ES2285989T3

ES2285989T3 - Inhibidores no covalentes de la uroquinasa y de la formacion de vasos sanguineos.

Info

Publication number: ES2285989T3
Application number: ES00126874T
Authority: ES
Inventors: Joseph Edward Semple; Michael I. Weinhouse; Odile Ester Levy; Edwin L. Madison
Original assignee: Wilex AG
Current assignee: Heidelberg Pharma AG
Priority date: 2000-08-11
Filing date: 2000-12-07
Publication date: 2007-12-01
Anticipated expiration: 2020-12-07
Also published as: EP1182207A3; EP1182207B1; DE60034447D1; DE60034447T2; KR20020063562A; US6586405B2; EP1808440A1; US20020037857A1; EP1182207A2; ATE517910T1; IL149042A; ZA200202825B; ATE360028T1; KR100879673B1; EP1808440B1

Abstract

Un compuesto con la **fórmula**, en el que: (a) X se selecciona de entre el grupo que consiste en -S(O)2-, N(R'')-S(O)2-, -(C=O)-, -OC(=O)-, -NH-C(=O)-, -P(O)(R'')-, y un enlace directo, en el que R'' es independientemente hidrógeno, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, arilo de 6 a 14 átomos de carbono o aralquilo de 7 a 16 átomos de carbono, con la excepción de que cuando X es -P(O)(R'')-, entonces R'' no es hidrógeno; (b) R1 se selecciona de entre el grupo que consiste en (1) alquilo de 1 a 12 átomos de carbono que está opcionalmente sustituido con Y1 y/o Y2; (2) alquilo de 1 a 3 átomos de carbono sustituidos con cicloalquilo de 3 a 8 átomos de carbono que está opcionalmente, mono-, di- o tri-sustituido con Y1, Y2 y/o Y3; (3) cicloalquilo de 3 a 15 átomos de carbono que está opcionalmente, mono-, di- o tri-sustituido en el anillo con Y1, Y2 y/o Y3; y (4) heterocicloalquilo de 4 a 10 átomos en el anillo con los átomos del anillo seleccionados de entre carbono y heteroátomos, en el que los heteroátomos se seleccionan de entre el grupo que consiste en oxígeno, nitrógeno, y S(O)i, en el que i es 0, 1 o 2, que está opcionalmente mono-, di- o tri-sustituido en el anillo con Y1, Y2, y/o Y3; (5) heterociclo de 4 a 10 átomos en el anillo con los átomos del anillo seleccionados de entre carbono y heteroátomos.

Description

Inhibidores no covalentes de la uroquinasa y de la formación de vasos sanguíneos.

La uroquinasa es una enzima que está involucrada en la metástasis de las células tumorales, la neovascularización, y otras actividades. Un propósito de la presente invención es proporcionar nuevos compuestos que sean activos como inhibidores de la uroquinasa que puedan utilizarse para inhibir la actividad de la uroquinasa y por lo tanto atenuar sus efectos deletéreos. Otro propósito de la presente invención es proporcionar nuevos compuestos que inhiban la formación de vasos sanguíneos, concretamente la formación de vasos sanguíneos en relación a un estado patológico.

El Activador del plasminógeno de tipo urinario (uPA; uroquinasa) es una serin-proteasa de la familia de la tripsina/ quimiotripsina. En estado fisiológico, el uPA se encuentra en tres formas: pro-uPA de cadena sencilla, uPA de dos cadenas y uPA de bajo peso molecular (no presenta los dominios N-terminal). El zimógeno, pro-uPA, se convierte en uPA a través de la escisión del enlace peptídico en K158-I159. El uPA de dos cadenas resultante está unido por puentes disulfuro, tiene una masa de alrededor de 50 kD, y un dominio serin-proteinasa en C-terminal.

La actividad del uPA se centra en las superficies celulares tras la unión a su receptor, uPAR. El uPAR es un receptor glicosil fosfatidil inositol (GPI) de cadena sencilla anclado a la membrana. Los 92 aminoácidos del extremo N-terminal del uPAR tienen un papel esencial en su unión al uPA y pro-uPA. El receptor del uPA se localiza en las células T, células NK, monocitos y neutrófilos, así como en las células del endotelio vascular, fibroblastos, células de la musculatura lisa, queratinocitos, trofoblastos de la placenta, hepatocitos y una amplia variedad de células tumorales.

Tras la conversión de pro-uPA a uPA, que ocurre principalmente en el uPAR sobre la superficie celular, el uPA activa el plasminógeno a plasmina. La activación ocurre tras la escisión en los residuos PGR-VV del plasminógeno humano, o en los residuos SGR-IV del plasminógeno bovino. Como el plasminógeno también está presente sobre la superficie celular, esta cascada de activación sitúa la actividad del u-PA y la plasmina sobre la membrana plasmática. La plasmina tiene diferentes funciones, lo que incluye la activación de uPA adicional y otras enzimas, la digestión de la fibrina y la digestión de componentes de la matriz extracelular (MEC).

La digestión de la MEC que rodea un tumor elimina la barrera física para la metástasis de las células, que entonces pueden abandonar libremente los tumores primarios e invadir lugares secundarios. Se proporciona una revisión del papel del sistema uPA/ uPAR en la metástasis tumoral en "The Uroquinase-type Plasminogen Activator System in Cancer Metastasis: A Review", Andreasen et al., Int. J. Canc. 72:1-22 (1997).

Se ha detectado una correlación entre un nivel elevado de uPA y una tasa elevada de metástasis, y mal pronóstico, en ciertos tumores, especialmente en cáncer de mama [Quax et al., J. Cell Biol. 115:191-199 (1991); Duffy et al., Cancer Res. 50:6827-6829 (1990)]. Por ejemplo, en los tumores de pulmón [Oka et al., Cancer Res. 51:3522-3525 (1991)], de vejiga [Hasui et al., Int. J. Cancer 50:871-873 (1992)], de estómago [Nekarda et al., Lancet 343:117 (1994)], cáncer cervical [Kobayashi et al., Cancer Res. 54:6539-6548 (1994)], de ovario [Kuhn et al., Gynecol. Oncol. 55:401-409 (1994)], de riñón [Hofmann et al., Cancer 78:487-492 (1996)], cerebral [Bindahl et al., J. Neuro-Oncol. 22:101-110 (1994)], y sarcoma de tejido blando [Choong et al., Int. J. Cancer (Pred. Oncol.) 69:268-272 (1996)] se ha detectado un elevado nivel de uPA y/o de actividad del uPA y una elevada tasa de metástasis. Se ha descrito que la sobreproducción de uPA resulta en un aumento de las metástasis esqueléticas de las células de cáncer de próstata in vivo [Achbarou et al., Cancer Res. 54:2372-2377 (1994)].

Se ha demostrado que la inhibición o reducción de la actividad del uPA, o la eliminación/ inhibición de la interacción entre el uPA y su receptor (uPAR) tiene un efecto positivo sobre el mantenimiento de la matriz extracelular y un efecto inhibitorio sobre la metástasis [Ossowski y Reich, Cell 35:611-619 (1983); Ossowski, Cell 52:321-328 (1988); Ossowski, J. Cell Biol. 107:2437-2445 (1988); Wilhelm et al., Clin. Exp. Metastasis 13:296-302 (1995); Achbarou et al., Cancer Res. 54: 2372-2377 (1994); Crowley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5021-5025 (1993); Kook et al., EMBO J. 13:3983-3991 (1994)]. Los resultado de estos estudios experimentales sugieren que la activación del plasminógeno catalizada por el uPA es un factor limitante para la progresión tumoral, la invasión tumoral local y/o la formación de metástasis distantes. [Andreasen et al., Int. J. Canc. 72:1-22 (1997)].

Se cree que los efectos del sistema uPA sobre la migración e invasión celular son debidos tanto al efecto proteolítico de la degradación de la matriz extracelular mediada por la plasmina como mediante una interacción más directa del receptor del uPA con componentes de la matriz extracelular. La degradación de la matriz extracelular permite que una célula en metástasis invada la matriz, mientras que la interacción entre el receptor del uPA y la propia matriz ayuda en la migración celular. La localización del sistema del uPA/ plasmina sobre la superficie celular, o el frente de avance de las células en metástasis, es consistente con el papel que se postula del uPA en la metástasis [Plesner et al., Stem cells 15:398-408 (1997)].

La interacción del uPAR con la vitronectina, un componente de la matriz extracelular, media la adhesión celular y puede verse potenciada cuando el uPAR se une al uPA. Unas moléculas de adhesión a la superficie celular, las integrinas, también parecen estar involucradas en esta función de adhesión, concretamente las integrinas beta-1 y beta-2 [Paysant et al., Br. J. Haematol. 100:45-51 (1998); Simon et al., Blood 88:3185-3194 (1996)]. La integrina CD11b/CD18 puede asociarse con el complejo uPA-uPAR y promover la adhesión de las células que son portadoras de estos receptores, por ejemplo, los neutrófilos y leucocitos.

El sistema uPA/ uPAR también está involucrado en la generación de nueva vasculatura, o neovascularización.

La generación de nueva vasculatura es necesaria para mantener el crecimiento de los tumores primarios y metastásicos. La neovascularización patológica también es una característica de la enfermedad de la retina, rubeosis iritis, enfermedad de vitreoretinopatía proliferativa inflamatoria, retinopatía diabética, uveitis crónica, iridociclitis heterocrómica de Fuch, glaucoma neovascular, neovascularización corneal o del nervio óptico, enfermedad vascular, pterigión, fallo de la cirugía por ampolla del glaucoma, hiperqueratosis, formación de queloides y pólipos (véase la PE 451.130). La angiogénesis no deseada también puede aparecer en los estados siguientes o pueden ser el resultado de las siguientes actividades: degeneración macular, retinopatía prematura, rechazo de injerto corneo, fibroplasia retrolental, queratoconjuntivitis epidémica, deficiencia de vitamina A, uso excesivo de lentes de contacto, queratitis atópica, queratitis límbica superior, pterigio queratitis sicca, síndrome de sogrens, acné rosácea, filectenulosis, sífilis, infecciones por Mycobacteria diferentes de la lepra, degeneración lipídica, quemaduras químicas, úlceras bacterianas o fúngicas, infecciones por Herpes simplex o zoster, infecciones por protozoos, sarcoma de Kaposi, úlcera de Mooren, degeneración marginal de Terrien, queratolisis marginal, trauma, artritis reumatoide, lupus sistémico, poliarteritis, sarcoidosis de Wegener, esleritis, síndrome de Stevens Johnson, queratotomía radial, anemia falciforme, sarcoide, pseudoxantoma elástico, síndrome de Paget, oclusión arteria o venosa, enfermedad oclusiva de la carótida, uveitis crónica, vitritis crónica, enfermedad de Lyme, síndrome de Eales, síndrome de Bechet, miopía, foseta óptica, síndrome de Stargart, pars planitis, desprendimiento de retina crónico, síndromes de hiperviscosidad, toxoplasmosis, complicaciones post-láser, proliferación anormal de tejido fibrovascular, hemangiomas, Osler-Wever-Rendu, tumores sólidos, tumores transmitidos por la sangre, SIDA, síndrome neovascular ocular, osteoartritis, inflamación crónica, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, tumores de rabdomiosarcoma, tumores de retinoblastoma, tumores de sarcoma de Ewing, tumores de neuroblastoma, tumores de osteosarcoma, leucemia, psoriasis, aterosclerosis, penfigoide, como se enumera en la patente estadounidense Nº 5.712.291.

Se ha descrito que un antagonista de la unión de uPA/ uPAR (un dominio de tipo EGF de uPA fusionado con un Fc de IgG) inhibe la neovascularización y el crecimiento del melanoma B16murino [Min et al., Cancer Res. 56:2428-2433 (1996)]. Se ha detectado que, de forma consistente con este hallazgo, existe una correlación entre la densidad de los microvasos, la invasión vascular y los niveles de uPA en los carcinomas de mama [Hildenbrand et al., Brit. J. Cancer 72:818-823 (1995)]. También se ha descrito que el conocido inhibidor del uPA, amilorida, inhibe una serie de patologías de neovascularización [Glaser et al., PE 451.130; Avery et al., Arch. Ophthalmol. 108:1474-1476 (1990)].

Existen dos inhibidores fisiológicos primarios del uPA, PAI-1 y PAI-2, que son miembros de la familia de inhibidores de proteinasas de las serpinas. La unión de las serpinas a sus proteasas afines involucra un gran número de interacciones entre aminoácidos de cada una de las proteínas, lo que incluye los del bucle reactivo de la serpina (Ser-Ala-Arg-Met-Ala (ID. de SEC. Nº1) en PAI-1, Thr-Gly-Arg-Thr-Gly (ID. de SEC. Nº2) en PAI-2). Se ha descrito que la introducción de PAI-2 exógeno en animales de experimentación inhibe la tasa de metástasis pulmonar [Evans y Lin, Amer. Surg. 61:692-697 (1995); Mueller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:205-209 (1995)]. La capacidad de PAI-1 de inhibir la metástasis aún no se ha demostrado de forma consistente. El gen de PAI-1, y los métodos para su expresión recombinante, se describen en Loskutoff et al., patente estadounidense Nº 4.952.512. El PAI-2 nativo y recombinante humano se describen en Stephens et al., patente estadounidense Nº 5.422.090.

Los inhibidores de uPA más ampliamente estudiados son la clase de inhibidores benzo[b]tiofen-2-carboxamidina 4-sustituidos, de los que son miembros el B428 (4-yodo-benzo[b]tiofen-2-carboxamidina) y B623 [Towle et al., Cancer Res. 53:2553-2559 (1993); Bridges et al., Bioorg. Med. Chem. 1:403-410 (1993); Bridges et al., patente estadounidense Nº 5.340.833]. Se ha descrito que la infusión de B428 en ratas de experimentación inoculadas con células tumorales inhibe la expresión génica del uPAR, reduce el volumen del tumor primario y reduce la metástasis [Xing et al., Cancer Res. 57:3585-3593 (1997)]. Se ha descrito que el tratamiento intraperitoneal diario con B428 o B623 de los ratones con tumores bloquea la metástasis a los músculos y la grasa, pero no inhibe la angiogénesis inducida por le tumor o reduce la tasa de metástasis espontánea a pulmón. De hecho, B623 aumentó la formación de metástasis pulmonares (Alonso et al., Breast Cancer Res. Treat. 40:209-223 (1996)]. La infusión de B428 en un modelo singeneico de cáncer de próstata en rata también dio lugar a una reducción del volumen del tumor primario y el peso del tumor, y a una reducción en la metástasis [Rabbani et al., Int. J. Cancer 63:840-845 (1995)].

Otros inhibidores conocidos de uPA incluyen la p-aminobenzamidina, que es un inhibidor competitivo del uPA, y la amilorida. Se ha demostrado que ambos compuestos reducen el tamaño del tumor en animales de experimentación [Jankan et al., Cancer Res. 57: 559-563 (1997); Billstrom et al., Int. J. Cancer 61:542-547 (1995)]. Recientemente, se ha descrito que la epigalocatequina-3-galato (EGCG), un polifenol que se encuentra en el té verde, se une al uPA e inhibe su actividad [Jankun et al., Nature 387:561 (1997)]. Estos investigadores concluyeron que la EGCG es un inhibidor más débil del uPA que la amilorida, pero sugirieron que la EGCG puede consumirse en dosis mucho mayores que la amilorida sin dar lugar a efectos tóxicos. Pye et al. han descrito un inhibidor competitivo del uPA, la \alpha-N-bencilsulfonil-p-aminofenilalanina, en la patente estadounidense Nº 4.165.258.

Otras aproximaciones para inhibir el sistema uPA/ uPAR incluyen el desarrollo de una molécula híbrida bifuncional que consiste en el dominio de unión del uPAR a uPA y PAI-2, que se cree que inhibe el uPA y se une a uPAR in vitro [Ballance et al., Eur. J. Biochem. 207:177-183 (1992)]. Los antagonistas de uPAR también se han estudiado [Doyle y Rosenberg, patente estadounidense Nº 5.656.726; Min et al., Cancer Res. 56:2428-2433 (1996)], así como los oligonucleótidos antisentido complementarios a uPA [Wilhelm et al., Clin. Exp. Metast. 13:296-302 (1995); Iversen y Scholar, patente estadounidense Nº 5.552.390]. Dano et al. también han descrito anticuerpos dirigidos contra el uPAR, que inhiben la unión de uPA a UPAR, en la patente estadounidense Nº 5.519.120. Las moléculas pequeñas que inhiben la uroquinasa, junto con una serie de otras serin-proteasas, incluyen las descritas por Abe et al. en la patente estadounidense Nº 5.508.385 y la patente estadounidense Nº 5.153.176, y por Takano et al. en J. Pharmacol. Exp. Therapeut. 271:1027-1033 (1994).

Se han desarrollado compuestos para inhibir directamente la unión de u-PA al uPAR (Crowley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5021-5025 (1993); Goodson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7129-7133 (1994); Kobayashi et al., Brit. J. Cancer 67:537-544 (1993), e Int. J. Cancer 57:727-73f3 (1994), y J. Biol. Chem. 270:8361-8366 (1995); Lu et al., FEBS Lett. 356:56-59 (1994) y FEBS Lett. 380:21-24 (1996)].

Además, el factor de crecimiento pro-hepatocito (HGF), una proteína que estimula la migración celular, es un sustrato del uPA [Naldinie et al., EMBO J. 11:4825-4833 (1992)]. También se ha descrito la escisión directa de una proteína de la matriz extracelular de 66kDa y de la fibronectina por el uPA, lo que sugiere un papel más directo del uPA en facilitar la migración celular [Quigley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 84:2776-2780 (1987)]. Por lo tanto, la inhibición de uPA puede afectar también a estas actividades.

La WO 00/05245 describe inhibidores de la uroquinasa. La WO 00/05245 no describe o sugiere grupos R7 en la fórmula (I) de a continuación que estén seleccionados de entre hidrógeno o alquilo.

La PE-A-0601459 y US-A-5.932.567 describen inhibidores de proteasas. Tanto la PE-A-0601459 como la US-A-5.932.567 conciben la utilización de los compuestos descritos junto con agentes trombolíticos como la uroquinasa. Por lo tanto, ni la PE-A-0601459 ni la US-A-5.932.567 sugieren una modificación de los compuestos descritos para obtener inhibidores de la uroquinasa.

Resumen de la invención

La presente invención está dirigida a conseguir nuevos inhibidores peptídicos no covalentes de la uroquinasa. Los compuestos tienen un análogo de la arginina en P1. Estos compuestos tienen actividad como potentes inhibidores de la uroquinasa y por lo tanto son útiles en la reducción de sus efectos deletéreos. Los compuestos de la presente invención son activos en la inhibición de la formación de vasos sanguíneos, en particular los relacionados con un proceso patológico. Así, en un aspecto, la presente invención está dirigida a compuestos de fórmula (I):

1

en los que:

(a) X se selecciona de entre el grupo que consiste en -S(O)_{2}-, N(R')-S(O)_{2}-, -(C=O)-, -OC(=O)-, -NH-C(=O)-, -P(O)(R')-, y un enlace directo, en el que R' es independientemente hidrógeno, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, arilo de 6 a 14 átomos de carbono o aralquilo de 7 a 16 átomos de carbono, con la excepción de que cuando X es -P(O)(R')-, entonces R' no es hidrógeno;

(b) R1 se selecciona de entre el grupo que consiste en

(1) alquilo de 1 a 12 átomos de carbono que está opcionalmente sustituido con 1 o 2 con Y_{1} y/o Y_{2};

(2) alquilo de 1 a 3 átomos de carbono sustituidos con cicloalquilo de 3 a 8 átomos de carbono que está opcionalmente sustituido, mono-, di- o tri-sustituido con Y_{1}, Y_{2} y/o Y_{3};

(3) cicloalquilo de 3 a 15 átomos de carbono que está opcionalmente sustituido, mono-, di- o tri-sustituido en el anillo con Y_{1}, Y_{2} y/o Y_{3}; y

(4) heterocicloalquilo de 4 a 10 átomos en el anillo con los átomos del anillo seleccionados de entre carbono y heteroátomos, en el que los heteroátomos se seleccionan de entre el grupo que consiste en oxígeno, nitrógeno, y S(O)_{i},
en el que i es 0, 1 o 2, que está opcionalmente mono-, di- o tri-sustituido en el anillo con Y_{1}, Y_{2}, y/o Y_{3};

(5) heterociclo de 4 a 10 átomos en el anillo con los átomos del anillo seleccionados de entre carbono y heteroátomos, en el que los heteroátomos se seleccionan de entre el grupo que consiste en oxígeno, nitrógeno, y S(O)_{i}, en el que i es 0, 1, o 2, lo que incluye, 520 en el que 521 es un heterociclo de 5 a 7 miembros con de 3 a 6 átomos de carbono en el anillo, en el que V es -CH_{2}-, -O-, -S(=O)-, - S(O)_{2}- o -S-, que está opcionalmente mono-, di- o tri-sustituido en los carbonos del anillo con Y_{1}, Y_{2}, y/o Y_{3};

(6) alquenilo de 2 a 6 átomos de carbono que está opcionalmente sustituido con cicloalquilo de 3 a 8 átomos de carbono, que está opcionalmente mono-, di- o tri-sustituido en el anillo con Y_{1}, Y_{2}, y/o Y_{3};

(7) arilo de 6 a 14 átomos de carbono que está opcionalmente mono-, di- o tri-sustituido con Y_{1}, Y_{2} y/o Y_{3};

(8) heteroarilo de 5 a 14 átomos en el anillo con los átomos del anillo seleccionados de entre carbono y heteroátomos, en el que los heteroátomos se seleccionan de entre oxígeno, nitrógeno y azufre, y que está opcionalmente mono-, di- o tri- sustituido con Y_{1}, Y_{2}, y/o Y_{3};

(9) aralquilo de 7 a 15 átomos de carbono que está opcionalmente sustituido en la cadena alquilo con hidroxi o halógeno y que está opcionalmente mono-, di- o tri-sustituido con Y_{1}, Y_{2}, y/o Y_{3};

(10) heteroaralquilo de 5 a 14 átomos en el anillo con los átomos del anillo seleccionados de entre carbono y heteroátomos, en el que los heteroátomos se seleccionan de entre oxígeno, nitrógeno y azufre, que está opcionalmente sustituido en la cadena alquilo con hidroxi o halógeno y opcionalmente mono-, di- o tri-sustituido en el anillo con Y_{1}, Y_{2}, y/o Y_{3};

(11) aralquenilo de 8 a 16 átomos de carbono que está opcionalmente mono-, di- o tri-sustituido en el anillo arilo con Y_{1}, Y_{2}, y/o Y_{3};

(12) heteroaralquenilo de 5 a 14 átomos en el anillo con los átomos del anillo seleccionados de entre carbono y heteroátomos, en el que los heteroátomos se seleccionan de entre oxígeno, nitrógeno y azufre, y que está opcionalmente mono-, di- o tri-sustituido en el anillo carbono con Y_{1}, Y_{2}, y/o Y_{3};

2

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(17) alquilo carbocíclico fusionado de 9 a 15 átomos de carbono;

(18) difluorometilo o perfluoroalquilo de 1 a 12 átomos de carbono;

(19) perfluoroarilo de 6 a 14 átomos de carbono; y

(20) perfluoroaralquilo de 7 a 15 átomos de carbono

(21) hidrógeno cuando X es -C(=O)NH-, -S(O)_{2}-, -S(O)_{2}NH-, o un enlace directo; y

en el que Y_{1}, Y_{2} e Y_{3} son independientemente seleccionados y se

(i) seleccionan de entre el grupo que consiste en halógeno, ciano, nitro, tetrazolilo, guanidino, amidino, metilguanidino, -CF_{3}, -CF_{2}CF_{3}, -CH(CF_{3})_{2}, -C(OH)(CF_{3})_{2}, -OCF_{3}, -OCF_{2}H, -OCF_{2}CF_{3}, -OC(O)NH_{2}, -OC(O)NHZ_{1}, -OC(O)NZ_{1}Z_{2}, -NHC(O)Z_{1}, -NHC(O)NH_{2}, -NHC(O)NZ_{1}, -NHC(O)NZ_{1}Z_{2}, -C(O)OH, -C(O)OZ_{1}, -C(O)NH_{2}, -C(O)NHZ_{1}, -C(O)NZ_{1}Z_{2}, -P(O)_{3}H_{2}, -P(O)_{3}(Z_{1})_{2}, -S(O)_{3}H, -S(O)_{m}Z_{1}, -Z_{1}, -OZ_{1}, -OH, - NH_{2}, -NHZ_{1}, -NZ_{1}Z_{2}, -N-morfolino, y -S(O)_{m}(CF_{2})_{q}CF_{3}, en el que m es 0, 1 o 2, q es un entero de 0 a 5, y Z_{1} y Z_{2} se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste en alquilo de 1 a 12 átomos de carbono, arilo de 6 a 14 átomos de carbono, heteroarilo de 5 a 14 átomos en el anillo, aralquilo de 7 a 15 átomos de carbono y heteroaralquilo de 5 a 14 átomos en el anillo, o

(ii) Y_{1} e Y_{2} se seleccionan conjuntamente siendo -O[C(Z_{3})(Z_{4})]_{r}O o -O[C(Z_{3})(Z_{4})]_{r+1}-, en el que r es un entero de 1 a 4, y Z_{3} y Z_{4} se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo de 1 a 12 átomos de carbono, arilo de 6 a 14 átomos de carbono, heteroarilo de 5 a 14 átomos en el anillo, aralquilo de 7 a 15 átomos de carbono, y heteroaralquilo de 5 a 14 átomos en el anillo;

(c) R_{2} es -CH_{2}OH, -CH(CH_{3})OH, o se selecciona para dar lugar a un grupo en P3 seleccionado de entre el grupo que consiste en ésteres de acilo y carbonato de D-serilo;

(d) R_{3} y R_{4} se seleccionan conjuntamente para dar lugar a un grupo en P_{2} seleccionado de entre el grupo que consiste en prolilo, pipecolilo, azetidin-2-carbonilo, 4-hidroxiprolilo, 3-hidroxiprolilo, 3,4-metanoprolilo y 3,4-dehidroprolilo;

(e) R_{7} es hidrógeno o alquilo de 1 a 4 átomos de carbono;

(f) E se selecciona de entre el grupo que consiste en:

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en los que R_{8} y R_{9} se seleccionan independientemente de entre hidrógeno, hidroxilo, halógeno, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono sustituidos con alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 6 átomos de carbono, y trifluorometilo; R_{10} y R_{11} son independientemente hidrógeno, hidroxi, alcoxi de 1 a 3 átomos de carbono, trihidrocarbilsililo de 3 a 16 átomos de carbono, alquilo de 1 a 3 átomos de carbono o -C(=O)R_{12}; R_{11} es hidrógeno o alquilo de 1 a 3 átomos de carbono con la condición de que R_{10} y R_{11} no sean ambos hidroxilo o alcoxi; R_{12} es hidrógeno, alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 6 átomos de carbono o (CF_{2})_{j}CF_{3} en el que n es 0, 1, 2 o 3; R_{13} y R_{14} se seleccionan independientemente de entre hidrógeno o alquilo inferior de 1 a 3 átomos de carbono; y t es un entero de 0 a 6; y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

Los compuestos de la presente invención pueden dividirse en partes denominadas P_{1}, P_{2}, P_{3} y P_{4,} como se muestra en la siguiente fórmula Ia:

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5

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en la que X, R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{7} y E son como se han definido en relación con la fórmula (I). Así, la porción de un compuesto de fórmula (I) que se denomina P_{1} o P1 es la porción

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6

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La porción de un compuesto de fórmula (I) que se denomina P_{2} o P2 es la porción

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La porción de un compuesto de fórmula (I) que se denomina P_{3} o P3 es la porción

8

Entre otros factores, la presente invención se basa en nuestro descubrimiento de que los nuevos compuestos de la invención son activos como inhibidores de la uroquinasa. Los compuestos de la presente invención muestran actividad en la inhibición de la angiogénesis.

En otro aspecto, la presente invención está dirigida a composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la presente invención y un transportador farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto, la presente invención está dirigida a la utilización de los compuestos de la presente invención para la preparación de composiciones farmacéuticas para la inhibición de la uroquinasa.

Definiciones

De acuerdo con la presente invención, se definen los significados de los siguientes términos como se utilizan aquí, a no ser que se indique explícitamente de otro modo:

El término "alquenilo" se refiere a grupos alifáticos insaturados con al menos un doble enlace.

El término "alquilo" se refiere a grupos alifáticos saturados, lo que incluye grupos de cadena sencilla, de cadena ramificada y cíclicos (lo que incluye policíclicos).

Los términos "alcoxi" y "alcoxilo" se refieren a un grupo con la fórmula, R-O-, en el que R es un grupo alquilo.

El término "alcoxicarbonilo" se refiere a -C(O)OR en el que R es alquilo.

El término "aralquenilo" se refiere a un grupo alquenilo sustituido con un grupo arilo. Preferiblemente el grupo alquenilo tiene de 2 a alrededor de 6 átomos de carbono.

El término "aralquilo" se refiere a un grupo alquilo sustituido con un grupo arilo. Los grupos aralquilo adecuados incluyen bencilo, fenetilo y similares, y todos ellos pueden estar opcionalmente sustituidos. Preferiblemente, el grupo alquilo tiene de 1 a alrededor de 6 átomos de carbono.

El término "arilo" se refiere a un grupo aromático que tiene al menos un anillo con un sistema conjugado de electrones pi e incluye un arilo carbocíclico, arilo heterocíclico y grupos biarilo, y todos ellos pueden estar opcionalmente sustituidos.

El término "ariloxi" se refiere a un grupo con la fórmula R-O-, en la que R es un grupo arilo.

El término "aralcoxi" se refiere a un grupo con la fórmula, R-O-, en la que R es un grupo aralquilo.

El término "aminoácido" se refiere tanto a aminoácidos naturales como sintéticos en sus estereoisómeros D y L si sus estructuras permiten tales formas estereoisoméricas, y sus análogos. Los aminoácidos naturales incluyen la alanina (Ala), arginina (Arg), asparagina (Asn), ácido aspártico (Asp), cisteína (Cys), glutamina (Gln), ácido glutámico (Glu), glicina (Gly), histidina (His), isoleucina (Ile), leucina (Leu), lisina (Lys), metionina (Met), fenilalanina (Phe), prolina (Pro), serina (Ser), treonina (Thr), triptófano (Trp), tirosina (Tyr) y valina (Val). Los aminoácidos sintéticos incluyen, pero no se limitan a ácido azetidincarboxílico, ácido 2-aminoadípico, ácido 3-aminoadípico, beta-alanina, ácido aminopropiónico, ácido 2-aminobutírico, ácido 4-aminobutírico, ácido 6-aminocaproico, ácido 2-aminoheptanoico, ácido 2-aminoisobutírico, ácido 3-aminoisobutírico, ácido 2-aminopimélico, ácido 2,4 diaminoisobutírico, demosina, ácido 2,2'-diaminopimélico, ácido 2,3-diaminopropiónico, N-etilglicina, N-etilasparagina, hidroxilisina, alohidroxilisina, 3-hidroxiprolina, 4-hidroxiprolina, isodesmosina, aloisoleucina, N-metilglicina, N-metilisoleucina, N-metilvalina, norvalina, norleucina, ornitina y ácido pipecólico. Los análogo de aminoácido incluyen los aminoácidos naturales y sintéticos que están químicamente bloqueados, reversiblemente o irreversiblemente, o con modificaciones en su grupo amino N-terminal o los grupos de la cadena lateral, como por ejemplo, sulfóxido de metionina, sulfona de metionina, S-(carboximetil)-cisteína, sulfóxido de S-(carboximetil)-cisteína y sulfona de S-(carboximetil)-cisteína.

El término "análogo de aminoácido" se refiere a un aminoácido en el que el grupo carboxilo C-terminal, el grupo amino N-terminal o el grupo funcional de la cadena lateral se han modificado químicamente a otro grupo funcional. Por ejemplo, el beta-metil-éster de ácido aspártico es un análogo de aminoácido del ácido aspártico; la N-etilglicina es un análogo de aminoácido de la glicina; o la carboxamida de alanina es un análogo de aminoácido de la alanina.

El término "residuo aminoacídico" se refiere a los radicales con la estructura: (1) -C(O)-R-NH-, en la que R es normalmente -CH(R')-, en el que R' es H o un sustituyente que contiene carbono; o (2) 9 en el que p es 1, 2 o 3 lo que representa los residuos ácido azetidincarboxílico, prolina o ácido pipecólico, respectivamente.

"Biarilo" se refiere a un fenilo sustituido por un arilo carbocíclico o heterocíclico como se define aquí, orto, meta o para, respecto al punto de unión del anillo fenilo.

"Salmuera" se refiere a una solución acuosa saturada de cloruro sódico.

"Arilo carbocíclico" se refiere a grupos aromáticos en los que los átomos en el anillo del anillo aromático son átomos de carbono.

Los grupos arilo carbocíclicos incluyen grupos arilo carbocíclico monocíclicos y grupos naftilo, y todos ellos pueden estar opcionalmente sustituidos. Los grupos arilo carbocíclico adecuados incluyen el fenilo y naftilo. Los grupos arilo carbocíclico sustituidos adecuados incluyen el indeno y el fenilo sustituido por de uno a dos sustituyentes, siendo ventajoso el alquilo inferior, hidroxi, alcoxi inferior, alcoxicarbonilo inferior, halógeno, trifluorometilo, difluorometilo, nitro y ciano. Naftilo sustituido se refiere a naftilo, más preferiblemente 1- o 2-naftilo sustituido por Y_{1}, Y_{2} y/o Y_{3} como se definen en relación con la fórmula (I) anterior.

"Cicloalquenilo" se refiere a un grupo alquenilo cíclico. Los grupos cicloalquenilo adecuados incluyen, por ejemplo, el ciclopentenilo y ciclohexenilo.

"Cicloalquilo" se refiere a un grupo alquilo cíclico con al menos un anillo e incluye grupos policíclicos, lo que incluye grupos alquilo cíclicos con el anillo fusionado. Los grupos cicloalquilo adecuados incluyen, por ejemplo, el ciclohexilo, ciclopropilo, ciclopentilo y cicloheptilo.

"Ciclohexilmetilo" se refiere a un grupo ciclohexilo unido a CH_{2}.

"Carbocíclico fusionado" se refiere a un anillo carbocíclico fusionado multicíclico con anillos tanto aromáticos como no aromáticos. Los anillos carbocíclicos fusionados adecuados incluyen fluorenilo, tetralina y similares.

"Alquilo carbocíclico fusionado" se refiere a un grupo alquilo sustituido con una porción anillo carbocíclico fusionado, preferiblemente un anillo carbocíclico fusionado multicíclico, lo que incluye anillos tanto aromáticos como no aromáticos. Los grupos alquilo carbocíclico fusionado adecuados incluyen el fluorenilmetilo y similares.

El término "halógeno" se refiere a flúor, cloro, bromo y yodo.

"Heteroaralquenilo" se refiere a un grupo alquenilo sustituido con un heteroarilo e incluye aquellos sistemas heterocíclicos descritos en "Handbook of Chemistry and Physics", 49ª edición, 1968, R.C. Weast, editor; The Chemical Rubber Co., Cleveland, OH. Véase concretamente las secciones C, Rules for Naming Organic Compounds, B. Fundamental Heterociclic Systems. Preferiblemente el grupo alquenilo tiene de 2 a alrededor de 6 átomos de carbono.

"Heteroaralquilo" se refiere a un grupo alquilo sustituido con un heteroarilo, como el picolilo e incluye aquellos sistemas heterocíclicos descritos en "Handbook of Chemistry and Physics", 49ª edición, 1968, R.C. Weast, editor; The Chemical Rubber Co., Cleveland, OH. Véase concretamente las secciones C, Rules for Naming Organic Compounds, B. Fundamental Heterociclic Systems. Preferiblemente el grupo alquilo tiene de 1 a alrededor de 6 átomos de carbono.

"Heteroarilo" se refiere un grupo aromático con de 1 a 14 átomos de carbono y en el que el resto de átomos en el anillo son heteroátomos, e incluye aquellos sistemas heterocíclicos descritos en "Handbook of Chemistry and Physics", 49ª edición, 1968, R.C. Weast, editor; The Chemical Rubber Co., Cleveland, OH. Véase concretamente las secciones C, Rules for Naming Organic Compounds, B. Fundamental Heterociclic Systems. Los heteroátomos adecuados incluyen oxígeno, nitrógeno y S(O)_{i}, en el que i es 0, 1 o 2, y los arilos heterocíclicos adecuados incluyen furanilo, tienilo, piridilo, pirrolilo, pirimidilo, pirazinilo, imidazolilo y similares.

"Heterociclo" se refiere a un sistema de anillo heterocíclico reducido que comprende átomos de carbono, nitrógeno, oxígeno y/o azufre, e incluye aquellos sistemas heterocíclico descritos en "Handbook of Chemistry and Physics", 49ª edición, 1968, R.C. Weast, editor; The Chemical Rubber Co., Cleveland, OH. Véase concretamente las secciones C, Rules for Naming Organic Compounds, B. Fundamental Heterociclic Systems.

"Heterocicloalquilo" se refiere a un grupo alquilo sustituidos con un grupo heterociclo, e incluye aquellos sistemas heterocíclico descritos en "Handbook of Chemistry and Physics", 49ª edición, 1968, R.C. Weast, editor; The Chemical Rubber Co., Cleveland, OH. Véase concretamente las secciones C, Rules for Naming Organic Compounds, B. Fundamental Heterociclic Systems. Preferiblemente el grupo alquilo tiene de 1 a alrededor de 6 átomos de carbono.

El término "inferior" referido aquí en relación con radicales o grupos orgánicos define tales radicales o grupos con uno y hasta 5 átomos de carbono inclusive, preferiblemente hasta 4 átomos de carbono inclusive, y de forma ventajosa uno o dos átomos de carbono. Tales radicales o grupos pueden ser de cadena sencilla o ramificada.

"Perfluoroalquilo" se refiere a un grupo alquilo que tiene todos sus hidrógenos reemplazados por flúor.

"Perfluoroarilo" se refiere a un grupo arilo que tiene todos sus hidrógenos reemplazados por flúor.

"Perfluoroarilalquilo" se refiere a un grupo aralquilo en el que todos los hidrógenos de la porción arilo se han reemplazado por flúor.

"Sal farmacéuticamente aceptable" incluye las sales de los compuestos de la presente invención derivadas de la combinación de tales compuestos y un ácido orgánico o inorgánico. En la práctica, la utilización de la forma salina es equivalente a la utilización de la forma básica. Los compuestos de la presente invención son útiles tanto en forma de base libre como en forma de sal, y ambas formas se consideran dentro del alcance de la presente invención.

"AcN" o "MeCN" se refiere a acetonitrilo.

"AIBN" se refiere a 2,2'-azobisisobutironitrilo.

"Bn" se refiere a bencilo.

"Boc" se refiere a t-butoxicarbonilo.

"Boc_{2}O" se refiere a anhídrido de Boc (carbonato de di-terc-butilo).

"BzlSO_{2}" se refiere a bencilsulfonilo.

"Cbz" o "CBz" se refiere a benciloxicarbonilo.

"CsCO_{3}" se refiere a carbonato de cesio.

"DCA" se refiere a ácido dicloroacético.

"DCC" se refiere a N,N'-diciclohexilcarbodiimida.

"DCM" se refiere a diclorometano.

"DIEA" se refiere a diisopropiletilamina.

"DMF" se refiere a N,N-dimetilformamida.

"DMSO" se refiere a dimetilsulfóxido.

"DMAP" se refiere a 4-N,N-dimetilaminopiridina.

"EDC" se refiere a la sal de clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilamino-propil)carbodiimida.

"Et_{3}N" o "TEA" se refiere a trietilamina.

"EtOAc" se refiere a acetato de etilo.

"EtOH" se refiere a etanol.

"HATU" se refiere a hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio.

"HBTU" se refiere a hexafluorofosfato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio.

"HCl" se refiere a ácido clorhídrico.

"HOAc" se refiere a ácido acético.

"HOAt" o "HOAT" se refiere a 1-hidroxi-7-azabenzo-triazol.

"HOBt" se refiere a 1-hidroxibenzotriazol monohidrato.

"i-BuOCOCl" se refiere a isobutilcloroformato.

"HPLC" se refiere a cromatografía líquida a elevada presión.

"LiAlH_{4}" se refiere a hidruro de litio aluminio.

"LiAlH_{2}(OEt)_{2}" se refiere a dietóxido de hidruro de litio aluminio.

"Me" se refiere a metilo.

"MeOH" se refiere a metanol.

"NMM" se refiere a N-metilmorfolina.

"PhB(OH)_{2}" se refiere a ácido fenilborónico.

"Ph_{3}P" o "PPh_{3}" se refiere a trifenilfosfina.

"PyBOP" se refiere a hexafluorofosfato de benzotriazol-il-oxi-tris-pirrolidin-fosfonio.

"RP-HPLC" se refiere a cromatografía líquida a elevada presión de fase reversa.

"TFA" se refiere a ácido trifluoroacético.

"THF" se refiere a tetrahidrofurano.

"TLC" se refiere a cromatografía en capa fina.

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Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra un esquema de reacción de la síntesis en fase líquida de un intermediario útil en la síntesis de un compuesto de la presente invención. El compuesto 1-1 es N-\alpha-Cbz-D-serina(O-t-butilo), el compuesto 1-2 es metiléster de alanina, sal de clorhidrato. En esta figura, se definen de "i" a "iv" como i) EDC, 1-hidroxibenzotriazol y acetonitrilo, diisopropiletilamina para dar lugar a Cbz-D-Ser(O-t-butil)-Ala-OMe; (ii) etanol/ ácido acético/ agua (4:1:1), Pd al 10% sobre carbono, 45 psi de H_{2} durante 2 horas, rendimiento del 95% tras el análisis; iii) acetonitrilo, cloruro de bencensulfonilo, diisopropiletilamina, rendimiento del 43% tras el análisis; y iv) metanol, hidróxido de litio 1,0 M, acidificación sobre una resina de intercambio iónico DOWEX, eluyendo con metanol/ agua, rendimiento del 95% tras el análisis. Véanse también los Ejemplos de 60 a 62.

La Figura 2 un esquema de reacción de una ruta de síntesis en fase líquida que puede utilizarse para obtener un intermediario útil en la preparación de un compuesto de la presente invención. En esta figura, se definen de "i" a "iv" como: i) cloroformato de isobutilo, carbonato sódico, agua, rendimiento del 99,5% tras el análisis; ii) éster de t-butilo de alanina, sal de clorhidrato, EDC e hidroxibenzotriazol en acetonitrilo; diisopropiletilamina, rendimiento cuantitativo tras el análisis; y iii) TFA, DCM, rendimiento cuantitativo tras el análisis. Véanse también los Ejemplos de 74 a 76.

La Figura 3 muestra un esquema de reacción de la síntesis de intermediarios que pueden utilizarse en la preparación de compuestos de la presente invención. En esta figura, se definen de "i" a "xi" como sigue: i) CuCN, DMF, reflujo (4 horas); ii) EtOAc, NaCN acuoso al 10%; iii) N-bromosuccinimida, 2,2'-azobisisobutironitrilo, CCl_{4}, reflujo (5 horas); iv) NaN_{3}, DMF; v) trifenilfosfina, THF, agua, O C, agitación (10 horas); vi) K_{2}CO_{3}, Boc_{2}O, agua, dioxano; vii) hidroxilamina HCl, NMM, MeOH; viii) Pd al 10%/C, MeOH, 45 psi de H_{2} (10 horas); ix) HCl 4M en dioxano; x) CsCO_{3}, yodopropano en DMF; y xi) HCl 4M, dioxano, 3 horas, temperatura ambiente.

La Figura 4 muestra un esquema de reacción de la síntesis de intermediarios que pueden utilizarse en la preparación de compuestos de la presente invención. En esta figura, se definen de "i" a "iv" como sigue: i) NaN_{3}, DMF; ii) Pd al 10%/C, EtOAc, 45 psi de H_{2} (11 horas); iii) hidroxilamina HCl, NMM, MeOH; y iv) Pd al 10%/C, MeOH, 45 psi de H_{2} (48 horas).

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La Figura 5 muestra un esquema de reacción de la síntesis de intermediarios que pueden utilizarse en la preparación de compuestos de la presente invención. En esta figura, se definen de "i" a "vii" como sigue: i) Cu(I)CN, DMF; ii) NBS, peróxido de benzoilo, CCl_{4}, 80ºC (14 horas); iii) NaN_{3}, DMF, agitación (20 horas); iv) hidroxilamina HCl, NMM, MeOH, agitación (3 días); v) CsCO_{3}, yodopropano, DMF, 50ºC (20 horas); vi) trifenilfosfina, THF, agitación (20 horas); y vii) NaOH 3M hasta pH 14.

La Figura 6 muestra un esquema de reacción de la síntesis de un compuesto de la presente invención en el que R_{2} es -CH_{2}OA_{1} y A_{1} es -C(=O)R_{6}, utilizando como intermediario, el compuesto del Ejemplo 9. En esta figura, "i" se define como: i) piridina, R_{6}COCl.

La Figura 7 muestra un esquema de reacción de la síntesis de ciertos compuestos de la presente invención. En esta figura, se definen de "i" a "vi" como sigue: i) anhídrido trifluoracético, 0ºC, agitación durante toda la noche; hielo, CH_{2}Cl_{2}, Na_{2}SO_{4}; ii) Pd/C (10%) en MeOH (toda la noche); iii) N-N'-di-Boc-N''-trifluorometansulfonil-guanidina, TEA, CH_{2}Cl_{2}, 6 horas; HCl, salmuera, Na_{2}SO_{2}; cromatografía en columna (CH_{2}Cl_{2}/MeOH 99:1); iv) carbonato potásico, H_{2}O/MeOH (2:15), toda la noche; CH_{2}Cl_{2}/MeOH (9:1), Na_{2}SO_{4}; v) carboxilato de benzilsulfonil-D-serina-L-alanina, HATU, HOAT, DIEA, acetonitrilo, toda la noche; EtOAc, HCl, NaHCO_{3}, salmuera; HPLC (CH_{3}CN, H_{2}O, TFA al 0,1%); vi) CH_{2}Cl_{2}/TFA (1:1), 90 minutos; HPLC (CH_{3}CN, H_{2}O, TFA al 0,1%).

La Figura 8 muestra un esquema de reacción de la síntesis de ciertos compuestos de la presente invención. En esta figura, se definen de "i" a "v" como sigue: i) anhídrido trifluoroacético, agitación durante toda la noche; hielo, CH_{2}Cl_{2}, Na_{2}SO_{4}; ii) Pd/C (al 10%) en MeOH (toda la noche); iii) N-N'-Boc-N''-trifluorometansulfonil-guanidina, TEA, CH_{2}Cl_{2}, 24 horas; HCl, salmuera, Na_{2}SO_{4}; cromatografía en columna (CH_{2}Cl_{2}/MeOH 98:2); iv) carbonato potásico, H_{2}O/MeOH (1:1), toda la noche; H_{2}O, CH_{2}Cl_{2}/ MeOH (9:1), Na_{2}SO_{4}; y v) carboxilato de bencilsulfonil-D-serina-L-alanina, HATU, HOAT, DIEA, en acetonitrilo, temperatura ambiente durante toda la noche; EtOAc, HCl, NaHCO_{3}, salmuera; CH_{2}Cl_{2}/TFA (1:1), temperatura ambiente, 2 horas, HPLC (CH_{3}CN, H_{2}O, TFA al 0,1%).

La Figura 9 muestra un esquema de reacción de la síntesis de un compuesto de la presente invención. En esta figura, se definen de "i" a "vi" como sigue: i) anhídrido trifluoroacético, 0ºC, una hora; ii) KNO_{3}, -20ºC, agitación toda la noche; CH_{2}Cl_{2}, Na_{2}SO_{4}, cromatografía en columna; iii) HCl en MeOH, 0ºC, SnCl_{2}, agitación 30 minutos, NaHCO_{3}, CH_{2}Cl_{2}, Na_{2}SO_{4}; iv) N_{1}N'-di-Boc-N''-trifluorometansulfonil-guanidina, TEA, CH_{2}Cl_{3}, agitación 24 horas; HCl (1M), salmuera, Na_{2}SO_{4}, cromatografía en columna;

v) K_{2}CO_{3}, H_{2}O/MeOH (1:1), agitación toda la noche; H_{2}O, CH_{2}Cl_{2}/MeOH (95:5), Na_{2}SO_{4}; y vi) carboxilato de benzilsulfonil-D-serina-L-alanina, HATU, HOAT, DIEA, AcN, agitación toda la noche; EtOAc, HCl (1M), NaHCO_{3} acuoso, salmuera, Na_{2}SO_{4}; HPLC.

Las Figuras de 10A a 10F muestran ciertos compuestos preferibles de la presente invención.

La Figura 11 muestra un esquema de reacción de la síntesis de un compuesto de la presente invención. En esta figura, se definen de "i" a "xii" como sigue: i) CCl_{4}, N-bromo-succinimida; N_{2}, AIBN, agitación, cromatografía rápida; ii) DMF, NaN_{3}, agitación durante toda la noche, dietiléter, agua, salmuera, MgSO_{4}, filtrado; (iii) MeOH, TEA, 65ºC, 4 horas; EtOAc, H_{2}O, salmuera, MgSO_{4}; iv) THF/ agua, Ph_{3}P, agitación durante toda la noche; HCl 1N, H_{2}O, DCM, pH\sim9; v) dioxano/ agua, K_{2}CO_{3}, Boc_{2}O, agitación durante toda la noche; EtOAc, NAHCO_{3} acuoso, salmuera, Na_{2}SO_{4}, cromatografía rápida en columna; vi) DMF, 2-yodopropano, CsCO_{3}; EtOAc, NaHCO_{3} acuoso, Na_{2}SO_{4}, cromatografía rápida en columna; vii) dioxano, HCl 4N en dioxano, eliminado del solvente; viii) AcN, DIEA; Boc-alanina, EDC, HOBt, agitación durante toda la noche; EtOAc, NaHCO_{3} acuoso, salmuera, Na_{2}SO_{4}, cromatografía rápida en columna; ix) dioxano, HCl 4N en dioxano, eliminado del solvente, x) AcN, DIEA, BnSO_{2}-dSer(tBu)-OH, EDC, HOBt, agitación durante toda la noche;; EtOAc, NaHCO_{3} acuoso, salmuera, Na_{2}SO_{4}, RP-HPLC; xc) DCM, TFA; RP-HPLC; y xii) H_{2}O, HOAc, polvo de Zn; RP-HPLC.

Descripción detallada de la invención 1. Compuestos Preferibles

Los compuestos de la presente invención con la formula:

10

en los que:

(b) R_{1} se selecciona de entre el grupo que consiste en

(5) heterociclo de 4 a 10 átomos en el anillo con los átomos del anillo seleccionados de entre carbono y heteroátomos, en el que los heteroátomos se seleccionan de entre el grupo que consiste en oxígeno, nitrógeno, y S(O)_{i}, en el que i es 0, 1, o 2, lo que incluye, 522 en el que 523 es un heterociclo de 5 a 7 miembros con de 3 a 6 átomos de carbono en el anillo, en el que V es -CH_{2}-, -O-, -S(=O)-, - S(O)_{2}- o -S-, que está opcionalmente mono-, di- o tri-sustituido en los carbonos del anillo con Y_{1}, Y_{2}, y/o Y_{3};

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11

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506

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507

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(17) alquilo carbocíclico fusionado de 9 a 15 átomos de carbono;

(18) difluorometilo o perfluoroalquilo de 1 a 12 átomos de carbono;

(19) perfluoroarilo de 6 a 14 átomos de carbono; y

(20) perfluoroaralquilo de 7 a 15 átomos de carbono

en el que Y_{1}, Y_{2} e Y_{3} son independientemente seleccionados y se

(d) R_{3} y R_{4} se seleccionan conjuntamente para dar lugar a un grupo en P_{2} seleccionado de entre el grupo que consiste en prolilo, pipecolilo, azetidin-2-carbonilo, 4-hidroxi-prolilo, 3-hidroxiprolilo, 3,4-metanoprolilo y 3,4-dehidroprolilo;

(e) R_{7} es hidrógeno o alquilo de 1 a 4 átomos de carbono;

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(f) E se selecciona de entre el grupo que consiste en:

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12

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510

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Los grupos X preferibles incluyen -S(O)_{2}-, -OC(=O)-, -NH-C(=O)-, y un enlace directo. Son especialmente preferibles -S(O)_{2}- y -OC(=O)-.

Los grupos R_{1} preferibles incluyen los alquilos, especialmente isobutilo, 2-etilhexilo, metilo, n-butilo, isopropilo, ciclohexilmetilo y ciclohexilpropilo; cicloalquilos, especialmente (-)mentilo, (+)mentilo y ciclohexilo; arilos, especialmente naftilo y fenilo, aralquilos, especialmente bencilo, 3-fenilpropilo y 2-feniletilo; y alquilos carbocíclicos fusionados, especialmente fluorenilmetilo.

Los grupos R_{1} especialmente preferidos incluyen fenilo, bencilo, 2-feniletilo, isobutilo, n-butilo y 3-fenilpropilo.

Las combinaciones preferibles de R_{1}-X- incluyen fenil-S(O)_{2}-, bencil-S(O)_{2}-, 2-feniletil-S(O)_{2}-, 3-fenilpropil- S(O)_{2}-, n-butil-S(O)_{2}-, bencil-OC(=O)- y isobutil-OC(=O)-.

Los grupos R_{2} son CH(R_{5})OH, en el que R_{5} es hidrógeno o metilo. La quiralidad preferible en el carbono alfa es R. Cuando es quiral, la quiralidad preferible en el carbono beta es R. Los grupos R_{2} preferibles son aquellos que definen la posición P_{3} como d-serilo (-CH(R_{5})OH en el que R_{5} es H), (R,R)d-alotreonilo (-CH(R_{5})OH en el que R_{5} es metilo). Los grupos R_{2} especialmente preferibles son aquellos que definen P_{3} como d-serilo (R_{5} es H) o (R,R)d-alotreonilo (R_{5} es metilo).

Los grupos R_{2} alternativos incluyen -(CH_{2})_{2}OA_{1} y -CH(R_{5})OA_{1}, más preferiblemente -CH(R_{5})OA_{1}; preferiblemente R_{5} es H.

Más preferiblemente R_{2} se selecciona de forma que P_{3} está definido como un éster de acilo o carbonato de d-serilo. Los compuestos en los que R_{2} es -(CH_{2})_{2}OA_{1} o -CH(R_{5})OA_{1} pueden actuar como profármacos.

También se describe aquí un grupo R_{3}, cuando R_{3} y R_{4} no se seleccionan conjuntamente, que es hidrógeno. También se describe un grupo R_{4}, que, cuando R_{3} y R_{4} no se seleccionan conjuntamente, es metilo, vinilo, alilo o propargilo. En los compuestos de la invención, R_{3} y R_{4} se seleccionan conjuntamente y son prolilo, 3-hidroxi-prolilo, 4-hidroxi-prililo, 3,4-dehidroprolilo, 3,4-metanoprolilo y azetidin-2-carbonilo y definen un grupo en P_{2}.

Los grupos R_{7} preferibles incluyen hidrógeno.

Los grupos E preferibles incluyen 4-amidinofenilo, 4-guanidinofenilo, 3-amidinopropilo y 5-(2-amidino-tienilo).

Entre los compuestos de la presente invención, los compuestos preferibles incluyen aquellos con un elemento R_{2} que define una d-serina o d-alotreonina o un éster de acilo o carbonato de los mismos en la posición P_{3} del compuesto y un grupo amidinofenilo, guanidinofenilo o amidinotienilo en P_{1}. Son especialmente preferibles aquellos compuestos en los que también R_{3} y R_{4} se seleccionan conjuntamente de forma que P_{2} es prolilo, azetidin-2-carbonilo, 3,4-metanoprolilo o 3,4-dehidroprolilo.

Los compuestos preferibles de la presente invención incluyen aquellos que se muestran en las Figuras de 10A a 10F. Son especialmente preferibles los compuestos D, F, I, J, K, L, O, R, T, U, V, AE, AH, AJ, AN y AV de las Figuras de 10A a 10F.

También son especialmente preferibles los compuestos AX (X = S(O)_{2}, R_{1} = 4-clorobencilo, R_{2} = -CH_{2}OH, R_{3} = H, R_{4} = CH_{3}-, R_{7} = H y E = 4-amidinofenilo), AY (X = SO_{2}, R_{1} = 3-clorobencilo, R_{2} = -CH_{2}OH, R_{3} = H, R_{4} = CH_{3}, R_{7} = H y E = 4-amidinofenilo) y AZ (X = SO_{2}, R_{1} = 2-fluorobencilo, R_{2} = -CH_{2}OH, R_{3} = H, R_{4} = CH_{3}, R_{7} = H y E = 4-amidinofenilo). Las sustituciones deben realizarse respecto de la fórmula I.

2. Obtención de los Compuestos Preferibles

Las Figuras de 1 a 5 muestran esquemas sintéticos para la síntesis de intermediarios que pueden utilizarse para la obtención de ciertos compuestos de la presente invención.

La Figura 1 muestra la síntesis en fase líquida de intermediarios útiles en la preparación de compuestos de la presente invención. Véanse los Ejemplos de 60 a 62. Véanse también los Ejemplos de 95 a 97.

Los Ejemplos de 63 a 66, de 67 a 70 y de 71 a 73 describen la síntesis en fase líquida de intermediarios útiles en la preparación de compuestos de la presente invención.

La Figura 2 muestra una ruta de síntesis alternativa para obtener un intermediario útil en la preparación de un compuesto de la presente invención. Véanse también los Ejemplos de 74 a 76.

La Figura 6 muestra un esquema de reacción para la obtención de un compuesto de la presente invención con un hidroxilo esterificado en P_{3}.

La Figura 7 muestra un esquema de reacción para la obtención de un compuesto de la presente invención con un 4-guanidinofenilo en P_{1}.

La Figura 8 muestra un esquema de reacción para la obtención de un compuesto de la presente invención con un 3-guanidinofenilo en P_{1}.

La Figura 9 muestra un esquema de reacción para la obtención de un compuesto de la presente invención con un 2-guanidinotiofenilo en P_{1}.

La Figura 11 muestra un esquema de reacción para la obtención de un compuesto de la presente invención con un 3-amidinopiridilo en P_{1}.

Los métodos preferibles de acoplamiento químico (como por ejemplo, una función enlace amida) incluyen la formación de un enlace peptídico mediante la utilización de reactivos de acoplamiento convencionales conocidos en la materia. Véase Bodanszky, N. Peptide Chemistry, págs. 55-73, Springer-Verlag, New York (1988) y las referencias citadas en éste. El acoplamiento químico puede realizarse a través de un acoplamiento en un paso o un acoplamiento en dos pasos. En el acoplamiento en un paso, las dos porciones del acoplamiento se acoplan directamente. Los reactivos de acoplamiento preferibles para un acoplamiento en un paso de las porciones de acoplamiento incluyen DCC con HOBt, EDC con HOBt, EDC con HOAt, HBTU o TBTU. En el acoplamiento en dos pasos, se forma un éster activado o anhídrido del grupo carboxilo C-terminal de una porción de acoplamiento previamente a su acoplamiento a la otra porción de acoplamiento.

Para la obtención de ciertos compuestos con grupos sustituyentes sensibles a la hidrogenación, es preferible evitar la utilización de gas hidrógeno con paladio sobre carbono. Otro método preferido para la preparación de compuestos de la presente invención que contienen grupos sensibles a la hidrogenación como las porciones alquenilo o arilo sustituidas con halógeno, ciano, nitro, o -S-Z_{1}, es la utilización de tris(trifluoroacetato) de boro, B(OCOCF_{3})_{3}, para escindir el N^{g}-nitro del grupo arginina.

El reactivo se prepara mediante la reacción de BBr_{3} y CF_{3}COOH en diclorometano a 0ºC. El reactivo también está disponible comercialmente. En general, el compuesto N^{g}-nitro se trata con tris(trifluoroacetato) de boro en ácido trifluoroacético a 0ºC. Véase, por ejemplo, Fieser, M. y Fieser, L. F., Reagents for Organic Synthesis, pág. 46, John Wiley & Sons, New York (1974); Pless, J. y Bauer, W. Angew. Chem., Internat. Ed., 12, 147 (1973).

Además, otro reactivo preferible para la escisión selectiva de un grupo nitro es el tricloruro de titanio. Este reactivo está disponible comercialmente. El compuesto N^{g} nitro se trata con tricloruro de titanio en metanol acuoso que contiene un tampón de acetato de amonio seguido de la exposición de la mezcla de reacción al aire o a dimetilsulfóxido. Véase, por ejemplo, Freidinger, R. M., Hirschmann, R. y Veber, D. F., J. Org. Chem., 43, 4800 (1978).

La figura 6 muestra un esquema de reacción de la síntesis de un compuesto de la presente invención en el que R_{2} es -CH_{2}OA_{1} y A_{1} es -C(=O)R_{6}:

13

Un intermediario como el 6-1 (el compuesto del Ejemplo 9) se hace reaccionar con un cloruro ácido R_{6}COCl en presencia de una base como la piridina. Los compuestos en los que R_{2} es -(CH_{2})_{2}OA_{1} o -CH(R_{5})OA_{1} en los que A_{1} es -C(=O)R_{6} pueden prepararse convenientemente mediante la reacción de un intermediario apropiado correspondiente a 6-1 con el derivado cloruro ácido apropiado, R_{6}COCl, preferiblemente en presencia de una base como la piridina.

Los compuestos en los que R_{2} es (CH_{2})_{2}OA_{1} o -CH(R_{5})OA_{1} en los que A_{1} es -C(=O)OR_{6} pueden prepararse convenientemente mediante el tratamiento del compuesto correspondiente en el que R_{2} es -(CH_{2})_{2}OH o -CH(R_{5})OH con el derivado cloroformato apropiado. En la obtención de compuestos con un grupo amidino o guanidino en P1, puede ser preferible proteger el hidroxilo en P3 con el grupo carbonato previamente a la desprotección del grupo amidino o guanidino. De forma concordante, es preferible tratar el intermediario correspondiente con el derivado cloroformato. (Véase, por ejemplo, el Ejemplo 8). El producto entonces se hidrogena y de forma opcional se trata bajo condiciones de hidrólisis para dar lugar al producto. (Véanse, por ejemplo, los Ejemplos 16, 21, 28, 35 y 40).

3. Selección de los Compuestos Preferibles

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, los compuestos preferibles de la presente invención se seleccionan por su potencia y selectividad por la inhibición de serin-proteasas, especialmente la uroquinasa. Estas evaluaciones se realizan de forma rutinaria in vitro, siguiendo procedimientos como los que se exponen en el Ejemplo A.
Como se describe en éste, y como en general es conocido, una serin-proteasa diana y su sustrato se combinan en condiciones de reacción que permitan la reacción de la proteasa con su sustrato. El ensayo se realiza en ausencia del compuesto de prueba, y en presencia de concentraciones crecientes del compuesto de prueba. La concentración del compuesto de prueba a la que el 50% de la actividad de la serin-proteasa está inhibida por el compuesto de prueba es el valor de CI_{50} (Concentración inhibitoria) o valor de CE_{50} (Concentración Efectiva) de ese compuesto. Dentro de una serie o grupo de compuestos de prueba, aquellos con valores de CI_{50} o CE_{50} menores se consideran inhibidores más potentes de la serin-proteasa que aquellos compuestos con valores de CI_{50} o CE_{50} superiores. La medida de la CI_{50} se utiliza a menudo para ensayos más sencillos, mientras que la CE_{50} se utiliza a menudo para ensayos más complejos, como los que utilizan células. La K_{i} se calcula a partir de la CI_{50}.

Los compuestos preferibles de acuerdo con este aspecto de la presente invención tienen un valor de K_{i} de 100 nM o inferior medido en un ensayo in vitro de la inhibición de la actividad de la uroquinasa. Los compuestos especialmente preferibles tienen un valor de K_{i} inferior a 30 nM.

En los compuestos de prueba también se valora la selectividad frente a serin-proteasas. Como se describe en los Ejemplos, y como en general es conocido, se realiza un ensayo de la potencia de un compuesto de prueba frente a un panel de serin-proteasas y otros enzimas, y se determina un valor de CI_{50} o valor de CE_{50} para cada compuesto de prueba en cada sistema de ensayo. Un compuesto en el que se demuestra un valor de CI_{50} o valor de CE_{50} bajo o un valor de la K_{i} correspondiente bajo para la enzima diana, por ejemplo, la uroquinasa y un valor de CI_{50} o valor de CE_{50} superior para otras enzimas del panel de ensayo (por ejemplo, activador del plasminógeno tisular, trombina, factor Xa), se considera selectivo frente a la enzima diana. Generalmente, un compuesto se considera selectivo si su valor de CI_{50} o valor de CE_{50} (o valor de K_{i}) en el ensayo con la enzima diana es de al menos un orden de magnitud inferior al siguiente valor de CI_{50} o valor de CE_{50} más bajo obtenido en el panel de selectividad de enzimas.

Los compuestos preferibles de la presente invención tienen un valor de K_{i} de 100 nM o inferior según un ensayo in vitro de inhibición de la actividad de la uroquinasa. Los compuestos especialmente preferibles tienen un valor de K_{i} en el ensayo in vitro de inhibición de la uroquinasa de al menos un orden de magnitud inferior al valor de CI_{50} obtenido en el ensayo in vitro de inhibición del tPA. Los compuestos con una proporción de selectividad entre CI_{50} del ensayo tPA: K_{i} del ensayo uroquinasa superior a 100 son especialmente preferibles.

En los compuestos de la presente invención también se evalúa su actividad in vivo. El tipo de ensayo elegido para la evaluación de los compuestos de prueba dependerá del estado patológico a tratar o prevenir mediante el uso del compuesto, así como la ruta de administración a evaluar para el compuesto de prueba.

Por ejemplo, para evaluar la actividad de un compuesto de la presente invención en la reducción del crecimiento tumoral a través de la inhibición de la uroquinasa, pueden utilizarse los procedimientos descritos por Jankun et al. [Canc. Res. 57:559-563, 1997] para evaluar PAI-1. Brevemente, la línea celular DU145 de la ATCC, que expresa un nivel elevado de uPA, y la LnCaP, que no expresa uPA, se inyectan en ratones SCID. Tras el establecimiento de tumores, se administra a los ratones compuesto de prueba de acuerdo con un régimen de dosificación determinado a partir de las características del compuesto in vitro. El compuesto de Jankun et al. se administró en agua. Las medidas del volumen de los tumores se realizaron dos veces por semana durante alrededor de cinco semanas. Un compuesto se consideró activo si un animal al que se le había administrado el compuesto mostraba una reducción del volumen del tumor, comparado con los animales que recibían compuestos control apropiados. Además, una comparación del efecto de un compuesto en animales a los que se les ha inyectado células DU145 frente a células LnCaP puede mostrar si el efecto de un compuesto es debido a la inhibición de la uroquinasa.

Otro modelo experimental in vivo diseñado para evaluar el efecto de la p-aminobenzamidina, un compuesto propuesto como inhibidor de la uroquinasa, sobre la reducción del volumen del tumor se describe en Billström et al. [Int. J. Cancer 61:542-547, 1995].

Para evaluar la capacidad de un compuesto de la presente invención de reducir la aparición o de inhibir, la metástasis, pueden utilizarse los procedimientos descritos por Kobayashi et al. [Int. J. Canc. 57:727-733d, 1994]. Brevemente, un injerto heterólogo murino seleccionado por su elevado potencial de colonización del pulmón se inyectó en ratones C57B1/6 por vía i.v. (metástasis experimental) o por vía s.c. en la pared abdominal (metástasis espontánea). Varias concentraciones del compuesto de prueba pueden mezclarse con las células tumorales en Matrigel previamente a la inyección. Diariamente se realizan inyecciones por vía i.p. del compuesto de prueba en los días 1-6 o en los días 7-13 tras la inoculación del tumor. Los animales se sacrifican alrededor de tres o cuatro semanas tras la inoculación del tumor, y se cuentan las colonias tumorales en el pulmón. La evaluación de los datos resultantes permite una determinación de la eficacia del compuesto de prueba, dosis óptima y ruta de administración.

La actividad de los compuestos de la presente invención frente a la reducción del volumen del tumor y la metástasis puede evaluarse en el modelo descrito por Rabbani et al. [Int. J. Cancer 63:840-845, 1995] para evaluar su inhibidor. En éste, se inyectaron células tumorales Mat LyLu que sobreexpresan el uPA en el flanco de ratas Copenhagen. A los animales se les implantaron mini-bombas osmóticas par la administración continua de varias dosis del compuesto de prueba durante hasta tres semanas. Durante el experimento se evaluaron la masa y el volumen tumoral de los animales experimentales y control, así como el crecimiento de metástasis. La evaluación de los datos resultantes permite la determinación de la eficacia del compuesto de prueba, la dosis óptima y ruta de administración. Algunos de estos autores han descrito un protocolo relacionado en Xing et al. [Canc. Res. 57:3585-3593, 1997].

Para evaluar la actividad inhibitoria de un compuesto de la presente invención frente a la neovascularización, puede utilizarse un modelo de neovascularización de cornea de conejo. Avery et al. [Arch. Ophthalmol. 108:1474-1475, 1990] describieron el anestesiado de conejos albinos de Nueva Zelanda y luego la realización de una incisión central en la cornea y la formación de un surco radial en la cornea. Un botón de liberación lenta de prostaglandinas se colocó en el surco para inducir la neovascularización. El compuesto de prueba se administró por vía i.p. durante cinco días, en cuyo momento los animales se sacrificaron. El efecto del compuesto de prueba se evaluó mediante la revisión de fotografías del limbo tomadas periódicamente, que pueden utilizarse para calcular el área de respuesta neovascular y, por lo tanto, la neovascularización limbal. Un área reducida de neovascularización comparado con los controles apropiados indica que el compuesto de prueba es efectivo en la reducción o inhibición de la neovascularización.

Un modelo de angiogénesis utilizado para evaluar el efecto de un compuesto de prueba en la inhibición de la angiogénesis se describe en Min et al. [Canc. Res. 56:2428-2433, 1996]. Los ratones C57BL6 recibieron inyecciones subcutáneas de una mezcla de Matrigel que contenía bFGF, como agente inductor de angiogénesis, con y sin compuesto de prueba. Tras cinco días, los animales se sacrificaron y se fotografiaron los tapones de Matrigel, en los que puede visualizarse la neovascularización. Un animal de experimentación que ha recibido Matrigel y una dosis efectiva de compuesto de prueba mostrará una vascularización menor a la de un animal control o un animal experimental que ha recibido una dosis menor o no efectiva del compuesto.

Un sistema in vivo diseñado para probar la capacidad de los compuestos de limitar la expansión de tumores primarios se describe en Crowley et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. 90:5021-5025, 1993]. Se inyectaron células tumorales (PC3) modificadas para que expresen la CAT (cloranfenicol acetiltransferasa) en ratones sin pelaje. Las células secretan grandes cantidades de uPA y muestra cantidades saturantes de actividad de uPA unido al uPAR sobre la superficie celular. Los compuestos de los que quiere evaluarse su capacidad de reducir el tamaño del tumor y/o las metástasis se administraron a los animales, y se realizaron mediciones subsiguientes del tamaño del tumor y/o del crecimiento de metástasis. Además, el nivel de CAT detectado en varios órganos proporciona una prueba de la capacidad del compuesto de prueba de inhibir la metástasis; la detección de menos CAT en los tejidos de un animal tratado frente a un animal control indicaría una menor migración de células que expresan la CAT a ese tejido.

Los modelos experimentales in vivo diseñados para evaluar el potencial inhibitorio de la uroquinasa de un compuesto de prueba, utilizando la línea de células tumorales F3II, que se ha descrito como altamente invasiva, se han descrito en Alonso et al. [Breast Canc. Res. Treat. 40:209-223, 1996]. Este grupo describe estudios in vivo para la determinación de la toxicidad, el crecimiento tumoral, invasividad, metástasis espontánea, metástasis experimental al pulmón y un ensayo de angiogénesis.

El modelo MCA (modelo de la membrana corioalantoidea del embrión de pollo), descrito inicialmente por L. Ossowski en 1998 [J. Cell Biol. 107:2437-2445, 1988], proporciona otro método para la evaluación de la actividad inhibitoria de la uroquinasa de un compuesto de prueba. En el modelo MCA, la invasión de células tumorales a través de la membrana corioalantoidea depende de la presencia de uPA catalíticamente activo. La puesta en contacto de la MCA con células tumorales en presencia de un agente inhibidor de la uroquinasa resulta en una reducción o inhibición de la invasión de las células tumorales a través de la membrana. Por lo tanto, el ensayo MCA re realiza con la MCA y las células tumorales en presencia y ausencia de varias concentraciones de compuesto de prueba. La invasividad de las células tumorales se mide bajo estas condiciones para proporcionar una prueba de la actividad inhibitoria de la uroquinasa del compuesto. Un compuesto con actividad inhibitoria de la uroquinasa se corresponde con una menor invasión tumoral.

El modelo MCA también se utiliza en un ensayo estándar de angiogénesis (es decir, efecto sobre la formación de nuevos vasos sanguíneos (Brooks, P.C.; Montgomery, A.M.P.; y Cheresh, D.A., Methods in Molecular Biology 129: 257-269 (1999)). De acuerdo con este modelo, se coloca en la MCA un disco de filtro que contiene un inductor de la angiogénesis, como el factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF). La difusión de la citoquina en la MCA induce una angiogénesis local, que puede medirse de varias formas como el contaje del número de puntos de ramificación de los vasos sanguíneos de la MCA directamente bajo el disco de filtro. La capacidad de los compuestos de la presente invención de inhibir la angiogénesis inducida por citoquinas puede comprobarse utilizando este modelo. Un compuesto de prueba puede añadirse al disco de filtro que contiene el inductor de angiogénesis, situarse directamente sobre la membrana o administrarse de forma sistémica. La extensión de la formación de nuevos vasos sanguíneos en presencia y/o ausencia de un compuesto de prueba puede compararse utilizando este modelo. La formación de menos vasos sanguíneos nuevos en presencia de un compuesto de prueba sería indicativa de una actividad anti-angiogénesis. Ya que ciertos compuestos de la presente invención son activos como inhibidores de la uroquinasa, una actividad anti-angiogénesis de estos compuestos podría sugerir que la uroquinasa juega un papel significativo en la angiogénesis.

4. Composiciones farmacéuticas

En otro aspecto, la presente invención incluye las composiciones farmacéuticas preparadas para su almacenamiento o administración que comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la presente invención en un transportador farmacéuticamente aceptable.

La cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la presente invención dependerá de la vía de administración, el tipo de mamífero a tratar y de las características físicas del mamífero específico a considerar. Estos factores y su relación con la determinación de esta cantidad son bien conocidos para los expertos en la práctica médica. Esta cantidad y el método de administración pueden ajustarse para alcanzar una eficacia óptima pero dependerán de factores como el peso, dieta, medicación concurrente y otros factores que los expertos en la práctica médica reconocerán.

La cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto de la presente invención puede oscilar ampliamente en función de los efectos deseados y la indicación terapéutica. Normalmente, las dosis estarán entre alrededor de 0,01 mg/kg y 100 mg/kg de peso corporal, preferiblemente entre alrededor de 0,01 y 10 mg/kg de peso corporal.

Los transportadores farmacéuticamente aceptables para la utilización terapéutica son bien conocidos en la materia farmacéutica, y se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro edit. 1985). Pueden utilizarse, por ejemplo, salina y salina tamponada con fosfato estéril a pH fisiológico. Pueden proporcionarse agentes conservantes, estabilizantes, colorantes e incluso aromatizantes en la composición farmacéutica. Pueden añadirse, por ejemplo, benzoato sódico, ácido sórbico y ésteres de ácido p-hidroxibenzoico como conservantes. Id. en 1449. Además, pueden utilizarse agentes antioxidantes y suspensores. Id.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden formularse y utilizarse como comprimidos, cápsulas o elixires para la administración oral; supositorios para la administración rectal; soluciones y suspensiones estériles para la administración inyectable; y similares. La dosis y método de administración puede ajustarse para alcanzar una eficacia óptima pero dependerán de factores como el peso, dieta, medicación concurrente y otros factores que los expertos en la práctica médica reconocerán.

Cuando la administración ha de ser parenteral, como por ejemplo intravenosa de forma diaria, las composiciones farmacéuticas inyectables pueden prepararse en formas convencionales, como soluciones o suspensiones líquidas, formas sólidas adecuadas para su disolución o suspensión en líquido previamente a la inyección, o como emulsiones. Los excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, salina, dextrosa, manitol, lactosa, lecitina, albúmina, glutamato sódico o similares. Además, si se desea, las composiciones farmacéuticas inyectables pueden contener cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas, como los agentes humectantes, los agentes tamponadores de pH y similares. Si se desea, pueden utilizarse preparaciones potenciadoras de la absorción (por ejemplo, liposomas).

5. Utilidad

Los compuestos de la presente invención con actividad inhibitoria de la uroquinasa y/o actividad en la reducción o inhibición de la formación de vasos sanguíneos, lo que incluye la angiogénesis y la neovascularización, pueden utilizarse tanto in vitro como in vivo para una variedad de aplicaciones, algunas de las cuales se describen aquí a continuación.

Los compuestos de la presente invención son activos como inhibidores de la uroquinasa y se unen específicamente a la uroquinasa. De acuerdo con esto, aquellos compuestos que contienen lugares adecuados para la unión a un soporte sólido/ gel pueden utilizarse in vitro en una cromatografía de afinidad para purificar la uroquinasa de una muestra o para eliminar la uroquinasa de una muestra utilizando procedimientos convencionales de cromatografía de afinidad. Estos compuestos se unen o acoplan a una cromatografía de afinidad directamente o a través de un soporte de unión adecuado utilizando métodos convencionales. Véase, por ejemplo, Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons (J.E. Coligan et al., eds, 1997) y Protein Purification Protocols, Humana Press (S. Doonan, ed., 1966) y las referencias en éstos.

Los compuestos de la presente invención con actividad inhibitoria de la uroquinasa son útiles en ensayos in vitro para medir la actividad tPA en una muestra. En los ensayos que miden la actividad total de activación del plasminógeno en una muestra de sangre, un compuesto de la presente invención con actividad inhibitoria de la uroquinasa eliminará la porción de la activación del plasminógeno que puede atribuirse al uPA, lo que permitirá calcular la porción de la activación del plasminógeno total debida a la actividad del tPA así como la debida a la actividad del uPA. La utilización de tales ensayos para monitorizar la actividad del tPA permitirá un mejor control de la dosis en pacientes a los que se está administrando tPA. Estos ensayos también podrían utilizarse para monitorizar los niveles de actividad de uPA en muestras de tejido, como por ejemplo una biopsia o para monitorizar las actividades de uPA/ tPA en cualquier situación clínica en la que la medida de la actividad de activación del plasminógeno sea de ayuda. Estos ensayos también podrían utilizarse para monitorizar la actividad de activación del plasminógeno cuando un paciente ha sido tratado con un compuesto no endógeno con actividad de activación del plasminógeno, como la estreptoquinasa y estafiloquinasa

Los compuestos de la presente invención son útiles in vivo para el tratamiento de estados patológicos que podrían mejorarse reduciendo la actividad de la uroquinasa. Por ejemplo estos compuestos inhibirán la activación de las metaloproteasas por la cascada uPA-plasmina en el líquido sinovial y por tanto, pueden utilizarse en el tratamiento de la artritis.

Se cree que estos compuestos serán útiles en la reducción o inhibición de la metástasis, la neovascularización y la degradación de la matriz extracelular en tumores y otras neoplasias. Estos compuestos serán útiles como agentes terapéuticos en el tratamiento de estados caracterizados por una neovascularización patológica como la enfermedad de la retina, retinopatías y otros estados, lo que incluye aquellos descritos aquí con anterioridad en los Antecedentes e Introducción a la Invención.

Otra utilización de los compuestos de la presente invención con actividad inhibitoria de la uroquinasa es como antídoto si se ha administrado demasiada uroquinasa exógena a un paciente con otros propósitos, como para la disolución de un coágulo de sangre.

Los compuestos de la presente invención pueden utilizarse en el tratamiento de estados caracterizados por la inflamación debido a sus efectos anti-inflamatorios a causa de la inhibición de la uroquinasa, interfiriendo así con los mediadores de la adhesión o la migración celulares. Tales aplicaciones anti-inflamatorias incluyen el tratamiento de la apoplejía y las complicaciones del transplante de órganos.

La presente invención incluye métodos para la prevención o tratamiento de un estado en un mamífero en el que se sospecha un estado que puede atenuarse mediante la inhibición de la actividad de la uroquinasa que comprenden la administración a dicho mamífero de una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto o una composición farmacéutica de la presente invención.

Los compuestos o composiciones farmacéuticas de la presente invención se administran in vivo, de forma ordinaria en un mamífero, preferiblemente en un humano. En su utilización in vivo, los compuestos o composiciones farmacéuticas pueden administrarse a un mamífero de una variedad de formas, lo que incluye la vía oral, parenteral, intravenosa, subcutánea, intramuscular, colónica, rectal, nasal o intraperitoneal, utilizando una variedad de formas de dosificación. La administración es preferiblemente oral, como por ejemplo mediante comprimidos, cápsulas o elixires administrados de forma diaria.

En la práctica de los métodos de la presente invención, los compuestos o composiciones farmacéuticas de la presente invención se administran solos o en combinación con otro de estos, o en combinación con otros agentes terapéuticos o de diagnóstico in vivo.

Como será evidente para el experto en la práctica médica, una "cantidad terapéuticamente efectiva" de los compuestos o composiciones farmacéuticas de la presente invención variarán dependiendo de la edad, peso y especie de mamífero a tratar, los compuestos particulares utilizados, la vía concreta de administración, los efectos deseados y la indicación terapéutica. Como estos factores y su relación con la determinación de tal cantidad son bien conocidos en la práctica médica, la determinación de los niveles de dosificación terapéuticamente efectivos, la cantidad necesaria para alcanzar el resultado deseado de inhibición de la actividad del uPA, estarán dentro del ámbito de un experto en la materia. Normalmente, la administración de los compuestos o composiciones farmacéuticas de la presente invención se inicia a niveles de dosificación inferiores, aumentándose los niveles de dosificación hasta conseguir el efecto deseado de inhibición de la actividad del uPA hasta los niveles deseados, que definirán una cantidad terapéuticamente efectiva. Para los compuestos de la presente invención, solos o como parte de una composición farmacéutica, estas dosis están entre alrededor de 0,01 mg/kg y 100 mg/kg de peso corporal, preferiblemente entre alrededor de 0,01 mg/kg y 10 mg/kg de peso corporal.

Para ayudar en la compresión, la presente invención se ilustrará mediante los siguientes ejemplos. Estos ejemplos relacionados con la invención no deben, por supuesto, interpretarse como una limitación específica de la invención y aquellas variaciones de la invención, conocidas en este momento o desarrolladas en el futuro, que puedan estar dentro del alcance de un experto en la materia se considera que están dentro del alcance de la invención como se describe aquí y se reivindica más adelante.

Ejemplos A. Síntesis de Algunos Compuestos de la Presente Invención Ejemplo 1 Preparación de n-butilsulfonil-D-serina(terc-butil-éter)-metiléster (1)

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Una solución de HCl\cdotH-dSer(tBu)-OMe (2 g, 9,44 mmol) y cloruro de n-butilsulfonilo (1,1 ml, 8,50 mmol) en tetrahidrofurano (38 ml) se agitó durante diez minutos a temperatura ambiente. Se añadió entonces diisopropiletilamina (5,75 ml, 33,07 mmol) y la solución amarilla turbia se agitó durante la noche a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se diluyó entonces con acetato de etilo (200 ml) y se lavó con HCl 1N, seguido de salmuera (20 ml cada uno). Tras el secado sobre sulfato sódico anhidro, se eliminaron los solventes al vacío. El sólido amarillo grumoso (1,56 g, 62%) se interpretó que era puro mediante TLC (5% acetato de etilo en hexanos).

Ejemplo 2 Preparación de n-butilsulfonil-D-serina(terc-butil-éter) (2)

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A una solución del compuesto 1 (1,46 g, 4,94 mmol) en dioxano (32,95 ml), se le añadió gota a gota LiOH 2,0 N (5,44 ml, 10,87 mmol). La solución amarilla turbia se dejó agitar a temperatura ambiente durante la noche. Cuando se dejó de observar material de partida mediante TLC (5% acetato de etilo/ hexanos), el dioxano en exceso se eliminó al vacío. La mezcla de reacción se diluyó con una mezcla 1:1 de agua y metanol, y se pasó a través de una resina de intercambio iónico DOWEX prelavada (50 x 8-400) (30 ml). La resina se enjuagó exhaustivamente con metanol y agua. Los filtrados combinados se concentraron bajo presión reducida para proporcionar 1,44 g del compuesto del título en un rendimiento cuantitativo como un sólido cremoso.

Ejemplo 3 Preparación de n-butilsulfonil-D-serina(terc-butil-éter)-alanina terc-butiléster (3)

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16

Una solución del compuesto del Ejemplo 2 (0,50 g, 1,79 mmol), alanina terc-butiléster sal de clorhidrato (0,65 g, 3,58 mmol), EDC (0,68 g, 3,57 mmol), N-hidroxibenzotriazol (0,27 g, 1,79 mmol) y diisopropiletilamina (1,56 ml, 8,94 mmol) se agitó en acetonitrilo (18 ml) a temperatura ambiente. Tras 18 horas, el solvente se eliminó bajo presión reducida y el residuo resultante se resuspendió en acetato de etilo (50 ml) y HCl 1N (10 ml). La fase de acetato de etilo se lavó con HCl 1N (10 ml), bicarbonato sódico saturado (2 x 15 ml) y salmuera (15 ml), después se secó con sulfato sódico. El solvente se eliminó bajo presión reducida y el producto bruto se purificó mediante cromatografía rápida en columna eluyendo con 50% acetato de etilo/ hexanos, proporcionando 429 mg (59%) de producto. El producto apareció como un único pico en la HPLC de fase reversa (C18) (t_{R}= 9 minutos en ácido trifluoroacético al 0,1% en acetonitrilo acuoso al 5-90% durante 20 minutos).

Ejemplo 4 Preparación de n-butilsulfonil-D-serina-alanina (4)

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17

A una solución del compuesto del Ejemplo 3 (0,42 g, 1,02 mmol) en diclorometano (4,2 ml) se le añadió ácido trifluoroacético (4,2 ml). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. La mezcla de reacción se diluyó con 50 ml de n-heptano y se concentró al vacío. El residuo se resuspendió en 10 ml de acetonitrilo y 50 ml de n-heptano y se concentró al vacío para proporcionar 410 mg de producto.

Ejemplo 5 Preparación de \alpha-azido-4-cianotolueno (5)

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18

Se añadió azida sódica (Aldrich, 3,5 g, 54 mmol) a una solución de \alpha-bromotoluenitrilo (Aldrich, 10 g, 51 mmol) en DMF (100 ml), y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 5 horas. La mezcla de reacción se diluyó entonces con agua (350 ml) y se extrajo con éter (2 x 100 ml). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera y se secaron (MgSO_{4}). La eliminación del solvente proporcionó el compuesto del título (8 g, 96%). ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 4,42 (s, 2H), 7,41 (d, 2H, J = 8,1 Hz), 7,65 (d, 2H, J = 8,1 Hz).

Ejemplo 6 Preparación de 4-(aminometil)bencilnitrilo (6)

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19

Se añadió el catalizador Pd sobre C al 10% (Aldrich, 800 mg) a una solución de \alpha-azido-4-cianotolueno (compuesto 5, 8 g, 51 mmol) en EtOAc (150 ml). La mezcla de reacción se hidrogenó (H2, 45 psi) en un aparato Parr durante 11 horas. El catalizador se filtró y el solvente se eliminó al vacío para proporcionar el compuesto del título (6,3 g, 93%). ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 3,85 (s, 2H), 7,45 (d, 2H, J = 8,1), 7,60 (d, 2H, J = 8,1 Hz), 7,78 (s, 2H, NH_{2}).

Ejemplo 7 Preparación de n-butilsulfonil-D-serina-alanina-4-cianobencilamida (7)

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20

Una solución del compuesto 4 (150 mg, 0,51 mmol), 4-(aminometil)bencilnitrilo (compuesto 6, 171 mg, 1,02 mmol), EDC (195 mg, 1,02 mmol), y N-hidroxibenzotriazol (78 mg, 0,51 mmol) en acetonitrilo (5,1 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se añadió entonces 2,4,6-colidina (0,34 ml, 2,54 mmol) y la mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente. El solvente se eliminó bajo presión reducida y el residuo resultante se resuspendió en acetato de etilo (100 ml) y HCl 0,5M (10 ml). La fase de acetato de etilo se lavó con agua seguido de HCl 0,5M (10 ml), bicarbonato sódico saturado (2 x 10 ml) y salmuera (15 ml), después se secó con sulfato sódico. El solvente se eliminó bajo presión reducida para proporcionar 237 mg de producto. El producto eluyó a los 9,5 minutos mediante HPLC de fase reversa (C18) con ácido trifluoroacético al 0,1% en acetonitrilo acuoso al 5-75% durante 20 minutos.

Ejemplo 8 Preparación de n-butilsulfonil-D-serina-alanina-4-hidroxiamidinobencilamida (8)

21

A una solución del producto del Ejemplo 7 (117 mg, 0,285 mmol) en 1,14 ml de metanol se le añadió clorhidrato de hidroxilamina (33,7 mg, 0,485 mmol), seguido de N-metilmorfolina (53 \mul, 0,485 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente y después a 50ºC durante seis horas. La mezcla de reacción se concentró al vacío. El producto bruto se llevó al siguiente paso (Ejemplo 9) sin más purificación. El producto eluyó a los 6,5 minutos mediante HPLC de fase reversa (C18) con ácido trifluoroacético al 0,1% en acetonitrilo acuoso al 5-50% durante 20 minutos.

Ejemplo 9 Preparación de n-butilsulfonil-D-serina-alanina-4-amidinobencilamida (9)

22

Al producto del Ejemplo 8 (126 mg, 0,285 mmol) ácido acético (2,85 ml) y agua (0,28 ml) se le añadió 185 mg de polvo de zinc activado. La mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente. El polvo de zinc se filtró utilizando un embudo de vidrio y el filtrado se purificó mediante HPLC preparativa. Las fracciones que contenían el producto se eluyeron en acetonitrilo acuoso al 5-20% que contenía TFA al 0,1%, y se combinaron y liofilizaron proporcionando 35 mg del compuesto del título como un polvo blanco. El producto eluyó a los 6,0 minutos mediante HPLC de fase reversa (C18) con ácido trifluoroacético al 0,1% en acetonitrilo acuoso al 5-50% durante 20 minutos.

Ejemplo 10 Preparación de bencilsulfonil-D-serina(terc-butil-éter)-metil éster (10)

23

Una solución de HCl\cdotH-dSer(tBu)-OMe (1 g, 4,72 mmol) y cloruro de fenetilsulfonilo (1,45 g, 7,08 mmol) en acetonitrilo (19 ml) se agitó durante diez minutos a temperatura ambiente. Se añadió entonces diisopropiletilamina (1,53 ml, 11,81 mmol) y la solución amarilla clara se agitó durante 18 horas a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se diluyó entonces con acetato de etilo (100 ml) y se lavó con HCl 1N, seguido de salmuera (10 ml cada uno). Tras el secado sobre sulfato sódico anhidro, los solventes se eliminaron al vacío. El producto bruto se purificó mediante cromatografía rápida en columna eluyendo con diclorometano, seguido de un gradiente que consiste de acetato de etilo del 1 al 5% en diclorometano, proporcionando 840 mg (52%) de producto. La TLC del producto final en acetato de etilo al 5% en diclorometano proporcionó un punto con una Rf de 0,52.

Ejemplo 11 Preparación de bencilsulfonil-D-serina(terc-butiléter) (11)

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24

A una solución del compuesto del Ejemplo 10 (1,0 g, 3,03 mmol) en dioxano (20 ml), se le añadió gota a gota LiOH 2,0N (3,33 ml, 6,67 mmol). La solución se dejó en agitación a temperatura ambiente durante la noche. El exceso de dioxano se eliminó al vacío. La mezcla de reacción se diluyó con una mezcla 1:1 de agua y metanol y se pasó a través de una resina de intercambio iónico DOWEX prelavada (50 x 8-400) (30 ml). La resina se enjuagó exhaustivamente con metanol y agua. Los filtrados combinados se concentraron bajo presión reducida para proporcionar 1,10 g del compuesto del título como un pegamento amarillo.

Ejemplo 12 Preparación de terc-butiloxicarbonil-3,4-dehidroprolina p-cianobencilamida (12)

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25

Una solución de terc-butiloxicarbonil-3,4-dehidroprolina (0,4 g, 1,88 mmol), 4-(aminometil) bencilnitrilo (compuesto 6, 0,47 g, 2,82 mmol), EDC (0,54 g, 2,82 mmol), N-hidroxibenzotriazol (0,29 g, 1,88 mmol), y diisopropiletilamina (1,64 ml, 9,39 mmol) en acetonitrilo (7,5 ml) se agitó durante la noche a temperatura ambiente. El solvente se eliminó bajo presión reducida y el residuo resultante se resuspendió en acetato de etilo (25 ml) y HCl 0,5M (5 ml). La fase de acetato de etilo se lavó con agua seguido de HCl 0,5M (5 ml), bicarbonato sódico saturado (2 x 5 ml) y salmuera (10 ml), después se secó con sulfato sódico. El solvente se eliminó bajo presión reducida y el producto bruto se purificó mediante cromatografía rápida en columna eluyendo con 4/1 de acetato de etilo/hexano para proporcionar 561 mg de producto puro (91,3%). El producto eluyó a los 10,5 minutos mediante HPLC de fase reversa (C18) con ácido trifluoroacético al 0,1% en acetonitrilo acuoso al 5-75% durante 20 minutos.

Ejemplo 13 Preparación de 3,4-dehidroprolina-4-ciano bencil amida sal de clorhidrato (13)

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26

A una solución del compuesto del Ejemplo 12 (0,47 g, 1,44 mmol) en acetato de etilo (5,7 ml) se le añadió HCl anhidra 5M en acetato de etilo (1,44 ml) y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se concentró al vacío para proporcionar 363 mg (95%) de un sólido blanco.

Ejemplo 14 Preparación de bencilsulfonil-D-serina(terc-butiléter)-prolina(dehidro)-4-cianobencilamida (14)

27

Una solución del compuesto del Ejemplo 11 (0,10 g, 0,32 mmol), del compuesto del ejemplo 13 (0,092 g, 0,34 mmol), EDC (0,091 g, 0,48 mmol), y N-hidroxibenzotriazol (0,053 g, 0,35 mmol) se agitó en acetonitrilo (1,2 ml) durante 10 minutos. Se añadió entonces 2,4,6-colidina (0,209 ml, 1,58 mmol) y la mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente. El solvente se eliminó bajo presión reducida. El residuo resultante se resuspendió en acetato de etilo (50 ml) y HCl 1N (10 ml). La fase de acetato de etilo se lavó con HCl 1N (10 ml), bicarbonato sódico saturado (2 x 15 ml) y salmuera (15 ml), después se secó con sulfato sódico hasta proporcionar un jarabe amarillo (160 mg, 94%). El producto produjo un único pico mediante HPLC de fase reversa (C18) (t_{R}= 11 minutos con ácido trifluoroacético al 0,1% en 5-90% acetonitrilo acuoso durante 20 minutos).

Ejemplo 15 Preparación de bencilsulfonil-D-serina-3,4-dehidroprolina-4-cianobencilamida (15)

28

A una solución del compuesto del Ejemplo 14 (0,16 g, 0,30 mmol) en diclorometano (0,6 ml) se le añadió ácido trifluoroacético (0,6 ml). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. La mezcla de reacción se diluyó con 10 ml de n-heptano y se concentró al vacío. El residuo se resuspendió en 5 ml de acetonitrilo y 10 ml de n-heptano y se concentró al vacío para proporcionar 183 mg de producto.

Ejemplo 16 Preparación de bencilsulfonil-D-serina-3,4-dehidroprolina-4-hidroxiamidinobencilamida (16)

29

A una solución del producto del Ejemplo 15 (143 mg, 0,305 mmol) en 1,22 ml de metanol se le añadió clorhidrato de hidroxilamina (0,036 mg, 0,519 mmol) seguido de N-metilmorfolina (57 \mul, 0,519 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente. La HPLC analítica sugirió que la reacción no era completa. Se añadieron clorhidrato de hidroxilamina (0,036 mg, 0,519 mmol) y N-metilmorfolina (57 \mul, 0,519 mmol) adicionales y la agitación continuó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se concentró al vacío y el producto bruto se purificó mediante HPLC preparativa. Las fracciones que contenían el producto eluído en acetonitrilo acuoso al 5-20% que contenía una solución de TFA al 0,1% se combinaron y se liofilizaron proporcionando 16 mg del compuesto del título como un polvo blanco.

Ejemplo 17 Preparación de bencilsulfonil-D-serina-3,4-dehidroprolina-p-amidinobencilamida (17)

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30

Al producto del Ejemplo 16 (15 mg, 0,030 mmol) en ácido acético (0,30 ml) y agua (0,03 ml) se le añadieron 19 mg de polvo de zinc activado. La mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente. El polvo de zinc se filtró utilizando un embudo de vidrio y el filtrado se purificó mediante HPLC preparativa. Las fracciones que contenían el producto eluído en acetonitrilo acuoso al 5-20% que contenía una solución de TFA al 0,1% se combinaron y se liofilizaron proporcionando 7 mg del compuesto del título como un polvo blanco. El producto eluyó a minutos mediante HPLC de fase reversa (C18) con ácido trifluoroacético al 0,1% en acetonitrilo acuoso al 5-50% durante 20 minutos.

Ejemplo 18 Preparación de bis(benciloxicarbonil)guanidina (18)

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31

La síntesis del producto del título se llevó a cabo como se cita en la bibliografía (Tetrahedron Letters, vol. 35, No. 7, pp. 977-980, 1994) y se describe a continuación:

Una solución de N,N'-bis(benciloxicarbonil)-S-metil-isotiourea (1 g, 2,79 mmol) en amoníaco anhidro 7N en metanol (5,5 ml) se agitó durante la noche a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se concentró y el residuo restante se diluyó con acetato de etilo (10 ml). La fase orgánica se lavó dos veces con bicarbonato sódico saturado y una vez con salmuera (10 ml cada uno). Tras el secado sobre sulfato sódico, el producto bruto se sometió a cromatografía rápida en columna eluyendo con 3/2 de acetato de etilo/ hexanos para proporcionar 0,87 g de un sólido blanco. El producto se recristalizó entonces en un sistema de solvente 1:1 acetato de etilo: hexano para proporcionar 337 mg (37%) de producto puro (pf= 151ºC).

Ejemplo 19 Preparación de terc-butiloxicarbonil-4-amino-1-butanol (19)

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32

A una solución de 4-amino-1-butanol (1 g, 11,22 mmol) en tetrahidrofurano (45 ml) se le añadió Boc-anhídrido (2,20 g, 10,10 mmol) y trietilamina (2,84 g, 28,04 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se concentró y el residuo restante se diluyó con acetato de etilo (250 ml) y HCl 1M (50 ml). Las fases se separaron y la fase orgánica se lavó con HCl 1N, agua y salmuera (50 ml cada uno). Tras el secado sobre sulfato sódico 1,9 g (99%) el producto se obtuvo como un aceite claro.

Ejemplo 20 Síntesis de g-N,N'-bis(benciloxicarbonil)agmatina sal de trifluoroacetato (20)

33

A una solución del compuesto 18 (el producto del Ejemplo 18) (0,2 g, 0,61 mmol) y trifenilfosfina (0,12 g, 0,46 mmol) en tolueno seco (6,6 ml) bajo nitrógeno se le añadió mediante una jeringa el compuesto 19 (el producto del Ejemplo 19). La mezcla se enfrió a 0ºC, y se le añadió dietilazodicarboxilato (0,080 g, 0,46 mmol) gota a gota durante 15 minutos. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche al final de la cual, la TLC en 3/2 de acetato de etilo/ hexano confirmó la finalización de la reacción. Se añadieron cinco gotas de agua y el solvente se evaporó al vacío. El producto bruto se purificó mediante cromatografía rápida en columna eluyendo con 9/1 de hexanos/ acetato de etilo, seguido de 3/2 de hexanos/ acetato de etilo para proporcionar 83 mg (74%) de producto puro. El producto se trató entonces con diclorometano y ácido trifluoroacético (1 ml cada uno) durante una hora a temperatura ambiente. La eliminación de los solventes al vacío proporcionó 80 mg de producto 20.

Ejemplo 21 Preparación de n-butilsulfonil-D-serina-alanina-agmatina-q-N,N-bis(benciloxicarbonilo) (21)

34

Una solución del compuesto del Ejemplo 4 (0,05 g, 0,17 mmol), y del compuesto del Ejemplo 20 (0,065 g, 0,17 mmol), EDC (0,065 g, 0,34 mmol), y hidroxibenzotriazol (0,026 g, 0,17 mmol) se agitó en acetonitrilo (0,67 ml) durante 10 minutos. Se añadió entonces 2,4,6-colidina (0,11 ml, 0,84 mmol) y la mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente. El solvente se eliminó bajo presión reducida y el residuo resultante se resuspendió en acetato de etilo y HCl 1N (5 ml cada uno). La fase de acetato de etilo se lavó con HCl 1N (5 ml), bicarbonato sódico saturado (2 x 5 ml) y salmuera (5 ml), después se secó con sulfato sódico hasta formar un sólido (114 mg, 94%).

Ejemplo 22 Preparación de n-butilsulfonil-D-serina-alanina-agmatina (22)

35

El compuesto del Ejemplo 21 (114 mg, 0,17 mmol) se disolvió en metanol (15 ml) y se hidrogenó en un agitador Parr durante la noche a 40 psi en presencia de 15 mg de paladio sobre carbono. El catalizador se eliminó por filtración. La mezcla de reacción se diluyó a 35 ml con agua y se purificó mediante HPLC preparativa. Las fracciones que contenían el producto eluído en acetonitrilo acuoso al 0-25% que contenía TFA al 0,1% y se combinaron y liofilizaron proporcionando 16 mg del compuesto del título como un polvo blanco.

Ejemplo 23 Preparación de 2-ciano-5-metiltiofeno (23)

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36

Una solución de 2-bromo-5-metiltiofeno (TCI chemicals, 5 g, 28 mmol) y cianuro de cobre(I) (Aldrich, 2,53 g, 28 mmol) en DMF (10 ml) se calentó a su temperatura de reflujo durante 4 horas. Tras enfriar a temperatura ambiente, se añadieron acetato de etilo (500 ml) y solución acuosa de NaCN al 10% (500 ml). Tras la separación, se extrajo la fase acuosa con acetato de etilo (300 ml), y las fases orgánicas combinadas se concentraron en un aceite. El aceite se purificó de nuevo mediante una cromatografía rápida en columna (acetato de etilo) para proporcionar el compuesto del título (3,03 g, 87%). TLC: Rf 0,30 (1:1 de hexano/ acetato de etilo); ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 2,55 (m, 3H), 6,76 (d, 1H, J = 3,6 Hz), 7,42 (d, 1H, J = 3,6 Hz).

Ejemplo 24 Preparación de 2-ciano-5-(bromometil)tiofeno (24)

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37

Una solución de 2-ciano-5-metiltiofeno (compuesto 23, 3,0 g, 24 mmol), N-bromosuccinimida (Aldrich, 4,8 g, 27 mmol), y 2,2'-azobisisobutironitrilo (Aldrich, 0,4 g, 2,4 mmol) en CCl_{4} (Aldrich, 60 ml) se calentó a su temperatura de reflujo durante 5 horas. Tras enfriar a temperatura ambiente, el solvente se eliminó al vacío para proporcionar un aceite amarillo. El aceite se purificó mediante una cromatografía rápida en columna (1:1 de hexano/ acetato de etilo) para proporcionar el compuesto del título (4,5 g, 91%). TLC: Rf 0,91 (1:1 de hexano/ acetato de etilo); ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 4,66 (s, 2H), 7,10 (d, 1H, J = 3,8 Hz), 7,48 (d, 1H, J = 3,8 Hz).

Ejemplo 25 Preparación de 2-ciano-5-(azidometil) tiofeno (25)

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38

Una solución de 2-ciano-5-(bromometil)tiofeno (compuesto 24, 3,5 g, 17,3 mmol) y azida sódica (Aldrich, 1,7 g, 26 mmol) en DMF (Aldrich, 60 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 10 horas. La cromatografía rápida en columna (20% acetato de etilo en hexano) proporcionó el compuesto del título (2,35 g, 83%). TLC: Rf 0,48 (20% de acetato de etilo en hexano); ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 4,56 (s, 2H), 7,01 (d, 1H, J = 3,7 Hz), 7,55 (d, 1H, J = 3,7 Hz).

Ejemplo 26 Preparación de 2-ciano-5-(aminometil)tiofeno (26)

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39

Se le añadió trifenilfosfina (Aldrich, 5,7 g) a una solución de 2-ciano-5-(azidometil)tiofeno (compuesto 25, 2,5 g, 10 mmol) en THF (Aldrich, 40 ml) y agua (10 ml) a 0ºC. La solución resultante se dejó calentar a temperatura ambiente y se agitó a temperatura ambiente durante 10 horas. La purificación RP HPLC proporcionó el compuesto del título (2,3 g, 94%). MS (electropulverización): 139 (M + 1); ^{1}H RMN (CDCl_{3}) \delta 4,01 (s, 2H), 4,75 (br s, 2H, NH_{2}), 6,82 (d, 1H, J = 3,5 Hz), 7,08 (d, 1H, J = 3,5 Hz).

Ejemplo 27 Preparación de n-butilsulfonil-D-serina-alanina-2-ciano-5-(metilamida)tiofeno (27)

40

Una solución del compuesto del Ejemplo 4 (4, 860 mg, 2,9 mmol), y del compuesto del Ejemplo 26 (26, 400 mg, 2,9 mmol), EDC (556 mg, 2,9 mmol), N-hidroxibenzotriazol (488 mg, 3,19 mmol) y diisopropiletilamina (1,5 ml, 8,7 mmol) se agitó durante la noche a temperatura ambiente. El solvente se eliminó bajo presión reducida y el residuo resultante se resuspendió en acetato de etilo (50 ml) y bisulfato sódico 1N (10 ml). La fase de acetato de etilo se lavó con bisulfato sódico 1N (10 ml), bicarbonato sódico saturado (2 15 ml) y salmuera (15 ml), después se secó con sulfato sódico para proporcionar un aceite amarillo. El producto bruto se sometió a cromatografía rápida en columna eluyendo con una proporción 4/5/1 de acetato de etilo/ hexanos/ metanol. El producto fue una mezcla 3:1 de diastereómeros mediante HPLC de fase reversa (C18) (t_{R}= 8,5 minutos con ácido trifluoroacético al 0,1% en acetonitrilo acuoso al 5-75% durante 30 minutos). La espectroscopía de masas de baja resolución confirmó la masa deseada (MH+ 417).

Ejemplo 28 Síntesis de n-butilsulfonil-D-serina-alanina-2-hidroxiamidino-5-(metilamida)tiofeno (28)

41

A una solución del producto del Ejemplo 27 (220 mg, 0,53 mmol) en 5 ml de metanol se le añadió clorhidrato de hidroxilamina (184 mg, 2,64 mmol) seguido de N-metil-morfolina (290 \mul, 2,64 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente. La mezcla de metanol se concentró al vacío y el residuo restante se diluyó con acetato de etilo y se lavó con bicarbonato sódico saturado y salmuera (10 ml cada uno). Las fases orgánicas se secaron sobre sulfato sódico anhidro y se concentraron al vacío para proporcionar un aceite amarillo (120 mg, 50%). El producto fue una mezcla 3:1 de diastereómeros mediante HPLC de fase reversa (C18) (t_{R}= 5 minutos con ácido trifluoroacético al 0,1% en acetonitrilo acuoso al 5-75% durante 20 minutos). La espectroscopía de masas de baja resolución confirmó la masa deseada (MH+ 450,5).

Ejemplo 29 Síntesis de n-butilsulfonil-D-serina-alanina-2-amidino-5-(metilamida)tiofeno (29)

42

Al producto del Ejemplo 28 (60 mg, 0,13 mmol) en ácido acético (1,3 ml) y agua (0,13 ml) se le añadió 87 mg de polvo de zinc activado. La mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente. El polvo de zinc se filtró utilizando un embudo de vidrio y el filtrado se purificó mediante HPLC preparativa. Las fracciones que contenían el producto eluído en acetonitrilo acuoso al 0-20% que contenía TFA al 0,1%. Se combinaron y se liofilizaron proporcionando 7 mg del compuesto del título como un polvo blanco. La mezcla diastereomérica 3:2 de productos eluyó a los 13 minutos mediante HPLC de fase reversa (C18) con ácido trifluoroacético al 0,1% en acetonitrilo acuoso al 5-50% durante 20 minutos. La espectroscopía de masas de baja resolución confirmó la masa deseada (MH+ 434).

Ejemplo 30 Síntesis de terc-butiloxicarbonil-3,4-metanoprolina (30) (pasos A a E a continuación)

Paso A

Síntesis de N-bencil-3,4-metanoprolinol (b)

43

Una mezcla del material de partida bencilideno (a) (J. Org. Chem. 1999, 64(2), 547) (4,6 gramos, 21,4 mmol) e hidruro de aluminio litio (1,0M en THF, 64 ml, 64 mmol) se calentó a reflujo durante 5 horas. Tras enfriar a 0ºC, el hidruro de aluminio litio restante se paró cuidadosamente mediante la adición por goteo de sulfato sódico saturado acuoso (5 ml) durante 15 minutos. La mezcla se diluyó con acetato de etilo (200 ml) y después se filtró a través de celite. El filtrado se secó con sulfato sódico, se filtró y se concentró para proporcionar N-bencil aminoalcohol bruto (3,45 gramos), que se llevó al siguiente paso sin más purificación.

Paso B

Síntesis de N-benciloxicarbonil-3,4-metanoprolinol

44

Una solución de N-bencil-3,4-metanoprolinol bruto (paso A, (b))(3 gramos, 14,76 mmol) en metanol (120 ml) y HCl concentrado (1,5 ml) con 10% Pd/C (300 mg) se hidrogenó a 50 psi durante 16 horas. La mezcla de reacción se filtró para eliminar el catalizador basado en carbono y se concentró el filtrado. El residuo se disolvió en agua/ dioxano (100 ml) y se añadió diisopropiletilamina (3,2 ml). Se le añadió cloroformato de bencilo (2,76 ml, 16,2 mmol) y la mezcla de reacción se agitó durante la noche. La mezcla de reacción se concentró, se disolvió en HCl 1M (100 ml) y se extrajo con acetato de etilo (3 x 200 ml). Las fases orgánicas combinadas se secaron con sulfato magnésico, se filtraron y se concentraron. El residuo se purificó mediante cromatografía rápida utilizando 1:3 de acetato de etilo/ hexanos para proporcionar el N-Cbz-3,4-metanoprolinol (2,4 g).

Paso C

Síntesis de N-benciloxicarbonil-3,4-metanoprolina

45

A una solución de N-benciloxicarbonil-3,4-metanoprolinol (2,2 g, 8,90 mmol) en acetona (68 ml), en agitación a 0ºC, se le añadió el reactivo de Jones (6,6 ml) gota a gota durante 5 minutos. [reactivo de Jones: Preparado a partir de trióxido de cromo (13,4 g) y ácido sulfúrico concentrado (11,5 ml) diluido con agua en un volumen total de 50 ml.] Tras agitar a 0ºC durante 3 horas, se le añadió isopropanol (11 ml) y la agitación continuó durante otros 10 minutos. La mezcla de reacción se diluyó con agua (400 ml) y se extrajo con acetato de etilo (3 x 500 ml). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato magnésico, se filtraron y se concentraron para proporcionar N-Cbz-3,4-metanoprolina (2,25 g, 96%).

Paso D

Síntesis de 3,4-metanoprolina sal de clorhidrato

46

A una solución de N-benciloxicarbonil-3,4-metanoprolina (obtenida en el paso C, anterior) (1,23 g, 4,71 mmol) en etanol (47 ml) y HCl 0,5M (9,42 ml) se le añadió catalizador de paladio sobre carbono al 10%. La mezcla de reacción se hidrogenó a presión atmosférica durante la noche. El catalizador se eliminó por filtración y el filtrado se concentró al vacío para proporcionar 767 mg de producto puro. El producto eluyó a los 14 minutos mediante HPLC de fase reversa (C18) en ácido trifluoroacético al 0,1% en acetonitrilo acuoso al 5-75% durante 20 minutos.

Paso E

Preparación de terc-butiloxicarbonil-3,4-metanoprolina

47

A una solución de 3,4-metanoprolina sal de clorhidrato (del paso D anterior) (1,04 g, 6,38 mmol) en dioxano y agua (25 ml cada uno) se le añadió carbonato potásico (1,76 g, 12,76 mmol) y Boc-anhídrido (2,78 g, 12,76 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente. El dioxano se eliminó al vacío y el residuo restante se diluyó con dietiléter. Las fases se separaron y la fase acuosa se extrajo con dietiléter (1 x 25 ml). La fase acuosa se acidificó a pH <3 con ácido clorhídrico 1N y se extrajo con acetato de etilo (3 x 25 ml). La fase orgánica se secó sobre sulfato sódico, se decantó y se concentró bajo presión reducida para proporcionar 745 mg (50%) de producto. El producto eluyó a los 12,5 minutos mediante HPLC de fase reversa (C18) en ácido trifluoroacético al 0,1% en acetonitrilo acuoso al 5-75% durante 20 minutos.

Ejemplo 31 Preparación de terc-butiloxicarbonil-3,4-metanoprolina-4-cianobencilamida (31)

48

Una solución del compuesto del Ejemplo 30 (paso E) (0,70 g, 3,082 mmol), p-cianobencilamina sal de clorhidrato (0,784 g, 4,62 mmol), EDC (0,88 g, 4,62 mmol), N-hidroxibenzotriazol (0,47 g, 3,082 mmol) y diisopropiletilamina (2,68 ml, 15,41 mmol) se agitó en acetonitrilo (12 ml) a temperatura ambiente. Tras 18 horas, el solvente se eliminó bajo presión reducida y el residuo resultante se resuspendió en acetato de etilo (150 ml) y se lavó consecutivamente con HCl 0,5 M (2 x 15 ml), salmuera (1 x 15 ml), bicarbonato sódico saturado (2 x 15 ml), y salmuera (1 x 15 ml). La fase orgánica se secó sobre sulfato sódico, se decantó y concentró al vacío. El producto bruto se purificó mediante cromatografía rápida en columna eluyendo con 4/1 de acetato de etilo/ hexanos, proporcionando 822 mg (70%) de producto.

Ejemplo 32 Preparación de 3,4-metanoprolina-4-cianobencilamida sal de clorhidrato (32)

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49

A una solución del compuesto del Ejemplo 31 (1 g, 2,93 mmol) en acetato de etilo (11,7 ml) se le añadió HCl anhidro 5M en acetato de etilo (2,93 ml) y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se concentró al vacío para proporcionar 645 mg (79%) de un sólido blanco.

Ejemplo 33 Preparación de bencilsulfonil-D-serina(terc-butil-éter)-3,4-metanourolina-4-cianobenzilamida (33)

50

Una solución del compuesto del Ejemplo 11 (0,10 g, 0,32 mmol), del compuesto del Ejemplo 32 (0,105 g, 0,38 mmol), EDC (0,073 g, 0,38 mmol), N-hidroxibenzotriazol (0,049 g, 0,32 mmol), y diisopropiletilamina (0,28 ml, 1,59 mmol) se agitó durante la noche a temperatura ambiente. El solvente se eliminó bajo presión reducida y el residuo resultante se resuspendió en acetato de etilo (50 ml) y HCl 1N (10 ml). La fase de acetato de etilo se lavó con HCl 1N (10 ml), bicarbonato sódico saturado (2 x 15 ml) y salmuera (15 ml), después se secó con sulfato sódico. La fase orgánica se decantó y concentró bajo presión reducida para proporcionar 171 mg de producto.

Ejemplo 34 Preparación de bencilsulfonil-D-serina-3,4-metanoprolina-4-cianobencilamida (34)

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51

A una solución del compuesto del Ejemplo 33 (0,17 g, 0,32 mmol) en diclorometano (4 ml) se le añadió ácido trifluoroacético (4 ml). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. La mezcla de reacción se diluyó con 10 ml de n-heptano y se concentró al vacío. El residuo se resuspendió en 5 ml de acetonitrilo y 10 ml de n-heptano y se concentró al vacío para proporcionar 154 mg de producto.

Ejemplo 35 Preparación de bencilsulfonil-D-serina-3,4-metanoprolina-4-hidroxiamidinobencilamida (35)

52

A una solución del producto del Ejemplo 34 (154 mg, 0,32 mmol) en 1,3 ml de metanol se le añadió clorhidrato de hidroxilamina (0,11 g, 1,58 mmol) seguido de N-metilmorfolina (209 \mul, 1,902 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se concentró al vacío. El producto bruto se resuspendió en acetonitrilo al 25% en agua y se purificó mediante HPLC preparativa. Las fracciones que contenían el producto eluído en acetonitrilo acuoso al 0-20% que contenía solución de TFA al 0,1% se combinaron y liofilizaron proporcionando 19,5 mg del compuesto del título como un polvo blanco. La espectroscopía de masas de baja resolución confirmó la masa deseada (MH+ 516).

Ejemplo 36 Preparación de bencilsulfonil-D-serina-3,4-metanoprolina-p-amidinobencilamida (36)

53

Al producto del Ejemplo 35 (19,5 mg, 0,041 mmol) ácido acético (0,41 ml) y agua (0,041 ml) se le añadió 27 mg de polvo de zinc activado. La mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente. El polvo de zinc se filtró utilizando un embudo de vidrio y el filtrado se purificó mediante HPLC preparativa. Las fracciones que contenían el producto eluído en acetonitrilo acuoso al 0-20% que contenía TFA al 0,1% se combinaron y liofilizaron proporcionando 15 mg del compuesto del título como un polvo blanco. El producto eluyó a los 10,5 minutos mediante HPLC de fase reversa (C18) con ácido trifluoroacético al 0,1% en acetonitrilo acuoso al 5-50% durante 20 minutos. La espectroscopía de masas de baja resolución confirmó la masa deseada (MH+ 500).

Ejemplo 37 Preparación de 4-trifluoracetamidometilanilina (7-2)

54

Se añadió 4-nitrobencilamina (7-1) (4,0 g, 21 mmol) en porciones al anhídrido trifluoroacético (15 ml) mientras se enfriaba la mezcla en hielo. La mezcla se dejó calentar a temperatura ambiente y se agitó durante la noche. La suspensión se vertió en hielo (aproximadamente 200 g), y la suspensión turbia se extrajo con CH_{2}Cl_{2} (2 x 100 ml), se secó sobre Na_{2}SO_{4} y el solvente se eliminó para proporcionar un aceite transparente. Este aceite se agitó en un frasco Parr con Pd/C (10%, 300 mg) en MeOH (50 ml) durante la noche. El sólido se eliminó mediante filtración y el solvente se eliminó al vacío para proporcionar un sólido blanco que correspondía al compuesto del título (7-2) (4,5 g, proporción cuantitativa).

Ejemplo 38 Preparación de N-[(4-Trifluoracetamidometil)fenil]-N'-N''-bis(terc-butoxicarbonil) guanidina (7-3)

55

Se añadió 4-trifluoracetamidometilanilina (7-2) (279 mg, 1,28 mmol) a una mezcla en agitación de N-N'-Di-Boc-N''-trifluorometanosulfonil-guanidina (preparada de acuerdo al procedimiento descrito en J. Org. chem. 1998, 63, 3804-3805) (500 mg, 1,28 mmol), TEA (108 \mul, 1,28 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (10 ml). La mezcla de reacción se agitó durante 6 horas. La mezcla se diluyó con CH_{2}Cl_{2} (30 ml) y se lavó con HCl (1M, 20 ml), salmuera (20 ml), se secó sobre Na_{2}SO_{4} y el solvente se eliminó al vacío para proporcionar un sólido. La cromatografía en columna (CH_{2}Cl_{2}/MeOH, 99:1) proporcionó un sólido blanco que correspondía al compuesto del título (350 mg, 52%).

Ejemplo 39 Preparación de N-[(4-aminometil)fenil]-N'-terc-butoxicarbonilguanidina (7-4)

56

Se añadió carbonato potásico (500 mg) a una solución en agitación de N-[(4-trifluoracetamidometil)fenil]-N'-N''- bis(terc-butoxicarbonil) guanidina (7-3) (300 mg, 0,833 mmol) en H_{2}O/MeOH (2:15, 17 ml) y la mezcla se agitó durante la noche. El solvente se eliminó al vacío, y el residuo restante se disolvió en H_{2}O (10 ml) y se extrajo con CH_{2}Cl_{2}/MeOH (9:1, 3 x 10 ml). Las fases orgánicas se secaron sobre Na_{2}SO_{4} y se eliminaron al vacío para proporcionar un sólido blanco que correspondía al compuesto del título (150 mg, 68%).

Ejemplo 40 Preparación de Bencilsulfonil-D-serina-L-alanina-(4-(N-terc-butoxicarbonilguanidino)bencilamida (7-5)

57

Una solución de N-[(4-aminometil)fenil]-N'-terc-butoxicarbonilguanidina (7-4) (36 mg, 0,14 mmol), carboxilato de bencilsulfonil-D-serina-L-alanina (50 mg, 0,13 mmol), HATU (74 mg, 0,20 mmol), HOAT (27 mg, 0,20 mmol), y DIEA (68 \mul, 0,39 mmol) en acetonitrilo (2,0 ml) se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La solución se diluyó con EtOAc (20 ml) se lavó con HCl (1M, 10 ml), NaHCO_{3} (saturado, 10 ml), salmuera (10 ml), y se eliminó al vacío para proporcionar un aceite. La purificación por HPLC (CH_{3}CN, H_{2}O, TFA al 0,1%) proporcionó un sólido blanco esponjoso como el compuesto del título (35 mg, 45%), MS (electropulverización) 577 (M + 1).

Ejemplo 41 Preparación de Bencilsulfonil-D-serina-L-alanina-4-guanidinobencilamida (7-6)

58

Una solución de bencilsulfonil-D-serina-L-alanina-(4-(N-terc-butoxicarbonilguanidino)bencilamida (7-5) (9,0 mg, 0,016 mmol), en una mezcla de CH_{2}Cl_{2}/TFA (1:1, 600 \mul) se agitó a temperatura ambiente durante 90 minutos. El solvente se eliminó al vacío para proporcionar un aceite transparente. La purificación por HPLC (CH_{3}CN, H_{2}O, TFA al 0,1%) proporcionó un sólido blanco esponjoso como el compuesto del título (5,0 mg, 66%), MS (electropulverización) 477 (M + 1).

Ejemplo 42 Preparación de 3-Trifluoracetamidometilanilina (8-2)

59

Se añadió 3-nitrobencilamina (8-1) (3,0 g, 16 mmol) en porciones a anhídrido trifluoroacético en agitación (30 ml) mientras que la mezcla se enfriaba en hielo, y la mezcla se agitó durante la noche. La suspensión se vertió en hielo (aproximadamente 200 g) y la suspensión turbia se extrajo con CH_{2}Cl_{2} (2 x 100 ml) se secó sobre Na_{2}SO_{4} y el solvente se eliminó para proporcionar un aceite transparente. Este aceite se agitó en un frasco Parr con Pd/C (10%, 300 mg) en MeOH (30 ml) durante la noche. El sólido se eliminó mediante filtración y el solvente se eliminó al vacío para proporcionar un sólido blanco que correspondía al compuesto del título (3,3 g, 95%).

Ejemplo 43 Preparación de N-[(3-Trifluoracetamidometil)fenil]-N'-N''-bis(terc-butoxicarbonil) guanidina (8-3)

60

Se añadió 3-trifluoracetamidometilanilina (8-2) (el producto del Ejemplo 42) (500 mg, 2,29 mmol) a una mezcla en agitación de N-N'-Di-Boc-N''-trifluorometanosulfonil-guanidina (preparada de acuerdo al procedimiento descrito en J. Org. Chem. 1998, 63, 3804-3805) (986 mg, 2,52 mmol), TEA (642 \mul, 4,58 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (10 ml), y la mezcla se agitó durante 24 horas. La mezcla se lavó con HCl (1M, 10 ml), salmuera (10 ml) se secó sobre Na_{2}SO_{4} y el solvente se eliminó al vacío para proporcionar un sólido. La cromatografía en columna (CH_{2}Cl_{2}/MeOH, 98:2) proporcionó un sólido blanco que correspondía al compuesto del título (479 mg, 55%). MS (electropulverización) 461 (M + 1).

Ejemplo 44 Preparación de N-[(3-aminometil)fenil]-N'-terc-butoxicarbonilguanidina (8-4)

61

Se añadió carbonato potásico (1,0 g) a una solución en agitación de N-[(3-trifluoracetamidometil)fenil]-N'-N''-bis (terc-butoxicarbonil) guanidina (8-3) (el producto del Ejemplo 43) (450 mg, 0,978 mmol) en H_{2}O/ MeOH (1:1, 4 ml) y la mezcla se agitó durante la noche. El solvente se eliminó al vacío, y el residuo restante se disolvió en H_{2}O (10 ml) y se extrajo con CH_{2}Cl_{2}/ MeOH (9:1, 3 x 10 ml). Las fases orgánicas se secaron sobre Na_{2}SO_{4} y se eliminaron al vacío para proporcionar un sólido blanco que correspondía al compuesto del título (232 mg, 90%).

Ejemplo 45 Preparación de Bencilsulfonil-D-serina-L-alanina-3-guanidinobencilamida (8-5)

62

Una solución de N-[(3-aminometil)fenil]-N'-terc-butoxicarbonilguanidina (8-4) (el producto del Ejemplo 44) (130 mg, 0,492 mmol), carboxilato de bencilsulfonil-D-serina-L-alanina (190 mg, 0,492 mmol), HATU (380 mg, 0,739 mmol), HOAT (136 mg, 0,739 mmol), y DIEA (258 \muL, 1,48 mmol) en acetonitrilo (2,0 ml) se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La solución se diluyó con EtOAc (20 ml), se lavó con HCl (1M, 10 ml), NaHCO_{3} (saturado, 10 ml), salmuera (10 ml), y se eliminó al vacío para proporcionar un aceite. El aceite se trató con una mezcla de CH_{2}Cl_{2}/TFA (1:1, 3 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. El solvente se eliminó al vacío para proporcionar un aceite transparente. La purificación por HPLC (CH_{3}CN, H_{2}O, TFA al 0,1%) proporcionó un sólido blanco esponjoso como el compuesto del título (80 mg, 34%), MS (electropulverización) 477 (M + 1).

Ejemplo 46 Preparación de 2-Nitro-5-(4-trifluoracetamidometil)-tiofeno (9-2)

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63

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Se añadió en porciones 2-aminometiltiofeno (9-1) (5,0 g, 44 mmol) a anhídrido trifluoroacético en agitación (20 ml) mientras la mezcla se enfriaba en hielo, y la mezcla se agitó durante una hora. A esta solución se le añadió KNO_{3} (8,9 g, 88 mmol) en porciones a -20ºC. La solución homogénea se calentó a temperatura ambiente y se agitó durante la noche. La suspensión resultante se vertió en hielo (aproximadamente 200 g), y se extrajo con CH_{2}Cl_{2} (2 x 100 ml), se secó sobre Na_{2}SO_{4}, y el solvente se eliminó para proporcionar un sólido. La cromatografía en columna (CH_{2}Cl_{2}) proporcionó un sólido blanco que correspondía al compuesto del título (3,3 g, 29%), MS (electropulverización): 255 (M + 1).

Ejemplo 47 Preparación de N-[2-(5-trifluoracetamidometil) tiofenil]-N'-N''-(bis-terc-butoxicarbonil) guanidina (9-3)

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Se añadió 2-nitro-5-(4-trifluoracetamidometil)-tiofeno (9-2) (1,0 g, 3,9 mmol) a una solución saturada de HCl en MeOH a 0ºC. Se añadió SnCl_{2} (4,4 g) en porciones durante 15 minutos y la mezcla se agitó durante 30 minutos. La solución se concentró y después se diluyó con NaHCO_{3} (10 ml). Esta solución se extrajo con CH_{2}Cl_{2} (2 x 20 ml), se secó sobre Na_{2}SO_{4} y el solvente se eliminó al vacío para proporcionar 2-amino-5-(4-trifluoracetamidometil)-tiofeno como un aceite amarillo (>95% pureza mediante RMN, 0,80 g, 95%). Este compuesto se utilizó inmediatamente en el siguiente paso sin más purificación.

Se añadió 2-amino-5-(4-trifluoracetamidometil)-tiofeno (0,80 g, 3,6 mmol) a una solución en agitación de N-N'-di-Boc-N''-trifluorometanosulfonil-guanidina (1,5 g, 3,8 mmol) y TEA (1,1 ml, 7,8 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (20 ml). La mezcla se agitó durante 24 horas. La mezcla se diluyó con CH_{2}Cl_{2} (20 ml) y se lavó con HCl (1M, 20 ml), salmuera (20 ml), se secó sobre Na_{2}SO_{4}. El solvente se eliminó al vacío para proporcionar un aceite. La cromatografía en columna (CH_{2}Cl_{2}/ MeOH, 98:2) proporcionó un aceite que correspondía al compuesto del título (9-3) (150 mg, 9%), MS (electropulverización): 467 (M + 1).

Ejemplo 48 Preparación de N-[5-(4-aminometil)tiofenil]-N'-(terc-butoxicarbonil) guanidina (9-4)

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65

Se añadió carbonato potásico (500 mg) a una solución en agitación de N-[2-(5-trifluoracetamidometil) tiofenil]-N'-N''-(bis-terc-butoxicarbonil) guanidina (9-3) (150 mg, 0,322 mmol) en H_{2}O /MeOH (1:1, 4 ml) y la mezcla se agitó durante la noche. El solvente se eliminó al vacío. El residuo restante se disolvió en H_{2}O (10 ml) y se extrajo con CH_{2}Cl_{2} /MeOH (95:5, 3 x 10 ml). Las fases orgánicas se secaron sobre Na_{2}SO_{4}. El solvente se eliminó al vacío para proporcionar un sólido amarillo que corresponde al compuesto del título (150 mg, 68%).

Ejemplo 49 Preparación de Bencilsulfonil-D-Serina-L-Alanina-[5-(2-guanidino)tiofeno] (9-5).

66

Una solución de N-[5-(4-aminometil)tiofenil]-N'-(terc-butoxicarbonil) guanidina (9-4) (77 mg, 0,29 mmol), bencilsulfonil-D-Serina-L-alanina carboxilato (110 mg, 0,285 mmol), HATU (162 mg, 0,427 mmol), HOAT (58 mg, 0,42 mmol), y DIEA (199 PL, 1,13 mmol) en acetonitrilo (3,0 ml) se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La solución se diluyó con EtOAc (20 ml) se lavó con HCl (1M, 10 ml), NaHCO_{3} (saturado, 10 ml), y salmuera (10 ml). La fase orgánica se secó sobre Na_{2}SO_{4} y el solvente se eliminó al vacío para proporcionar un aceite. A este aceite se le añadió TFA/ CH_{2}Cl_{2} (1:1, 2 ml); la mezcla se agitó durante 3 horas. La purificación por HPLC (CH_{3}CN, H_{2}O, THF al 0,1%) proporcionó un sólido blanco esponjoso que correspondía al compuesto del título (3 mg), MS (electropulverización): 483 (M + 1).

Ejemplo 50 Preparación de 6-Bromometilnicotinonitrilo (11-2)

67

A una solución de 6-Metilnicotinonitrilo (11-1) (Lancaster) (15 g, 127 mmol) en tetracloruro de carbono (300 ml) se le añadió N-bromosuccinimida (27,12 g, 152,4 mmol). La solución resultante se desgasificó y se purgó con nitrógeno y se añadió AIBN (2,2'-azobisisobutironitrilo) (2,08 g, 12,6 mmol). Tras 7 horas a 85ºC, se le añadió otro lote de AIBN (1,04 g) y continuó la agitación durante otra hora. Tras eliminar el solvente, el producto bruto se sometió a cromatografía rápida en columna en acetato de etilo/ hexanos para proporcionar 10 g de material puro (40%).

Ejemplo 51 Preparación de 6-azidometilnicotinonitrilo (11-3)

68

A una solución de 6-Bromometilnicotinonitrilo (11-2) (8,0 g, 40,6 mmol) en DMF (100 ml) se le añadió azida sódica (3,17 g, 48,8 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se diluyó con 400 ml de dietiléter y 100 ml de agua y las fases se separaron. La fase acuosa se reextrajo con dietiléter (2 x 100 ml). Los extractos de éter combinados se lavaron con salmuera (2 x 100 ml) y después se secaron sobre MgSO_{4} y se filtraron para proporcionar 6,53 g de producto como un sólido blanco.

Ejemplo 52 Preparación de 3-hidroxiamidino-6-azidometilpiridina (11-4)

69

A una solución de la azida del Ejemplo 51 (11-3) (6,46 g, 40,6 mmol) en metanol (100 ml) se le añadió clorhidrato de hidroxilamina (3,95 g, 56,84 mmol), seguido de trietilamina (9,6 ml). La solución se calentó a 65ºC durante cuatro horas. El solvente se eliminó bajo presión reducida y el residuo restante se extrajo con acetato de etilo (300 ml) y agua (100 ml). La fase acuosa se reextrajo con acetato de etilo (2 x 200 ml). Los extractos orgánicos combinados se lavaron con salmuera (2 x 100 ml), se secaron sobre MgSO_{4} y se evaporaron para proporcionar el producto del título (11-4) (7,8 g).

Ejemplo 53 Preparación de 3-hidroxiamidino-6-aminometilpiridina (11-5)

70

A una solución de la azida (11-4) del Ejemplo 52 en THF/agua (80 ml/ 5 ml) (7,8 g, 40,6 mmol) se le añadió trifenilfosfina (12,8 g, 48,72 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente. El solvente se eliminó hasta la sequedad y el residuo restante se diluyó con 100 ml de HCl 1N y 100 ml de agua. La fase acuosa se extrajo varias veces con diclorometano. La fase acuosa se hizo básica (pH \sim9) con una resina alcalina (Bio Rad AG 1-X8). La resina se filtró y se lavó exhaustivamente con agua. Los lavados combinados se secaron bajo presión reducida para proporcionar un sólido blanco (6,60 g).

Ejemplo 54 Preparación de 3-Hidroxiamidino-6-aminometil (Boc) piridina (11-6)

71

A una solución del producto del Ejemplo 53 (11-5) (0,5 g, 3,01 mmol) en dioxano y agua (6 ml cada uno) se le añadió carbonato potásico (832 mg, 6,02 mmol), seguido de Boc-anhídrido (0,66 g, 3,01 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se concentró y el residuo restante se disolvió en acetato de etilo y se lavó con bicarbonato sódico (saturado) y salmuera. La fase orgánica se secó sobre sulfato sódico, se filtró y se concentró. La cromatografía rápida en columna en 8/2 acetato de etilo/hexanos seguido de acetato de etilo y 9/1 diclorometano/metanol proporcionó 0,43 g de producto como un sólido blanco. RMN \delta (ppm) CDCl_{3}: 8,8(d, 1H), 7,9 (dd, 1H), 7,3 (d, 1H), 6,6 (bs, 1H), 5,5 (bs, 1H), 4,8 (bs, 1H), 4,4 (d, 2H), 1,4 (s, 9H).

Ejemplo 55 Preparación de 3-isopropiloxiamidino-6-aminometil(Boc) piridina (11-7)

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72

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A una solución del producto del Ejemplo 54 (11-6) (0,43 g, 1,39 mmol) en dimetilformamida (5 ml) se le añadió 2-yodopropano (210 Pl, 2,1 mmol), seguido de carbonato de cesio (0,68 g, 2,1 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo y se lavó con bicarbonato sódico (saturado). La fase orgánica se secó sobre sulfato sódico, se filtró y se concentró para proporcionar un aceite amarillento. La cromatografía rápida en columna realizada en 1/1 acetato de etilo/ hexano seguido de acetato de etilo proporcionó 229 mg (53%) de producto como un sólido cristalino. RMN \delta (ppm) CDCl_{3}: 8,8 (d, 1H), 7,9 (dd, 1H), 7,3 (d, 1H), 5,5 (bs, 1H), 4,7 (bs, 2H), 4,4 (d, 1H), 1,4 (s, 9H), 1,3 (d, 6H).

Ejemplo 56 Preparación de Boc-Ala-3-isopropiloxiamidino-6-aminometilpiridina (11-8)

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73

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El compuesto del Ejemplo 55 (11-7) (229 mg, 0,74 mmol) se disolvió en dioxano (1 ml) y se trató con una solución de HCl 4N en dioxano (1 ml) durante una hora a temperatura ambiente. La eliminación del solvente bajo presión reducida proporcionó 290 mg de un sólido blanco. Este producto se disolvió entonces en acetonitrilo (4,12 ml), se neutralizó con diisopropiletilamina (538 \mul, 3,09 mmol) y se acopló a Boc-alanina (195 mg, 1,03 mmol) utilizando EDC (197 mg, 1,03 mmol) y HOBt (157,6 mg, 1,03 mmol) como reactivos de acoplamiento. Tras agitar durante la noche a temperatura ambiente, el solvente se eliminó bajo presión reducida, y el residuo restante se diluyó en acetato de etilo. La fase orgánica se lavó varias veces con bicarbonato sódico (saturado) y salmuera, se secó sobre sulfato sódico, se filtró y se concentró en un aceite amarillento. La cromatografía rápida en columna en 9/1 acetato de etilo/hexano, seguido de acetato de etilo proporcionó 181 mg de un aceite blanco (46%). RMN \delta (ppm) CDCl_{3}: 8,7 (d, 1H), 7,9 (dd, 1H), 7,3 (d, 1H), 7,1 (bs, 1H), 5,0 (bs, 1H), 4,7 (bs, 2H), 4,6 (d, 2H), 4,3 (m, 1H), 4,1 (m, 1H), 1,4 (s, 9H), 1,39 (d, 3H), 1,3 (d, 6H).

Ejemplo 57 Preparación de Bencilsulfonil-dSer(tBu)-Ala-3-isopropiloxiamidino-6-aminometilpiridina (11-9)

74

El compuesto del Ejemplo 56 (11-8) (181 mg, 0,48 mmol) se disolvió en dioxano (1 ml) y se trató con HCl 4N en dioxano (1 ml) durante 1,5 horas a temperatura ambiente. La eliminación del solvente bajo presión reducida proporcionó 200 mg de un sólido blanco. Este producto se disolvió entonces en acetonitrilo (5 ml), se neutralizó con diisopropiletilamina (298 \mul, 1,71 mmol) y se acopló a BnSO_{2}-dSer(tBu)-OH (180 mg, 0,57 mmol), utilizando EDC (109 mg, 0,57 mmol) y HOBt (96 mg, 0,63 mmol) como reactivos de acoplamiento. Tras agitar durante la noche a temperatura ambiente, el solvente se eliminó bajo presión reducida, y el residuo restante se diluyó en acetato de etilo. La fase orgánica se lavó varias veces con bicarbonato sódico (saturado) y salmuera, se secó sobre sulfato sódico, se filtró y se concentró para proporcionar un sólido (250 mg, 76%). El producto eluyó a los 11,5 minutos mediante HPLC de fase reversa (C18) con ácido trifluoroacético al 0,1% en acetonitrilo acuoso al 5-75% durante 20 minutos. MS (electropulverización): 577 (M + 1).

Ejemplo 58 Preparación de Bencilsufonil-dSer-Ala-3-isopropiloxiamidino-6-aminometilpiridina (11-10)

75

El compuesto del Ejemplo 57 (11-9) (137 mg, 0,24 mmol) se trató con 2 ml de diclorometano y de ácido trifluoroacético durante una hora a temperatura ambiente. La eliminación del solvente bajo presión reducida proporcionó 169 mg de un aceite anaranjado. El producto eluyó a los 9 minutos mediante HPLC de fase reversa (C18) con ácido trifluoroacético al 0,1% en acetonitrilo acuoso al 5-90% durante 20 minutos.

Ejemplo 59 Preparación de Bencilsulfonil-dSer-Ala-3-amidino-6-aminometilpiridina (11-11)

76

\newpage

El producto del Ejemplo 58 (11-10) (74 mg, 0,14 mmol) en agua (8 ml) y ácido acético (0,8 ml) se trató con polvo de zinc activado (91 mg) durante 45 minutos. La solución se filtró y el filtrado se sometió a purificación mediante HPLC de fase reversa (C18). El producto eluyó a los 11 minutos mediante HPLC de fase reversa con ácido trifluoroacético al 0,1% en acetonitrilo acuoso al 5-25% durante 20 minutos. MS (electropulverización): 463 (M + 1).

B. Rutas Sintéticas Para Ciertos Compuestos Intermediarios

(i) Los Ejemplos 60 a 97 describen la síntesis de ciertos intermediarios utilizados en la Preparación de Compuestos de la presente invención. Véase también las Figuras 1 a 5.

Ejemplo 60 Preparación de la Síntesis de D-Ser(O-t-Bu)-Ala-OMe, sal de acetato (1-3)

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77

Se combinaron N-\alpha-Cbz-D-serina (1-1) (Bachem, 4,97 g, 16,8 mmol), alanina metil éster, sal de clorhidrato (1-2) (Novabiochem, 4,7 g, 33,7 mmol), EDC (6,5 g, 33,7 mmol), y 1-hidroxibenzotriazol (2,6 g, 16,8 mmol), y se añadió acetonitrilo (67 ml). Tras agitar la mezcla durante 10 minutos, se le añadió diisopropiletilamina (14,4 ml, 84 mmol), y la mezcla clara resultante se agitó durante 18 horas adicionales. El solvente se eliminó bajo presión reducida, y el residuo se suspendió en acetato de etilo (500 ml). La solución se lavó con HCl 0,5M (2 x 100 ml), seguido de bicarbonato sódico saturado (2 x 100 ml), y salmuera (100 ml). La fase orgánica se secó después con sulfato sódico, y el solvente se eliminó al vacío para proporcionar Cbz-D-Ser(O-t-Bu)-Ala-OMe en un rendimiento cuantitativo como un pico único mediante HPLC de fase reversa (C18) t_{R}= 16,9 con ácido trifluoroacético al 0,1% en acetonitrilo acuoso al 5-75% durante 20 minutos.

Cbz-D-Ser(O-t-Bu)-Ala-OMe se disolvió entonces en etanol/ácido acético/agua (150 ml de una mezcla 4:1:1). El frasco se cargó con nitrógeno, y se añadió paladio sobre carbono al 10% (1,5 g). Esta mezcla se hidrogenó a 45 psi durante 2 horas. El catalizador de paladio se filtró, y el solvente se eliminó bajo presión reducida para proporcionar 4,58 g del compuesto del título en una proporción del 95% como único pico mediante HPLC de fase reversa (C18) (t_{R}= 8,0 minutos con ácido trifluoroacético al 0,1% en acetonitrilo acuoso al 5-75% durante 20 minutos), y MS
(M + H = 247,2).

Ejemplo 61 Preparación de bencenosufonil-D-Ser(O-t-Bu)-Ala-OMe (1-4)

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78

A una mezcla en agitación del compuesto del Ejemplo 60 (1-3) (1,0 g, 3,3 mmol) en acetonitrilo (13 ml) se le añadió cloruro de bencenosulfonilo (0,87 g, 4,9 mmol). A esta mezcla se le añadió diisopropiletilamina (1,67 ml, 9,8 mmol) en cinco porciones durante un periodo de 1 hora. La mezcla se dejó en agitación otra hora adicional. El solvente se eliminó bajo presión reducida, y el residuo se suspendió en acetato de etilo (100 ml). La solución se lavó con HCl 0,5M (2 x 10 ml), seguido de bicarbonato sódico saturado (2 x 10 ml), y salmuera (1 x 10 ml). La fase orgánica se secó después con sulfato sódico, y el solvente se eliminó bajo presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía rápida eluyendo con 50% de hexanos/ acetato de etilo, proporcionando 0,54 g, 1,4 mmol, de producto en un rendimiento del 43%. El producto se obtuvo como un único pico mediante HPLC de fase reversa (C18) (t_{R}= 20,2 minutos con ácido trifluoroacético al 0,1% en acetonitrilo acuoso al 5-75% durante 20 minutos). ^{1}H RMN (CD_{3}OD): 7,5-7,9 ppm (m, 5H), 4,3 ppm (q, 1H), 3,9 ppm (t, 1H), 3,7(s,3H), 3,4 ppm (m, 1H), 3,5 ppm (m, 1H), 1,3 ppm (d, 3H), 1,05 ppm (s, 9H).

Ejemplo 62 Preparación de bencenosufonil-D-Ser(O-t-Bu)-Ala-OH (1-5)

79

Al compuesto del Ejemplo 61 (1-4) (0,53 g, 1,4 mmol) en metanol (9 ml) se le añadió hidróxido de litio 1,0M (3,0 ml, 3 mmol). Tras agitar durante 18 horas, la mezcla de reacción se vertió sobre una columna de 10 ml de resina de intercambio iónico DOWEX (50 X 8-400), y eluyó con metanol/ agua (60 ml de una mezcla 1:1). El metanol se eliminó mediante bombeo bajo presión reducida y el agua restante se liofilizó, proporcionando 0,49 g, 1,3 mmol (95%) del compuesto del título como un pico único mediante HPLC de fase reversa (C18) (t_{R}= 13,5 minutos con ácido trifluoroacético al 0,1% en acetonitrilo acuoso al 5-75% durante 20 minutos). ^{1}H RMN (CD_{3}OD): 7,9 ppm (d,2H), 7,6 ppm (t,1H), 7,5 ppm (t,2H), 4,25 ppm (q,1H), 3,9 ppm (t,1H), 3,5 ppm (m,1H), 3,4 ppm (m,1H), 1,3 ppm (d,3H), 1,075 ppm (s,9H).

Ejemplo 63 Preparación de bencilsulfonil-D-Ser(O-t-Bu)-OMe

80

A una solución agitada de D-serina(O-t-Bu) metil éster, sal de clorhidrato (2,07 g, 9,8 mmol) en acetonitrilo (39 ml) se le añadió cloruro de \alpha-toluenosulfonilo (1,86 g, 9,8 mmol). A esta mezcla de diisopropiletilamina (3,7 ml, 21,5 mmol) se le añadieron en cinco porciones durante un periodo de 1 hora. La mezcla se dejó en agitación una hora adicional. El solvente se eliminó bajo presión reducida, y el residuo se suspendió en acetato de etilo (100 ml). La solución se lavó con HCl 0,5M (2 x 10 ml), seguido de bicarbonato sódico saturado (2 x 10 ml), y salmuera (1 x 10 ml). La fase orgánica se secó con sulfato sódico, y el solvente se eliminó al vacío para proporcionar 2,84 g del compuesto del título en un rendimiento del 88%. Rf= 0,4 (4:1 acetato de etilo:hexanos).

Ejemplo 64 Preparación de bencilsulfonil-D-Ser(O-t-Bu)-OH

81

A una solución agitada del compuesto del Ejemplo 63 (2,66 g, 8,1 mmol) en metanol (54 ml) se le añadió hidróxido de litio 1,0M (17,8 ml, 17,8 mmol). La mezcla de reacción se dejó en agitación durante 18 horas, después se vertió sobre una columna de 10 ml de resina de intercambio iónico DOWEX(50 X 8-400) y eluyó con metanol:agua (60 ml de una mezcla 1:1). El metanol se eliminó bajo presión reducida, y la solución acuosa restante se liofilizó para proporcionar 2,47 g del compuesto del título en un rendimiento del 97%. t_{R}= 14,8 minutos (0,1% ácido trifluoroacético en acetonitrilo acuoso al 5-75% durante 20 minutos).

Ejemplo 65 Preparación de bencilsulfonil-D-Ser(O-t-Bu)-Ala-OMe

82

Se combinó el compuesto del Ejemplo 64 (1,0 g, 3,2 mmol), alanina metil éster, sal de clorhidrato (Novabiochem, 0,89 g, 6,3 mmol), EDC (1,22 g, 6,3 mmol), y 1-hidroxibenzotriazol (0,49 g, 3,2 mmol) y se añadió acetonitrilo (13 ml). Tras agitar la mezcla resultante durante 10 minutos, se le añadió diisopropiletilamina (2,71 ml, 15,8 mmol) y la mezcla clara resultante se agitó durante otras 18 horas más. El solvente se eliminó bajo presión reducida, y el residuo se suspendió en acetato de etilo (100 ml). La solución se lavó con HCl 0,5M (2 x 10 ml), seguido de bicarbonato sódico saturado (2 x 10 ml), y salmuera (1 x 10 ml). La fase orgánica se secó después con sulfato sódico, y el solvente se eliminó al vacío para proporcionar 1,22 g del compuesto del título en un rendimiento del 97%. t_{R}= 16,2 minutos (ácido trifluoroacético al 0,1% en acetonitrilo acuoso al 5-75% durante 20 minutos).

Ejemplo 66 Preparación de bencilsulfonil-D-Ser(O-t-Bu)-Ala-OH

83

Al compuesto del Ejemplo 65 (1,22 g, 3,1 mmol) en metanol (22 ml), se le añadió hidróxido de litio 1M (7,2 ml, 7,2 mmol). Tras agitar 18 horas, la mezcla de reacción se vertió sobre una columna de 10 ml de resina de intercambio iónico DOWEX (50 X 8-400) y eluyó con metanol:agua (60 ml de una mezcla 1:1). El metanol se eliminó bajo presión reducida, y la solución acuosa se liofilizó para proporcionar 1,16 g del compuesto del título en un rendimiento del 91%. t_{R}= 13,2 minutos (ácido trifluoroacético al 0,1% en acetonitrilo acuoso al 5-75% durante 20 minutos).

Ejemplo 67 Preparación de i-butoxicarbonil-D-Ser(O-t-Bu)-OMe

84

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A una solución homogénea agitada de HCl-D-Ser(O-t-Bu)-OMe (15 g, 71 mmol, Bachem) en tetrahidrofurano (200 ml), se le añadió bicarbonato sódico saturado (80 ml), seguido de isobutilcloroformato (19,45 g, 142 mmol). Las fases se separaron y la fase acuosa se lavó con acetato de etilo (50 ml). Las fases orgánicas se combinaron y el solvente se eliminó bajo presión reducida. El residuo se suspendió en acetato de etilo (100 ml) y se lavó con HCl 1M (100 ml), bicarbonato sódico saturado (100 ml), y salmuera (100 ml). La fase orgánica se secó con sulfato magnésico, se trató con carbón decolorante, (como el que se comercializa bajo el nombre comercial de Darco), se filtró, y el solvente se eliminó bajo presión reducida, proporcionando un rendimiento cuantitativo del compuesto del título. Rf = 0,3 (20% acetato de etilo/ hexanos).

Ejemplo 68 Preparación de i-butoxicarbonil-D-Ser(O-t-Bu)-OH

85

A una solución agitada del compuesto del Ejemplo 67 (19,51 g, 70 mmol) en tetrahidrofurano (78 ml), se le añadió hidróxido de litio (78 mmol, 3,28 g). La mezcla de reacción se agitó vigorosamente durante 3 horas hasta que no se observó material de partida mediante TLC (20% de acetato de etilo/ hexanos). La solución se acidificó con HCl concentrado a pH\sim2 y el solvente se eliminó bajo presión reducida. El producto bruto se suspendió en acetato de etilo y se extrajo con bicarbonato sódico saturado (2X, 75 ml). Los lavados de bicarbonato sódico combinados se acidificaron con HCl 6M y el aceite que se separó se extrajo con acetato de etilo (2 x 100 ml). Las fases orgánicas combinadas se secaron con sulfato magnésico, se trataron con Darco, se filtraron, y el solvente se eliminó bajo presión reducida, proporcionando un rendimiento cuantitativo del compuesto del título. Rf= 0,01 (20% de acetato de etilo en hexanos).

Ejemplo 69 Preparación de i-butoxicarbonil-D-Ser(O-t-Bu)-Ala-OMe

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86

A una solución del compuesto del Ejemplo 68 (16,5 g, 63 mmol), HCl-Ala-OMe (10,6 g, 76 mmol), 1-hidroxibenzotriazol (10,2 g, 76 mmol), y EDC (16,33 g, 85 mmol) en acetonitrilo (280 ml) a 0ºC, se le añadió 4-metilmorfolina (35 ml, 315 mmol). Esta mezcla se agitó durante 1 hora a 0ºC, después a temperatura ambiente durante 72 horas. El solvente se eliminó bajo presión reducida y el residuo resultante se suspendió en acetato de etilo (300 ml) y HCl 1M (350 ml). La fase acuosa se separó y se lavó con acetato de etilo (300 ml). Las fases combinadas de acetato de etilo se combinaron y se lavaron con HCl 1M (300 ml), bicarbonato sódico saturado (400 ml), y salmuera (200 ml). La fase orgánica se secó con sulfato magnésico, se trató con carbón decolorante Darco y se filtró. El solvente se eliminó bajo presión reducida, proporcionando 21,48 g del compuesto del título (rendimiento del 98%).

Ejemplo 70 Preparación de i-butoxicarbonil-D-Ser-Ala-OH

87

El compuesto del Ejemplo 69 (21 g, 58 mmol) se disolvió en ácido trifluoroacético (110 ml); la mezcla resultante se agitó durante 35 minutos. La solución se enfrió en un baño de hielo, se añadió bicarbonato sódico saturado (630 ml), seguido de bicarbonato sódico sólido (70 g) durante 45 minutos a un resultante de pH=7. La solución acuosa se extrajo con acetato de etilo (3 x 250 ml). Los extractos orgánicos combinados se combinaron, se secaron con sulfato magnésico, se trataron con carbón decolorante Darco y se filtraron. El solvente se eliminó al vacío, proporcionando un rendimiento cuantitativo de i-butoxicarbonil-D-Ser-Ala-OMe.

A una solución agitada del residuo bruto en tetrahidrofurano (68 ml), se le añadió hidróxido de litio (2,7 g, 64 mmol, 1,1 eq.) en agua (17 ml). La mezcla de reacción se agitó vigorosamente durante 0,5 horas hasta que no se observó más material de partida mediante TLC (9:1 diclorometano/ isopropanol). La solución se acidificó con HCl 6M (13 ml) a pH\sim2 y el solvente se eliminó bajo presión reducida. El producto bruto se suspendió en acetato de etilo (400 ml) y agua (50 ml). La fase acuosa se extrajo con acetato de etilo (200 ml). Las fases orgánicas combinadas se secaron con sulfato magnésico, se filtraron, y el solvente se eliminó al vacío, proporcionando 13,94 g del compuesto del título (rendimiento del 86%). Rf= 0,3 (90:30:5 cloroformo/ metanol/ ácido acético).

Ejemplo 71 Preparación de N-\alpha-(3-fenilpropil)-D-serina-t-butil éter metil éster

88

Serina O-t-butil éter metil éster (1,50 g, 7,1 mmol), hidrocinamaldehído (1,40 ml, 10,6 mmol), y trietilamina (1,18 ml, 8,5 mmol) se sometieron a reflujo en tetrahidrofurano (70 ml) durante 4 horas. Tras dejar enfriar la solución a temperatura ambiente, se añadió en dos porciones borhidruro sódico (0,46 g, 12 mmol) a la solución en agitación. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos; la solución se concentró bajo presión reducida. El residuo se repartió entre acetato de etilo y HCl 1,0M. La fase orgánica se lavó con HCl 1,0N. La fase acuosa se basificó con NaOH al 40% a pH 10, después se extrajo con acetato de etilo (2X). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato sódico; el solvente se eliminó al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía rápida sobre gel de sílice (columna de 1 x 6 pulgadas) eluyendo con acetato de etilo/ hexanos al 10-30% para proporcionar 150 mg (rendimiento del 7%) del compuesto del título. Rf = 0,60 (50% de acetato de etilo/ hexanos).

Ejemplo 72 Preparación de N-\alpha-t-butoxicarbonil-N-\alpha-(3-fenilpropil)-D-serina-t-butil éter metil éster

89

El compuesto del Ejemplo 71 (150 mg, 0,51 mmol), di-t-butildicarbonato (167 mg, 0,77 mmol) y diisopropiletilamina (0,13 ml, 0,77 mmol) se agitaron en tetrahidrofurano (2 ml) a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se concentró bajo presión reducida. El residuo se diluyó con acetato de etilo (20 ml), se lavó sucesivamente con HCl 1,0N (2X), bicarbonato sódico saturado (2X), y salmuera (1X). El solvente se eliminó al vacío para proporcionar 206 mg del compuesto del título en un rendimiento cuantitativo. Rf = 0,74 (50% acetato de etilo/hexanos).

Ejemplo 73 Preparación de N-\alpha-t-butoxicarbonil-N-\alpha-(3-fenilpropil)-D-serina-t-butil éter

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90

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A una solución del compuesto del Ejemplo 72 (206 mg, 0,52 mmol) en metanol (3,5 ml), se le añadió por goteo LiOH 1,0N (0,63 ml, 0,63 mmol). La solución se volvió turbia, después se volvió homogénea en 5 minutos. La mezcla de reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante la noche. Se le añadió LiOH 1,0N adicional (1,47 ml). Tras 2 horas, se le añadió LiOH 1,0N adicional (1,0 ml). Cuando no se observó material de partida mediante TLC (50% acetato de etilo/ hexanos), la mezcla de reacción se acidificó a pH=4 con la resina de intercambio iónico DOWEX (50 X 8-400). La solución se filtró, se enjuagó con metanol y después con agua. La solución se concentró bajo presión reducida, después se liofilizó para proporcionar 189 mg del compuesto del título en un rendimiento del 95% como un aceite amarillo. Rf = 0,04 (50% acetato de etilo/ hexanos).

Ejemplo 74 Preparación de i-butoxicarbonil-D-Ser(O-t-butil)-OH (2-2)

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91

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A una solución de D-serina-O-t-butil éter (2-1) (10,5 g, 65,3 mmol) en agua (51 ml) se le añadió carbonato sódico (20,1 g, 196,2 mmol) seguido de cloroformato de isobutilo (9,8 ml, 75,2 mmol). Tras 3 horas esta mezcla se volvió turbia y se agitó durante 3 horas adicionales. Tras 6 horas la solución se acidificó con HCl 6M (\sim50 ml). La mezcla de reacción se extrajo entonces con acetato de etilo (3 x 200 ml). Tras la extracción inicial, la fase acuosa se saturó con cloruro sódico y se extrajo con acetato de etilo (2 x 200 ml). Las fases de acetato de etilo se combinaron y se secaron con sulfato sódico, seguido de la eliminación del solvente al vacío, proporcionando 17,0 g (rendimiento del 99,5%) del compuesto del título como un sólido blanco. HPLC: t=18,5 minutos en un gradiente de acetonitrilo al 5%-75% en tampón TFA acuoso al 0,1% en una columna C18 de 4,6 x 250 mm, de 5 micras de partícula, 100 angstroms de poro, a una tasa de flujo de 1 ml/ minuto. RMN (CDCl_{3}): 5,5 ppm (m,1H), 4,45 ppm (bs,1H), 3,82-3,95 ppm (m,3H), 3,52-3,6 ppm (m,1H), 1,85-1,97 ppm (m,1H), 1,2 ppm (s,9H), 0,9 ppm (d,6H).

Ejemplo 75 Preparación de i-butoxicarbonil-D-Ser(t-Bu)-L-Ala-o-t-Bu (2-3)

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92

Una solución del compuesto del Ejemplo 74 (2-2) (10 g, 38,3 mmol), L-alanina t-butil éster, sal de HCl (10,43 g, 57,4 mmol), EDC (11,05 g, 57 mmol), y hidroxibenzotriazol (5,85 g, 38,3 mmol) en acetonitrilo (153 ml) se agitó durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se le añadió diisopropiletilamina (32,7 ml, 191 mmol) y la mezcla de reacción se agitó durante 18 horas. El solvente se eliminó bajo presión reducida; el residuo resultante se resuspendió en acetato de etilo (1000 ml) y HCl 1M (100 ml). La fase de acetato de etilo se lavó con HCl 0,5M (100 ml), saturado con bicarbonato sódico (2 x 100 ml), y salmuera (100 ml). La fase de acetato de etilo se secó con sulfato sódico y el solvente se eliminó al vacío, resultando en un rendimiento cuantitativo del compuesto del título. HPLC: t_{r}= 18,7 minutos en un gradiente de acetonitrilo del 5% al 90% en tampón TFA acuoso al 0,1% en una columna C18 de 4,6 x 250 mm, de 5 micras de partícula, 100 angstrom de poro, a una tasa de flujo de 1 ml/ minuto. RMN (CDCl_{3}): 7,15 ppm (bs, 1H), 5,6 ppm (bs, 1H), 4,4-4,5 ppm (m, 1H), 4,2 ppm (bs, 1H), 3,87-3,95 ppm (m, 3H), 3,3-3,4 ppm (m, 1H), 1,85-1,95 ppm (m, 1H), 1,45 ppm (s, 9H), 1,39 ppm (d, 3H), 1,2 ppm (s, 9H), 0,9 ppm (d, 6H).

Ejemplo 76 Preparación de i-butoxicarbonil-D-Ser-L-Ala-OH (2-4)

93

A una solución del compuesto del Ejemplo 75 (2-3) (7,15 g, 18,4 mmol) en diclorometano (35 ml), se le añadió ácido trifluoroacético (35 ml). Esta mezcla se agitó durante dos horas, después se eliminó el solvente bajo presión reducida. Se le añadió tolueno y los solventes se eliminaron al vacío para eliminar el ácido trifluoroacético. Un rendimiento cuantitativo del compuesto del título como un aceite amarillo viscoso se llevó a cabo en el siguiente paso. t_{r}= 10,5 minutos en un gradiente de acetonitrilo del 5% al 90% en tampón TFA acuoso al 0,1% en una columna C18 de 4,6 x 250 mm, de 5 micras de partícula, 100 angstrom de poro, a una tasa de flujo de 1 ml/ minuto.

Ejemplo 77 Preparación de 2-ciano-5-metiltiofeno (3-2)

94

Una solución de 2-bromo-5-metiltiofeno (3-1) (TCI chemicals, 5 g, 28 mmol) y cianuro de cobre (I) (Aldrich, 2,53 g, 28 mmol) en DMF (10 ml) se calentó a reflujo durante 4 horas. Tras enfriar a temperatura ambiente, se añadieron acetato de etilo (500 ml) y una solución acuosa de NaCN al 10% (500 ml). Tras la separación de las fases acuosas y orgánicas, la fase acuosa se extrajo con acetato de etilo (300 ml). Las fases orgánicas combinadas se concentraron en un aceite, que se purificó además mediante una cromatografía rápida en columna (acetato de etilo) para proporcionar el compuesto del título (3,03 g, 87%). TLC: Rf 0,30 (1:1 de hexano/ acetato de etilo); ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 2,55 (m, 3H), 6,76 (d, 1H, J = 3,6 Hz), 7,42 (d, 1H, J = 3,6 Hz).

Ejemplo 78 Preparación de 2-ciano-5-(bromometil)tiofeno (3-3)

95

Una solución de 2-ciano-5-metiltiofeno (compuesto 3-2, 3,0 g, 24 mmol), N-bromosuccinimida (Aldrich, 4,8 g, 27 mmol), y 2,2'-azobisisobutironitrilo (Aldrich, 0,4 g, 2,4 mmol) en CCl_{4}, (Aldrich, 60 ml) se calentó a reflujo durante 5 horas. Tras enfriar a temperatura ambiente, el solvente se eliminó al vacío para proporcionar un aceite amarillo. El aceite se purificó mediante una cromatografía rápida en columna (1:1 hexano/ acetato de etilo) para proporcionar el compuesto del título (4,5 g, 91%). TLC: Rf 0,91 (1:1 de hexano/ acetato de etilo); ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 4,66 (s, 2H), 7,10 (d, 1H, J = 3,8 Hz), 7,48 (d, 1H, J = 3,8 Hz).

Ejemplo 79 Preparación de 2-ciano-5-(azidometil)tiofeno (3-4)

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96

Una solución de 2-ciano-5-(bromometil)tiofeno (compuesto 3-3, 3,5 g, 17,3 mmol) y azida sódica (Aldrich, 1,7 g, 26 mmol) en DMF (Aldrich, 60 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 10 horas. La cromatografía rápida en columna (20% acetato de etilo en hexano) proporcionó el compuesto del título (2,35 g, 83%). TLC: Rf 0,48 (20% de acetato de etilo en hexano); ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 4,56 (s, 2H), 7,01 (d, 1H, J = 3,7 Hz), 7,55 (d, 1H, J = 3,7 Hz).

Ejemplo 80 Preparación de 2-ciano-5-(aminometil)tiofeno (3-5)

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97

Se le añadió trifenilfosfina (Aldrich, 5,7 g) a una solución de 2-ciano-5-(azidometil)tiofeno (compuesto 3-4, 2,5 g, 10 mmol) en THF (Aldrich, 40 ml) y agua (10 ml) a 0ºC. La solución se dejó calentar a temperatura ambiente y se agitó a temperatura ambiente durante 10 horas. La purificación por RP-HPLC proporcionó el compuesto del título (2,3 g, 94%). MS (electropulverización): 139 (M + 1); ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 4,01 (s, 2H), 4,75 (br s, 2H, NH_{2}), 6,82 (d, 1H, J = 3,5 Hz), 7,08 (d, 1H, J = 3,5 Hz).

Ejemplo 81 Preparación de 2-ciano-5-(t-butoxicarbonilaminometil)tiofeno (3-6)

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98

Se le añadió carbonato potásico (Aldrich, 2 g) a una solución de 2-ciano-5-(aminometil)tiofeno (compuesto 3-5, 0,6 g, 4 mmol), Boc_{2}O (Fluka, 0,95 g, 4 mmol) en agua (4 ml) y 1,4-dioxano (Aldrich). La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 12 horas. La cromatografía rápida (1:1 hexano/ acetato de etilo) proporcionó el compuesto del título (0,58 g, 56%). MS (electropulverización): 239 (M + 1); ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 1,44 (s, 9H), 4,55 (s, 2H), 4,90 (br s, 1H, NH), 6,88 (d, 1H, J = 3,6 Hz), 7,07 (d, 1H, J = 3,6 Hz).

Ejemplo 82 Preparación de 2-(N-hidroxiamidinil)-5-(t-butoxicarbonilaminometil)tiofeno (3-7)

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99

Una solución de 2-ciano-5-(t-butoxicarbonilmetil)-tiofeno (compuesto 3-6, 560 mg, 2,44 mmol), clorhidrato de hidroxilamina (Aldrich, 330 mg, 4,8 mmol) y 4-metil-morfolina (Aldrich, 1 ml, 9,1 mmol) en metanol (5 ml) 54 se agitó a temperatura ambiente durante 12 horas. La cromatografía rápida (5:95:1 isopropil alcohol/ cloruro de metileno/ trietilamina) proporcionó el compuesto del título (550 mg, 86%). MS (electropulverización): 272 (M + 1).

Ejemplo 83 Preparación de 2-amidinil-5-(aminometil)tiofeno (3-8)

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100

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Se le añadió Pd-sobre-C al 10% (Aldrich, 100 mg) a una solución de 2-(N-Hidroxiamidinil)-5-(t-butoxicarbonil-amino-metil) tiofeno (compuesto 3-7, 900 mg, 3,3 mmol) en metanol (10 ml). La mezcla resultante se hidrogenó (45 psi de H_{2}) en un aparato Parr a temperatura ambiente durante 10 horas. El catalizador se eliminó mediante filtración y el solvente se evaporó al vacío para proporcionar el intermediario Boc protegido [900 mg, 94%, MS (electropulverización) 256 (M + 1)] que se trató con HCl 4M en 1,4-dioxano (Aldrich, 5 ml) durante 3 horas a temperatura ambiente para proporcionar el compuesto del título (460 mg, 84%). MS (electropulverización): 56 (M + 1); ^{1}H RMN (CD_{3}OD): \delta 4,43 (s, 2H), 7,42 (d, 1H, J = 3,5 Hz), 7,78 (d, 1H, J = 3,5 Hz).

Ejemplo 84 Preparación de 2-[N-(propiloxi)amidinil)-5-(aminometil)tiofeno (3-9)

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101

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Se le añadió CsCO_{3} (Aldrich, 0,5 g) a una solución de 2-(N-Hidroxiamidinil)-5-(t-butoxicarbonilaminometil) tiofeno (compuesto 3-7, 271 mg, 1,0 mmol) y yodopropano (Aldrich, 200 mg, 1,2 mmol) en DMF. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 10 horas. La cromatografía rápida (5:95:1 isopropil alcohol/cloruro de metileno/ trietilamina) proporcionó el intermediario Boc protegido [MS (electropulverización) 314 (M + 1)] que se trató con HCl 4M en 1,4-dioxano (Aldrich) durante 3 horas a temperatura ambiente para proporcionar el compuesto del título (201 mg, 81%). MS (electropulverización): 214 (M + 1); ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 0,95 (t, 3H, J = 7,5 Hz), 1,55 (br s, 2H, NH2), 1,70 (m, 2H), 4,00 (t, 2H, J = 7,5 Hz), 4,01 (d, 2H, J = 7,5 Hz), 4,70 (br s, 2H, NH_{2}), 6,80 (d, 1H, J = 3,6 Hz), 7,08 (d, 1H, J = 3,6 Hz).

Ejemplo 85 Preparación de \alpha-azido-4-cianotolueno (4-2)

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102

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Se le añadió azida sódica (Aldrich, 3,5 g, 54 mmol) a una solución de bromuro de p-cianobencilo (Aldrich, 10 g, 51 mmol) en DMF (100 ml), y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 5 horas. La mezcla de reacción se diluyó entonces con agua (350 ml) y se extrajo con éter (2 x 100 ml). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera y se secaron (MgSO_{4}). La eliminación del solvente proporcionó el compuesto del título (8 g, 96%). ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 4,42 (s, 2H), 7,41 (d, 2H, J = 8,1 Hz), 7,65 (d, 2H, J = 8,1 Hz).

Ejemplo 86 Preparación de p-cianobencilamina (4-3)

103

Se le añadió catalizador de Pd-sobre-C al 10% (Aldrich, 800 mg) a una solución de \alpha-azido-4-cianotolueno (compuesto 4-2, 8 g, 51 mmol) en EtOAc (150 ml). La mezcla de reacción se hidrogenó (H_{2}, 45 psi) en un aparato Parr durante 11 horas. El catalizador se eliminó mediante filtración y el solvente se eliminó al vacío para proporcionar el compuesto del título (6,3 g, 93%). ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 3,85 (s, 2H), 7,45 (d, 2H, J = 8,1), 7,60 (d, 2H, J = 8,1 Hz), 7,78 (s, 2H, NH_{2}).

Ejemplo 87 Preparación de 4-(aminometil)fenil-N-hidroxiamidina (4-4)

104

Se le añadió clorhidrato de hidroxilamina (7 g) a una solución del compuesto 4-3 (7 g) y NMM (4 ml) en metanol (100 ml). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 3 días. El compuesto se purificó mediante RP HPLC para proporcionar el compuesto del título (7 g, 89%). MS (electropulverización): 166 (M + 1).

Ejemplo 88 Preparación de 4-(aminometil)fenilamidina (4-5)

105

Se le añadió Pd-sobre-C al 10% (Aldrich, 800 mg) a una solución de 4-(aminometil)fenil-N-hidroxiamidina (compuesto 4-4, 7 g) en metanol (150 ml). La mezcla de reacción se hidrogenó (H_{2}, 45 psi) en un aparato Parr durante 48 horas. El catalizador se eliminó mediante filtración y el solvente se eliminó al vacío para proporcionar el compuesto del título (6,3 g, 99%). MS (electropulverización): 150 (M + 1).

Ejemplo 89 Preparación de 2-fluoro-4-cianotolueno (5-2)

106

Se le añadió cianuro de cobre (I) (Aldrich, 3,6 g, 40 mmol) a una solución de 4-bromo-2-fluorotolueno (Aldrich, 5 g, 27 mmol) en DMF (60 ml). La mezcla de reacción se calentó a 150ºC durante 11 horas. Tras enfriar a temperatura ambiente, la mezcla se repartió entre agua y EtOAc (500 ml cada uno). La fase orgánica se secó (MgSO_{4}), y el solvente se eliminó al vacío para proporcionar el compuesto del título (2,08, 58%). ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 2,36 (s, 3H), 7,30 (m, 3H), 7,35 (d, 1H, J = 8,1 Hz).

Ejemplo 90 Preparación de 3-fluoro-4-(bromometil)benzonitrilo (5-3)

107

NBS (Aldrich, 3,02 g, 17 mmol) y peróxido de benzoílo (Aldrich, 0,37 g, 1,5 mmol) se le añadió a una solución de 2- fluoro-4-cianotolueno (compuesto 5-2, 2,08 g, 15 mmol) en CCl_{4}. La mezcla de reacción se calentó a 80ºC durante 14 horas. Tras enfriar a temperatura ambiente, la mezcla se diluyó con éter (100 ml) y se lavó con Na_{2}S_{3}O_{3} acuoso, y se secó (MgSO_{4}). La eliminación del solvente al vacío produjo un aceite amarillo que se purificó mediante cromatografía flash. El compuesto del título 5-3 (1,4 g, 42%) se obtuvo junto con un producto secundario, 3-fluoro-4-(bromometil) benzonitrilo (5-4) (1,0 g, 30%). Para el compuesto del título (5-3): ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 4,46 (s, 2H), 7,35 (d, 1H, J = 8,0 Hz), 7,42 (d, 1H, J = 8,0 Hz), 7,52 (t, 1H, J = 8,0 Hz). Para el producto secundario (5-4): ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 6,90 (s, 1H), 7,35 (d, 1H, J = 8,0 Hz), 7,55 (d, 1H, J = 8,0 Hz), 7,96 (t, 1H, J = 8,0 Hz).

Ejemplo 91 Preparación de 3-fluoro-4-(azidometil)benzonitrilo (5-5)

108

Se le añadió azida sódica (Aldrich, 0,63 g, 9,8 mmol) a una solución de 3-fluoro-4-(bromometil)benzonitrilo (compuesto 5-3, 1,4 g, 6,5 mmol) en DMF (15 ml). Tras agitar a temperatura ambiente durante 20 horas, la mezcla de reacción se repartió en EtOAc y agua (100 ml, cada uno). La fase orgánica se secó después (MgSO_{4}) y el solvente se eliminó al vacío para proporcionar el compuesto del título (0,995 g, 86%). ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 4,50 (s, 2H), 7,38 (d, 2H, J = 8,1 Hz), 7,52 (m, 2H).

Ejemplo 92 Preparación de 3-fluoro-4-(azidometil)fenil-N-hidroxiamidina (5-6)

109

Se le añadió clorhidrato de hidroxilamina (Aldrich, 800 mg, 11,6 mmol) a una solución de 3-fluoro-4-(azidometil) benzonitrilo (compuesto 5-5, 1,2 g, 6,8 mmol) y NMM (2 ml) en metanol (25 ml). Tras agitar a temperatura ambiente durante 3 días, la mezcla de reacción se diluyó con EtOAc y se lavó con salmuera. La eliminación del solvente al vacío proporcionó el compuesto del título (1,38, 82%). ^{1}H RMN (CD_{3}OD): \delta 4,41 (s, 2H), 7,45 (m, 3H).

Ejemplo 93 Preparación de 3-fluoro-4-(azidometil)fenil(-N-propiloxi)amidina (5-7)

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110

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Se le añadió carbonato de cesio (Aldrich, 3,2 g, 9,9 mmol) a una solución de yodopropano (1 ml, 10 mmol) y 3- fluoro-4-(azidometil)fenil-N-hidroxiamidina (compuesto 5-6, 1,38 g, 6,6 mmol) en DMF (20 ml). La mezcla de reacción se calentó a 50ºC durante 20 horas. Tras enfriar a temperatura ambiente, se le añadió agua y la mezcla resultante se extrajo con éter. La fase orgánica se lavó con salmuera y se secó (MgSO_{4}). La cromatografía rápida proporcionó el compuesto del título (1,03 g, 62%). ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 0,99 (t, 3H, J =7,5 Hz), 1,75 (m, 2H), 4,08 (t, 2H, J = 7,5 Hz), 4,40 (s, 2H), 4,78 (br s, 2H) 7,40 (m, 3H).

Ejemplo 94 Preparación de 3-fluoro-4-(aminometil)fenil(-N-propiloxi)amidina (5-8)

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111

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Se le añadió trifenilfosfina (Aldrich, 1,6 g, 6,2 mmol) a una solución de 3-fluoro-4-(azidometil)fenil(-N-propiloxi)-amidina (compuesto 5-7, 1,03 g, 4,1 mmol) en THF (15 ml). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 20 horas. Se le añadió NaOH (3M) a la mezcla de reacción hasta que el pH= 14. La solución resultante se extrajo con EtOAc (2 x 100 ml). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera y se secaron (MgSO_{4}). La eliminación del solvente al vacío proporcionó el compuesto del título (825 mg, 77%). ^{1}H RMN (CD_{3}OD): \delta 0,98 (t, 3H, J = 7,5 Hz), 1,72 (m, 2H), 3,82 (s, 2H), 3,95 (t, 2H, J = 7,5 Hz), 7,35 (d, 1H, J = 8,0 Hz), 7,40 (m, 2H).

Ejemplo 95 Preparación de N-\alpha-benciloxicarbonil-D-Ser(O-t-butil)-L-Ala t-butil éster

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112

A una solución de N-\alpha-Cbz-D-serina t-butil éter (5,02 g, 17 mmol) en acetonitrilo (100 ml) se le añadió EDC (4,90 g, 25,5 mmol, 1,5 equiv.) y 1-hidroxibenzotriazol (2,60 g, 17 mmol). Tras agitar durante 45 minutos, se le añadió alanina t-butil éster, sal de HCl (3,55 g, 19,6 mmol, 1,15 equiv) y 4-metilmorfolina (7,5 ml, 68 mmol, 4 equiv.). La mezcla de reacción se agitó durante 1,5 horas. La TLC indicó que la reacción se había completado. La mezcla de reacción se concentró bajo presión reducida. El residuo se disolvió en acetato de etilo (100 ml), después se lavó sucesivamente con HCl 1N, bicarbonato sódico saturado, agua y salmuera (25 ml cada uno). El solvente se eliminó al vacío para proporcionar un aceite que cristalizó al reposar. El compuesto del título (6,95 g) se obtuvo como un sólido amarillo pálido en un rendimiento del 97%. Rf= 0,63 (isopropanol al 5% en diclorometano).

Ejemplo 96 Preparación de D-Ser(O-t-butil)-L-Ala t-butil éster

113

Una solución del compuesto del Ejemplo 95 (1,14 g, 2,69 mmol) en metanol se hidrogenó sobre hidróxido de paladio(110 mg) a una presión de globo durante 1,5 horas. La mezcla de reacción se filtró a través de celite, y el solvente se eliminó al vacío para proporcionar el compuesto del título en un rendimiento cuantitativo como un aceite amarillo. Rf = 0,44 (5% metanol en diclorometano).

Ejemplo 97 Preparación de fenetilsulfonil-D-Ser(O-t-butil)-L-Ala t-butil éster

114

A una solución agitada del compuesto del Ejemplo 96 (4,2 g, 14,6 mmol) y cloruro de fenetilsulfonilo (3,58 g, 17,5 mmol, 1,2 equiv.) en acetonitrilo (100 ml) se enfrió en un baño de hielo, se le añadió 2,4,6-colidina (4,8 ml, 36,5 mmol, 2,5 equiv.). La mezcla de reacción se dejó calentar a temperatura ambiente, después se agitó durante la noche. La mezcla de reacción se concentró bajo presión reducida. El residuo se disolvió en acetato de etilo (80 ml); la solución resultante se lavó sucesivamente con HCl 1,0N, bicarbonato sódico saturado, agua y salmuera, después se secó sobre sulfato sódico. El solvente se eliminó al vacío. El residuo se cromatografió a través de gel de sílice eluyendo con 0-60% de acetato de etilo/ hexanos. El compuesto del título se aisló en un rendimiento del 89% como un aceite amarillo. Rf = 0,84 (5% metanol en diclorometano).

C. Rutas Sintética para Compuestos que Poseen Ésteres de Acilo o Carbonato en P3 Ejemplo 98 Preparación de n-butilsulfonil-D-(isopropiloxicarbonil)-serina-alanina-4-amidinobencilamida

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115

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A una solución del compuesto del Ejemplo 9 (2,32 g, 4,3 mmol) en piridina (100 ml) enfriada en un baño de hielo, se añadió cloroformato de isopropilo (21 ml de una solución 1M en tolueno, 21 mmol, 5 equiv.). La reacción se monitorizó hasta que se determinó que estaba completo mediante HPLC analítica. La mezcla de reacción se diluyó con tolueno (300 ml); el solvente se eliminó bajo presión reducida. El residuo se disolvió en acetonitrilo (400 ml) y el solvente se eliminó bajo presión reducida. El residuo se disolvió en acetonitrilo (30 ml) y acetato de etilo (30 ml). Se añadió éter, y se aisló el precipitado. El sólido se lavó con éter, después se secó al vacío. El sólido se lavó con éter y acetato de etilo (2 X 200 ml de una mezcla 1:1), después se secó al vacío para proporcionar el compuesto del
título.

Ejemplo 99

Siguiendo el protocolo del Ejemplo 98, resaltando la sustitución por cloroformato de isopropilo, se prepararon los siguientes compuestos:

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116

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Ejemplo A Ensayos Enzimáticos in vitro para determinar la especificidad

La capacidad de los compuestos de la presente invención de actuar como inhibidores selectivos de la actividad catalítica de la uroquinasa se evaluó mediante la determinación de la concentración del compuesto prueba que inhibe la actividad de esta enzima en un 50%, (CI_{50}), y comparando este valor con el que se ha determinado para todos o alguno de las siguientes serina proteasas relacionadas: activador de plasminógeno tisular recombinante (rt-PA), plasmina, proteína C activada, quimiotripsina, factor Xa, trombina y tripsina.

El tampón utilizado para todos los ensayos fue HBSA (HEPES 10 mM, pH 7,5, cloruro sódico 150 mM, albúmina sérica bovina 0,1%).

El ensayo para las determinaciones de IC_{50} se llevó a cabo mediante la combinación en pocillos apropiados de una placa Corning microtitulada, 50 microlitros de HBSA, 50 microlitros del compuesto prueba a una concentración especificada (cubriendo un amplio rango de concentración) diluido en HBSA (o HBSA solo para la medición de V_{0} (velocidad no inhibida)), y 50 microlitros de la enzima diluida en HBSA. Tras una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente, se añadieron a los pocillos 50 microlitros del sustrato a las concentraciones especificadas más abajo, proporcionando un volumen final total de 200 microlitros (alrededor de 4 veces la Km). La velocidad inicial de la hidrólisis del sustrato cromogénico se midió mediante el cambio de absorbancia a 405 nm utilizando un lector de microplacas Thermo Max® Kinetic Microplate Reader durante un periodo de 5 minutos en que se utilizó menos del 5% del sustrato añadido. La concentración del inhibidor añadido que provocó un descenso del 50% en la tasa inicial de hidrólisis se definió como el valor de CI_{50}. La Ki se puede calcular a partir del valor de CI_{50}.

Ensayo Uroquinasa

La actividad catalítica de la uroquinasa se determinó utilizando el sustrato cromogénico S-2444 150 mM (clorhidrato de L-piroglutamil-glicil-L-arginina-p-nitroanili-na), obtenida de DiaPharma Group, Inc. Urokinase (Abbokinase), fabricado por Abbott Laboratories, se obtuvo de Priority Pharmaceuticals y se diluyó a 750 pM en el tampón de ensayo HBSA antes de utilizarlo. El tampón de ensayo era HBS (HEPES 10 mM, cloruro sódico 150 mM pH 7,4) con BSA al 0,1%. La Ki se calculó utilizando el valor CI_{50}.

Ensayo trombina (fIIa)

La actividad enzimática se determinó utilizando el sustrato cromogénico, Pefachrome t-PA (CH_{3}SO_{2}-D-hexahidrotirosina-glicil-L-Arginina-p-nitroanilina, obtenido de Pentapharm Ltd.). El sustrato se reconstituyó en agua desionizada antes de utilizarlo. La \alpha-trombina humana purificada se obtuvo a partir de Enzyme Research Laboratories, Inc. El tampón utilizado para todos los ensayos fue HBSA (HEPES 10 mM, pH 7,5, cloruro sódico 150 mM, albúmina de suero bovino al 0,1%).

Las determinaciones de CI_{50} se llevaron a cabo con HBSA (50 \muL), \alpha-trombina (50 \muL) (la concentración final de enzima es de 0,5 nM) e inhibidor (50 \muL) (cubriendo un amplio rango de concentración), se combinaron en pocillos apropiados y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente antes de la adición del sustrato Pefachrome-t-PA (50 \muL) (la concentración final de enzima es de 250 \muM, alrededor de 5 veces la Km). La velocidad inicial de la hidrólisis de Pefachrome t-PA se midió mediante el cambio de la absorbancia a 405nm utilizando un lector de microplacas Thermo Max® Kinetic Microplate Reader durante un periodo de 5 minutos en que se utilizó menos del 5% del sustrato utilizado. La concentración del inhibidor añadido que provocó un descenso del 50% en la tasa inicial de hidrólisis se definió como el valor de CI_{50}.

Factor Xa

La actividad catalítica del Factor Xa se determinó utilizando el sustrato cromogénico S-2765 (N-benciloxi-carbonil-D-arginina-L-glicina-L-arginine-p-nitro-anilina), obtenido de DiaPharma Group (Franklin, OH). Todos los sustratos se reconstituyeron en agua desionizada antes de utilizarlos. La concentración final de S-2765 fue de 250 \muM (alrededor de 5 veces la Km). El Factor X humano purificado se obtuvo de Enzyme Research Laboratories, Inc. (South Bend, IN) y el Factor Xa (FXa) se activó y preparó como se ha descrito [Bock, P.E., Craig, P.A., Olson, S.T., y Singh, P., Arch. Biochem. Biophys. 273:375-388 (1989)]. La enzima se diluyó en HBSA antes del ensayo en que la concentración final fue de 0,25 nM.

Ensayo del activador de plasminógeno tisular Recombinante (rt-PA)

La actividad catalítica de rt-PA se determinó utilizando el sustrato, Pefachrome t-PA (CH_{3}SO_{2}-D-hexahidrotirosina-glicil-L-arginina-p-nitroanilina, obtenido de Pentapharm Ltd.). El sustrato se reconstituyó en agua desionizada seguido por la dilución en HBSA antes del ensayo en que la concentración final fue de 500 micromolar (alrededor de 3 veces la Km). La rt-PA humana (Activase®) se obtuvo de Genentech Inc. La enzima se reconstituyó en agua desionizada y se diluyó en HBSA antes del ensayo, en el que la concentración final fue de 1,0 nM.

Ensayo Plasmina

La actividad catalítica de la plasmina se determinó utilizando el sustrato cromogénico, S-2366 [clorhidrato de L-piroglutamil-L-prolil-L-arginina-p-nitroanilina], que se obtuvo de DiaPharma Group. El sustrato se reconstituyó en agua desionizada seguido por la dilución en HBSA antes del ensayo en que la concentración final fue de 300 micromolar (alrededor de 2,5 veces la Km). La plasmina humana purificada se obtuvo de Enzyme Research Laboratories, Inc. La enzima se diluyó en HBSA antes del ensayo en el que la concentración final fue de 1,0 nM.

Ensayo de Proteína C (aPC) Activada

La actividad catalítica de aPC se determinó utilizando el sustrato cromogénico, Pefachrome PC (diclorhidrato de delta-carbobenciloxi-D-lisina-L-prolil-L-arginina-p-nitroanilina), obtenido de Pentapharm Ltd.). El sustrato se reconstituyó en agua desionizada seguido por la dilución en HBSA antes del ensayo en que la concentración final fue de 400 micromolar (alrededor de 3 veces la Km). La aPC humana purificada se obtuvo de Hematologic Technologies, Inc. La enzima se diluyó en HBSA antes del ensayo en que la concentración final fue de 1,0 nM.

Ensayo Quimiotripsina

La actividad catalítica de la quimiotripsina se determinó utilizando el sustrato cromogénico, S-2586 (metoxi-succinil-L-arginina-L-prolil-L-tirosil-p-nitroanilida), que se obtuvo de DiaPharma Group. El sustrato se reconstituyó en agua desionizada seguido por la dilución en HBSA antes del ensayo en que la concentración final fue de 100 micromolar (alrededor de 9 veces la Km). Se obtuvo \alpha-quimio-tripsina pancreática bovina purificada (3X-cristalizada; CDI) de Worthington Biochemical Corp. La enzima se reconstituyó en agua desionizada y se diluyó en HBSA antes del ensayo en que la concentración final fue de 0,5 nM.

Ensayo Tripsina

La actividad catalítica de la tripsina se determinó utilizando el sustrato cromogénico, S-2222 (benzoil-L-isoleucina-L-ácido glutámico-[gamma-metil éster]-L-arginina-p-nitroanilida), que se obtuvo de DiaPharma Group. El sustrato se reconstituyó en agua desionizada seguido por la dilución en HBSA antes del ensayo en que la concentración final fue de 250 micromolar (alrededor de 4 veces la Km). Se obtuvo tripsina pancreática bovina purificada (3X-cristalizada; TRL3) de worthington Biochemical Corp. La enzima se reconstituyó en agua desionizada y se diluyó en HBSA antes del ensayo en que la concentración final fue de 0,5 nM.

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Tabla I

La Tabla I muestra la Ki determinada o los valores de CI_{50} para ciertos enzimas mostrados antes para los Compuestos de la presente invención que demuestran un alto grado de especificidad para la inhibición de uroquinasa en comparación con otras serin proteasas.

TABLA I

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118

A = menos de 100 nm

B = 100-250 nm

C = 250-2500 nm

D = más de 2500 nm

E = No Activa

NT = No probado

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Ejemplo B Evaluación del Compuesto Prueba como Inhibidor de la Angiogénesis In Vivo

Se utilizó el modelo de MCA de pollo (membrana corioalantoidea de embrión de pollo), un ensayo de angiogénesis estándar, para evaluar la capacidad de un compuesto prueba de inhibir la angiogénesis. Este modelo es un modelo establecido para la evaluación de la actividad de un compuesto prueba para afectar la formación de nuevos vasos sanguíneos.

Se colocó un filtro de disco saturado con una solución de 0,5 \mug/ml de factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) en la MCA de embriones de pollo de 10 días de edad para inducir la angiogénesis. Veinticuatro horas después, se inyectó por vía intravenosa en el embrión de 0 a 1 \mug del Compuesto Prueba, en un volumen total de 100 \mul de PBS estéril. Aproximadamente 48 horas después, se sacrificaron los embriones y se cortaron los filtros de disco la MCA de tejido circundante para su análisis. La angiogénesis se cuantificó contando el número de puntos de ramificación de los vasos sanguíneos dentro de la región confinada en el filtro [Brooks, P.C., et al, Methods in Molecular Biology 120:257-269 (1999)]. El índice angiogénico se define como la diferencia en el número de puntos de ramificación de vasos sanguíneos entre un grupo de embriones experimental y el grupo de embriones control no tratados. Cada grupo experimental contendrá de 8 a 10 embriones de pollo.

Ejemplo C Evaluación del Compuesto Prueba para Inhibir el Crecimiento de Células Tumorales Humanas en un Modelo de Embrión de Pollo

Se utilizó un modelo de embrión de pollo para evaluar la actividad del Compuesto Prueba para inhibir el crecimiento de células tumorales humanas in vivo. Se colocó una única suspensión de células de fibrosarcoma humano (HT 1080), que contenía 4 X 10^{5} células en un volumen total de 40 \mul, a embriones de pollo de 10 días de edad como se describe en Brooks, et al (``Brooks, P.C., et al, "Integrin \alpha_{v}\beta_{3} Antagonists Promote Tumor Regression by Inducing Apoptosis of Angiogenic Blood Vessels", Cell 79:1157-1164 (1994)). Veinticuatro horas después se inyectó por vía intravenosa en el embrión de 0 a 10 \mug del Compuesto Prueba en los embriones. Siguiendo esta administración única del compuesto, se incubaron los embriones control y tratados durante un total de 7 días y después se sacrificaron. Se escindieron los tumores, liberándolos del tejido MCA circundante, y se pesaron. Los pesos húmedos de los tumores escindidos en este experimento se tabularon. Cada grupo experimental contendrá de 10 a 12 embriones de pollo.

Claims

1. Un compuesto con la fórmula:

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en el que:

(b) R_{1} se selecciona de entre el grupo que consiste en

(1): alquilo de 1 a 12 átomos de carbono que está opcionalmente sustituido con Y_{1} y/o Y_{2};

(2): alquilo de 1 a 3 átomos de carbono sustituidos con cicloalquilo de 3 a 8 átomos de carbono que está opcionalmente, mono-, di- o tri-sustituido con Y_{1}, Y_{2} y/o Y_{3};

(3): cicloalquilo de 3 a 15 átomos de carbono que está opcionalmente, mono-, di- o tri-sustituido en el anillo con Y_{1}, Y_{2} y/o Y_{3}; y

(4): heterocicloalquilo de 4 a 10 átomos en el anillo con los átomos del anillo seleccionados de entre carbono y heteroátomos, en el que los heteroátomos se seleccionan de entre el grupo que consiste en oxígeno, nitrógeno, y S(O)_{i}, en el que i es 0, 1 o 2, que está opcionalmente mono-, di- o tri-sustituido en el anillo con Y_{1}, Y_{2}, y/o Y_{3};

(5): heterociclo de 4 a 10 átomos en el anillo con los átomos del anillo seleccionados de entre carbono y heteroátomos, en el que los heteroátomos se seleccionan de entre el grupo que consiste en oxígeno, nitrógeno, y S(O)_{i}, en el que i es 0, 1, o 2, lo que incluye, 524 en el que 525 es un heterociclo de 5 a 7 miembros con de 3 a 6 átomos de carbono en el anillo, en el que V es -CH_{2}-, -O-, -S(=O)-, - S(O)_{2}- o -S-, que está opcionalmente mono-, di- o tri-sustituido en los carbonos del anillo con Y_{1}, Y_{2}, y/o Y_{3};

(6): alquenilo de 2 a 6 átomos de carbono que está opcionalmente sustituido con cicloalquilo de 3 a 8 átomos de carbono, que está opcionalmente mono-, di- o tri-sustituido en el anillo con Y_{1}, Y_{2}, y/o Y_{3};

(7): arilo de 6 a 14 átomos de carbono que está opcionalmente mono-, di- o tri-sustituido con Y_{1}, Y_{2} y/o Y_{3};

(8): heteroarilo de 5 a 14 átomos en el anillo con los átomos del anillo seleccionados de entre carbono y heteroátomos, en el que los heteroátomos se seleccionan de entre oxígeno, nitrógeno y azufre, y que está opcionalmente mono-, di- o tri- sustituido con Y_{1}, Y_{2}, y/o Y_{3};

(9): aralquilo de 7 a 15 átomos de carbono que está opcionalmente sustituido en la cadena alquilo con hidroxi o halógeno y que está opcionalmente mono-, di- o tri-sustituido con Y_{1}, Y_{2}, y/o Y_{3};

(10): heteroaralquilo de 5 a 14 átomos en el anillo con los átomos del anillo seleccionados de entre carbono y heteroátomos, en el que los heteroátomos se seleccionan de entre oxígeno, nitrógeno y azufre, que está opcionalmente sustituido en la cadena alquilo con hidroxi o halógeno y opcionalmente mono-, di- o tri-sustituido en el anillo con Y_{1}, Y_{2}, y/o Y_{3};

(11): aralquenilo de 8 a 16 átomos de carbono que está opcionalmente mono-, di- o tri-sustituido en el anillo arilo con Y_{1}, Y_{2}, y/o Y_{3};

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(12): heteroaralquenilo de 5 a 14 átomos en el anillo con los átomos del anillo seleccionados de entre carbono y heteroátomos, en el que los heteroátomos se seleccionan de entre oxígeno, nitrógeno y azufre, y que está opcionalmente mono-, di- o tri-sustituido en el anillo carbono con Y_{1}, Y_{2}, y/o Y_{3};

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(17): alquilo carbocíclico fusionado de 9 a 15 átomos de carbono;

(18): difluorometilo o perfluoroalquilo de 1 a 12 átomos de carbono;

(19): perfluoroarilo de 6 a 14 átomos de carbono;

(20): perfluoroaralquilo de 7 a 15 átomos de carbono; y

(21): hidrógeno cuando X es -C(=O)NH-, -S(O)_{2}-, -S(O)_{2}NH-, o un enlace directo; y

: en el que cada Y_{1}, Y_{2} e Y_{3} son independientemente seleccionados y se

(i): seleccionan de entre el grupo que consiste en halógeno, ciano, nitro, tetrazolilo, guanidino, amidino, metilguanidino, -CF_{3}, -CF_{2}CF_{3}, -CH(CF_{3})_{2}, -C(OH)(CF_{3})_{2}, -OCF_{3}, -OCF_{2}H, -OCF_{2}CF_{3}, -OC(O)NH_{2}, -OC(O)NHZ_{1}, -OC(O)NZ_{1}Z_{2}, -NHC(O)Z_{1}, -NHC(O)NH_{2}, -NHC(O)NZ_{1}, -NHC(O)NZ_{1}Z_{2}, -C(O)OH, -C(O)OZ_{1}, -C(O)NH_{2}, -C(O)NHZ_{1}, -C(O)NZ_{1}Z_{2}, -P(O)_{3}H_{2}, -P(O)_{3}(Z_{1})_{2}, -S(O)_{3}H, -S(O)_{m}Z_{1}, -Z_{1}, -OZ_{1}, -OH, -NH_{2}, -NHZ_{1}, -NZ_{1}Z_{2}, -N-morfolino, y -S(O)_{m}(CF_{2})_{q}CF_{3}, en el que m es 0, 1 o 2, q es un entero de 0 a 5, y Z_{1} y Z_{2} se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste en alquilo de 1 a 12 átomos de carbono, arilo de 6 a 14 átomos de carbono, heteroarilo de 5 a 14 átomos en el anillo, aralquilo de 7 a 15 átomos de carbono y heteroaralquilo de 5 a 14 átomos en el anillo, o

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(ii): Y_{1} e Y_{2} se seleccionan conjuntamente siendo -O[C(Z_{3})(Z_{4})]_{r}O o -O[C(Z_{3})(Z_{4})]_{r+1}-, en el que r es un número entero de 1 a 4, y Z_{3} y Z_{4} se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo de 1 a 12 átomos de carbono, arilo de 6 a 14 átomos de carbono, heteroarilo de 5 a 14 átomos en el anillo, aralquilo de 7 a 15 átomos de carbono, y heteroaralquilo de 5 a 14 átomos en el anillo;

(c) R_{2} es -CH_{2}OH, -CH(CH_{3})OH, o se selecciona para dar lugar a un grupo en P_{3} seleccionado de entre el grupo que consiste en ésteres de acilo y carbonato de D-serilo;

(e) R_{7} es hidrógeno o alquilo de 1 a 4 átomos de carbono;

(f) E se selecciona de entre el grupo que consiste en:

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2. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 en el que E se selecciona del grupo que consiste en:

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3. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 2 en el que X es -S(O_{2})- o -O-C(=O)-.

4. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 en el que R_{2} es -CH_{2}OH o -CH(CH_{3})OH.

5. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 en el que R_{2} se selecciona para proporcionar un grupo en P_{3} seleccionado de D-serilo y (R,R) D-alotreonilo.

6. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 en el que R_{2} es -CH_{2}OH y el carbono portador de R_{2} (carbono alfa) presenta la configuración R.

7. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 en el que R_{2} es -CH(CH_{3})OH y ambos carbonos portadores de R_{2} (carbono alfa) y el carbono portador del grupo metilo de R_{2} (carbono beta) presenta la configuración R.

8. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 en el que R_{3} y R_{4} se seleccionan juntos para proporcionar un grupo en P_{2} seleccionado del grupo que consiste en prolilo, 4-cis-hidroxiprolilo, 3,4-dehidroprolilo, 3,4-metanoprolilo y azetidina-2-carbonilo.

9. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 8 en el que R_{3} y R_{4} se seleccionan juntos para proporcionar un grupo en P_{2} seleccionado prolilo, azetidina-2-carbonilo, 3,4-metanoprolilo y 3,4-dehidroprolilo.

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10. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 en el que X se selecciona de -S(O)_{2}-, -OC(=O)-, NH-C(=O)- y un enlace directo.

11. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 10 en el que X es -S(O)_{2}- o -OC(=O).

12. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 11 en el que R_{1} se selecciona de fenilo, bencilo, 2-feniletilo, isobutilo, n-butilo, 3-fenilpropilo; 4-clorobencilo, 3-clorobencilo y 2-fluorobencilo.

13. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 12 en el que R_{1}-X- se selecciona de fenil-S(O)_{2}-, bencil-S(O)_{2}-,
2-feniletil-S(O)_{2}-, 3-fenilpropil-S(O)_{2}-, n-butil-S(O)_{2}-, bencil-OC(=O)-, isobutil-OC(=O)-, 4-clorobencil-S(O)_{2}-,
3-clorobencil-S(O)_{2}- y 2-fluorobencil-S(O)_{2}-.

14. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 que se selecciona del grupo que consiste en

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15. Un compuesto de la reivindicación 1, en el que R_{2} se selecciona para proporcionar un grupo en P_{3} seleccionado de entre ésteres de acilo y carbonato de D-serilo

16. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 15 en el que R_{3} y R_{4} se seleccionan juntos para proporcionar un grupo en P_{3} seleccionado del grupo que consiste en prolilo, 4-cis-hidroxiprolilo, 3,4-dehidroprolilo, 3,4-metanoprolilo y azetidina-2-carbonilo.

17. Una composición que comprende un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, 4, 14 o 15 y un transportador farmacéuticamente aceptable.

18. El uso de un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, 4, 14 o 15 para la preparación de una composición farmacéutica para tratar una enfermedad en un mamífero que la necesite que mejora mediante la inhibición o disminución de la actividad uroquinasa en dicho mamífero.

19. El uso de un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, 4, 14 o 15 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de una condición patológica en un mamífero que lo necesite y que mejore mediante la inhibición o disminución de la angiogénesis en dicho mamífero.