ES2281113T3 - Agentes tromboliticos con actividad antitrombotica. - Google Patents

Agentes tromboliticos con actividad antitrombotica. Download PDF

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Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UNOS AGENTES TROMBOLITICOS Y A SUS PROCEDIMIENTOS DE OBTENCION Y USO. SE REFIERE, EN PARTICULAR, A AGENTES TROMBOLITICOS QUE COMPRENDEN UNA PROTEINASA TROMBOLITICA UNIDA POR COVALENCIA A UN COMPUESTO OBJETO QUE SE FIJA ESPECIFICAMENTE IN VIVO EN EL SITIO DE LOS COAGULOS SANGUINEOS Y DE LOS TROMBOS. ESTA INVENCION SE REFIERE TAMBIEN A UNOS CONJUGADOS DE UNA PROTEINASA TROMBOLITICA Y A, POR LO MENOS, DOS COMPUESTOS OBJETO. SE REFIERE ADEMAS A UNOS PROCEDIMIENTOS DE OBTENCION Y UTILIZACION DE DICHOS CONJUGADOS PARA LA ELIMINACION IN VIVO DE LOS TROMBOS PARA ALIVIAR LOS ESTADOS PATOLOGICOS QUE PROVOCAN.

Description

Agentes trombolíticos con actividad antitrombótica.
Antecedentes de la invención
Esta invención se refiere a agentes trombolíticos y métodos para fabricar y utilizar tales agentes. Específicamente, la invención se refiere a agentes trombolíticos que comprenden una proteinasa trombolítica enlazada covalentemente a un compuesto de direccionamiento que se fija específicamente a los coágulos de sangre (trombos) in vivo. Los agentes trombolíticos de la invención son útiles para eliminar trombos in vivo a fin de aliviar las afecciones patológicas causadas por ellos.
La trombosis y la tromboembolia, es decir, la aparición de trombos oclusivos en la vasculatura de los pacientes humanos, plantea un problema clínico importante y es una causa importante de morbilidad y mortalidad. Los trombos arteriales pueden presentarse en la placa ateroesclerótica y son responsables de infarto de miocardio (MI) e isquemia cerebral (derrame cerebral). Los trombos venosos pueden causar trombosis venosa profunda (DVT) y embolia pulmonar (PE). La magnitud de la exposición clínica creada por la trombosis se refleja en las estadísticas de morbilidad y mortalidad. Una de las causas principales de muerte en los hombres de edad superior a 50 años es el MI agudo, y el derrame cerebral sigue siendo una enfermedad debilitante e imprevisible. Se ha estimado que en los Estados Unidos aproximadamente cinco millones de pacientes experimentan uno o más episodios de DVT al año y que se producen más de 500.000 casos de PE, dando como resultado 100.000 fallecimientos (Seabold, Society of Nuclear Medicine Annual Meeting 1990).
Todos los trombos contienen células sanguíneas, fibrina, y proteínas de coagulación, variando la composición precisa de cada trombo de acuerdo con la localización del trombo y su etiología. Por ejemplo, los trombos venosos son generalmente ricos en fibrina y pobres en plaquetas, conteniendo también glóbulos rojos. En comparación, los trombos arteriales están compuestos principalmente por agregados de plaquetas interconectados por cadenas delgadas de fibrina. Como otro ejemplo, los trombos que se forman después del restablecimiento del flujo sanguíneo en una arteria ocluida están compuestos casi enteramente de plaquetas activadas, proteínas de coagulación, y una cantidad relativamente pequeña de fibrina. Proteínas de coagulación ilustrativas que pueden encontrarse en los trombos incluyen trombina, factor XIII, antiplasmina \alpha_{2}, factor von Willebrand, fibronectina, fibrinógeno, plasmina, y análogos.
Se cree que la formación de trombos ocurre por activación de la cascada compleja de coagulación de la sangre en un sitio de lesión vascular. La lesión deja expuesto el subendotelio del vaso sanguíneo, lo que desencadena la activación de las plaquetas y la adherencia subsiguiente de las plaquetas al subendotelio vascular. Una vez activadas, las plaquetas se desgranulan, es decir, secretan sustancias que atraen otras plaquetas al sitio de la lesión, tales como epinefrina, adenosina-difosfato, tromboxano A_{2}, y serotonina. Las plaquetas activadas secretan también trombina, una proteasa multi-sustrato que promueve la activación y agregación de más plaquetas. La trombina convierte también el fibrinógeno en fibrina, el entramado estructural del trombo. Otra enzima, Factor XIIIa, reticula la fibrina para fortificar la estructura del coágulo. En la hemostasis normal, el trombo se disuelve por la acción de la enzima proteolítica plasmina sobre la fibrina reticulada, mediante activación del precursor de plasmina, plasminógeno. Cuando la hemostasis normal se perturba, el coágulo no se disuelve y puede formar una oclusión local o embolia. Alternativamente, el trombo puede desprenderse de su sitio de formación y desplazarse a través del sistema cardiovascular para formar una embolia en un sitio distante.
La terapia con anticoagulantes puede tratar eficazmente la trombosis en muchos casos, si se aplica suficientemente pronto. Sin embargo, dicho tratamiento va asociado a riesgos, por ejemplo, hemorragia interna. Adicionalmente, en particular en los trombos arteriales, la retrombosis y reoclusión de vasos sanguíneos en el sitio del trombo es un desenlace clínico elocuente (10-30%). Incluso utilizando las metodologías más avanzadas disponibles actualmente, el 25-30% de los pacientes de MI agudo no logran restablecer la perfusión de la arteria coronaria ocluida por el trombo, que es la causa proximal del ataque cardiaco.
Enzimas activadoras del plasminógeno tales como estreptoquinasa, uroquinasa, y el activador del plasminógeno tisular (tPA) son de uso clínico actualmente para disolver los trombos arteriales, particularmente los trombos que se encuentran en las arterias coronarias. Estas enzimas actúan por generación de plasmina. Si bien la plasmina es eficaz para disolver la fibrina reticulada en los coágulos, las acciones proteolíticas de la plasmina sobre proteínas circulantes tales como el fibrinógeno pueden causar efectos secundarios sistémicos graves tales como hemorragia en localizaciones no coronarias. Además, son necesarias grandes dosis de enzimas activadoras del plasminógeno para la disolución rápida de los trombos. Otra desventaja de las enzimas activadoras del plasminógeno reside en su capacidad para activar la trombina, aumentando así la probabilidad de retrombosis. Una desventaja adicional de la estreptoquinasa es que se trata de un producto bacteriano, y por tanto la estreptoquinasa induce una respuesta de anticuerpos de larga duración, limitando su utilidad para un segundo uso si ocurre trombosis adicional.
Se han desarrollado cierto numero de agentes farmacéuticos para intentar el suministro direccionado de agentes trombolíticos a sitios de trombo in vivo y limitar así los efectos secundarios de los agentes conocidos. En particular, se han producido conjugados entre los anticuerpos específicos de los componentes del trombo y enzimas activadoras del plasminógeno. Tales conjugados han empleado anticuerpos monoclonales contra el receptor de la glicoproteína integrita IIb/IIIa (GPIIb/IIIa) presente en las membranas de las plaquetas, o anticuerpos monoclonales contra una proteína de la coagulación. Un anticuerpo de este tipo ha sido aprobado para uso clínico. Por supuesto, el uso de anticuerpos, incluso anticuerpos humanizados, puede causar efectos secundarios inmunológicos indeseables. Además, el anticuerpo monoclonal aprobado ha sido asociado con trombocitopenia y tiempos de hemorragia prolongados en algunos pacientes.
Un gran número de agentes antitrombóticos propuestos han empleado péptidos que contienen el motivo de aminoácidos -Arg-Gly-Asp (RGD), que representa el sitio de reconocimiento de fibrinógeno para el receptor de GPIIb/IIIa. Estudios clínicos han indicado que un agente peptídico de este tipo era terapéuticamente eficaz sólo para un subconjunto de pacientes. Agentes peptidomiméticos basados en el motivo RGD se encuentran también en estudios clínicos iniciales. La hemorragia ha sido asociada con la totalidad de los agentes basados en el motivo RGD, y ninguno de estos agentes ha sido aprobado para uso humano.
La Patente U.S. No. 4.610.879 describe la fibrolasa, una cinc-metaloproteinasa purificada a partir del veneno de la serpiente Southern Copperhead (Agkistrodon contortrix contortrix) que tiene actividad proteolítica directa para la fibrina. La fibrolasa no activa el plasminógeno y por tanto no exhibe la actividad hemorrágica de los agentes trombolíticos activadores del plasminógeno. Sin embargo, como se describe en la Patente U.S. No. 5.260.060, la fibrolasa exhibe actividad proteolítica general, lo que puede excluir el uso de dosis altas o la administración de larga duración. La Patente U.S. No. 5.260.060 describe cinc-metaloproteinasas adicionales del veneno de la serpiente de cascabel de la costa occidental de Méjico (Crotalus basiliscus basiliscus) que actúan directamente sobre la fibrina pero que son menos activas como proteinasas generales que la fibrolasa.
Existe necesidad de agentes trombolíticos que puedan direccionarse específicamente a los sitios de trombo in vivo y reducir o eliminar con ello los efectos secundarios sistémicos deletéreos de los agentes conocidos.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona agentes trombolíticos que están direccionados específicamente a sitios de trombo in vivo y que tienen efectos secundarios hemorrágicos mínimos. Los agentes trombolíticos de la invención tienen además efectos secundarios mínimos relacionados con la proteólisis inespecífica. Los agentes trombolíticos preferidos de la invención no activan apreciablemente la trombina, y por tanto no contribuyen a retrombosis después del tratamiento con éxito de un episodio trombótico agudo. Los agentes trombolíticos de la invención son conjugados enlazados covalentemente entre una enzima proteolítica que actúa sobre un componente de un trombo y un compuesto activador que se fija específicamente al sitio del trombo.
En una realización, la invención proporciona un agente trombolítico que comprende una metaloproteinasa trombolítica enlazada covalentemente a un compuesto de direccionamiento capaz de fijarse específicamente a un componente de un trombo.
La invención proporciona también métodos para fabricar los agentes trombolíticos de la invención por una síntesis química utilizando un agente de reticulación o, cuando el compuesto de direccionamiento es un péptido, por técnicas recombinantes.
La invención se refiere también a un método de utilización de los agentes trombolíticos de la invención para la resolución de coágulos en sitios patológicos in vivo, que comprende el paso de administrar una cantidad terapéutica eficaz del agente trombolítico de la invención.
La invención se refiere también a un método por el cual el direccionamiento y la disolución del coágulo sanguíneo pueden monitorizarse, por ejemplo, por escintigrafía. Este método comprende los pasos de administrar una cantidad terapéutica eficaz de un agente trombolítico radiomarcado de la invención, detectar la radiación emitida por el radiomarcador localizado en el sitio del trombo, y observar la disminución de la radiación a medida que el trombo es disuelto por el agente trombolítico.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 ilustra el esquema de reacción para la conjugación de la fibrolasa con un péptido de direccionamiento de la invención utilizando éster de N-(\gamma-maleimidobutiriloxi)-sulfosuccinimida (S-GMBS).
La Figura 2 muestra la estructura química de un reactivo fluorescente de detección (SAMSA-fluoresceína) utilizado para determinar la extensión de la formación del aducto químico entre fibrolasa y S-GMBS.
La Figura 3 ilustra el esquema de reacción para la conjugación de la fibrolasa con un péptido de direccionamiento de la invención utilizando N-succinimidil-3-(2-piridilditio)-propionato (SPDP).
La Figura 4 ilustra el esquema de reacción para la conjugación de la fibrolasa con un péptido de direccionamiento de la invención utilizando sulfosuccinimidil-6-(\alpha-metil-\alpha-(2-piridilditio)-toluamido)-hexonato (S-SMPT).
La Figura 5 muestra los resultados de la purificación por HPLC de los conjugados fibrolasa:péptido reticulados con SPDP. El Panel A ilustra el perfil de elución del control no conjugado de fibrolasa isoforma 2; el Panel B muestra el perfil de elución del péptido no conjugado; el Panel C muestra el perfil de elución de la fibrolasa enlazada a SPDP; y el Panel D muestra el perfil de elución de los conjugados fibrolasa:péptido reticulados con SPDP.
La Figura 6 muestra los resultados del análisis de la composición de aminoácidos del péptido CH_{2}CO-Y_{D}.
Amp.GDCKGCG.amida (Panel A), fibrolasa (Panel B), y un conjugado de fibrolasa:péptido CH_{2}CO-Y_{D}.Amp.GDC
KGCG.amida reticulado con SPDP (Panel C).
Descripción detallada de las realizaciones preferidas
Los agentes trombolíticos de la presente invención poseen varias ventajas sobre los agentesg trombolíticos conocidos en la técnica anterior. Los péptidos de direccionamiento de los agentes trombolíticos de la invención minimizan la cantidad de proteinasa trombolítica requerida para disolver eficazmente los trombos. La dosificación mínima de proteinasa trombolítica da como resultado menores efectos secundarios sistémicos que los observados con los agentes trombolíticos disponibles actualmente. Los agentes trombolíticos de la invención pueden diseñarse además para actuar sólo sobre la fibrina, por la elección de la proteinasa, minimizando con ello el riesgo de efectos secundarios sistémicos y de retrombosis.
Para los propósitos de esta invención, el término "agente trombolítico" abarca cualquier agente enzimático o químico que rompe, disuelve, digiere, disocia, lisa, reduce, elimina o mejora (denominadas colectivamente "propiedades trombolíticas") los trombos y coágulos de sangre en arterias, venas, arteriolas, capilares y otras estructuras vasculares en el cuerpo de un animal, así como en diversos sitios tisulares que incluyen, pero sin carácter limitante, cerebro, pulmón, riñón, piel, corazón, y venas profundas de las extremidades inferiores.
Para los propósitos de esta invención, el término "proteinasa trombolítica" tiene por objeto abarcar una metaloproteinasa. Metaloproteinasas derivadas de venenos, en particular de venenos de serpiente, pueden utilizarse también en los agentes trombolíticos de la invención. El uso de una metaloproteinasa minimiza los efectos secundarios hemorrágicos y maximiza la eficacia in vivo, dado que las metaloproteinasas no son inhibidas por las serpinas y otros inhibidores circulantes de la actividad de serina-proteasa encontrados en la circulación animal. El agente trombolítico de la invención puede comprender un fragmento de una proteinasa trombolítica que retiene actividad proteolítica para un componente de trombo. Preferiblemente, la proteinasa empleada en el agente trombolítico de la invención es una cinc-metaloproteinasa tal como las proteinasas derivadas de venenos de serpiente descritas en las Patentes U.S. Núms. 4.610.879 y 5.260.060. Más preferiblemente, la proteinasa trombolítica empleada en la invención es la fibrolasa aislada del veneno de A. contortrix contortrix e identificada como EC 3.4.24.72. De modo muy preferible, la proteinasa trombolítica empleada en la invención se prepara utilizando tecnología genética recombinante, por ejemplo, como se describe en la Solicitud de Patente Europea No. 323722.
Cualquier péptido capaz de fijarse específicamente a un trombo in vivo puede emplearse como péptido de direccionamiento de acuerdo con la presente invención. Para los propósitos de esta invención, la expresión "péptido de direccionamiento" incluye péptidos que tienen afinidad biológica para componentes específicos de tejidos y otras estructuras biológicas en un trombo, que incluyen muy preferiblemente una proteína de la coagulación, fibrina, y plaquetas. En otras realizaciones, el péptido de direccionamiento puede fijarse específicamente a cualquier otro componente de un trombo. El término "direccionamiento", como se define en esta memoria, excluye específicamente hirudina y análogos de hirudina, proteínas tales como anticuerpos y grandes fragmentos de proteínas tales como fragmentos de anticuerpo Fc, fragmentos Fab', y fragmentos de anticuerpos monocatenarios. El péptido de direccionamiento comprende de modo preferible desde aproximadamente 3 a aproximadamente 100 aminoácidos, de modo más preferible aproximadamente 4 a aproximadamente 50 aminoácidos, y de modo muy preferible desde aproximadamente 4 a aproximadamente 20 aminoácidos.
El agente trombolítico de la invención puede comprender más de un compuesto de direccionamiento enlazado covalentemente a la proteinasa trombolítica, para mejorar la afinidad del agente para los trombos. En esta realización, al menos dos compuestos de direccionamiento están enlazados covalentemente a la proteinasa. Los enlaces de los compuestos de direccionamiento a la proteinasa en esta realización pueden encontrarse en cualquier sitio o sitios en la molécula de proteinasa que no reduzca sustancialmente la actividad trombolítica de la proteinasa. El enlace covalente de los péptidos de direccionamiento a la proteinasa puede estar configurado de cualquier manera, v.g., en una configuración tal como proteinasa del péptido de direccionamiento-péptido de direccionamiento.
Alternativamente, los péptidos de direccionamiento pueden estar configurados para extenderse desde un sitio único en la proteinasa a fin de formar un "gancho molecular", v.g., en una configuración tal como péptido de direccionamiento proteinasa del péptido de direccionamiento. En esta realización pueden emplearse moléculas de direccionamiento que tienen especificidades de fijación diferentes, o puede emplearse una multiplicidad de moléculas de direccionamiento que tienen la misma especificidad de fijación.
En una realización, el péptido de direccionamiento del agente trombolítico de la invención se fija específicamente a las plaquetas. En esta realización, el péptido de direccionamiento se fija preferiblemente de modo específico al receptor de las plaquetas GPIIb/IIIa que está presente en las plaquetas. Por ejemplo, pueden emplearse derivados de guanidina específicos del receptor de GPIIb/IIIa tales como los descritos en la Patente U.S. No. 5.086.069 como compuestos de direccionamiento en los agentes trombolíticos de la invención. Análogamente, derivados de tirosina específicos del receptor de GPIIb/IIIa tales como los descritos en el documento EP 478328 y en Hartman, et al. (1992) J. Med. Chem. 35, 4640-4642 pueden utilizarse como compuestos de direccionamiento de acuerdo con la invención. El péptido de direccionamiento puede ser un ligando peptídico lineal para un receptor de GPIIb/IIIa o un ligando peptídico cíclico para un receptor de GPIIb/IIIa. Preferiblemente, dicho péptido de direccionamiento tiene una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia -XGD-, en donde X es cualquier aminoácido que tenga una cadena lateral que comprende un grupo amino, un grupo guanidino o un grupo amidino. En la realización específica de plaquetas, el compuesto de direccionamiento puede ser opcionalmente capaz de inhibir la agregación plaquetaria y las interacciones plaqueta/fibrinógeno. Cuando el compuesto de direccionamiento es capaz de inhibir la agregación plaquetaria, el compuesto es capaz de inhibir la agregación de las plaquetas humanas en plasma rico en plaquetas en un 50% (es decir, tiene un valor CI_{50} para la agregación plaquetaria) cuando está presente a una concentración no mayor que 1 \muM, de modo más preferible no mayor que 0,3 \muM, y de modo muy preferible no mayor que 0,1 \muM.
En otra realización, el péptido de direccionamiento se fija específicamente a la fibrina. Cuando el compuesto de direccionamiento específico de fibrina es un péptido, se prefiere un ligando peptídico para un sitio de polimerización de la fibrina. Ligandos específicos para un sitio de polimerización de fibrina incluyen, por ejemplo, péptidos que comprenden copias múltiples de la secuencia de aminoácidos (Gly-Pro-Arg-Pro).
Ejemplos de péptidos de direccionamiento útiles como componentes de los agentes trombolíticos de la invención incluyen péptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos -XGD-, en donde X es un aminoácido que comprende un grupo amino, un grupo guanidino o un grupo amidino en su cadena lateral, y péptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos -GPRP- (SEQ ID NO:1), y que incluyen, pero sin carácter limitante, péptidos que tienen las fórmulas siguientes:
HHLGGAKQAGDV (SEQ ID NO:2)
CH_{2}CO.Y_{D}.Apc.GDCGGC_{Acm}GC_{Acm}GGC.amida (SEQ ID NO:3),
CH_{2}CO.Y_{D}.Apc.GDCKGC_{Acm}GC_{Acm}GGC.amida (SEQ ID NO:4),
C_{Acm}GC_{Acm}GGRGDSC (SEQ ID NO:5),
C_{Acm}GC_{Acm}GGRGDGGRGDSC (SEQ ID NO:6),
C_{Acm}GC_{Acm}GGRGDGGRGDGGRGDSC (SEQ ID NO:7),
C_{Acm}GC_{Acm}RRRRRRRRRGDVC (SEQ ID NO:8),
CGRGDVKC_{Acm}GC_{Acm}.amida (SEQ ID NO:9),
CGRGDVC_{Acm}GC_{Acm}.amida (SEQ ID NO:10),
CGRGDVRGDFKC_{Acm}GC_{Acm}.amida (SEQ ID NO:11),
CGRGDVRGDFC_{Acm}GC_{Acm}.amida (SEQ ID NO:12),
acetil-G.Apc.GDV.Apc.GDFKC_{Acm}GC_{Acm}.GGCamida (SEQ ID NO:13),
G.Apc.GDV.Apc.GDFKC_{Acm}GC_{Acm}.GGCamida (SEQ ID NO:14),
G.Apc.GDVKC_{Acm}GC_{Acm}GGC.amida (SEQ ID NO:15),
CC_{Acm}GC_{Acm}GGRGDS (SEQ ID NO:16),
acetil-RRARGDDLDC_{Acm}GC_{Acm}GGC.amida (SEQ ID NO:17),
GRGDFGGC_{Acm} (SEQ ID NO:18),
ma_{Bz}-GGRGDF (SEQ ID NO:19),
C_{Acm}GGGRGDF (SEQ ID NO:20),
GRGDGGC_{Acm} (SEQ ID NO:21),
ma-GGRGDF (SEQ ID NO:22),
ma_{Acm}-GGGRGDF (SEQ ID NO:23),
ma-RGDF (SEQ ID NO:24),
ma-RGD,
CH_{2}CO.Y_{D}.Apc.GDCGGC.amida (SEQ ID NO:25),
CH_{2}CO.Y_{D}.Apc.GDCGGGC.amida (SEQ ID NO:26),
CH_{2}CO.Y_{D}.Apc.GDCKGGGC.amida (SEQ ID NO:27)
CH_{2}CO.Y_{D}.Apc.GDCGGGGC.amida (SEQ ID NO:28),
GGRGDSC (SEQ ID NO:29),
GGRGDGGRGDSC (SEQ ID NO:30),
GGRGDGGRGDGGRGDSC (SEQ ID NO:31),
RRRRRRRRRGDVC (SEQ ID NO:32),
CGRGDVK.amida (SEQ ID NO:33),
CGRGDV.amida (SEQ ID NO:34),
CGRGDVRGDFK.amida (SEQ ID NO:35),
CGRGDVRGDF.amida (SEQ ID NO:36),
acetil-G.Apc.GDV.Apc.GDFKGGCamida (SEQ ID NO:37),
G.Apc.GDV.Apc.GDFKGGCamida (SEQ ID NO:38),
G.Apc.GDVKGGC.amida (SEQ ID NO:39),
CGGRGDS (SEQ ID NO:40),
acetil-RRARGDDLDGGC.amida (SEQ ID NO:41),
CKRARGDDMDDYC (SEQ ID NO:42),
mmp-GGGRGDF (SEQ ID NO:43),
acetil-RGDC.amida(SEQ ID NO:44),
CRGDC (SEQ ID NO:45),
CGGGRGDF (SEQ ID NO:46),
GRGDGGGGC (SEQ ID NO:47),
GRGDGGC (SEQ ID NO:48),
ma_{Acm}-GGGRGDF (SEQ ID NO:49),
acetil-CNP.Apc.GDC(SEQ ID NO:50),
CRIARGDWNDDYC (SEQ ID NO:51),
CKFFARTVCRIARGDWNDDYCTGKSSDC (SEQ ID NO:52),
KYGGHHLGGAKQAGDV (SEQ ID NO:53),
(CH_{2}CO-Y_{D}.Amp.GDCKGCG.amida)_{2}-(\varepsilon-K)GC.amida,
o
CH_{2}CO-Y_{D}.Amp.GDCKGCG.amida (SEQ ID NO:54).
Cada realización de la invención que contiene péptido de direccionamiento comprende una secuencia de aminoácidos. El término aminoácido, tal como se utiliza en esta invención, tiene por objeto incluir todos los aminoácidos L y D, que existen naturalmente y de otros tipos. Las abreviaturas de una sola letra para los aminoácidos pueden encontrarse en Zubay, Biochemistry (2ª edición), 1988. (MacMillen Publishing: Nueva York) p. 33; el subrayado indica la formación de un enlace tiol entre los aminoácidos o grupos derivados enlazados; Ac = acetilo; Bz = benzoílo; Amp = 4-amidinofenilalanina; (\varepsilon-K) = lisina enlazada a través del grupo amino (épsilon) de la cadena lateral; Acm = acetamidometilo; Mob = 4-metoxibencilo; Apc = L-S-(3-aminopropil)cisteína; Hly = homolisina; F_{D} = D-fenilalanina; Y_{D} = D-tirosina; ma = ácido 2-mercapto-acético; mmp = ácido 2-mercapto-2-metilpropiónico. La lista de péptidos de direccionamiento arriba expuesta es ilustrativa y no tiene por objeto ser limitante o exclusiva, y los expertos en la técnica comprenderán que péptidos que comprenden combinaciones de los péptidos descritos en esta memoria o sus equivalentes pueden enlazarse covalentemente a cualquiera de las proteinasas trombolíticas de la invención y están dentro de su alcance.
Como se define en esta memoria, una proteinasa trombolítica está "enlazada covalentemente" a un compuesto de direccionamiento cuando un enlace peptídico media la conexión entre la proteinasa y el compuesto. De acuerdo con la invención, el enlace covalente puede ser directo, es decir, un resto químico de la proteinasa puede estar enlazado a un resto químico que forma parte del compuesto de direccionamiento sin sustituyentes intramoleculares interpuestos. Alternativamente, el enlace covalente de la proteinasa trombolítica y el compuesto de direccionamiento puede ser indirecto, es decir, pueden estar interpuestos sustituyentes químicos entre un resto químico de la proteinasa y un resto químico que forma parte del compuesto de direccionamiento.
Los péptidos de direccionamiento de la presente invención pueden sintetizarse químicamente in vitro. Tales péptidos pueden prepararse ventajosamente por regla general en un sintetizador de péptidos. Cuando los compuestos de direccionamiento de la invención se sintetizan químicamente, los mismos pueden estar enlazados covalentemente a la proteinasa trombolítica por un resto químico de conjugación. En realizaciones preferidas, este resto comprende un resto químico de conjugación bifuncional. En una realización, la proteinasa trombolítica está conjugada con desde aproximadamente 1 a aproximadamente 10, de modo más preferible desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 5 y de modo muy preferible desde aproximadamente 1 a aproximadamente 3 copias del compuesto de direccionamiento. Realizaciones preferidas de los restos químicos de conjugación que comprenden los agentes trombolíticos de la invención incluyen, pero sin carácter limitante, N-succinimidil-2-(2-piridilditio)-propionato, éster de N-(\gamma-maleimidobutiriloxi)-sulfosuccinimida, 4-(p-maleimidofenil)butirato de succinimidilo, 4-(p-maleimidofenil)butirato de sulfosuccinimidilo, 4-succinimidiloxicarbonil-metil-\alpha-(2-piridilditio)tolueno, N-hidroxisuccinimidil-2,3-dibromopropionato, N-succinimidil-(4-yodoacetil)-aminobenzoato, sulfosuccinimidil-(4-yodoacetil)-aminobenzoato, succinimidil-4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato, sulfosuccinimidil-4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato, éster de N-(\gamma-maleimidobutiriloxi)-succinimida, éster de m-maleimidobencenil-N-hidroxisuccinimida, éster de m-maleimidobencenil-N-hidroxisulfosuccinimida, 6-(\alpha-metil)-\alpha-(2-piridilditio)-toluamida-hexanoato de sulfosuccinimidiloxicarbonilo, y 6-(\alpha-metil-\alpha-(2-piridilditio)toluamido)-hexanoato de sulfosuccinimidilo.
Los conjugados trombolíticos de la invención pueden producirse recombinantemente. En esta realización, un ácido nucleico que codifica una o más copias del péptido de direccionamiento está enlazado operativamente a un ácido nucleico que codifica la enzima proteolítica para producir un ácido nucleico que codifica un conjugado que puede expresarse en una célula hospedadora adecuada a fin de producir el conjugado trombolítico. Como se utiliza en esta memoria, "enlazado operativamente" significa ligado enzimática o químicamente para formar un enlace covalente entre los ácidos nucleicos. Puede emplearse cualquier ácido nucleico para producir el agente trombolítico de la invención, con tal que el ácido nucleico codifique el péptido de direccionamiento y la enzima proteolítica y siempre que el ácido nucleico sea capaz de expresarse en una células hospedadora. Por supuesto, secuencias de ácido nucleico degeneradas que codifican el péptido de direccionamiento y la enzima proteolítica pueden emplearse para producir el agente trombolítico. Preferiblemente, se utilizan ácidos desoxirribonucleicos para la producción recombinante de los agentes trombolíticos de la invención.
De acuerdo con esta realización, el ácido nucleico que codifica el agente trombolítico está enlazado operativamente a una secuencia de control de la expresión apropiada para formar un vector de expresión, que se transforma (se transfecta) en una célula hospedadora apropiada. Puede emplearse cualquier vector de expresión adecuado para producir los agentes trombolíticos de la invención recombinantemente. Secuencias de control de la expresión para una diversidad de células hospedadoras se conocen en la técnica. Para expresión en mamíferos, vectores de expresión ilustrativos incluyen pED (Kaufman et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19, 4484-4490; pEF-BOS (Mizushima et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18, 5322; pXM, pJL3 y pJL4 (Gough et al. (1995) EMBO J. 4, 645-653; pMT2 (derivado de pMT2-VWF, A.T.C.C. \alm{1}67122, véase PCT/US87/00033); y análogos. Vectores de expresión adecuados para uso en levaduras y células bacterianas se conocen también, y vectores de expresión para células de insecto se indican, por ejemplo, en la Patente U.S. No. 5.004.687 y en Summers y Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555
(1987). La construcción de tales vectores de expresión está perfectamente dentro del nivel de experiencia 
\hbox{en la
técnica.}
Células hospedadoras adecuadas incluyen, por ejemplo, células de mamífero tales como células COS de mono, células de ovario de hámster chino (CHO), células 293 de riñón humano, células A431 de epidermis humana, células Colo205 humanas, células 3T3 de ratón, células CV-1, otras líneas de células de primate transformadas, células diploides normales, cepas de células derivadas de cultivo in vitro de tejido primario, explantes primarios, células HeLa, células L de ratón, células BHK, células HL-60, células U937, células HaK, y análogas. Materiales y métodos para expresión de baculovirus/células de insecto están disponibles comercialmente, v.g., de Invitrogen, San Diego, California, EE.UU. (el kit MaxBac®). Cepas de levaduras adecuadas incluyen, por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, cepas de Kluyveromyces, Candida, o cualquier cepa de levadura capaz de expresar proteínas heterólogas. Cepas bacterianas adecuadas incluyen Escherichia coli, Bacillus subtilis, cepas atenuadas de Salmonella typhimurium, o cualquier cepa bacteriana capaz de expresar proteínas heterólogas.
Los agentes trombolíticos de la invención pueden expresarse también como producto de animales transgénicos, v.g., como un componente de la leche de vacas, cabras, cerdos, u ovejas transgénicos(as) que se caracterizan por células somáticas o germinales que contienen una secuencia de ácido nucleico que codifica los conjugados.
En ciertas realizaciones de los agentes trombolíticos de la invención, el agente se somete a radiomarcación, preferiblemente con un radioisótopo emisor gamma tal como Tc-99m, ^{111}In, ^{68}Ga, ^{123}I o ^{131}I (véase, por ejemplo, Pearson et al., 1996 J. Med. Chem. 39: 1372-1382). Se proporcionan agentes trombolíticos marcados radiactivamente proporcionados por la presente invención que tienen una cantidad adecuada de radiactividad. Generalmente, la dosis de agente trombolítico radiomarcado administrada tiene una radiactividad de aproximadamente 0,01 mCi a aproximadamente 100 mCi, con preferencia 1 mCi a 20 mCi.
Una característica ventajosa de los agentes trombolíticos de la invención es que la localización de tales agentes puede visualizarse, y el curso de la trombólisis puede monitorizarse, in vivo, y en tiempo real. La administración de agentes trombolíticos radiomarcados puede utilizarse por tanto para monitorizar de cerca el curso del tratamiento y facilitar la elección y administración de las cantidades terapéuticamente eficaces de los agentes trombolíticos de la invención.
Una dosis baja de una forma marcada del agente trombolítico de la invención puede utilizarse también para obtener imágenes de trombos para propósitos de diagnóstico. En esta realización puede utilizarse cualquier marcador generador de señal. Por ejemplo, pueden utilizarse radiomarcadores, marcadores fluorescentes, marcadores paramagnéticos, elementos pesados o iones de tierras raras adecuados para uso en tomografía computerizada, y análogos, para marcar el agente trombolítico de la invención para propósitos de diagnóstico.
Como se utiliza en esta memoria, la expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" significa la cantidad total de cada componente activo de la composición farmacéutica que contiene el agente trombolítico de la invención o método que emplea el agente trombolítico de la invención que es suficiente para exhibir un beneficio significativo para el paciente, a saber, la reducción en la incidencia y gravedad de los trombos en comparación con la esperada para un grupo comparable de pacientes que no reciben el agente trombolítico de la invención, tal como es determinado por el médico que tiene a su cargo el tratamiento. Cuando se aplica a un ingrediente activo individual administrado solo, el término hace referencia a dicho ingrediente solo. Cuando se aplica a una combinación, el término hace referencia a las cantidades combinadas de los ingredientes activos que dan como resultado el efecto terapéutico, sea administrados en combinación, sucesivamente, o de modo simultáneo.
Los agentes trombolíticos proporcionados por la presente invención se proporcionan como composiciones farmacéuticas para lisar los trombos in vivo. De acuerdo con la doctrina de esta invención, los agentes trombolíticos se administran preferiblemente en una sola dosis inyectable unitaria. Estos agentes pueden administrarse por vía intravenosa en cualquier medio convencional para inyección intravenosa tal como un medio salino acuoso, o en medio de plasma sanguíneo. La solución a inyectar en dosis unitarias es de aproximadamente 0,01 ml a aproximadamente 10 ml. Los agentes trombolíticos de la invención se administran preferiblemente en una dosis que va desde aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal, administrada por vía intravenosa sea totalmente como un bolus o parcialmente como un bolus seguido por infusión durante 1-2 horas. En las realizaciones radiomarcadas de los agentes trombolíticos, la dosis unitaria a administrar tiene una radiactividad de aproximadamente 0,01 mCi a aproximadamente 100 mCi, preferiblemente 1 mCi a 20 mCi. Después de la administración intravenosa, el sitio del trombo se monitoriza, en ciertas realizaciones por formación de radioimágenes in vivo.
Los métodos para fabricar, radiomarcar y utilizar los agentes trombolíticos de la invención se ilustran más detalladamente en los ejemplos que siguen, que se presentan a modo de ilustración y no con carácter de limitación.
Ejemplo 1 Purificación de la Fibrolasa
Se purificó fibrolasa a partir del veneno de Agkistrodon contortrix contortrix utilizando un protocolo de purificación bioquímico como se describe en Loayza et al. (1994), J. Chromatog. B 662: 227-243).
Resumidamente, el veneno bruto de la serpiente se obtuvo de Biotoxins Inc. (St. Cloud, FL) o del Miami Serpentarium Laboratory (Punta Gorda, FL). Todos los pasos de purificación se realizaron a 4ºC. Se aplicaron 10 gramos de veneno en 5 aplicaciones a una columna de cromatografía de interacción hidrófoba de 250 mm (HIC; Poly Propyl A, Poly LC, Western Analytical Products, Temecula, CA) que tenía un diámetro interior de 21 mm. El veneno se disolvió a una concentración de 2 g por 9 ml de tampón HIC A (que comprende fosfato 0,01 M, sulfato de amonio 1 M, y 0,02% de azida de sodio, pH 6,8) y se sometió a centrifugación a 9.000 g durante 30 minutos a 4ºC para eliminar los contaminantes particulados. La solución sobrenadante resultante se filtró a través de una membrana de 0,2 \mum y se aplicó luego a la columna HIC. Las proteínas del veneno se eluyeron de la columna utilizando un protocolo de elución en gradiente como sigue: (a) 50 minutos isocráticamente a 100% tampón HIC A; (b) 90 minutos utilizando un gradiente lineal hasta 100% tampón HIC B (que comprende fosfato 0,1 M y 0,02% de azida de sodio, pH 6,8), y (c) 60 minutos isocráticamente a 100% tampón HIC B. El caudal a través de la columna se mantuvo a 5 ml/minuto, y se recogieron fracciones de 5 ml. Las fracciones se monitorizaron espectrofotométricamente utilizando absorbancia a 280 mm, y se analizaron respecto a actividad fibrinolítica, y por electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE).
Las fracciones que contenían actividad fibrinolítica se agruparon, se concentraron utilizando sulfato de amonio al 80%, y se dializaron contra tampón de hidroxiapatito (HAP) (que comprende fosfato 0,01 M, 0,02% de azida de sodio, pH 6,8). Esta muestra dializada se concentró utilizando una celdilla agitada que contenía una membrana YM 10 o un concentrador Centricon-10 (obtenidos ambos de Amicon, Beverly, MA), a un volumen final de aproximadamente 10 ml.
Esta muestra concentrada se aplicó luego a una columna de hidroxiapatito (HAP) de 100 mm (SynChropak HAP-5, SynChrom, Lafayette, IN) que tenía un diámetro interior de 21,1 mm. Las proteínas del veneno se eluyeron de esta columna utilizando un protocolo de elución en gradiente como sigue: (a) 15 minutos isocráticamente a 100% tampón HAP A; (b) 130 minutos utilizando un gradiente lineal hasta 60% tampón HAP B (que comprende fosfato 0,35 M y 0,02% de azida de sodio, pH 6,8); y (c) 35 minutos de gradiente lineal hasta 100% tampón HAP B. El caudal a través de la columna se mantuvo a 2 ml/minuto, y se recogieron fracciones de 2 ml. Como en el caso anterior, las fracciones se monitorizaron espectrofotométricamente utilizando absorbancia a 280 nm, y se analizaron respecto a actividad fibrinolítica.
Se utilizó cromatografía de intercambio de aniones utilizando una columna de cromatografía líquida rápida de proteínas de alta resolución de 100 mm (Mono Q, Pharmacia LKB, Piscataway, NJ) que tenía un diámetro interior de 16 mm para la eliminación de contaminantes menores de las fracciones que contenían actividad fibrolítica. Las fracciones de la cromatografía HAP que tenían actividad fibrolítica se agruparon, se concentraron utilizando la celdilla agitada Amicon como anteriormente, y se utilizaron contra varios cambios de Mono Q tampón A (que comprende Tris-HCl 20 mM, pH 8) durante una noche. Un volumen correspondiente a aproximadamente 18 mg de proteína se filtró a través de una membrana de 0,2 \mum y se aplicó a la columna Mono Q. Las proteínas del veneno se eluyeron de esta columna utilizando un protocolo de elución en gradiente como sigue: (a) 10 minutos isocráticamente a 100% tampón Mono Q A; (b) 90 minutos utilizando un gradiente lineal hasta 20% tampón Mono Q B (que comprende Tris-HCl 20 mM, NaCl 500 mM, pH 8); (c) 5 minutos de gradiente lineal a 100% tampón Mono Q B; y (d) 5 minutos isocráticamente a 100% tampón Mono Q B. El caudal a través de la columna se mantuvo en 4 ml/minuto, y se recogieron fracciones de 2 ml. Como anteriormente, las fracciones se monitorizaron espectrofotométricamente utilizando absorbancia a 280 nm, y se analizaron respecto a actividad fibrinolítica y por SDS-PAGE.
El protocolo de purificación dio como resultado una preparación de fibrolasa purificada de otras proteínas presentes originalmente en el veneno de la serpiente. El análisis SDS-PAGE de las fracciones de la columna Mono Q que tenían actividad fibrinolítica exhibió purificación hasta homogeneidad, comprendiendo una sola banda que tenía un peso molecular aparente de aproximadamente 23 kD. El análisis ulterior, sin embargo, reveló que la fibrolasa nativa purificada utilizando este esquema estaba constituida por dos isoformas, detectables utilizando electroforesis en gel de enfoque isoeléctrico de intervalo muy estrecho (pH 6,6-6,9). Las dos isoformas de la fibrolasa se separaron utilizando un protocolo HPLC de intercambio de cationes débiles, como sigue. Aproximadamente 9 mg de proteína de la agrupación de fracciones Mono Q se dializaron contra tampón CM A (que comprende ácido 2-(N-morfolino)-etanosulfónico 30 mM, sal de sodio (NaMES), pH 6,4) y se concentraron utilizando la celdilla agitada Amicon. La muestra se filtró a través de una membrana de 0,2 \mum y se aplicó a una columna HPLC de carboximetil-celulosa de 250 mm (SynChropak CM 300, SynChrom; diámetro interior 10 mm). Las proteínas isoforma de fibrolasa se eluyeron de esta columna utilizando un protocolo de elución en gradiente como sigue: (a) 10 minutos isocráticamente a 100% tampón CM 300 A; (b) 95 minutos utilizando un gradiente lineal a 30% tampón CM 300 B (que comprende NaMES 30 mM, NaCl 300 mM, pH 6,4); (c) 40 minutos de gradiente lineal a 100% tampón CM 300 B; y (d) 10 minutos isocráticamente a 100% tampón CM 300 B. El caudal a través de la columna se mantuvo a 2,4 ml/minuto, y se recogieron fracciones de 1,2 ml.
Para disolver completamente las isoformas, las fracciones agrupadas que contenían cada una las isoformas fib1 y fib2 se dializaron contra tampón CM 300 A, se aplicaron de nuevo a la columna y se eluyeron como se ha descrito. Las fracciones que contenían actividad fibrinolítica procedentes de cada una de las isoformas de fibrolasa se agruparon, se concentraron y se cambiaron a un tampón que comprendía HEPES 20 mM, NaCl 50 mM, pH 7,2, se diluyeron (o concentraron) hasta una concentración de aproximadamente 1 mg/ml, y se guardaron a -80º hasta su utilización. La concentración de proteínas se determinó utilizando un ensayo disponible comercialmente (BCA, Pierce Chemical Co., Rockford, IL).
Alternativamente, puede producirse fibrolasa recombinante utilizando los métodos de la Solicitud de Patente Europea EP 323722 y Loayza et al. (ibid.), incorporándose las doctrinas de estas citas por referencia en esta memoria.
Ejemplo 2 Síntesis de Péptidos en Fase Sólida
Se realizó la síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS) en una escala de 0,25 milimoles (mmol) utilizando un Sintetizador de Péptidos Applied Biosystems Modelo 431A y utilizando protección del término amino con 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc), acoplamiento con diciclohexilcarbodiimida/hidroxibenzotriazol o hexafluorofosfato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametil-uronio/hidroxibenzotiazol (HBTU/HOBT), y utilizando resina de p-hidroximetilfenoxi-metilpoliestireno (HMP) para los ácidos del término carboxilo o resina de amida de Rink para las amidas del término carboxilo. Los productos fijados a la resina se escindieron rutinariamente utilizando una solución que comprendía ácido trifluoroacético, agua, tioanisol (si está contenido un residuo arginina en el péptido), etanoditiol, y trietilsilano, preparada en relaciones de 100:5:5:2,5:2 durante 0,5-3 horas a la temperatura ambiente.
En caso apropiado, se introdujeron grupos acetilo N-terminales por tratamiento del péptido amino libre del terminal N fijado a la resina con 20% v/v de anhídrido acético en NMP (N-metilpirrolidinona) durante 30 minutos. En caso apropiado, se introdujeron grupos 2-cloroacetilo y 2-bromoacetilo por utilización del ácido 2-halo-acético apropiado como el último residuo a acoplar durante la SPPS o por tratamiento del péptido amino libre del término N fijado a la resina con el ácido 2-halo-acético/diisopropilcarbodiimida/N-hidroxisuccinimida en NMP o el anhídrido 2-halo-acético/diisopropiletilamina en NMP. En caso apropiado, los péptidos haloacetilados en posición 2 se sometieron a ciclación por agitación en una solución de 0,1-1,0 mg/ml en tampón de fosfato o bicarbonato (pH 8) que contenía EDTA 0,5-1,0 mM durante 4-48 horas, seguido por acidificación con ácido acético, liofilización y purificación por HPLC. En caso apropiado, se realizaron ciclaciones del enlace disulfuro Cys-Cys por tratamiento de los péptidos tiol precursores exentos de cisteína a 0,1 mg/ml, en tampón de pH 7 con partes alícuotas de K_{3}Fe(CN)_{6} 0,006 M hasta que persistió un color amarillo estable. Se redujo el exceso de oxidante con exceso de cisteína, se liofilizó la mezcla y se purificó luego por HPLC.
En caso apropiado, se preparan los aminoácidos 4-amidinofenilalanina y L-(S-3-aminopropil)-cisteína utilizando el protocolo de Pearson et al., 1996, J. Med. Chem. 39: 1372-1382, incorporado por referencia en esta memoria.
Los péptidos brutos se purificaron por cromatografía líquida preparativa a alta presión (HPLC) utilizando una columna Waters Delta Pak C18 y elución en gradiente utilizando ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1% en agua modificada con acetonitrilo. Se evaporó el acetonitrilo de las fracciones eluidas, las cuales se liofilizaron después. La identidad de cada producto se confirmó por espectroscopia de masas con bombardeo de átomos rápidos (FABMS) o espectrometría de masas con pulverización electrónica (ESMS).
Ejemplo 3 Reticulación de la Fibrolasa con Agentes de Reticulación Químicos 1. Reticulación de la fibrolasa con S-GMBS por la vía de una amina primaria
Se preparó la isoforma 2 de fibrolasa (fib2) como se describe en el Ejemplo 1. Se disolvió éster de N-(\gamma-maleimidobutiriloxi)sulfosuccinimida (S-GMBS, representado en la Figura 1 y obtenido de Pierce) en agua a una concentración final de 25 mM. Se combinaron fibrolasa y S-GMBS en una relación molar de 1:20 en un volumen total de 1 ml, y se dejaron reaccionar durante 30 minutos a la temperatura ambiente. Después de este tiempo de reacción, se retiró el exceso de S-GMBS utilizando un concentrador centrífugo Amicon Centricon-10. La reacción se diluyó con 1 ml adicional de tampón de dilución de fibrolasa, se aplicó al concentrador y se centrifugó hasta que el volumen se redujo a aproximadamente 200 \mul. Se añadieron 1,8 ml adicionales de tampón y el volumen se redujo de nuevo a 200 \mul por centrifugación. Este protocolo se repitió hasta que hubo pasado un volumen de aproximadamente 10 ml a través del concentrador, correspondiente a una dilución aproximada 1:1000 de los reactivos que comprendían la mezcla de reacción fibrolasa:S-GMBS. El producto retenido final del concentrador se diluyó con tampón a un volumen final de 1 ml, y se determinó que la concentración de fibrolasa era 0,84 mg/ml utilizando el reactivo y protocolo BCA (Pierce). Las reacciones de acoplamiento (descritas más adelante) se realizaron en el transcurso de una hora después de la reticulación química.
La extensión de la formación de aducto de S-GMBS con la fibrolasa se determinó utilizando un reactivo de detección fluorescente (SAMSA-fluoresceína, Figura 2, obtenida de Molecular Probes, Eugene OR). Este reactivo (después de activación con una base fuerte) forma un enlace covalente con los grupos que reaccionan con tiol en reactivos de modificación de proteínas tales como S-GMBS. La absorbancia y las propiedades fluorescentes de SAMSA-fluoresceína han sido caracterizadas extensamente, lo que permite la cuantificación del número de aductos SAMSA-fluoresceína formados por molécula de fibrolasa, lo cual proporciona a su vez una estimación exacta del número medio de agentes de reticulación que se han enlazado covalentemente a cada molécula de fibrolasa. (La fibrolasa carece totalmente de grupos sulfhidrilo libres que pudieran reaccionar con SAMSA-fluoresceína).
Se activó SAMSA-fluoresceína por incubación de 1 mg del reactivo en 100 \mul de NaOH 0,1 M durante 15 minutos a la temperatura ambiente. Las fracciones se neutralizaron luego por la adición de 14 \mul de HCl 6 M tamponado con 200 \mul de fosfato de sodio 0,5 M, pH 7. Una parte alícuota de fibrolasa reticulada con S-GMBS Se combinó luego con SAMSA-fluoresceína activada a una relación molar de 1:10 y se incubó a la temperatura ambiente durante 30 minutos. La SAMSA-fluoresceína no fijada se eliminó como se ha descrito arriba utilizando una unidad concentradora Centricon que tenía un punto de corte por peso molecular de 3000 dalton; se intercambiaron 10 volúmenes de tampón con la mezcla de reacción de fibrolasa tratada con SAMSA-fluoresceína. Después de la concentración, se determinó la absorbancia de la proteína reticulada-SAMSA-fluoresceína a 495 nm. Sobre la base de un coeficiente de extinción de 80.000 cm^{-1}M^{-1}, se calculó que el número de grupos maleimida libres reactivos con S de la S-GMBS enlazada covalentemente a la fibrolasa era 1,7 por molécula de fibrolasa. Este ensayo demuestra también que existían 1,7 grupos maleimida libres por molécula de fibrolasa disponibles para la reacción con el péptido (como se describe más adelante). Se realizaron reacciones de control utilizando tampón que no contenía cantidad alguna de fibrolasa, así como tampón que contenía fibrolasa no reticulada, cada uno de los cuales proporcionó una determinación de la fluorescencia inespecífica de fondo.
2. Reticulación de fibrolasa con SPDP y S-SMPT
Se preparó fibrolasa isoforma 2 (fib2) como se describe en el Ejemplo 1. Una solución de fibrolasa a una concentración de 2,6 mg/1,2 ml en HEPES 50 mM, NaCl 100 mM, pH 7,5 se trató con un exceso molar de 10 veces de N-succinimidil-3-(2-piridilditio)-propionato (SPDP, Figura 3) o 6-(\alpha-metil-\alpha-(2-piridilditio)toluamido)-hexanoato de sulfosuccinimidilo (S-SMPT, Figura 4). Se prepararon soluciones stock de cada uno de estos reactivos a una concentración de 20 mM en dimetilsulfóxido). Cada mezcla del reactivo y fibrolasa se agitó moderadamente a la temperatura ambiente durante 30 minutos. Se retiró el exceso del reactivo de reticulación por filtración en gel utilizando una columna Sephadex G-25 o por centrifugación utilizando el concentrador Centricon-10 como se ha descrito arriba. Se determinó la concentración final de proteínas utilizando los reactivos y el protocolo BCA.
La eficiencia de reticulación tanto de SPDP como de S-SMPT se determinó por la producción de piridina-2-tiona a partir de fibrolasa reticulada después de tratamiento con ditiotreitol. Una parte alícuota de fibrolasa reticulada (220 \mug en 1,2 ml) se trató con 0,1 ml de ditiotreitol 25 mM a la temperatura ambiente durante 30 minutos. La cantidad de piridina-2-tiona liberada por los agentes de reticulación SPDP y S-SMTP se detectó espectrofotométricamente a 343 nm, y se calculó la cantidad correspondiente de cada reticulador enlazado covalentemente a fibrolasa utilizando el coeficiente de extinción de piridina-2-tiona, 80.800 cm^{-1}M^{-1}. Utilizando este ensayo, se encontró que las eficiencias de reticulación de SPDP y S-SMTP eran prácticamente idénticas, existiendo 1,7 moles de cada reticulador por mol de proteína fibrolasa.
Ejemplo 4 Acoplamiento de la Fibrolasa Reticulada con Péptido 1. Acoplamiento del péptido con fibrolasa reticulada por S-GMBS
Un péptido que tenía la estructura CH_{2}CO-Y_{D}.Amp.GDCKGCG.amida (SEQ ID NO:54, las abreviaturas y otras convenciones son como se ha descrito arriba) se acopló a fibrolasa reticulada con S-GMBS como sigue. Se añadió el péptido a la fibrolasa reticulada en una relación molar péptido:extremos de reticulación 5:1 (equivalente a una relación molar péptido:fibrolasa 5:1,7 para las preparaciones de fibrolasa reticulada del Ejemplo 3). Se añadió lentamente el péptido liofilizado a una solución agitada de fibrolasa para permitir que el péptido se disolviera lenta y completamente. La reacción se efectuó bajo una ligera corriente de nitrógeno durante 30 minutos iniciales, después de lo cual la mezcla de reacción se tapó y se incubó a la temperatura ambiente durante 15 horas. Después de esta incubación, se retiró de la fibrolasa conjugada el exceso de péptido no conjugado utilizando un concentrador centrífugo que tenía un punto de corte por peso molecular de 10.000 dalton. Una parte alícuota del conjugado final se ensayó con SAMSA-fluoresceína para determinar la extensión de la fibrolasa reticulada no conjugada. Este ensayo determinó que se incorporaban en el aducto un promedio de 1,7 moles de péptido por mol de fibrolasa, lo que indicaba que esencialmente la totalidad de los grupos reactivos maleimida libres en la fibrolasa reticulada se habían conjugado con el péptido.
2. Acoplamiento del péptido a fibrolasa reticulada con SPDP y S-SMPT
Un péptido que tenía la estructura CH_{2}CO-Y_{D}.Amp.GDCKGCG.amida (SEQ ID NO:54) se acopló a fibrolasa reticulada con SPDP y S-SMTP como sigue. Se añadió el péptido a fibrolasa reticulada en una relación molar de 2:1 péptido:extremos de reticulación (equivalente a una relación molar de 2:1,7 péptido:fibrolasa para las preparaciones de fibrolasa reticuladas del Ejemplo 3). El péptido liofilizado se añadió lentamente a una solución agitada de fibrolasa para permitir que el péptido se disolviera lenta y completamente. La reacción se efectuó bajo una corriente suave de nitrógeno durante 5 minutos iniciales, después de lo cual se tapó la mezcla de reacción y se incubó a la temperatura ambiente durante una noche. Después de esta incubación, se retiró el exceso de péptido no conjugado de la fibrolasa conjugada utilizando un concentrador centrífugo que tenía un punto de corte por peso molecular de 10.000 dalton. Una parte alícuota del conjugado final se ensayó con SAMSA-fluoresceína para determinar la proporción de la fibrolasa reticulada no conjugada. Este ensayo determinó que se incorporaban en el aducto un promedio de 1,7 moles de péptido por mol de fibrolasa, lo que indicaba que esencialmente la totalidad de los grupos reactivos maleimida libres en la fibrolasa reticulada se habían conjugado con el péptido.
3. Purificación por HPLC de los conjugados fibrolasa:péptido
Los conjugados péptido:fibrolasa se purificaron por HPLC como sigue. Por ejemplo, los conjugados reticulados con SPDP se aplicaron a una columna de intercambio de catión de 200 mm (Poly Cat A, Western Analytical Products, Inc., Temecula, CA) en tampón NaMES a un caudal de 1 ml/minuto. Los conjugados se eluyeron de la columna utilizando un gradiente de elución de 0 a 30% de tampón de elución B (que comprende NaMES 30 mM y NaCl 0,3 M, pH 6,4) durante 95 minutos, seguido por elución durante 40 minutos con 100% de tampón de elución B.
Los resultados de este protocolo de purificación se muestran en la Figura 5. El panel A ilustra el perfil de elución de la fibrolasa isoforma 2 no conjugada de control, que se eluía de la columna al cabo de 29,9 minutos, y el panel B muestra el perfil de elución del péptido no conjugado, que se eluía de la columna al cabo de 66,7 minutos. El perfil de elución de la fibrolasa reticulada a SPDP exhibía dos picos: un primer pico a los 6,8 minutos que representaba PDP-fibrolasa, y un segundo pico a los 29 minutos que correspondía a fibrolasa no modificada (panel C). Los conjugados péptido-fibrolasa se eluían de la columna como se muestra en el panel D a los 6,3 minutos, mientras que la fibrolasa no conjugada se eluía a los 29 minutos como se ha descrito previamente. La cantidad de conjugado péptido:fibrolasa obtenida utilizando este protocolo fue 1,46 mg a partir de una cantidad inicial de 2,6 mg de fibrolasa, un rendimiento global de 56,5%.
La identidad química del conjugado se determinó por análisis de la composición de aminoácidos. Se hidrolizaron muestras de conjugado (33-50 mg) en HCl 6 N durante 90 minutos a 150ºC. Los hidrolizados se derivatizaron con fenilisotiocianato y se analizaron utilizando un analizador automático de aminoácidos (Modelo 420A, obtenido de Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). El análisis se realizó por triplicado en una columna HPLC PTC-18 de 2,1 x 220 mm, a un caudal de 300 ml/minuto utilizando un detector ultravioleta ajustado a 254 nm. Los análisis de la composición de aminoácidos se realizaron por triplicado.
Los resultados de estos análisis se muestran en la Tabla I y en la Figura 6. La fibrolasa está compuesta por 203 aminoácidos (como se describe en Randolph et al., 1992, Prot. Sci. 1: 590-600), y el péptido está constituido por 9 aminoácidos. Un derivado de arginina singular (representado como el pico a 14,8 minutos en la Figura 6) se deriva del péptido; la observación de este tipo en el conjugado purificado confirmó la conjugación péptido:fibrolasa a una relación molar de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 2:1.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA I
1 
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 5 Actividad Proteolítica de los Conjugados Péptido:Fibrolasa
La actividad proteolítica de los conjugados péptido-fibrolasa se determinó utilizando dos sustratos: azocaseína (para determinar la actividad inespecífica de proteasa) y fibrina (para determinar la actividad fibrolítica y comparar esta actividad entre la fibrolasa purificada y el conjugado péptido:fibrolasa). Estos ensayos se realizaron como sigue.
Los ensayos de azocaseína se realizaron como se describe en Retzios et al., (1990, Prot. Express. Purific. 1: 33-39). Resumidamente, se preparó azocaseína disolviendo 2,5 g de azocaseína (Cal BioChem, San Diego, CA) en 50 ml de una solución al 1% de NaHCO_{3}. Esta solución se calentó gradualmente a 60ºC con agitación hasta que la proteína se disolvió por completo. Esta solución se dializó durante una noche contra 4 l de una solución de NaHCO_{3} al 1%, y la proteína se precipitó por la adición de un volumen igual de ácido tricloroacético (TCA) al 10%. La proteína se recogió por centrifugación, se desechó el sobrenadante y el sedimento de proteína se resuspendió en 50 ml de una solución al 1% de NaHCO_{3}. Esta solución se dializó de nuevo durante una noche contra 4 l de una solución de NaHCO_{3} al 1%.
En la realización del ensayo, se combinó 1 ml de la solución del reactivo azocaseína anterior con 50 \mul de la muestra y se incubó a 37ºC durante 30 minutos. Después de esta incubación, se añadió 1 ml de una solución de ácido perclórico 1,16 M. La mezcla de reacción se centrifugó en una centrífuga de sobremesa durante 10 minutos, y se determinó la absorbancia a 390-440 nm contra la muestra en blanco apropiada. Se calculó la actividad proteolítica utilizando una curva estándar de actividad versus absorbancia.
La actividad fibrinolítica se detectó utilizando un ensayo de fibrina en placa descrito en Bajwa et al., (1980, Toxicon 18: 285-289). Resumidamente, se preparó una placa de fibrina pipeteando una solución de fibrinógeno (6 ml de fibrinógeno humano al 1,65% en sulfato de amonio 0,07 M, barbital sódico 50 mM, NaCl 93 mM, CaCl_{2} 1,66 mM, y MgCl_{2} 0,69 mM, pH 7,5) en una cápsula Petri de 90 x 15 mm después de mezclar con 0,2 ml de una solución tópica de trombina (20 unidades NIH/ml en NaCl 150 mM, pH 7,5; obtenida de Parke-Davis, Detroit, MI) que contenía 0,25% de gelatina (laboratorios Difco, Detroit, MI). Las placas se dejaron en reposo a la temperatura ambiente durante al menos 30 minutos sobre una superficie nivelada para formar la capa de fibrina. Se practicaron pequeños orificios (de 2 mm de diámetro) que comprendían los pocillos de muestra en la capa de fibrina, espaciados a intervalos de 1,5 cm en la placa. Se añadieron las muestras a los pocillos de muestra en 10 \mul, y se incubaron las placas a 37ºC durante 18 horas. El aclaramiento de las placas de fibrina se determinó como el aumento en el diámetro del pocillo de muestra debido a la actividad fibrolítica de la muestra. Alternativamente, se utilizó una placa de 24 pocillos para realizar este ensayo, en la cual cada pocillo contiene 300 \mul de una solución de fibrinógeno, a la que se añaden 10 ml de una solución de trombina para iniciar la formación de fibrina.
Los resultados de estos ensayos se presentan en la Tabla II. Se muestran las actividades proteolíticas de fibrolasa, PDP-fibrolasa y conjugado péptido:fibrolasa. La modificación por SPDP de dos grupos \varepsilon-amino en la fibrolasa no parecía tener efecto importante alguno sobre la actividad de la fibrolasa en ninguno de los ensayos. La fibrolasa derivatizada retenía en cada caso más del 90% de la actividad proteolítica de la fibrolasa nativa. La conjugación subsiguiente de PDP-fibrolasa con el péptido (SEQ ID NO:54) no produjo tampoco ningún cambio espectacular en la actividad proteolítica, exhibiendo el conjugado 79-82% de la actividad de la fibrolasa nativa en ambos ensayos. Resultados similares a éstos (obtenidos con un agente de reticulación que tenía una cadena carbonada espaciadora de 6,8 A) se obtuvieron con conjugados reticulados S-SMPT (en los cuales el resto SMPT tiene una rama espaciadora de 20 A) y con conjugados reticulados con S-GMBS (que no exhibían reducción alguna en la actividad proteolítica en ninguno de los ensayos). Estos resultados demuestran que la derivatización de la fibrolasa isoforma 2 con una diversidad de agentes de reticulación químicos y que la conjugación con un péptido específico de las plaquetas no afecta de modo adverso a la actividad proteolítica, y lo que es más importante, la actividad fibrinolítica de la fibrolasa.
TABLA II
2
Ejemplo 6 Ensayos de Inhibición de la Agregación Plaquetaria de los Conjugados Péptido:Fibrolasa
Se realizaron estudios de la agregación plaquetaria esencialmente como ha sido descrito por Zucker (1989, Methods in Enzymol. 169: 117-133). Resumidamente, se ensayó la agregación plaquetaria con o sin compuestos inhibidores supuestos de la agregación plaquetaria utilizando plasma humano reciente rico en plaquetas (PRP), que comprendía 250.000 plaquetas por \mul. Se extrajo recientemente sangre humana entera (36 ml) de individuos voluntarios que estaban exentos de medicación durante al menos dos semanas antes de la extracción de sangre. Se diluyó la sangre en 4 ml de una solución 0,1 M de citrato de sodio y se centrifugó (150 g durante 20 minutos a 22ºC) para reducir a un sedimento los glóbulos rojos. El sobrenadante, que comprendía PRP, se retiró y la sangre residual se centrifugó de nuevo a 8.000 g durante 10 minutos para producir plasma pobre en plaquetas (PPP); utilizado para diluir el PRP a una concentración final de 250.000 plaquetas/\mul). Alternativamente, se preparó PPP por centrifugación de PRP durante 1 minuto en una microcentrífuga de sobremesa. PPP se utiliza también como control negativo para la agregación plaquetaria.
Se indujo la agregación plaquetaria por la adición a 37ºC de una solución de adenosina-difosfato (ADP)a una concentración final de 20 \muM, y se monitorizó la extensión de la agregación plaquetaria utilizando un agregómetro de 4 canales (Modelo IV Plus, Helena Laboratories, Beaumont, TX). Las concentraciones de compuestos inhibidores de la agregación plaquetaria utilizadas se variaron desde 0,1 a 500 \mug/ml, y estos compuestos se añadieron a PRP inmediatamente antes (aproximadamente 1 minuto antes) de la adición de la solución de ADP utilizada para inducir la agregación plaquetaria. La concentración de inhibidor que reducía la extensión de la agregación plaquetaria en un 50% (definida como el valor CI_{50}) se determinó a partir de gráficas de concentración del inhibidor versus la extensión de la agregación plaquetaria. Se determinaron las curvas de inhibición para una diversidad de desintegrinas que comprendían la secuencia peptídica RGD para cada lote de plaquetas ensayado como controles positivos.
Los resultados de estos experimentos se muestran en la Tabla III. Se determinó que la fibrolasa nativa tiene un valor CI_{50} mayor que 1300 nM, mientras que el péptido (SEQ ID NO:54) exhibía un valor CI_{50} de 67 nM. Se determinó que el péptido (SEQ ID NO:54) conjugado con S-SMPT tenía un valor CI_{50} de 300 nM, mientras que la realización reticulada con S-GMBS exhibía un valor CI_{50} de 97 nM. Estos resultados ilustran que los conjugados péptido:fibrolasa de la invención retienen la capacidad de inhibir la agregación plaquetaria in vitro, una propiedad fuertemente correlacionada con la fijación de las plaquetas y la actividad antitrombótica in vivo.
TABLA III
3
Debe entenderse que la descripción que antecede hace resaltar ciertas realizaciones específicas de la invención y que todas las modificaciones o alternativas equivalentes a la misma están dentro del alcance de la invención como se expone en las reivindicaciones adjuntas.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE: Markland Jr., Francis S.
\hskip3.9cm
Bush, Larry R. 
\hskip3.9cm
Swenson, Stephen 
\hskip3.9cm
Flores Sánchez, Eladio 
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: AGENTES TROMBOLÍTICOS CON ACTIVIDAD ANTITROMBÓTICA
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 54
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESTINATARIO: Diatide, Inc.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 9 Delta drive
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Londonderry
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: NH
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 03053
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOPORTE LÓGICO: PatentIn Release #1.0, Version 1.30
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
DATOS DE SOLICITUDES ANTERIORES:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/753.781
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 02-DIC-1996
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
INFORMACIÓN DE PROCURADOR/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: McDaniels, Patricia A.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 33.194
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE: DITI 124.1
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO:603 437 8970
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TELEFAX: 603 437 8977
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 4 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLECULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Pro Arg Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 12 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLECULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His His Leu Gly Gly Ala Lys Gln Ala Gly Asp Val}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador = D-Tyrisine
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 2
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador = Apc/nota = "El residuo X es L-S-(3-aminopropil)cisteína"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1...5
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: nota = "El azufre de la cadena lateral de la cisteína 5 está carboximetilado y esterificado a la D-tirosina amino-terminal para formar un péptido cíclico"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 8
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=Cacm/nota = "El grupo tiol de la cadena lateral de la cisteína 8 está protegido por un grupo acetamidometilo"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 10
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=Cacm/nota = "El grupo tiol de la cadena lateral de la cisteína 10 está protegido por un grupo acetamidometilo"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 13
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=amida/nota = "La cisteína del terminal carboxilo está amidada"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Xaa Gly Asp Cys Gly Gly Cys Gly Cys Gly Gly Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOPLOGÍA: circular
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /marcador=D-tirosina
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 2
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /marcador=Apc/nota="El residuo X es L-S-(3-aminopropil) cisteína"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1...5
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: nota = "El azufre de la cadena lateral de la cisteína 5 está carboximetilado y esterificado a la D-tirosina amino-terminal para formar un péptido cíclico"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 8
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=Cacm/nota = "El grupo tiol de la cadena lateral de la cisteína 8 está protegido por un grupo acetamidometilo"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 10
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=Cacm/nota = "El grupo tiol de la cadena lateral de la cisteína 10 está protegido por un grupo acetamidometilo"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 13
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=amida/nota = "La cisteína del terminal carboxilo está amidada"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA;: SEQ ID NO: 4
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Xaa Gly Asp Cys Lys Gly Cys Gly Cys Gly Gly Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOPLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=Cacm/nota = "El grupo tiol de la cadena lateral de la cisteína 1 está protegido por un grupo acetamidometilo"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 3
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=Cacm/nota = "El grupo tiol de la cadena lateral de la cisteína 3 está protegido por un grupo acetamidometilo"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Gly Cys Gly Gly Arg Gly Asp Ser Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 6
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOPLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=Cacm/nota = "El grupo tiol de la cadena lateral de la cisteína 1 está protegido por un grupo acetamidometilo"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 3
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=Cacm/nota = "El grupo tiol de la cadena lateral de la cisteína 3 está protegido por un grupo acetamidometilo"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Gly Cys Gly Gly Arg Gly Asp Gly Gly Arg Gly Asp Ser Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
20 aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOPLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=Cacm/nota = "El grupo tiol de la cadena lateral de la cisteína 1 está protegido por un grupo acetamidometilo"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 3
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=Cacm/nota = "El grupo tiol de la cadena lateral de la cisteína 3 está protegido por un grupo acetamidometilo"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Gly Cys Gly Gly Arg Gly Asp Gly Gly Arg Gly Asp Gly Gly Arg}
\sac{Gly Asp Ser Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 8
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 16 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOPLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=Cacm/nota = "El grupo tiol de la cadena lateral de la cisteína 1 está protegido por un grupo acetamidometilo"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 3
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=Cacm/nota = "El grupo tiol de la cadena lateral de la cisteína 3 está protegido por un grupo acetamidometilo"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Gly Cys Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Asp Val Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 9
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOPLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 8
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=Cacm/nota = "El grupo tiol de la cadena lateral de la cisteína 8 está protegido por un grupo acetamidometilo"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 10
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=Cacm/nota = "El grupo tiol de la cadena lateral de la cisteína 10 está protegido por un grupo acetamidometilo"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 10
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=anida/nota = "La cisteína carboxiterminal 10 está anidada"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ:ID NO: 9
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Gly Arg Gly Asp Val Lys Cys Gly Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 10
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOPLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 7
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN :marcador=Cacm/nota = "El tiol de la cisteína 7 está protegido por un grupo acetamidometilo"
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 9
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=Cacm/nota = "El grupo tiol de la cisteína 9 está protegido por un grupo acetamidometilo"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 9
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INPORMACIÓN: marcador=amida/nota = "La cisteína carboxi-terminal 9 está amidada"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEA ID NO: 10
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Gly Arg Gly Asp Val Cys Gly Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 9
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 14 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOPLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 12
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=Cacm/nota = "El tiol de la cisteína 12 está protegido por un grupo acetamidometilo"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 14
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=Cacm/nota = "El tiol de la cisteína 14 está protegido por un grupo acetamidometilo"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 14
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=Cacm/nota = "La cisteína carboxi-terminal 14 está amidada"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Gly Arg Gly Asp Val Arg Gly Asp Phe Lys Cys Gly Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 12
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOPLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 11
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=Cacm/nota = "El tiol de la cisteína 11 está protegido por un grupo acetamidometilo"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 13
\newpage
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=Cacm/nota = "El tiol de la cisteína 13 está protegido por un grupo acetamidometilo"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 13
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=amida/nota = "La cisteína carboxiterminal 13 está solidada"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ:ID NO: 12
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Gly Arg Gly Asp Val Arg Gly Asp Phe Cys Gly Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 13
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 16 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOPLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=acetilo/nota = ``La glicelina amino-terminal 1 está acetilada
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 2
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=Apc/nota = "X es L-S-(3-aminopropil)cisteína"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 6
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=Apc/nota = "X es L-S-(3-aminopropil)cisteína"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN:11
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=Cacm/nota = "El tiol de la cisteína 11 está protegido por un grupo acetamidometilo"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 13
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=Cacm/nota = "El tiol de la cisteína 13 está protegido por un grupo acetamidometilo"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 16
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=amida/nota = "La cisteína carboxi-terminal 16 esta amidada"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA; SEQ ID NO: 13
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Xaa Gly Asp Val Xaa Gly Asp Phe Lys Cys Gly Cys Gly Gly Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 14
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 16 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOPLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 2
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=Apc/nota = "X es L-S-(3-aminopropil)cisteína"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 6
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=Apc/nota = "X es L-S-(3-aminipropil)cisteína"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 11
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=Cacm/nota = "El tiol de la cisteína 11 está protegido por un grupo acetamidometilo"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 13
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=Cacm/nota = "El tiol de la cisteína 13 está protegido por un grupo acetamidometilo"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 16
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=amida/nota = "La cisteína carboxi-terminal 9 está amidada"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ:ID NO: 14
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Xaa Gly Asp Val Xaa Gly Asp Phe Lys Cys Gly Cys Gly Gly Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 15
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 12 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOPLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 2
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=Apc/nota = "X es L-S-(3-aminopropil)cisteína"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 7
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=Cacm/nota = "El tiol de la cisteína 7 está protegido por un grupo acetamidometilo"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 9
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=Cacm/nota = "El tiol de la cisteína 9 está protegido por un grupo acetamidometilo"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 12
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=amida/nota = "La cisteína carboxi-terminal 9 está amidada"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ:ID NO: 15
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Xaa Gly Asp Val Lys Cys Gly Cys Gly Gly Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 16
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOPLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 2
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=Cacm/nota = "El tiol de la cisteína 2 está protegido por un grupo acetamidometilo"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 4
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=Cac,/nota = "El tiol de la cisteína 4 está protegido por un grupo acetamidometilo"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ:ID NO: 16
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Cys Gly Cys Gly Gly Arg Gly Asp Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 17
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOPLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=acetilo/nota = "La argitina amino-terminal 1 está acetilada"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 10
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=Cacm/nota = "El tiol de la cisteína 10 está protegido por un grupo acetamidometilo"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 12
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=Cacm/nota = "El tiol de la cisteína 12 está protegido por un grupo acetamidometilo"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 15
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=amida/nota = "La cisteína carboxi-terminal 9 está amidada"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ:ID NO: 17
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Arg Ala Arg Gly Asp Asp Leu Asp Cys Gly Cys Gly Gly Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 18
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOPLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 8
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=Cacm/nota = "La cisteína carboxi-terminal 8 está protegida por un grupo acetamidometilo"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ:ID NO: 18
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Arg Gly Asp Phe Gly Gly Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 19
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOPLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=mabz/nota = "La glicina amino-terminal 1 está enlazada a un grupo (S-benzoil)-2 mercaptoacetilo"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ:ID NO: 19
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Gly Arg Gly Asp Phe}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 20
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOPLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=Cacm/nota = "La cisteína amino-terminal 1 está protegida por un grupo acetamidometilo"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ:ID NO: 20
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Gly Gly Gly Arg Gly Asp Phe}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 21
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 7 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOPLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 7
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=Cacm/nota = "La cisteína carboxi-terminal 7 está protegida por un grupo acetamidometilo"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ:ID NO: 21
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Arg Gly Asp Gly Gly Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 22
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOPLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=ma/nota = "La glicina amino-terminal 1 está enlazada a un grupo 2 mercaptoacetilo"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ:ID NO: 22
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Gly Arg Gly Asp Phe}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 23
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 7 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOPLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=Acm/nota = "La glicina amino-terminal 1 está enlazada a un grupo (S-acetamidometilo)-2-mercaptoacetilo"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ:ID NO: 23
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Gly Gly Arg Gly Asp Phe}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 24
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 4 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOPLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=ma/nota = "La argimina amino-terminal 1 está enlazada a un grupo 2 mercaptoacetilo"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ:ID NO: 24
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Gly Asp Phe}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 25
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOPLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=D-tirosina''
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 2
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=Apc/nota = "X es L-S-(3-aminopropil)cisteína"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN:1..5
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota = "El azufre de la cadena lateral de la cisteína 5 está carboximetilado y esterificado a la D-tirosina amino-terminal para formar un péptido cíclico"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN:8
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=amida/nota = "La cisteína carboxi-terminal 8 está amidada"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Xaa Gly Asp Cys Gly Gly Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 26
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOPLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN:/marcador=D-tirosina
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 2
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=Apc/nota = "X es L-S-(3-aminopropil)cisteína"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1..5
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /marcador= "El azufre de la cadena lateral de la cisteína 5 está carboximetilado y esterificado a la D-tirosina 1 para formar un péptido cíclico"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 9
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INPORMACIÓN: marcador=amida/nota = "La cisteína carboxi-terminal 9 está amidada"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 26:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Xaa Gly Asp Cys Gly Gly Gly Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 27
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOPLOGÍA: circular
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /marcador=D-tirosina
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 2
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=Apc/nota = "X es L-S-(3-aminopropil)cisteína"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1..5
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /marcador= "El azufre de la cadena lateral de la cisteína 5 está carboximetilado y esterificado a la D-tirosina 1 para formar un péptido cíclico"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 10
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=amida/nota = "La cisteína carboxi-terminal 10 está amidada"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 27:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Xaa Gly Asp Cys Lys Gly Gly Gly Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 27
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOPLOGÍA: circular
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /marcador = D-tirosina
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 2
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=Apc/nota = "X es L-S-(3-aminopropil)cisteína"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1..5
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /marcador= "El azufre de la cadena lateral de la cisteína 5 está carboximetilado y esterificado a la D-tirosina 1 para formar un péptido cíclico"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 10
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=amida/nota = "La cisteína carboxi-terminal 10 está amidada"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN: SEQ ID NO: 28:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Xaa Gly Asp Cys Gly Gly Gly Gly Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 29
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 7 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOPLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 29
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Gly Arg Gly Asp Ser Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 30
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 12 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOPLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 30:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Gly Arg Gly Asp Gly Gly Arg Gly Asp Ser Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 31
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 17 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOPLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 31:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Gly Arg Gly Asp Gly Gly Arg Gly Asp Gly Gly Arg Gly Asp Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 32
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOPLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 32:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Asp Val Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 33
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 7 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOPLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 7
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=amida/nota = "La lisina carboxi-terminal 7 está amidada"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 33:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Gly Arg Gly Asp Val Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 34
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOPLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 6
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=amida/nota = "La valina carboxi-terminal 10 está amidada"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 34
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Gly Arg Gly Asp Val}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 35
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 11 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOPLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 11
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=amida/nota = "La lisina carboxi-terminal 10 está amidada"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 35:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Gly Arg Gly Asp Val Arg Gly Asp Phe Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 36
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOPLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLECULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 10
\newpage
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=amida/nota = ``La fenilanina carboxi-terminal 10 está amidada
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 36
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Gly Arg Gly Asp Val Arg Gly Asp Phe}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 37
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOPLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLECULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN:1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=acetil/nota = "La glicina amino-terminal 1 está acetilada"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 2
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=Apc/nota = "X es L-S-(3-aminopropil)cisteína"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 6
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=Apc/nota = "X es L-S-(3-aminopropil)cisteína"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 13
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=amida/nota = "La cisteína carboxi-terminal 13 está amidada"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ:ID NO: 37
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Xaa Gly Asp Val Xaa Gly Asp Phe Lys Gly Gly Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 38
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOPLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 2
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=Apc/nota = "X es L-S-(3-aminopropil)cisteína"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 6
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=Apc/nota = "X es L-S-(3-aminopropil)cisteína"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 6
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=Apc/nota = "X es L-S-(3-aminopropil)cisteína"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ:ID NO: 38
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Xaa Gly Asp Val Xaa Gly Asp Phe Lys Gly Gly Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 39
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOPLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 2
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=Apc/nota = "X es L-S-(3-aminopropil)cisteína"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 9
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=Apc/nota = "La cisteína carboxi-terminal 9 está amidada"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ:ID NO: 39
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Xaa Gly Asp Val Lys Gly Gly Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 40
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 7 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOPLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ:ID NO: 40
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Gly Gly Arg Gly Asp Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 41
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 12 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOPLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=Apc/nota = "La arginina amino-terminal 1 está acetilada"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 12
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=Apc/nota = "La cisteína carboxi-terminal 12 está amidada"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ:ID NO: 41
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Arg Ala Arg Gly Asp Asp Leu Asp Gly Gly Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 42
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOPLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ:ID NO: 42
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Lys Arg Ala Arg Gly Asp Asp Met Asp Asp Tyr Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 43
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 7 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOPLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=mmp/nota = "La glicina amino-terminal 1 está enlazada a un grupo 2-mercapto-Z-metilpropionilo"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ:ID NO: 43
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Gly Gly Arg Gly Asp Phe}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 44
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 4 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOPLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=acetil/nota = "La arginina amino-terminal 1 está acetilada"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 4
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=amida/nota = "La cisteína carboxi-terminal 13 está amidada"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ:ID NO: 44
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Gly Asp Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 45
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOPLOGÍA: lineal
\vskip0.500000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ:ID NO: 45
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Arg Gly Asp Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 46
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOPLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ:ID NO: 46
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Gly Gly Gly Arg Gly Asp Phe}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 47
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOPLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ:ID NO: 47
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Arg Gly Asp Gly Gly Gly Gly Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 48
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 7 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOPLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ:ID NO: 48
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Arg Gly Asp Gly Gly Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 49
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 7 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOPLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=maAcm/nota = "La arginina amino-terminal 1 está acetilada"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ:ID NO: 49
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Gly Gly Arg Gly Asp Phe}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 50
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 7 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOPLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=acetil/nota = "La cisteína amino-terminal 1 está acetilada"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 4
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=Apc/nota = "X es L-S-(3-aminopropil)cisteína"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ:ID NO: 50
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Asn Pro Xaa Gly Asp Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 51
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOPLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ:ID NO: 51
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Arg Ile Ala Arg Gly Asp Trp Asn Asp Asp Tyr Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 52
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOPLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ:ID NO: 51
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Lys Phe Phe Ala Arg Thr Val Cys Arg Ile Ala Arg Gly Asp Trp}
\sac{Asn Asp Asp Tyr Cys Thr Gly Lys Ser Ser Asp Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 53
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 16 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOPLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ:ID NO: 53
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Tyr Gly Gly His His Leu Gly Gly Ala Lys Gln Ala Gly Asp Val}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 54
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOPLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=D-tirosina
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 2
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=Amp/nota = "X es 4-amidinofenilalanina"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1..5
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN:/nota = "El azufre de la cadena lateral de la cisteína 5 está carboximetilado y esterificado a la D-tirosina 1 para formar un péptido cíclico"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
RASGO DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 9
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: marcador=amida/nota = "La glicina carboxi-terminal 9 está amidada"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ:ID NO: 54
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Xaa Gly Asp Cys Lys Gly Cys Gly}

Claims (9)

1. Un agente trombolítico que comprende una metaloproteinasa trombolítica enlazada covalentemente a un péptido de direccionamiento capaz de fijarse específicamente a un componente de un trombo.
2. El agente trombolítico de la reivindicación 1, en donde la metaloproteinasa es la fibrolasa de Agkistrodon contortrix contortrix (EC 3.4.24.72).
3. El agente trombolítico de las reivindicaciones 1 ó 2,
en el cual el péptido se selecciona del grupo constituido por un ligando peptídico lineal para un receptor de GPIIb/IIIa, un ligando peptídico cíclico para un receptor de GPIIb/IIIa, un ligando peptídico para un sitio de polimerización de fibrina, y un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos XGD, en donde X es cualquier aminoácido que tenga una cadena lateral que comprende un grupo amino, un grupo guanidino, o un grupo amidino.
4. El agente trombolítico de la reivindicación 3, en donde el péptido se selecciona del grupo constituido por:
HHLGGAKQAGDV (SEQ ID NO:2)
CH_{2}CO.Y_{D}.Apc.GDCGGC_{Acm}GC_{Acm}GGC.amida (SEQ ID NO:3),
CH_{2}CO.Y_{D}.Apc.GDCKGC_{Acm}GC_{Acm}GGC.amida (SEQ ID NO:4),
C_{Acm}GC_{Acm}GGRGDSC (SEQ ID NO:5),
C_{Acm}GC_{Acm}GGRGDGGRGDSC (SEQ ID NO:6),
C_{Acm}GC_{Acm}GGRGDGGRGDGGRGDSC (SEQ ID NO:7),
C_{Acm}GC_{Acm}RRRRRRRRRGDVC (SEQ ID NO:8),
CGRGDVKC_{Acm}GC_{Acm}.amida (SEQ ID NO:9),
CGRGDVC_{Acm}GC_{Acm}.amida (SEQ ID NO:10),
CGRGDVRGDFKC_{Acm}GC_{Acm}.amida (SEQ ID NO:11),
CGRGDVRGDFC_{Acm}GC_{Acm}.amida (SEQ ID NO:12),
acetil-G.Apc.GDV.Apc.GDFKC_{Acm}GC_{Acm}.GGCamida (SEQ ID NO:13),
G.Apc.GDV.Apc.GDFKC_{Acm}GC_{Acm}.GGCamida (SEQ ID NO:14),
G.Apc.GDVKC_{Acm}GC_{Acm}GGC.amida (SEQ ID NO:15),
CC_{Acm}GC_{Acm}GGRGDS (SEQ ID NO:16),
acetil-RRARGDDLDC_{Acm}GC_{Acm}GGC.amida (SEQ ID NO:17),
GRGDFGGC_{Acm} (SEQ ID NO:18),
ma_{Bz}-GGRGDF (SEQ ID NO:19),
C_{Acm}GGGRGDF (SEQ ID NO:20),
GRGDGGC_{Acm} (SEQ ID NO:21),
ma-GGRGDF (SEQ ID NO:22),
ma_{Acm}-GGGRGDF (SEQ ID NO:23),
ma-RGDF (SEQ ID NO:24),
ma-RGD,
CH_{2}CO.Y_{D}.Apc.GDCGGC.amida (SEQ ID NO:25),
CH_{2}CO.Y_{D}.Apc.GDCGGGC.amida (SEQ ID NO:26),
CH_{2}CO.Y_{D}.Apc.GDCKGGGC.amida (SEQ ID NO:27)
CH_{2}CO.Y_{D}.Apc.GDCGGGGC.amida (SEQ ID NO:28),
GGRGDSC (SEQ ID NO:29),
GGRGDGGRGDSC (SEQ ID NO:30),
GGRGDGGRGDGGRGDSC (SEQ ID NO:31),
RRRRRRRRRGDVC (SEQ ID NO:32),
CGRGDVK.amida (SEQ ID NO:33),
CGRGDV.amida (SEQ ID NO:34),
CGRGDVRGDFK.amida (SEQ ID NO:35),
CGRGDVRGDF.amida (SEQ ID NO:36),
acetil-G.Apc.GDV.Apc.GDFKGGCamida (SEQ ID NO:37),
G.Apc.GDV.Apc.GDFKGGCamida (SEQ ID NO:38),
G.Apc.GDVKGGC.amida (SEQ ID NO:39),
CGGRGDS (SEQ ID NO:40),
acetil-RRARGDDLDGGC.amida (SEQ ID NO:41),
CKRARGDDMDDYC (SEQ ID NO:42),
mmp-GGGRGDF (SEQ ID NO:43),
acetil-RGDC.amida(SEQ ID NO:44),
CRGDC (SEQ ID NO:45),
CGGGRGDF (SEQ ID NO:46),
GRGDGGGGC (SEQ ID NO:47),
GRGDGGC (SEQ ID NO:48),
ma_{Acm}-GGGRGDF (SEQ ID NO:49),
acetil-CNP.Apc.GDC(SEQ ID NO:50),
CRIARGDWNDDYC (SEQ ID NO:51),
CKFFARTVCRIARGDWNDDYCTGKSSDC (SEQ ID NO:52),
KYGGHHLGGAKQAGDV (SEQ ID NO:53),
(CH_{2}CO-Y_{D}.Amp.GDCKGCG.amida)_{2}-(\varepsilon-K)GC.amida, y
CH_{2}CO-Y_{D}.Amp.GDCKGCG.amida (SEQ ID NO:54).
5. El agente trombolítico de la reivindicación 4, en donde el péptido es CH_{2}CO.Y_{D}.Apc.GDCKGCG.amida (SEQ ID NO:54).
6. El agente trombolítico de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el compuesto está enlazado covalentemente a la proteinasa utilizando un resto químico de conjugación seleccionado del grupo constituido por N-succinimidil-2-(2-piridilditio)-propionato, éster de N-(\gamma-maleimidobutiriloxi)-sulfosuccinimida (S-GMBS), 4-(p-maleimidofenil)butirato de succinimidilo, 4-(p-maleimidofenil)butirato de sulfosuccinimidilo, 4-succinimidiloxicarbonilmetil-\alpha-(2-piridilditio)-tolueno, N-hidroxisuccinimidil-2,3-dibromopropionato, N-succinimidil-(4-yodoacetil)-aminobenzoato, sulfo-
succinimidil-(4-yodoacetil)-aminobenzoato, succinimidil-4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato, sulfo-
succinimidil-4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato, éster de N-(\gamma-maleimidobutiriloxi)-succinimida, éster de m-maleimidobencenil-N-hidroxisuccinimida, éster de m-maleimidobencenil-N-hidroxisulfosuccinimida, 6-(\alpha-metil)-\alpha-(2-piridilditio)-toluamida-hexanoato de sulfosuccinimidiloxicarbonilo, y 6-(\alpha-metil-\alpha-(2-piridilditio)toluamido)-hexanoato de sulfosuccinimidilo.
7. El agente trombolítico de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, producido por expresión de un ácido nucleico que codifica la proteinasa y el péptido en una célula hospedadora.
8. El agente trombolítico de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente un radiomarcador.
9. Uso del agente trombolítico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para la fabricación de una composición farmacéutica para lisar un trombo en el cuerpo de un mamífero.
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