WO2001064743A1 - CONSTRUCTION A LIAISON GPib-LIPIDE ET UTILISATION CORRESPONDANTE - Google Patents

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Yasuo Ikeda
Hiroshi Saito
Hiromichi Mukai
Yoshiyuki Mori
Mitsuru Murata
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Mitsubishi Pharma Corporation
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Definitions

  • the present invention includes a conjugate in which GPIb and a lipid are bonded via a polyalkylene oxide (hereinafter, also referred to as a “GPIb-lipid conjugate”), this conjugate, and free lipid.
  • the present invention relates to a lipid complex and its use.
  • glycoproteins are present on the platelet membrane surface and are involved in the expression of platelet function.
  • GPIb, GPIIb, GPIIIa, GPIIIb, GPIV, GPIX and the like are known as such platelet membrane glycoproteins.
  • GP Ib functions as a receptor for von Willebrand factor (hereinafter “vWF”).
  • vWF von Willebrand factor
  • GPI b is a heterodimer with a molecular weight of 160,000 and a disulfide bond between the heavy chain and the /? Chain (Pro c. At l. Acad. Sci. USA, 84, 5615-5619). 1987, Hematology and Oncology, Vol. 31, No. 1, pages 5-10, 1995, etc.).
  • VWF plays an important role as an adhesive protein in the formation of platelet thrombus, and at this time, GPIb binds to vWF as a receptor, and the subsequent adhesion of platelets via vWF at the vascular injury site. It is thought to have a function to activate or promote the aggregation reaction.
  • the binding between vWF and GPlb has been implicated in the formation of pathological thrombi as well as in the function of hemostasis in injured blood vessels. Therefore, GPIb is expected to be effectively used in examination and diagnosis of vascular injury sites, detection of pathological thrombus, and furthermore, treatment.
  • the present inventors proceeded with research in consideration of the above circumstances, and as a result, by introducing a polyalkylene oxide (hereinafter referred to as “PAO”) between GPIb and a lipid, the blood was further reduced.
  • PAO polyalkylene oxide
  • the present inventors have found that a GPI b-lipid conjugate having excellent storage properties can be prepared, and as a result of further intensive studies, the present invention has been completed.
  • the present invention is a.
  • the conjugate of (5) above, wherein the lipid having a functional group is a phospholipid, a glycolipid, a fatty acid, glyceride, cholesterol, or an amphipathic lipid;
  • GP Ib lipid complex (12) a complex containing GPI b—lipid conjugate and free lipid (hereinafter also referred to as “GP Ib lipid complex”);
  • test or diagnostic agent comprising a labeling substance and the complex of (12) as active ingredients
  • the labeling substance is a radioisotope, a paramagnetic metal for MRI, an iodine compound for X-ray imaging, a fluorescent substance or a dye,
  • a drug-containing composition comprising a drug and the complex of the above (12) as active ingredients; (24) a drug which is a hemostatic agent, a vasoconstrictor, an anti-inflammatory agent, a thrombolytic agent, an anticoagulant or an antiplatelet
  • the invention relates to the drug-containing composition according to the above (23), which is an agent. The details of the present invention are described below.
  • the GPIb-lipid conjugate of the present invention is a conjugate in which (1) GPlb and (2) lipid are bonded via (3) PAO.
  • GPIb used in the present invention includes not only natural GPIb itself but also one in its amino acid sequence as long as the object of the present invention is achieved, as long as it has the binding ability to vWF.
  • One or more amino acids with any mutation such as deletion, substitution, addition or modification, for example, a natural GPIb substitution, analog, mutant, modified, derivative, sugar chain adduct Etc. are also included.
  • the GPIb ⁇ chain [His (1) to Leu (610)] a fragment of the vWF binding region of the light chain (hereinafter referred to as “GPIb light chain fragment”) and the like.
  • examples of the substitute include a G Ib heavy chain fragment consisting of His (1) to A1a (302) in which G1y (233) or Met (239) is substituted with Va1.
  • GPI b heavy chain fragments lack transmembrane sites.
  • the transmembrane site is G In the PI b chain, Leu (486) to Gly (514) correspond (Proc. Nat 1. Acad. Sci. USA, 84, 5615 to 5619, published in 1987).
  • the method for preparing GPIb is not particularly limited, and GPIb can be prepared by a method of extracting and isolating from platelet membrane, a method of cell culture, a method of producing by genetic engineering, and the like.
  • Lipids that bind to GPIb via PAO have a functional group that can bind directly or indirectly to PAO.
  • functional groups include an amino group (NH 2 group), a carboxyl group (COOH group), a thiol group (SH group), and an aldehyde group (CHO group), but are not particularly limited thereto. Any substance can be directly or indirectly bonded to PAO.
  • lipid types include phospholipids, glycolipids, fatty acids, glycerides, and cholesterols. Preferably it is amphiphilic.
  • lipids include phosphatidylethanolamine (hereinafter referred to as “PE”) and phosphatidylthioethanol (for example, 1,2-dioleoyl-1sn-glycerol-13-phosphatidylthioethanol and the like) in phospholipids.
  • PPE phosphatidylethanolamine
  • phosphatidylthioethanol for example, 1,2-dioleoyl-1sn-glycerol-13-phosphatidylthioethanol and the like
  • Glycolipids include, for example, ceramide, cereproside, sphingosine, sulfatide, gangliosides, and glycerol glycolipids (eg, galactosyldiasylglycerol).
  • Fatty acids include those having 12 to 18 carbon atoms, and may be saturated fatty acids or unsaturated fatty acids.
  • palmitic acid, oleic acid and lauric acid are exemplified.
  • glycerides include monoglyceride, diglyceride, and triglyceride.
  • Cholesterols include cholesterol, cholesterol esters and arocholesterol.
  • the functional groups in these lipids may be in the form of acid halides, acid anhydrides and active esters to enhance the reactivity with PA0 and the crosslinking agent described below.
  • a cross-linking agent (so-called In addition, a product obtained by reacting a linker with a functional group of a lipid in advance can be used.
  • a crosslinking agent include dicarboxylic acid, aminocarboxylic acid, bismaleimide compound, bishalocarbonyl compound, halocarbonylmaleide compound, dithiomaleimide, dithiocarboxylic acid, and maleimide carboxylic acid.
  • These crosslinking agents preferably have 2 to 10 carbon atoms.
  • the reaction between the crosslinking agent and the functional group of the lipid is carried out by a conventional means.
  • PE-N-force luponylamine eg, PE-N-force prolylamine, PE-N-dodecanylamine, PE-N-glucurylamine, etc.
  • PE-N-carbonyl for example, PE-N-succinyl, PE-N-glucuryl (NGP E), PE-N-dodecanyl (NDPE), etc.
  • PE-N-dithioacylate for example, PE —N—3— (2-pyridyldithio) propionate, etc.
  • PE—N—maleimidacylate eg, PE—N—4— (p-maleimidophenyl) butylate]
  • PE—N-piotinyl and the like PE-N-force luponylamine (eg, PE-N-force prolylamine, PE-N-dodecanylamine, PE-N-glucurylamine, etc.)
  • PE-N-carbonyl for example, PE
  • PAO polyalkylene oxide
  • PAO intervenes between (1) GPIb and (2) lipids and binds both.
  • PAO has the same meaning as polyalkylene glycol, and examples include polyethylene glycol (PEG), polypropylene glycol, glycol obtained by copolymerizing ethylene oxide and propylene oxide, and the like.
  • the number average molecular weight of PAO is from 100 to 100,000, preferably from 1,000 to 10,000.
  • a crosslinking agent such as linker, linker
  • examples of such a crosslinking agent include dicarboxylic acid, aminocarboxylic acid, bismaleimide compound, bishalocarbonyl compound, halocarbonylmaleimide compound, dithiomaleimide, dithiocarboxylic acid, maleimide carboxylic acid and the like.
  • the reaction between these crosslinking agents and PAO is carried out by conventional means. 4
  • the bond between GPIb and PAO and the bond between PAO and a lipid having a functional group can be chemically performed directly or indirectly, that is, without or through a group derived from a cross-linking agent. More preferred in the present invention is the mode of indirect binding.
  • the mixing ratio of GPIb to PAO or a lipid having a functional group is about 1: 1 to 1:20, preferably about 1: 1 to 1:10 in molar ratio.
  • Carbodimids eg, N, N, dicyclohexylcarbodiimide, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC), etc.
  • EDC 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide
  • Succinimides eg, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxysulfosuccinimide (NHSS), etc.
  • those used in thiol group exchange reactions eg, 5, 5, -dithiobis (2 - nitrobenzoic acid), 2, 2 5 - dithio piston pyridine and the like] and the like.
  • divalent crosslinking agent examples include a crosslinking agent having the same reactivity and a crosslinking agent having a different reactivity.
  • examples of the same reactivity include dimethyl adipimidate and disuccinimidyl suberate, and examples of the different reactivity include succinimidyl 1-3- (2-pyridyldithio) propionate and N— (6-maleimidate). Docaproyloxy) succinimid, N-succinimidyl-16-maleimide hexanoate and the like.
  • GPIb or lipid can be directly bonded to PAO by one COO— [for example, it can be obtained by ester bonding between the carboxyl group of GPlb or lipid (for example, fatty acid) and the hydroxyl group of PAO.
  • N— for example, an aldehyde group in a sugar chain of GP lb
  • a CH 2 NH— obtained by further reducing a Schiff bond
  • a NH— etc., obtained by Schiff bonding of an aldehyde group introduced into a lipid and an amino group introduced into PAO.
  • the mode of binding between the cross-linking agent (including a bivalent cross-linking agent; the same applies hereinafter) and PAO is the same as described above.
  • —, — 0—, — CONH—, — CH N—, one CH 2 NH—, —NH one and the like.
  • a crosslinker such as maleimide compound, halocarbonyl compound, etc.
  • the preparation of the GP Ib-lipid conjugate may be performed in the presence of a surfactant.
  • the surfactant is not particularly limited as long as it can solubilize lipids, but it is preferable to use a nonionic surfactant that does not affect the structure of GPIb.
  • a nonionic surfactant that does not affect the structure of GPIb.
  • those having a high critical micelle concentration (CMC) for example, those having a CMC of 1 mM or more are preferable.
  • octyl glucoside for example, n-octyl /?-D-glucoside
  • octyl thioglucoside for example, n-octyl-?-D-thioglucoside
  • 31-((3-colamidopropyl) ) Dimethylammonio] propane sulfate (CHAPS) and N, N-bis (3-D-gluconamidopropyl) deoxycolamide deoxy-BIGCHAP.
  • the mixing ratio of lipid: surfactant is preferably about 0.01: 1 to 0.1: 1 (molar ratio).
  • Activated lipid consisting of PAO—lipid (hereinafter simply referred to as “activated lipid”)
  • an activated lipid composed of a reactive substituent—PAO—lipid can be used as an intermediate for this purpose.
  • the “activated lipid” refers to a conjugate of PAO and a lipid having a reactive substituent at the terminal of PAO.
  • the PAO and the lipid are chemically linked, directly or indirectly, ie, without or via a group derived from the crosslinker.
  • the reactive substituent is not particularly limited as long as it has an action of activating the binding to a protein. For example, it can be obtained by reacting succinimide, maleimide and the like with the PAO terminal.
  • the reactive substituent in the activated lipid and the binding mode between PAO and PAO and the lipid are as described in the section on the preparation of the 4GPIb-lipid conjugate, respectively.
  • activated lipid Chemically linking the activated lipid and GP lb, directly or indirectly, ie, with or without a cross-linking agent, results in a GPI b -lipid conjugate.
  • the following compounds are specifically exemplified as the activated lipid.
  • These activated lipids are known and can be produced according to known methods, and commercially available products can also be used.
  • DSPE-34HCS I Distearoylphosphatidyl-N_ (succinimidylsuccinyl-polyoxyethylene-succinyl) ethanolamine.
  • the number average molecular weight of PE G is 3400.
  • DSPE-20HMAL Distearoylphosphatidyl-N- (maleimide propionylamino-polyoxyethylene-oxycarbonyl) ethanolamine.
  • the number average molecular weight of PEG is 2000.
  • the GPI b -lipid conjugate of the present invention has a molar ratio of GPI b to PAO or lipid of about 1: 1 to 1:20 in molar ratio.
  • the composition ratio of PAO to lipid is 1: 1 in molar ratio.
  • the complex of the present invention containing the above-described GPI b—lipid complex and free lipid is In the form of a solution, micelle, fat emulsion, etc., preferably in the form of ribosome Can be.
  • a GPIb lipid complex in the form of ribosome will be described. The following description of the GPIb lipid complex applies to other forms besides liposomes.
  • the lipid used here is not particularly limited as long as it can take the form of a lipid complex (for example, ribosome) either alone or as a mixture with another kind of lipid.
  • examples of such lipids include phospholipids, glycolipids, cholesterols, fatty acids, and derivatives thereof.
  • the free lipid for forming the complex any nontoxic lipid that is physiologically acceptable and can be metabolized can be used in the present invention.
  • the free lipid means a lipid other than the lipid itself that constitutes the GP Ib-lipid conjugate, and may be any of the same type and different from the lipid that constitutes the GP Ib-lipid conjugate.
  • phospholipid examples include phosphatidylcholine (hereinafter, referred to as “PC”), phosphatidylserine, phosphatidic acid, phosphatidylglycerol, phosphatidylinositol, sphingomyelin, dicetylphosphate, cardiolipin, and lysophosphatidylcholine.
  • PC phosphatidylcholine
  • phosphatidylcholine hereinafter, referred to as “PC”)
  • phosphatidylserine phosphatidic acid
  • phosphatidylglycerol phosphatidylinositol
  • sphingomyelin dicetylphosphate
  • cardiolipin cardiolipin
  • Fatty acids for example, those substituted with palmitic acid or myristic acid (diacylphosphatidylcholine, diacylphosphatidylglycerol, etc.) may be used.
  • specific examples include purified egg yolk lecithin, hydrogenated purified soybean lecithin, egg yolk-derived phosphatidylcholine, dipalmitoylphosphatidylcholine, dipalmitoylphosphatidylglycerol, distearylphosphatidylcholine, and dimyristylphosphatidylcholine.
  • glycolipids examples include ceramide, celeb mouth side, sphingosine, sulfatide, gangliosides, and glycerol side glycolipids.
  • Cholesterols include cholesterol, cholesterol esters, Contains sterols.
  • Fatty acids include, for example, oleic acid, lauric acid, myristic acid, palmitic acid and stearic acid.
  • lipid derivatives include phosphatidylethanolamine and polyoxyethylene derivatives of fatty acids, and polysaccharide derivatives of fatty acids and cholesterol.
  • the mixing ratio of GPIb—lipid conjugate: free lipid is such that the molar ratio of GPIb to free lipid is about 1:10 to 1: 1000, preferably 1:50 to 1: 2. It is about 00.
  • GP lb lipid complexes can be prepared by, for example, detergent removal, hydration, ultrasonication, reversed-phase distillation, freeze-thaw, ethanol injection, and extrusion (extrusion). on method) and a high-pressure emulsification method. Gel filtration, dialysis, ultrafiltration and the like are generally used as a surfactant removing method.
  • a method of binding GPIb to lipid via PAO and then forming a complex that is, a method of preparing a GPIb-lipid conjugate and then forming a lipid complex is more preferable.
  • lipid complex for example, ribosome
  • GP lb is added, and the lipid of (I) 2 and GP Ib
  • Isolation and purification of the GP Ib lipid complex can be performed by a means known per se such as centrifugation and gel filtration.
  • the conjugate of lipid [(I) 2] with PAO and GPIb were mixed in the presence of a surfactant to prepare a GPIb-lipid conjugate, and then free lipid [(II ) 1] may be mixed to form a GPIb lipid complex by a method of removing the surfactant. Unreacted GPIb, lipid [(1) ⁇ ], free lipid [(II) 1], etc. are separated and removed to obtain a purified product.
  • the definition of the surfactant is as defined above.
  • the mixing ratio is as follows: free fat [(II) 1]: 0.001::! ⁇ 0.1: 1 (molar ratio).
  • lipid [(1) 2] and PAO and free lipid [(II) 1] Dissolve the combined product of lipid [(1) 2] and PAO and free lipid [(II) 1] in an organic solvent such as chloroform, ethanol, etc., remove the organic solvent after mixing.
  • organic solvent such as chloroform, ethanol, etc.
  • An appropriate aqueous solvent is added, and a lipid complex is formed by a known method such as shaking or stirring.
  • GPIb is added to bind GPIb and lipid via PAO to form a GPIb lipid complex. Unreacted GPIb, lipids, etc. are separated and removed to obtain a purified product.
  • free lipid [(II) I] that does not react with or bind to GPIb is used.
  • Specific examples include phosphatidylcholine and lysophosphatidylcholine.
  • the ratio of GPIb to free lipid [(II) 1] in the obtained GPIb lipid complex was 0.01 to 10 parts by weight per 1 part by weight of free lipid [(11) 1]. And preferably 0.1 to 5 parts by weight.
  • the particle size of the obtained GPI b lipid complex is about 50-500 nm, preferably about 100-400 nm.
  • the number of GP I b molecules per particle is 100 to 1 0000, preferably 250 to 3000, the surface density of 10 10 to 10 13 of GPI b, preferably 10 "to 10 12.
  • Examples of the structure of the GPlb lipid complex include a multilamellar vesicle (MLV), a small unilamellar vesicle, a large nilamellar vesicle, and the like. Further, it may be coated with a hydrophilic polymer (derivative) such as polyethylene glycol (PEG) or Pull Mouth Nick (registered trademark) (polyoxyethylene polyoxypropylene block copolymer).
  • MMV multilamellar vesicle
  • PEG polyethylene glycol
  • Pull Mouth Nick registered trademark
  • the obtained GPIb lipid complex is then washed, if necessary, with a physiologically acceptable aqueous solution, sterilized by filtration, and dispensed to prepare a liquid preparation, a pellet form, and a suspension form. .
  • Formulation is in accordance with widely known methods in the production of pharmaceuticals.
  • the preparation is also provided as a lyophilized preparation by freezing the liquid preparation and drying it under reduced pressure.
  • monosaccharides eg, glucose, etc.
  • disaccharides eg, sucrose, etc.
  • the preparation of the GPIb lipid complex may contain as a stabilizer a polymer selected from albumin, dextran, vinyl polymer, gelatin and hydroxylethyl starch.
  • the macromolecular substance may be incorporated into the voids in the lipid complex together with the drug, or may be added to and blended with the preparation of the lipid complex incorporating the drug (ie, added and blended outside the liposome). Is also good. It goes without saying that both the inside and outside of the lipid complex may be blended.
  • the amount of the stabilizer to be added is 0.5 to 10 parts by weight, preferably 1 to 5 parts by weight, per 1 part by weight of the free lipid [(II) 1].
  • the GPI b lipid complex of the present invention can be used as a diagnostic agent for vascular injury sites, thrombus formation sites, von Willebrand factor deficiency, etc. .
  • labeling substances include RI (radioactive Radioisotopes), paramagnetic metals for MR I, iodine compounds for X-ray imaging, fluorescent substances and dyes.
  • the RI for example, 3 H, 14 C, 99m Tc, 123 1, 125 1, 131 1, 871 S r s 113a I n and 197 Hg and the like.
  • paramagnetic metals for MR I include chromium (Cr) -gadolinium (Gd), manganese (Mn), iron (Fe), cobalt (Co), nickel (Ni), and brassodime (Pr). , Neodymium (Nd), samarium (Sm), ytterbium (Yb), terbium (Tb), dysprosium (Dy), holmium (Ho), erbium (Er) and copper (Cu). Examples thereof include divalent or trivalent ions, and among them, preferred are divalent or trivalent ions such as gadolinium, terpium, dysprosium, holmium, erbium, and iron.
  • a compound known as a known X-ray contrast agent can be used as the iodine compound for X-ray contrast.
  • adipiodone, amidotrizoic acid, iodaramic acid, iopanoic acid, thiopenzamic acid, iobodate, tylopanoic acid, thiopidol, iopidone, propriodone, iodamide or a salt thereof (eg, sodium salt, meglumine salt, etc.) are exemplified. Is done.
  • the fluorescent substance include fluorescein isothiocyanate (FITC) and carboxyfluorescein (CF).
  • labeling substances can be encapsulated in a lipid complex (for example, ribosome) by a known method.
  • a chelating agent such as a salt form or a chelating agent such as ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) and diethylenetriaminopentaacetic acid (DTPA) and encapsulated in a lipid complex.
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • DTPA diethylenetriaminopentaacetic acid
  • the agent for testing or diagnosis of the present invention containing the labeling substance and the GPIb lipid complex can be prepared by the same method as described above using GPIb labeled with a labeling substance (for example, RI).
  • a GPI b lipid complex of the invention may be prepared. Since the GPI b lipid complex of the present invention has a property of accumulating at the site of vascular injury, An embodiment as a containing composition (drug carrier) can also be taken.
  • a drug is not particularly limited as long as it is physiologically and pharmacologically effective by accumulating at the site of vascular injury. Examples thereof include a hemostatic agent, a vasoconstrictor, an anti-inflammatory agent, Thrombolytic agents, anticoagulants, antiplatelet agents and the like.
  • Hemostatic agents include carbazochrome, blood coagulation factors (FVIII, FIX), thrombin, antiplasmin agents (eg, epsilon-monoaminocaproic acid, tranexamic acid), prominamine sulfate, ethanesylate, phytonadione and conjugated estrogens (eg, , Sodium estrone sulfate, sodium equilin sulfate) and the like.
  • FVIII, FIX blood coagulation factors
  • thrombin eg, epsilon-monoaminocaproic acid, tranexamic acid
  • antiplasmin agents eg, epsilon-monoaminocaproic acid, tranexamic acid
  • prominamine sulfate ethanesylate
  • phytonadione and conjugated estrogens eg, Sodium estrone sulfate, sodium equilin sulf
  • vasoconstrictor noradrenaline, Norufuenefurin, phenylene Refurin, main evening lamino Ichiru, main Tokisamin, prostaglandins shed, like prostaglandin F 2 Hioyobi thromboxane A 2 are exemplified.
  • anti-inflammatory drugs examples include steroid-based anti-inflammatory drugs (dexamethasone, hydrocortisone, prednisolone, vesamethasone, triamcinolone, methylprednisolone, etc.), non-steroid anti-inflammatory drugs (indamesin, asemesin, Flurbiprofen, aspirin, ibuprofen, flufenamic acid, ketoprofen, etc.).
  • steroid-based anti-inflammatory drugs diamethasone, hydrocortisone, prednisolone, vesamethasone, triamcinolone, methylprednisolone, etc.
  • non-steroid anti-inflammatory drugs indamesin, asemesin, Flurbiprofen, aspirin, ibuprofen, flufenamic acid, ketoprofen, etc.
  • thrombolytic agent examples include plasmin, tissue plasminogen, perkinase, etc., or precursors and derivatives thereof.
  • anticoagulant examples include acidic mucopolysaccharides such as heparin, coumarin anticoagulants, natural extracts such as hirudin and derivatives thereof, and physiologically active substances such as thrombomodulin-active protein C.
  • antiplatelet agent examples include aspirin, ticlovidine, syrosyl sol, prosyl cyclin and the like. These drugs are encapsulated in a lipid complex by a known method.
  • the GPIb lipid complex of the present invention can be administered as GPIb at a rate of about 0.001 to 100 Omg per day.
  • the dose can be appropriately adjusted according to the sex, age, symptoms, etc. of the patient.
  • the GPI b lipid complex of the present invention is more preferably administered parenterally.
  • Concrete Specific examples include intravascular (intra-arterial, intravenous) injection, continuous infusion, subcutaneous administration, local administration, or intramuscular administration.
  • compositions containing the GPIb lipid complex of the present invention include platelet substitutes, drugs for preventing and treating vascular disorders, vascular damage, thrombosis, etc., and diagnostic agents for diagnosing vWF deficiency, etc. , Biological and medical reagents, platelet aggregation inhibitors, and antithrombotic screening reagents. It is also useful as a diagnostic or therapeutic agent for examining sites of vascular injury and thrombus formation.
  • the GPIb used in Examples and Experimental Examples of the present invention is a GPIb heavy chain fragment (His (1) -Arg (293), molecular weight 45000) produced by genetic engineering using CHO cells. And Japanese Patent Application Laid-Open No. 9-208599].
  • EPC yolk phosphatidylcholine
  • 45.4 mg of cholesterol 2.33 g of octylglucoside (0G)
  • the amount of EPC corresponds to 100 times the molar ratio of GPIb.
  • a solution obtained by dissolving DSPE-34HC SI purchased from NOF Corporation
  • HEPE S (pH 8.0) buffer containing 0.1% 0G was added.
  • the amount of DSPE-34HCS I added was 10 times the molar amount of GP Ib.
  • ribosomes were collected by centrifugation using the CsC1 density gradient method.
  • the conditions are as follows. That is, CsCl was dissolved in 1 to 1.5 mL of the sample to a 35% concentration, and 0.5 mL of 25% CsC1 and 0.1 mL of saline solution were overlaid, and 214,000 Xg for 10 minutes Processed.
  • the ribosome-containing fraction was collected and dialyzed into a dialysis membrane (fraction molecular weight 10,000 daltons, Slide-A-Lyzer 10 (K, manufactured by Pierce) overnight.
  • the prepared GP Ib ribosome had a PC concentration of 0.61 mg / mL, a GP Ib concentration of 0.24 mg / mL, and an average particle size of 0.25 / m.
  • the solution (100 mg / mL) was added in an amount of 100 ⁇ L, and reacted at room temperature for 10 minutes. Further, 25 mM NaI was added at 100 / L, and the solution was subjected to gel filtration (MicroSpInG-25, manufactured by Pharmacia Biotech) and ultrafiltration (U1trafree_MC 10K, manufactured by Millipore). Iodine-labeled GP Ib ( 125 I—GP Ib) was prepared.
  • Example 2 All operations were performed in the same manner as in Example 1 except that the above 125 I-GPIb was used instead of GPIb in Example 1.
  • the PC concentration of the prepared GP I b ribosome is 3.54 mg / mL, 0-1) 3 concentration is 1.00 mg / mL, average particle size is 0.33 ⁇ m, radioactivity is 9.3 X 10 7 cpm / mL.
  • the aggregation ability of GP Ib ribosome was confirmed.
  • the GPIb ribosome prepared in Example 1 was adjusted to a PC concentration of 0.2 mgZmL.
  • 25 ⁇ L of a 2 mg / mL vWF solution was added, and the mixture was stirred and stirred at 37 ° C.
  • 25 ⁇ L of a 15 mg / mL ristocetin solution was mixed.
  • Aggregates were measured using a platelet aggregometer (AG-10, manufactured by Kowa Co., Ltd.) for a total of 15 minutes immediately before the incubation. The sum of the number of aggregates multiplied by the scattering intensity was calculated and used as an index of the degree of aggregate formation. Table 1 shows the results.
  • the GPI b ribosome according to the present invention specifically reacted with vWF in the presence of ristocetin to form an aggregate. This proved that the GPI b ribosome was useful as a platelet substitute. It was also found that the GPI b ribosome according to the present invention had improved aggregation ability as compared with the control product.
  • the blood kinetics of GP I b ribosome was confirmed.
  • the iodine-labeled GPI b ribosome prepared in Example 2 was administered to a Hart 1 ey guinea pig (Example 3) into the femoral vein at a dose of 1 mg / kg body weight as GPIb. Blood was collected from the orbit over time up to 60 minutes after administration, and 100 / L of the blood was counted (1 minute) with a gamma-one count.
  • a similar experiment was carried out using GPI b ribosome not described in Example 1 of JP-A-9-208599, without using PEG. Table 3 shows the results. Table 3
  • the GPI b ribosome according to the present invention has improved retention in blood as compared to the control product.
  • the GPI b lipid complex of the present invention can bind to vWF and form aggregates. Therefore, platelet substitutes, drugs for the prevention and treatment of vascular disorders, vascular damage and thrombosis, etc., or diagnostic agents for diagnosing vWF deficiency, biological and medical reagents, platelet aggregation Inhibitors ⁇ It is expected to have a wide range of practical applications as a screening reagent for antithrombotic agents.
  • the GPIb lipid complex of the present invention has a property of specifically accumulating at a vascular injury site, it is extremely useful as a diagnostic or therapeutic agent for testing a vascular injury site and a thrombus formation site. Further, the GPI b lipid complex of the present invention has excellent retention in blood, and can exhibit sustained pharmacological action.
  • the GPIB-lipid conjugate of the present invention is highly useful as an active ingredient of the GPIB lipid complex of the present invention.
  • This application is based on a patent application No. 2000-570449 filed in Japan, the contents of which are incorporated in full herein.

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Description

明細書
GP I b—脂質結合体およびその用途
技術分野
本発明は、 GP I bと脂質とがポリアルキレンォキサイ ドを介して結合された 結合体 （以下 「GP Ib—脂質結合体」 ともいう。）、 この結合体および遊離の脂 質を含有する脂質複合体、 ならびにその用途に関する。
背景技術
血小板膜表面には各種糖タンパク質 （グリコプロテイン、 Gl yc opr o t e in、 以下 「GP」 という。） が存在しており、 血小板機能の発現に関与してい る。 このような血小板膜糖タンパク質には、 GP I b、 GPIIb、 GPIIIa、 G PIIIb、 GPIV、 GPIX等が知られている。 これらのうち、 GP Ibはフォン ヴィルブラント因子 （以下「vWF」 という。） の受容体として機能している。 G P I bはひ鎖および/?鎖がジスルフイ ド結合した、 分子量 160, 000のへテ ロニ量体である （Pro c. at l. Acad. S c i. USA， 8 4卷， 5615〜 5619頁， 1987年、 血液■腫瘍科， 31卷， 1号， 5〜 10頁， 1995年等による。）。
血管損傷が起きると、 速やかに血小板が当該血管損傷部位に粘着し、 凝集など の反応を通じて血小板血栓を形成する。 血小板血栓の形成には vWFが粘着性蛋 白として重要な役割を果たすが、 このとき GP I bは受容体として vWFと結合 し、 当該血管損傷部位における、 その後の vWFを介した血小板の粘着 '凝集反 応を活性化あるいは促進する機能を有すると考えられている。 また、 vWFと G P lbとの結合は、 損傷血管における止血の機能の他に、 病的血栓の形成にも関 与している。 従って、 GP I bは血管損傷部位の検査や診断ならびに病的血栓の 検出、 さらには治療において有効に利用されることが期待される。
しかしながら、 単離した GP I bを用いても、 上述したような生理活性を人為 的に発現させることはできなかった。 従って、 GP I bを医薬あるいは試薬とし て実用化するためには何らかの製剤的工夫が必要であった。 本発明者らは先に、 GP I bおよび特定の脂質が結合した結合体と、 通常の脂 質とを含有する脂質複合体を調製することにより、 初めて GP I bの生理活性を 発現できることを見出した （W 097/29128、 特開平 9— 208599号 公報、 USP—6177059、 EP— 894807— A)。
発明の開示
本発明者らは上記の事情を考慮して研究を進めた結果、 GP I bと脂質との間 に、 ポリアルキレンォキサイ ド （以下 「PAO」 という。） を導入することにより、 さらに血中での貯留性に優れた G P I b—脂質結合体を調製できることを見出し、 さらに鋭意研究の結果、 本発明を完成した。
本発明は、
(1) GP I bと脂質とが P AOを介して結合した結合体 （以下 「GP Ib—脂 質結合体」 ともいう。）、
(2) GP Ibが、 GP Ibそのもの、 GP I b断片、 GP Ibひ鎖または GP lbひ鎖断片である上記 （1) の結合体、
(3) GP Ibが、 GP I bと同程度のフォンヴィルブラント因子結合能を有す る類似体、 変異体、 修飾体、 誘導体または糖鎖付加物である上記 （1)の結合体、
(4) GP I bが膜貫通部位を欠失したものである上記 （1) の結合体、
(5) 脂質が官能基を有するものである上記 （ 1) の結合体、
(6) 官能基を有する脂質が、 リン脂質、 糖脂質、 脂肪酸、 グリセライ ド、 コレ ステロールまたは両親媒性の脂質である上記 （5) の結合体、
(7) 官能基が、 アミノ基、 カルボキシル基、 チオール基またはアルデヒド基で ある上記 （5) の結合体、
(8) PA〇が、 ポリエチレングリコール、 ポリプロピレングリコール、 または エチレンォキサイ ドおよびプロピレンォキサイ ドを共重合して得られるグリコ一 ルである上記 （ 1 ) の結合体、
(9) PAOが 100〜100000の数平均分子量を有する上記 （ 1 ) の結合 体、 (10) GP I bと PAO、 PAOと官能基を有する脂質が、 各々、 架橋剤を介 して化学的に結合したものである上記 （5) の結合体、
(11) GP I bと P AOとの比がモル比で 1 ： 1〜1 ： 20であり、 PAOと 官能基を有する脂質との比がモル比で 1 ： 1である上記 （5) の結合体、
(12) GP I b—脂質結合体および遊離の脂質を含有する複合体 （以下 「GP I b脂質複合体」 ともいう。）、
( 13)複合体がリボソームの形態である上記 （12) の複合体。
(14) 遊離の脂質が、 リン脂質、 糖脂質、 コレステロール、 脂肪酸またはそれ らの誘導体である上記 （12) の複合体、
(15) GP I bと遊離の脂質との比がモル比で 1 ： 10〜 1 ： 1000である 上記 （ 12 ) の複合体、
( 16)複合体がリストセチンの存在下に凝集能を有する上記（12)の複合体、
(17) GP I bと脂質とが PAOを介して結合した結合体を調製後に、 当該結 合体と遊離の脂質との複合体を調製してなる上記 （ 12) の複合体、
( 18) 上記 （ 12) の複合体を含有する医薬組成物、
(19) 医薬組成物が血小板代用剤である上記 （18) の医薬組成物、
(20) 医薬組成物が血管障害、 血管損傷または血栓症の予防または治療剤であ る上記 （18) の医薬組成物、
(21)標識物質および上記 （12) の複合体を有効成分とする検査または診断 のための薬剤、
(22)標識物質が放射性同位元素、 MR I用常磁性金属、 X線造影用ヨウ素化 合物、 蛍光物質または色素である上記 （21) の薬剤、
(23) 薬物および上記 （12) の複合体を有効成分とする薬物含有組成物、 (24) 薬物が止血剤、 血管収縮剤、 抗炎症剤、 血栓溶解剤、 抗血液凝固剤また は抗血小板剤である上記 （23) の薬物含有組成物に関する。 以下に本発明の詳 細を説明する。
(I) GP I b— PAO—脂質からなる結合体 （GP I b—脂質結合体） 本発明の GP I b—脂質結合体は、 ① GP l bと②脂質とが、 ③ P AOを介し て結合された結合体である。
① GP I b
本発明で用いられる GP I bとしては、 vWFとの結合能を有していれば、 天 然の GP I bそのもののほか、 本発明の目的が達成される限り、 そのアミノ酸配 列中の 1個または複数個のアミノ酸に欠失、 置換、 付加もしくは修飾といった任 意の変異を施したもの、 例えば天然の GP I bの置換体、 類似体、 変異体、 修飾 体、 誘導体、 糖鎖付加物等も包含される。 具体的には、 G P I bの α鎖 〔H i s ( 1) 〜L eu ( 610)〕、 当該ひ鎖の vWF結合領域の断片 （以下 「GP I b ひ鎖断片」 という。）等の GP I b断片、 さらに膜貫通部位を欠失した GP I b断 片等が挙げられる。 本発明においてより好ましいのは、 膜貫通部位を欠失した G P I b断片である。
より具体的な GP I bひ鎖断片として、 Hi s (l) 〜Cys (485)、 Hi s (l) 〜Pro (340)、 H i s ( l) 〜Thr (304)、 Hi s (1) 〜 Ala (302 )、 Hi s (1) 〜Arg ( 293 ) 〔特開平 1— 221394号 公報、 EP— 317278— A〕、 Al a (165) 〜： Leu (184)、 Gin (180) 〜Phe (199)、 Hi s (195) 〜Leu (214)、 A s n ( 2 10)〜Val (229 )、 Glu (225)〜Al a (244)および T hr (2 40) 〜Tyr ( 259 ) 〔特開平 1一 100196号公報〕、 As n (61) 〜 T h r (75)、 Gin (71) 〜Se r (85)、 T h r (81) 〜： Leu ( 9 5)、 Gln (97) 〜Arg ( l l l)、 Leu (136) 〜： Leu ( 150)、 As n (210)〜 A l a (224)、 Gin (22 1) 〜 Asp (235)およ び Se r (241) -Asp ( 255 ) 〔特表平 5— 503708号公報、 WO 9 1/09614〕 等が例示される。 また、 置換体として、 Hi s ( 1 ) 〜A 1 a (302) からなる GP Ibひ鎖断片において、 G 1 y ( 233 ) または Me t ( 239 )を各々 Va 1に置換したもの等が例示される〔WO 93/16712〕c これらの GP I bひ鎖断片は全て膜貫通部位を欠失している。 膜貫通部位は、 G P I bひ鎖では L e u (486)〜Gly (514)が該当する （P r o c . N a t 1. Ac ad. Sc i. USA, 84巻， 5615〜5619頁， 1 987年発行による）。
GP I bの調製方法に特別の制限はなく、 血小板膜から抽出 ·単離する方法、 細胞培養による方法、 遺伝子工学的に産生する方法等により GP I bを調製する ことができる。
②脂質
PAOを介して GP I bと結合する脂質は、 P AOと直接または間接的に結合 可能な官能基を有している。 かかる官能基としては、 アミノ基 （NH2基）、 カル ボキシル基（COOH基）、 チオール基（SH基）およびアルデヒド基（CHO基） 等が挙げられるが、 特にこれらに限定されるものではなく、 PAOと直接または 間接的に結合を生じうるものであればどのようなものでもよい。
脂質の種類としては、 リン脂質、 糖脂質、 脂肪酸、 グリセライ ドおよびコレス テロール類等が例示される。 好ましくは両親媒性のものである。
脂質の具体例として、 リン脂質ではホスファチジルエタノールァミン（以下「P E」 という。）、 ホスファチジルチオエタノール （例えば、 1, 2—ジォレオイル 一 s n—グリセ口一 3—ホスファチジルチオエタノール等） が例示される。 糖脂 質としては、 例えば、 セラミ ド、 セレプロシド、 スフィンゴシン、 サルファチド、 ガングリオシド類およびグリセ口糖脂質類 （例えばガラク トシルジァシルグリセ ロール）等が挙げられる。脂肪酸としては、 炭素数 12〜18のものが挙げられ、 飽和脂肪酸でも、 不飽和脂肪酸でもよい。 例えば、 パルミチン酸、 ォレイン酸お よびラウリン酸等が例示される。 グリセライ ドとしては、 モノグリセライ ド、 ジ グリセライ ド、 トリグリセライ ド等が例示される。 コレステロール類には、 コレ ステロール、 コレステロールエステル、 ァロコレステロールが含まれる。 これら の脂質における官能基は、 P A 0や後述する架橋剤との反応性を高めるために、 酸ハライ ド、 酸無水物および活性エステル体の形態でもよい。
また、 脂質と PAOとを間接的に結合させる場合には、 架橋剤 （いわゆるスぺ ーサ一、 リンカ一） を予め脂質の官能基と反応させたものも利用できる。 このよ うな架橋剤としては、 例えば、 ジカルボン酸、 アミノカルボン酸、 ビスマレイミ ド化合物、 ビスハロカルボニル化合物、 ハロカルボニルマレイミ ド化合物、 ジチ オマレイミ ド、 ジチォカルボン酸およびマレイミ ドカルボン酸等が例示される。 これら架橋剤は炭素数が 2〜 10であることが好ましい。 これら架橋剤と脂質の 官能基との反応は、 常套手段により行なわれる。
当該架橋剤と官能基とを反応させて形成されたリン脂質として、 PE—N—力 ルポニルァミン （例えば、 P E— N—力プロィルァミン、 PE— N—ドデカニル ァミン、 PE— N—グル夕リルアミン等）、 PE— N—カルボニル 〔例えば、 PE —N—サクシニル、 P E— N—グル夕リル（NGP E)、 P E— N—ドデカニル（N DPE)等〕、 PE— N—ジチオアシレート 〔例えば、 PE— N— 3— (2—ピリ ジルジチォ） プロピオネート等〕、 PE—N—マレイミ ドアシレート 〔例えば、 P E— N— 4— （p—マレイミ ドフエニル） プチレート〕、 PE— N—ピオチニル等 が例示される。
③ PAO (ポリアルキレンオキサイ ド）
PAOは、 ① GP I bと②脂質との間に介在して両者を結合する。 PAOは、 ポリアルキレングリコールと同意義であり、 ポリエチレングリコール（ P E G)、 ポリプロピレングリコール、 エチレンォキサイ ドおよびプロピレンォキサイ ドを 共重合して得られるグリコールなどが例示される。 P AOの数平均分子量は、 1 00〜： 100, 000、 好ましくは 1 , 000~ 10, 000程度の高分子量を 有するものである。
また、 P AOとして、 P AOの一方または両方の末端と架橋剤 （いわゆるスぺ —ザ一、 リンカ一） とを予め反応させたものも利用できる。 このような架橋剤と しては、 例えば、 ジカルボン酸、 アミノカルボン酸、 ビスマレイミ ド化合物、 ビ スハロカルボニル化合物、ハロカルボニルマレイミ ド化合物、 ジチオマレイミ ド、 ジチォカルボン酸およびマレイミ ドカルボン酸等が例示される。 これら架橋剤と P AOとの反応は、 常套手段により行なわれる。 ④ GP I b—脂質結合体の調製
GP I bと PAOとの結合、 および PAOと官能基を有する脂質との結合は、 直接または間接的に、 すなわち架橋剤由来の基を介さずにまたは介して、 化学的 に行うことができる。 本発明においてより好ましいのは間接的に結合させる態様 である。 GP I bと PAOまたは官能基を有する脂質との混合比は、モル比で 1 ： 1〜1 ： 20程度、 好ましくは 1 ： 1〜1 ： 10程度である。
GP I bまたは官能基を有する脂質と P AOとの化学的結合においては、 直接 結合できない場合には、 脂質の官能基や P AOに上記架橋剤を反応させる方法の 他に、 公知の縮合剤、 脂質中の官能基を活性化させる活性化剤、 二価性架橋剤等 を用いることもできる。 縮合剤および活性化剤として、 カルボジィミ ド類 〔例え ば、 N, N， ージシクロへキシルカルボジイミ ド、 1—ェチル一 3— (3—ジメ チルァミノプロピル） カルボジィミ ド （ED C)等〕、 スクシンイミ ド類〔例えば、 N—ヒドロキシスクシンイミ ド、 N—ヒドロキシスルホスクシンィミ ド （NH S S)等〕、 チオール基の交換反応に用いるもの〔例えば、 5, 5， —ジチォビス（2 —ニトロ安息香酸）、 2, 25 —ジチオピスピリジン等〕 等が例示される。
二価性架橋剤としては、 同反応性の架橋剤、 異反応性の架橋剤が挙げられる。 同反応性のものとして、 例えば、 ジメチルアジピンイミデート、 ジスクシンイミ ジルスべレート等が例示され、 異反応性のものとして、 例えば、 スクシンイミジ ル一3 - (2—ピリジルジチォ） プロピオネート、 N— （6—マレイミ ドカプロ ィルォキシ） スクシンイミ ド、 N—スクシンィミジル一 6—マレイミ ドへキサノ ェ一ト等が例示される。
GP I bまたは脂質と PAOとを直接的に結合する様式としては、 一 COO— 〔例えば、 GP lbまたは脂質 （例えば脂肪酸） のカルボキシル基と P AOの水 酸基とをエステル結合して得られる〕、 — 0— (例えば、 GP l bまたは脂質の水 酸基と PA0の水酸基とをエーテル結合して得られる）、 -CONH- (例えば、 GP I bまたは脂質のカルボキシル基と P AOに導入したァミノ基とをアミ ド結 合して得られる）、 — CH = N— (例えば、 GP lbの糖鎖におけるアルデヒド基 または脂質に導入したアルデヒド基と、 P AOに導入したァミノ基とをシヅフ結 合して得られる）、 一 CH2NH— (シヅフ結合をさらに還元して得られる）、 一 N H—等が挙げられる。
GP I bまたは脂質と PAOとを間接的に結合する具体的方法のうち、 架橋剤 (二価性架橋剤を含む。 以下同じ） と PAOとの結合様式としては、 上記と同様 に、 一 COO—、 — 0—、 — CONH—、 — CH = N—、 一 CH2NH -、 -NH 一等が例示される。 また、 GP I bまたは脂質と架橋剤との結合様式としては、 上記と同様のものの他に、 — S— S— 〔GP I bまたは脂質 （例えば、 ホスファ チジルチオエタノール） のチオール基と、 ジチオマレイミ ド、 ジチォカルボニル 化合物等の架橋剤のジチォ部分とをジスルフィ ド結合して得られる〕、 -S- (G P I bまたは脂質のチオール基をマレイミ ド化合物、 ハロカルボニル化合物等の 架橋剤を用いて還元アルキル化により結合して得られる）、 -NH- (例えば、 G P I bまたは脂質 （例えば、 PE) のァミノ基とマレイミ ドカルボン酸等の架橋 剤のマレイミ ド部分とを反応させて得られる）、 —CO—等が挙げられる。
GP I b—脂質結合体の調製は界面活性剤の存在下で行ってもよい。 界面活性 剤は脂質を可溶化するものであれば特に制限はないが、 GP I bの構造に影響を 及ぼさない非イオン性界面活性剤を用いることが好ましい。 特に臨界ミセル濃度 (CMC) が高いもの、 例えば 1 mM以上の CMCを有するものが好ましい。 具 体的には、 ォクチルグルコシド （例えば、 n—ォクチルー/?— D—グルコシド）、 ォクチルチオグルコシド （例えば、 n—ォクチル— ?— D—チォグルコシド）、 3 一 〔（3—コラミ ドプロピル） ジメチルアンモニォ〕 プロパン硫酸 （CHAPS) および N， N—ビス （ 3—D—グルコンアミ ドプロピル） デォキシコラミ ド （d e oxy-B I GCHAP) 等が例示される。 その混合比は脂質：界面活性剤と して、 0. 01 ： 1〜0. 1 ： 1程度 （モル比） が好ましい。
⑤反応性置換基— PAO—脂質からなる活性化脂質 （以下単に 「活性化脂質」 ともいう。）
GP I b— P AO—脂質からなる結合体 （GP I b—脂質結合体） を合成する ための中間体として、 反応性置換基— P AO—脂質からなる活性化脂質を用いる ことができる。 ここで、 「活性化脂質」 とは、 P AOの末端に反応性置換基を有す る、 P AOと脂質との結合物をいう。 PAOと脂質は、 直接または間接的に、 す なわち架橋剤由来の基を介さずにまたは介して、 化学的に結合されている。 反応 性置換基としては、 蛋白質との結合を活性化する作用を有するものであれば、 特 に限定されない。 例えば、 スクシンィミ ド、 マレイミ ド等を PAOの末端と反応 させて得られる。 活性化脂質における反応性置換基と PAO、 PAOと脂質の結 合様式は、 それそれ上記の④ GP I b—脂質結合体の調製の項で述べた通りであ る。
活性化脂質と GP lbを、 直接または間接的に、 すなわち架橋剤を介さずにま たは介して化学的に結合することにより、 GP I b—脂質結合体が得られる。 活性化脂質としては、 具体的には以下の化合物が例示される。 これらの活性化 脂質は公知であり、 既知の方法に従って製造することができ、 また市販品を使用 することもできる。
DSPE-34HCS I ： ジステアロイルホスファチジル一 N _ (スクシンィ ミジルスクシニル一ポリオキシエチレン一スクシニル） エタノールァミン。 PE Gの数平均分子量は 3400。
DSPE— 20HMAL :ジステアロイルホスファチジル一 N— (マレイミ ド プロピオニルァミノ一ポリオキシエチレン一ォキシカルボニル） エタノールアミ ン。 P E Gの数平均分子量は 2000。
⑥ G P I b—脂質結合体の性状
本発明の GP I b—脂質結合体は、 GP I bと P AOまたは脂質との構成比が モル比で 1 ： 1〜1 ： 20程度である。 P AOと脂質との構成比はモル比で 1 ： 1となる。
(I I) GP I b—脂質結合体と遊離の脂質との複合体（GP I b脂質複合体） 上記 GP I b—脂質結合体および遊離の脂質を含有する本発明の複合体は、 リ ポソ一ム、 ミセル、 脂肪乳剤等の形態、 好ましくはリボソームの形態をとること ができる。 本発明の複合体の例として、 リボソームの形態をとる G P I b脂質複 合体を挙げて説明する。 なお、 以下の G P I b脂質複合体に係わる説明は、 リポ ゾーム以外の他の形態についても同様に該当する。
①遊離の脂質
ここで使用される脂質は単独で、 または他種の脂質と混合して脂質複合体 （例 えば、 リボソーム） の形態をとりうるものであれば特に限定されない。 そのよう な脂質としては、 リン脂質、 糖脂質、 コレステロール類、 脂肪酸およびこれらの 誘導体等が挙げられる。 当該複合体を形成するための遊離の脂質は、 生理的に許 容され、 そして代謝されうる無毒の脂質であればいずれも本発明に用いることが できる。 なお、 遊離の脂質とは、 G P I b—脂質結合体を構成する脂質それ自体 以外の脂質を意味するものであり、 G P I b—脂質結合体を構成する脂質と異種 および同種のいずれでもよい。
リン脂質としては、 例えば、 ホスファチジルコリン （以下 「P C」 という。）、 ホスファチジルセリン、 ホスファチジン酸、 ホスファチジルグリセロール、 ホス ファチジルイノシトール、 スフインゴミエリン、 ジセチルホスフェート、 カルジ オリピンおよびリゾホスファチジルコリン等が挙げられる。 また、 これらの脂質 は大豆油または卵黄など天然の材料から抽出 ·精製したものでも、 それらを水素 添加して構成脂肪酸を飽和化したもの すなわち水素添加リン脂質） でも、 また 更に構成脂肪酸を特定の脂肪酸、 例えば、 パルミチン酸またはミ リスチン酸に置 き換えたもの （ジァシルホスファチジルコリン、 ジァシルホスファチジルグリセ ロール等） であってもよい。 具体的には、 精製卵黄レシチン、 水素添加精製大豆 レシチン、 卵黄由来ホスファチジルコリン、 ジパルミ トイルホスファチジルコリ ン、 ジパルミ トイルホスファチジルグリセロール、 ジステアリルホスファチジル コリンおよびジミリスチルホスファチジルコリン等が例示される。
糖脂質としては、 例えば、 セラミ ド、 セレブ口シド、 スフインゴシン、 サルフ ァチド、 ガングリオシド類およびグリセ口糖脂質類等が挙げられる。
コレステロール類には、 コレステロール、 コレステロールエステル、 ァロコレ ステロールが含まれる。
脂肪酸としては、 例えば、 ォレイン酸、 ラウリン酸、 ミリスチン酸、 パルミチ ン酸およびステアリン酸等が挙げられる。 脂質誘導体としては、 例えば、 ホスフ ァチジルエタノールァミンおよび脂肪酸のポリオキシェチレン誘導体、 脂肪酸お よびコレステロールの多糖誘導体等が挙げられる。 具体的には、 ジステアリル一
N— (モノメ トキシポリエチレングリコールサクシニル） ホスファチジルェタノ —ルァミン、 ポリオキシエチレンパルミチン酸エステル、 N— 〔2— （ステア口 ィルカルボキシァミノ） ェチル〕 力ルバモイルメチルマンナンおよび N— 〔2— (コレステリルカルボキシァミノ） ェチル〕 力ルバモイルメチルプルラン等が例 示される。
②複合体化
GP I b—脂質結合体：遊離の脂質の混合比としては、 GP I bと遊離の脂質 との比がモル比で 1 ： 10〜 1 ： 1000程度、 好ましくは、 1 ： 50〜 1 ： 2 00程度である。
GP l b脂質複合体 （例えば、 リボソーム） の調製は、 例えば、 界面活性剤除 去法、 水和法、 超音波法、 逆相蒸留法、 凍結融解法、 エタノール注入法、 押出し 法 （ext rus i on法） および高圧乳化法等で行うことができる。 界面活性 剤除去法としては、 ゲル濾過、 透析および限外濾過等が一般的に用いられる。 本 発明においては、 GP I bと脂質とを PAOを介して結合させた後に複合体化を 行う方法、 すなわち GP I b—脂質結合体を調製後に、 脂質複合体にする方法が より好ましい。 ただし （I) ②の脂質と （I I)①の遊離の脂質からなる脂質複 合体（例えば、 リボソーム） を調製後に、 GP lbを添加して、 （I)②の脂質と GP I bとを P AOを介して結合させることにより、 GP I b脂質複合体を調製 することも可能である。 GP I b脂質複合体の単離 ·精製は遠心分離およびゲル 濾過等の自体公知の手段にて行うことができる。
以下に、 具体例として、 GP I b脂質複合体の製法を説明する。
(i) GP I b—脂質結合体を調製後に、 GP I b脂質複合体とする方法 脂質〔（ I)②〕 を界面活性剤で可溶化し、 P AOと結合させて結合物を得る。 この結合物、 GP I bおよび遊離の脂質〔（ I I )①〕 を適当な水性溶媒中で混合 し、 まず、 GP lbと脂質〔（1)②〕 とを P AOを介して結合させた後に、 界面 活性剤を除去することにより GP I b脂質複合体を形成させる。なお、脂質〔（ I ) ②〕 と PAOとの結合物および GP I bを界面活性剤の存在下に混合して、 GP I b—脂質結合体を調製した後に、 更に遊離の脂質 〔（I I)①〕 を混合し、 界面 活性剤を除去する手法によって GP I b脂質複合体を形成してもよい。 未反応の GP I b、 脂質 〔（1)②〕、 遊離の脂質 〔（I I)①〕等を分離除去して精製品を 得る。 界面活性剤の定義は、 前記と同義である。 また、 その混合比は、 遊離の脂 質 〔（ I I )①〕：界面活性剤として 0. 001 : ：！〜 0. 1 : 1 (モル比） 程度 である。
(i i) 脂質複合体 （例えば、 リボソーム） の調製後に GP I bを結合させて GP I b脂質複合体とする方法
脂質 〔（1) ②〕 と P AOとの結合物および遊離の脂質 〔（I I)①〕 を有機溶 媒、 例えば、 クロ口ホルム、 エタノール等に溶解 '混合した後に、 有機溶媒を除 去して、 脂質薄膜を調製する。 適当な水性溶媒を加えて、 振盪あるいは攪拌等の 公知の手法により、 脂質複合体を形成する。 さらに、 GP l bを添加して、 GP I bと脂質とを PAOを介して結合させ GP I b脂質複合体を形成させる。 未反 応の GP I b、 脂質等を分離除去して精製品を得る。
この方法では、 遊離の脂質 〔（I I)①〕 のうち GP I bと反応 '結合しないも のが用いられる。 具体的には、 ホスファチジルコリン、 リゾホスファチジルコリ ンなどである。
得られた GP I b脂質複合体における遊離の脂質〔（I I)①〕に対する GP I bの割合は、 遊離の脂質 〔（11)①〕 1重量部に対して、 0. 01〜10重量部、 好ましくは 0. 1〜5重量部である。
得られた GP I b脂質複合体の粒子径は約 50〜500 nm、 好ましくは約 1 00〜400 nmである。 また、 粒子 1個当たりの GP I b分子数は 100〜 1 0000、 好ましくは 250〜 3000であり、 G P I bの表面密度は 1010〜 1013、 好ましくは 10"〜1012である。
GP l b脂質複合体 （例えば、 リボソーム） の構造としては、 マルチラメラベ シクル（ML V)、スモールュニラメラベシクルおよびラージュ二ラメラベシクル 等が挙げられる。 さらに、 ポリエチレングリコール （PEG)、 プル口ニック （登 録商標） （ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンプロヅクコポリマー）等の親 水性ポリマ一 （誘導体） で被覆してもよい。
得られた GP I b脂質複合体は、 次いで要すれば、 生理的に許容される水溶液 で洗浄し、 除菌濾過、 分注を行い、 液状製剤、 ペレット状および懸濁状製剤とし て調製する。
製剤化は医薬品の製法において広く公知の方法に準ずる。 また、 製剤は液状製 剤を凍結させた後、 減圧下で乾燥させ、 凍結乾燥製剤としても提供される。 なお、 凍結乾燥する場合は保護剤として、 単糖類 （例えば、 ブドウ糖等）、 二糖類 （例え ば、 蔗糖等） 等を配合してもよい。
GP I b脂質複合体の製剤には、 アルブミン、 デキス トラン、 ビニル重合体、 ゼラチンおよびヒドロキシルェチル澱粉から選ばれた高分子物質を安定化剤とし て配合してもよい。
当該高分子物質は、 薬物と共に当該脂質複合体内の空隙に取り込まれていても よいし、 また薬物を取り込んだ脂質複合体の製剤に添加配合 （すなわち、 リポソ ーム外に添加，配合） してもよい。 もちろん脂質複合体の内外ともに配合しても よいことはいうまでもない。
当該安定化剤の添加量は、 遊離の脂質 〔（I I)①〕 1重量部に対して、 0. 5 〜10重量部、 好ましくは 1〜5重量部である。
(I I I) GP I b脂質複合体の医薬としての用途
本発明の GP I b脂質複合体は標識物質 （いわゆるマーカ一） を封入すること により、 血管損傷部位、 血栓形成部位やフォンヴィルブラント因子欠損症等の診 断薬としての態様をとることができる。 このような標識物質としては、 RI (放 射性同位元素）、 MR I用常磁性金属、 X線造影用ヨウ素化合物、 蛍光物質および 色素等が挙げられる。
RIとしては、 例えば、 3H、 14C、 99mTc、 1231、 1251、 1311、 871 S r s 113aI nおよび197 Hg等が挙げられる。 MR I用常磁性金属としては、 例えば、 クロム ( C r )ヽ ガドリニウム （ G d )、 マンガン （ M n )、 鉄 （ F e )、 コバルト （ C o )、 ニッケル （Ni)、 ブラセォジゥム （Pr)、 ネオジゥム （Nd)、 サマリウム （S m)、 イッテルビウム （Yb)、 テルビウム （Tb)、 ジスプロシウム （Dy)、 ホ ルミゥム （Ho)、 エルビウム （E r)および銅 （Cu)等の常磁性金属原子の 2 価または 3価イオンが挙げられ、 なかでも、 好ましいのは、 ガドリニウム、 テル ピウム、 ジスプロシウム、 ホルミウム、 エルビウムおよび鉄等の 2価または 3価 のイオンである。
X線造影用ヨウ素化合物は、 公知の X線造影剤として知られているものを利用 できる。 具体的には、 アジピオドン、 アミ ドトリゾ酸、 ィォダラム酸、 ィォパノ 酸、 ィォペンザム酸、 ィオボダート、 チロパノ酸、 ィォピドール、 ィォピドン、 プロピリオドン、 ョーダミ ドまたはその塩 （例えば、 ナトリウム塩、 メグルミン 塩等） が例示される。 蛍光物質としては、 例えば、 フルォレセインイソチオシァ ネート （F I T C) およびカルボキシフルォレセィン （CF) 等が例示される。 これらの標識物質は、 公知の方法によって脂質複合体 （例えば、 リボソーム） に封入することができる。 例えば、 そのまま、 塩の形態あるいはエチレンジアミ ン四酢酸 （EDTA) およびジエチレントリアミノ五酢酸 （DTPA) 等のキレ ート化剤により、 キレート化して脂質複合体中に封入することができる。 具体的 に 99»Tcの場合、 過テクネチウム酸ナトリウム、 テクネチウムポリリン酸塩およ び^ T c DTP A等を用いることができる。
標識物質および GP I b脂質複合体を含有する本発明の検査または診断のため の薬剤は、 標識物質 （例えば、 R I) で標識した GP I bを使用して、 前記と同 様の方法により本発明の GP I b脂質複合体を調製したものであってもよい。 本発明の GP I b脂質複合体は、 血管損傷部位への集積性を有するので、 薬物 含有組成物 （薬物運搬体） としての態様をとることもできる。 このような薬物と しては、 血管損傷部位へ集積させることによって生理学的、 薬理学的に有効であ るものであれば特に制限はなく、 例えば、 止血剤、 血管収縮剤、 抗炎症剤、 血栓 溶解剤、 抗血液凝固剤、 抗血小板剤等が挙げられる。
止血剤としては、 カルバゾクロム、 血液凝固因子 （F V I I I、 F I X )、 トロン ビン、 抗プラスミン剤 （例えば、 ィプシロン一アミノカプロン酸、 トラネキサム 酸）、 硫酸プロ夕ミン、 エタンシラート、 フィ トナジオンおよび結合型エストロゲ ン （例えば、 エストロン硫酸ナトリウム、 ェクイリン硫酸ナトリウム） 等が例示 される。
血管収縮剤としては、 ノルアドレナリン、 ノルフエネフリン、 フエ二レフリン、 メ夕ラミノ一ル、 メ トキサミン、 プロスタグランジン ひ、 プロスタグランジン F2ひおよびトロンボキサン A2等が例示される。 抗炎症剤としては、 ステロイ ド 系抗炎症剤 （デキサメサゾン、 ハイ ドロコルチゾン、 プレドニゾロン、 ベ夕メタ ゾン、 トリアムシノロン、メチルプレ ドニゾロン等）、非ステロイ ド系抗炎症剤（ィ ンドメ夕シン、 ァセメ夕シン、 フルルビプロフェン、 アスピリン、 イブプロフエ ン、 フルフエナム酸、 ケトプロフェン等） 等が例示される。
血栓溶解剤としては、 プラスミン、 組織プラスミノ一ゲンァクテイべ一夕一、 ゥロキナーゼ等、 またはその前駆体や誘導体等が例示される。 抗血液凝固剤とし ては、 へパリン等の酸性ムコ多糖類や、 クマリン系抗凝固薬、 ヒルジン等の天然 抽出物やその誘導体、 トロンボモジュリンゃ活性プロティン C等の生理活性物質 等が例示される。 抗血小板剤としては、 アスピリン、 チクロビジン、 シロス夕ゾ ール、 プロス夕サイクリン等が例示される。 これらの薬物は公知の方法によって 脂質複合体に封入する。
本発明の G P I b脂質複合体は、 G P I bとして、 1日当たり 0 . 0 0 1〜 1 0 0 O m g程度を投与することができる。 その投与量は患者の性別、 年齢、 症状 等に応じて適宜増減できる。
本発明の G P I b脂質複合体は、 より好ましくは非経口的に投与される。 具体 的には、 血管内 （動脈内，静脈内） への注射、 持続点滴、 皮下投与、 局所投与あ るいは筋肉内投与等が例示される。
本発明の GP I b脂質複合体を含む医薬組成物としては、 血小板代用剤、 血管 障害、 血管損傷および血栓症等の予防 ·治療等の医薬品、 あるいは vWF欠損症 等を診断するための診断薬、 生物学的 ·医学的な試薬、 血小板凝集抑制剤 '抗血 栓剤のスクリーニング用の試薬等がある。 血管損傷部位および血栓形成部位の検 査用診断薬あるいは治療剤としても有用である。
実施例
本発明をより詳細に説明するために実施例および実験例を挙げるが、 本発明は これらにより何ら限定されるものではない。 なお、 本発明の実施例および実験例 に供した GP I bは、 CHO細胞を用いて遺伝子工学的に産生した GP I bひ鎖 断片 〔 Hi s (1) -Ar g (293 )、 分子量 45000、 特開平 9 - 2085 99号公報を参照のこと〕 である。
実施例 1
GP I bを含む生理食塩水 （ 10 Omg/mL) 100〃Lに、 卵黄ホスファ チジルコリン （E P C) 221 mg、 コレステロール 45. 4mg、 ォクチルグ ルコシド （0G) 2. 33 gを注射用水 1. 5 mLに溶解したものを添加した。 E P C量は GP I bの 100倍モル比に相当する。 さらに、 DSPE— 34HC S I (日本油脂 （株） より購入） を 0. 1%0Gを含む HEPE S (pH8. 0) 緩衝液に溶解したものを添加した。 DSPE— 34HCS Iの添加量は GP I b の 10倍モル量とした。 4°Cで 16時間反応後に、 ゲル濾過 （担体はセフアデヅ クス G— 75、 フアルマシア社製） により 0Gを除去して、 リボソームを調製し た。 C s C 1密度勾配法による遠心分離を行って、 GP I bリボソームを回収し た。 その条件は以下のとおりである。 すなわち、 試料 1〜1. 5mLに Cs C l を溶解して 35 %濃度とし、 0. 5mLの 25%C s C 1および 0. lmLの生 理食塩水を重層し、 214000 X gで 10分間処理した。 リボソーム含有画分 を回収し、 透析膜 （分画分子量 1万ダルトン、 S l ide -A-Ly z e r 10 K、 P i e r c e社製） を用いて生理食塩水で一晩透析した。 調製した GP I b リボソームの P C濃度は 0. 61mg/mL、 GP Ib濃度は 0. 24mg/m L、 平均粒子径は 0. 25 /mであった。
実施例 2
1， 3, 4， 6—テトラクロ口一 3ひ， 6ひ一ジフエニルグリコゥリル 200 〃gにNa125I溶液 （448 MB q/mL) を 30〃L、 さらに GP I bを含む 生理食塩液 （ 100 mg/mL) を 100〃 L添加して室温で 10分間反応させ た。 さらに 25 mMの N a Iを 100 /L添加し、 ゲル濾過 （Mi c r oSp i nG— 25、 フアルマシア ·バイオテック社製） および限外濾過 （U 1 t r a f ree_MC 10K、 ミリポア社製） して、 ヨウ素標識 GP Ib (125I— GP I b) を調製した。
実施例 1の GP I bの代わりに上記 125I— GP I bを用いる以外は全て実施 例 1に準じて操作した。 調製した GP I bリボソームの P C濃度は 3. 54mg /mL、 0? 1 )3濃度は1. 00mg/mL、 平均粒子径は 0. 33〃m、 放射 活性は 9. 3 X 107c pm/mLであった。
実験例 1
GP Ibリボソームの凝集能を確認した。 実施例 1において調製した GP I b リボソームを PC濃度 0. 2mgZmLに調整した。 その溶液 200〃Lに 2m g/mLの vWF液 25〃Lを加えて 37°Cでィンキュベ一シヨンおよび攪拌し、 その 2分後に 15mg/mLのリストセチン液 25〃Lを混合した。 血小板凝集 計 （AG— 10、 興和株式会社製） を用いてィンキュベーシヨン直前から計 15 分間にわたり凝集塊を測定した。 凝集塊数に散乱強度を乗じたものの総和を算出 し、 凝集塊の生成の程度の指標とした。 結果を表 1に示す。
また、 対照として、 P E Gを介さない GP I bリボソーム （特開平 9— 208 599号公報の実施例 1に記載） を用いて、 同様の実験を行った。 結果を表 2に 示す。 表 1
Figure imgf000020_0001
本発明に係る GP I bリボソームは、 リストセチンの存在下で、 vWFと特異 的に反応し、 凝集塊を形成した。 このことから GP I bリボソームは血小板代用 剤として有用であることが判明した。 また、 本発明に係る GP I bリボソームは 対照品と比較して凝集能が改善されていることも判明した。
実験例 2
GP I bリボソームの血中動態を確認した。 Ha r t 1 e y系モルモット （例 数 3) に実施例 2で調製したヨウ素標識 GP I bリボソームを GP I bとして 1 mg/kg体重の投与量となるように大腿静脈内に投与した。 投与後 60分まで 経時的に眼窩から採血し、 その血液 100 /Lをガンマ一カウン夕一で計数 ( 1 分） した。 また、 対照として、 特開平 9— 208599号公報の実施例 1に記載 された、 PEGを介さない GP I bリボソームを用いて、 同様の実験を行った。 結果を表 3に示す。 表 3
Figure imgf000021_0001
本発明に係る G P I bリボソームは対照品と比較して血中での貯留性が改善さ れていることが判明した。
産業上の利用可能性
本発明の G P I b脂質複合体は vW Fと結合することができ、 また、 凝集を形 成することができる。 したがって、 血小板代用剤、 血管障害、 血管損傷および血 栓症等の予防 ·治療等の医薬品として、 あるいは v W F欠損症等を診断するため の診断薬、 生物学的 ·医学的な試薬、 血小板凝集抑制剤 ·抗血栓剤のスクリー二 ング用の試薬等として、幅広い実用化の可能性を有するものと期待される。また、 本発明の G P I b脂質複合体は、 血管損傷部位に特異的に集積する性質を有する ので、 血管損傷部位および血栓形成部位の検査用診断薬あるいは治療剤としても 極めて有用である。 さらに、 本発明の G P I b脂質複合体は血中での貯留性にも 優れており、 持続的な薬理作用の発現が可能となる。
本発明の G P I b—脂質結合体は、 本発明の G P I b脂質複合体の有効成分と して利用価値の高いものである。 本出願は、 日本で出願された特願 2 0 0 0— 5 7 4 4 9を基礎としており、 そ の内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims

請求の範囲
I. GP I bと脂質とがポリアルキレンォキサイ ド （以下、 「PAO」 という。） を介して結合した結合体。
2. GP Ibが、 GP lbそのもの、 GP I b断片、 0卩 113ひ鎖または0？ I bひ鎖断片である請求項 1記載の結合体。
3. GP Ibが、 GP I bと同程度のフォンヴィルブラント因子結合能を有す る類似体、 変異体、 修飾体、 誘導体または糖鎖付加物である請求項 1記載の結合 体。
4. GP I bが膜貫通部位を欠失したものである請求項 1記載の結合体。
5. 脂質が官能基を有するものである請求項 1記載の結合体。
6. 官能基を有する脂質が、 リン脂質、 糖脂質、 脂肪酸、 グリセライ ド、 コレ ステロールまたは両親媒性の脂質である請求項 5記載の結合体。
7. 官能基が、 アミノ基、 カルボキシル基、 チオール基またはアルデヒド基で ある請求項 5記載の結合体。
8. PAOが、 ポリエチレングリコール、 ポリプロピレングリコール、 または エチレンォキサイ ドおよびプロピレンォキサイ ドを共重合して得られるグリコー ルである請求項 1記載の結合体。
9. PAOが 100〜100000の数平均分子量を有する請求項 1記載の結 合体。
10. 0? 11)と？八0、 PAOと官能基を有する脂質が、 各々、 架橋剤を介 して化学的に結合したものである請求項 5記載の結合体。
I I. GP I bと P AOとの比がモル比で 1 : 1〜1 : 20でぁり、 ？八〇と 官能基を有する脂質との比がモル比で 1 ： 1である請求項 5記載の結合体。
12. 請求項 1記載の結合体および遊離の脂質を含有する複合体。
13. 複合体がリボソームの形態である請求項 12記載の複合体。
14. 遊離の脂質が、 リン脂質、 糖脂質、 コレステロール、 脂肪酸またはそれ らの誘導体である請求項 12記載の複合体。
15. GP I bと遊離の脂質との比がモル比で 1 ： 10〜 1 ： 1000である 請求項 12記載の複合体。
16. 複合体がリストセチンの存在下に凝集能を有する請求項 12記載の複合 体。
17. GP I bと脂質とが PAOを介して結合した結合体を調製後に、 当該結 合体と遊離の脂質との複合体を調製してなる請求項 12記載の複合体。
18. 請求項 12記載の複合体を含有する医薬組成物。
19. 医薬組成物が血小板代用剤である請求項 18記載の医薬組成物。
20. 医薬組成物が血管障害、 血管損傷または血栓症の予防または治療剤であ る請求項 18記載の医薬組成物。
21. 標識物質および請求項 12記載の複合体を有効成分とする検査または診 断のための薬剤。
22. 標識物質が放射性同位元素、 MR I用常磁性金属、 X線造影用ヨウ素化 合物、 蛍光物質または色素である請求項 21記載の薬剤。
23. 薬物および請求項 12記載の複合体を有効成分とする薬物含有組成物。
24. 薬物が止血剤、 血管収縮剤、 抗炎症剤、 血栓溶解剤、 抗血液凝固剤また は抗血小板剤である請求項 23記載の薬物含有組成物。
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