ES2291165T3

ES2291165T3 - Membrana microporosa hidrofila.

Info

Publication number: ES2291165T3
Application number: ES00124187T
Authority: ES
Inventors: Peter Dr. Zschocke; Anja Enderle; Michael Dr. Doser; Heinrich Prof. Dr. Planck
Original assignee: Deutsche Institute fuer Textil und Faserforschung Stuttgart
Current assignee: Deutsche Institute fuer Textil und Faserforschung Stuttgart
Priority date: 1999-11-10
Filing date: 2000-11-08
Publication date: 2008-03-01
Anticipated expiration: 2020-11-08
Also published as: EP1099468A3; DE19954158A1; JP2001200089A; DK1099468T3; EP1099468B1; ATE367855T1; DE50014508D1; EP1099468A2

Abstract

Membrana hidrófila microporosa en forma de un capilar, constituida por una polisulfona químicamente sustituida, que presenta grupos metilenohidroxilos ligados por covalencia, donde cada una de las unidades de polímero repetitivas presenta un grado de sustitución (DS) de 0,5 a 1,9 grupos metilenohidroxilos, la membrana presenta un espesor de 20 µm a 400 µm, una porosidad con respecto al volumen del 50% al 90% y un tamaño de poros que aumenta esencialmente en sección transversal, con lo cual el tamaño de poros está en el orden de entre 10 nm y 50 nm en la zona de poros más pequeños, la membrana presenta un límite de separación molecular de 5.000 Dalton a 100.000 Dalton y es envasada en estado estéril y húmedo.

Description

Membrana microporosa hidrófila.

La invención se refiere a membranas hidrófilas microporosas que son permeables para sustancias de bajo peso molecular, particularmente proteínas. Además, la invención se refiere a procedimientos para la producción de dichas membranas.

En muchos campos de la biotecnología, en la industria alimenticia y particularmente en la biomedicina resulta extraordinariamente interesante separar determinadas macromoléculas como por ejemplo enzimas, anticuerpos o determinadas hormonas o materias-señal de otras sustancias. Esto desempeña un papel por ejemplo en la limpieza de proteínas de agentes activos genéticamente preparados. También en el sector de la diálisis de pacientes con enfermedades del riñón o en la producción de capilares artificiales las características de separación de las membranas empleadas tienen una importancia extraordinaria.

Habitualmente, para las membranas, con cuya ayuda deben ser separadas las mezclas macromoleculares, se utilizan membranas microporosas a base de polímeros. Por regla general, dichas membranas presentan una estructura asimétrica.

La cara superior de una membrana de este tipo puede estar formada como una capa delgada de poros finos, de un espesor de 0,2 a 2 \mum, la membrana en sí. Esta membrana puede ser soportada por una infraestructura de un espesor de por ejemplo aproximadamente 50 a 200 \mum, la cual está estructurada con poros gruesos que aumentan hacia abajo.

Tales membranas asimétricas son fabricadas principalmente según un procedimiento denominado inversión de fases, desarrollado por Loeb y Sourirajan. Así, se disuelve un polímero en un disolvente y se extiende como una película y se precipita con un no disolvente, el llamado precipitante, y es precipitado a una membrana de inversión de fases. El precipitante puede ser mezclado ilimitadamente con el disolvente de polímero. Por lo tanto el disolvente es diluido cada vez más por el precipitante, hasta precipitar el polímero como membrana.

Según este procedimiento las membranas estructuradas de manera asimétrica pueden producirse a partir de diferentes polímeros solubles. Ejemplos de polímeros adecuados son acetatos de celulosa, poliamidas, poliolefinas, polisulfonas y polietercetonas. Según el agente precipitante empleado, se forma una determinada estructura de la membrana. Aquellos precipitantes que se diluyen con elevado calor de mezcla en los disolventes de polímero dan lugar a la formación de una membrana con estructura en forma de dedo. Los precipitantes con un calor de mezcla reducido por el contrario dan lugar a membranas de estructura esponjosa. Por lo tanto a través de la selección del precipitante o también del disolvente se puede ajustar la estructura de una membrana.

El mecanismo de separación de estas membranas se basa entre otras cosas en la exclusión de todas las macromoléculas que tengan diámetros más grandes que los diámetros de los poros de la cara superior de la membrana. Las macromoléculas con diámetros claramente más pequeños pueden permear principalmente la membrana. Este límite de separación molecular o límite de exclusión es definido de tal manera que un 90% de una molécula de prueba del tamaño conocido sea retenido por la membrana. Seleccionando correspondientemente los polímeros utilizados y las condiciones de producción de membranas puede establecerse un determinado límite de separación molecular.

En caso de una mera difusión, la fuerza motriz para el pasaje de las moléculas, es decir la permeación, es el gradiente de presión osmótico que actúa como transmembran o permeantes de las respectivas moléculas.

Las membranas de difusión usuales hasta ahora son generalmente hidrófobas. Esto es muy desventajoso sobre todo en la separación por difusión de proteínas de diferentes tamaños de molécula, puesto que las proteínas se adhieren en la superficie de la membrana y en la matriz de la membrana. Esto por un lado da lugar a la formación de capas de recubrimiento (incrustaciones) sobre la superficie de la membrana, por lo cual las características de las membranas son modificadas considerablemente. Además, los poros de la membrana son disminuidos u obstruidos completamente por la adsorción de proteínas. Con ello se reduce considerablemente o se impide completamente la intensidad del permeato. La funcionalidad de dichas membranas es por lo tanto muy limitada y sólo de corta duración. Principalmente tales membranas resultan inadecuadas para la separación difusiva de proteínas.

Se han realizado diferentes ensayos para emplear un material más hidrófilo para las membranas que evite estas características adsortivas negativas de las membranas convencionales. Las membranas basadas en un material hidrófilo como por ejemplo acetato de celulosa, no presentan sin embargo la estabilidad de temperatura necesaria y son sensibles a los agentes químicos o microbiológicos. Dichos materiales hidrófilos de membrana por lo tanto tampoco representan una solución al problema.

Como una solución posible se propuso modificar la matriz de las membranas hidrófobas por la adsorción de componentes hidrófilos, para poder proveer así una membrana con características antiadsortivas. Así se logró que las proteínas no fueran adsorbidas en solución, sino que fueron rechazadas más bien por la membrana y permanecieron en solución. Por consiguiente se evitó la formación de capas de recubrimiento sobre la superficie de la membrana. Por otra parte no podían conseguirse resultados satisfactorios respecto a la continuidad de las membranas para proteínas, por lo que sigue existiendo la necesidad de una membrana antiadsortiva que funcione bien y tenga una vida larga.

De la publicación de Möckel, Staude, Guiver, "Static protein absorption, ultrafiltration behavior and cleanability of hydrophilized polysulfone membranes" Journal of Membrane Science, Elsevier Science, Amsterdam, NL, vol. 158, Nº. 1-2, de 1 de Junio de 1999 se conocen unas membranas hidrófilas, producidas a partir de polisulfonas sustituidas con grupos carboxilos. Dichas membranas exhiben ya buenas características de separación con proteínas de bajo peso molecular. Aun en caso de escasas cantidades de proteína, la adsorción en la membrana sigue siendo demasiado grande. De la DE 19622338 A1 se puede deducir la producción de membranas similares, en la cual se logra una porosidad asimétrica en la producción de membranas por inversión de fases.

La US 4,797,457 describe generalmente la sustitución de polisulfonas con los sustituyentes más diferentes y su aptitud como membranas. También se describe en la misma la producción de las polisulfonas sustituidas con los grupos de carboxilos mencionados. También se menciona que la transformación de polisulfonas sustituidas con litio con aldehídos y cetonas produce polímeros con características hidrófilas. Sin embargo no se encuentran indicaciones para los problemas relacionados con la difusión de cantidades más pequeñas de proteínas.

En la US 5,837,234 se describen unos órganos bioartificiales, en los cuales están contenidas células vivas en membranas hidrófilas de polietersulfona. El material de membrana de polietersulfona puede ser fabricado por coextrusión mediante una boquilla anular en forma de tubo y tiene superficies internas y externas de poros finos, que están unidas por una estructura de soporte de poros abiertos.

La invención pretende producir una membrana que sea particularmente antiadsortiva para las proteínas y evite así las desventajas descritas en el estado de la técnica. La membrana en particular debe ser adecuada como membrana de difusión para pequeñas cantidades de proteína y para órganos biohíbridos. El objetivo se resuelve con una membrana microporosa hidrófila con las características descritas en la reivindicación 1. Las formas de realización preferidas de esta membrana están descritas en las reivindicaciones 2 a 4. En la reivindicación 5 se reivindica un procedimiento para la producción de dicha membrana hidrófila microporosa. Las formas de realización preferidas del procedimiento están representadas en las reivindicaciones 6 a 9. Las reivindicaciones 10 a 15 conciernen esencialmente la utilización de una membrana según la invención, incluyendo un órgano hueco biohíbrido (reivindicación 13). El texto de todas las reivindicaciones se toma por lo tanto como contenido de la descripción como referencia.

El objeto de la invención es una membrana hidrófila microporosa, en forma de un capilar de polisulfona químicamente sustituido, el cual presenta grupos metilenohidroxilos covalentes ligados, con lo cual cada unidad de polímero repetitiva comprende un grado de sustitución (DS) de 0,5 a 1,9 grupos metilenohidroxilos y la membrana presenta un espesor de 20 \mum a 400 \mum, una porosidad, con respecto al volumen del 50% al 90% y en sección transversal presenta un tamaño de poros esencialmente creciente, con lo cual el tamaño de poros es de entre 10 nm y 50 nm en la zona de poros más pequeños, y la membrana presenta un límite de separación molecular de 5.000 Dalton a 100.000 Dalton y es envasada en estado estéril y húmedo.

Modificando los polímeros hidrófobos en sí, que son químicamente muy estables y biocompatibles, se logra que una membrana producida a partir de estos polímeros sustituidos posea características hidrófilas y por lo tanto antiadsortivas. Por una parte se logra que la membrana según la invención tenga las características positivas en cuanto a estabilidad y vida de una membrana de polímeros hidrófobos y por otra parte la modificación de los polímeros conduce a una membrana que es adecuada particularmente para por ejemplo una separación difusiva de proteínas de diferentes tamaños de molécula. Contrariamente a las hidrofilizaciones convencionales de superficies de membranas hidrófobas en sí, la membrana según la invención presenta continuamente una estructura hidrófila. Con ello se evita una adsorción de proteínas tanto sobre la superficie como también en los poros o en la matriz de la membrana, de manera que los problemas descritos arriba de la vida corta y la obstrucción de los poros de las membranas convencionales no aparecen en la membrana según la invención.

La membrana según la invención tampoco se desgasta en caso de utilización a largo plazo, puesto que es maciza e hidrófila. En la membrana según la invención sorprendentemente tampoco se perjudica la resistencia de la membrana. Generalmente se parte de que una membrana de componentes hidrófilos no presenta la estabilidad de una membrana hidrófoba. Combinando los polímeros base hidrófobos con sustituyentes hidrófilos por una parte se combinan las características positivas, es decir la estabilidad y la duración de vida, de una membrana hidrófoba con las características antiadsortivas extraordinarias de una membrana hidrófila.

Como sustituyentes hidrófilos sirven los grupos metilenohidroxilos. Estos son adecuados particularmente, puesto que aquí la distancia entre el grupo OH hidrófilo y el polímero base hidrófobo es óptima para muchas aplicaciones.

Preferiblemente se utilizan polisulfonas aromáticas como polímeros base. Ejemplos de polímeros base especialmente adecuados son Polisulfona Udel® (PSU), Polifenilosulfona Radel® (PPSU), Polietersulfona Victrex® (PES), cuyos ejemplos de fórmulas estructurales de dichas unidades de polímeros base están representados en el esquema a).

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Esquema a)

1

La modificación de estos polímeros base con sustituyentes hidrófilos ocurre esencialmente según los métodos conocidos (DE 3636854 A1). El grado de sustitución (DS) es de 0,5 a 1,9 por unidad repetitiva. Variando las condiciones durante la derivatización, p.ej. de los reactivos, polisulfonas: butil-litio o el tiempo de permanencia del PEEK en ácido sulfúrico al 98% de concentración, se pueden sintetizar los derivados de polímero de diferentes grados de sustitución. Por encima de un grado de sustitución de 2 se puede perjudicar bajo ciertas circunstancias la estabilidad de la membrana o puede surgir una solubilidad indeseada.

La modificación del polímero base puede transcurrir por ejemplo según el siguiente esquema.

Esquema b)

2

El esquema b) muestra el método de metalización de las poliarilsulfonas disueltas o hinchadas en disolventes apróticos con n-butil-litio(BuLi) con temperaturas comprendidas entre -65ºC y -90ºC en atmósfera de argón con la sucesiva transformación de las poliarilsulfonas carbanionizadas con los enlaces electrófilos. Como enlace electrófilo se utiliza formaldehído.

La utilización de formaldehído genera una poliarilsulfona hidrófila metilenohidroxilada de las unidades representadas en el siguiente esquema c). Los polímeros base sustituidos representados son particularmente adecuados para las membranas según la invención. A partir de los diferentes polímeros derivatizados se pueden producir membranas capilares, laminares o tubulares, debido a su solubilidad en ácido carboxílico-N-alquilamidas y en N-metilpirrolidona(2).

Esquema c)

3

La sustitución se realiza en ortoposición con respecto al grupo sulfónico en los grupos fenilénicos adyacentes al grupo sulfónico, por lo cual preferiblemente cada grupo fenilénico no es sustituido más que una vez. Por regla general, los polímeros ya no presentan otros sustituyentes además de la sustitución en los grupos fenilénicos.

Los polímeros sustituidos según la invención son disueltos preferiblemente en un disolvente inerte que sea mezclable ilimitadamente con agua. La producción de las membranas puede realizarse por ejemplo según el procedimiento de hilatura en húmedo por inversión de fases con ayuda de hileras húmedas de 2 o 3 sustancias por precipitación con agua.

Las membranas según la invención, particularmente las membranas de difusión de polisulfonas hidrófilas aromáticas son permeables a las proteínas de bajo peso molecular con masas molares de hasta 20 000 Dalton o superiores y son impermeables a las proteínas de alto peso molecular con masas molares superiores a 100 000 Dalton. Durante la permeación o difusión sólo desempeña un papel esencial el tamaño de los poros de la membrana, es decir el límite de separación molecular de la membrana. La fuerza de impulsión para la permeación es el gradiente de presión osmótico transmembranario de los permeantes.

Generalmente, la permeación se realiza sin otra presión hidroestática. Sin embargo también es posible influir sobre la separación por aplicación de una presión o de un vacío.

Según los polímeros utilizados y las condiciones de producción de membranas se puede influir sobre el límite de separación molecular de la membrana resultante. Aquí están previstos límites de separación molecular de 5 000 Dalton a 100 000 Dalton. El límite de separación molecular elegido depende esencialmente de la aplicación planificada. Si la membrana debe ser continua por ejemplo para la insulina, es adecuada una membrana con un límite de separación molecular de aproximadamente 70 000 Dalton.

En una forma de realización preferida de la invención se trata de una membrana de un espesor extremadamente más pequeño. Aquí, el espesor de pared de la membrana es de 20 \mum a 400 \mum. Especialmente preferido es un espesor de pared de aproximadamente 40 \mum hasta aproximadamente 150 \mum. Con ello se logra que las proteínas puedan pasar la membrana de forma bastante rápida y completamente. Se disponen por lo tanto de vías de difusión bastante cortas, por lo cual el intercambio de material ocurre muy rápidamente. Según la invención, la membrana presenta una porosidad, por lo cual se permite la difusión o la permeación de proteínas. La porosidad de la membrana es del 50% al 90% con respecto al volumen total de la membrana. Según la aplicación deseada, particularmente la velocidad de permeación deseada, se puede variar la porosidad de la membrana. Generalmente, la velocidad de permeación disminuye en caso de una porosidad más escasa.

El límite de separación molecular de la membrana está determinado esencialmente también por el tamaño de los poros. El tamaño de los poros se encuentra por término medio entre 10 nm y 50 nm. La membrana presenta en sección transversal, es decir desde una superficie hasta la otra, un tamaño de poros medio esencialmente creciente hacia el exterior. Aquí, el tamaño de los poros más pequeños es de 10 nm a 50 nm.

Además de la hidrofilia propia de la membrana según la invención puede preferirse que junto a la hidrofilia instalada químicamente se prevea una saturación adicional de puntos de adsorción de la membrana. Una preadsorción de este tipo de la membrana da lugar a que las características antiadsortivas de la membrana aún se refuercen y se optimicen más. Además con ello se puede mejorar la biocompatibilidad de la membrana. En una forma de realización preferida, la membrana es preincubada con suero de ternero fetal (SFT).

A través de la preincubación con, por ejemplo suero de ternero fetal, se bloquean diferentes puntos de enlace no específicos de la membrana. Así se logra un efecto sinérgico que hace especialmente adecuada una membrana según la invención tratada de esta manera para su utilización en la técnica biomédica.

Según la invención, la membrana es embalada en estado estéril, por ejemplo soldada. Esto ocurre en estado húmedo de la membrana, por ejemplo después de una preincubación con suero de ternero fetal. La soldadura se realiza preferiblemente en láminas plásticas convencionales. Mediante la soldadura es posible almacenar y conservar las membranas según la invención durante un período prolongado. Las membranas son esterilizadas, para impedir una posible contaminación bacteriana. En una forma de realización preferida la esterilización ocurre por radiación gamma.

La invención comprende además un procedimiento para la producción de la membrana hidrófila microporosa. En este procedimiento de producción son sustituidos en primer lugar los polímeros base, los polímeros base sustituidos son disueltos en un disolvente y precipitados con al menos un agente precipitante mezclable con el disolvente. La sustitución de los polímeros es realizada con formaldehído, que introduce al menos un grupo hidroximetilo. De esta manera se obtiene una membrana que consiste en principio en polímeros base hidrófobos, que presenta en su conjunto características hidrófilas por sustitución, es decir por introducción de grupos hidrófilos. Dicha membrana es particularmente adecuada para la difusión o permeación de proteínas de determinado peso molecular, puesto que aquí las ventajas con respecto a las membranas basadas en la estabilidad de polímeros hidrófobos se enlazan con las características hidrófilas introducidas por modificación, con lo cual se puede proveer una membrana estable pero extremadamente antiadsortiva.

El grupo metilenohidroxilo obtenido por conversión con formaldehído, presenta características especialmente favorables en cuanto a la hidrofilia, junto con una separación óptima, es decir la distancia entre el grupo hidrófilo y el polímero base.

Respecto a otras características del procedimiento según la invención se indica la descripción arriba citada.

La modificación de los polímeros base ocurre esencialmente según los métodos conocidos. Preferiblemente esta ocurre por metalización directa (intercambio H/Li) o por un intercambio de halógeno-metal.

Mediante la elección del precipitante se puede influenciar la distribución de los poros, particularmente de poros de diferentes tamaños, en sección transversal de la membrana. Aplicando agua como agente precipitante se puede producir una membrana con estructura asimétrica, que presenta un tamaño de poros esencialmente creciente en sección transversal de una superficie a la otra. Aquí, la superficie con poros más pequeños sirve de membrana en sí. La sección con tamaño de poros creciente sirve de estructura de soporte o de matriz.

La producción de membranas capilares estructuradas en forma de dedo ocurre preferiblemente por disolución de los polímeros sustituidos según la invención en un disolvente inerte que es mezclable con agua. Con ayuda de hileras húmedas de 2 o 3 sustancias pueden producirse membranas capilares estructuradas en forma de dedo por precipitación con agua libres de disolventes de polímero.

Mediante la precipitación con agua conteniendo aproximadamente del 20% al 60% del disolvente inerte de polímero se pueden producir unas membranas capilares con mezclas de estructura esponjosa y en forma de dedo.

Un campo de aplicación preferido de las membranas según la invención es la técnica biomédica. Sobre todo en vista a la fabricación de biorreactores y órganos biohíbridos, que son introducidos en un organismo, las membranas según la invención forman un material sumamente apropiado, puesto que en estas membranas una larga vida está vinculada a unas características funcionales óptimas.

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Otro campo de aplicación es el sector de lavado de sangre o la diálisis. Junto a las características funcionales en sí de la membrana es también siempre ventajosa la biocompatibilidad de las membranas según la invención.

Además, las membranas según la invención son adecuadas de manera sobresaliente para una llamada liberación de sustancia activa en el organismo. Un ejemplo de dicha liberación de sustancia activa es el páncreas biohibrido. Aquí se forma, bajo la aplicación de las membranas según la invención, un órgano artificial en forma de una cámara que aloja células del islote a transplantar. Estas células del islote producen insulina, la cual, debido a las características antiadsortivas de la membrana, abandona esta cámara, cuyas limitaciones al menos están formadas parcialmente por la membrana según la invención, y puede ser absorbida en el organismo.

Según la invención, este órgano artificial, es decir la cámara, está formada como capilar, dentro de la cual se encuentran las células del islote. El órgano artificial por ejemplo consiste en una membrana de difusión capilar microporosa helicoidal en un tubo flexible, que está estabilizada por un vellón en aerosol de poliuretano. Dicho capilar es introducido en un vaso sanguíneo. Por permeación transmembranaria, la glucosa y sustancias nutrientes esenciales pueden pasar de la corriente sanguínea al interior capilar y así pueden alimentar las células del islote con los nutrientes necesarios. De esta manera, la glucosa accede también a la cámara. Las células del islote producen insulina a causa del estímulo de la glucosa. La insulina pasa a la corriente sanguínea por medio de la membrana según la invención a causa de la precipitación por concentración. También otras proteínas de bajo peso molecular segregadas por las células del islote entran de esta manera en la corriente sanguínea.

Ventajosamente, el límite de separación molecular de la membrana dentro de un órgano biohibrido de este tipo es elegido de tal manera que la globulina inmune no pueda pasar de la corriente sanguínea al capilar. Esto se logra por un límite de separación molecular de la membrana de aproximadamente 100000 Dalton. De esta manera se evita que las células del islote transplantadas dentro del órgano biohíbrido sean atacadas por el sistema inmunológico y provoquen por lo tanto una reacción de rechazo.

Una forma preferida para un páncreas biohíbrido es la capilar, puesto que en la forma capilar se realiza una densidad de espacio máxima en caso de una densidad máxima de superficie de difusión. Un lumen capilar preferido es de aproximadamente 600 hasta aproximadamente 800 \mum. El espesor de pared ventajosamente es de aproximadamente 40 a 120 \mum.

Las membranas convencionales no son adecuadas para la utilización en un órgano biohíbrido, particularmente en un páncreas biohíbrido. El problema particular se encuentra aquí en las cantidades de proteína muy reducidas, que, en las concentraciones fisiológicas que surgen se mueven en el orden de nMol/l. En por ejemplo membranas hidrófobas modificadas en superficies (hidrofilización adsortiva) o membranas de polímeros base sulfonizados, las cantidades de proteína muy reducidas son casi completamente adsorbidas por la membrana, de modo que puede pasar poca hasta incluso ninguna proteína deseada, particularmente insulina, por la membrana. Esto muestran los resultados de Fane et. Al., Desalination 53, 37, 1985. Según mediciones propias de difusión de insulina lo mismo rige para membranas capilares de PSU sulfonizado de grados de sustitución prácticamente relevantes (DS) hasta DS 0,76. Las membranas según la invención son sin embargo sumamente adecuadas para esta aplicación, según lo justifican los resultados de medición mostrados en los ejemplos.

Otro campo de aplicación preferido de las membranas según la invención se encuentra en los biorreactores, por ejemplo para el fraccionamiento de proteínas o para la limpieza de proteínas de por ejemplo agentes activos fabricados genéticamente.

Además, las membranas según la invención pueden emplearse también muy ventajosamente en el sector del cultivo celular.

Además, la utilización de la membrana según la invención es especialmente adecuada en todos los sistemas en los cuales juegue un papel la secreción de proteínas por células vivientes. Aquí, las células son soportes para las membranas, por lo cual las células similares o diferentes pueden ser situarse sólo en uno o ambos lados de la membrana. Dichos sistemas pueden emplearse por ejemplo como transplantes. La membrana puede separar el sistema en compartimentos, dentro de los cuales transcurren diferentes circulaciones de diferente función (p. ej. la circulación de sangre/plasma y de nutrientes). Mediante los correspondientes límites de exclusión moleculares, la membrana procura que los compartimentos delimitados por la membrana estén aislados con respecto al sistema inmunológico. Esto juega un papel fundamental, particularmente cuando con ayuda de los compartimentos formados por la membrana se introducen células que provienen de otro organismo en un paciente.

Además del páncreas biohíbrido ya mencionado, son posibles también otros sistemas de liberación de sustancia activa utilizando la membrana según la invención. Estos pueden ser sistemas que se disuelven lentamente solos en el cuerpo. Además son posibles sistemas que contengan células vivientes, que han sido manipuladas por ejemplo genéticamente, de tal manera que sinteticen permanentemente determinadas sustancias activas y las liberen por la membrana según la invención en el organismo, preferiblemente en la circulación de sangre. Estos agentes activos son generalmente proteínas, por ejemplo citoquinas. Dicho sistema es por ejemplo una membrana capilar implantable, que contiene células que segregan permanentemente factores analgésicos.

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Además, utilizando la membrana según la invención puede proveerse un hígado biohíbrido, que puede ser empleado para la terapia de pacientes en coma hepático. En este caso, el hígado está dañado de tal manera que ya no puede tener lugar una suficiente desintoxicación del cuerpo. El hígado biohíbrido asume la desintoxicación hasta que por ejemplo haya un transplante disponible o se haya regenerado el hígado del paciente.

Además, la membrana según la invención puede emplearse para analizar la comunicación de diferentes tipos celulares (p. ej. del sistema inmunológico) mediante sustancias mensajeras, preferiblemente citoquinas. En dichos sistemas Transwell, la membrana separa dos tipos celulares diferentes que por ejemplo pueden estimularse mutuamente. Las características extremadamente antiadsortivas de las membranas según la invención son aquí de un significado particular, puesto que sólo se vierten unas cantidades extremadamente pequeñas de sustancias mensajeras, que serían adsorbidas por las membranas convencionales y harían así completamente imposible dicho análisis.

Se deducen las características descritas así como otros detalles de la invención de la siguiente descripción de unos ejemplos de realización en relación con las reivindicaciones secundarias. Las figuras muestran:

Fig. 1 índices de difusión de insulina de membranas capilares de PSU hidrofilizadas por adsorción y metilenohidroxiladas. Las membranas PSU hidrófilas metilenohidroxiladas (capilares 200 y capilares 400) muestran claramente con creciente grado de sustitución unos índices más altos de difusión de insulina en caso de fases de latencia más corta (fase de retardo) como aquellas de PSU pura (capilar 1001) o de PSU hidrofilizada por adsorción con PVP (capilar 80Br).

Fig. 2 índices de difusión de insulina para membranas capilares de PSU carboxiladas con diferentes grados de sustitución. Las membranas PSU carboxiladas muestran claramente con creciente grado de sustitución unos índices de difusión de insulina más altos en caso de fases de latencia más cortas.

Fig. 3 índices de difusión de insulina de membranas capilares PSU hidrofilizadas por adsorbión, hidrófilas y puras, respectivamente preincubadas con SFT. Las membranas preincubadas con SFT de PSU hidrófilas metilenohidroxiladas (capilares 400), hidrofilizadas por adsorbción con PVP y puras muestran, en comparación con las membranas no preincubadas, mejores índices de difusión de insulina y fases de latencia más cortas. Aquí, la membrana hidrófila (capilar 400) muestra mejores índices de difusión de insulina que las membranas de PSU hidrofilizadas por adsorción y puras.

Fig. 4 comparación de índices de difusión de insulina de membranas capilares de PPSU metilenohidroxiladas y carboxiladas con y sin preincubación. La comparación muestra que las membranas preincubadas con SFT de PPSU metilenohidroxiladas (capilares 219) y carboxiladas (capilares 218) muestran claramente mejores índices de difusión de insulina que las membranas no preincubadas.

Fig. 5 Influencia del polímero capilar sobre la secreción de insulina inducida con glucosa de islas de ratas macroencapsuladas y libremente flotantes. La comparación con el control (islas de ratas libremente flotantes) muestra, que incluso una membrana metilenohidroxilada relativamente poco sustituida (capilar 200) es esencialmente más permeable a la insulina que sólo una (PSU/NDS) hidrofilizada por adsorción.

Ejemplos Ejemplo 1 Síntesis de la PSU metilenohidroxilada Udel®

En un matraz de cuatro cuellos de 6 I, se disuelve bajo argón 132 g de PSU 300,8 \cong mMol en 4 l de tetrahidrofurano (THF). La solución clara y amarillenta es enfriada a -65ºC y se le añade gota a gota en el plazo de 20 min. 66,4 ml 10M de n-butil-litio (BuLi) \cong 664 mMol. Así la solución se vuelve primero verdosa y luego marrón rojiza. Se vuelve a agitar entre -65ºC y -80ºC durante 1,5 horas y luego se añade 56 g de formaldehído = 1700 mMol, obtenido por termolisis de paraformaldehido, disuelto en 1,5 l THF, igualmente preenfriado entre -65ºC y -80ºC. Muy lentamente y bajo calentamiento continuo a temperatura ambiente se obtiene una mezcla amarillenta heterogénea (PSU\cdotCH_{2}OLi). Esta es transferida al enlace hidroxílico por acidificación con ácido clorhídrico al 37% de concentración (HCl), lo cual es reconocible porque la precipitación se disuelve completamente. El THF es destilado y el polímero absorbido en 500 ml de N,N-dimetilacetamida (DMAc). La solución DMAc es vertida en 500 ml de agua completamente desalada (agua VE), por lo cual se precipita el polímero que es desmenuzado en el mezclador de laboratorio. Una vez filtrado el polímero, este es lavado tres veces con agua VE hirviendo y secado por la noche en el armario secador a 105ºC.

Se obtiene una PSU metilenohidroxilada no reticulada.

Termolisis del oaraformaldehído

Aprox. 60 g de paraformaldehido son calentados en un matraz de triple cuello a 160ºC y el formaldehído monómero que se produce es introducido con una corriente débil de argón en un THF, en el cual se disuelve y se enfría entre
-65ºC a -80ºC. Los grupos OH de los grupos de hidroximetileno fueron verificados de manera espectroscópica.

Determinación del grado de sustitución (DS) mediante una espectroscopia ^{1}H-NMR

Se disolvió una muestra del polímero seco en dimetilsulfóxido deuterizado (DMSO) y se registró el espectro ^{1}H-NMR. Mediante una relación de la integral de los grupos de metileno a la integral de los grupos de metilo de la unidad de isopropilideno de la PSU se obtuvo un DS de 1,9.

Ejemplo 2 Variación del ejemplo 1

Síntesis y Analítica según se describe en el ejemplo 1 con las diferencias de que 132 g de PSU = 300,8 mMol son transformados con 24,5 ml 10M de BuLi = 245 mMol y la PSU metalizada ha sido captada con 21 g de formaldehído = 627 mMol. El análisis espectroscópico ^{1}H-NMR dio como resultado PSU terminada con metilenohidroxilo con un DS de 0,7.

Ejemplo 3 Síntesis de PPSU carboxilada (ejemplo comparativo)

Bajo argón se hinchan, a temperatura ambiente en un matraz de cuatro cuellos de 2 l, 30 g de PPSU \cong 75,0 mMol, que ha sido precipitada de su solución en DMAc con agua VE, con 1,2 l THF. La suspensión es enfriada a -78ºC, a la cual se añade gota a gota en un plazo de 20 min. 9 ml 10M BuLi \cong 90 mMol. Entonces se vuelve a agitar a -78ºC durante 30 min. y bajo agitación intensiva a -78ºC se introduce CO_{2}. La suspensión por lo tanto se vuelve más clara, hasta que se forma una masa incolora uniforme. Bajo agitación se deja calentar a temperatura ambiente. Entonces, la suspensión (PPSU-COOLi) es transformada en la forma de ácido carboxílico por acidificación con HCl a una concentración del 37%. El THF es destilado y el polímero cargado en 200 ml DMAc y reelaborado según el ejemplo 1. Se obtiene una PPSU no reticulada y terminada con carboxilo.

La transformación ha sido verificada de manera espectroscópica IR y ^{1}H-NMR.

Ejemplo 4 Síntesis de PPSU metilenohidroxilada

Bajo argón se hinchan, dentro de un matraz de 2 l de triple cuello, 30 g de PPSU \cong 75 mMol en 1,2 l de THF. Durante el enfriamiento a -78ºC se obtiene una suspensión muy hinchada, a la cual se añade gota a gota en un plazo de 20 min. 9 ml 10M BuLi \cong 90 mMol. Se vuelve a agitar a -65ºC durante 0,5 horas y luego se añaden 12 g de formaldehído (\cong 400 mMol), según se describe en el ejemplo 1, disuelto en 0,8 l de THF, preenfriado a -65ºC. Bajo agitación se deja calentar a temperatura ambiente y el enlace de litio obtenido con HCl a una concentración del 37% se transforma a la forma de hidróxilo. El THF es destilado y el polímero es añadido en 200 ml DMAc y es reelaborado según lo descrito bajo el ejemplo 1.

Se obtiene una PPSU no reticulada metilenohidroxilada.

La transformación es verificada de manera espectroscópica IR y ^{1}H-NMR.

Ejemplo 5 Síntesis de PES carboxilada (ejemplo comparativo)

20 g \cong 86,3 mMol de PES han sido hinchados durante una hora a temperatura ambiente en 1 l de 1,3-Dioxolano secado por medio de una criba molecular 4\ring{A}. Después del enfriamiento a -78ºC se añadió gota a gota y bajo agitación 10,4 ml 10M BuLi = 104 mMol y se reagitó durante 3 horas más, cuando la suspensión inicialmente incolora cambió a beige pardo. Luego se introdujo CO_{2} a -78ºC, cuando la suspensión se esclareció considerablemente. Tras el calentamiento a temperatura ambiente se acidificó con HCl a una concentración del 37%, se destiló el dioxolano, se recogió el residuo en DMAc y se reelaboró según lo descrito bajo el ejemplo 1.

La transformación es verificada de manera espectroscópica IR y ^{1}H-NMR.

Ejemplo 6 Producción de membranas capilares con estructura de dedo

De los polímeros previamente citados se prepararon las soluciones fundidas con un 20% de contenido en polímero en 75% DMAc y 5% LiCl y se elaboraron con hileras húmedas de 2 o 3 sustancias (desarrollos propios, parcialmente en colaboración con la empresa Lechler, Metzingen, Alemania) con un precipitante, obteniendo membranas capilares asimétricas según el principio de inversión de fases. En este caso, la solución fundida de polímero ha sido pasada por una boquilla anular exterior y puesta en contacto con precipitantes, que han sido transportados por una boquilla interior central. Una vez recorrida una carrera de precipitación libre definida, se sumergieron los capilares en un baño de precipitación exterior con agua VE para un intercambio ulterior disolvente-precipitante, que se completó por enjuague de las membranas capilares por la noche con agua corriente del grifo.

Las membranas capilares tenían una capa de piel situada en el interior y una capa de soporte exterior. Sus luminas ascendieron a entre 650 y 850 \mum con espesores totales de pared extremadamente reducidos de entre 40 y 100 \mum según la medida de una suficiente estabilidad mecánica.

Variando los parámetros de hilatura

\bullet: relación del diámetro de la boquilla anular con el diámetro exterior de la boquilla interior

\bullet: relación de las cantidades de solución fundida con las cantidades de precipitantes

\bullet: altura de precipitación se pueden variar los lúmenes capilares y espesores de pared.

Ejemplo 7 Producción de las membranas capilares con estructura esponjosa parcial

El modo de proceder fue el del ejemplo 7 con la diferencia de que se precipitó con soluciones con una concentración del 20 al 60% de DMAc en agua VE. De esta manera se produjeron membranas capilares con aumento de la parte de estructura esponjosa cuanto mayor era el contenido en DMAc en el precipitante.

Ejemplo 8 Determinación de los índices de difusión de insulina

Las muestras de membrana capilar de PSU, con PSU hidrolizada con polivinilpirrolidona (PVP) y de PSU hidrófila fueron respectivamente llenadas con una solución de 239 U/l (1.434 Mol) de insulina en tampón de Tris/HCl, pH 7,4, obturadas por ambos lados, suspendidas en vasos agitados imantados con cada vez 80 ml de tampón puro de Tris/HCl, pH 7,4 (fase exterior) y se averiguaron de manera inmunológica-fotométrica (ELISA[DAKO insulina]) los índices de difusión para la insulina como cantidad en función del tiempo de la insulina permeada en % de la cantidad total de insulina presente en la membrana.

Los resultados representados en las figuras 1 a 4 justifican que:

\bullet: Las membranas PSU hidrófilas metilenohidroxiladas muestran con DS creciente claramente unos índices más altos de difusión de insulina con fases de latencia más cortas que las de una PSU pura o una PSU hidrofilizada con PVP por adsorción (Fig. 1).

\bullet: Las membranas de PSU carboxilada muestran a partir de un DS de 0,8 igualmente unos índices más altos de difusión de insulina y fases de latencia más cortas que las de una PSU pura o una PSU hidrofilizada con PVP por adsorción. Una comparación muestra que las membranas de una PSU metilenohidroxilada presentan mejores índices de difusión de insulina y fases de latencia más cortas que las membranas de una PSU carboxilada con grados de sustitución comparables. Esto puede explicarse con un efecto hidrófilo mejor del espaciador CH_{2} entre el anillo aromático y el grupo OH en la PSU metilenohidroxilada (Figs. 1 y 2).

\bullet: En membranas preincubadas con SFT con una PSU hidrófila metilenohidroxilada (capilares 400), hidrofilizadas con PVP por adsorción y pura se lograron efectivamente en todo caso mejores índices de difusión de insulina y fases de latencia más cortas, pero con la diferencia cualitativa de que la membrana hidrófila presentó índices de difusión de insulina esencialmente mejores que las membranas de PSU hidrofilizada por adsorción y pura, cuyos valores en la sucesión arriba citada dentro del tiempo de difusión prácticamente relevante de 30 min. fueron cada vez peores. Se logró el mejor índice de difusión de insulina y una fase de latencia extremadamente corta de aprox. 1,7 min. con el capilar 400 de PSU metilenohidroxilada, el polímero con grupos hidroxilos espaciados en la cadena de polímero (Fig. 3).

\bullet: Una comparación de los índices de difusión y de las fases de latencia de la membrana hidrófila capilar 400 con y sin preincubación con SFT (Figs. 1 y 3) muestra que la combinación de la sustitución de los polímeros base con grupos hidrófilos, particularmente con grupos metilenohidróxilos, y la preincubaci6n con SFT lograron los mejores índices de difusión para proteínas de bajo peso molecular, como la insulina, y se lograron las fases de latencia más cortas.

\bullet: Ambas preparaciones actúan de manera sinérgica sobre la difusión transmembranaria de proteínas de bajo peso molecular.

\bullet: Del mismo modo se ensayaron membranas capilares de PPSU metilenohidroxilada (capilares 219) y de PPSU carboxilada (capilares 218) con y sin preadsorción con SFT sobre la permeabilidad a la insulina. Los resultados (Fig. 4) confirman los diagnósticos de las correspondientes membranas de PSU. Sólo la combinación de la sustitución de PPSU con grupos hidrófilos y la preadsorción con SFT conduce a índices óptimos de difusión de insulina.

Ejemplo 9 Determinación de la difusión de insulina de células del islote en membranas macroencapsuladas tras el estímulo de glucosa in vitro

Se llenaron cada vez 50 células del islote de ratas recién aisladas en solución tamponada de KREBS-RINGER-HEPES con pH 7,4 con 3 mMol/l de glucosa en las muestras de membranas capilares preincubadas con SFT de PSU metilenohidroxilada (DS = 0,75) y de PSU hidrofilizada por adsorción con dodecilsulfato de sodio (NDS), obturadas por ambos lados (macroencapsuladas) y perifundidas en la misma solución tamponada (fluido externo). Tras la estimulación entre el minuto 30 y 45 aumentando la cantidad de glucosa a 16,7 mMol/l se determinó de manera radioinmunológica (RIA) la insulina segregada por las células del islote y difundida de manera transmembranaria y se comparó con la segregación de la insulina en el fluido externo de las células del islote libremente flotantes sin barrera de membrana (control).

Los resultados, valores medios de cada vez 7 series de medida, representados en la figura 5 muestran que incluso una membrana metilenohidroxilada, relativamente poco sustituida, para insulina es esencialmente más permeable que una membrana hidrofilizada sólo de manera adsortiva.

Ejemplo 10 Determinación del límite de separación molecular

Se llenaron 3 muestras de las membranas capilares de PSU metilenohidroxilada, DS = 1,7 con respectivamente 100 \mul de una solución de albúmina con una concentración del 20% (fracción bovina V, peso molar 69000 g/mol) en un tampón Tris-HCl de 10 mMol, pH 7,4 y dializadas contra 80 ml de la misma concentración de tampón durante 120 min.

En los ensayos de dialisato no pudo verificarse de manera fotométrica ninguna albúmina (determinación total de proteínas con reactivo de color Bio Rad Nº. 016953 con 595 nm).

El límite de separación molecular de las membranas debe establecerse por lo tanto a \leq 69 000.

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Documentos relacionados en la descripción

Esta lista de documentos relacionados por el solicitante fue recopilada exclusivamente para la información del lector y no forma parte del documento de patente europea. La misma ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin embargo no asume responsabilidad alguna por eventuales errores u omisiones.

Documentos de patente relacionados en la descripción

\bullet DE19622338 A1 [0012]: \bullet US 5837234 A [0014]

\bullet US 4797457 A [0013]: \bullet DE 3636854 A1 [0021]

Literatura no relacionada con patentes indicada en la descripción

\bullet Static protein absorption, ultrafiltration behavior and cleanability of hydrophilized polysulfone membranes. MÖCKEL; STAUDE; GUIVER. Journal of Membrane Science. Elsevier Science, 01, de Junio 1999 vol. 158 [0012].

Claims

1. Membrana hidrófila microporosa en forma de un capilar, constituida por una polisulfona químicamente sustituida, que presenta grupos metilenohidroxilos ligados por covalencia, donde cada una de las unidades de polímero repetitivas presenta un grado de sustitución (DS) de 0,5 a 1,9 grupos metilenohidroxilos, la membrana presenta un espesor de 20 \mum a 400 \mum, una porosidad con respecto al volumen del 50% al 90% y un tamaño de poros que aumenta esencialmente en sección transversal, con lo cual el tamaño de poros está en el orden de entre 10 nm y 50 nm en la zona de poros más pequeños, la membrana presenta un límite de separación molecular de 5.000 Dalton a 100.000 Dalton y es envasada en estado estéril y húmedo.

2. Membrana según la reivindicación 1, caracterizada por el hecho de que las polisulfonas son polisulfonas aromáticas, particularmente polifenilenosulfonas.

3. Membrana según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por el hecho de que la membrana presenta un espesor de 40 \mum a 150 \mum.

4. Membrana según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por el hecho de que la membrana es además saturada en adsorción, preferiblemente con suero de ternero fetal.

5. Procedimiento para la producción de una membrana hidrófila microporosa según una de las reivindicaciones anteriores, comprendiendo esencialmente las siguientes etapas:

a): sustitución de polímeros de polisulfona con la introducción de grupos metilenohidroxilos,

b): disolución de los polímeros en un disolvente,

c): formación de la membrana, particularmente por aplicación de la solución sobre un soporte o por un proceso de hilatura,

d): precipitación con al menos un agente precipitante mezclable con el disolvente con formación de una membrana con un tamaño de poros esencialmente creciente en sección transversal.

6. Procedimiento según la reivindicación 5, caracterizado por el hecho de que la sustitución se efectúa bajo la utilización de formaldehído.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 5 ó 6, caracterizado por el hecho de que los polímeros son activados antes de la sustitución, preferiblemente con al menos un compuesto a base de litio.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 5 a 7, caracterizado por el hecho de que el polímero es sustituido en los grupos fenilénicos adyacentes al grupo sulfónico en ortoposición con respecto al grupo sulfónico, con lo cual cada grupo fenilénico preferiblemente ya no es sustituido más que una vez.

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones 5 a 8, caracterizado por el hecho de que se utiliza agua como agente precipitante.

10. Utilización de la membrana hidrófila microporosa según al menos una de las reivindicaciones 1 a 4 para la separación por difusión de proteínas.

11. Utilización de la membrana hidrófila microporosa según una de las reivindicaciones 1 a 4 para la diálisis.

12. Utilización de la membrana hidrófila microporosa según al menos una de las reivindicaciones 1 a 4 para la producción de un órgano hueco biohíbrido con al menos una cámara para recibir células de un órgano, con lo cual las paredes de la cámara están formadas al menos parcialmente por la membrana.

13. Órgano hueco biohíbrido con al menos una cámara para recibir células de un órgano, caracterizado por el hecho de que las paredes de la cámara están formadas al menos parcialmente por una membrana hidrófila microporosa según una de las reivindicaciones 1 a 4.

14. Utilización según la reivindicación 12 caracterizada por el hecho de que el órgano hueco biohíbrido es un páncreas biohíbrido.

15. Utilización de la membrana hidrófila microporosa según una de las reivindicaciones 1 a 4 para el intercambio de sustancias.