red) a partir de esta relación. Los parámetros
de la secuencia de impulsos utilizados en este experimento fueron
TR de 50 ms, TE de 10 ms, ángulo de inclinación de 5 grados, matriz
de 64 x 64, campo de visión de 160 x 104 mm, 20 imágenes, retraso
tras el impulso de inversión de 16 ms. El experimento se repitió
con un Tr de 25 ms con el fin de medir T1 muy cortos a una elevada
concentración de Gd^{3+}. Se generaron mapas paramétricos de T1
en los que la intensidad de píxel es el valor de T1 en milisegundos.
La tabla 1 revela la dependencia directa del acortamiento de T1 con
la concentración de gadolinio. El acortamiento de T1 fue superior
para las partículas que contenían concentraciones superiores de
gadolinio, ya se hubiese conseguido mediante formulación o
dilución.
| 0,2% de Gd | 0,4% de Gd | 0,6% de Gd | ||||
| Dilución de la formulación | [Gd] mM | T1 (ms) | [Gd] mM | T1 (ms) | [Gd] mM | T1 (ms) |
| 1:16 (2,5% de PFC) | 0,000125 | 972 \pm 2 | 0,000252 | 492 \pm 1 | 0,000314 | 519 \pm 1 |
| 1:8 (5% de PFC) | 0,000249 | 878 \pm 7 | 0,000505 | 339 \pm 2 | 0,000628 | 414 \pm 4 |
| 1:4 (10% de PFC) | 0,000498 | 430 \pm 7 | 0,00101 | 189 \pm 2 | 0,001256 | 156 \pm 2 |
| 1:2 (20% de PFC) | 0,000996 | 169 \pm 1 | 0,00202 | 92 \pm 1 | 0,002511 | 90 \pm 1 |
| 1:1 (40% de PFC) | 0,001992 | 65 \pm 1 | 0,00404 | < 50 | 0,005022 | < 50 |
La emulsión de control (es decir, sin gadolinio)
tenía un %1 medio de 1788 \pm 9 ms. Los T1 más cortos de 50 ms no
pudieron resolverse con la presente técnica. La relajatividad para
cada preparación (0,2%, 0,4% y 0,6% de [Gd]) se determinó
calculando la pendiente de la recta que relaciona [Gd] en mM con
1/%1 (tabla 2). La relajatividad de las emulsiones con 0,2% de
gadolinio fue la mayor; mientras, la relajatividad de las
formulaciones de contraste del 0,4% y el 0,6 fueron más cortas y
similares.
| pendiente (ms-mM) | ordenada en el origen | r | |
| 0,2% | 7,89 | -0,00093 | 0,99 |
| 0,4% | 5,06 | 0,00049 | 0,99 |
| 0,6% | 4,36 | 0,00034 | 0,99 |
Se prepararon emulsiones biotiniladas que
incorporan gadolinio-DTPA a concentraciones globales
del 10, 20 y 30% en moles en la membrana lipídica externa, tal como
se describe en el ejemplo 13. El porcentaje en peso real de
gadolinio en las emulsiones aplicadas son del 0,25% (10%), 0,43%
(20%) y 0,54% (30%). Se obtuvo sangre humana completa, fresca y
anticoagulada (9:1, v/v) con citrato de sodio estéril. En una serie
de ensayos, se produjeron coágulos plasmáticos (6) combinando
plasma y cloruro de calcio 1000 mM (3:1, v/v) con 5 unidades de
trombina (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) en un molde de
plástico sobre una superficie de nitrocelulosa. Las dimensiones del
coágulo cuando se formó sobre la membrana de soporte de
nitrocelulosa eran: espesor < 0,5 mm; diámetro \sim 1 cm. Se
permitió que el plasma se coagulara lentamente a temperatura
ambiente. La mitad de los coágulos (3) se incubaron individualmente
con 150 \mug de anticuerpo monoclonal anti-fibrina
biotinilado (NIB 5F3; NIBSC, Herts, Reino Unido) en 10 ml de PBS
durante dos horas; los coágulos restantes (3) se mantuvieron en
PBS. Los coágulos tratados con el anticuerpo se incubaron luego con
avidina (50 \mug/ml de PBS) durante 30 minutos seguido por
emulsión perfluorocarbonada biotinilada, con gadolinio al 10% (30
\mul/ml de PBS) durante 30 minutos. Los coágulos control se
trataron de manera similar con emulsión perfluorocarbonada control
(30 \mul/ml de PBS). La mitad de los coágulos seleccionados como
objetivo y control se volvieron a tratar con avidina y la emulsión
perfluorocarbonada dirigida o control, respectivamente, para
optimizar la saturación superficial antes de la obtención de
imágenes.
Los coágulos expuestos al contraste de gadolinio
dirigido y control se recubrieron con gelatina al 10% en
P-30, placas de Petri de plástico y se realizó la
obtención de imágenes mediante resonancia magnética utilizando un
Philips Gyroscan S15 ACS-NT (1,5 T). Se utilizó una
secuencia de impulsos de Look-Locker para obtener un
mapa de la curva de relajación longitudinal. Brevemente, se aplicó
un impulso de inversión, seguido por la adquisición de una serie de
imágenes con pequeños ángulos de inclinación y un corto espaciado
entre imágenes. Los parámetros de la secuencia de impulsos
utilizados en este experimento fueron TR de 50 ms, TE de 10 ms,
ángulo de inclinación de 5 grados, matriz de 64 x 64, campo de
visión de 160 x 104 mm, 20 imágenes, retraso tras el impulso de
inversión de 16 ms. Se determinó T1 a partir del mapa de T1
paramétrico resultante en cada coágulo y en el gel circundante. Se
determinó T2 (tiempo de relajación espín-espín) a
partir de una secuencia de espín-eco de 8 ecos con
TE de 30 ms y TR de 8000 ms. La dimensión del vóxel de la imagen
para este experimento fue de \sim 2,5 x 2,0 x 2,0 mm.
El valor de T1 medio para el gel fue de 582 \pm
8 ms. Los valores de T2 para todas las muestras cayeron en un
estrecho intervalo entre 80 y 92 ms. El T2 del gel fue de 91 ms.
Añadir Gd a la preparación dio como resultado una caída medible y
significativa de T1 que formó una meseta en la concentración
paramagnética más baja (tabla 3). Debido a que el efecto de volumen
parcial en esta medición (es decir, sólo una capa fina de emulsión
de gadolinio sobre la superficie de un coágulo con respecto a la
dimensión del vóxel, o aproximadamente 11:1 de sustrato de gel con
respecto a la emulsión de gadolinio), el efecto de aumento del
contraste es real y notablemente sensible.
| [Gd] | 1 exposición al sistema de selección de | 2 exposiciones al sistema de selección de |
| objetivo | objetivo | |
| T1 (ms) | T1 (ms) | |
| 0,0% | 725 \pm 16 | 824 \pm 41 |
| 0,25% | 662 \pm 23 | 696 \pm 15 |
| 0,43% | 642 \pm 21 | 660 \pm 11 |
| 0,54% | 666 \pm 17 | 667 \pm 13 |
Según los protocolos para animales aprobados, se
anestesiaron perros que pesaban 20 - 30 kg con pentobarbital sódico
(30 mg/longitud de onda, i.v.) seguido por halotano al 1% en
oxígeno. Se dejaron al descubierto la arteria femoral derecha y
todas las ramas entre el ligamento inguinal y la arteria safena. Se
seleccionó por canulación una rama arterial proximal, ligeramente
distal con respecto al ligamento inguinal. Se ligaron todas las
demás ramas. Se insertó la punta de una aguja de calibre 23
engarzada en un cable de cobre plateado de manera oblicua en la
arteria femoral, 2 - 3 cm proximal a la rama safena y se sujetó con
una sutura de Prolene 4-0 a través del tejido
conjuntivo en el otro lado. Se aplicó corriente anódica (200 - 400
\muA) durante de 90 a 120 minutos para inducir un trombo
parcialmente oclusivo. Se utilizó una sonda de flujo Doppler situada
de manera proximal para monitorizar el desarrollo del trombo. Se
utilizó la constricción distal parcial de la arteria femoral para
facilitar la formación del trombo.
Una vez que se hubo formado un trombo, se insertó
un catéter de calibre 20 en la rama proximal preservada de la
arteria y se unió un gotero a presión de NaCl al 0,9% mediante una
llave de paso de tres vías para el catéter. Se permitió que se
irrigara la arteria con solución salina y se detuvo el flujo
sanguíneo anterógrado a través de la arteria femoral mediante la
colocación de una pinza 1 - 2 cm proximal al catéter. Se evitó el
flujo sanguíneo continuado a través de la arteria femoral distal que
contiene el trombo en la duración del estudio.
Tras irrigarse sangre desde el segmento arterial
aislado con infusión continua de solución salina, se ocluyó
temporalmente la arterial femoral distal con una pinza. Para los
trombos seleccionados como objetivo para el contraste, se inyectó
anticuerpo monoclonal anti-fibrina biotinilado (150
\mug de NIB 5F3 o NIB 1H10 en 0,5 ml de PBS, pH
7,2-7,4) a través de la llave de paso de tres vías y
se incubó en el vaso durante una hora. Se liberó entonces la pinza
distal en la arteria femoral y se eliminó por irrigación el
anticuerpo no unido con solución salina al 0,9%. Tras reestablecer
la oclusión arterial distal, se inyectaron 0,5 mg de avidina
(Pierce, Rockfold, IL) en 0,5 ml de PBS en el segmento y se incubó
dentro de la arteria durante 30 minutos. De nuevo, se liberó la
oclusión distal y se eliminó por irrigación la avidina no unida de
la luz con NaCl al 0,9%. Se reestableció la oclusión arterial
distal y se inyectaron 0,2 ml de emulsión biotinilada en la luz del
vaso y se incubó durante 30 minutos.
Se obtuvieron imágenes de las arterias mediante
ultrasonidos tras la formación del trombo (nivel inicial y tras
cada administración de anticuerpo, avidina y emulsión
perfluorocarbonada con un transductor con alineamiento en fase
lineal de 7,5 MHz utilizando un sistema de obtención de imágenes
disponible comercialmente. Se utilizó el electrodo de aguja
reflectante para localizar regiones de trombosis para insonación.
Una vez que se recogieron todos los datos, se confirmó la presencia
del trombo en cada animal mediante la incisión de la arteria a la
finalización del estudio.
Tras la obtención ultrasónica de imágenes, el
segmento de la arteria femoral se perfundió con formalina in
situ durante 30 minutos, y luego se cortó con un soporte rígido
para conservar la conformación, el segmento arterial se situó en un
recipiente con formalina y se trasladó a un escáner de RMN para la
obtención de imágenes. Se realizó una resonancia magnética nuclear
utilizando un Philips Gyroscan S15 ACS-NOT (1,5 T),
usando la técnica de Look-Locker con un TR de 100
ms, TE de 10 ms, ángulo de inclinación de 5 grados, una matriz de
64 x 64, un campo de visión de 160 x 104 mm, 20 imágenes, un retraso
tras el impulso de inversión de 16 ms. El espesor de los cortes fue
de 4 mm.
El T1 medido del fondo de formalina fue de 2319
\pm 12 ms y el T1 medido del trombo fue de 1717 \pm 173 ms. Esta
diferencia en T1 entre el coágulo y el fondo dio como resultado un
alto contraste, tal como se muestra en la figura 20. La ubicación y
las dimensiones de la señal T1 aumentada fueron análogas al
resultado obtenido mediante ultrasonidos, figura 20, y se confirmó
la disección de la arteria. Una segunda preparación de trombo
arterial de la que se obtuvo imágenes con las mismas técnicas de
resonancia magnética dio resultados análogos. En este experimento,
el T1 del coágulo fue de 1572 \pm 173 ms, y el T1 del fondo fue de
2319 \pm 12 ms.
En vista de lo anterior, se observará que se
alcanzan los diversos objetos de la invención y se obtienen otros
resultados ventajosos.
Claims (10)
1. Uso de una composición que comprende
una emulsión de partículas lipídicas encapsuladas que comprenden un
fluorocarbono líquido, acopladas dichas partículas a un agente para
la unión basada en ligando de dichas partículas a un epítopo o
receptor molecular, para la preparación de una formulación para un
procedimiento de diagnóstico dirigido in vivo, en el que
dicho procedimiento de diagnóstico comprende obtener imágenes de
dicho objetivo en presencia de dicha emulsión de partículas
lipídicas encapsuladas que comprenden un fluorocarbono líquido, con
la condición de que no esté presente fluorocarbono gaseoso como
agente de contraste.
2. Uso según la reivindicación 1, en el
que dicho agente es un agente biotinilado.
3. Uso según la reivindicación 1, en el
que dicho agente es un ligando específico para dicho epítopo o
receptor.
4. Uso según la reivindicación 3, en el
que dicho ligando es un anticuerpo o fragmento del mismo.
5. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que el fluorocarbono comprende al
menos un perfluorocarbono.
6. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha obtención de imágenes es
obtención acústica de imágenes.
7. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha obtención de imágenes es
obtención de imágenes mediante resonancia magnética (RMN).
8. Uso según la reivindicación 7, en el
que dicha composición contiene además un quelato de gadolinio
acoplado a dichas partículas.
9. Uso según la reivindicación 2, en el
que dicho procedimiento de diagnóstico comprende además administrar
a un sujeto que va a diagnosticarse, un ligando biotinilado
específico para dicho epítopo o receptor y en el que o bien dicha
composición contiene además avidina o estreptavidina, o bien en el
que dicho procedimiento de diagnóstico comprende además administrar
avidina o estreptavidina al sujeto.
10. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en el que dicha composición contiene además
un agente quimioterápico.
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