DE60034447T2

DE60034447T2 - Nicht-kovalente Urokinase-und Angiogenese-Inhibitoren

Info

Publication number: DE60034447T2
Application number: DE60034447T
Authority: DE
Inventors: Joseph Edward San Diego Semple; Michael I. Escondido Weinhouse; Odile Ester San Diego Levy; Edwin L. San Diego Madison
Original assignee: Wilex AG
Current assignee: Heidelberg Pharma AG
Priority date: 2000-08-11
Filing date: 2000-12-07
Publication date: 2008-02-14
Anticipated expiration: 2020-12-08
Also published as: EP1182207B1; EP1182207A3; IL149042A; ATE360028T1; ZA200202825B; US20020037857A1; EP1182207A2; ES2285989T3; KR100879673B1; US6586405B2; EP1808440B1; KR20020063562A; DE60034447D1; ATE517910T1; EP1808440A1

Description

Urokinase ist ein Enzym, das an der Metastasierung von Tumorzellen, Neovaskularisierung und anderen Aktivitäten beteiligt ist. Ein Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, neue Verbindungen bereitzustellen, die als Hemmer der Urokinase wirksam sind, die verwendet werden können, um die Aktivität von Urokinase zu hemmen und dadurch ihre schädlichen Wirkungen abzumildern. Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, neue Verbindungen bereitzustellen, die Blutgefäßbildung, insbesondere Blutgefäßbildung im Zusammenhang mit einem pathologischen Zustand, hemmen.
Urin-Plasminogenaktivator (uPA; Urokinase) ist eine Serinprotease innerhalb der Trypsin/Chymotrypsin-Familie. In ihrem physiologischen Zustand ist uPA in drei Formen vorzufinden: einzelkettige Pro-uPA, zweikettige uPA und niedermolekulargewichtige uPA (ohne N-terminale Domänen). Das Zymogen, Pro-uPA, wird durch Spaltung der Peptidbindung an K158-I159 in uPA umgewandelt. Die resultierende zweikettige uPA ist über Disulfidbrücken verknüpft, besitzt ein M_r von etwa 50 kD und eine C-terminale Serinproteasedomäne.
Die Aktivität von uPA konzentriert sich auf Zelloberflächen bei der Bindung an ihren Rezeptor, uPAR. uPAR ist ein einzelkettiger Glykosyl-phosphatidyl-inositol (GPI)-verankerter Membranrezeptor. Die N-terminalen 92 Aminosäuren von uPAR spielen eine dominierende Rolle bei der Bindung an uPA und Pro-uPA. Der Rezeptor für uPA wurde auf T-Zellen, NK-Zellen, Monozyten und Neutrophilen, sowie vaskulären Endothelzellen, Fibroblasten, glatten Muskelzellen, Kreatinozyten, plazentaren Trophoblasten, Hepatozyten und einer breiten Vielfalt von Tumorzellen lokalisiert.
Nach der Umwandlung von Pro-uPA zu uPA, die vorrangig an dem uPAR auf der Zelloberfläche erfolgt, aktiviert uPA Plasminogen zu Plasmin. Die Aktivierung erfolgt bei der Spaltung an den Resten PGR-VV für humanes Plasminogen oder an den Resten SGR-IV für bovines Plasminogen. Da Plasminogen auch auf der Zelloberfläche vorhanden ist, konzentriert diese Aktivierungskaskade die Aktivität von uPA und Plasmin auf die Plasmamembran. Plasmin besitzt viele Aufgaben, einschließlich der Aktivierung von zusätzlichem uPA und anderen Enzymen, Verdau von Fibrin und Verdau von Bestandteilen der extrazellulären Matrix (ECM). Der Verdau der ECM, welche einen Tumor umgibt, entfernt die ECM als physikalische Barriere für metastasierende Zellen, die dann die Primärtumore verlassen und in sekundäre Stellen eindringen können. Einen Überblick über die Rolle des uPA/uPAR-Systems bei der Krebsmetastasierung findet man in „The Urokinase-type Plasminogen Activator System in Cancer Metastasis: A Review", Andreasen et al., Int. J. Canc. 72:1-22 (1997).
Eine Korrelation zwischen einem hohen uPA-Wert und einer hohen Metastasierungsrate und schlechter Prognose wurde bei bestimmten Tumoren festgestellt, insbesondere bei Brustkrebs [Quax et al., J. Cell Biol. 115:191-199 (1991); Duffy et al., Cancer Res. 50: 6827-6829 (1990)]. Beispielsweise zeigten Tumore der Lunge [Oka et al., Cancer Res. 51:3522-3525 (1991)], Blase [Hasui et al., Int. J. Cancer 50: 871-873 (1992)], Magen [Nekarda et al., Lancet 343:117 (1994)], Gebärmutterhalskrebs [Kobayashi et al., Cancer Res. 54:6539-6548 (1994)], Eierstöcke [Kuhn et al., Gynecol. Oncol. 55:401-409 (1994)], Nieren [Hofmann et al., Cancer 78:487-492 (1996)], Hirn [Bindahl et al., J. Neuro-Oncol. 22:101-110 (1994)] und Weichgewebesarkom [Choong et al., Int. J. Cancer (Pred. Oncol.) 69:268-272 (1996)] einen hohen uPA-Wert und/oder uPA-Aktivität und eine hohe Metastasierungsrate. Es wurde berichtet, dass die Überproduktion von uPA zu einer erhöhten Skelettmetastasierung durch Prostatakrebszellen in vivo führt [Achbarou et al., Cancer Res. 54:2372-2377 (1994)].
Die Hemmung oder Verringerung der uPA-Aktivität oder Unterbrechung/Hemmung der Wechselwirkung zwischen uPA und dessen Rezeptor (uPAR) besitzt, wie gezeigt wurde, eine positive Wirkung auf die Aufrechterhaltung der extrazellulären Matrix und eine hemmende Wirkung auf die Metastasierung [Ossowski und Reich, Cell 35:611-619 (1983); Ossowski, Cell 52:321-328 (1988); Ossowski, J. Cell Biol. 107:2437-2445 (1988); Wilhelm et al., Clin. Exp. Metastasis 13:296-302 (1985); Achbarou et al., Cancer Res. 54:2372-2377 (1994); Crowley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5021-5025 (1993); Kook et al., EMBO J. 13:3983-3991 (1994)]. Die Ergebnisse solcher experimenteller Studien legen nahe, dass die uPA-katalysierte Plasminogenaktivierung die Rate der Tumorprogression, lokalen Tumorinvasion und/oder Bildung von entfernten Metastasen begrenzt [Andreasen et al., Int. J. Canc. 72:1-22 (1997)].
Man nimmt an, dass die Wirkungen des uPA-Systems auf Zellmigration und -invasion auf eine proteolytische Wirkung der Plasmin-vermittelten Zersetzung der extrazellulären Matrix sowie eine direktere Wechselwirkung des uPA-Rezeptors mit Bestandteilen der extrazellulären Matrix zurückzuführen sind. Die Degradation der extrazellulären Matrix erlaubt einer metastasierenden Zelle in die Matrix einzudringen, wohingegen die Wechselwirkung zwischen uPA-Rezeptor und der Matrix selbst eine Zelle bei ihrer Migration unterstützt. Die Lokalisierung des uPA/Plasmin-Systems auf der Zelloberfläche oder der Vorderkante metastasierender Zellen ist mit der postulierten Rolle von uPA bei der Metastasierung im Einklang [Plesner et al., Stem Cells 15:398-408 (1997)].
Die Wechselwirkung von uPAR mit Vitronectin, einem Bestandteil der extrazellulären Matrix, vermittelt Zelladhäsion und kann verstärkt sein, wenn uPAR durch uPA gebunden ist. Zelloberflächenadhäsionsmoleküle, Integrine, scheinen auch an dieser Adhäsionsfunktion beteiligt zu sein, insbesondere Beta-1- und Beta-2-Integrine [Paysant et al., Br. J. Haematol. 100:45-51 (1998); Simon et al., Blood 88:3185-3194 (1996)]. Das CD11b/CD18-lntegrin kann mit dem uPA-uPAR-Komplex assoziieren und die Adhäsion von Zellen, welche diese Rezeptoren tragen, zum Beispiel Neutrophile, Leukozyten, fördern.
Das uPA/uPAR-System ist außerdem an der Bildung eines neuen Gefäßsystems oder Neovaskularisierung beteiligt.
Die Bildung eines neuen Gefäßsystems ist zur Stützung von primärem und metastatischem Tumorwachstum erforderlich. Pathologische Neovaskularisierung ist außerdem ein Kennzeichen von retinaler Erkrankung, Rubeosis Iridis, inflammatorischer Erkrankung, proliferativer Vitreoretinopathie, diabetischer Retinopathie, chronischer Uveitis, Fuchs heterochromer Iridocylitis, neovaskularem Glaukom, Hornhaut- oder Sehnerv-Neovaskularisierung, vaskulärer Erkrankung, Pterygium, unzureichender Ausbildung des Sickerkissens bei Glaukomchirurgie, Hyperkeratose, Cheloid- und Polypenbildung (siehe EP 451,130 ). Unerwünschte Angiogenese kann auch bei den folgenden Zuständen auftreten oder ein Ergebnis der folgenden Aktivitäten sein: Makuladegeneration, prämature Retinopathie, Hornhauttransplantatabstoßung, retrokristalline Fibroplasie, epidemische Keratokonjunktivitis, Vitamin A-Mangel, übermäßiges Tragen von Kontaktlinsen, atopische Keratitis, obere limbische Keratitis, Pterygium keratitis sicca, Sögrens-Erkrankung, Acne rosacea, Phylectenulosa, Syphilis, andere Mycobakterieninfektionen als Lepra, Lipiddegeneration, chemische Verbrennungen, bakterielle oder pilzliche Geschwüre, Herpes simplex oder Zosterinfektionen, Protozoeninfektionen, Kaposi-Sarkom, Mooren-Hornhautulcus, Terrien-Marginatadegeneration, marginale Keratolyse, Trauma, rheumatoide Arthritis, systemischer Lupus, Polyarteritis, Wegener-Sarkoidose, Skleritis, Steven Johnson-Erkrankung, radiäre Keratotomie, Sichelzellanämie, Sarkoid, Pseudoxanthoma elasticum, Paget-Syndrom, Venen- oder Arterienverschluss, karotisches Obstruktionssyndrom, chronische Uveitis, chronische Vitritis, Lyme-Krankheit, Eales-Krankheit, Bechet-Krankheit, Myopie, Grubenpupille, Stargardt-Syndrom, Pars planitis, chronische Netzhautablösung, Hyperviskositätssyndrom, Toxoplasmose, Post-Laser-Komplikationen, krankhafte Proliferation von fibrovaskulärem Gewebe, Hämangiom, Osler-Wever-Rendu, solide Tumore, Bluttumore, AIDS, okuläre neovaskuläre Erkrankung, Osteoarthritis, chronische Entzündung, Crohn-Erkrankung, ulzerative Colitis, Tumore des Rhabdomyosacrom, Tumore des Retinoblastom, Tumore des Ewing-Sarkom, Tumore des Neuroblastom, Tumore des Osteosarkom, Leukämie, Psoriase, Atherosklerose, Pemphigoid, wie in U.S.-Patent Nr. 5,712,291 aufgeführt.
Ein Antagonist der uPA/uPAR-Bindung (EGF-ähnliche Domäne von uPA, kondensiert an Fc von IgG) hemmte angeblich Neovaskularisierung und Wachstum des murinen B16-Melanoms [Min et al., Cancer Res. 56:2428-2433 (1996)]. Konsistent mit diesem Befund ist die beobachtete Korrelation zwischen Mikrogefäßdichte, vaskulärer Invasion und uPA-Werten bei Brustkarzinoms (Hildenbrand et al., Brit. J. Cancer 72: 818-823 (1995)]. Dem bekannten uPA-Hemmer Amilorid wurde außerdem eine Hemmung einer Vielfalt von Neovaskularisierungspathologien zugeschrieben [Glaser et al., EP 451,130 ; Avery et al., Arch. Ophthalmol. 108:1474-1476 (1990)].
Es gibt zwei primäre physiologische Hemmer von uPA, PAI-1 und PAI-2, die Mitglieder der Serpinfamilie von Proteinaseinhibitoren sind. Die Bindung von Serpinen an ihre verwandten Proteasen schließt eine große Zahl von Wechselwirkungen zwischen Aminosäuren jedes Proteins, einschließlich denjenigen in der Serpin-reaktiven Schleife (Ser-Als-Arg-Met-Ala (SEQ ID. NO. 1) für PAI-1, Thr-Gly-Arg-Thr-Gly (SEQ ID. NO. 2) für PAI-2, ein. Es wurde berichtet, dass das Einbringen von exogenem PAI-2 in Versuchstiere die Rate der Lungenmetastasierung hemmt [Evans und Lin, Amer. Surg. 61:692-697 (1995); Mueller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:205-209 (1995)]. Die Fähigkeit von PAI-1, Metastasierung zu hemmen, wurde bisher noch nicht einheitlich gezeigt. Das Gen für PAI-1 und Mittel für seine rekombinante Expression sind in Loskutoff et al., U.S.-Patent Nr. 4,952,512 offenbart. Rekombinantes und natives humanes PAI-2 ist in Stephens et al., U.S.-Patent Nr. 5,422,090 offenbart.
Die am besten untersuchten uPA-Hemmer stammen möglicherweise aus der 4-substituierten Benzo[b]thiophen-2-carboxamidin-Klasse von Inhibitoren, der B428 (4-Iod-benzo[b]thiophen-2-carboxamid) und B623 angehören [Towle et al., Cancer Res. 53:2553-2559 (1993); Bridges et al., Bioorg. Med. Chem. 1:403-410 (1993); Bridges et al., U.S.-Patent Nr. 5,340,833 ]. Die Infusion von 8428 in Versuchsratten, die mit Tumorzellen inokuliert waren, soll uPA-Genexpression hemmen, das Primärtumorvolumen verringern und Metastasierung verringern [Xing et al., Cancer Res. 57:3585-3593 (1997)]. Die tägliche intraperitoneale Behandlung von Mäusen, die Tumore aufweisen, mit B428 oder B623, sollte die Metastasierung in Muskeln und Fett blockieren, sie hemmte aber nicht die Tumor-induzierte Angiogenese und verringerte die Rate der spontanen Lungenmetastasierung nicht. Tatsächlich förderte B623 die Bildung von Lungenmetastasen (Alonso et al., Breast Cancer Res. Treat. 40:209-223 (1996)]. Die Infusion von B428 in einem genidentischen Modell von Rattenprostatakrebs ergab auch eine Verringerung des Primärtumorvolumens und -tumorgewichts und eine Verringerung der Metastasierung [Rabbani et al., Int. J. Cancer 63:840-845 (1995)].
Andere bekannte Inhibitoren von uPA beinhalten p-Aminobenzamidin, welches ein kompetitiver Hemmer von uPA ist und Amilorid. Von beiden Verbindungen wurde gezeigt, dass sie die Tumorgröße in Versuchstieren verringern [Jankun et al., Cancer Res. 57:559-563 (1997); Billstrom et al., Int. J. Cancer 61:542-547 (1995)]. Vor kurzem wurde berichtet, dass Epigallo-cathecin-3-gallat (EGCG), ein in grünem Tee vorkommendes Polyphenol, uPA bindet und dessen Aktivität hemmt [Jankun et al., Nature 387:561 (1997)]. Die Forscher schlossen, dass EGCG ein schwächerer Hemmer von uPA ist als Amilorid, sie vermuteten jedoch, dass EGCG in viel höheren Dosen aufgenommen werden kann als Amilorid, ohne toxische Wirkung. Ein kompetitiver Hemmer von uPA, α-N-Benzylsulfonyl-a-aminophenylalanin, ist von Pye et al. in U.S.-Patent Nr. 4,165,258 offenbart.
Andere Ansätze zur Hemmung des uPA/uPAR-Systems beinhalten die Entwicklung eines bifunktionalen Hybridmoleküls, das aus der uPAR-Bindungsdomäne von uPA und PAI-2 besteht, welche uPA hemmen und uPAR in vitro binden sollen [Ballance et al., Eur. J. Biochem. 207:177-183 (1992)]. Antagonisten von uPA wurden ebenfalls untersucht [Doyle und Rosenberg, U.S.-Patent Nr. 5,656,726 ; Min et al., Cancer Res. 56:2428-2433 (1996)], sie besitzen Antisensoligonukleotidkomplementarität zu uPAR [Wilhelm et al., Clin. Exp. Metast. 13:296-302 (1995); Iversen und Scholar, U.S.-Patent Nr. 5,552,390 ]. Antikörper, die gegen uPAR gerichtet sind und die Bindung von uPA an uPAR hemmen sollen, sind von Dano et al. in U.S.-Patent Nr. 5,519,120 offenbart. Kleine Moleküle, welche Urokinase hemmen sollen, zusammen mit einer Vielfalt anderer Serinproteasen, beinhalten solche, die von Abe et al. in U.S.-Patent Nr. 5,508,385 und U.S.-Patent Nr. 5,153,176 und von Takano et al. in J. Pharmacol. Exp. Therapeut. 271:1027-1033 (1994) offenbart sind.
Es wurden Verbindungen entwickelt, um die Bindung von uPA an uPAR direkt zu hemmen [Crowley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5021-5025 (1993); Goodson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7129-7133 (1994); Kobayashi et al., Brit. J. Cancer 67:537-544 (1993) und Int. J. Cancer 57:727-73f3 (1994) und J. Biol. Chem. 270:8361-8366 (1995); Lu et al., FEBS Lett. 356:56-59 (1994) und FERS Lett. 380:21-24 (1996)].
Außerdem ist Pro-Hepatozytenwachstumsfaktor (HGF), ein Zellmigrations-stimulierendes Protein, ein Substrat von uPA [Naldinie et al., EMBO J. 11:4825-4833 (1992)]. Die direkte Spaltung eines 66 kDa extrazellulären Matrixproteins und von Fibronektin durch uPA wurde ebenfalls berichtet, was eine direktere Rolle von uPA bei der Unterstützung der Zellmigration vermuten lässt [Quigley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 84:2776-2780 (1987)]. Somit kann die Hemmung von uPA diese Aktivitäten ebenfalls beeinflussen.
WO 00/05245 beschreibt Urokinasehemmer. In WO 00/05245 sind keine Gruppen R₇ in der unteren Formel (I) offenbart oder nahegelegt, die ausgewählt sind aus Wasserstoff oder Alkyl.
EP-A-0 601 459 und US-A-5,932,567 beschreiben Proteaseinhibitoren. Sowohl EP-A-0 601 459 als auch US-A-5,932,567 beabsichtigen die Verwendung der beschriebenen Verbindungen zusammen mit thrombolytischen Mitteln wie etwa Urokinase. Daher legen weder EP-A-0 601 459 noch US-A-5,932,567 eine Modifikation der beschriebenen Verbindungen nahe, um Urokinasehemmer zu erhalten.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung ist auf neue peptidische nicht-kovalente Urokinasehemmer gerichtet. Die Verbindungen besitzen einen Argininimitator an P1. Diese Verbindungen besitzen eine Aktivität als wirkungsvolle Urokinasehemmer und sind daher nützlich, um deren schädliche Wirkungen abzumildern. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind wirksam bei der Hemmung der Blutgefäßbildung, insbesondere bei derjenigen im Zusammenhang mit einem pathologischen Vorgang.
Somit ist die vorliegende Erfindung in einem Aspekt auf Verbindungen der Formel (I) gerichtet:
wobei:

(a) X ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -S(O)₂-, -N(R')-S(O)₂-, -(C=O)-, -OC (=O)-, -NH-C(=O)-, -P(O)(R')- und einer direkten Bindung, wobei R' unabhängig Wasserstoff, Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Aryl mit 6 bis 14 Kohlenstoffatomen oder Aralkyl mit 7 bis 16 Kohlenstoffatomen ist, mit der Maßgabe, dass wenn X -P(O) (R')- ist, R' nicht Wasserstoff ist;
(b) R₁ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus (1) Alkyl mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert mit Y₁ und/oder Y₂; (2) Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen substituiert mit Cycloalkyl mit 3 bis 8 Kohlenstoffatomen, das gegebenenfalls mit Y₁, Y₂ und/oder Y₃ mono-, di- oder trisubstituiert ist; (3) Cycloalkyl mit 3 bis 15 Kohlenstoffatomen, das gegebenenfalls mit Y₁, Y₂ und/oder Y₃ am Ring mono-, di- oder trisubstituiert ist; und (4) Heterocycloalkyl mit 4 bis 10 Ringatomen, wobei die Ringatome ausgewählt sind aus Kohlenstoff- und Heteroatomen, wobei die Heteroatome ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Sauerstoff, Stickstoff und S(O)_i, wobei i 0, 1 oder 2 ist, das gegebenenfalls mit Y₁, Y₂ und/oder Y₃ am Ring mono-, di- oder trisubstituiert ist; (5) Heterocyclo mit 4 bis 10 Ringatomen, wobei die Ringatome ausgewählt sind aus Kohlenstoff- und Heteroatomen, wobei die Heteroatome ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Sauerstoff, Stickstoff und S(O)_i, wobei i 0, 1 oder 2 ist, einschließlich
ein 5 bis 7-gliedriger Heterocyclus ist, der 3 bis 6 Ringkohlenstoffatome hat, wobei V -CH₂-, -O-, -S(=O)-, -S(O)₂- or -S- ist, das gegebenenfalls mit Y₁, Y₂ und/oder Y₃ am Ring mono-, di- oder trisubstituiert ist; (6) Alkenyl mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen, das gegebenenfalls mit Cycloalkyl mit 3 bis 8 Kohlenstoffatomen substituiert ist, das gegebenenfalls mit Y₁, Y₂ und/oder Y₃ am Ring mono-, di- oder trisubstituiert ist; (7) Aryl mit 6 bis 14 Kohlenstoffatomen, das gegebenenfalls mit Y₁, Y₂ und/oder Y₃ mono-, di- oder trisubstituiert ist; (8) Heteroaryl mit 5 bis 14 Ringatomen, wobei die Ringatome ausgewählt sind aus Kohlenstoff- und Heteroatomen, wobei die Heteroatome ausgewählt sind aus Sauerstoff, Stickstoff und Schwefel, und das gegebenenfalls mit Y₁, Y₂ und/oder Y₃ mono-, di- oder trisubstituiert ist; (9) Aralkyl mit 7 bis 15 Kohlenstoffatomen, das gegebenenfalls an der Alkylkette mit Hydroxy oder Halogen substituiert ist und das gegebenenfalls mit Y₁, Y₂ und/oder Y₃ mono-, di- oder trisubstituiert ist; (10) Heteroaralkyl mit 5 bis 14 Ringatomen, wobei die Ringatome ausgewählt sind aus Kohlenstoff- und Heteroatomen, wobei die Heteroatome ausgewählt sind aus Sauerstoff, Stickstoff und Schwefel, das gegebenenfalls an der Alkylkette mit Hydroxy oder Halogen substituiert ist und gegebenenfalls mit Y₁, Y₂ und/oder Y₃ am Ring mono-, di- oder trisubstituiert ist; (11) Aralkenyl mit 8 bis 16 Kohlenstoffatomen, das gegebenenfalls mit Y₁, Y₂ und/oder Y₃ am Arylring mono-, di- oder trisubstituiert ist; (12) Heteroaralkenyl mit 5 bis 14 Ringatomen, wobei die Ringatome ausgewählt sind aus Kohlenstoff- und Heteroatomen, wobei die Heteroatome ausgewählt sind aus Sauerstoff, Stickstoff und Schwefel, und das gegebenenfalls mit Y₁, Y₂ und/oder Y₃ an den Ringkohlenstoffen mono-, di- oder trisubstituiert ist; (13)
(14)
(15)
(16)
(17) kondensiertes carbocyclisches Alkyl mit 9 bis 15 Kohlenstoffatomen; (18) Difluormethyl oder Perfuoralkyl mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen; (19) Perfluoraryl mit 6 bis 14 Kohlenstoffatomen; (20) Perfluoraralkyl mit 7 bis 15 Kohlenstoffatomen; und (21) Wasserstoff, wenn X -C(=O)NH-, -S(O)₂-, -S(O)₂NH- oder eine direkte Bindung ist; und wobei Y₁, Y₂ und Y₃ jeweils unabhängig ausgewählt sind und folgendes sind (i) ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Cyano, Nitro, Tetrazolyl, Guanidino, Amidino, Methylguanidino, -CF₃, -CF₂CF₃, -CH(CF₃)₂, -C(OH) (CF₃)₂, -OCF₃, -OCF₂H, -OCF₂CF₃, -OC(O)NH₂, -OC(O)NHZ₁, -OC(O)NZ₁Z₂, -NHC(O)Z₁, -NHC(O)NH₂, -NHC(O)NZ₁, -HC(O)NZ₁Z₂, -C(O)OH, -C(O)OZ₁, -C(O)NH₂, -C(O)NHZ₁, -C(O)NZ₁Z₂, -P(O)₃H₂, -P(O)₃(Z₁)₂, -S(O)₃H, -S(O)_mZ₁, -Z₁, -OZ₁, -OH, -NH₂, -NHZ₁, -NZ₁Z₂, -N-Morpholino und -S(O)_m(CF₂)_qCF₃, wobei m 0, 1 oder 2 ist, q ein ganzzahliger Wert von 9 bis 5 ist und Z₁ und Z₂ unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Alkyl mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, Aryl mit 6 bis 14 Kohlenstoffatomen, Heteroaryl mit 5 bis 14 Ringatomen, Aralkyl mit 7 bis 15 Kohlenstoffatomen und Heteroalkyl mit 5 bis 14 Ringatomen, oder (ii) Y₁ und Y₂ zusammen ausgewählt sind, sodass sie -O[C(Z₃)(Z₄)]_rO- or -O[C(Z₃) (Z₄)]_r+1- sind, wobei r ein ganzzahliger Wert von 1 bis 4 ist und Z₃ und Z₄ unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Alkyl mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, Aryl mit 6 bis 14 Kohlenstoffatomen, Heteroaryl mit 5 bis 14 Ringatomen, Aralkyl mit 7 bis 15 Kohlenstoffatomen und Heteroaralkyl mit 5 bis 14 Ringatomen;
(c) R₂ -CH₂OH, -CH(CH₃)OH ist oder ausgewählt ist, um an P3 eine Gruppe zu ergeben, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Acyl- und Carbonatestern von D-Seryl;
(d) R₃ und R₄ zusammen ausgewählt sind, um an P₂ eine Gruppe zu ergeben, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Prolyl, Pipecolyl, Azetin-2-carbonyl, 4-Hydroxyprolyl, 3-Hydroxyprolyl, 3,4-Methanoprolyl und 3,4-Dehydroprolyl;
(e) R₇ Wasserstoff oder Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen ist;
(f) E ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus

wobei R₈ und R₉ unabhängig ausgewählt sind aus Wasserstoff, Hydroxyl, Halogen, Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und substituiert mit Alkoxy mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Alkoxy mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen und Trifluormethyl; R₁₀ und R₁₁ unabhängig Wasserstoff, Hydroxy, Alkoxy mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, Trihydrocarbylsilyl mit 3 bis 16 Kohlenstoffatomen, Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen oder -C(=O)R₁₂ sind, R₁₁ Wasserstoff oder Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen ist, mit der Maßgabe, dass R₁₀ und R₁₁ nicht beide Hydroxyl oder Alkoxy sind; R₁₂ Wasserstoff, Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Alkoxy mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder (CF₂)_jCF₃ ist, wobei n 0, 1, 2 oder 3 ist; R₁₃ und R₁₄ jeweils unabhängig ausgewählt sind aus Wasserstoff oder Niederalkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen; und t ein ganzzahliger Wert von 0 bis 6 ist; und pharmazeutisch verträgliche Salze davon.

Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können in Teile mit den Bezeichnungen P₁, P₂, P₃ und P₄ unterteilt werden, wie in der folgenden Formel Ia gezeigt ist:
worin X, R₁, R₂, R₃, R₄, R₇ und E wie im Zusammenhang mit Formel (I) definiert sind.
Somit ist der Abschnitt einer Verbindung der Formel (I), der mit P₁ oder P1 bezeichnet wird, die Gruppe
Der Abschnitt einer Verbindung der Formel (I), der als P₂ oder P2 bezeichnet wird, ist die Gruppe
Der Abschnitt einer Verbindung der Formel (I), der als P₃ oder P3 bezeichnet wird, ist die Gruppe
Unter anderen Faktoren beruht die vorliegende Erfindung auf unserer Erkenntnis, dass die neuen Verbindungen unserer Erfindung als Urokinasehemmer wirksam sind. Verbindungen der vorliegenden Erfindung zeigen eine Wirksamkeit bei der Hemmung von Angiogenese.
In einem anderen Aspekt ist die vorliegende Erfindung auf Zusammensetzungen gerichtet, die eine therapeutisch wirksame Menge einer erfindungsgemäßen Verbindung und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfassen.
In noch einem weiteren Aspekt ist die vorliegende Erfindung auf Verwendungen der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen für die Urokinasehemmung gerichtet.
Definitionen
Gemäß der vorliegenden Erfindung und wie hierin verwendet, sind die folgenden Bezeichnungen so definiert, dass sie, wenn nicht anders angegeben, die folgenden Bedeutungen haben:
Der Begriff „Alkenyl" bezieht sich auf ungesättigte aliphatische Gruppen, die wenigstens eine Doppelbindung aufweisen.
Der Begriff „Alkyl" bezieht sich auf gesättigte aliphatische Gruppen, einschließlich geradkettige, verzweigt-kettige und zyklische (einschließlich polyzyklische) Gruppen.
Die Begriffe „Alkoxy" und „Alkoxyl" betreffen eine Gruppe mit der Formel R-O-, worin R eine Alkylgruppe ist.
Der Begriff „Alkoxycarbonyl" bezieht sich auf -C(O)OR, worin R Alkyl ist.
Der Begriff „Aralkenyl" bezieht sich auf eine Alkenylgruppe, die mit einer Arylgruppe substituiert ist. Vorzugsweise weist die Alkenylgruppe von 2 bis etwa 6 Kohlenstoffatome auf.
Der Begriff „Aralkyl" bezieht sich auf eine Alkylgruppe, die mit einer Arylgruppe substituiert ist. Geeignete Aralkylgruppen beinhalten Benzyl, Phenethyl und dergleichen, die jeweils gegebenenfalls substituiert sein können. Bevorzugt hat die Alkylgruppe von 1 bis etwa 6 Kohlenstoffatome.
Der Begriff „Aryl" bezieht sich auf eine aromatische Gruppe, die wenigstens einen Ring mit einem konjugierten Pi-Elektronensystem aufweist und schließt carbozyklische Aryl-, heterozyklische Aryl- und Biarylgruppen ein, die jeweils gegebenenfalls substituiert sein können.
Der Begriff „Aryloxy" bezieht sich auf eine Gruppe mit der Formel R-O-, worin R eine Arylgruppe ist.
Der Begriff „Aralkoxy" bezieht sich auf eine Gruppe mit der Formel R-O-, worin R eine Aralkylgruppe ist.
Der Begriff „Aminosäure" bezieht sich auf sowohl natürliche als auch nicht natürliche Aminosäuren in ihren D- und L-Stereoisomeren, wenn ihre Strukturen solche stereoisomeren Formen erlauben, und deren Analoga. Natürliche Aminosäuren beinhalten Alanin (Ala), Arginin (Arg), Asparagin (Asn), Aspartamsäure (Asp), Cystein (Cys), Glutamin (Gln), Glutaminsäure (Glu), Glycin (Gly), Histidin (His), Isoleucin (Ile), Leucin (Leu), Lysin (Lys), Methionin (Met), Phenylalanin (Phe), Prolin (Pro), Serin (Ser), Threonin (Thr), Tryptophan (Trp), Tyrosin (Tyr) und Valin (Val). Nicht-natürliche Aminosäuren beinhalten, sind aber nicht begrenzt auf, Azetidincarbonsäure, 2-Aminoadipinsäure, 3-Aminoadipinsäure, Beta-aanin, Aminopropionsäure, 2-Aminobuttersäure, 4-Aminobuttersäure, 6-Aminocapronsäure, 2-Aminoheptansäure, 2-Aminoisobuttersäure, 3-Aminoisobuttersäure, 2-Aminopimelinsäure, 2,4-Diaminoisobuttersäure, Demosin, 2,2'-Diaminopimelinsäure, 2,3-Diaminopropionsäure, N-Ethylglycin, N-Ethylasparagin, Hydroxylysin, Allohydroxylysin, 3-Hydroxyprolin, 4-Hydroxyprolin, Isodesmosin, Alloisoleucin, N-Methylglycin, N-Methylisoleucin, N-Methylvalin, Norvalin, Norleucin, Ornithin und Pipecolinsäure. Aminosäureanaloga beinhalten die natürlichen und nicht-natürlichen Aminosäuren, die reversibel oder irreversibel chemisch blockiert oder an ihrer N-terminalen Aminogruppe oder ihren Seitenkettengruppen modifiziert sind, wie beispielsweise Methioninsulfoxid, Methioninsulfon, S-(Carboxymethyl)-cystein, S-(Carboxymethyl)-cysteinsulfoxid und S-(Carboxymethyl)-cysteinsulfon.
Der Begriff „Aminosäureanalogon" bezieht sich auf eine Aminosäure, worin entweder die C-terminale Carbonsäuregruppe, die N-terminale Aminogruppe oder funktionelle Seitenkettengruppen chemisch zu einer anderen funktionellen Gruppe modifiziert wurden. Beispielsweise ist Asparaginsäure-(beta-methylester) ein Aminosäureanalogon von Asparaginsäure; N-Ethylglycin ist ein Aminosäureanalogon von Glycin oder Alanincarboxamid ist ein Aminosäureanalogon von Alanin.
Der Begriff „Aminosäurerest" bezieht sich auf Reste mit der Struktur: (1) -C(O)-R-NH-, worin R typischerweise -CH(R')- ist, worin R' H oder ein Kohlenstoff-haltiger Substituent ist; oder (2)
worin p 1, 2 oder 3 ist, was die Azetidincarbonsäure-, Prolin- bzw. Pipecolinsäurereste bedeutet.
„Biaryl” bezieht sich auf ein Phenyl, das in ortho-, meta- oder para-Position zu der Anbindung des Phenylrings mit einem wie hierin definierten carbozyklischen oder heterozyklischen Aryl substituiert ist.
„Salzwasser" bezieht sich auf eine wässrige gesättigte Lösung von Natriumchlorid.
„Carbozyklisches Aryl" bezieht sich auf aromatische Gruppen, worin die Ringatome des aromatischen Rings Kohlenstoffatome sind. Carbozyklische Arylgruppen beinhalten monozyklische carbozyklische Arylgruppen und Naphthylgruppen, die jeweils gegebenenfalls substituiert sein können. Geeignete carbozyklische Arylgruppen beinhalten Phenyl und Naphthyl. Geeignete substituierte carbozyklische Arylgruppen beinhalten Inden und Phenyl, substituiert mit ein bis zwei Substituenten, bei denen es sich vorzugsweise um Niederalkyl, Hydroxy, Niederalkoxy, Niederalkoxycarbonyl, Halogen, Trifluormethyl, Difluormethyl, Nitro und Cyano handelt. Substituiertes Naphthyl bedeutet Naphthyl, weiter bevorzugt 1- oder 2-Naphthyl, welches mit Y₁, Y₂ und/oder Y₃ substituiert ist, wie im Zusammenhang mit Formel (I) vorstehend definiert wurde.
„Cycloalkenyl" bezieht sich auf eine zyklische Alkenylgruppe. Geeignete Cycloalkenylgruppen beinhalten beispielsweise Cyclopentenyl und Cyclohexenyl.
„Cycloalkyl" bezieht sich auf eine zyklische Alkylgruppe, die wenigstens einen Ring aufweist und polyzyklische Gruppen einschließt, einschließlich kondensierte Ringe zyklischer Alkylgruppen. Geeignete Cycloalkylgruppen beinhalten beispielsweise Cyclohexyl, Cyclopropyl, Cyclopentyl und Cycloheptyl.
„Cyclohexylmethyl" bezieht sich auf eine an CH₂ angebundene Cyclohexylgruppe.
„Kondensierter Carbozyklus" bezieht sich auf einen multizyklischen kondensierten carbozyklischen Ring, der sowohl aromatische als auch nicht-aromatische Ringe aufweist. Geeignete kondensierte carbozyklische Ringe beinhalten Fluorenyl, Tetralin und dergleichen.
„Kondensiertes carbozyklisches Alkyl" bezieht sich auf eine Alkylgruppe, die mit einer kondensierten carbozyklischen Ringgruppe substituiert ist, vorzugsweise ein multizyklischer kondensierter carbozyklischer Ring, der sowohl aromatische als auch nicht-aromatische Ringe einschließt. Geeignete kondensierte carbozyklische Alkylgruppen beinhalten Fluorenylmethyl und dergleichen.
Der Begriff „Halogen" bezieht sich auf Fluor, Chlor, Brom und Iod.
„Heteroaralkenyl" bezieht sich auf eine Alkenylgruppe, die mit einem Heteroalkyl substituiert ist und schließt die heterozyklischen Systeme ein, die in „Handbook of Chemistry and Physics", 49. Ausgabe, 1968, R. C. Weast, Herausgeber; The Chemical Rubber Co., Cleveland, OH, beschrieben sind. Siehe insbesondere Abschnitt C, Rules for Naming Organic Compounds, B. Fundamental Heterocyclic Systems. Vorzugsweise weist die Alkenylgruppe von 2 bis etwa 6 Kohlenstoffatome auf.
„Heteroaralkyl" bezieht sich auf eine Alkylgruppe, die mit einem Heteroaryl, wie etwa Picolyl, substituiert ist und schließt solche heterozyklischen Systeme ein, die in „Handbook of Chemistry and Physics", 49. Ausgabe, 1968, R. C. Weast, Herausgeber; The Chemical Rubber Co., Cleveland, OH, beschrieben sind. Siehe insbesondere Abschnitt C, Rules for Naming Organic Compounds, B. Fundamental Heterocyclic Systems. Vorzugsweise weist die Alkylgruppe von 1 bis etwa 6 Kohlenstoffatome auf.
„Heteroaryl" bezieht sich auf aromatische Gruppen mit von 1 bis 14 Kohlenstoffatomen, wobei die restlichen Ringatome Heteroatome sind und schließt solche heterozyklischen Systeme ein, die in „Handbook of Chemistry and Physics", 49. Ausgabe, 1968, R. C. Weast, Herausgeber; The Chemical Rubber Co., Cleveland, OH, beschrieben sind. Siehe insbesondere Abschnitt C, Rules for Naming Organic Compounds, B. Fundamental Heterocyclic Systems. Geeignete Heteroatome beinhalten Sauerstoff, Stickstoff und S(O)_i, worin i 0, 1 oder 2 ist, und geeignete heterozyklische Aryle beinhalten Furanyl, Thienyl, Pyridyl, Pyrrolyl, Pyrimidyl, Pyrazinyl, Imidazolyl und dergleichen.
„Heterocyclo" bezieht sich auf ein reduziertes heterozyklisches System, das sich aus Kohlenstoff, Stickstoff, Sauerstoff und/oder Schwefelatomen zusammensetzt und schließt diejenigen heterozyklischen Systeme ein, die in „Handbook of Chemistry and Physics", 49. Ausgabe, 1968, R. C. Weast, Herausgeber; The Chemical Rubber Co., Cleveland, OH, beschrieben sind. Siehe insbesondere Abschnitt C, Rules for Naming Organic Compounds, B. Fundamental Heterocyclic Systems.
„Heterocycloalkyl” bezieht sich auf eine Alkylgruppe, die mit einer Heterocyclogruppe substituiert ist und schließt diejenigen heterozyklischen Systeme ein, die in „Handbook of Chemistry and Physics", 49. Ausgabe, 1968, R. C. Weast, Herausgeber; The Chemical Rubber Co., Cleveland, OH, beschrieben sind. Siehe insbesondere Abschnitt C, Rules for Naming Organic Compounds, B. Fundamental Heterocyclic Systems. Bevorzugt weist die Alkylgruppe von etwa 1 bis etwa 6 Kohlenstoffatome auf.
Der Begriff „Nieder-", der hierin im Zusammenhang mit organischen Resten oder Gruppen verwendet wird, definiert solche Reste oder Gruppen mit einer und bis zu einschließlich 5 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise bis zu und einschließlich 4 Kohlenstoffatome und vorteilhafterweise einem oder zwei Kohlenstoffatomen. Solche Reste oder Gruppen können geradkettig oder verzweigt-kettig sein.
„Perfluoralkyl" bezieht sich auf eine Alkylgruppe, bei der jeder Wasserstoff durch Fluor ersetzt ist.
„Perfluoraryl" bezieht sich auf eine Arylgruppe, bei der jeder Wasserstoff durch Fluor ersetzt ist.
„Perfluorarylalkyl" bezieht sich auf eine Aralkylgruppe, bei der jeder Wasserstoff an der Arylgruppe durch Fluor ersetzt ist.
„Pharmazeutisch annehmbares Salz" beinhaltet Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen, die von der Kombination solcher Verbindungen und einer organischen oder anorganischen Säure abgeleitet sind. In der Praxis läuft die Verwendung der Salzform auf die Verwendung der Basenform hinaus. Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind sowohl in freier Basen- als auch Salzform nützlich, wobei beide Formen als vom Rahmen der vorliegenden Erfindung umfasst angesehen werden.
„AcN" oder „MeCN" bezieht sich auf Acetonitril.
„AIBN" bezieht sich auf 2,2'-Azobisisobutyronitril.
„Bn" bezieht sich auf Benzyl.
„Boc" bezieht sich auf t-Butoxycarbonyl.
„Boc₂O” bezieht sich auf Boc-Anhydride (Di-tert-butyl-carbonat).
„BzlSO₂" bezieht sich auf Benzylsulfonyl.
„Cbz" oder „CBz" bezieht sich auf Benzyloxycarbonyl.
„CsCo₃" bezieht sich auf Cäsiumcarbonat.
„DCA" bezieht sich auf Dichloressigsäure.
„DCC" bezieht sich auf N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid.
„DCM" bezieht sich auf Dichlormethan.
„DIEA" bezieht sich auf Diisopropylethylamin.
„DMF" bezieht sich auf N,N-Dimethylformamid.
„DMSO" bezieht sich auf Dimethylsulfoxid.
„DMAP" bezieht sich auf 4-N,N-Dimethylaminopyridin.
„EDC" bezieht sich auf 1-Ethyl-3-(3-dimethylamino-propyl)carbodiimid-Hydrochloridsalz.
„Et₃N" oder „TEA" bezieht sich auf Triethylamin.
„EtOAc" bezieht sich auf Ethylacetat.
„EtOH" bezieht sich auf Ethanol.
„HATU" bezieht sich auf O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat.
„HBTU" bezieht sich auf 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat.
„HCl" bezieht sich auf Chlorwasserstoffsäure.
„HOAc" bezieht sich auf Essigsäure.
„HOAt" oder „HORT" bezieht sich auf 1-Hydroxy-7-azabenzotriazol.
„HOBt" bezieht sich auf 1-Hydroxybenzotriazol-Monohydrat.
„i-BuOCOCl" bezieht sich auf Isobutylchlorformiat.
„HPLC" bezieht sich auf Hochdruckflüssigchromatographie.
„LiAlH₄” bezieht sich auf Lithiumaluminumhydrid.
„LiAlH₂(OEt)₂" bezieht sich auf Lithiumaluminumhydrid-Diethoxid.
„Me" bezieht sich auf Methyl."
"MeOH" bezieht sich auf Methanol.
„NMM" bezieht sich auf N-Methylmorpholin.
„PhB(OH)₂" bezieht sich auf Phenylborsäure.
„Ph₃P" oder „PPh₃" bezieht sich auf Triphenylphospin.
„PyBOP" bezieht sich auf Benzotriazol-1-yl-oxy-tris-pyrrolidin-phosphoniumhexafluorphosphat.
„RP-HPLC" bezieht sich auf Reversphasenhochdruckflüssigchromatographie.
„TFA" bezieht sich auf Trifluoressigsäure.
„THF" bezieht sich auf Tetrahydrofuran.
„DSC" bezieht sich auf Dünnschichtchromatographie.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt ein Reaktionsschema für die Lösungsphasensynthese eines Intermediats, das zur Synthese einer erfindungsgemäßen Verbindung nützlich ist. Verbindung 1-1 ist N-α-Cbz-D-Serin (O-t-butyl), Verbindung 1-2 ist Alaninmethylester-Hydrochloridsalz. In dieser Figur sind „i" bis „iv" definiert als i) EDC, 1-Hydroxybenzotriazol und Acetonitril, Diisopropylethylamin, um Cbz-D-Ser (O-t-butyl)-Ala-OMe zu erhalten; (ii) Ethanol/Essigsäure/Wasser (4:1:1), 10% Pd auf Kohlenstoff, 45 psi H₂ für 2 Stunden, 95 % Ausbeute nach Aufarbeitung; iii) Acetonitril, Benzylsulfonylchlorid, Diisopropylethylamin, 43 % Ausbeute nach Aufarbeitung; und iv) Methanol, 1.0 M Lithiumhydroxid, Ansäuern auf DOWEX-Ionenaustauschharz, Eluieren mit Methanol/Wasser, 95 % Ausbeute nach Aufarbeitung. Siehe auch Beispiele 60 bis 62.
2 zeigt ein Reaktionsschema für eine Lösungsphasensyntheseroute, die verwendet werden kann, um ein Intermediat herzustellen, das bei der Herstellung einer erfindungsgemäßen Verbindung nützlich ist. In dieser Figur sind „i" bis „iii" definiert als: i) Isobutylchlorformiat, Natriumcarbonat, Wasser, 99.5 % Ausbeute nach Aufarbeitung; ii) Alanine-t-butylester-Hydrochloridsalz, EDC, und Hydroxybenzotriazol in Acetonitril; Diisopropylethylamin, quantitative Ausbeute nach Aufarbeitung; und iii) TFA, DCM, quantitative Ausbeute nach Aufarbeitung. Siehe auch Beispiele 74 bis 76.
3 zeigt ein Reaktionsschema für die Synthese von Intermediaten, die zur Herstellung von erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet werden können. In dieser Figur sind „ii" bis „xi" wie folgt definiert: i) CuCN, DMF, Rückfluss (4 Stunden); ii) EtOAc, 10 % wässriges NaCN; iii) N-Bromsuccinimid, 2,2'-Azobisisobutyronitril, CCl₄, Rückfluss (5 Stunden); iv) NaN₃, DMF; v) Triphenylphosphin, THF, Wasser, O C, Rühren (10 Stunden); vi) K₂CO₃, Boc₂O, Wasser, Dioxan; vii) Hydroxylamin HCl, NMM, MeOH; viii) 10 % Pd/C, MeOH, 45 psi H₂ (10 Stunden); ix) 4M HCl in Dioxan; x) CsCO₃, Iodpropan in DMF; und xi) 4M HCl, Dioxan, 3 Stunden, Raumtemperatur.
4 zeigt ein Reaktionsschema für die Synthese von Intermediaten, die zur Herstellung von erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet werden können. In dieser Figur sind „i" bis „iv" wie folgt definiert: i) NaN₃, DMF; ii) 10 % Pd/C, EtOAc, 45 psi H₂ (11 Stunden); iii) Hydroxylamin HCl, NMM, MeOH; und iv) 10 % Pd/C, MeOH, 45 psi H₂ (48 Stunden).
5 zeigt ein Reaktionsschema für die Synthese von Intermediaten, die zur Herstellung von erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet werden können. In dieser Figur sind „i" bis „vii" wie folgt definiert: i) Cu(I)CN, DMF; ii) NBS, Benzoylperoxid, CCl₄, 80 °C (14 Stunden); iii) NaN₃, DMF, Rühren (20 Stunden); iv) Hydroxylamin HCl, NMM, MeOH, Rühren (3 Tage); v) CsCO₃, Iodpropan, DMF, 50 °C (20 Stunden); vi) Triphenylphosphin, THF, Rühren (20 Stunden); und vii) 3M NaOH auf pH 14.
6 zeigt ein Reaktionsschema für die Synthese einer Verbindung der vorliegenden Erfindung, worin R₂ -CH₂OA₁ ist und A₁ ist -C(=O)R₆, wobei als Intermediat die Verbindung aus Beispiel 9 verwendet wird. In dieser Figur ist „i" definiert als: i) Pyridin, R₆COCl.
7 zeigt ein Reaktionsschema für die Synthese bestimmter erfindungsgemäßer Verbindungen. In dieser Figur sind „i" bis „vi" wie folgt definiert: i) Trifluoressigsäureanhydrid, 0 °C, Rühren über Nacht; Eis, CH₂Cl₂, Na₂SO₄; ii) Pd/C (10 %) in MeOH (über Nacht); iii) N-N'-Di-Boc-N''-trifluormethansulfonyl-guanidin, TEA, CH₂Cl₂, 6 Stunden; HCl, Salzwasser, Na₂SO₂; Säulenchromatographie (CH₂Cl₂/MeOH 99:1); iv) Kaliumcarbonat, H₂O/MeOH (2:15), über Nacht; CH₂Cl₂/MeOH (9:1), Na₂SO₄; v) Benzylsulfonyl-D-serin-L-alanin-carboxylat, HATU, HORT, DIEA, Acetonitril, über Nacht; EtOAc, HCl, NaHCO₃, Salzlösung; HPLC (CH₃CN, H₂O, 0.1 % TFA) ; vi) CH₂Cl₂/TFA (1:1), 90 Minuten; HPLC (CH₃CN, H₂O, 0.1 % TFA).
8 zeigt das Reaktionsschema für die Synthese bestimmter erfindungsgemäßer Verbindungen. In dieser Figur sind „i" bis „v" definiert als: i) Trifluoressigsäure-anhydrid, Rühren über Nacht; Eis, CH₂Cl₂, Na₂SO₄; ii) Pd/C (10 %) in MeOH (über Nacht); iii) N-N'-Boc-N''-trifluormethansulfonylguanidin, TEA, CH₂Cl₂, 24 Stunden; HCl, Salzwasser, Na₂SO₄; Säulenchromatographie (CH₂Cl₂/MeOH 98:2); iv) Kaliumcarbonat, H₂O/MeOH (1:1), über Nacht; H₂O, CH₂Cl₂/MeOH (9:1), Na₂SO₄; und v) Benzylsulfonyl-D-serin-L-alanincarboxylat, HATU, HORT, DIEA, in Acetonitril, Raumtemperatur über Nacht; EtOAc, HCl, NaHCO₃, Salzwasser; CH₂Cl₂/TFA (1:1), Raumtemperatur, 2 Stunden, HPLC (CH₃CN, H₂O, 0.1 % TFA).
9 zeigt ein Reaktionsschema für die Synthese einer erfindungsgemäßen Verbindung. In dieser Figur sind „i" bis „vi" wie folgt definiert: i) Trifluoressigsäureanhydrid, 0 °C, eine Stunde; ii) KNO₃, –20 °C, Rühren über Nacht; CH₂Cl₂, Na₂SO₄, Säulenchromatographie; iii) HCl in MeOH, 0 °C, SnCl₂, Rühren 30 Minuten, NaHCO₃, CH₂Cl₂, Na₂SO₄; iv) N₁N'-Di-Boc-N''-trifluormethansulfonyl-guanidin, TEA, CH₂Cl₃, Rühren 24 Stunden; HCl (IM), Salzwasser, Na₂SO₄, Säulenchromatographie; v) K₂CO₃, H₂O/MeOH (1:1), Rühren über Nacht; H₂O, CH₂Cl₂/MeOH (95:5), Na₂SO₄; und vi) Benzylsulfonyl-D-serin-L-alanin carboxylat, HATU, HOAT, DIEA, AcN, Rühren über Nacht; EtOAc, HCl (1M), wässriges NaHCO₃, Salzwasser, Na₂SO₄; HPLC.
Die 10A bis 10F zeigen bestimmte bevorzugte Verbindungen der vorliegenden Erfindung.
11 zeigt ein Reaktionsschema für die Synthese einer erfindungsgemäßen Verbindung. In dieser Figur sind „i" bis „xii" wie folgt definiert: i) CCl₄, N-Bromsuccinimid; N₂, AIBN, Rühren, Flashchromatographie; ii) DMF, NaN₃, Rühren über Nacht, Diethylether, Wasser, Salzwasser, MgSO₄, Filtrieren; (iii) MeOH, TEA, 65 °C, 4 Stunden; EtOAc, H₂O, Salzwasser, MgSO₄; iv) THF/Wasser, Ph₃P, Rühren über Nacht; 1N HCl, H₂O, DCM, ph-9; v) Dioxan/Wasser, K₂CO₃, Boc₂O, Rühren über Nacht; EtOAc, wässriges NaHCO₃, Salzwasser, Na₂SO₄, Flashsäulenchromatographie; vi) DMF, 2-Iodpropan, CsCO₃; EtOAc, wässriges NaHCO₃, Na₂SO₄, Flashsäulenchromatographie; vii) Dioxan, 4N HCl in Dioxan, Lösungsmittelentfernung; viii) AcN, DIEA; Boc-Alanin, EDC, HOBt, Rühren über Nacht; EtOAc, wässriges NaHCO₃, Salzwasser, Na₂SO₄, Flashsäulenchromatographie; ix) Dioxan, 4N HCl in Dioxan, Lösungsmittelentfernung, x) AcN, DIEA, BnSO₂-dSer(tBu)-OH, EDC, HOBt, Rühren über Nacht; EtOAc, wässriges NaHCO₃, Salzwasser, Na₂SO₄, RP-HPLC; xi) DCM, TFA; RP-HPLC; und xii) H₂O, HOAc, Zn-Staub; RP-HPLC.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
1. Bevorzugte Verbindungen
Verbindungen der vorliegenden Erfindung weisen die Formel
auf, worin:

(a) X ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -S(O)₂-, -N(R')-S(O)₂-, -(C=O)-, -OC (=O)-, -NH-C(=O)-, -P(O)(R')- und einer direkten Bindung, wobei R' unabhängig Wasserstoff, Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Aryl mit 6 bis 14 Kohlenstoffatomen oder Aralkyl mit 7 bis 16 Kohlenstoffatomen ist, mit der Maßgabe, dass wenn X -P(O) (R')- ist, R' nicht Wasserstoff ist;
(b) R₁ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus (1) Alkyl mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert mit Y, und/oder Y₂; (2) Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen substituiert mit Cycloalkyl mit 3 bis 8 Kohlenstoffatomen, das gegebenenfalls mit Y₁, Y₂ und/oder Y₃ mono-, di- oder trisubstituiert ist; (3) Cycloalkyl mit 3 bis 15 Kohlenstoffatomen, das gegebenenfalls mit Y₁, Y₂ und/oder Y₃ am Ring mono-, di- oder trisubstituiert ist; und (4) Heterocycloalkyl mit 4 bis 10 Ringatomen, wobei die Ringatome ausgewählt sind aus Kohlenstoff- und Heteroatomen, wobei die Heteroatome ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Sauerstoff, Stickstoff und S(O)_i, wobei i 0, 1 oder 2 ist, das gegebenenfalls mit Y₁, Y₂ und/oder Y₃ am Ring mono-, di- oder trisubstituiert ist; (5) Heterocyclo mit 4 bis 10 Ringatomen, wobei die Ringatome ausgewählt sind aus Kohlenstoff- und Heteroatomen, wobei die Heteroatome ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Sauerstoff, Stickstoff und S(O)_i, wobei i 0, 1 oder 2 ist, einschließlich
ein 5 bis 7-gliedriger Heterocyclus ist, der 3 bis 6 Ringkohlenstoffatome hat, wobei V -CH₂-, -O-, -S(=O)-, -S(O)₂- or -S- ist, das gegebenenfalls mit Y₁, Y₂ und/oder Y₃ am Ring mono-, di- oder trisubstituiert ist; (6) Alkenyl mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen, das gegebenenfalls mit Cycloalkyl mit 3 bis 8 Kohlenstoffatomen substituiert ist, das gegebenenfalls mit Y₁, Y₂ und/oder Y₃ am Ring mono-, di- oder trisubstituiert ist; (7) Aryl mit 6 bis 14 Kohlenstoffatomen, das gegebenenfalls mit Y₁, Y₂ und/oder Y₃ mono-, di- oder trisubstituiert ist; (8) Heteroaryl mit 5 bis 14 Ringatomen, wobei die Ringatome ausgewählt sind aus Kohlenstoff- und Heteroatomen, wobei die Heteroatome ausgewählt sind aus Sauerstoff, Stickstoff und Schwefel, und das gegebenenfalls mit Y₁, Y₂ und/oder Y₃ mono-, di- oder trisubstituiert ist; (9) Aralkyl mit 7 bis 15 Kohlenstoffatomen, das gegebenenfalls an der Alkylkette mit Hydroxy oder Halogen substituiert ist und das gegebenenfalls mit Y₁, Y₂ und/oder Y₃ mono-, di- oder trisubstituiert ist; (10) Heteroaralkyl mit 5 bis 14 Ringatomen, wobei die Ringatome ausgewählt sind aus Kohlenstoff- und Heteroatomen, wobei die Heteroatome ausgewählt sind aus Sauerstoff, Stickstoff und Schwefel, das gegebenenfalls an der Alkylkette mit Hydroxy oder Halogen substituiert ist und gegebenenfalls mit Y₁, Y₂ und/oder Y₃ am Ring mono-, di- oder trisubstituiert ist; (11) Aralkenyl mit 8 bis 16 Kohlenstoffatomen, das gegebenenfalls mit Y₁, Y₂ und/oder Y₃ am Arylring mono-, di- oder trisubstituiert ist; (12) Heteroaralkenyl mit 5 bis 14 Ringatomen, wobei die Ringatome ausgewählt sind aus Kohlenstoff- und Heteroatomen, wobei die Heteroatome ausgewählt sind aus Sauerstoff, Stickstoff und Schwefel, und das gegebenenfalls mit Y₁, Y₂ und/oder Y₃ an den Ringkohlenstoffen mono-, di- oder trisubstituiert ist; (13)
(14)
(15)
(16)
(17) kondensiertes carbocyclisches Alkyl mit 9 bis 15 Kohlenstoffatomen; (18) Difluormethyl oder Perfluoralkyl mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen; (19) Perfluoraryl mit 6 bis 14 Kohlenstoffatomen; (20) Perfluoraralkyl mit 7 bis 15 Kohlenstoffatomen; und (21) Wasserstoff, wenn X -C(=O)NH-, -S(O)₂-, -S(O)₂NH- oder eine direkte Bindung ist; und wobei Y₁, Y₂ und Y₃ jeweils unabhängig ausgewählt sind und folgendes sind (i) ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Cyano, Nitro, Tetrazolyl, Guanidino, Amidino, Methylguanidino, -CF₃, -CF₂CF₃, -CH(CF₃)₂, -C(OH) (CF₃)₂, -OCF₃, -OCF₂H, -OCF₂CF₃, -OC(O)NH₂, -OC(O)NHZ₁, -OC(O)NZ₁Z₂, -NHC(O)Z₁, -NHC(O)NH₂, -NHC(O)NZ₁, -HC(O)NZ₁Z₂, -C(O)OH, -C(O)OZ₁, C(O)NH₂, -C(O)NHZ₁, -C(O)NZ₁Z₂, -P(O)₃H₂, -P(O)₃(Z₁)₂, -S(O)₃H, -S(O)_mZ₁, -Z₁, -OZ₁, -OH, -NH₂, -NHZ₁, -NZ₁Z₂, -N-Morpholino und -S(O)_m(CF₂)_qCF₃, wobei m 0, 1 oder 2 ist, q ein ganzzahliger Wert von 9 bis 5 ist und Z₁ und Z₂ unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Alkyl mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, Aryl mit 6 bis 14 Kohlenstoffatomen, Heteroaryl mit 5 bis 14 Ringatomen, Aralkyl mit 7 bis 15 Kohlenstoffatomen und Heteroalkyl mit 5 bis 14 Ringatomen, oder (ii) Y₁ und Y₂ zusammen ausgewählt sind, sodass sie -O[C(Z₃)(Z₄)]_rO- or -O[C(Z₃) (Z₄)]_r+1- sind, wobei r ein ganzzahliger Wert von 1 bis 4 ist und Z₃ und Z₄ unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Alkyl mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, Aryl mit 6 bis 14 Kohlenstoffatomen, Heteroaryl mit 5 bis 14 Ringatomen, Aralkyl mit 7 bis 15 Kohlenstoffatomen und Heteroaralkyl mit 5 bis 14 Ringatomen;
(c) R₂ -CH₂OH, -CH(CH₃)OH ist oder ausgewählt ist, um an P3 eine Gruppe zu ergeben, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Acyl- und Carbonatestern von D-Seryl;
(d) R₃ und R₄ zusammen ausgewählt sind, um an P₂ eine Gruppe zu ergeben, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Prolyl, Pipecolyl, Azetin-2-carbonyl, 4-Hydroxyprolyl, 3-Hydroxyprolyl, 3,4-Methanoprolyl und 3,4-Dehydroprolyl;
(e) R₇ Wasserstoff oder Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen ist;
(f) E ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus

wobei R₈ und R₉ unabhängig ausgewählt sind aus Wasserstoff, Hydroxyl, Halogen, Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und substituiert mit Alkoxy mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Alkoxy mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen und Trifluormethyl; R₁₀ und R₁₁ unabhängig Wasserstoff, Hydroxy, Alkoxy mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, Trihydrocarbylsilyl mit 3 bis 16 Kohlenstoffatomen, Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen oder -C(=O)R₁₂ sind, R₁₁ Wasserstoff oder Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen ist, mit der Maßgabe, dass R₁₀ und R₁₁ nicht beide Hydroxyl oder Alkoxy sind; R₁₂ Wasserstoff, Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Alkoxy mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder (CF₂)_jCF₃ ist, wobei n 0, 1, 2 oder 3 ist; R₁₃ und R₁₄ jeweils unabhängig ausgewählt sind aus Wasserstoff oder Niederalkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen; und t ein ganzzahliger Wert von 0 bis 6 ist; und pharmazeutisch verträgliche Salze davon.

Bevorzugte X-Gruppen beinhalten -S(O)₂-, -OC(=O)-, -NH-C(=O)- und eine direkte Verknüpfung. Besonders bevorzugt sind -S(O)₂- und -OC(=O)-.
Bevorzugte R₁-Gruppen beinhalten Alkyle, insbesondere Isobutyl, 2-Ethylhexyl, Methyl, n-Butyl, Isopropyl, Cyclohexylmethyl und Cyclohexylpropyl; Cycloalkyl, insbesondere (–) Menthyl, (+)Menthyl und Cyclohexyl; Aryle, insbesondere Naphthyl und Phenyl, Aralkyle, insbesondere Benzyl, 3-Phenylpropyl und 2-Phenylethyl; und kondensierte carbozyklische Alkyle, insbesondere Fluorenylmethyl. Besonders bevorzugte R₁-Gruppen beinhalten Phenyl, Benzyl, 2-Phenylethyl, Isobutyl, n-Butyl und 3-Phenylpropyl.
Bevorzugte Kombinationen von R₁-X- beinhalten Phenyl-S(O)₂-, Benzyl-S(O)₂-, 2- Phenylethyl-S(O)₂-, 3-Phenylpropyl-S(O)_2-, 3-Phenylpropyl-S(O)₂-, n-Butyl-S(O)₂-, Benzyl-OC(=O)- und Isobutyl-OC(=O)-.
R₂-Gruppen sind -CH(R₅)OH, worin R₅ Wasserstoff oder Methyl ist. Die bevorzugte Chiralität am Alpha-Kohlenstoff ist R. Falls chiral, ist die bevorzugte Chiralität am Beta-Kohlenstoff R. Bevorzugte R₂-Gruppen sind solche, welche die P₃-Position als d-Seryl (-CH(R₅)OH mit R₅ gleich H), (R,R)d-Allothreonyl (-CH(R₅)OH mit R₅ Methyl) definieren. Besonders bevorzugte R₂-Gruppen sind solche, die P₃ als d-Seryl (R₅ ist H) oder (R,R)d-Allothreonyl (R₅ ist Methyl) definieren.
Alternative R₂-Gruppen beinhalten -(CH₂)₂OA₁ und -CH(R₅)OA₁, weiter bevorzugt -CH(R₅) OA₁; bevorzugt ist R₅ H. Weiter bevorzugt ist R₂ so ausgewählt, dass P₃ als Acyl oder Carbonatester von d-Seryl definiert ist. Verbindungen, worin R₂ -(CH₂)₂OA₁ oder -CH(R₅) OA₁ ist, können als Wirkstoffvorläufer fungieren.
Ebenfalls hierin beschrieben ist eine R₃-Gruppe, die, wenn R₃ und R₄ nicht gemeinsam gewählt sind, Wasserstoff ist. Ebenfalls beschrieben ist eine R₄-Gruppe, die, wenn R₃ und R₄ nicht gemeinsam gewählt sind, Methyl, Vinyl, Allyl oder Propargyl ist. In den erfindungsgemäßen Verbindungen sind R₃ und R₄ gemeinsam ausgewählt, um Prolyl, 3-Hydroxyprolyl, 4-Hydroxyprolyl, 3,4-Dehydroprolyl, 3,4-Methanprolyl und Azetidin-2-carbonyl zu bilden und definieren eine Gruppe an P2.
Bevorzugte R₇-Gruppen beinhalten Wasserstoff.
Bevorzugte E-Gruppen beinhalten 4-Amidinophenyl, 4-Guanidinophenyl, 3-Amidinopropyl und 5-(2-Amidino-thienyl).
Unter den erfindungsgemäßen Verbindungen beinhalten bevorzugte Verbindungen solche mit einem R₂-Element, welche d-Serin oder d-Allothreonin oder ein Acyl oder Carbonatester davon an der P₃-Position der Verbindung definieren und eine Amidinophenyl-, Guanidinophenyl- oder Amidinothienylgruppe an P1. Besonders bevorzugt sind solche Verbindungen, bei denen außerdem R₃ und R₄ zusammen gewählt sind, so dass P2 Prolyl, Azetidin-2-carbonyl, 3,4-Methanprolyl oder 3,4-Dehydroprolyl ist.
Bevorzugte Verbindungen der vorliegenden Erfindung beinhalten solche, die in den 10A bis 10F abgebildet sind. Besonders bevorzugt sind Verbindungen D, F, I, J, K, L, O, R, T, U, V, AE, AH, AJ, AN und AV in den 10A bis 10F.
Ebenfalls bevorzugt sind die Verbindungen AX (X=S(O)₂, R₁=4-Chlorbenzyl, R₂=-CH₂OH, R₃=H, R₄=CH₃, R₇=H und E=4-Amidinophenyl), AY (X=SO₂, R₁=3-Chlorbenzyl, R₂=-CH₂OH, R₃=H, R₄=CH₃, R₇=H und E=4-Amidinophenyl) und AZ (X=SO₂, R₁=2-Fluorbenzyl, R₂=-CH₂OH, R₃=H, R₄=CH₃, R₇=H und E=4-Amidinophenyl). Die Substitutionen erfolgen im Hinblick auf Formel I.
2. Herstellung bevorzugter Verbindungen
Die 1 bis 5 zeigen Syntheseschemata für die Synthese von Intermediaten, die zur Herstellung bestimmter erfindungsgemäßer Verbindungen verwendet werden können.
1 zeigt die Lösungsphasensynthese von Intermediaten, die zur Herstellung von erfindungsgemäßen Verbindungen nützlich sind. Siehe Beispiele 60 bis 62. Siehe auch Beispiele 95 bis 97.
Die Beispiele 63 bis 66, 67 bis 70 und 71 bis 73 beschreiben Lösungsphasensynthesen von Intermediaten, die zur Synthese von erfindungsgemäßen Verbindungen nützlich sind.
2 zeigt eine alternative Syntheseroute zur Herstellung eines Intermediats, das zur Herstellung von erfindungsgemäßen Verbindungen unter Verwendung der Lösungsphasensynthese nützlich ist. Siehe auch Beispiele 74 bis 76.
6 zeigt ein Reaktionsschema für die Herstellung einer erfindungsgemäßen Verbindung, die ein verestertes Hydroxyl an P3 aufweist.
7 zeigt ein Reaktionsschema für die Herstellung einer erfindungsgemäßen Verbindung, die ein 4-Guanidinophenyl an P1 aufweist.
8 zeigt ein Reaktionsschema für die Herstellung einer erfindungsgemäßen Verbindung, die ein 3-Guanidinophenyl an P1 aufweist.
9 zeigt ein Reaktionsschema für die Herstellung einer erfindungsgemäßen Verbindung, die 2-Guanidinothiophenyl an P1 aufweist.
11 zeigt ein Reaktionsschema für die Herstellung einer erfindungsgemäßen Verbindung, die ein 3-Amidinopyridyl an P1 aufweist.
Bevorzugte Mittel zur chemischen Kopplung (wie beispielsweise Amidbindungsbildung) beinhalten die Bildung einer Peptidbindung unter Verwendung herkömmlicher im Stand der Technik bekannter Kopplungsreagenzien. Siehe Bodanszky, N. Peptide Chemistry, S. 55-73, Springer-Verlag, New York (1988) und darin zitierte Literaturstellen. Die chemische Kopplung kann entweder über eine einstufige oder zweistufige Kopplung erfolgen. Bei der einstufigen Kopplung werden die beiden Kopplungspartner direkt gekoppelt. Bevorzugte Kopplungsreagenzien für die einstufige Kopplung der Kopplungspartner beinhalten DCC mit HOBt, EDC mit HOBt, EDC mit HOAt, HBTU oder TBTU. Bei der zweistufigen Kopplung wird ein aktivierter Ester oder ein aktiviertes Anhydrid der C-terminalen Carbonsäuregruppe des einen Kopplungspartners vor dessen Kopplung an den anderen Kopplungspartner gebildet.
Für die Herstellung bestimmter Verbindungen mit Hydrierungs-empfindlichen Substituentengruppen ist es bevorzugt, die Verwendung von Wasserstoffgas mit Palladium auf Kohlenstoff zu vermeiden. Ein weiteres bevorzugtes Verfahren zur Herstellung von erfindungsgemäßen Verbindungen, die Hydrierungs-empfindliche Gruppen aufweisen, wie etwa Alkenyl- oder Arylgruppen, die mit Halogen, Cyano, Nitro oder -S-Z₁- substituiert sind, besteht darin, Bortris(trifluoracetat), B(OCOCF₃)₃ zu verwenden, um das N⁹-Nitro der Arginingruppe zu spalten. Dieses Reagenz wird hergestellt durch Umsetzung von BBr₃ und CF₃COOH in Dichlormethan bei 0 °C. Das Reagenz ist außerdem kommerziell erhältlich. Im Allgemeinen wird die N⁹-Nitroverbindung mit Bortris(trifluoracetat) in Trifluoressigsäure bei 0 °C behandelt. Siehe z.B. Fieser, M. und Fieser, L. F., Reagents for Organic Synthesis, S. 46, John Wiley & Sons, New York (1974); Pless, J., und Bauer, W. Angew. Chem., Internat. Ausg., 12, 147 (1973).
Außerdem ist ein weiteres bevorzugtes Reagenz für die selektive Nitrogruppenspaltung Titantrichlorid. Dieses Reagenz ist kommerziell erhältlich. Die N⁹-Nitroverbindung wird mit Titantrichlorid in wässrigem Methanol, welches einen Ammoniumacetatpuffer enthält, behandelt und anschließend wird das Reaktionsgemisch Luft oder Dimethylsulfoxid ausgesetzt. Siehe z.B. Freidinger, R. M., Hirschmann, R. und Veber, D. F., J. Org. Chem., 43, 4800 (1978).
6 zeigt ein Reaktionsschema für die Synthese einer erfindungsgemäßen Verbindung, worin R₂ -CH₂OA₁ ist und A₁ -C(=O)R₆ ist:
Ein Intermediat, wie etwa 6-1 (die Verbindung aus Beispiel 9), wird mit einem Säurechlorid R₆COCl in Gegenwart einer Base wie etwa Pyridin umgesetzt. Verbindungen, bei denen R₂ -(CH₂)₂OA₁ oder -CH(R₅)OA₁ ist, worin A₁ -C(=O)R₆ ist, können günstig hergestellt werden durch Umsetzung eines entsprechenden Intermediats, welches 6-1 entspricht, mit dem entsprechenden Säurechloridderivat R₆COCl, vorzugsweise in Gegenwart einer Base wie etwa Pyridin.
Verbindungen, bei denen R₂ -(CH₂)₂OA₁ oder -CH(R₅)OA₁ ist, worin A₁ -C(=O)R₆ ist, können günstig hergestellt werden, indem eine entsprechende Verbindung mit R₂ -(CH₂)₂OH oder -CH(R₅)OH mit dem zugehörigen Chlorformiatderivat umgesetzt wird. Bei der Herstellung von Verbindungen, die eine Amidino- oder Guadinogruppe an P₁ aufweisen, kann es bevorzugt sein, das P3-Hydroxyl vor dem Entschützen der Amidino- oder Guanidinogruppe mit der Carbonatgruppe zu bedecken. Dementsprechend ist es bevorzugt, das entsprechende Intermediat mit dem Chlorformiatderivat zu behandeln (siehe z.B. Beispiel 8). Das Produkt wird dann hydriert und gegebenenfalls unter Hydrolysebedingungen behandelt, um das Produkt zu erhalten (siehe z.B. Beispiele 16, 21, 28, 35 und 40).
3. Auswahl bevorzugter Verbindungen
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung werden bevorzugte erfindungsgemäße Verbindungen aufgrund ihrer Wirksamkeit und Selektivität bei der Hemmung von Serinproteasen, insbesondere Urokinase, gewählt. Solche Bewertungen werden routinemäßig in vitro durchgeführt, nach Verfahren wie denjenigen, die in Beispiel 1 dargestellt sind. Wie hierin beschrieben und allgemein bekannt ist, werden eine Zielserinprotease und ihr Substrat unter Assaybedingungen, die eine Reaktion der Protease mit ihrem Substrat erlauben, kombiniert. Der Assay wird in Abwesenheit der Testverbindung und in Anwesenheit zunehmender Konzentrationen der Testverbindung durchgeführt. Die Konzentration der Testverbindung, bei der 50 % der Serinproteaseaktivität von der Testverbindung gehemmt wird, ist der IC₅₀ (inhibitorische Konzentration)-Wert oder EC₅₀ (effektive Konzentration)-Wert für diese Verbindung. Innerhalb einer Reihe oder Gruppe von Testverbindungen werden diejenige mit niedrigeren IC₅₀- oder EC₅₀-Werten als wirkungsvollere Hemmer der Serinprotease angesehen im Vergleich zu solchen Verbindungen mit höheren IC₅₀- oder EC₅₀-Werten. Die IC₅₀-Messung wird häufig für einfachere Assays verwendet, während EC₅₀ häufig für kompliziertere Assays verwendet wird, wie etwa solche, bei denen Zellen eingesetzt werden. K_i wird aus den IC₅₀-Werten berechnet.
Bevorzugte Verbindungen besitzen gemäß diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung einen K_i-Wert von 100 nM oder weniger, bei Messung in einem In vitro-Assay zur Hemmung der Urokinaseaktivität. Besonders bevorzugte Verbindungen besitzen einen K_i-Wert von weniger als 30 nM.
Die Testverbindungen werden auch auf ihre Selektivität gegenüber einer Serinprotease bewertet. Wie in den Beispielen beschrieben und allgemein bekannt ist, wird eine Testverbindung auf ihre Wirksamkeit gegenüber einer Reihe von Serinproteasen und anderen Enzymen untersucht und ein EC₅₀-Wert oder EC₅₀-Wert wird für jede Testverbindung in jedem Assaysystem bestimmt. Eine Verbindung, die einen niedrigen EC₅₀-Wert oder EC₅₀-Wert oder entsprechenden niedrigen K_i-Wert für das Zielenzym, zum Beispiel Urokinase, und einen höheren EC₅₀-Wert oder EC₅₀-Wert für andere Enzyme in dem Testfeld zeigt (z.B. Gewebeplasminogenaktivator, Thrombin, Faktor Xa) wird als selektiv gegenüber dem Zielenzym angesehen. Im Allgemeinen wird eine Verbindung als selektiv angesehen, wenn ihr IC₅₀-Wert oder EC₅₀-Wert (oder K_i-Wert) in dem Zielenzymassay wenigstens um eine Größenordnung geringer ist als der nächstkleinere IC₅₀-Wert oder EC₅₀-Wert, der für die Selektivitätsgruppe von Enzymen gemessen wird.
Bevorzugte erfindungsgemäße Verbindungen besitzen einen K_i-Wert von 100 nM oder weniger, gemäß Messung in einem In vitro-Assay zur Hemmung der Urokinaseaktivität. Besonders bevorzugte Verbindungen besitzen einen K_i-Wert in dem In vitro- Urokinaseinhibitorassay, der um wenigstens eine Größenordnung kleiner ist, als der in dem In vitro-tPA-Inhibitionsassay gemessene IC₅₀-Wert. Verbindungen mit einem Selektivitätsverhältnis von IC₅₀-tPA-Assay:K_i-Urokinaseassay von mehr als 100 sind besonders bevorzugt.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen wurden auch nach ihrer In vivo-Aktivität bewertet. Die Art des Assays, der für die Bewertung der Testverbindungen gewählt wird, hängt von dem pathologischen Zustand, der mit der Verbindung behandelt oder verhindert werden soll sowie von dem Verabreichungsweg für die Testverbindung, der bewertet werden soll, ab.
Um beispielsweise die Aktivität einer erfindungsgemäßen Verbindung zur Verringerung des Tumorwachstums durch Hemmung von Urokinase zu bewerten, können beispielsweise die von Jankun et al. [Canc. Res. 57:559-563, 1997] beschriebenen Vorgehensweisen verwendet werden, um PAI-1 zu bewerten. Kurz zusammengefasst werden die ATCC-Zelllinien DU145, die eine große Menge uPA exprimiert, und LnCaP, die kein uPA exprimiert, in SCID-Mäuse injiziert. Nachdem sich Tumore gebildet haben, wird den Mäusen die Testverbindung nach einem Dosisplan, der aus den In vitro-Eigenschaften der Verbindung erstellt wurde, verabreicht. Die Jankun et al.-Verbindung wurde in Wasser verabreicht. Messungen des Tumorvolumens werden zweimal wöchentlich für etwa fünf Wochen vorgenommen. Eine Verbindung wird als aktiv angesehen, wenn ein Tier, dem die Verbindung verabreicht wurde, ein verringertes Tumorwachstum zeigte, im Vergleich zu Tieren, die entsprechende Kontrollverbindungen erhielten. Außerdem kann ein Vergleich der Wirkung einer Verbindung in Tieren, denen DU145-Zellen injiziert wurden, mit LnCaP-Zellen zeigen, ob die Wirkung der Verbindung auf eine Hemmung der Urokinase oder auf andere Ursachen zurückzuführen war.
Ein weiteres experimentelles In vivo-Modell, das dazu konzipiert ist, die Wirkung von p-Aminobenzamidin, einer angeblichen Urokinase-hemmenden Verbindung, auf die Verringerung des Tumorvolumens zu bewerten, ist von Billström et al. beschrieben worden [Int. J. Cancer 61:542-547, 1995].
Um die Fähigkeit einer erfindungsgemäßen Verbindung zur Verringerung des Auftretens oder zur Hemmung von Metastasierung zu bewerten, können die von Kobayashi et al. [Int. J. Canc. 57:727-733d, 1994] beschriebenen Vorgehensweisen verwendet werden.
Kurz zusammengefasst wird ein aufgrund des hohen Lungenkolonisierungspotenzials ausgewähltes murines Heterotransplantat in C57B1/6-Mäuse i.v. (experimentelle Metastasierung) oder s.c. in die Bauchdecke (spontane Metastasierung) injiziert. Unterschiedliche Konzentrationen der zu untersuchenden Testverbindung können vor der Injektion mit den Tumorzellen in Matrigel vermischt werden. Tägliche i.p. Injektionen der Testverbindung werden entweder an den Tagen 1-6 oder den Tagen 7-13 nach der Tumorinokulation durchgeführt. Die Tiere werden etwa drei oder vier Wochen nach der Tumorinokulation getötet und die Lungentumorkolonien werden gezählt. Die Bewertung der resultierenden Daten erlaubt eine Bestimmung der Effizienz der Testverbindung, der optimalen Dosierung und Verabreichungsweise.
Die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen gegenüber einer Verringerung des Tumorvolumens und Metastasierung kann durch das von Rabbani et al. [Int. J. Cancer 63:840-845, 1995] zur Bewertung ihres Inhibitors beschriebene Modell bewertet werden. Dort wurden Mat LyLu-Tumorzellen, die uPA überexprimieren, in die Flanke von Kopenhagen-Ratten injiziert. Den Tieren wurden osmotische Minipumpen implantiert, um verschiedene Dosierungen der Testverbindung für bis zu drei Wochen kontinuierlich zu verabreichen. Tumormasse und -volumen der Versuchstiere und der Kontrolltiere wurden während des Experiments bewertet, ebenso wie das Metastasenwachstum. Die Bewertung der resultierenden Daten erlaubt eine Bestimmung hinsichtlich der Wirksamkeit, optimalen Dosierung und Verabreichungsweise der Testverbindung. Einige dieser Autoren beschrieben ein verwandtes Protokoll in Xing et al. [Canc. Res. 57:3585-3593, 1997].
Um die hemmende Wirkung einer erfindungsgemäßen Verbindung gegenüber Neovaskularisierung zu bewerten, kann ein Kaninchenhornhaut-Neovaskularisierungsmodell verwendet werden. Avery et al. [Arch. Ophthalmol. 108:1474-1475, 1990] beschreiben die Anästhesierung von New Zealand-Albinokaninchen und die anschließende Durchführung eines Einschnittes in die mittlere Hornhaut und die Bildung einer radiären Hornhauttasche. Ein langsam Prostaglandin-freisetzendes Pellet wurde in die Tasche eingesetzt, um Neovaskularisierung hervorzurufen. Die Testverbindung wurde i.p. für fünf Tage verabreicht und nach diesem Zeitraum wurden die Tiere getötet. Die Wirkung der Testverbindung wird durch Betrachtung von regelmäßig aufgenommenen Photographien des Limbus bewertet, die verwendet werden können, um den Bereich der neovaskulären Antwort und daher die limbale Neovaskularisierung zu berechnen. Ein im Vergleich zu der entsprechenden Kontrolle verringerter Bereich der Neovaskularisierung zeigt, dass die Testverbindung Neovaskularisierung wirkungsvoll verringerte oder hemmte.
Ein zur Bewertung der Wirkung einer Testverbindung bei der Vorbeugung von Angiogenese verwendetes Angiogenesemodell wurde von Min et al. [Canc. Res. 56:2428-2433, 1996] beschrieben. C57BL6-Mäuse erhalten subkutane Injektionen eines Matrigel-Gemischs, welches bFGF als Angiogenese-injizierendes Mittel mit und ohne Testverbindung enthält. Nach fünf Tagen werden die Tiere getötet und die Matrigel-Propfen, in denen eine Neovaskularisierung erkennbar ist, werden photographiert. Ein Versuchstier, das Matrigel und eine wirksame Dosis der Testverbindung erhält, zeigt eine geringere Vaskularisierung als ein Kontrolltier oder ein Versuchstier, das eine weniger oder nicht wirksame Dosis der Verbindung erhält.
Ein In vivo-System, das dazu konzipiert ist, Verbindungen auf ihre Fähigkeit zur Begrenzung der Ausbreitung von Primärtumoren zu untersuchen, wurde von Crowley et al. beschrieben [Proc. Natl. Acad. Sci. 90:5021-5025, 1993]. Nackten Mäusen werden Tumorzellen (PC3) injiziert, die zur Expression von CAT (Chloramphenicolacetyltransferase) konzipiert sind. Die Zellen sekretieren große Mengen an uPA und zeigen Sättigungsmengen an uPA-Aktivität, die an uPAR auf der Zelloberfläche gebunden sind. Verbindungen, die auf ihre Fähigkeit zur Verringerung der Tumorgröße und/oder Metastasierung hin untersucht werden sollen, werden den Tieren verabreicht und anschließend erfolgen Messungen der Tumorgröße und/oder des Metastasenwachstums. Außerdem bietet die Menge des in verschiedenen Organen nachgewiesenen CAT einen Hinweis auf die Fähigkeit der Testverbindung, Metastasierung zu hemmen; der Nachweis von weniger CAT in Geweben eines behandelten Tiers im Vergleich zu einem Kontrolltier zeigt, dass weniger CAT-exprimierende Zellen in dieses Gewebe eingewandert sind.
Experimentelle In vivo-Modelle, die für die Bewertung des Urokinase-hemmenden Potentials einer Testverbindung konzipiert sind, unter Verwendung einer Tumorzelllinie F3II, die als hoch-invasiv gilt, wurden von Alonso et al. beschrieben [Breast Canc. Res. Treat. 40:209-223, 1996]. Diese Gruppe beschreibt In vivo-Studien zur Toxizitätsbestimmung, Tumorwachstum, Invasivität, spontanen Metastasierung, experimentelle Lungenmetastasierung und einen Angiogeneseassay.
Das erstmals von L. Ossowski 1998 beschriebene CAM-Modell (chick embryo chorioallantoic membrane model, Kükenembryo-Chorioallantoidmembranmodell) [J. Cell Biol. 107:2437-2445, 1988] bildet ein weiteres Verfahren zur Bewertung der Urokinasehemmenden Aktivität einer Testverbindung. In dem CAM-Modell ist die Invasion von Tumorzellen durch die Chorioallantoidmembran abhängig von dem Vorhandensein von katalytisch aktivem uPA. Das Inkontaktbringen von CAM mit Tumorzellen in Gegenwart eines Urokinase-hemmenden Mittels führt zu einer verringerten oder keiner Invasion der Tumorzellen durch die Membran. Daher wird der CAM-Assay mit CAM und Tumorzellen in Gegenwart und Abwesenheit verschiedener Konzentrationen der Testverbindung durchgeführt. Die Invasivität von Tumorzellen wird unter solchen Bedingungen gemessen, die einen Hinweis auf die Urokinase-hemmende Wirkung der Verbindung bieten. Eine Verbindung, die Urokinase-hemmende Aktivität besitzt, ist mit einer geringeren Tumorinvasion verbunden.
Das CAM-Modell wird auch in einem Standardassay zur Angiogenese verwendet (d.h. Wirkung auf die Bildung neuer Blutgefäße (Brooks, P. C.; Montgomery, A. M. P.; und Cheresh, D. A., Methods in Molecular Biology 129: 257-269 (1999)). Gemäß diesem Modell wird eine Filterscheibe, die ein Angiogenese induzierendes Mittel enthält, wie etwa basischen Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF). auf die CAM platziert. Die Diffusion des Zytokins in die CAM induziert lokale Angiogenese, die auf verschiedene Weise, wie etwa durch Zählen der Anzahl von Blutgefäßverzweigungspunkten innerhalb der CAM direkt unterhalb der Filterscheibe, gemessen werden kann. Die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen, Zytokin-induzierte Angiogenese zu hemmen, kann unter Verwendung dieses Modells untersucht werden. Eine Testverbindung kann entweder zu der Filterscheibe, welche das Angiogenese-induzierende Mittel enthält, zugegeben werden, direkt auf die Membran gegeben werden oder systemisch verabreicht werden. Das Ausmaß der Bildung neuer Blutgefäße in Gegenwart und/oder Abwesenheit der Testverbindung kann unter Verwendung dieses Modells verglichen werden. Die Bildung von weniger neuen Blutgefäßen in Gegenwart einer Testverbindung wäre ein Anzeichen für eine antiangiogene Wirkung. Da bestimmte der erfindungsgemäßen Verbindungen als Urokinasehemmer wirksam sind, lässt eine antiangiogene Wirkung solcher Verbindungen vermuten, dass Urokinase eine signifikante Rolle bei der Angiogenese spielt.
4. Pharmazeutische Zusammensetzungen
In einem weiteren Aspekt umfasst die vorliegende Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen, die für die Lagerung oder Verabreichung präpariert sind, die eine therapeutisch wirksame Menge einer erfindungsgemäßen Verbindung in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger umfassen.
Die therapeutisch wirksame Menge einer erfindungsgemäßen Verbindung ist abhängig von dem Verabreichungsweg, der Art des behandelten Säugers und den physikalischen Eigenschaften des speziellen Säugers, der betrachtet wird. Diese Faktoren und ihre Beziehung zu der Bestimmung dieser Menge sind dem Fachmann im Bereich der Medizin bekannt. Diese Menge und das Verfahren zur Verabreichung können maßgeschneidert werden, um eine optimale Effizienz zu erreichen, es besteht aber eine Abhängigkeit von Faktoren wie etwa Gewicht, Ernährung, gleichzeitiger Medikation und anderen Faktoren, die der Fachmann im Bereich der Medizin erkennen wird.
Die therapeutisch wirksame Menge der erfindungsgemäßen Verbindung kann über breite Bereiche variieren, abhängig von den gewünschten Effekten und der therapeutischen Indikation. Typischerweise liegen Dosierungen zwischen etwa 0,01 und 10 mg/kg Körpergewicht.
Pharmazeutisch annehmbare Träger für die therapeutische Verwendung sind im Bereich der Pharmazie gut bekannt und beispielsweise in Remingtons Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro, Herausgeber 1985) beschrieben. Zum Beispiel können sterile Saline und Phosphat-gepufferte Saline bei physiologischem pH verwendet werden. Konservierungsmittel, Stabilisatoren, Farbstoffe und sogar Geschmacksstoffe können in der pharmazeutischen Zusammensetzung bereitgestellt werden. Beispielsweise können Natriumbenzoat, Sorbinsäure und Ester von p-Hydroxybenzoesäure als Konservierungsmittel hinzugefügt werden. s.o. bei 1449. Außerdem können Antioxidanzien und Suspendiermittel verwendet werden. s.o.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können als Tabletten, Kapseln oder Elixiere für die orale Verabreichung; Zäpfchen für die rektale Verabreichung; sterile Lösungen und Suspensionen für die Verabreichung durch Injektion und dergleichen formuliert und verwendet werden. Die Dosis und das Verfahren zur Verabreichung können maßgeschneidert werden, um eine optimale Wirksamkeit zu erreichen, sie hängen aber ab von Faktoren wie dem Gewicht, Ernährung, gleichzeitiger Medikation und anderen Faktoren, die der Fachmann im Bereich der Medizin erkennen wird.
Wenn eine parenterale Verabreichung beabsichtigt ist, wie etwa täglich intravenös, so können injizierbare pharmazeutische Zusammensetzungen in herkömmlichen Formen, entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen, feste Formen, die zur Auflösung oder Suspension in Flüssigkeit vor der Injektion geeignet sind oder als Emulsionen hergestellt werden. Geeignete Hilfsstoffe sind beispielsweise Wasser, Saline, Dextrose, Mannitol, Lactose, Lecithin, Albumin, Natriumglutamat oder dergleichen. Außerdem können die injizierbaren pharmazeutischen Zusammensetzungen, falls gewünscht, kleinere Mengen nicht-toxischer Hilfssubstanzen, wie etwa Benetzungsmittel, pH-Puffermittel und dergleichen, enthalten. Falls gewünscht, können Absorptions-fördernde Präparationen (z.B. Liposome) eingesetzt werden.
5. Verwendbarkeit
Die erfindungsgemäßen Verbindungen, die Urokinase-hemmende Wirkung und/oder eine Wirkung zur Verringerung oder Hemmung der Blutgefäßbildung einschließlich Angiogenese und Neovaskularisierung besitzen, können sowohl in vitro als auch in vivo für zahlreiche Anwendungen verwendet werden, von denen einige nachstehend beschrieben werden.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind als Urokinasehemmer wirksam und binden insbesondere Urokinase. Dementsprechend können solche Verbindungen, welche Stellen, die für die Anbindung an einen festen/Gel-förmigen Träger geeignet sind, in vitro für die Affinitätschromatographie zur Aufreinigung von Urokinase aus einer Probe verwendet werden, oder um Urokinase aus einer Probe unter Verwendung herkömmlicher Affinitätschromatographieverfahren zu entfernen. Diese Verbindungen werden bei einer Affinitätschromatographie entweder direkt oder durch einen geeigneten Linkerträger unter Verwendung herkömmlicher Verfahren angebunden oder gekoppelt. Siehe z.B. Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons (J. E. Coligan et al., Herausgeber, 1997) und Protein Purification Protocols, Humana Press (S. Doonan, Herausgeber, 1966) und die dortigen Literaturstellen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen mit Urokinase-hemmender Wirkung sind in In vitro-Assays zur Messung der tPA-Aktivität in einer Probe nützlich. In Assays, welche die Gesamtaktivität der Plasminogenaktivierung in einer Blutprobe messen, schaltet eine erfindungsgemäße Verbindung mit Urokinase-hemmender Wirkung den Anteil der Plasminogenaktivierung, der uPA zuzuschreiben ist aus, so dass es möglich ist, den auf tPA-Aktivität zurückzuführenden Anteil der gesamten Plasminogenaktivierung und den Anteil aufgrund der uPA-Aktivität zu berechnen. Die Verwendung solcher Assays zur Anzeige der tPA-Aktivität ermöglicht eine bessere Dosierungskontrolle bei Patienten, welche tPA erhalten. Diese Assays könnten verwendet werden, um die uPA-Aktivitätswerte in Gewebeproben anzuzeigen, wie etwa bei einer Biopsie, oder um uPA/tPA-Aktivitäten in einer beliebigen klinischen Situtation anzuzeigen, in der die Messung der Plasminogenaktivierungsaktivität hilfreich ist. Diese Assays können außerdem verwendet werden, um die Plasminogen-aktivierende Wirkung anzuzeigen, wenn ein Patient mit einer nicht endogenen Verbindung behandelt wurde, die eine Plasminogen-aktivierende Wirkung besitzt, wie etwa Streptokinase und Staphlyokinase.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind nützlich für die In vivo-Behandlung pathologischer Zustände, die durch eine verringerte Urokinaseaktivität verbessert werden. Beispielsweise hemmen diese Verbindungen die Aktivierung von Metalloproteasen durch die uPA-Plasminkaskade in Synovialflüssigkeit und sie können somit zur Behandlung von Arthritis verwendet werden.
Man nimmt an, dass diese Verbindungen nützlich sind zur Verringerung oder Hemmung der Metastasierung, Neovaskularisierung und Degradation der extrazellulären Matrix bei Tumoren und anderen Neoplasmen. Diese Verbindungen sind als therapeutische Mittel zur Behandlung von Zuständen, die sich durch pathologische Neovaskularisierung auszeichnen, nützlich, wie etwa bei Netzhauterkrankung, Retinopathien und anderen Zuständen, einschließlich solchen, die hierin vorstehend unter Hintergrund und Einführung der Erfindung beschrieben sind.
Eine weitere Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen mit Urokinasehemmender Wirkung ist als Gegenmittel, wenn einem Patienten zu viel exogene Urokinase verabreicht wurde, beispielsweise zum Zweck der Auflösung eines Blutgerinnsels.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können bei der Behandlung von Zuständen, die durch Entzündung gekennzeichnet sind, verwendet werden, aufgrund ihrer antiinflammatorischen Wirkung durch die Hemmung von Urokinase, wobei sie Mediatoren der Zelladhäsion oder -migration stören. Solche antiinflammatorischen Anwendungen beinhalten die Behandlung von Schlaganfall und Komplikationen bei Organtransplantationen.
Die vorliegende Erfindung beinhaltet Verfahren zur Verhinderung oder Behandlung eines Zustandes bei einem Säuger, der unter Verdacht steht, eine Störung aufzuweisen, die durch Hemmung der Urokinaseaktivität abgemildert werden kann, umfassend die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer erfindungsgemäßen Verbindung oder pharmazeutischen Zusammensetzung an den Säuger.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen oder pharmazeutischen Zusammensetzungen werden in vivo, üblicherweise einem Säuger, vorzugsweise einem Menschen, verabreicht. Bei der Verwendung in vivo können die Verbindungen oder pharmazeutischen Zusammensetzungen einem Säuger auf eine Vielfalt von Wegen verabreicht werden, einschließlich oral, parenteral, intravenös, subkutan, intramuskulär, über den Darm, rektal, nasal oder intraperetoneal, unter Verwendung einer Vielfalt von Dosierungsformen. Die Verabreichung erfolgt vorzugsweise oral, wie etwa durch Tabletten, Kapseln oder Elixiere, die täglich eingenommen werden.
Bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren werden die erfindungsgemäßen Verbindungen oder pharmazeutischen Zusammensetzungen alleine oder in Kombination miteinander oder in Kombination mit anderen therapeutischen oder in vivo-diagnostischen Mitteln verabreicht.
Wie für einen Fachmann im Bereich der Medizin offensichtlich ist, variiert eine „therapeutisch wirksame Menge" der erfindungsgemäßen Verbindungen oder pharmazeutischen Zusammensetzungen abhängig von dem Alter, Gewicht und der Säugerspezies, die behandelt wird, den bestimmten verwendeten Verbindungen, der bestimmten Verabreichungsweise und den gewünschten Effekten und der therapeutischen Indikation. Da diese Faktoren und ihr Zusammenhang zu der Bestimmung dieser Menge im Bereich der Medizin bekannt sind, liegt diese Bestimmung therapeutisch wirksamer Dosierungsmengen, der erforderlichen Menge, um das gewünschte Ergebnis der Hemmung der uPA-Aktivität zu bestimmen, im Bereich der Kenntnis eines Fachmannes auf diesem Gebiet. Typischerweise beginnt die Verabreichung der erfindungsgemäßen Verbindungen oder pharmazeutischen Zusammensetzung bei niedrigeren Dosierungsmengen, wobei die Dosierungsmengen solange erhöht werden, bis der gewünschte Effekt der Hemmung der uPA-Aktivität in dem gewünschten Ausmaß erzielt wird, was einer therapeutisch wirksamen Menge entspricht. Für die erfindungsgemäßen Verbindungen, allein oder als Teil einer pharmazeutischen Zusammensetzung, liegen solche Dosierungen zwischen etwa 0,01 mg/kg und 100 mg/kg Körpergewicht, vorzugsweise zwischen etwa 0,01 mg/kg und 10 mg/kg Körpergewicht.
Zum besseren Verständnis wird die vorliegende Erfindung nun durch die folgenden Beispiele weiter veranschaulicht. Diese Beispiele, die sich auf diese Erfindung beziehen, sollten selbstverständlich nicht als besondere Einschränkung der Erfindung angesehen werden und Variationen der Erfindung, die bekannt sind oder in Zukunft entwickelt werden, die im Bereich der Kenntnis eines Fachmannes liegen, fallen innerhalb den Rahmen der Erfindung wie sie hierin beschrieben wurde und im Folgenden beansprucht wird.
Beispiele
A. Synthese bestimmter erfindungsgemäßer Verbindungen Beispiel 1 sHerstellung von n-Butylsulfonyl-D-serin(tert-butylether)-methylester (1)
Eine Lösung von HCl·H-dSer(tBu)-OMe (2 g, 9,44 mmol) und n-Butylsulfonylchlorid (1,1 ml, 8,50 mmol) in Tetrahydrofuran (38 ml) wurde für zehn Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Diisopropylethylamin (5,75 ml, 33,07 mmol) wurde dann zugegeben und die trübe gelbe Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt.
Das Reaktionsgemisch wurde dann mit Ethylacetat (200 ml) verdünnt und mit 1 N HCl gewaschen, anschließend mit Salzwasser (jeweils 20 ml). Nach Trocknen über wasserfreiem Natriumsulfat wurden die Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Der flockige gelbe Feststoff (1,56 g, 62 %) wurde gemäß DSC als rein beurteilt (5 % Ethylacetat in Hexanen).
Beispiel 2 Herstellung von n-Butylsulfonyl-D-serin(tert-butylether)(2)
Zu einer Lösung von Verbindung 1 (1,46 g, 4,94 mmol) in Dioxan (32,95 ml) wurde tropfenweise 2,0 N LiOH (5,44 ml, 10,87 mmol) hinzugefügt. Die trübe gelbe Lösung ließ man bei Raumtemperatur über Nacht rühren. Wenn gemäß DSC (5 % Ethylacetat/Hexane) kein Ausgangsmaterial beobachtet wurde, so wurde das überschüssige Dioxan im Vakuum entfernt. Das Reaktionsgemisch wurde mit einem 1:1-Gemisch von Wasser und Methanol verdünnt und durch ein vorgewaschenes DOWEX (50 × 8-400) Ionenaustauschharz (30 ml) passiert. Das Harz wurde sorgfältig mit Methanol und Wasser gespült. Die vereinigten Filtrate wurden unter vermindertem Druck aufkonzentriert, um 1,44 g der Titelverbindung in quantitativer Ausbeute als cremefarbenen Feststoff zu erhalten.
Beispiel 3 Herstellung von n-Butylsulfonyl-D-serin(tert-butylether)-alanin-tert-butylester (3)
Eine Lösung der Verbindung aus Beispiel 2 (0,50 g, 1,79 mmol), Alanin-tert-butylester-Hydrochloridsalz (0,65 g, 3,58 mmol), EDC (0,68 g, 3,57 mmol), N-Hydroxybenzotriazol (0,27 g, 1,79 mmol) und Diisopropylethylamin (1,56 ml, 8,94 mmol) wurde in Acetonitril (18 ml) bei Raumtemperatur gerührt. Nach 18 Stunden wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt und der resultierende Rückstand wurde in Ethylacetat (50 ml) und 1 N HCl (10 ml) resuspendiert. Die Ethylacetatschicht wurde mit 1 N HCl (10 ml), gesättigtem Natriumbicarbonat (2 × 15 ml) und Salzwasser (15 ml) gewaschen, dann mit Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt und das Rohprodukt wurde durch Flashsäulenchromatographie aufgereinigt, wobei mit 50 % Ethylacetat/Hexane eluiert wurde und 429 mg (59 %) Produkt erhalten wurden. Das Produkt war gemäß Reversphasen (C18)-HPLC ein einzelner Peak (t_R = 9 Minuten bei 0,1 % Trifluoressigsäure in 5-90 % wässrigem Acetonitril über 20 Minuten).
Beispiel 4 Herstellung von n-Butylsulfonyl-D-serin-alanin (4)
Zu einer Lösung der Verbindung aus Beispiel 3 (0,42 g, 1,02 mmol) in Dichlormethan (4,2 ml) wurde Trifluoressigsäure (4,2 ml) hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 1 Stunde gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit 50 ml n-Heptan verdünnt und im Vakuum aufkonzentriert. Der Rückstand wurde in 10 ml Acetonitril und 50 ml n-Heptan resuspendiert und im Vakuum aufkonzentriert, um 410 mg Produkt zu erhalten.
Beispiel 5 Herstellung von α-Azido-4-cyanotoluol (5)
Natriumazid (Aldrich, 3,5 g, 54 mmol) wurde zu einer Lösung von α-Bromtoluolnitril (Aldrich, 10 g, 51 mmol) in DMF (100 ml) hinzugefügt, und das resultierende Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 5 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann mit Wasser (350 ml) verdünnt und mit Ether (2 × 100 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Salzlösung gewaschen und getrocknet (MgSO₄). Entfernung des Lösungsmittels führte zur Titelverbindung (8 g, 96 %). ¹H-NMR (CDCl₃): δ 4,42 (s, 2H), 7,41 (d, 2H, J = 8,1 Hz), 7,65 (d, 2H, J = 8,1 Hz).
Beispiel 6 Herstellung von 4-(Aminomethyl)benzylnitril (6)
Der Katalysator aus 10 % Pd-auf-C (Aldrich, 800 mg) wurde zu einer Lösung von α-Azido-4-cyanotoluol (Verbindung 5, 8 g, 51 mmol) in EtOAc (150 ml) hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde hydriert (H₂, 45 psi) in einer Parr-Apparatur für 11 Stunden. Der Katalysator wurde abfiltriert und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, um die Titelverbindung zu erhalten (6.3 g, 93 %).¹H-NMR (CDCl₃): δ 3,85 (s, 2H), 7,45 (d, 2H, J = 8,1), 7,60 (d, 2H, J = 8,1 Hz), 7,78 (s, 2H, NH₂).
Beispiel 7 Herstellung von n-Butylsulfonyl-D-serin-alanin-4-cyanobenzylamid (7)
Eine Lösung der Verbindung 4 (150 mg, 0,51 mmol), 4-(Aminomethyl)benzylnitril (Verbindung 6, 171 mg, 1,02 mmol), EDC (195 mg, 1,02 mmol) und N-Hydroxybenzotriazol (78 mg, 0,51 mmol) in Acetonitril (5,1 ml) wurde bei Raumtemperatur für 10 Minuten gerührt. 2,4,6-Collidin (0,34 ml, 2,54 mmol) wurde dann hinzugefügt und das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt und der resultierende Rückstand wurde in Ethylacetat (100 ml) und 0,5 M HCl (10 ml) resuspendiert. Die Ethylacetatschicht wurde mit Wasser gewaschen, anschließend mit 0,5 M HCl (10 ml), gesättigtem Natriumbicarbonat (2 × 10 ml) und Salzwasser (15 ml), dann mit Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt, um 237 mg Produkt zu erhalten. Das Produkt eluierte nach 9,5 Minuten durch Reversphasen (C18)-HPLC bei 0,1 % Trifluoressigsäure in 5-75 % wässrigem Acetonitril über 20 Minuten.
Beispiel 8 Herstellung von n-Butylsulfonyl-D-serin-alanin-4-hydroxyamidinobenzylamid (8)
Zu einer Lösung des Produkts in Beispiel 7 (117 mg, 0,285 mmol) in 1,14 ml Methanol wurde Hydroxylamin-Hydrochlorid (33,7 mg, 0,485 mmol) und anschließend N-Methylmorpholin (53 μl, 0,485 mmol) hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und dann für sechs Stunden bei 50 °C. Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum aufkonzentriert. Das Rohprodukt wurde ohne weitere Reinigung für den nächsten Schritt (Beispiel 9) verwendet. Das Produkt eluierte nach 6,5 Minuten durch Reversphasen (C18)-HPLC mit 0,1 % Trifluoressigsäure in 5-50 % wässrigem Acetonitril über 20 Minuten.
Beispiel 9 Herstellung von n-Butylsulfonyl-D-serin-alanin-4-amidinobenzylamid (9)
Zu dem Produkt aus Beispiel 8 (126 mg, 0,285 mmol) in Essigsäure (2,85 ml) und Wasser (0,28 ml) wurden 185 mg aktivierter Zinkstaub hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Der Zinkstaub wurde unter Verwendung eines Glastrichters abfiltriert und das Filtrat wurde durch präparative HPLC aufgereinigt. Die Fraktionen, welche das Produkt enthielten, eluierten in einem 5-20 %-igen wässrigen Acetonitril, welches 0,1 % TFA enthielt und wurden gesammelt und lyophilisiert, um 35 mg der Titelverbindung als weißes Pulver zu erhalten. Das Produkt eluierte nach 6,0 Minuten durch Reversphasen (C18)-HPLC mit 0,1 % Trifluoressigsäure in 5-50 % wässrigem Acetonitril über 20 Minuten.
Beispiel 10 Herstellung von Benzylsulfonyl-D-serin(tert-butylether)-methylester (10)
Eine Lösung von HCl·H-dSer(tBu)-OMe (1 g, 4,72 mmol) und Phenethylsulfonylchlorid (1,45 g, 7,08 mmol) in Acetonitril (19 ml) wurde für zehn Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Diisopropylethylamin (1,53 ml, 11,81 mmol) wurde dann hinzugefügt und die klare gelbe Lösung wurde für 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann mit Ethylacetat (100 ml) verdünnt und mit 1N HCl gewaschen, gefolgt von Salzlösung (jeweils 10 ml). Nach Trocknen über wasserfreiem Natriumsulfat wurden die Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Das Rohprodukt wurde durch Flashsäulenchromatographie aufgereinigt, wobei mit Dichlormethan, anschließend mit einem Gradienten, der aus 1 bis 5 % Ethylacetat in Dichlormethan bestand, eluiert wurde, was 840 mg (52 %) Produkt ergab. DSC des Endprodukts in 5 % Ethylacetat in Dichlormethan ergab einen Punkt mit einem Rf-Wert von 0,52.
Beispiel 11 Herstellung von Benzylsulfonyl-D-serin(tert-butylether) (11)
Zu einer Lösung der Verbindung von Beispiel 10 (1,0 g, 3,03 mmol) in Dioxan (20 ml) wurde tropfenweise 2,0 N LiOH (3,33 ml, 6,67 mmol) hinzugefügt. Man ließ die Lösung bei Raumtemperatur über Nacht rühren. Das überschüssige Dioxan wurde im Vakuum entfernt. Das Reaktionsgemisch wurde mit einem 1:1-Gemisch von Wasser und Methanol verdünnt und durch ein vorgewaschenes DOWEX (50 × 8-400)-Ionenaustauschharz (30 ml) passiert. Das Harz wurde sorgfältig mit Methanol und Wasser gespült. Die vereinigten Filtrate wurden unter vermindertem Druck aufkonzentriert, um 1,10 g der Titelverbindung als gelben Leim zu erhalten.
Beispiel 12 Herstellung von tert-Butyloxycarbonyl-3,4-dehydroprolin-p-cyanobenzylamid (12)
Eine Lösung von tert-Butyloxycarbonyl-3,4-dehydroprolin (0,4 g, 1,88 mmol), 4-(Aminomethyl)benzylnitril (Verbindung 6, 0,47 g, 2,82 mmol), EDC (0,54 g, 2,82 mmol), N-Hydroxybenzotriazol (0,29 g, 1,88 mmol) und Diisopropylethylamin (1,64 ml, 9,39 mmol) in Acetonitril (7,5 ml) wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt und der resultierende Rückstand wurde in Ethylacetat (25 ml) und 0,5 M HCl (5 ml) resuspendiert. Die Ethylacetatschicht wurde mit Wasser gewaschen, gefolgt von 0,5 M HCl (5 ml), gesättigtem Natriumbicarbonat (2 × 5 ml) und Salzwasser (10 ml), dann mit Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt und das Rohprodukt wurde durch Flashsäulenchromatographie aufgereinigt, wobei mit 4/1 Ethylacetat/Hexan eluiert wurde, um 561 mg reines Produkt (91,3 %) zu erhalten. Das Produkt eluierte nach 10,5 Minuten bei Reversphasen (C18)-HPLC mit 0,1 % Trifluoressigsäure in 5-75 % wässrigem Acetonitril über 20 Minuten.
Beispiel 13 Herstellung von 3,4-Dehydroprolin-4-cyanobenzylamid-Hydrochloridsalz (13)
Zu einer Lösung der Verbindung aus Beispiel 12 (0,47 g, 1,44 mmol) in Ethylacetat (5,7 ml) wurden 5M wasserfreies HCl in Ethylacetat (1,44 ml) hinzugefügt und die Reaktion wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum aufkonzentriert, um 363 mg (95 %) eines weißen Feststoffs zu erhalten.
Beispiel 14 Herstellung von Benzylsulfonyl-D-serin(tert-butylether)-prolin(dehydro)-4-cyanobenzylamid (14)
Eine Lösung der Verbindung aus Beispiel 11 (0,10 g, 0,32 mmol), der Verbindung aus Beispiel 13 (0,092 g, 0,34 mmol), EDC (0,091 g, 0,48 mmol) und N-Hydroxybenzotriazol (0,053 g, 0,35 mmol) wurde in Acetonitril (1,2 ml) für 10 Minuten gerührt. 2,4,6-Collidin (0,209 ml, 1,58 mmol) wurde dann hinzugefügt und das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Der resultierende Rückstand wurde in Ethylacetat (50 ml) und 1 N HCl (10 ml) resuspendiert. Die Ethylacetatschicht wurde mit 1 N HCl (10 ml), gesättigtem Natriumbicarbonat (2 × 15 ml) und Salzwasser (15 ml) gewaschen, dann mit Natriumsulfat getrocknet, um einen gelben Sirup (160 mg, 94 %) zu erhalten. Das Produkt war gemäß Reversphasen (C18)-HPLC ein einzelner Peak (t_R = 11 Minuten bei 0,1 % Trifluoressigsäure in 5-90 % wässrigem Acetonitril über 20 Minuten).
Beispiel 15 Herstellung von Benzylsulfonyl-D-serin-3,4-dehydroprolin-4-cyanobenzylamid (15)
Zu einer Lösung der Verbindung aus Beispiel 14 (0,16 g, 0,30 mmol) in Dichlormethan (0,6 ml) wurde Trifluoressigsäure (0,6 ml) hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 1 Stunde gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit 10 ml n-Heptan verdünnt und im Vakuum aufkonzentriert. Der Rückstand wurde in 5 ml Acetonitril und 10 ml n-Heptan resuspendiert und im Vakuum aufkonzentriert, um 183 mg Produkt zu erhalten.
Beispiel 16 Herstellung von Benzylsulfonyl-D-serin-3,4-dehydroprolin-4-hydroxyamidinobenzylamid (16)
Zu einer Lösung des Produkts aus Beispiel 15 (143 mg, 0,305 mmol) in 1,22 ml Methanol wurde Hydroxylamin-Hydrochlorid (0,036 mg, 0,519 mmol) und anschließend N-Methylmorpholin (57 μl, 0,519 mmol) hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Analytische HPLC deutete an, dass die Reaktion nicht vollständig war. Weiteres Hydroxyamin-Hydrochlorid (0,036 mg, 0,519 mmol) und N-Methylmorpholin (57 μl, 0,519 mmol) wurden hinzugefügt und es wurde weiter bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum aufkonzentriert und das Rohprodukt wurde durch präparative HPLC gereinigt. Die Fraktionen, welche das Produkt enthielten, eluierten in 5-20 %-igem wässrigem Acetonitril, welches 0,1 % TFA-Lösung enthielt und wurden gesammelt und lyophilisiert, um 16 mg der Titelverbindung als weißes Pulver zu erhalten.
Beispiel 17 Herstellung von Benzylsulfonyl-D-serin-3,4-dehydroprolin-p-amidinobenzylamid (17)
Zu dem Produkt aus Beispiel 16 (15 mg, 0,030 mmol) in Essigsäure (0,30 ml) und Wasser (0,03 ml) wurden 19 mg aktivierter Zinkstaub hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Der Zinkstaub wurde unter Verwendung eines Glastrichters abfiltriert und das Filtrat wurde durch präparative HPLC gereinigt. Die Fraktionen, welche das Produkt enthielten, eluierten in einem 5-20 %-igen wässrigen Acetonitril, welches 0,1 % TFA enthielt und wurden gesammelt und lyophilisiert, um 7 mg der Titelverbindung als weißes Pulver zu erhalten. Das Produkt eluierte nach Minuten durch Reversphasen (C18)-HPLC mit 0,1 % Trifluoressigsäure in 5-50 % wässrigem Acetonitril über 20 Minuten.
Beispiel 18 Herstellung von Bis(benzyloxycarbonyl)guanidin (18)
Die Synthese des Titelprodukts wurde wie in der Literatur erwähnt durchgeführt (Tetrahedron Letters, Band 35, Nr. 7, S. 977-980, 1994) und ist nachstehend beschrieben:
Eine Lösung von N,N'-Bis(benzyloxycarbonyl)-S-methylisothioharnstoff (1 g, 2,79 mmol) in 7 N wasserfreiem Ammoniak in Methanol (5,5 ml) wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde aufkonzentriert und der verbleibende Rückstand wurde mit Ethylacetat (10 ml) verdünnt. Die organische Schicht wurde zweimal mit gesättigtem Natriumbicarbonat und einmal mit Salzwasser (jeweils 10 ml) gewaschen. Nach Trocknen über Natriumsulfat wurde das Rohprodukt einer Flashsäulenchromatographie unterzogen, wobei mit 3/2 Ethylacetat/Hexane eluiert wurde, um 0,87 g eines weißen Feststoffs zu erhalten. Das Produkt wurde dann in einem 1:1 Ethylacetat : Hexan Lösungsmittelsystem umkristallisiert, um 337 mg (37 %) reines Produkt (Smp. = 151 °C) zu erhalten.
Beispiel 19 Herstellung von tert-Butyloxycarbonyl-4-amino-1-butanol (19)
Zu einer Lösung von 4-Amino-1-butanol (1 g, 11,22 mmol) in Tetrahydrofuran (45 ml) wurde Boc-Anhydrid (2,20 g, 10,10 mmol) und Triethylamin (2,84 g, 28,04 mmol) hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde aufkonzentriert und der verbleibende Rückstand wurde mit Ethylacetat (250 ml) und 1 M HCl (50 ml) verdünnt. Die Schichten wurden getrennt und die organische Schicht wurde mit 1 N HCl, Wasser und Salzwasser (jeweils 50 ml) gewaschen. Nach Trocknen über Natriumsulfat wurden 1,9 g (99 %) Produkt als klares Öl erhalten.
Beispiel 20 Synthese von g-N,N'-bis(Benzyloxycarbonyl)agmatintrifluoracetatsalz (20)
Zu einer Lösung von Verbindung 18 (das Produkt aus Beispiel 18) (0,2 g, 0,61 mmol) und Triphenylphosphin (0,12 g, 0,46 mmol) in trockenem Toluol (6,6 ml) unter Stickstoff wurde über eine Spritze Verbindung 19 (das Produkt aus Beispiel 19) hinzugefügt. Das Gemisch wurde auf 0 °C gekühlt und Diethylazodicarboxylat (0,080 g, 0,46 mmol) wurde tropfenweise innerhalb von 15 Minuten hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt, wobei nach dieser Zeit DSC in 3/2 Ethylacetat/Hexan die Vollständigkeit der Reaktion bestätigte. Fünf Tropfen Wasser wurden zugegeben und das Lösungsmittel wurde im Vakuum abgedampft. Das Rohprodukt wurde durch Flashsäulenchromatographie gereinigt, wobei mit 9/1 Hexane/Ethylacetat und anschließend mit 3/2 Hexane/Ethylacetat eluiert wurde, um 83 mg (74 %) reines Produkt zu erhalten. Das Produkt wurde dann mit Dichlormethan und Trifluoressigsäure (jeweils 1 ml) für eine Stunde bei Raumtemperatur behandelt. Die Entfernung der Lösungsmittel im Vakuum ergab 80 mg Produkt 20.
Beispiel 21 Herstellung von n-Butylsulfonyl-D-serin-alanin-agmatin-g-N,N-bis(benzyloxycarbonyl) (21)
Eine Lösung der Verbindung aus Beispiel 4 (0,05 g, 0,17 mmol) und der Verbindung aus Beispiel 20 (0,065 g, 0,17 mmol), EDC (0,065 g, 0,34 mmol) und Hydroxybenzotriazol (0,026 g, 0,17 mmol) wurde in Acetonitril (0,67 ml) für 10 Minuten gerührt. 2,4,6-Collidin (0,11 ml, 0,84 mmol) wurde dann hinzugefügt und das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt und der resultierende Rückstand wurde in Ethylacetat und 1 N HCl (jeweils 5 ml) resuspendiert. Die Ethylacetatschicht wurde mit 1 N HCl (5 ml), gesättigtem Natriumbicarbonat (2 × 5 ml) und Salzwasser (5 ml) gewaschen, dann mit Natriumsulfat zu einem Feststoff getrocknet (114 mg, 94 %).
Beispiel 22 Herstellung von n-Butylsulfonyl-D-serin-alanin-agmatin (22)
Die Verbindung aus Beispiel 21 (114 mg, 0,17 mmol) wurde in Methanol (15 ml) gelöst und an einem Parr-Schüttler über Nacht bei 40 psi in Gegenwart von 15 mg Palladium auf Kohle hydriert. Der Katalysator wurde abfiltriert. Das Reaktionsgemisch wurde mit 35 ml Wasser verdünnt und durch präparative HPLC gereinigt. Die Fraktionen, welche das Produkt enthielten, eluierten in 0-25 %-igem wässrigem Acetonitril, welches 0,1 % TFA enthielt und sie wurden gesammelt und lyophilisiert, um 16 mg der Titelverbindung als weißes Pulver zu erhalten.
Beispiel 23 Herstellung von 2-Cyano-5-methylthiophen (23)
Eine Lösung von 2-Brom-5-methylthiophen (TCl chemicals, 5 g, 28 mmol) und Kupfer(I)-cyanid (Aldrich, 2,53 g, 28 mmol) in DMF (10 ml) wurde für 4 Stunden auf Rückflusstemperatur erhitzt. Nach Kühlen auf Raumtemperatur wurden Ethylacetat (500 ml) und eine 10 %-ige wässrige NaCN-Lösung (500 ml) hinzugefügt. Nach Abtrennung wurde die wässrige Schicht mit Ethylacetat (300 ml) extrahiert und die vereinigten organischen Schichten wurden zu einem Öl aufkonzentriert. Das Öl wurde durch Flashsäulenchromatographie (Ethylacetat) weiter gereinigt, um die Titelverbindung zu erhalten (3,03 g, 87 %). DSC: Rf 0,30 (1:1 Hexan/Ethylacetat); ¹H-NMR (CDCl₃): δ 2,55 (m, 3H), 6,76 (d, 1H, J = 3,6 Hz), 7,42 (d, 1H, J = 3,6 Hz).
Beispiel 24 Herstellung von 2-Cyano-5-(brommethyl)thiophen (24)
Eine Lösung von 2-Cyano-5-methylthiophen (Verbindung 23, 3,0 g, 24 mmol), N-Bromsuccinimid (Aldrich, 4,8 g, 27 mmol) und 2,2'-Azobisisobutyronitril (Aldrich, 0,4 g, 2,4 mmol) in CCl₄ (Aldrich, 60 ml) wurde für 5 Stunden auf Rückflusstemperatur erhitzt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt, um ein gelbes Öl zu erhalten. Das Öl wurde durch Flashsäulenchromatographie gereinigt (1:1 Hexan/Ethylacetat) um die Titelverbindung zu erhalten (4,5 g, 91 %). DSC: Rf 0,91 (1:1 Hexan/Ethylacetat); ¹H-NMR (CDCl₃):δ 4,66 (s, 2H), 7,10 (d, 1H, J = 3,8 Hz), 7,48 (d, 1H, J = 3,8 Hz).
Beispiel 25 Herstellung von 2-Cyano-5-(azidomethyl)thiophen (25)
Eine Lösung von 2-Cyano-5-(brommethyl)thiophen (Verbindung 24, 3,5 g, 17,3 mmol) und Natriumazid (Aldrich, 1,7 g, 26 mmol) in DMF (Aldrich, 60 ml) wurde bei Raumtemperatur für 10 Stunden gerührt. Flashsäulenchromatographie (20 % Ethylacetat in Hexan) ergab die Titelverbindung (2,35 g, 83 %). DSC: Rf 0,48 (20 % Ethylacetat in Hexan); ¹H-NMR (CDCl₃): δ 4,56 (s, 2H), 7,01 (d, 1H, J = 3,7 Hz), 7,55 (d, 1H, J = 3,7 Hz).
Beispiel 26 Herstellung von 2-Cyano-5-(aminomethyl)thiophen (26)
Triphenylphosphin (Aldrich, 5,7 g) wurde zu einer Lösung von 2-Cyano-5-(azidomethyl) thiophen (Verbindung 25, 2,5 g, 10 mmol) in THF (Aldrich, 40 ml) und Wasser (10 ml) bei 0 °C hinzugefügt. Man ließ die resultierende Lösung auf Raumtemperatur erwärmen und sie wurde bei Raumtemperatur für 10 Stunden gerührt. RP HPLC-Reinigung führte zu der Titelverbindung (2,3 g, 94 %). MS (Elektronenspray): 139 (M + 1); ¹H-NMR (CDCl₃): δ 4,01 (s, 2H), 4,75 (br s, 2H, NH₂), 6,82 (d, 1H, J = 3,5 Hz), 7,08 (d, 1H, J = 3,5 Hz).
Beispiel 27 Herstellung von n-Butylsulfonyl-D-serin-alanin-2-cyano-5-(methylamid)thiophen (27)
Eine Lösung der Verbindung aus Beispiel 4 (4, 860 mg, 2,9 mmol) und der Verbindung aus Beispiel 26 (26, 400 mg, 2,9 mmol), EDC (556 mg, 2,9 mmol), N-Hydroxybenzotriazol (488 mg, 3,19 mmol) und Diisopropylethylamin (1,5 ml, 8,7 mmol) wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt und der resultierende Rückstand wurde in Ethylacetat (50 ml) und 1 N Natriumbisulfat (10 ml) resuspendiert. Die Ethylacetatschicht wurde mit 1 N Natriumbisulfat (10 ml), gesättigtem Natriumbicarbonat (2 × 15 ml) und Salzwasser (15 ml) gewaschen, dann mit Natriumsulfat getrocknet, um ein gelbes Öl zu erhalten. Das Rohprodukt wurde Flashsäulenchromatographie unterzogen, wobei mit einem 4/5/1-Verhältnis von Ethylacetat/Hexane/Methanol eluiert wurde. Das Produkt war ein 3:1-Gemisch von Diastereomeren gemäß Reversphasen (C18)-HPLC (t_R = 8,5 Minuten bei 0,1 % Trifluoressigsäure in 5-75 % wässrigem Acetonitril über 30 Minuten). Niedrig aufgelöste Massenspektroskopie bestätigte die benötigte Masse (MH⁺ 417).
Beispiel 28 Synthese von n-Butylsulfonyl-D-serin-alanin-2-hydroxyamidino-5-(methylamid)thiophen (28)
Zu einer Lösung des Produkts von Beispiel 27 (220 mg, 0,53 mmol) in 5 ml Methanol wurde Hydroxylamin-Hydrochlorid (184 mg, 2,64 mmol) zugegeben und anschließend N-Methylmorpholin (290 μl, 2,64 mmol). Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Methanolgemisch wurde im Vakuum aufkonzentriert und der verbleibende Rückstand wurde mit Ethylacetat verdünnt und mit gesättigtem Natriumbicarbonat und Salzwasser (jeweils 10 ml) gewaschen. Die organischen Schichten wurden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum aufkonzentriert, um ein gelbes Öl zu erhalten (120 mg, 50 %). Das Produkt war ein 3:1-Gemisch von Diastereomeren gemäß Reversphasen (C18)-HPLC (t_R = 5 Minuten bei 0,1 % Trifluoressigsäure in 5-75 % wässrigem Acetonitril über 20 Minuten). Das niedrig aufgelöste Massenspektrum bestätigte die gewünschte Masse (MH⁺ 450,5).
Beispiel 29 Synthese von n-Butylsulfonyl-D-serin-alanin-2-amidino-5-(methylamid)thiophen (29)
Zu dem Produkt aus Beispiel 28 (60 mg, 0,13 mmol) in Essigsäure (1,3 ml) und Wasser (0,1 ml) wurden 87 mg aktivierter Zinkstaub hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Der Zinkstaub wurde unter Verwendung eines Glastrichters abfiltriert und das Filtrat wurde durch präparative HPLC gereinigt. Die Fraktionen, welche das Produkt enthielten, eluierten in 0-20 % wässrigem Acetonitril, welches 0,1 % TFA enthielt. Sie wurden gesammelt und lyophilisiert, um 7 mg der Titelverbindung als weißes Pulver zu erhalten. Das 3:2 diastereomere Gemisch der Produkte eluierte nach 13 Minuten bei Reversphasen (C18)-HPLC mit 0,1 % Trifluoressigsäure in 5-50 % wässrigem Acetonitril über 20 Minuten. Niedrig aufgelöste Massenspektroskopie bestätigte die gewünschte Masse (MH⁺ 434).
Beispiel 30 Synthese von tert-Butyloxycarbonyl-3,4-methanoprolin (30) (nachstehende Schritte A bis E) Schritt A. Synthese von N-Benzyl-3,4-methanoprolinol (b)
Ein Gemisch des Benzyliden-Ausgangsmaterials (a) (J. Org. Chem. 1999, 64(2), 547) (4,6 Gramm, 21,4 mmol) und Lithiumaluminumhydrid (1,0 M in THF, 64 ml, 64 mmol) wurde für 5 Stunden unter Rückfluss erhitzt. Nach Kühlen auf 0 °C wurde das restliche Aluminiumhydrid sorgfältig gequencht durch tropfenweise Zugabe von gesättigtem wässrigem Natriumsulfat (5 ml) innerhalb von 15 Minuten. Das Gemisch wurde mit Ethylacetat verdünnt (200 ml) und dann durch Celite filtriert. Das Filtrat wurde mit Natriumsulfat getrocknet, filtriert und aufkonzentriert, um rohen N-Benzylaminoalkohol (3,45 Gramm) zu erhalten, der ohne weitere Aufreinigung für den nächsten Schritt verwendet wurde.
Schritt B. Synthese von N-Benzyloxycarbonyl-3,4-methanoprolinol
Eine Lösung von rohem N-Benzyl-3,4-methanoprolinol (Schritt A, (b))(3 Gramm, 14,76 mmol) in Methanol (120 ml) und konzentrierter HCl (1,5 ml) mit 10 % Pd/C (300 mg) wurde bei 50 psi für 16 Stunden hydriert. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert, um den auf Kohlenstoff getragenen Katalysator zu entfernen, und das Filtrat wurde aufkonzentriert. Der Rückstand wurde in Wasser/Dioxan (100 ml) gelöst und Diisopropylethylamin (3,2 ml) wurde hinzugefügt. Benzylchlorformiat (2,76 ml, 16,2 mmol) wurde zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde über Nacht gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde aufkonzentriert, in 1 M HCl (100 ml) gelöst und mit Ethylacetat (3 × 200 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und aufkonzentriert. Der Rückstand wurde mit Flashchromatographie unter Verwendung von 1:3 Ethylacetat/Hexane gereinigt, um das N-Cbz-3,4-methanoprolinol (2,4 g) zu erhalten.
Schritt C. Synthese von N-Benzyloxycarbonyl-3,4-methanoprolin
Zu einer Lösung von N-Benzyloxycarbonyl-3,4-methanoprolinol (2,2 g, 8,90 mmol) in Aceton (68 ml) wurde unter Rühren bei 0 °C Jones-Reagenz (6,6 ml) tropfenweise innerhalb von 5 Minuten zugegeben [Jones-Reagenz: Hergestellt aus Chromtrioxid (13,4 g) und konzentrierter Schwefelsäure (11,5 ml), verdünnt mit Wasser auf ein Gesamtvolumen von 50 ml.] Nach Rühren bei 0 °C für 3 Stunden wurde Isopropanol (11 ml) hinzugefügt und das Rühren wurde für weitere 10 Minuten fortgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Wasser verdünnt (400 ml) und mit Ethylacetat extrahiert (3 × 500 ml). Die vereinigten organischen Schichten wurden über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und aufkonzentriert um N-Cbz-3,4-methanoprolin zu erhalten (2,25 g, 96 %).
Schritt D. Synthese von 3,4-Methanoprolin-Hydrochloridsalz
Zu einer Lösung von N-Benzyloxycarbonyl-3,4-methanoprolin (erhalten in Schritt C, oben) (1,23 g, 4,71 mmol) in Ethanol (47 ml) und 0,5 M HCl (9,42 ml) wurde 10 % Palladium auf Kohlenstoff-Katalysator zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Atmosphärendruck über Nacht hydriert. Der Katalysator wurde abfiltriert und das Filtrat wurde im Vakuum aufkonzentriert, um 767 mg reines Produkt zu erhalten. Das Produkt eluierte nach 14 Minuten bei Reversphasen (C18)-HPLC mit 0,1 % Trifluoressigsäure in 5-75 % wässrigem Acetonitril über 20 Minuten.
Schritt E. Herstellung von tert-Butyloxycarbonyl-3,4-methanoprolin
Zu einer Lösung von 3,4-Methanoprolin-Hydrochloridsalz (aus Schritt D oben) (1,04 g, 6,38 mmol) in Dioxan und Wasser (jeweils 25 ml) wurde Kaliumcarbonat (1,76 g, 12,76 mmol) und Boc-Anhydrid (2,78 g, 12,76 mmol) hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Dioxan wurde im Vakuum entfernt und der verbleibende Rückstand wurde mit Diethylether verdünnt. Die Schichten wurden getrennt und die wässrige Schicht wurde mit Diethylether extrahiert (1 × 25 ml). Die wässrige Schicht wurde angesäuert auf pH < 3 mit 1 N Chlorwasserstoffsäure und extrahiert mit Ethylacetat (3 × 25 ml). Die organische Schicht wurde über Natriumsulfat getrocknet, dekantiert und unter vermindertem Druck aufkonzentriert, um 745 mg (50 %) Produkt zu erhalten. Das Produkt eluierte nach 12,5 Minuten bei Reversphasen (C18)-HPLC mit 0,1 % Trifluoressigsäure in 5-75 % wässrigem Acetonitril über 20 Minuten.
Beispiel 31 Herstellung von tert-Butyloxycarbonyl-3,4-methanoprolin-4-cyanobenzylamid (31)
Eine Lösung der Verbindung aus Beispiel 30 (Schritt E) (0,70 g, 3,082 mmol), p-Cyanobenzylamin-Hydrochloridsalz (0,784 g, 4,62 mmol), EDC (0,88 g, 4,62 mmol), N-Hydroxybenzotriazol (0,47 g, 3,082 mmol) und Diisopropylethylamin (2,68 ml, 15,41 mmol) wurde in Acetonitril (12 ml) bei Raumtemperatur gerührt. Nach 18 Stunden wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt und der resultierende Rückstand wurde in Ethylacetat resuspendiert (150 ml) und nacheinander mit 0,5 M HCl (2 × 15 ml), Salzwasser (1 × 15 ml), gesättigtem Natriumbicarbonat (2 × 15 ml) und Salzwasser (1 × 15 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde über Natriumsulfat getrocknet, dekantiert und im Vakuum konzentriert. Das Rohprodukt wurde durch Flashsäulenchromatographie gereinigt, wobei mit 4/1 Ethylacetat/Hexane eluiert wurde und 822 mg (70 %) Produkt erhalten wurden.
Beispiel 32 Herstellung von 3,4-Methanoproline-4-cyanobenzylamid-Hydrochloridsalz (32)
Zu einer Lösung der Verbindung aus Beispiel 31 (1 g, 2,93 mmol) in Ethylacetat (11,7 ml) wurde 5 M wasserfreie HCl in Ethylacetat (2,93 ml) hinzugefügt und die Reaktion wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum aufkonzentriert, um 645 mg (79 %) eines weißen Feststoffs zu erhalten.
Beispiel 33 Herstellung von Benzylsulfonyl-D-serin(tert-butylether)-3,4-methanoproline-4-cyanobenzylamid (33)
Eine Lösung der Verbindung aus Beispiel 11 (0,10 g, 0,32 mmol) der Verbindung aus Beispiel 32 (0,105 g, 0,38 mmol), EDC (0,073 g, 0,38 mmol), N-Hydroxybenzotriazol (0,049 g, 0,32 mmol) und Diisopropylethylamin (0,28 ml, 1,59 mmol) wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt und der resultierende Rückstand wurde in Ethylacetat (50 ml) und 1 N HCl (10 ml) resuspendiert. Die Ethylacetatschicht wurde mit 1 N HCl (10 ml), gesättigtem Natriumbicarbonat (2 × 15 ml) und Salzwasser (15 ml) gewaschen, dann mit Natriumsulfat getrocknet. Die organische Schicht wurde dekantiert und unter vermindertem Druck aufkonzentriert, um 171 mg Produkt zu erhalten.
Beispiel 34 Herstellung von Benzylsulfonyl-D-serin-3,4-methanoprolin-4-cyanobenzylamid (34)
Zu einer Lösung der Verbindung aus Beispiel 33 (0,17 g, 0,32 mmol) in Dichlormethan (4 ml) wurde Trifluoressigsäure (4 ml) hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 1 Stunde gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit 10 ml n-Heptan verdünnt und im Vakuum aufkonzentriert. Der Rückstand wurde in 5 ml Acetonitril und 10 ml n-Heptan resuspendiert und im Vakuum aufkonzentriert, um 154 mg Produkt zu erhalten.
Beispiel 35 Herstellung von Benzylsulfonyl-D-serin-3,4-methanoprolin-4-hydroxyamidinobenzylamid (35)
Zu einer Lösung des Produkts aus Beispiel 34 (154 mg, 0,32 mmol) in 1,3 ml Methanol wurde Hydroxylamin-Hydrochlorid (0,11 g, 1,58 mmol) und anschließend N-Methylmorpholin (209 μl, 1,902 mmol) hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum aufkonzentrert. Das Rohprodukt wurde in 25 % Acetonitril in Wasser resuspendiert und durch präparative HPLC gereinigt. Die Fraktionen, welche das Produkt enthielten, eluierten in 0-20 % wässrigem Acetonitril, welches 0,1 % TFA-Lösung enthielt und wurden gesammelt und lyophilisiert, wodurch 19,5 mg der Titelverbindung als weißes Pulver erhalten wurden. Niedrig aufgelöste Massenspektroskopie bestätigte die gewünschte Masse (MH⁺ 516).
Beispiel 36 Herstellung von Benzylsulfonyl-D-serin-3,4-methanoprolin-p-amidinobenzylamid (36)
Zu dem Produkt aus Beispiel 35 (19,5 mg, 0,041 mmol) in Essigsäure (0,41 ml) und Wasser (0,041 ml) wurden 27 mg aktivierter Zinkstaub hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Der Zinkstaub wurde unter Verwendung eines Glastrichters abfiltriert und das Filtrat wurde durch präparative HPLC gereinigt. Die Fraktionen, welche das Produkt enthielten, eluierten in 0-20 % wässrigem Acetonitril, welches 0,1 % TFA enthielt, sie wurden gesammelt und lyophilisiert, was 15 mg der Titelverbindung als weißes Pulver ergab. Das Produkt eluierte nach 10,5 Minuten bei Reversphasen (C18)-HPLC mit 0,1 % Trifluoressigsäure in 5-50 % wässrigem Acetonitril über 20 Minuten. Niedrig aufgelöste Massenspektroskopie bestätigte die gewünschte Masse (MH⁺ 500).
Beispiel 37 Herstellung von 4-Trifluoracetamidomethylanilin (7-2)
4-Nitrobenzylamin (7-1) (4,0 g, 21 mmol) wurde portionsweise zu Trifluoressigsäure-Anhydrid (15 ml) hinzugefügt, während das Gemisch auf Eis gekühlt wurde. Man ließ das Gemisch auf Raumtemperatur erwärmen und rührte über Nacht. Die Suspension wurde auf Eis geschüttet (ungefähr 200 g) und die trübe Suspension wurde mit CH₂Cl₂ extrahiert (2 × 100 ml), über Na₂SO₄ getrocknet und das Lösungsmittel wurde entfernt, um ein transparentes Öl zu erhalten. Dieses Öl wurde in einem Parr-Kolben mit Pd/C (10 %, 300 mg) in MeOH (50 ml) über Nacht geschüttelt. Der Feststoff wurde durch Filtration entfernt und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, um einen weißen Feststoff zu erhalten, welcher der Titelverbindung (7-2) entsprach (4,5 g, quantitative Ausbeute).
Beispiel 38 Herstellung von N-[(4-Trifluoracetamidomethyl)phenyl]-N'-N''-bis(tert-butoxycarbonyl)-guanidin (7-3)
4-Trifluoracetamidomethylanilin (7-2) (279 mg, 1,28 mmol) wurden zu einem gerührten Gemisch von N-N'-Di-Boc-N''-trifluormethansulfonyl-guanidin (hergestellt gemäß dem in J. Org. chem. 1998, 63, 3804-3805) beschriebenen Verfahren (500 mg, 1,28 mmol), TEA (108 μl, 1,28 mmol) in CH₂Cl₂ (10 ml) hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde für 6 Stunden gerührt. Das Gemisch wurde mit CH₂Cl₂ verdünnt (30 ml) und mit HCl (1 M, 20 ml), Salzwasser (20 ml) gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, um einen Feststoff zu erhalten. Säulenchromatographie (CH₂Cl₂/MeOH, 99:1) ergab einen weißen Feststoff, welcher der Titelverbindung entsprach (350 mg, 52 %).
Beispiel 39 Herstellung von N-[(4-Aminomethyl)phenyl]-N'-tert-butoxycarbonylguanidin (7-4)
Kaliumcarbonat (500 mg) wurde zu einer gerührten Lösung von N-[(4-Trifluoracetamidomethyl)phenyl]-N'-N''-bis(tert-butoxycarbonyl)-guanidin (7-3) (300 mg, 0,833 mmol) in H₂O/MeOH (2:15, 17 ml) hinzugefügt und das Gemisch wurde über Nacht gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der verbleibende Rückstand wurde in H₂O gelöst (10 ml) und mit CH₂Cl₂/MeOH (9:1, 3 × 10 ml) extrahiert. Die organischen Schichten wurden über Na₂SO₄ getrocknet und im Vakuum entfernt, um einen weißen Feststoff zu erhalten, welcher der Titelverbindung entspricht (150 mg, 68 %).
Beispiel 40 Herstellung von Benzylsulfonyl-D-serin-L-alanin-(4-(N-tert-butoxycarbonyl-guanidiho)-benzylamid (7-5)
Eine Lösung von N-[(4-Aminomethyl)phenyl]-N'-tert-butoxycarbonylguanidin (7-4) (36 mg, 0,14 mmol), Benzylsulfonyl-D-serin-L-alanin-carboxylat (50 mg, 0,13 mmol), HATU (74 mg, 0,20 mmol), HORT (27 mg, 0,20 mmol) und DIEA (68 μl, 0,39 mmol) in Acetonitril (2,0 ml) wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Die Lösung wurde mit EtOAc (20 ml) verdünnt, mit HCl (1 M, 10 ml), NaHCO₃ (gesättigt, 10 ml), Salzwasser (10 ml) gewaschen und im Vakuum entfernt, um ein Öl zu erhalten. HPLC-Aufreinigung (CH₃CN, H₂O, 0,1 % TFA) ergab einen flauschigen weißen Feststoff als Titelverbindung (35 mg, 45 %), MS (Elektronenspray) 577 (M + 1).
Beispiel 41 Herstellung von Benzylsulfonyl-D-serin-L-alanin-4-guanidinobenzylamid (7-6)
Eine Lösung von Benzylsulfonyl-D-serin-L-alanin-(4-(N-tert-butoxycarbonyl-guanidino) benzylamid (7-5) (9,0 mg, 0,016 mmol) in einem Gemisch aus CH₂Cl₂/TFA (1:1, 600 μl) wurde bei Raumtemperatur für 90 Minuten gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, um ein transparentes Öl zu erhalten. HPLC-Reinigung (CH₃CN, H₂O, 0,1 % TFA) ergab einen flauschigen weißen Feststoff als Titelverbindung (5,0 mg, 66 %), MS (Elektronenspray) 477 (M + 1).
Beispiel 42 Herstellung von 3-Trifluoracetamidomethylanilin (8-2)
3-Nitrobenzylamin (8-1) (3,0 g, 16 mmol) wurde portionsweise zu gerührtem Trifluoressigsäureanhydrid (30 ml) hinzugegeben, während das Gemisch auf Eis gekühlt wurde, und das Gemisch wurde über Nacht gerührt. Die Suspension wurde auf Eis gegossen (etwa 200 g) und die trübe Suspension wurde mit CH₂Cl₂ extrahiert (2 × 100 ml), über Na₂SO₄ getrocknet und das Lösungsmittel wurde entfernt, um ein transparentes Öl zu erhalten. Dieses Öl wurde in einem Parr-Kolben mit Pd/C (10 %, 300 mg) in MeOH (30 ml) über Nacht geschüttelt. Der Feststoff wurde durch Filtration entfernt und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, um einen weißen Feststoff zu erhalten, welcher der Titelverbindung entspricht (3,3 g, 95 %).
Beispiel 43 Herstellung von N[(3-Trifluoracetamidomethyl)phenyl]-N'-N''-bis(tert-butoxycarbonyl) guanidin (8-3)
3-Trifluoracetamidomethylanilin (8-2) (das Produkt aus Beispiel 42) (500 mg, 2,29 mmol) wurde zu einem gerührten Gemisch von N-N'-Di-Boc-N''-trifluormethansulfonyl-guanidin (hergestellt gemäß dem in J. Org. chem. 1998, 63, 3804-3805) beschriebenen Verfahren (986 mg, 2,52 mmol), TEA (642 μl, 4,58 mmol) in CH₂Cl₂ (10 ml) hinzugegeben und das Gemisch wurde für 24 Stunden gerührt. Das Gemisch wurde mit HCl (1 M, 10 ml), Salzwasser (10 ml) gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, um einen Feststoff zu erhalten. Säulenchromatographie (CH₂Cl₂/MeOH, 98:2) ergab einen weißen Feststoff, welcher der Titelverbindung entspricht (479 mg, 55 %). MS (Elektronenspray) 461 (M + 1).
Beispiel 44 Herstellung von N-[(3-Aminomethyl)phenyl]-N'-tert-butoxycarbonylguanidin (8-4)
Kaliumcarbonat (1,0 g) wurde zu einer gerührten Lösung von N-[(3-Trifluoracetamidomethyl)phenyl]-N'-N''-bis(tert-butoxycarbonyl)guanidin (8-3) (das Produkt aus Beispiel 43) (450 mg, 0,978 mmol) in H₂O/MeOH (1:1, 4 ml) hinzugefügt und das Gemisch wurde über Nacht gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der verbleibende Rückstand wurde in H₂O (10 ml) gelöst und mit CH₂Cl₂/MeOH extrahiert (9:1, 3 × 10 ml). Die organischen Schichten wurden mit Na₂SO₄ getrocknet und im Vakuum entfernt, um einen weißen Feststoff zu erhalten, welcher der Titelverbindung entspricht (232 mg, 90 %).
Beispiel 45 Herstellung von Benzylsulfonyl-D-serin-L-alanin-3-guanidinobenzylamid (8-5)
Eine Lösung von N-[(3-Aminomethyl)phenyl]-N'-tert-butoxycarbonylguanidin (8-4) (das Produkt aus Beispiel 44) (130 mg, 0,492 mmol), Benzylsulfonyl-D-serin-L-alanincarboxylat (190 mg, 0,492 mmol), HATU (380 mg, 0,739 mmol), HORT (136 mg, 0,739 mmol) und DIEA (258 μl, 1,48 mmol) in Acetonitril (2,0 ml) wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Die Lösung wurde mit EtOAc verdünnt (20 ml), mit HCl (1 M, 10 ml), NaHCO₃ (gesättigt, 10 ml), Salzwasser (10 ml) gewaschen und im Vakuum entfernt, um ein Öl zu erhalten. Das Öl wurde mit einem Gemisch aus CH₂Cl₂/TFA (1:1, 3 ml) behandelt und bei Raumtemperatur für 2 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, um ein transparentes Öl zu erhalten. HPLC-Reinigung (CH₃CN, H₂O, 0,1 % TFA) ergab einen flauschigen weißen Feststoff als Titelverbindung (80 mg, 34 %), MS (Elektronenspray) 477 (M + 1).
Beispiel 46 Herstellung von 2-Nitro-5-(4-trifluoracetamidomethyl)-thiophen (9-2)
2-Aminomethylthiophen (9-1) (5,0 g, 44 mmol) wurde portionsweise zu gerührtem Trifluoressigsäureanhydrid (20 ml) hinzugefügt, während das Gemisch auf Eis gekühlt wurde, und das Gemisch wurde für eine Stunde gerührt. Zu dieser Lösung wurde KNO₃ (8,9 g, 88 mmol) portionsweise bei –20 °C hinzugefügt. Die homogene Lösung wurde auf Raumtemperatur erwärmt und über Nacht gerührt. Die resultierende Suspension wurde auf Eis geschüttet (ungefähr 200 g) und mit CH₂Cl₂ extrahiert (2 × 100 ml), über Na₂SO₄ getrocknet und das Lösungsmittel wurde entfernt, um einen Feststoff zu erhalten. Säulenchromatographie (CH₂Cl₂) ergab einen weißen Feststoff, welcher der Titelverbindung entspricht (3,3 g, 29 %), MS (Elektronenspray): 255 (M + 1).
Beispiel 47 Herstellung von N-[2-(5-Trifluoracetamidomethyl)thiophenyl]-N'-N''-(bis-tert-butoxycarbonyl) guanidin (9-3)
2-Nitro-5-(4-trifluoracetamidomethyl)-thiophen (9-2) (1,0 g, 3,9 mmol) wurde zu einer gesättigten Lösung von HCl in MeOH bei 0 °C hinzugefügt. SnCl₂ (4,4 g) wurde portionsweise innerhalb von 15 Minuten hinzugefügt und das Gemisch wurde für 30 Minuten gerührt. Die Lösung wurde aufkonzentriert und dann mit NaHCO₃ (10 ml) verdünnt. Diese Lösung wurde mit CH₂Cl₂ (2 × 20 ml) extrahiert, über Na₂SO₄ getrocknet und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, um 2-Amino-5-(4-trifluoracetamidomethyl)-thiophen als gelbes Öl zu erhalten (> 95 % rein gemäß NMR, 0,80 g, 95 %). Diese Verbindung wurde unmittelbar ohne weitere Aufreinigung im nächsten Schritt angesetzt.
2-Amino-5-(4-trifluoracetamidomethyl)-thiophen (0,80 g, 3,6 mmol) wurde zu einer gerührten Lösung von N-N'-Di-Boc-N''-trifluormethansulfonyl-guanidin (1,5 g, 3,8 mmol) und TEA (1,1 ml, 7,8 mmol) in CH₂Cl₂ (20 ml) hinzugefügt. Das Gemisch wurde für 24 Stunden gerührt. Das Gemisch wurde mit CH₂Cl₂ verdünnt (20 ml) und mit HCl (1 M, 20 ml), Salzwasser (20 ml) gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, um ein Öl zu erhalten. Säulenchromatographie (CH₂Cl₂/MeOH, 98:2) ergab ein Öl, welches der Titelverbindung entspricht (9-3) (150 mg, 9 %), MS (Elektronenspray): 467 (M + 1).
Beispiel 48 Herstellung von N-[5-(4-Aminomethyl)thiophenyl]-N'-(tert-butoxycarbonyl)guanidin (9-4)
Kaliumcarbonat (500 mg) wurde zu einer gerührten Lösung von N-[2-(5-trifluoracetamidomethyl)thiophenyl]-N'-N''-(bis-tert-butoxycarbonyl)guanidin (9-3) (150 mg, 0,322 mmol) in H₂O/MeOH (1:1, 4 ml) hinzugefügt und das Gemisch wurde über Nacht gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Der verbleibende Rückstand wurde in H₂O (10 ml) gelöst und mit CH₂Cl₂/MeOH (95:5, 3 × 10 ml) extrahiert. Die organischen Schichten wurden über Na₂SO₄ getrocknet. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, um einen gelben Feststoff zu erhalten, welcher der Titelverbindung entspricht (150 mg, 68 %).
Beispiel 49 Benzylsulfonyl-D-serin-L-Alanin-[5-(2-guanidino)thiophenl (9-5)
Eine Lösung von N-[5-(4-Aminomethyl)thiophenyl]-N'-(tert-butoxycarbonyl)guanidin (9-4) (77 mg, 0,29 mmol), Benzylsulfonyl-D-serin-L-alanincarboxylat (110 mg, 0,285 mmol), HATU (162 mg, 0,427 mmol), HORT (58 mg, 0,42 mmol) und DIEA (199 μl, 1,13 mmol) in Acetonitril (3,0 ml) wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Die Lösung wurde mit EtOAc verdünnt (20 ml), mit HCl (1 M, 10 ml), NaHCO₃ (gesättigt, 10 ml) und Salzwasser (10 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde über Na₂SO₄ getrocknet und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, um ein Öl zu erhalten. Zu diesem Öl wurde TFA/CH₂Cl₂ hinzugefügt (1:1, 2 ml); das Gemisch wurde für 3 Stunden gerührt. HPLC-Aufreinigung (CH₃CN, H₂O, 0,1 % THF) ergab einen flauschigen weißen Feststoff, welcher der Titelverbindung entspricht (3 mg), MS (Elektronenspray): 483 (M + 1).
Beispiel 50 Herstellung von 6-Brommethylnicotinonitril (11-2)
Zu einer Lösung von 6-Methylnicotinonitril (11-1) (Lancaster) (15 g, 127 mmol) in Kohlenstofftetrachlorid (300 ml) wurde N-Bromsuccinimid (27,12 g, 152,4 mmol) hinzugefügt. Die resultierende Lösung wurde entgast und mit Stickstoff gesättigt und AIBN (2,2'-Azobisisobutyronitril) (2,08 g, 12,6 mmol) wurde hinzugefügt. Nach 7 Stunden bei 85 °C wurde eine weitere Menge AIBN (1,04 g) hinzugefügt und es wurde für eine weitere Stunde gerührt. Nach Entfernung des Lösungsmittels wurde das Rohprodukt Flashsäulenchromatographie in Ethylacetat/Hexane unterzogen, um 10 g reines Material (40 %) zu erhalten.
Beispiel 51 Herstellung von 6-Azidomethylnicotinonitril (11-3)
Zu einer Lösung von 6-Brommethylnicotinonitril (11-2) (8,0 g, 40,6 mmol) in DMF (100 ml) wurde Natriumazid (3,17 g, 48,8 mmol) hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit 400 ml Diethylether und 100 ml Wasser verdünnt und die Schichten wurden getrennt. Die wässrige Schicht wurde erneut mit Diethylether extrahiert (2 × 100 ml). Die vereinigten Etherextrakte wurden mit Salzwasser gewaschen (2 × 100 ml) und dann über MgSO₄ getrocknet und filtriert, um 6,53 g Produkt als weißen Feststoff zu erhalten.
Beispiel 52 Herstellung von 3-Hydroxyamidino-6-azidomethylpyridin (11-4)
Zu einer Lösung des Azids aus Beispiel 51 (11-3) (6,46 g, 40,6 mmol) in Methanol (100 ml) wurde Hydroxylamin-hydrochlorid (3,95 g, 56,84 mmol) und anschließend Triethylamin (9,6 ml) hinzugefügt. Die Lösung wurde für vier Stunden auf 65 °C erhitzt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt und der verbleibende Rückstand wurde mit Ethylacetat (300 ml) und Wasser (100 ml) extrahiert. Die Wasserschicht wurde erneut mit Ethylacetat extrahiert (2 × 200 ml). Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Salzwasser gewaschen (2 × 100 ml), über MgSO₄ getrocknet und eingedampft, um das Titelprodukt zu erhalten (11-4) (7,8 g).
Beispiel 53 Herstellung von 3-Hydroxyamidino-6-aminomethylpyridin (11-5)
Zu einer Lösung des Azids (11-4) aus Beispiel 52 in THF/Wasser (80 ml/5 ml) (7,8 g, 40,6 mmol) wurde Triphenylphosphin (12,8 g, 48,72 mmol) hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde bis zur Trockene entfernt und der verbleibende Rückstand wurde mit 100 ml 1 N HCl und 100 ml Wasser verdünnt. Die wässrige Schicht wurde mehrmals mit Dichlormethan extrahiert. Die wässrige Schicht wurde basisch gemacht (pH ~9) mit einem alkalischen Harz (Bio Rad AG 1-X8). Das Harz wurde abfiltriert und sorgfältig mit Wasser gewaschen. Die vereinigten Waschlösungen wurden unter vermindertem Druck getrocknet, um einen weißen Feststoff zu erhalten (6,60 g).
Beispiel 54 Herstellung von 3-Hydroxyamidino-6-aminomethyl(Boc)pyridin (11-6)
Zu einer Lösung des Produkts aus Beispiel 53 (11-5) (0,5 g, 3,01 mmol) in Dioxan und Wasser (jeweils 6 ml) wurde Kaliumcarbonat hinzugefügt (832 mg, 6,02 mmol) und anschließend Boc-Anhydrid (0,66 g, 3,01 mmol). Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde aufkonzentriert und der verbleibende Rückstand wurde in Ethylacetat gelöst und mit Natriumbicarbonat (gesättigt) und Salzwasser gewaschen. Die organische Schicht wurde über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und aufkonzentriert. Flashsäulenchromatographie in 8/2 Ethylacetat/Hexane, gefolgt von Ethylacetat und 9/1 Dichlormethan/Methanol ergab 0,43 g Produkt als weißen Feststoff. NMR δ (ppm) CDCl₃: 8,8 (d, 1H), 7,9 (dd, 1H), 7,3 (d, 1H), 6,6 (bs, 1H), 5,5 (bs, 1H), 4,8 (bs, 1H), 4,4 (d, 2H), 1,4 (s, 9H).
Beispiel 55 Herstellung von 3-Isopropyloxyamidino-6-aminomethyl(Boc)pyridin (11-7)
Zu einer Lösung des Produkts aus Beispiel 54 (11-6) (0,43 g, 1,39 mmol) in Dimethylformamid (5 ml) wurde 2-Iodpropan (210 μl, 2,1 mmol) und anschließend Cäsiumcarbonat (0,68 g, 2,1 mmol) hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Ethylacetat verdünnt und mit Natriumbicarbonat (gesättigt) gewaschen. Die organische Schicht wurde über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und aufkonzentriert, um ein orangefarbenes Öl zu erhalten. Flashsäulenchromatographie in 1/1 Ethylacetat/Hexan und anschließend Ethylacetat ergab 229 mg (53 %) Produkt als kristallinen Feststoff. NMR δ (ppm) CDCl₃: 8,8 (d, 1H), 7,9 (dd, 1H), 7,3 (d, 1H), 5,5 (bs, 1H), 4,7 (bs, 2H), 4,4 (d, 1H), 1,4 (s, 9H), 1,3 (d, 6H).
Beispiel 56 Herstellung von Boc-Ala-3-isopropyloxyamidino-6-aminomethylpyridin (11-8)
Die Verbindung aus Beispiel 55 (11-7) (229 mg, 0,74 mmol) wurde in Dioxan (1 ml) gelöst und mit einer Lösung von 4 N HCl in Dioxan (1 ml) für eine Stunde bei Raumtemperatur behandelt. Die Entfernung des Lösungsmittels unter vermindertem Druck ergab 290 mg eines weißen Feststoffs. Das Produkt wurde dann in Acetonitril gelöst (4,12 ml), mit Diisopropylethylamin neutralisiert (538 μl, 3,09 mmol) und an Boc-Alanin gekoppelt (195 mg, 1,03 mmol) unter Verwendung von EDC (197 mg, 1,03 mmol) und HOBt (157,6 mg, 1,03 mmol) als Kopplungsreagenzien. Nach Rühren über Nacht bei Raumtemperatur wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt und der verbleibende Rückstand wurde in Ethylacetat verdünnt. Die organische Schicht wurde mehrmals mit Natriumbicarbonat (gesättigt) und Salzwasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und aufkonzentriert zu einem gelblichen Öl. Flashsäulenchromatographie in 9/1 Ethylacetat/Hexan und anschließend Ethylacetat ergab 181 mg eines weißen Öls (46 %). NMR δ (ppm) CDCl₃: 8,7 (d, 1H), 7,9 (dd, 1H), 7,3 (d, 1H), 7,1 (bs, 1H), 5,0 (bs, 1H), 4,7 (bs, 2H), 4,6 (d, 2H), 4,3 (m, 1H), 4,1 (m, 1H), 1,4 (s, 9H), 1,39 (d, 3H), 1,3 (d, 6H).
Beispiel 57 Herstellung von Benzysulfonyl-dSer(tBu)-Ala-3-isopropyloxyamidino-6-amino-methylpyridine (11-9)
Die Verbindung aus Beispiel 56 (11-8) (181 mg, 0,48 mmol) wurde in Dioxan gelöst (1 ml) und mit 4 N HCl in Dioxan (1 ml) für 1,5 Stunden bei Raumtemperatur behandelt. Die Entfernung des Lösungsmittels unter vermindertem Druck ergab 200 mg eines weißen Feststoffs. Das Produkt wurde dann in Acetonitril gelöst (5 ml), mit Diisopropylethylamin neutralisiert (298 μl, 1,71 mmol) und an BnSO₂-dSer(tBu)-OH (180 mg, 0,57 mmol) gekoppelt, unter Verwendung von EDC (109 mg, 0,57 mmol) und HOBt (96 mg, 0,63 mmol) als Kopplungsreagenzien. Nach Rühren über Nacht bei Raumtemperatur wurde das Lösungsmittel entfernt unter vermindertem Druck und der verbleibende Rückstand wurde in Ethylacetat verdünnt. Die organische Schicht wurde mehrmals mit Natriumbicarbonat (gesättigt) und Salzwasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und aufkonzentriert, um einen Feststoff zu erhalten (250 mg, 76 %). Das Produkt eluierte nach 11,5 Minuten bei Reversphasen (C18)-HPLC mit 0,1 % Trifluoressigsäure in 5-75 % wässrigem Acetonitril über 20 Minuten. MS (Elektronenspray): 577 (M + 1).
Beispiel 58 Herstellung von Benzylsulfonyl-dSer-Ala-3-isopropyloxyamidino-6-aminomethylpyridin (11-10)
Die Verbindung aus Beispiel 57 (11-9) (137 mg, 0,24 mmol) wurde mit jeweils 2 ml Dichlormethan und Trifluoressigsäure für eine Stunde bei Raumtemperatur behandelt. Die Entfernung des Lösungsmittels unter vermindertem Druck ergab 169 mg eines orangefarbenen Öls. Das Produkt eluierte nach 9 Minuten bei Reversphasen (C18) HPLC mit 0,1 % Trifluoressigsäure in 5-90 % wässrigem Acetonitril über 20 Minuten.
Beispiel 59 Herstellung von Benzylsulfonyl-dSer-Ala-3-amidino-6-aminomethylpyridin (11-11)
Das Produkt aus Beispiel 58 (11-10) (74 mg, 0,14 mmol) in Wasser (8 ml) und Essigsäure (0,8 ml) wurde mit aktiviertem Zinkstaub (91 mg) für 45 Minuten behandelt. Die Lösung wurde filtriert und das Filtrat wurde einer Reinigung durch Reversphasen-HPLC (C18) unterzogen. Das Produkt eluierte nach 11 Minuten bei Reversphasen-HPLC mit 0,1 % Trifluoressigsäure in 5-25 % wässrigem Acetonitril über 20 Minuten. MS (Elektronenspray): 463 (M + 1).
B. Syntheserouten für bestimmte Zwischenverbindungen

(i) Die Beispiele 60 bis 97 beschreiben die Synthese bestimmter Intermediate, die bei der Herstellung von erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet werden. Siehe auch 1 bis 5.

Beispiel 60 Herstellung der Synthese von D-Ser(O-t-Bu)-Ala-OMe, Acetatsalz (1-3)
N-α-Cbz-D-serin (1-1) (Bachem, 4,97 g, 16,8 mmol), Alaninmethylester-Hydrochloridsalz (1-2) (Novabiochem, 4,7 g, 33,7 mmol), EDC (6,5 g, 33,7 mmol) und 1-Hydroxybenzotriazol (2,6 g, 16,8 mmol) wurden kombiniert und Acetonitril (67 ml) wurde hinzugefügt. Nach Rühren als Aufschlämmung für 10 Minuten wurde Diisopropylethylamin (14,4 ml, 84 mmol) hinzugefügt und das resultierende klare Gemisch wurde für weitere 18 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand wurde in Ethylacetat (500 ml) suspendiert. Die Lösung wurde mit 0,5 M HCl gewaschen (2 × 100 ml) und anschließend mit gesättigtem Natriumbicarbonat (2 × 100 ml) und Salzwasser (100 ml). Die organische Schicht wurde dann mit Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, um Cbz-D-Ser(O-t-Bu)-Ala-OMe in quantitativer Ausbeute als einzelnen Peak zu erhalten, bei Reversphasen (C18)-HPLC t_R = 16,9 mit 0,1 % Trifluoressigsäure in 5-75 % wässrigem Acetonitril über 20 Minuten.
Cbz-D-Ser(O-t-Bu)-Ala-OMe wurde dann in Ethanol/Essigsäure/Wasser gelöst (150 ml eines 4:1:1-Gemischs). Der Kolben wurde mit Stickstoff gefüllt und 10 % Palladium auf Kohle (1,5 g) wurde hinzugefügt. Dieses Gemisch wurde bei 45 psi für 2 Stunden hydriert. Der Palladiumkatalysator wurde abfiltriert und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt, um 4,58 g der Titelverbindung in einer 95 %-igen Ausbeute als einzelnen Peak zu erhalten, bei Reversphasen (C18)-HPLC (t_R = 8,0 Minuten mit 0,1 % Trifluoressigsäure in 5-75 % wässrigem Acetonitril über 20 Minuten) und MS (M+H = 247,2).
Beispiel 61 Herstellung von Benzylsulfonyl-D-Ser(O-t-Bu)-Ala-OMe (1-4)
Zu einer gerührten Aufschlämmung der Verbindung aus Beispiel 60 (1-3) (1,0 g, 3,3 mmol) in Acetonitril (13 ml) wurde Benzylsulfonylchlorid (0,87 g, 4,9 mmol) hinzugefügt. Zu diesem Gemisch wurde Diisopropylethylamin (1,67 ml, 9,8 mmol) in fünf Portionen über einen Zeitraum von 1 Stunde hinzugefügt. Man ließ das Gemisch für eine weitere Stunde rühren. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand wurde in Ethylacetat suspendiert (100 ml). Die Lösung wurde mit 0,5 M HCl gewaschen (2 × 10 ml) und anschließend mit gesättigtem Natriumbicarbonat (2 × 10 ml) und Salzwasser (1 × 10 ml). Die organische Schicht wurde dann mit Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde durch Flashchromatographie aufgereinigt, wobei mit 50 % Hexane/Ethylacetat eluiert wurde und 0,54 g, 1,4 mmol Produkt in einer 43 %-igen Ausbeute erhalten wurden. Das Produkt war ein einzelner Peak bei Reversphasen (C18)-HPLC (t_R = 20,2 Minuten mit 0,1 % Trifluoressigsäure in 5-75 % wässrigem Acetonitril über 20 Minuten). ¹H-NMR(CD₃OD): 7,5-7,9 ppm (m, 5H), 4,3 ppm (q, 1H), 3,9 ppm (t, 1H), 3,7 (s, 3H), 3,4 ppm (m, 1H), 3,5 ppm (m, 1H), 1,3 ppm (d, 3H), 1,05 ppm (s, 9H).
Beispiel 62 Herstellung von Benzylsulfonyl-D-Ser(O-t-Bu)-Ala-OH (1-5)
Zu der Verbindung aus Beispiel 61 (1-4) (0,53 g, 1,4 mmol) in Methanol (9 ml) wurde 1,0 M Lithiumhydroxid (3,0 ml, 3 mmol) hinzugefügt. Nach Rühren für 18 Stunden wurde das Reaktionsgemisch über eine Säule von 10 ml DOWEX (50 X 8-400)-Ionenaustauschharz gegossen und mit Methanol/Wasser eluiert (60 ml eines 1:1-Gemischs). Das Methanol wurde unter vermindertem Druck abgepumpt und das verbleibende Wasser wurde lyophilisiert, was 0,49 g, 1,3 mmol (95 %) der Titelverbindung als einzelnen Peak ergab, bei Reversphasen (C18)-HPLC (t_R = 13,5 Minuten mit 0,1 % Trifluoressigsäure in 5-75 % wässrigem Acetonitril über 20 Minuten). ¹H-NMR(CD₃OD): 7,9 ppm (d, 2H), 7,6 ppm (t, 1H), 7,5 ppm (t, 2H), 4,25 ppm (q, 1H), 3,9 ppm (t, 1H), 3,5 ppm (m, 1H), 3,4 ppm (m, 1H), 1,3 ppm (d, 3H), 1,075 ppm (s, 9H).
Beispiel 63 Herstellung von Benzylsulfonyl-D-Ser(O-t-Bu)-OMe
Zu einer gerührten Lösung von D-Serin(O-t-Bu)methylester-Hydrochloridsalz (2,07 g, 9.8 mmol) in Acetonitril (39 ml) wurde α-Toluolsulfonylchlorid (1,86 g, 9,8 mmol) hinzugefügt. Zu diesem Gemisch wurde Diisopropylethylamin (3,7 ml, 21,5 mmol) in fünf Portionen über einen Zeitraum von 1 Stunde hinzugefügt. Man ließ das Gemisch für eine weitere Stunde rühren. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand wurde in Ethylacetat suspendiert (100 ml). Die Lösung wurde mit 0,5 M HCl gewaschen (2 × 10 ml) und anschließend mit gesättigtem Natriumbicarbonat (2 × 10 ml) und Salzwasser (1 × 10 ml). Die organische Schicht wurde mit Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, um 2,84 g der Titelverbindung in 88 %-iger Ausbeute zu erhalten. R_f = 0,4 (4:1 Ethylacetat:Hexane).
Beispiel 64 Herstellung von Benzylsulfonyl-D-Ser(O-t-Bu)-OH
Zu einer gerührten Lösung der Verbindung aus Beispiel 63 (2,66 g, 8,1 mmol) in Methanol (54 ml) wurde 1,0 M Lithiumhydroxid (17,8 ml, 17,8 mmol) hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde für 18 Stunden gerührt, dann auf eine Säule von 10 ml DOWEX (50 X 8-400)-Ionenaustauschharz gegossen und mit Methanol:Wasser (60 ml eines 1:1-Gemischs) eluiert. Das Methanol wurde unter vermindertem Druck entfernt und die verbleibende wässrige Lösung wurde lyophilisiert, um 2,47 g der Titelverbindung in 97 %-iger Ausbeute zu erhalten. t_R = 14,8 Minuten (0,1 % Trifluoressigsäure in 5-75 % wässrigem Acetonitril über 20 Minuten).
Beispiel 65 Herstellung von Benzylsulfonyl-D-Ser(O-t-Bu)-Ala-OMe
Die Verbindung aus Beispiel 64 (1,0 g, 3,2 mmol), Alaninmethylester-Hydrochloridsalz (Novabiochem, 0,89 g, 6,3 mmol), EDC (1,22 g, 6,3 mmol) und 1-Hydroxybenzotriazol (0,49 g, 3,2 mmol) wurden vereinigt und Acetonitril (13 ml) wurde hinzugefügt. Nach Rühren der resultierenden Aufschlämmung für 10 Minuten wurde Diisopropylethylamin (2,71 ml, 15,8 mmol) hinzugefügt und das resultierende klare Gemisch wurde für weitere 18 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand wurde in Ethylacetat (100 ml) suspendiert. Die Lösung wurde mit 0,5 M HCl (2 × 10 ml) gewaschen und anschließend mit gesättigtem Natriumbicarbonat (2 × 10 ml) und Salzwasser (1 × 10 ml). Die organische Schicht wurde dann mit Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, um 1,22 g der Titelverbindung in 97 %-iger Ausbeute zu erhalten. t_R = 16,2 Minuten (0,1 % Trifluoressigsäure in 5-75 % wässrigem Acetonitril über 20 Minuten).
Beispiel 66 Herstellung von Benzylsulfonyl-D-Ser(O-t-Bu)-Ala-OH
Zu der Verbindung aus Beispiel 65 (1,22 g, 3,1 mmol) in Methanol (22 ml) wurde 1 M Lithiumhydroxid (7,2 ml, 7,2 mmol) hinzugefügt. Nach Rühren für 18 Stunden wurde das Reaktionsgemisch auf eine Säule von 10 ml DOWEX (50 X 8-400)-Ionenaustauschharz gegossen und mit Methanol:Wasser (60 ml eines 1:1-Gemischs) eluiert. Das Methanol wurde unter vermindertem Druck entfernt und die wässrige Lösung wurde lyophilisiert, um 1,16 g der Titelverbindung in 91 %-iger Ausbeute zu erhalten. t_R = 13,2 Minutes (0,1 % Trifluoressigsäure in 5-75 % wässrigem Acetonitril über 20 Minuten).
Beispiel 67 Herstellung von i-Butoxycarbonyl-D-Ser(O-t-Bu)-OMe
Zu einer gerührten homogenen Lösung von HCl-D-Ser(O-t-Bu)-OMe (15 g, 71 mmol, Bachem) in Tetrahydrofuran (200 ml) wurde gesättigtes Natriumbicarbonat hinzugefügt (80 ml), anschließend Isobutylchlorformiat (19,45 g, 142 mmol). Die Schichten wurden getrennt und die wässrige Schicht wurde mit Ethylacetat gewaschen (50 ml). Die organischen Phasen wurden vereinigt und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde in Ethylacetat suspendiert (100 ml) und mit 1 M HCl (100 ml), gesättigtem Natriumbicarbonat (100 ml) und Salzwasser (100 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde mit Magnesiumsulfat getrocknet, mit Bleichkohle behandelt (decolorizing charcoal, unter diesem Handelsnamen von Darco erhältlich), filtriert und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt, wobei eine quantitative Ausbeute der Titelverbindung erhalten wurde. R_f = 0,3 (20 % Ethylacetat/Hexane).
Beispiel 68 Herstellung von i-Butoxycarbonyl-D-Ser(O-t-Bu)-OH
Zu einer gerührten Lösung der Verbindung aus Beispiel 67 (19,51 g, 70 mmol) in Tetrahydrofuran (78 ml) wurde Lithiumhydroxid (78 mmol, 3,28 g) hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde für 3 Stunden heftig gerührt, bis gemäß DSC (20 % Ethylacetat/Hexane) kein weiteres Ausgangsmaterial mehr beobachtet werden konnte. Die Lösung wurde angesäuert mit konzentrierter HCl auf pH 2 und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Das Rohprodukt wurde in Ethylacetat suspendiert und mit gesättigtem Natriumbicarbonat extrahiert (2 × 75 ml). Die vereinigten Natriumbicarbonat-Waschlösungen wurden mit 6 M HCl angesäuert und das Öl, welches sich abtrennte, wurde mit Ethylacetat extrahiert (2 × 100 ml). Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Magnesiumsulfat getrocknet, mit Darco behandelt, filtriert und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt, um eine quantitative Ausbeute der Titelverbindung zu erhalten. R_f = 0,01 (20 % Ethylacetat in Hexane).
Beispiel 69 Herstellung von i-Butoxycarbonyl-D-Ser(O-t-Bu)-Ala-OMe
Zu einer Lösung der Verbindung aus Beispiel 68 (16,5 g, 63 mmol), HCl-Ala-OMe (10,6 g, 76 mmol), 1-Hydroxybenzotriazol (10,2 g, 76 mmol) und EDC (16,33 g, 85 mmol) in Acetonitril (280 ml) bei 0 °C wurde 4-Methylmorpholin (35 ml, 315 mmol) hinzugefügt. Dieses Gemisch wurde für 1 Stunde bei 0 °C, dann bei Raumtemperatur für 72 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt und der resultierende Rückstand wurde in Ethylacetat (300 ml) und 1 M HCl (350 ml) suspendiert. Die wässrige Schicht wurde abgetrennt und mit Ethylacetat gewaschen (300 ml). Die vereinigten Ethylacetatschichten wurden vereinigt und mit 1 M HCl (300 ml), gesättigtem Natriumbicarbonat (400 ml) und Salzwasser (200 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde mit Magnesiumsulfat getrocknet, mit Darco-Bleichkohle behandelt und filtriert. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt, was zu 21,48 g der Titelverbindung (98 % Ausbeute) führte.
Beispiel 70 Herstellung von i-Butoxycarbonyl-D-Ser-Ala-OH
Die Verbindung aus Beispiel 69 (21 g, 58 mmol) wurde in Trifluoressigsäure gelöst (110 ml); das resultierende Gemisch wurde für 35 Minuten gerührt. Die Lösung wurde in einem Eisbad gekühlt, gesättigtes Natriumbicarbonat (630 ml) wurde hinzugefügt und anschließend festes Natriumbicarbonat (70 g) innerhalb von 45 Minuten bis zu pH = 7. Die wässrige Lösung wurde mit Ethylacetat extrahiert (3 × 250 ml). Die vereinigten organischen Extrakte wurden vereinigt, mit Magnesiumsulfat getrocknet, mit Darco-Bleichkohle behandelt und filtriert. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, wobei eine quantitative Ausbeute an i-Butoxycarbonyl-D-Ser-Ala-OMe erhalten wurde.
Zu einer gerührten Lösung des rohen Rückstands in Tetrahydrofuran (68 ml) wurde Lithiumhydroxid (2,7 g, 64 mmol, 1,1 eq.) in Wasser (17 ml) hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde für 0,5 Stunden heftig gerührt, bis kein weiteres Ausgangsmaterial gemäß DSC (9:1 Dichlormethan/Isopropanol) beobachtet wurde. Die Lösung wurde mit 6 M HCl (13 ml) auf pH 2 angesäuert und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Das Rohprodukt wurde in Ethylacetat (400 ml) und Wasser (50 ml) suspendiert. Die wässrige Schicht wurde mit Ethylacetat extrahiert (200 ml). Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, was 13,94 g der Titelverbindung ergab (86 % Ausbeute). R_f = 0,3 (90:30:5 Chloroform/Methanol/Essigsäure).
Beispiel 71 Herstellung von N-α-(3-Phenylpropyl)-D-serin-t-butylethermethylester
Serin-O-t-butylethermethylester (1,50 g, 7,1 mmol), Hydrozimtaldehyd (1,40 ml, 10,6 mmol) und Triethylamin (1,18 ml, 8,5 mmol) wurden in Tetrahydrofuran (70 ml) für 4 Stunden refluxiert. Nachdem die Lösung auf Raumtemperatur abgekühlt war, wurde Natriumborhydrid (0,46 g, 12 mmol) in zwei Portionen zu der gerührten Lösung hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten gerührt; die Lösung wurde unter vermindertem Druck aufkonzentriert. Der Rückstand wurde zwischen Ethylacetat 1,0 M HCl partitioniert. Die organische Schicht wurde mit 1,0 N HCl gewaschen. Die wässrige Schicht wurde mit 40 % NaOH auf basischen pH = 10 gebracht, dann mit Ethylacetat extrahiert (2X). Die vereinigten organischen Schichten wurden über Natriumsulfat getrocknet; das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde durch Flashchromatographie an Silicagel aufgereinigt (1 × 6 Inch-Säule), wobei mit 10-30 % Ethylacetat/Hexane eluiert wurde, um 150 mg (7 % Ausbeute) der Titelverbindung zu erhalten. R_f = 0,60 (50 % Ethylacetat/Hexane).
Beispiel 72 Herstellung von N-α-t-Butoxycarbonyl-N-α-(3-phenylpropyl)-D-serin-t-butylethermethylester
Die Verbindung aus Beispiel 71 (150 mg, 0,51 mmol), Di-t-butyldicarbonat (167 mg, 0,77 mmol) und Diisopropylethylamin (0,13 ml, 0,77 mmol) wurden in Tetrahydrofuran (2 ml) bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter vermindertem Druck aufkonzentriert. Der Rückstand wurde mit Ethylacetat verdünnt (20 ml), nacheinander mit 1,0 N HCl (2X), gesättigtem Natriumbicarbonat (2X) und Salzwasser (1X) gewaschen. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, um 206 mg der Titelverbindung in quantitativer Ausbeute zu erhalten. R_f = 0,74 (50 % Ethylacetat/Hexane).
Beispiel 73 Herstellung von N-α-t-Butoxycarbonyl-N-a-(3-phenylpropyl)-D-serin-t-butylether
Zu einer Lösung der Verbindung aus Beispiel 72 (206 mg, 0,52 mmol) in Methanol (3,5 ml) wurde tropfenweise 1,0 N LiOH (0,63 ml, 0,63 mmol) hinzugefügt. Die Lösung trübte sich, wurde dann innerhalb von 5 Minuten homogen. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Weiteres 1,0 N LiOH (1,47 ml) wurde hinzugefügt. Nach 2 Stunden wurde weiteres 1,0 N LiOH (1,0 ml) hinzugefügt. Nachdem gemäß DSC (50 % Ethylacetat/Hexane) kein Ausgangsmaterial mehr beobachtet werden konnte, wurde das Reaktionsgemisch auf pH 4 angesäuert mit DOWEX (50 X 8-400)-Ionenaustauschharz. Die Lösung wurde filtriert, mit Methanol und dann Wasser gespült. Die Lösung wurde unter vermindertem Druck aufkonzentriert, dann lyophilisiert, um 189 mg der Titelverbindung in 95 %-iger Ausbeute als gelbes Öl zu erhalten. R_f = 0,04 (50 % Ethylacetat/Hexane).
Beispiel 74 Herstellung von i-Butoxycarbonyl-D-Ser(O-t-butyl)-OH (2-2)
Zu einer Lösung von D-Serin-O-t-butylether (2-1) (10,5 g, 65,3 mmol) in Wasser (51 ml) wurde Natriumcarbonat (20,1 g, 196,2 mmol) und anschließend Isobutylchlorformiat (9,8 ml, 75,2 mmol) hinzugefügt. Nach 3 Stunden trübte sich dieses Gemisch und es wurde für weitere 3 Stunden gerührt. Nach 6 Stunden wurde die Lösung mit 6 M HCl angesäuert (50 ml). Das Reaktionsgemisch wurde dann mit Ethylacetat extrahiert (3 × 200 ml). Nach der ursprünglichen Extraktion wurde die wässrige Schicht mit Natriumchlorid gesättigt und mit Ethylacetat extrahiert (2 × 200 ml). Die Ethylacetatschichten wurden vereinigt und mit Natriumsulfat getrocknet, anschließend wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt, woraufhin 17,0 g (99,5 % Ausbeute) der Titelverbindung als weißer Feststoff erhalten wurden. HPLC: t = 18,5 Minuten in einem 5 %- bis 75 %-igen Acetonitril-Gradienten in 0,1 % wässrigem TFA-Puffer auf einer 4,6 × 250 mm, 5 Mikrometer-Partikel, 100 Angstrom-Poren, C18-Säule bei einer Flussrate von 1 ml/Minute. NMR(CDCl₃) : 5,5ppm (m, 1H), 4,45 ppm (bs, 1H), 3,82-3,95 ppm (m, 3H), 3,52-3,6 ppm (m, 1H), 1,85-1,97 ppm (m, 1H), 1,2 ppm (s, 9H), 0,9 ppm (d, 6H).
Beispiel 75 Herstellung von i-Butoxycarbonyl-D-Ser(t-Bu)-L-Ala-O-t-Bu (2-3)
Eine Lösung der Verbindung aus Beispiel 74 (2-2) (10 g, 38,3 mmol), L-Alanin-t-butylester-HCl-Salz (10,43 g, 57,4 mmol), EDC (11,05 g, 57 mmol) und Hydroxybenzotriazol (5,85 g, 38,3 mmol) in Acetonitril (153 ml) wurde für 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Diisopropylethylamin (32,7 ml, 191 mmol) wurde hinzugefügt und das Reaktionsgemisch wurde für 18 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt; der resultierende Rückstand wurde in Ethylacetat (1000 ml) und 1 M HCl (100 ml) resuspendiert. Die Ethylacetatschicht wurde mit 0,5 M HCl (100 ml) gewaschen, mit Natriumbicarbonat gesättigt (2 × 100 ml) und Salzwasser (100 ml). Die Ethylacetatschicht wurde mit Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, was zu einer quantitativen Ausbeute der Titelverbindung führte. HPLC: t_r = 18,7 Minuten in einem 5 %- bis 90 %-igen Acetonitrilgradienten in 0,1 % wässrigem TFA-Puffer auf einer 4,6 × 250 mm, 5 Mikrometer-Partikel, 100 Angstrom-Poren, C18-Säule bei einer Flussrate von 1 ml/Minute. NMR(CDCl₃): 7,15 ppm (bs, 1H), 5,6 ppm (bs, 1H), 4,4-4,5 ppm (m, 1H), 4,2 ppm (bs, 1H), 3,87-3,95 ppm (m, 3H), 3,3-3,4 ppm (m, 1H), 1,85-1,95 ppm (m, 1H), 1,45 ppm (s, 9H), 1,39 ppm (d, 3H), 1,2 ppm (s, 9H), 0,9 ppm (d, 6H).
Beispiel 76 Herstellung von i-Butoxycarbonyl-D-Ser-L-Ala-OH (2-4)
Zu einer Lösung der Verbindung aus Beispiel 75 (2-3) (7,15 g, 18,4 mmol) in Dichlormethan (35 ml) wurde Trifluoressigsäure (35 ml) hinzugefügt. Dieses Gemisch wurde für zwei Stunden gerührt, dann wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Toluol wurde hinzugefügt und die Lösungsmittel wurden im Vakuum entfernt, um die Trifluoressigsäure zu entfernen. Eine quantitative Ausbeute der Titelverbindung als viskoses gelbes 01 wurde dann im nächsten Schritt eingesetzt. t_R = 10,5 Minuten in einem 5 %- bis 90 %-igen Acetonitril-Gradienten in 0,1 % wässrigem TFA-Puffer auf einer 4,6 × 250 mm, 5 Mikrometer-Partikel, 100 Angstrom-Poren, C18-Säule bei einer Flussrate von 1 ml/Minute.
Beispiel 77 Herstellung von 2-Cyano-5-methylthiophen (3-2)
Eine Lösung von 2-Brom-5-methylthiophen (3-1) (TCl chemicals, 5 g, 28 mmol) und Kupfer(I)cyanid (Aldrich, 2,53 g, 28 mmol) in DMF (10 ml) wurde für 4 Stunden unter Rückfluss erhitzt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurden Ethylacetat (500 ml) und eine 10 %-ige wässrige NaCN-Lösung (500 ml) hinzugefügt. Nach Trennung der wässrigen und organischen Schichten wurde die wässrige Schicht mit Ethylacetat extrahiert (300 ml). Die vereinigten organischen Schichten wurden zu einem 01 aufkonzentriert, welches durch Flashsäulenchromatographie (Ethylacetat) weiter aufgereinigt wurde, um die Titelverbindung zu erhalten (3,03 g, 87 %). DSC: Rf 0,30 (1:1 Hexan/Ethylacetat); ¹H-NMR (CDCl₃): δ 2,55 (m, 3H), 6,76 (d, 1H, J = 3,6 Hz), 7,42 (d, 1H, J = 3,6 Hz).
Beispiel 78 Herstellung von 2-Cyano-5-(brommethyl)thiophen (3-3)
Eine Lösung von 2-Cyano-5-methylthiophen (Verbindung 3-2, 3,0 g, 24 mmol), N-Bromsuccinimid (Aldrich, 4,8 g, 27 mmol) und 2,2'-Azobisisobutyronitril (Aldrich, 0,4 g, 2,4 mmol) in CCl₄ (Aldrich, 60 ml) wurde für 5 Stunden unter Rückfluss erhitzt. Nach Kühlen auf Raumtemperatur wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt, um ein gelbes Öl zu erhalten. Das Öl wurde durch Flashsäulenchromatographie aufgereinigt (1:1 Hexan/Ethylacetat), um die Titelverbindung zu erhalten (4,5 g, 91 %). DSC: R_f 0,91 (1:1 Hexan/Ethylacetat); ¹H-NMR (CDCl₃): δ 4,66 (s, 2H), 7,10 (d, 1H, J = 3,8 Hz), 7,48 (d, 1H, J = 3,8 Hz).
Beispiel 79 Herstellung von 2-Cyano-5-(azidomethyl)thiophen (3-4)
Eine Lösung von 2-Cyano-5-(brommethyl)thiophen (Verbindung 3-3, 3,5 g, 17,3 mmol) und Natriumazid (Aldrich, 1,7 g, 26 mmol) in DMF (Aldrich, 60 ml) wurde bei Raumtemperatur für 10 Stunden gerührt. Flashsäulenchromatographie (20 % Ethylacetat in Hexan) ergab die Titelverbindung (2,35 g, 83 %). DSC: R_f 0,48 (20 % Ethylacetat in Hexan); ¹H-NMR (CDCl₃): δ 4,56 (s, 2H), 7,01 (d, 1H, J = 3,7 Hz), 7,55 (d, 1H, J = 3,7 Hz).
Beispiel 80 Herstellung von 2-Cyano-5-(aminomethyl)thiophen (3-5)
Triphenylphosphin (Aldrich, 5,7 g) wurde zu einer Lösung von 2-Cyano-5-(azidomethyl) thiophen (Verbindung 3-4, 2,5 g, 10 mmol) in THF (Aldrich, 40 ml) und Wasser (10 ml) bei 0 °C hinzugefügt. Man ließ die Lösung auf Raumtemperatur erwärmen und es wurde bei Raumtemperatur für 10 Stunden gerührt. Aufreinigung durch RP-HPLC ergab die Titelverbindung (2,3 g, 94 %). MS (Elektronenspray): 139 (M + 1); ¹H-NMR (CDCl₃): δ 4,01 (s, 2H), 4,75 (br s, 2H, NH₂), 6,82 (d, 1H, J = 3,5 Hz), 7,08 (d, 1H, J = 3,5 Hz).
Beispiel 81 Herstellung von 2-Cyano-5-(t-butoxycarbonylaminomethyl)thiophen (3-6)
Kaliumcarbonat (Aldrich, 2 g) wurde zu einer Lösung von 2-Cyano-5-(aminomethyl) thiophen (Verbindung 3-5, 0,6 g, 4 mmol), Boc₂O (Fluka, 0,95 g, 4 mmol) in Wasser (4 ml) und 1,4-Dioxan (Aldrich) hinzugefügt. Das resultierende Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 12 Stunden gerührt. Flashchromatographie (1:1 Hexan/Ethylacetat) ergab die Titelverbindung (0,58 g, 56 %). MS (Elektronenspray): 239 (M + 1); ¹H-NMR (CDCl₃): δ 1,44 (s, 9H), 4,55 (s, 2H), 4,90 (br s, 1H, NH), 6,88 (d, 1H, J = 3,6 Hz), 7,07 (d, 1H, J = 3,6 Hz).
Beispiel 82 Herstellung von 2-(N-Hydroxyamidinyl)-5-(t-butoxycarbonylaminomethyl)thiophen (3-7)
Eine Lösung von 2-Cyano-5-(t-butoxycarbonylmethyl)thiophen (Verbindung 3-6, 560 mg, 2,44 mmol), Hydroxylamin-Hydrochlorid (Aldrich, 330 mg, 4,8 mmol) und 4-Methylmorpholin (Aldrich, 1 ml, 9,1 mmol) in Methanol (5 ml) wurde bei Raumtemperatur für 12 Stunden gerührt. Flashchromatographie (5:95:1 Isopropylalkohol/Methylenchlorid/Triethylamin) ergab die Titelverbindung (550 mg, 86 %). MS (Elektronenspray): 272 (M + 1).
Beispiel 83 Herstellung von 2-Amidinyl-5-(aminomethyl)thiophen (3-8)
10 % Pd-auf-C (Aldrich, 100 mg) wurde zu einer Lösung von 2-(N-Hydroxyamidinyl)-5-(t-butoxycarbonylaminomethyl)thiophen (Verbindung 3-7, 900 mg, 3,3 mmol) in Methanol (10 ml) hinzugefügt. Das resultierende Gemisch wurde hydriert (45 psi H₂) in einer Parr-Apparatur bei Raumtemperatur für 10 Stunden. Der Katalysator wurde durch Filtration entfernt und das Lösungsmittel wurde im Vakuum abgedampft, um das mit Boc geschützte Intermediat zu erhalten [900 mg, 94 %, MS (Elektronenspray) 256 (M + 1)], welches mit 4 M HCl in 1,4-Dioxan (Aldrich, 5 ml) für 3 Stunden bei Raumtemperatur behandelt wurde, um die Titelverbindung zu erhalten (460 mg, 84 %). MS (Elektronenspray): 56 (M + 1); ¹H-NMR (CD₃OD): δ 4,43 (s, 2H), 7,42 (d, 1H, J = 3,5 Hz), 7,78 (d, 1H, J = 3,5 Hz).
Beispiel 84 Herstellung von 2-[N-(Propyloxy)amidinyl)-5-(aminomethyl)thiophen (3-9)
CsCO₃ (Aldrich, 0,5 g) wurde zu einer Lösung von 2-(N-Hydroxyamidinyl)-5-(t-butoxycarbonylaminomethyl)thiophen (Verbindung 3-7, 271 mg, 1,0 mmol) und Iodpropan (Aldrich, 200 mg, 1,2 mmol) in DMF hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 10 Stunden gerührt. Flashchromatographie (5:95:1 Isopropylalkohol/Methylenchlorid/Triethylamin) ergab das mit Boc geschützte Intermediat [MS (Elektronenspray) 314 (M + 1)], welches mit 4 M HCl in 1,4-Dioxan (Aldrich) für 3 Stunden bei Raumtemperatur behandelt wurde, um die Titelverbindung zu erhalten (201 mg, 81 %). MS (Elektronenspray): 214 (M + 1); ¹H-NMR (CDCl₃): δ 0,95 (t, 3H, J = 7,5 Hz), 1,55 (br s, 2H, NH₂), 1,70 (m, 2H), 4,00 (t, 2H, J = 7,5 Hz), 4,01 (d, 2H, J = 7,5 Hz), 4,70 (br s, 2H, NH₂), 6,80 (d, 1H, J = 3,6 Hz), 7,08 (d, 1H, J = 3,6 Hz).
Beispiel 85 Herstellung von α-Azido-4-cyanotoluol (4-2)
Natriumazid (Aldrich, 3,5 g, 54 mmol) wurde zu einer Lösung von p-Cyanobenzylbromid (Aldrich, 10 g, 51 mmol) in DMF (100 ml) hinzugefügt und das resultierende Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 5 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann mit Wasser verdünnt (350 ml) und mit Ether extrahiert (2 × 100 ml). Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Salzwasser gewaschen und getrocknet (MgSO₄). Die Entfernung des Lösungsmittels ergab die Titelverbindung (8 g, 96 %). ¹H-NMR (CDCl₃): δ 4,42 (s, 2H), 7,41 (d, 2H, J = 8,1 Hz), 7,65 (d, 2H, J = 8,1 Hz).
Beispiel 86 Herstellung von p-Cyanobenzylamin (4-3)
10 % Pd-auf-C (Aldrich, 800 mg)-Katalysator wurde zu einer Lösung von α-Azido-4-cyanotoluol (Verbindung 4-2, 8 g, 51 mmol) in EtOAc (150 ml) hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde hydriert (H₂, 45 psi) in einer Parr-Apparatur für 11 Stunden. Der Katalysator wurde durch Filtration entfernt und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, um die Titelverbindung zu erhalten (6,3 g, 93 %). ¹H-NMR (CDCl₃): δ 3,85 (s, 2H), 7,45 (d, 2H, J = 8,1), 7,60 (d, 2H, J = 8,1 Hz), 7,78 (s, 2H, NH₂).
Beispiel 87 Herstellung von 4-(Aminomethyl)phenyl-N-hydroxyamidin (4-4)
Hydroxylamin-Hydrochlorid (7 g) wurde zu einer Lösung von Verbindung 4-3 (7 g) und NMM (4 ml) in Methanol (100 ml) hinzugefügt. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 3 Tage gerührt. Die Verbindung wurde durch RP HPLC aufgereinigt, um die Titelverbindung (7 g, 89 %) zu erhalten. MS (Elektronenspray): 166 (M + 1).
Beispiel 88 Herstellung von 4-(Aminomethyl)phenylamidin (4-5)
10 % Pd-auf-C (Aldrich, 800 mg) wurden zu einer Lösung von 4-(Aminomethyl)phenyl-N-hydroxyamidin (Verbindung 4-4, 7 g) in Methanol (150 ml) hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde hydriert (H₂, 45 psi) in einer Parr-Apparatur für 48 Stunden. Der Katalysator wurde durch Filtration entfernt und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, um die Titelverbindung zu erhalten (6,3 g, 99 %). MS (Elektronenspray): 150 (M + 1).
Beispiel 89 Herstellung von 2-Fluor-4-cyanotoluol (5-2)
Kupfer(I)cyanid (Aldrich, 3,6 g, 40 mmol) wurde zu einer Lösung von 4-Brom-2-fluortoluol (Aldrich, 5 g, 27 mmol) in DMF (60 ml) hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde bei 150 °C für 11 Stunden erhitzt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde das Gemisch zwischen Wasser und EtOAc (jeweils 500 ml) partitioniert. Die organische Schicht wurde getrocknet (MgSO₄) und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, um die Titelverbindung zu erhalten (2,08, 58 %). ¹H-NMR (CDCl₃): δ 2,36 (s, 3H), 7,30 (m, 3H), 7,35 (d, 1H, J = 8,1 Hz).
Beispiel 90 Herstellung von 3-Fluor-4-(brommethyl)benzonitril (5-3)
NBS (Aldrich, 3,02 g, 17 mmol) und Benzoylperoxid (Aldrich, 0,37 g, 1,5 mmol) wurden zu einer Lösung von 2-Fluor-4-cyanotoluol (Verbindung 5-2, 2,08 g, 15 mmol) in CCl₄ hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde für 14 Stunden auf 80 °C erhitzt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde das Gemisch mit Ether verdünnt (100 ml) und mit wässrigem Na₂S₃O₃ gewaschen und getrocknet (MgSO₄). Die Entfernung des Lösungsmittels im Vakuum führte zu einem gelben Öl, welches durch Flashchromatographie aufgereinigt wurde. Die Titelverbindung 5-3 (1,4 g, 42 %) wurde erhalten, zusammen mit einem Nebenprodukt, 3-Fluor-4-(brommethyl)benzonitril (5-4) (1,0 g, 30 %). Für die Titelverbindung (5-3): ¹H-NMR (CDCl₃): δ 4,46 (s, 2H), 7,35 (d, 1H, J = 8,0 Hz), 7,42 (d, 1H, J = 8,0 Hz), 7,52 (t, 1H, J = 8,0 Hz). Für das Nebenprodukt (5-4): ¹H-NMR (CDCl₃): δ 6,90 (s, 1H), 7,35 (d, 1H, J = 8,0 Hz), 7,55 (d, 1H, J = 8,0 Hz), 7,96 (t, 1H, J = 8,0 Hz).
Beispiel 91 Herstellung von 3-Fluor-4-(azidomethyl)benzonitril (5-5)
Natriumazid (Aldrich, 0,63 g, 9,8 mmol) wurde zu einer Lösung von 3-Fluor-4-(brommethyl)benzonitril (Verbindung 5-3, 1,4 g, 6,5 mmol) in DMF (15 ml) hinzugefügt. Nach Rühren bei Raumtemperatur für 20 Stunden wurde das Reaktionsgemisch in EtOAc und Wasser partitioniert (jeweils 100 ml). Die organische Schicht wurde dann getrocknet (MgSO₄) und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, um die Titelverbindung zu erhalten (0,995 g, 86 %). ¹H-NMR (CDCl₃): δ 4,50 (s, 2H), 7,38 (d, 2H, J = 8,1 Hz), 7,52 (m, 2H).
Beispiel 92 Herstellung von 3-Fluor-4-(azidomethyl)phenyl-N-hydroxyamidin (5-6)
Hydroxylamin-Hydrochlorid (Aldrich, 800 mg, 11,6 mmol) wurde zu einer Lösung von 3-Fluor-4-(azidomethyl)benzonitril (Verbindung 5-5, 1,2 g, 6,8 mmol) und NMM (2 ml) in Methanol (25 ml) hinzugefügt. Nach Rühren bei Raumtemperatur für 3 Tage wurde das Reaktionsgemisch mit EtOAc verdünnt und mit Salzwasser gewaschen. Die Entfernung des Lösungsmittels in Vakuum ergab die Titelverbindung (1,38, 82 %). ¹H-NMR (CD₃OD): δ 4,41 (s, 2H), 7,45 (m, 3H).
Beispiel 93 Herstellung von 3-Fluor-4-(azidomethyl)phenyl(-N-propyloxy)amidin (5-7)
Cäsiumcarbonat (Aldrich, 3,2 g, 9,9 mmol) wurde zu einer Lösung von Jodpropan (1 ml, 10 mmol) und 3-Fluor-4-(azidomethyl)phenyl-N-hydroxyamidin (Verbindung 5-6, 1,38 g, 6,6 mmol) in DMF (20 ml) hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde für 20 Stunden auf 50 °C erwärmt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde Wasser hinzugefügt und das resultierende Gemisch wurde mit Ether extrahiert. Die organische Schicht wurde mit Salzwasser gewaschen und getrocknet (MgSO₄). Flashchromatographie ergab die Titelverbindung (1,03 g, 62 %). ¹H-NMR (CDCl₃): δ 0,99 (t, 3H, J = 7,5 Hz), 1,75 (m, 2H), 4,08 (t, 2H, J = 7,5 Hz), 4,40 (s, 2H), 4,78 (br s, 2H), 7,40 (m, 3H).
Beispiel 94 Herstellung von 3-Fluor-4-(amiomethyl)phenyl(-N-propyloxy)amidin (5-8)
Triphenylphosphin (Aldrich, 1,6 g, 6,2 mmol) wurde zu einer Lösung von 3-Fluor-4-(azidomethyl)phenyl(-N-propyloxy)amidin (Verbindung 5-7, 1,03 g, 4,1 mmol) in THF (15 ml) hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 20 Stunden gerührt. NaOH (3M) wurde zu dem Reaktionsgemisch hinzugefügt bis auf pH = 14. Die resultierende Lösung wurde mit EtOAc extrahiert (2 × 100 ml). Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Salzwasser gewaschen und getrocknet (MgSO₄). Die Entfernung des Lösungsmittels im Vakuum ergab die Titelverbindung (825 mg, 77 %). ¹H-NMR (CD₃OD): δ 0,98 (t, 3H, J = 7,5 Hz), 1,72 (m, 2H), 3,82 (s, 2H), 3,95 (t, 2H, J = 7,5 Hz), 7,35 (d, 1H, J = 8,0 Hz), 7,40 (m, 2H).
Beispiel 95 Herstellung von N-α-Benzyloxycarbonyl-D-Ser(O-t-butyl)-L-Ala-t-butylester
Zu einer Lösung von N-α-Cbz-D-serin-t-butylether (5,02 g, 17 mmol) in Acetonitril (100 ml) wurde EDC (4,90 g, 25,5 mmol, 1,5 Äquivalente) und 1-Hydroxybenzotriazol (2,60 g, 17 mmol) hinzugefügt. Nach Rühren für 45 Minuten wurden Alanin-t-butylester, HCl-Salz (3,55 g, 19,6 mmol, 1,15 Äquivalente) und 4-Methylmorpholin (7,5 ml, 68 mmol, 4 Äquivalente) hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde für 1,5 Stunden gerührt. DSC zeigte an, dass die Reaktion vollständig war. Das Reaktionsgemisch wurde unter vermindertem Druck aufkonzentriert. Der Rückstand wurde in Ethylacetat gelöst (100 ml), dann nacheinander mit 1 N HCl, gesättigtem Natriumbicarbonat, Wasser und Salzwasser (jeweils 25 ml) gewaschen. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, um ein Öl zu erhalten, welches beim Stehen kristallisierte. Die Titelverbindung (6,95 g) wurde als blassgelber Feststoff in 97 %-iger Ausbeute erhalten. R_f = 0,63 (5% Isopropanol in Dichloromethan).
Beispiel 96 Herstellung von D-Ser(O-t-butyl)-L-Ala-t-butylester
Eine Lösung der Verbindung aus Beispiel 95 (1,14 g, 2,69 mmol) in Methanol wurde über Palladiumhydroxid (110 mg) bei Ballondruck für 1,5 Stunden hydriert. Das Reaktionsgemisch wurde durch Celite filtriert und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, um die Titelverbindung in quantitativer Ausbeute als gelbes Öl zu erhalten. R_f = 0,44 (5 % Methanol in Dichlormethan).
Beispiel 97 Herstellung von Phenethylsulfonyl-D-Ser(O-t-butyl)-L-Ala-t-butylester
Zu einer gerührten Lösung der Verbindung aus Beispiel 96 (4,2 g, 14,6 mmol) und Phenethylsulfonylchlorid (3,58 g, 17,5 mmol, 1,2 Äquivalente) in Acetonitril (100 ml) gekühlt in einem Eisbad wurde 2,4,6-Collidin (4,8 ml, 36,5 mmol, 2,5 Äquivalente) hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch ließ man auf Raumtemperatur erwärmen, dann wurde über Nacht gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter vermindertem Druck aufkonzentriert. Der Rückstand wurde in Ethylacetat gelöst (80 ml); die resultierende Lösung wurde nacheinander mit 1,0 N HCl, gesättigtem Natriumbicarbonat, Wasser und Salzwasser gewaschen, dann über Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde durch Silicagel chromatographiert, wobei mit 0-60 % Ethylacetat/Hexane eluiert wurde. Die Titelverbindung wurde in 89 %-iger Ausbeute als gelbes Öl isoliert. R_f = 0,84 (5 % Methanol in Dichlormethan).
C. Syntheserouten für Verbindungen mit Acyl- oder Carbonatestern an P3 Beispiel 98 Herstellung von n-Butylsulfonyl-D-(isopropyloxycarbonyl)serin-alanin-4-amidinobenzylamid
Zu einer Lösung der Verbindung aus Beispiel 9 (2,32 g, 4,3 mmol) in Pyridin (100 ml), die in einem Eisbad gekühlt wurde, wird Isopropylchlorformiat (21 ml einer 1 M-Lösung in Toluol, 21 mmol, 5 Äquivalente) hinzugefügt. Die Reaktion wird beobachtet, bis durch analytische HPLC die Vollständigkeit der Reaktion bestimmt wurde. Das Reaktionsgemisch wird mit Toluol (300 ml) verdünnt; das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wird in Acetonitril gelöst (400 ml) und das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wird in Acetonitril (30 ml) und Ethylacetat (30 ml) gelöst. Ether wurde zugegeben und das Präzipitat wurde isoliert. Der Feststoff wird mit Ether gewaschen, dann im Vakuum getrocknet. Der Feststoff wird mit Ether und Acetylacetat (2 × 200 ml eines 1:1-Gemischs) gewaschen, dann im Vakuum getrocknet, um die Titelverbindung zu erhalten.
Beispiel 99

Nach dem Ablauf von Beispiel 98 werden die folgenden Verbindungen hergestellt, wobei Isopropylchlorformiat wie angegeben ersetzt wird:

Bezeichnung der Verbindung	Austausch in Beispiel 99
n-Butylsulfonyl-D-[(+)-menthyloxycarbonyl]-serin-alanin4-amidinobenzylamid	(+)-Menthylchlorformiat
n-Butylsulfonyl-D-(phenoxycarbonyl)-serin-alanin-4-amidinobenzylamid	Phenylchlorformiat

Beispiel A
In vitro-Enzymassays zur Bestimmung der Spezifität
Die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen, als selektive Hemmer der katalytischen Aktivität von Urokinase zu fungieren, wurde untersucht, indem die Konzentration der Testverbindung, welche die Aktivität dieses Enzyms um 50 % hemmte, (IC₅₀) bestimmt wurde und dieser Wert mit demjenigen verglichen wurde, der für alle oder einige der folgenden verwandten Serinproteasen bestimmt wurde: Rekombinanter Gewebeplasminogenaktivator (rt-PA), Plasmin, aktiviertes Protein C, Chymotrypsin, Faktor Xa, Thrombin und Trypsin.
Der für alle Assays verwendete Puffer war HBSA (10 mM HEPES, pH 7,5, 150 mM Natriumchlorid, 0,1 % Rinderserumalbumin). Der Assay für die Bestimmung von IC₅₀ wurde durchgeführt, indem in entsprechenden Wells einer Corning-Mikrotiterplatte 50 Mikroliter HBSA, 50 Mikroliter der Testverbindung mit einer bestimmten Konzentration (es wurde ein breiter Konzentrationsbereich abgedeckt) verdünnt in HBSA (oder HBSA allein für die Messung von V₀ (ungehemmte Geschwindigkeit)) und 50 Mikroliter des in HBSA verdünnten Enzyms kombiniert wurden. Nach 30 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur wurden 50 Mikroliter des Substrats mit den unten angegebenen Konzentrationen zu den Wells zugegeben, so dass ein Endvolumen von insgesamt 200 Mikroliter erhalten wurde (etwa 4-fache Km). Die anfängliche Geschwindigkeit der Hydrolyse des chromogenen Substrats wurde über die Veränderung der Absorption bei 405 nm unter Verwendung eines Thermo Max^® Kinetic Microplate-Lesegeräts in einem Zeitraum von 5 Minuten gemessen, in dem weniger als 5 % des zugegebenen Substrats verbraucht wurden. Die Konzentration des zugegebenen Inhibitors, die eine 50 %-ige Verringerung der anfänglichen Hydrolyserate verursachte, wurde als IC₅₀-Wert definiert. K_i kann aus dem IC₅₀-Wert berechnet werden.
Urokinase-Assay
Die katalytische Urokinaseaktivität wurde unter Verwendung des chromogenen Substrats 150 mM S-2444 (L-Pyroglutamyl-glycyl-L-arginin-p-nitroanilin-Hydrochlorid), erhalten von DiaPharma Group, Inc., bestimmt. Urokinase (Abbokinase), hergestellt von Abbott Laborstories, wurde von Priority Pharmaceuticals bezogen und in dem HBSA-Assaypuffer vor der Verwendung auf 750 pM verdünnt. Der Assaypuffer war HBS (10 mM HEPES, 150 mM Natriumchlorid pH 7,4) mit 0,1 % BSA. K_i wurde unter Verwendung des IC₅₀-Werts berechnet.
Thrombin (flla)-Assay
Die Enzymaktivität wurde unter Verwendung des chromogrenen Substrats, Pefachrome t-PA, (CH₃SO₂-D-Hexahydrotyrosin-glycyl-L-arginin-p-nitroanilin, bezogen von Pentapharm Ltd.) bestimmt. Das Substrat wurde in entionisiertem Wasser vor der Verwendung rekonstituiert. Gereinigtes humanes α-Thrombin wurde von Enzyme Research Laborstories, Inc bezogen. Der Puffer, der für alle Assays verwendet wurde, war HBSA (10 mM HEPES, pH 7,5, 150 mM Natriumchlorid, 0,1 % Rinderserumalbumin).
Die IC₅₀-Bestimmungen wurden durchgeführt, wobei HBSA (50 μl), α-Thrombin (50 μl) (die Enzymendkonzentration beträgt 0,5 nM) und Inhibitor (50 μl) (es wurde ein breiter Konzentrationsbereich abgedeckt) in entsprechenden Wells kombiniert wurden und für 30 Minuten bei Raumtemperatur vor der Zugabe des Substrats Pefachrome-t-PA (50 μl) (die Substratendkonzentration ist 250 μM, etwa 5-fache Km) kombiniert wurden. Die anfängliche Geschwindigkeit der Pefachrome t-PA-Hydrolyse wurde über die Veränderung der Absorption bei 405 nm unter Verwendung eines Thermo Max^® Kinetic Microplate-Lesegeräts über einen Zeitraum von 5 Minuten gemessen, in dem weniger als 5 % des zugegebenen Substrats verbraucht wurden. Die Konzentration des zugegebenen Inhibitors, die eine 50 %-ige Verringerung der anfänglichen Hydrolyserate bewirkte, wurde als IC₅₀-Wert definiert.
Faktor Xa
Die katalytische Faktor Xa-Aktivität wurde unter Verwendung des chromogenen Substrats S-2765 (N-Benzyloxycarbonyl-D-arginin-L-glycin-L-arginin-p-nitroanilin), bezogen von DiaPharma Group (Franklin, OH), bestimmt. Alle Substrate wurden vor der Verwendung in entionisiertem Wasser rekonstituiert. Die Endkonzentration an S-2765 betrug 250 μM (etwa 5-fache Km). Gereinigter humaner Factor X wurde von Enzyme Research Laborstories, Inc. (South Bend, IN) bezogen und Faktor Xa (FXa) wurde wie beschrieben aktiviert und hergestellt [Bock, P. E., Craig, P. A., Olson, S. T. und Singh, P., Arch. Biochem. Biophys. 273:375-388 (1989)]. Das Enzym wurde vor dem Assay in HBSA verdünnt, wobei die Endkonzentration 0,25 nM betrug.
Rekombinanter Gewebeplasminogenaktivator (rt-PA)-Assay
Die katalytische rt-PA Aktivität wurde unter Verwendung des Substrats Pefachrome-t-PA (CH₃SO₂-D-Hexahydrotyrosin-glycyl-L-arginin-p-nitroanilin, bezogen von Pentapharm Ltd.) bestimmt. Das Substrat wurde in entionisiertem Wasser gebildet und anschließend vor dem Assay in HBSA verdünnt, wobei die Endkonzentration 500 Mikromolar war (etwa 3-fache Km). Humaner rt-PA (Activase^®) wurde von Genentech Inc. bezogen. Das Enzym wurde in entionisiertem Wasser rekonstituiert und vor dem Assay in HBSA verdünnt, wobei die Endkonzentration 1,0 nM betrug.
Plasmin-Assay
Die katalytische Plasminaktivität wurde unter Verwendung des chromogenen Substrats S-2366 [L-Pyroglutamyl-L-prolyl-L-arginin-p-nitroanilin-Hydrochlorid], welches von DiaPharma Group bezogen wurde, bestimmt. Das Substrat wurde in entionisiertem Wasser bereitgestellt und anschließend vor dem Assay in HBSA verdünnt, wobei die Endkonzentration 300 Mikromolar war (etwa 2,5-fache Km). Gereinigtes humanes Plasmin wurde von Enzyme Research Laborstories, Inc. bezogen. Das Enzym wurde vor dem Assay in HBSA verdünnt, wobei die Endkonzentration 1,0 nM betrug.
Aktiviertes Protein C (aPC)-Assay
Die katalytische aPC-Aktivität wurde unter Verwendung des chromogenen Substrats, Pefachrome PC (Delta-carbobenzyloxy-D-lysin-L-prolyl-L-arginin-p-nitroanilin-dihydrochlorid), bezogen von Pentapharm Ltd.) bestimmt. Das Substrat wurde in entionisiertem Wasser bereitgestellt und anschließend vor dem Assay in HBSA verdünnt, wobei die Endkonzentration 400 Mikromolar war (etwa 3-fache Km). Gereinigtes humanes aPC wurde von Hematologic Technologies, Inc. bezogen. Das Enzym wurde vor dem Assay in HBSA verdünnt, wobei die Endkonzentration 1,0 nM betrug.
Chymotrypsin-Assay
Die katalytische Chymotrypsinaktivität wurde unter Verwendung des chromogenen Substrats S-2586 (Methoxy-succinyl-L-arginin-L-prolyl-L-tyrosyl-p-nitroanilid), welches von DiaPharma Group bezogen wurde, bestimmt. Das Substrat wurde in entionisiertem Wasser bereitgestellt und anschließend vor dem Assay in HBSA verdünnt, wobei die Endkonzentration 100 Mikromolar war (etwa 9-fache Km). Gereinigtes (3X-kristallisiert; CDI) Rinderpankreas-α-chymotrypsin wurde von Worthington Biochemical Corp. bezogen. Das Enzym wurde in entionisiertem Wasser rekonstituiert und vor dem Assay in HBSA verdünnt, wobei die Endkonzentration 0,5 nM betrug.
Trypsin-Assay
Die katalytische Trypsinaktivität wurde unter Verwendung des chromogenen Substrats S-2222 (Benzoyl-L-isoleucin-L-glutaminsäure-[gamma-methylester]-L-arginin-p-nitroanilid), welches von DiaPharma Group bezogen wurde, bestimmt. Das Substrat wurde in entionisiertem Wasser bereitgestellt und anschließend vor dem Assay in HBSA verdünnt, wobei die Endkonzentration 250 Mikromolar war (etwa 4-fache Km). Gereinigtes (3X-kristallisiert; TRL3) Rinderpankreas-Trypsin wurde von Worthington Biochemical Corp. bezogen. Das Enzym wurde in entionisiertem Wasser rekonstituiert und vor dem Assay in HBSA verdünnt, wobei die Endkonzentration 0,5 nM betrug.
Tabelle I

Tabelle I listet die ermittelten K_i- oder IC₅₀-Werte für bestimmte der oben aufgelisteten Enzyme für die erfindungsgemäßen Verbindungen auf, welche ein hohes Maß an Spezifität für die Hemmung von Urokinase im Vergleich zu anderen Serinproteasen zeigen. TABELLE 1

Verbindung	Ki uPA*	IC50 tPA*	IC50- Plasmin
A	A	D	D
B	C	D	E
C	C	E	D
D	B	D	D
E	A	E	NT
P	A	E	NT
G	B	D	E
H	B	D	D
1	A	D	D
J	A	D	C
K	A	D	C
L	A	D	D
M	B	E	E
N	A	D	D
O	A	D	D
P	A	E	D
Q	A	E	D
R	A	E	D
S	B	E	E
T	A	D	C
U	A	C	C
V	A	D	C
W	B	E	E
X	A	D	D
Y	A	D	D
Z	A	E	D
AA	A	E	D
AB	A	E	D
AC	B	E	E
AD	A	D	C
AE	A	C	C
AF	A	D	C

AG	A	E	E
AH	A	C	D
AI	B	E	E
AJ	A	D	D
AK	A	D	D
AL	A	D	D
AM	A	E	E
AN	A	E	E
AO	B	E	E
AP	A	E	D
AQ	A	E	D
AR	C	E	E
AS	A	E	D
AT	A	E	D
AU	C	E	E
AV	A	E	E
AW	C	E	E
*A = weniger als 100 nm B = 100-250 nm C = 250-2500 nm D = mehr als 2500 nm E = nicht aktiv NT = nicht untersucht

Beispiel B
Bewertung der Testverbindung als Hemmer der Angiogenese in vivo
Das Küken-CAM (Kükenembryochorioallantoische Membran)-Modell, ein Standardangiogenese-Assay, wird verwendet, um die Fähigkeit einer Testverbindung, Angiogenese zu hemmen, zu untersuchen. Dieses Modell ist ein anerkanntes Modell für die Bewertung der Aktivität einer Testverbindung, die Bildung neuer Blutgefäße zu beeinflussen.
Eine mit einer 0,5 μg/ml Lösung an basischem Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) gesättigte Filterscheibe wird auf die CAM von 10 Tage alten Kükenembryos platziert, um Angiogenese zu induzieren. Vierundzwanzig Stunden später werden 0 bis 1 μg Testverbindung in einem Gesamtvolumen von 100 μl sterilem PBS intravenös in den Embryo injiziert. Etwa 48 Stunden später werden die Embryos getötet und die Filterscheiben und umgebendes CAM-Gewebe werden für die Analyse herausgeschnitten. Die Angiogenese wird quantitativ bestimmt, indem die Anzahl der Blutgefäßverzweigungspunkte innerhalb des begrenzten Bereichs des Filters gezählt werden [Brooks, P. C., et al, Methods in Molecular Biology, 120:257-269 (1999)]. Der Angiogeneseindex ist als Differenz der Anzahl an Blutgefäßverzweigungspunkten zwischen einer Versuchsgruppe und den unbehandelten Kontrollembryos definiert. Jede Versuchsgruppe enthält 8 bis 10 Kükenembryos.
Beispiel C
Bewertung der Testverbindung zur Hemmung des Wachstums humaner Tumorzellen in einem Kükenembryo-Modell
Ein Kükenembryo-Modell wird verwendet, um die Aktivität der Testverbindung, das Wachstum humaner Tumorzellen in vivo zu hemmen, zu bewerten. Eine einzelne Zellsuspension humaner Fibrosarkomzellen (HT 1080), die 4 × 10⁵-Zellen in einem Gesamtvolumen von 40 μl wird 10 Tage alten Kükenembryos verabreicht, wie von Brooks, et al beschrieben („Brooks, P. C., et al, „Integrin α_vβ₃ Antagonists Promote Tumor Regression by Inducing Apoptosis of Angiogenic Blood Vessels", Cell 79:1157-1164 (1994)). Vierundzwanzig Stunden später wurden 0 bis 10 μg der Testverbindung intravenös in die Embryos injiziert. Nach dieser einmaligen Verabreichung der Verbindung wurden die Kontrollembryos und die behandelten Embryos für insgesamt sieben Tage inkubiert und dann getötet. Die Tumore werden herausgeschnitten, von dem umgebenden CAM-Gewebe befreit und gewogen. Die Nassgewichte der in diesem Experiment herausgeschnittenen Tumore werden tabelliert. Jede Versuchsgruppe enthält 10-12 Kükenembryos.

Claims

Verbindung der Formel
wobei: (a) X ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -S(O)₂-, N(R')-S(O)₂-, -(C=O)-, -OC(=O)-, -NH-C(=O)-, -P(O)(R')- und einer direkten Bindung, wobei R' unabhängig Wasserstoff, Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Aryl mit 6 bis 14 Kohlenstoffatomen oder Aralkyl mit 7 bis 16 Kohlenstoffatomen ist, mit der Maßgabe, dass wenn X -P(O)(R')- ist, R' nicht Wasserstoff ist; (b) R₁ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus (1) Alkyl mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert mit Y₁ und/oder Y₂; (2) Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen substituiert mit Cycloalkyl mit 3 bis 8 Kohlenstoffatomen, das gegebenenfalls mit Y₁, Y₂ und/oder Y₃ mono-, di- oder trisubstituiert ist; (3) Cycloalkyl mit 3 bis 15 Kohlenstoffatomen, das gegebenenfalls mit Y₁, Y₂ und/oder Y₃ am Ring mono-, di- oder trisubstituiert ist; und (4) Heterocycloalkyl mit 4 bis 10 Ringatomen, wobei die Ringatome ausgewählt sind aus Kohlenstoff- und Heteroatomen, wobei die Heteroatome ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Sauerstoff, Stickstoff und S(O)_i, wobei i 0, 1 oder 2 ist, das gegebenenfalls mit Y₁, Y₂ und/oder Y₃ am Ring mono-, di- oder trisubstituiert ist; (5) Heterocyclo mit 4 bis 10 Ringatomen, wobei die Ringatome ausgewählt sind aus Kohlenstoff und Heteroatomen, wobei die Heteroatome ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Sauerstoff, Stickstoff und S(O)_i, wobei i 0, 1 oder 2 ist, einschließlich
ein 5 bis 7-gliedriger Heterocyclus ist, der 3 bis 6 Ringkohlenstoffatome hat, wobei V -CH₂-, -O-, -S(=O)-, -S(O)₂- oder -S- ist, das gegebenenfalls mit Y₁, Y2 und/oder Y3 am Ring mono-, di- oder trisubstituiert ist; (6) Alkenyl mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen, das gegebenenfalls mit Cycloalkyl mit 3 bis 8 Kohlenstoffatomen substituiert ist, das gegebenenfalls mit Y₁, Y₂ und/oder Y₃ am Ring mono-, di- oder trisubstituiert ist; (7) Aryl mit 6 bis 14 Kohlenstoffatomen, das gegebenenfalls mit Y₁, Y₂ und/oder Y₃ mono-, di- oder trisubstituiert ist; (8) Heteroaryl mit 5 bis 14 Ringatomen, wobei die Ringatome ausgewählt sind aus Kohlenstoff- und Heteroatomen, wobei die Heteroatome ausgewählt sind aus Sauerstoff, Stickstoff und Schwefel, und das gegebenenfalls mit Y₁, Y₂ und/oder Y₃ mono-, di- oder trisubstituiert ist; (9) Aralkyl mit 7 bis 15 Kohlenstoffatomen, das gegebenenfalls an der Alkylkette mit Hydroxy oder Halogen substituiert ist und das gegebenenfalls mit Y₁, Y₂ und/oder Y₃ mono-, di- oder trisubstituiert ist; (10) Heteroaralkyl mit 5 bis 14 Ringatomen, wobei die Ringatome ausgewählt sind aus Kohlenstoff- und Heteroatomen, wobei die Heteroatome ausgewählt sind aus Sauerstoff, Stickstoff und Schwefel, das gegebenenfalls an der Alkylkette mit Hydroxy oder Halogen substituiert ist und gegebenenfalls mit Y₁, Y₂ und/oder Y₃ am Ring mono-, di- oder trisubstituiert ist; (11) Aralkenyl mit 8 bis 16 Kohlenstoffatomen, das gegebenenfalls mit Y₁, Y₂ und/oder Y₃ am Arylring mono-, di- oder trisubstituiert ist; (12) Heteroaralkenyl mit 5 bis 14 Ringatomen, wobei die Ringatome ausgewählt sind aus Kohlenstoff- und Heteroatomen, wobei die Heteroatome ausgewählt sind aus Sauerstoff, Stickstoff und Schwefel, und das gegebenenfalls mit Y₁, Y₂ und/oder Y₃ an den Ringkohlenstoffen mono-, di- oder trisubstituiert ist; (13)
(14)
(15)
(16)
(17) kondensiertes carbocyclisches Alkyl mit 9 bis 15 Kohlenstoffatomen; (18) Difluormethyl oder Perfluoralkyl mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen; (19) Perfluoraryl mit 6 bis 14 Kohlenstoffatomen; (20) Perfluoraralkyl mit 7 bis 15 Kohlenstoffatomen; und (21) Wasserstoff, wenn X -C(=O)NH-, -S(O)₂-, -S(O)₂NH- oder eine direkte Bindung ist; und wobei Y₁, Y₂ und Y₃ jeweils unabhängig ausgewählt und das folgende ist (i) ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Cyano, Nitro, Tetrazolyl, Guanidino, Amidino, Methylguanidino, -CF₃, -CF₂CF₃, -CH(CF₃)₂, -C(OH)(CF₃)₂, -OCF₃, -OCF₂H, -OCF₂CF₃, -OC(O)NH₂, -OC(O)NHZ₁, -OC(O)NZ₁Z₂, -NHC(O)Z₁, -NHC(O)NH₂, -NHC(O)NZ₁, -NHC(O)NZ₁Z₂, -C(O)OH, -C(O)OZ₁, -C(O)NH₂, -C(O)NHZ₁, -C(O)NZ₁Z₂, -P(O)₃H₂, -P(O)₃(Z₁)₂, -S(O)₃H, -S(O)_mZ₁, -Z₁, -OZ₁, -OH, -NH₂, -NHZ₁, -NZ₁Z₂, -N-Morpholino und -S(O)_m(CF₂)_qCF₃, wobei m 0, 1 oder 2 ist, q ein ganzzahliger Wert von 0 bis 5 ist und Z₁ und Z₂ unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Alkyl mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, Aryl mit 6 bis 14 Kohlenstoffatomen, Heteroaryl mit 5 bis 14 Ringatomen, Aralkyl mit 7 bis 15 Kohlenstoffatomen und Heteroaralkyl mit 5 bis 14 Ringatomen, oder (ii) Y₁ und Y₂ zusammen ausgewählt sind, sodass sie -O[C(Z₃)(Z₄)]_rO oder -O[C(Z₃)(Z₄)]_r+1- sind, wobei r ein ganzzahliger Wert von 1 bis 4 ist und Z₃ und Z₄ unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Alkyl mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, Aryl mit 6 bis 14 Kohlenstoffatomen, Heteroaryl mit 5 bis 14 Ringatomen, Aralkyl mit 7 bis 15 Kohlenstoffatomen und Heteroaralkyl mit 5 bis 14 Ringatomen; (c) R₂ -CH₂OH, -CH(CH₃)OH ist oder ausgewählt ist, um an P3 eine Gruppe zu ergeben, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Acyl- und Carbonatestern von D-Seryl; (d) R₃ und R₄ zusammen ausgewählt sind, um an P₂ eine Gruppe zu ergeben, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Prolyl, Pipecolyl, Azetidin-2-carbonyl, 4-Hydroxyprolyl, 3-Hydroxyprolyl, 3,4-Methanoprolyl und 3,4-Dehydroprolyl; (e) R₇ Wasserstoff oder Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen ist; (f) E ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
wobei R₈ und R₉ unabhängig ausgewählt sind aus Wasserstoff, Hydroxyl, Halogen, Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und substituiert mit Alkoxy mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Alkoxy mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen und Trifluormethyl; R₁₀ und R₁₁ unabhängig Wasserstoff, Hydroxy, Alkoxy mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, Trihydrocarbylsilyl mit 3 bis 16 Kohlenstoffatomen, Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen oder -C(=O)R₁₂ sind, R₁₁ Wasserstoff oder Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen ist, mit der Maßgabe, dass R₁₀ und R₁₁ nicht beide Hydroxyl oder Alkoxy sind; R₁₂ Wasserstoff, Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Alkoxy mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder (CF₂)_jCF₃ ist, wobei n 0, 1, 2 oder 3 ist; R₁₃ und R₁₄ jeweils unabhängig ausgewählt sind aus Wasserstoff oder Niederalkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen; und t ein ganzzahliger Wert von 0 bis 6 ist; und pharmazeutisch verträgliche Salze davon.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei E ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
Verbindung nach Anspruch 2, wobei X -S(O₂)- oder -O-C(=O)- ist.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei R₂ -CH₂OH oder -CH(CH₃)OH ist.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei R₂ ausgewählt ist, um an P3 eine Gruppe zu ergeben, die aus D-Seryl und (R,R) D-Allothreonyl ausgewählt ist.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei R₂ -CH₂OH ist und der Kohlenstoff, der R₂ trägt (Alpha-Kohlenstoff), die R-Konfiguration hat.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei R₂ -CH(CH₃)OH ist und sowohl der Kohlenstoff, der R₂ trägt (Alpha-Kohlenstoff), als auch der Kohlenstoff, der die Methylgruppe von R₂ (Beta-Kohlenstoff) trägt, die R-Konfiguration haben.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei R₃ und R₄ zusammen ausgewählt sind, um an P₂ eine Gruppe zu ergeben, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Prolyl, 4-cis-Hydroxyprolyl, 3,4-Dehydroprolyl, 3,4-Methanoprolyl und Azetidin-2-carbonyl.
Verbindung nach Anspruch 8, wobei R₃ und R₄ zusammen ausgewählt sind, um an P2 eine Gruppe zu ergeben, die ausgewählt ist aus Prolyl, Azetidin-2-carbonyl, 3,4-Methanoprolyl und 3,4-Dehydroprolyl.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei X ausgewählt ist aus -S(O)₂-, -OC(=O)-, -NH-C(=O)- und einer direkten Bindung.
Verbindung nach Anspruch 10, wobei X -S(O)₂- oder -OC(=O)- ist.
Verbindung nach Anspruch 11, wobei R₁ ausgewählt ist aus Phenyl, Benzyl, 2-Phenylethyl, Isobutyl, n-Butyl, 3-Phenylpropyl; 4-Chlorbenzyl, 3-Chlorbenzyl und 2-Fluorbenzyl.
Verbindung nach Anspruch 12, wobei R₁-X- ausgewählt ist aus Phenyl-S(O)2-, Benzyl-S(O)₂-, 2-Phenylethyl-S(O)₂-, 3-Phenylpropyl-S(O)₂-, n-Butyl-S(O)2-, Benzyl-OC(=O)-, Isobutyl-OC(=O)-, 4-Chlorbenzyl-S(O)₂-, 3-Chlorbenzyl-S(O)₂- und 2-Fluorbenzyl-S(O)₂-.
Verbindung nach Anspruch 1, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
Verbindung nach Anspruch 1, wobei R₂ ausgewählt ist, um an P3 eine Gruppe zu ergeben, die ausgewählt ist aus Acyl- und Carbonatestern von D-Seryl.
Verbindung nach Anspruch 15, wobei R₃ und R₄ zusammen ausgewählt sind, um an P2 eine Gruppe zu ergeben, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Prolyl, 4-cis-Hydroxyprolyl, 3,4-Dehydroprolyl, 3,4-Methanoprolyl und Azetidin-2-carbonyl.
Zusammensetzung, umfassend eine Verbindung nach Anspruch 1, 4, 14 oder 15 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1, 4, 14 oder 15 für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, um einen Zustand, der durch Hemmen oder Senken von Urokinaseaktivität verbessert wird, in einem Säuger zu behandeln, der dessen bedarf.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1, 4, 14 oder 15 für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, um einen pathologischen Zustand in einem Säuger zu behandeln, der dessen bedarf, der durch Senken oder Hemmen der Angiogenese in dem Säuger verbessert wird.