CN100491394C - 抗血管增生的多肽 - Google Patents

Abstract

此处公告的专利是具有抗-血管增生作用的A₆₁或p22多肽。在此同时公告制备这些多肽的方法，以及针对具有血管增生方面疾病与状态的病患，所给予的治疗方法。

Description

抗血管增生的多肽

相关专利申请的交叉参考资料

此项发明已于2000年11月28日向美国专利局提出专利申请，专利号码60/253725。

技术领域

该项发明主要涉及血管增生(angiogenesis)，更明确的说，是指和血浆酶原(plasminogen)有关而能抑制血管增生的多肽，以及这种多肽的生成和使用方法。

背景技术

血管增生是指新血管的生成，这个过程涉及血管内皮细胞(endothelial cell)的繁殖、移位，基膜(basement membrane)的降解退化，以及新血管组织之间的复杂协调(参考文献Ji et al.，FASEB J.12：1731-1738，1998)。在诸如胚胎器官生成，成年人伤口愈合这类常规进程中，血管增生为正在生成的新组织提供了必要的血管支援。然而，在患病的状况下，新血管的生成却可以加速发病的过程，它可以加快癌症肿瘤，糖尿病性视网膜病，组织和器官畸形，心脏血管病症的发展与进程(参考文献(Folkman，Nat.Med.1：27-31，1995)。以癌症肿瘤而言，愈来愈多的证据指出，肿瘤的生长和致死率主要取决于血管增生，若能抑制血管增生就能抑制肿瘤的生长(参考文献Folkman，Forum(Genova)9：59-62，1999；Folkman，Adv.Cancer.Res.43：175-203，1985)。

许多血管增生抑制剂，也就是抗血管增生的物质，已经被确认出来，其中包括血管增生阻断素(angiostatin)，血小板敏感蛋白(thrombospondin)，以及神经胶质瘤源性血管生成抑制因子(参考文献Folkman，1995 supra)。这其中，血管增生阻断素，这是一个分子重量为38kDa的血浆酶原片断，被证明具有非常强的抑制血管增生的活性，因此它能够抑制肿瘤的生长(参考文献O’Reilly etal.Nat.Med.2：689-692，1996；O’Reilly et al.，Cell 79：315-328，1994)。相较之下，完整的血浆酶原，反而不具有抑制血管增生的活性(Id.)。

血管增生阻断素(angiostatin)具有血浆酶原所含有的五个三环二硫连锁圈(亦即所谓的三环域)中的前四个三环二硫连锁圈。通过对血浆酶原各个片断的活性研究，血管增生阻断素所含有的四个三环域，以及在血浆酶原中所发现的第五个三环域(血管增生阻断素中并没有该结构域)，现已被确认具有抑制血管增生的活性。研究报告指出，从血浆酶原的蛋白质水解和重组技术所获得的血浆酶原三环域5结构片断，展现出非常强的抑制血管内皮细胞增殖的活性(参考文献Cao et al.，J.Biol.Chem.272：22924-22928，1997)。同样的，重组三环域1结构片断和重组三环域3结构片断也展现出很强的抑制血管内皮细胞增殖的活性，而三环域2结构片断的抑制活性较弱，三环域4结构片断的抑制活性则最差(参考文献Cao et al.，J.Biol.Chem.271：29461-29467，1996；U.S.Patent No.6,024,688 to Folkman et al.)。不同的是，兼含三环域2和三环域3的结构片断所表现出来的抑制活性却很弱，但兼含三环域1-3的较大型血管增生阻断素片断，则比兼含三环域1-5的血管增生阻断素的抗-增生活性来的更强而有力(Id.)。

由於根据单一三环域结构所具有的活性，并不能准确地推测出兼含多个三环域结构的血浆酶原片断，其所具有的抗-血管增生的活性，因此早期发表的研究报告并未指出，兼含多个三环域结构的血浆酶原片断，是否具有抗-血管增生的活性。此外，血管增生阻断素本身是在还原条件下被分离从而获得的一种物质，一般咸信这种物质乃是一种非-自然产生的片断，它需要通过前文所提的蛋白质水解和重组技术才可以获得。这类非-自然产生的多肽，可能会在某一主体身上产生免疫反应或不良副作用，而自然生成的片断，则很可能不会产生这种现象。再者，从早期研究报告所发表的蛋白质水解和重组片断的三度空间结构，亦不能准确的推测出，一个功能为内生性血管增生剂的自然生成血浆酶原片断的三度空间结构。因此，鉴别及分离出崭新的，自然生成的，具有强而有效的抗-血管增生活性，而且只有很小，甚或不会产生免疫反应和某些副作用的血浆酶原多肽片断，乃是众望所归的。

发明内容

发明者成功的发现了一些崭新的，自然生成的血浆酶原片断。其中一个片断为A₆₁，这个分子的重量大约是61kDa，这是通过在还原条件下进行的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-polyacrylamide)胶体电泳分析法得到的(参考文献Kassam，G.et al.，(2001)Journal of Biological Chemistry 276：8924-8933)。人体A₆₁有391个氨基酸，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1。第二个自然生成的片断是A₆₁的少量变异同族体，血浆酶原被细胞裂解后，在生成A₆₁时，同时也生成了少量的变异同族体。这种变异同族体含有394个氨基酸，其核苷酸序列为SEQ ID NO：2。在此，我们将这种变异同族体统称为A₆₁。我们所发现的第三个自然生成的片断，在此称之为p22(Kwon，M.et al.，(2001)Biochemistry 40：13246-13253)。P22的分子重量大约为22kDa，人体中的p22含有103个氨基酸，其核苷酸序列为SEQ IDNO：3。图1和SEQ ID NO：4陈列的是完整的人体血浆酶原序列，其它片断均是由这个人体血浆酶原所衍生出来的。A61，它的少量变异同族体，以及p22均展现出抗-血管增生的活性，这种活性能够在体内(in vivo)和体外(in vitro)抑制内皮细胞的增殖，它们并且还在体内展现出抗癌的活性。

(0008)这项发明意欲包括各类脊椎动物所有的A₆₁和p22分子，其中更主要的是研究哺乳类动物，尤其是人类。从已知的广大物种的血浆酶和血浆酶原的序列，我们可以很容易的推断出那些是非人类物种的序列。A₆₁和p22的对偶质变异体亦包括在这项发明之中。

(0009)A₆₁和p22与血管增生阻断素(angiostatin)有数点不同之处。首先，A₆₁和p22是自然形成的分子，无论在健康人群还是癌症患者的血浆内，它们都存在。第二，它们都是血浆酶自体消化的分裂产物，因此，氨基-末端和羧基-末端，乃是由血浆酶原分子内的血浆酶的分裂位置来决定。与血管增生阻断素不同的是，人体p22由血浆酶原的赖氨酸-78延伸至赖氨酸-180，是以，它乃是由103个连续的血浆酶原氨基酸所组成。人体A₆₁由血浆酶原的赖氨酸-78延伸至赖氨酸-468，它同时还包含一个由赖氨酸-78延伸至精氨酸-471的少量变异体，是以，它分别含有391和394个连续的氨基酸。因此，p22含有三环域1结构域以及一部分血浆酶原的三环域2序列，A₆₁则含有三环域1-4结构域以及一部分血浆酶原的三环域5序列。

(00010)另外，与血管增生阻断素(angiostatin)不同的是，当缺少自由硫氢基供体或血浆还原酶时，这些片断还是可以在体外从血浆酶和血浆酶原中制备。由于人体血浆酶原的现成可用性，以及血浆酶具有自动分解蛋白质使其转化为p22和A₆₁的本质，因此不论是在无细胞系统下，或是将血浆酶原与细胞相接触，都能很容易产生微克以上的这些片断。运用一些在这个领域里广为人知的方法，可以将A₆₁和p22多肽，从具有血浆酶原的细胞培养液中纯化出来，例如利用固定化的赖氨酸或具有血浆酶结合功能的赖氨酸衍生物进行的亲和色谱法，疏水交换层析法，凝胶过滤层析法，以及离子交换层析法。亲和色谱法也可以利用其它固定化的配基进行，例如：利用血浆酶原三环域的抗体(但不仅限于此)。当使用固定化的赖氨酸来进行纯化时，不管是经过涌流馏分还是洗脱馏分得到的p22组分，都表现出抑制血管增生的活性。当使用疏水交换层析法纯化时，经洗脱馏分得到的p22组分，也表现出这种活性，在这种方法中，用辛烷基—琼脂糖(OctylSepharose)作疏水固相原模。

(00011)这些片断与血管增生阻断素，以及其它具有抗-血管增生活性的血浆酶原片断相比，其光谱的特征是不相同的。尤其是，它们在自体荧光光谱和圆二色散仪光谱(Circular Dichroism)中的差异，表明了p22的三环域三环域，与重组三环域1结构，在立体结构组成上明显不同。p22在圆二色散仪光谱中所显示的波段为+227.5和-202.7，而血浆酶原三环域1片断的波段则为+227.5和-197.4。这表示p22和血浆酶原三环域1结构两者的三度空间结构是不相同的。

这些片断与血管增生阻断素的生物活性也不同。当采用牛的毛细血管内皮细胞增殖作为测定系统时，若要达到50％细胞增殖的抑制效果，需要使用35nM的A₆₁，或14nM的p22。此外，通过在老鼠身上所进行的Lewis肺癌细胞测定发现，p22和A₆₁都能有效抑制体内转移性肿瘤(metastatic tumors)的生长。和血浆酶原相比较，使用2.5毫克/公斤/每日的p22和A₆₁，能更有效的抑制肺转移癌的生长过程。因此，A₆₁和p22可以用来治疗人类和其它哺乳类动物的癌症。

因此，这项发明的实施方式之一是，分离和纯化A₆₁和p22多肽血浆酶原片断。将这些片断的序列，与人体血浆酶原序列SEQ ID NO：4放在一起进行序列对比，便可以确认出这些片断，其中氨基-末端的氨基酸，为人体血浆酶原的赖氨酸-78，羧基-末端的氨基酸，为人体血浆酶原的赖氨酸-180(p22)，或赖氨酸-468(A₆₁)，或精氨酸-471(A₆₁少量变异体)。这些片断是自然生成的，从非人类物种提取的片断与人体血浆酶原序列SEQ ID NO：4相比，两者至少有60％的相同性，也可以有至少75％、80％、90％、而最好是有95％的相同性。

这项发明的另一个实施方式是，被分离出来的A₆₁和p22多肽，分别含有在血浆酶氨基末端的102、391或394个氨基酸。这种血浆酶可以是脊椎动物的血浆酶，也可以是哺乳类动物的血浆酶，最好是人类的血浆酶。图1和SEQ ID NO：4陈列了一个人体血浆酶原序列。这种多肽与血浆酶原序列SEQ ID NO：4相比，至少有60％的相同性，也可以有至少75％、80％、90％、而最好是有95％的相同性。

另一个实施方式所提供的是，被分离出来的A₆₁和p22多肽，其序列为SEQ IDNO：1，SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3，或者它们的保守变异替代物的序列。所谓保守变异替代物是指，与SEQ ID NO：1-3序列相比，其多肽具有一个或数个保守氨基酸替代物。由於保守氨基酸替代物与原氨基酸支链的化学性质相似，是以它们彼此可以互换。

另一个实施方式所提供的是，该项发明的各类形式表现比较：

 

两者序列的相同程度比较	至少	一般	较好	更好	最好
						被分离出来的A<sub>61</sub>和p22多肽，与A<sub>61</sub>和p22序列的比较	60％	75％	80％	90％	95％
被分离出来的含有391个连续氨基酸的多肽，与SEQ ID NO：1序列的比较	60％	75％	80％	90％	95％
						被分离出来的含有394个连续氨基酸的多肽，与SEQ ID NO：2序列的比较	60％	75％	80％	90％	95％
被分离出来的含有103个连续氨基酸的多肽，与SEQ ID NO：3序列的比较	60％	75％	80％	90％	95％

该项发明的另一个实施方式提供的是，一个A₆₁或p22多肽与一个细胞毒素因子的结合体。在这个结合体中，A₆₁或p22多肽不仅提供抗-血管增生的效用，而且还可以将相结合的细胞毒素，带到出现血管增生现象的部位，例如生长中的肿瘤。在某些情况下，这些结合体可以是融合蛋白，而且融合蛋白的核酸分子编码也包括在内。这些结合体也包括带有这些核酸分子编码的核酸分子载体(vector)，以及被这些核酸分子转化过的细胞。

这项发明的另一项实施方式提供的是，一个A₆₁或p22的核酸分子，这个核酸分子包括可转译成被分离出来的A₆₁或p22多肽的多聚核苷酸序列。第一种包含可转译为含有391个连续氨基酸的A₆₁多肽的多聚核苷酸序列，此多聚核苷酸序列至多含有1173个连续核苷，此序列可转译为血浆酶原。另外一种可转译为包含394个连续氨基酸的A₆₁多肽的多聚核苷酸序列，此多聚核苷酸序列至多包含1182个连续核苷，此序列可转译为血浆酶原。还有一种可转译为含有103个连续氨基酸的p22多肽的多聚核苷酸序列，此多聚核苷酸序列至多包含309个连续核苷，此序列可转译为血浆酶原。该项发明并且提供了含有此种核苷酸的载体，以及含有此种载体的真核和原核细胞。这些细胞可以是哺乳类动物的细胞，例如：人类的，鼠类的，或者牛的。原核细胞可以是细菌细胞，例如：E.coli细胞。除此以外，载体可以是质粒(plasmid)或病毒。

此外，这项发明的另一项实施方式提供的是，A₆₁和p22核酸或是与其互补的309，1173或1182个核苷的核酸，这些核酸分别与SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQID NO：7序列至少有90％的相同性。另一项实施方式所提供的是，在严格的反应条件下，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7序列与这些含有309，1173或1182个核苷的核酸，会产生杂交。

这项发明同时提供了A₆₁或/和p22多肽血浆酶原片断的制备方法。A₆₁和p22可以通过细胞媒介法或无细胞法制备。细胞媒介法是，用脊椎动物细胞去接触血浆酶原，运用在培植中所进行的自体分解，去制造血浆酶原的A₆₁或/和p22片断，然后将A₆₁或/和p22片断从分解后的物质中分离出来。哺乳类动物的细胞更合适，最好是直接用诸如：HT-1080或海拉(HeLa)细胞等人体细胞。另一种可以被应用的细胞是牛毛细血管的内皮细胞。这里所用的血浆酶原可以是谷氨酸-血浆酶原，也可以是赖氨酸-血浆酶原。任何适当的分离方法都可以使用，包括亲和色谱法，这个方法使用的是固定化的赖氨酸或者具有能够与血浆酶相结合的赖氨酸衍生物。此外，可以通过疏水交换层析法和凝胶过滤层析法等色谱技术去进行纯化。

在无细胞法中，先将血浆酶原活化剂与血浆酶原混合物一起培育以制备A₆₁。然后将A₆₁从混合物中分离出来。p22的制备法则是，将A₆₁与血浆酶以及诸如二硫苏糖醇(Dithiothreitol)等还原剂共同培育，然后将p22从培育混合物中分离出来。此外，也可以通过将A₆₁与内皮细胞受体四聚物(膜联蛋白II四聚体)的内皮细胞受体子组共同培育去制备p22。

这项发明也为哺乳类动物抗-血管增生的治疗提供了一些方法。这些方法包括给于哺乳类动物足以抑制血管增生作用的A₆₁和/或p22含量。这个方法可以应用在任何涉及非必要血管增生的疾病和状况，尤其是癌症肿瘤细胞的生长。这里所指的哺乳类动物最好是人类，A₆₁和/或p22也最好是人类的多肽。A₆₁和p22也可以和其它因子混合起来治疗特殊疾病，例如：用来治疗癌症的其他抗癌因子。

这项发明的另一项实施方式是，这项发明提供了一个抑制血管内皮细胞增殖的方法。这项方法包括使用适量的A₆₁或p22，或是它们的结合物，去抑制血管内皮细胞的增殖。

兹将这项发明的几个优点综述如下：这项发明提供了一种崭新的抗-血管增生的物质，这种物质对治疗那些因为形成对人体有害的新血管而导致的疾病，例如因癌症肿瘤而产生的新血管，是非常有用的；由於这项发明所提供的这种物质是在体内自然形成的，因此接受这种物质的人体，较不会产生免疫性反应；这项发明所提供的这种抗-血管增生的物质是非常有效的，由於这些物质是在接受这种物质的人体内自然形成的，因此会产生不良副作用的可能性将减低；这项发明所提供的生产新的抗-血管增生多肽的方法非常简单，而且产量很高；这套崭新而有效的，用来治疗涉及到血管增生方面疾病的方法，使用的是崭新的成分。

附图说明

图1陈列的是，人体血浆酶原前体的氨基酸序列，从蛋氨酸-1到氨基乙酸-19(M-1到G-19)是信号肽；从谷氨酸-20到天门冬酸-810是谷氨酸-血浆酶原；从赖氨酸-97到天门冬酸-810是赖氨酸-血浆酶原；从赖氨酸-97到赖氨酸-487，以及从赖氨酸-97到精氨酸-490是两种A₆₁的同族体；从赖氨酸-97到赖氨酸-199是p22。

图2陈列的是，人体血浆酶原前体的核酸序列，核酸55-111编码信号肽；核酸112-2484编码谷氨酸-血浆酶原；核酸343-2484编码一部分谷氨酸-血浆酶原所组成的赖氨酸-血浆酶原；核酸343-1515和343-1524编码一部分谷氨酸-血浆酶原或赖氨酸-血浆酶原所组成的两种A₆₁同族体；核酸343-651编码一部分谷氨酸-血浆酶原或赖氨酸-血浆酶原所组成的p22。

图3陈列的是，在无细胞系统内所进行的A₆₁的产生和分离过程，然后采用在还原条件下所进行的十二烷基硫酸钠-聚丙烯胶体电泳分析法及考马斯氏蓝色染色法染色去进行分析(A)，采用在非还原条件下所进行的十二烷基硫酸钠-聚丙烯胶体电泳分析法及考马斯氏蓝色染色法染色去进行分析(B)，以及采用以一个单克隆抗体作初级抗体去认识人体血浆酶原三环域1-3结构的免疫印迹法(WesternBlotting)去进行分析(C)。

图4陈列的是，血浆酶原分裂为A₆₁的时间进程分析，采用在还原条件下所进行的十二烷基硫酸钠-聚丙烯胶体电泳分析法及考马斯氏蓝色染色法染色去进行分析(A)，以及采用在非还原条件下所进行的十二烷基硫酸钠-聚丙烯胶体电泳分析法及考马斯氏蓝色染色法染色去进行分析(B)。

图5陈列的是，在免疫印迹法中，使用兔子的抗鼠血浆酶抗体(A)或单克隆抗人体血浆酶原三环域1-3结构的抗体(B)去比较A₆₁和老鼠血清的血浆酶原片断。

图6陈列的是，在正常老鼠、有肿瘤的老鼠、经过肿瘤切除的老鼠的血清中所呈现的一个可测量的类似A₆₁的血浆酶原片断。

图7陈列的是，在普通志愿者(A)和癌症患者(B)中含有的血清血浆酶原片断与A₆₁之间的比较。

图8陈列的是A₆₁的圆二色散仪光谱。

图9陈列的是在含有及不含有Tran-4-氨甲环酸(AMCHA)的条件下，A₆₁的内部荧光光谱。

图10陈列的是，A₆₁对牛毛细血管内皮细胞繁殖的抑制。

图11陈列的是，经由测量皮下注射了Lewis肺癌的老鼠，其肺重量在一段期间内的变化，证明了A₆₁可以抑制转移性肿瘤的生长。

图12陈列的是，在无细胞系统中产生的p22。

图13陈列的是，由HT-1080细胞所产生的新血浆酶原片断(p22)的鉴定。

图14陈列的是，p22的结构图解。

图15陈列的是，p22和三环域1结构(K1)的圆二色散仪光谱。

图16陈列的是，p22和重组三环域1结构的自身荧光光谱。

图17陈列的是，p22和重组三环域1结构对牛毛细血管内皮细胞繁殖的抑制。

图18陈列的是，p22抑制鸡的绒毛尿囊膜(chorioallantoic membrane，CAM)上新血管的形成。

图19陈列的是，对老鼠肺中转移性肿瘤生长的抑制。

图20陈列的是，A₆₁与膜联蛋白II四聚物结合。

图21陈列的是，当海拉细胞(HeLa cells)被一个含有反义链(antisense)的表达载体，转染到内皮细胞受体四聚物(膜联蛋白II tetramer)的p11子组中后，p22和A₆₁的产量减少了。

图22陈列的是，从A₆₁中产生p22需要血浆酶和内皮细胞受体四聚物。

具体实施方式

根据这项发明，崭新的、自然生成的血浆酶原片断被发现了。这里所提的崭新的多肽是指A₆₁和p22。由於这类多肽表现出抗-血管增生的活性，因此用它们去治疗和有害新血管之形成有关的疾病，是非常有用的。

血浆酶原是血浆中的单链醣蛋白，其浓度为2μM。(参考文献Wohl et al.，Thromb.Res.27：523-535，1982；Kang et al.，Trends Cardiovasc.Med.90：92-102，1999)人类的这种血浆酶原多肽含有791个氨基酸(图1，氨基酸19-810)。通过对赖氨酸-77-赖氨酸-78键的血浆酶水解作用，天然谷氨酸-血浆酶原可以很容易转变为赖氨酸-血浆酶原(图1，氨基酸79-810)。血浆酶原是血浆酶的前体，这种物质是一种，运用组织血浆酶原活化物或尿激酶型血浆酶原活化物(urokinase-type plasminogen activator)，去切断精氨酸-561和纈氨酸-562之间的血浆酶原后，所形成的蛋白酶。二硫共价键将血浆酶的这两条多肽链连接起来。其中较大的一条多肽链(或者称为血浆酶A链)含有5个三环域结构，这个多肽链也是在血浆酶原的赖氨酸-77和赖氨酸-78之间分裂后，所形成的一条从赖氨酸-78到精氨酸-561的多肽链，。较小的一条多肽链或B链，则是由血浆酶原纈氨酸-562到精氨酸-791所组成的。血浆酶原和血浆酶二者均通过氨基末端的三环域结构域与纤维蛋白相连，其中每一个结构域都是由二硫键所连成的三个环状结构域(三环二硫连锁圈)。此处所指的血浆酶原，包括人类的谷氨酸-血浆酶原和赖氨酸-血浆酶原以及人类序列的等位基因变异体。另外还包括非人类哺乳类动物和非哺乳类脊椎动物的血浆酶原的直系同源物，这其中有许多是这个领域中已知的直向同源物。

这项发明中的A₆₁和p22多肽及多聚核苷酸序列，各自有一部分符合血浆酶原的多肽序列和多聚核苷酸序列。这里所谓的“符合”(corresponds to)是指一个多肽序列与所论及的参考多肽序列相同，或者一个多聚核苷酸的序列与所论及的参考多聚核苷酸序列，全部或部分属于同源多肽或核苷酸(这里是指相同，不是指严格的指在进化上相关)。在这里所谓的“互补”(complementary to)是指，互补序列与所论及的参考序列不相同，但是其所包含的一个嘌呤和嘧啶碱基，与所论及的参考序列的嘌呤和嘧啶碱基是明确配合的。例如，“TATAC”核酸序列和“TATAC”参考序列是相同的，但与“GTATA”参考序列则是互补的。

A₆₁有主要和次要两种多肽变异体，主要变异体的序列含有391个氨基酸(SEQID NO：1)，这是从血浆酶原的赖氨酸-78到赖氨酸-468。而次要变异体序列含有394个氨基酸(SEQ ID NO：2)，是从血浆酶原的赖氨酸-78到精氨酸-471。虽然人体A₆₁变异体被证实和一部分人体血浆酶原的序列相同，但是这里所谓的A₆₁意图包括非人类哺乳类动物以及非哺乳类脊椎动物的直系同源物序列。将血浆酶原直系同源物序列与人体血浆酶原序列进行序列对比，然后确认出代表A₆₁多肽的那一部份分子，如此可以很容易为这些A₆₁的直系同源物分子序列定位。另一种方法是将A₆₁直系同源多肽和与人体A₆₁进行序列相对比。一般相信，非人类哺乳类动物的直系同源A₆₁多肽序列和人体A₆₁序列相比，至少有75％是相同的，亦即至少有75％的氨基酸是相同的，非哺乳类脊椎动物的A₆₁直系同源多肽序列和人体A₆₁序列相比，至少有60％是相同的。

p22的序列是血浆酶原从赖氨酸-78到赖氨酸-180的103个氨基酸组成(SEQ IDNO：3)。虽然人体p22被证实和一部分人体血浆酶原的序列相同，这里所谓的p22包括其来自非人类哺乳动物以及非哺乳类脊椎动物的直系同源物。该p22的直系同源物分子序列，可以通过血浆酶原直系同源物序列与人体血浆酶原序列之间的对比来决定。另外一种方法是，将假设的p22的直系同源物分子和人体p22进行对比。一般相信，非人类哺乳类动物的直系同源p22多肽序列和人体p22序列相比，至少有75％是相同的，亦即至少有75％的氨基酸是相同的，非哺乳类脊椎动物的p22直系同源多肽序列和人体p22序列相比，至少有60％是相同的。

辨别对应序列的序列对比方法，在这个领域里广为人知，这些方法可以鉴别横向同源物(Paralog)和直向同源物(ortholog)的序列。例如，在Lasergene生物计算软件(DNASTAR，INC，Madison，Wis.)中输入了数种序列并列对比的Clustal法(参考文献Higgins et al，Cabios 8：189-191，1992)，可以对两种或数种序列进行序列对比。这种方法对多种序列的并列对比方式非常先进，它采用从一系列成对的对比组合中计算出来的相似数据，去汇聚变得越来越大的对比组合群。只要找到最大的序列对比数据，便可获得最佳的序列对比组合，而该数据是从对比中各残基分数的平均值得出来的，而各残基的分数则来自于残基重量表，此重量表代表某一氨基酸在两个相关蛋白质内发生变化的或然率。序列对比中空置的及过长的间隔会降低序列对比的数据。该软件所使用的数据自动设定母数如下：多种序列对比(Multiple Alignment)的空置间隔处罚＝10；多种序列对比的过长间隔处罚＝10；双序列对比(pairwise alignment)的k-tuple值＝1；双序列对比的空置间隔处罚＝3；双序列对比的窗口值＝5；双序列对比留存下来的对角值＝5。该软件所使用的残基重量表是PAM250(参考文献：Dayhoff et al.，inAtlas of Protein Sequence and Structure，Dayhoff，Ed.，NBRF，Washington，Vol.5，suppl.3，p.345，1978)。

进一步陈述人体A₆₁的特征，A₆₁多肽的分子重量大约是61kDa，这是通过在还原条件下进行的十二烷基硫酸钠-聚丙烯胶体电泳分析得到的。用来检查分子二级结构的循环二象光谱显示，A₆₁多肽在202nm处有一道很强的负波段，在227nm处有一道弱的正波段。对二级结构内含所进行的分析显示，A₆₁多肽含有三环域结构，且该结构具有与自由赖氨酸残基和羧基末端赖氨酸残基相结合的功能。将A₆₁多肽在体外与牛毛细血管内皮细胞一起培育，A₆₁多肽表现出抑制细胞增殖的生物活性，要达到50％抑制管内皮细胞增殖的效果所需要的A₆₁浓度(IC₅₀)为35±10nM。更甚者，当A₆₁的用量为2.5mg/kg时，它能够抑制在老鼠体内因注射Lweis肺癌细胞而产生出的转移性肿瘤的生长。

进一步陈述人体p22的特征，p22多肽的分子重量大约是22kDa，这是通过在还原条件下进行的十二烷基硫酸钠-聚丙烯胶体电泳分析得到的。循环二象光谱显示，p22多肽在202.7nm处有一道很强的负波段，在227.5nm处有一道弱的正波段。与之相比，重组三环域多肽则在197.4nm处有一道很强的负波段，在227.5nm处有一道弱的正波段，这显示p22与重组三环域1多肽的二级结构不同。针对p22生物活性所进行之评估显示，将p22多肽在体外与牛毛细血管内皮细胞一起培育，要达到50％抑制内皮细胞增殖效果所需要的p22浓度(IC₅₀)为14.3±2.3nM。更甚者，当p22的用量为2.5mg/kg时，它能够抑制在老鼠体内因注射Lweis肺癌细胞而产生出的转移性肿瘤的生长。

此项发明中的A₆₁和p22多肽是自然生成的，因为A₆₁和p22被发现存在于正常人和癌症患者的血清中。这里所谓的“自然生成”是指，这种物质存在于大自然中，而且可以在脊椎动物体内找到这种物质。这种物质可能在体内一直存在或是间歇性存在，或者只有在特定的生理或病理条件下才会存在。这种“自然生成”的物质其特定样品，可能并不存在于脊椎动物的体内，但是却可以通过一些诸如化学合成，重组等方式得到，只要所得到的物质与脊椎动物体内的物质相同即可。相较之下，和脊椎动物体内物质不相同的“人造”物质，则不被认为是“自然生成”的物质。

此项发明并且包括A₆₁和p22多肽的变异体，和A₆₁与p22多肽相比，A₆₁和p22多肽变异体具有包含保守氨基酸替代物的序列。所谓保守变异替代物指的是，与原氨基酸具有相似的化学性质和/或相似的支链，是以它们彼此可以互换。例如：一群包括丙胺酸(alanine)、缬氨酸(valine)、亮氨酸(leucine)、异亮氨酸(isoleucine)、脯氨酸(proline)、色氨酸(tryptophan)、苯基丙氨酸(phenylalanine)和甲硫氨酸(methionine)在内的中性及疏水性氨基酸；一群包括氨基乙酸(glycine)、丝氨酸(serine)、苏氨酸(threonine)、酪氨酸(tyrosine)、半胱氨酸(cysteine)、天冬酰胺酸(asparagine)和谷氨酰胺酸(glutamine)在内的中性及有极性氨基酸；一群包括赖氨酸(lysine)、精氨酸(arginine)和组氨酸(histidine)在内的碱性氨基酸；一群包括天(门)冬氨酸(aspartic acid)和谷氨酸(glutamic acid)在内的酸性氨基酸；一群包括氨基乙酸(glycine)、丙胺酸(alanine)、缬氨酸(valine)、亮氨酸(leucine)和异亮氨酸(isoleucine)在内的带有脂肪性质支链的氨基酸；一群包括丝氨酸(serine)和苏氨酸(threonine)在内的带有脂肪质羟氢氧基支链的氨基酸；一群包括天冬酰胺酸(asparagine)和谷氨酰胺酸(glutamine)在内的含有氨基化合物支链的氨基酸；含有苯基丙氨酸(phenylalanine)、酪氨酸(tyrosine)和色氨酸(tryptophan)在内的含有芳香族支链的氨基酸；一群包括半胱氨酸(cysteine)和甲硫氨酸(methionine)在内的含有硫支链的氨基酸。较佳的保守氨基酸替代物是：缬氨酸(valine)-亮氨酸(leucine)-异亮氨酸(isoleucine)，苯基丙氨酸(phenylalanine)-酪氨酸(tyrosine)，赖氨酸(lysine)-精氨酸(arginine)，丙胺酸(alanine)-缬氨酸(valine)，天冬酰胺酸(asparagine)-谷氨酰胺酸(glutamine)，谷氨酸(glutamic acid)-天(门)冬氨酸(asparticacid)，亮氨酸(leucine)-甲硫氨酸(methionine)以及谷氨酰胺酸(glutamine)-组氨酸(histidine)。

此项发明中的A₆₁多肽内也包括糖基化的A₆₁。将一条碳水化合物支链结合在氨基酸上可形成糖蛋白，最常见的糖蛋白是，糖被联接在氨基族群中天冬酰胺酸(asparagine)上的氮联低聚糖，。较少见的糖蛋白是，糖被联接在羟氢基族群中丝氨酸或苏氨酸上的氧联低聚糖。糖基出现在任何一个或数个这些支链上，均会增加分子的分子重量。

将被分离和纯化出来的此项发明中的A₆₁和p22多肽，与量非常少并且和体内其它物质混合在一起的A₆₁和p22多肽相互比较。这里所谓一个“分离”的物质或者“实质上纯净”的物质，尤其是多肽和多聚核苷酸，乃是指该物质至少包含大约50％摩尔基数上的所有大分子物种。被分离和实质上纯化的物质，包含组合中大约80％至90％以上的所有大分子物种则更佳。该物质最好是纯化到具有本质上的同质性，以至于用传统探测方式探测不出组合中的污杂质物种，而且组合在本质上包含一个单一大分子物种。溶剂物种，小分子(<500 Daltons)和元素离子物种，不属于大分子物种。

制备A₆₁和p22多肽的方法也包括在此项发明的范畴内。A₆₁和p22可以用细胞培育法和无细胞法生成。

A₆₁可以通过血浆酶的自体分解作用在体外制备。在以前的研究工作中，A-链上的血浆酶原片断，是在含有血浆酶原，u-血浆酶原活化剂以及硫氢基载体N-乙酰基-L-半胱氨酸的无细胞系统内生成的(参考文献：Gately et al，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94：10868-10872，1999；Fitzpatrick et al，Biochemistry39：1021-1028，2000)。相较之下，此项发明中A₆₁的A-链血浆酶原片断，则是由u-血浆酶原活化剂在不含有硫氢基载体的条件下培育而产生的。反应产物可以通过L-赖氨酸-琼脂糖亲和法与凝胶渗入层析法进行纯化。我们已经指出，用这种方式生产的A₆₁会产生两个片断，一个片断的分子重量很明显是61和64kDa，这是通过变性后，在还原条件下所进行的十二烷基硫酸钠-聚丙烯胶体电泳分析法及考马斯氏蓝色染色法得到的。另一个片断的分子重量很明显是50kDa，这是通过变性后，在非还原条件下所进行的十二烷基硫酸钠-聚丙烯胶体电泳分析法及考马斯氏蓝色染色法得到的。采用这种方法，每100mg的血浆酶原一般可以回收51mg的A₆₁。

透过细胞系统也可以产生A₆₁。这些细胞最好是哺乳类动物的细胞，这些细胞可以来自正常组织，也可以来自含有癌细胞的组织。合适的哺乳类动物细胞被放在含有谷氨酸-血浆酶原或赖氨酸-血浆酶原的媒质中培育一整夜，这样由细胞产生的血浆酶原片断便形成了。可以使用在还原条件或非还原条件下进行的十二烷基硫酸钠-聚丙烯胶体电泳分析法和免疫印迹法，去辨认A₆₁片断。我们发现HT-1080纤维肉瘤细胞、牛毛细血管内皮细胞、以及较为次要的选择，海拉细胞和HUVEC细胞，都能生成A₆₁。血浆酶原的A₆₁片断可以用处理过的细胞培养，再通过亲和色谱法进行纯化。

p22血浆酶原片断也可以在体外制备。制备的方法是将A₆₁与血浆酶和一个诸如碘化麝香草酚(dithiothreitol)的还原因子放在一起培育。含有p22的血浆酶原片断于是通过A₆₁的降解而产生了。微克量的p22可以使用一个L-赖氨酸-琼脂糖柱，从反应混合物中分离纯化出来。

透过细胞-传媒系统也可以用来产生p22。这些细胞最好是哺乳类动物的细胞。将谷氨酸-血浆酶原或赖氨酸-血浆酶原，与HT1080人体纤维肉瘤细胞放在一起培育，可以产生A₆₁和p22。通过在还原条件下所进行的十二烷基硫酸钠-聚丙烯胶体电泳分析法，以及使用一个L-赖氨酸-琼脂糖柱所进行的纯化，可以辨认出p22片断为一质量为22kDa的片断。

A₆₁多(聚)核苷酸和p22多(聚)核苷酸也包括在此项发明的范畴内。这类多(聚)核苷酸分别编码A₆₁多肽和p22多肽。人体血浆酶原前体的人体核酸序列编码陈列在图2中。两种人体A₆₁同源物的序列编码为核酸343-1515(SEQ ID NO：5)和核酸343-1524(SEQ ID NO：6)。人体p22的序列编码为343-651(SEQ ID NO：7)。在这个领域中广为人知的是，由于氨基酸有重复编码的存在，所以A₆₁和p22多肽的其它核酸序列编码，也包括在此项发明的范畴内。

A₆₁多肽的多(聚)核苷酸编码和p22多肽的多(聚)核苷酸编码，也包括人体多肽直向变异体的序列编码。除此之外，此项发明还包括了非人类哺乳类动物多肽和非哺乳类脊椎动物多肽的多(聚)核苷酸序列编码。

除了SEQ ID NO：5-7序列外，由于此类多(聚)核苷酸与SEQ ID NO：5-7序列当中的任何一个序列，至少有90％的相同性，因此它们可以被辨认出来。所谓90％的相同性是指，和对照序列的长度相同并且至少有90％的核苷酸相同。这些和SEQ IDNO：5-7序列当中任何一个序列，至少有90％相同性的序列，可转译成A₆₁多肽或p22多肽，这些A₆₁多肽或p22多肽具有抑制血管增生的活性，更好的是，具有抑制内皮细胞增殖的活性。A₆₁多(聚)核苷酸编码391个氨基酸的A₆₁多肽，和带有394个氨基酸的A₆₁多肽，它分别带有1173个连续核苷酸或1182个连续核苷酸。p22多(聚)核苷酸则编码带有103个连续氨基酸的p22多肽。是以，具体而言，一个A₆₁多肽可以包含1173个连续核苷基或1182个连续核苷，它和SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6也至少有90％的核苷酸是相同的。同样地，一个p22多肽可以包含309个连续核苷酸，它和SEQ ID NO：7至少有90％是相同的。

在严格条件下能够与SEQ ID NO：5、6、或7序列进行杂交的核酸序列，也包括在这项发明的范畴内。更好的是，这类多(聚)核苷酸可转译成A₆₁或p22多肽，并且表现出抗-血管增生的活性。在严格条件或特别严格的条件下，科学家得以区分出，某一多(聚)核苷酸序列，是否为A₆₁或p22多肽的多(聚)核苷酸序列编码。这个领域里具有一般技术的科技人员，可以根据诸如：温度、离子力强度、时间长度、以及甲酰胺(formamide)的浓度(参考文献：Sambrook et al.，Molecular Cloning，2nd Ed.，1989)等在杂交过程和清洗过程中用来严格控制杂交的已知基本要素，去选择适当的严格条件。

含有A₆₁或p22多(聚)核苷酸的载体(vectors)，以及含有真核细胞和原核细胞的载体，也包括在这项发明的范畴内。这些细胞可以是哺乳类动物的细胞。这些哺乳类动物的细胞可以是，例如：人类、鼠科动物或牛的细胞。原核细胞可以是细菌细胞，例如E.coli细胞。此外，载体可以是，例如：质粒(plasmid)或病毒。

这项发明也包括体液和组织内A₆₁多肽和p22多肽的检验方法，以此检验诸如癌症及血管增生的情况。这里所谓的“检验”意指，发现病人体内某种疾病的存在，将该疾病与其它疾病区分开，估计该疾病的可能后果和恢复情况，监视疾病的发展或复发情况，决定病人的治疗方法和治疗目标。这种检验方法包括，但不限于，任何一种这个领域里已知的蛋白质检验方法在内，例如：免疫扩散法(immunodiffusion)，免疫电泳法(immunoelectrophoresis)，免疫化学法(immunochemical methods)，结合物-配基(binder-ligand)测定法，免疫组织化学技术(immunohistochemical techniques)，凝集与补体测定(参考文献：Basic and Clinical Immunology，Sites and Terr.eds.，Appleton & Lange，Norwalk，Conn.pp.217-262，1991)。最好是结合物-配基免疫测定法，这些方法包括反应抗体与一个或数个A₆₁多肽或p22多肽抗原表位，以及有标识的A₆₁多肽或p22多肽或它们的衍生物之间的交叉反应。

这里所指的A₆₁或p22多肽衍生物是指，一个多肽的某个特定氨基酸被除去、或替换、或改变为修改过或不寻常的氨基酸，然而A₆₁或p22多肽衍生物的生物特性和A₆₁或p22是相同的，多肽衍生物可以和抗A₆₁或p22的抗体交叉反应。交叉反应是指一个抗体和不是产生此抗体之抗原间的反应。

测量病体内A₆₁和p22标准的试剂组(kits)，也包括在这项发明的范畴内。这些检验方法可以是任何一种，这个领域内已知的蛋白质检验方法，例如：免疫扩散法(immunodiffusion)，免疫电泳法(immunoelectrophoresis)，免疫化学法(immunochemical method)，结合物-配基测定，免疫组织化学技术(immunohistochemical techniques)，凝集与补体测定法。这些试剂组还包括进行测定所需之适当试剂。

A₆₁和p22的抗体，也包括在这项发明的范畴内。这些抗体可以是多克隆抗体也可以是单克隆抗体。多克隆抗体可以从被免疫的兔子，或者注射过抗原并且按时注射后续抗原的其他动物身上取得。收集这些动物的血液，而且其血清经化验能够抵抗纯化的A₆₁或p22多肽。当使用诸如鸡、火鸡等鸟类物种时，抗体可以从蛋的蛋黄中提取出来。可以通过Milstein和Kohler法去制备单克隆抗体，此法是熔解从免疫老鼠身上取得的脾细胞，这些老鼠带有诸如：骨髓和淋巴细胞等持续复制性的肿瘤细胞(参考文献：Milstein and Kohler，Nature 256：495-497，1975；Gulfre and Milstein，Methods in Enzymology：Immunochemical Techniques73：1-46，Langone and Banatis eds.，Academic Press，1981)。然后通过限制稀释法去克隆该杂交瘤细胞，并通过酶联免疫吸附測定(ELIAS)、放射免疫測定(RIA)或生物测定进行抗体生产的化验。

特定抗体，不论A₆₁或p22的多克隆抗体或单克隆抗体，都可以通过上面所描述的任何一种适当的方法取得。例如，鼠类动物和人类的单克隆抗体可通过杂交瘤细胞技术生产，其它如A₆₁或p22多肽，或一个含有免疫活性的A₆₁或p22多肽片断，或一个抗-突变抗体，或动物体内所产生的可以辨识且结合到A₆₁或p22多肽的抗体片断。这些抗体可以是任何种类的抗体，例如，但是不限于，IgG，IgA，IgM，IgD和IgE，或者鸟类的抗体，包括IgY和任何来自次纲目中的抗体。

这项发明并且包括治疗和预防血管增生疾病与状态的方法。这类血管增生疾病与状态包括：固体肿瘤；诸如白血球过多症等血肿瘤；转移性肿瘤；诸如血管瘤(hemangiomas)、声带神经瘤(acoustic neuromas)、神经纤维瘤(neurofibromas)等良性瘤；风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)；牛皮癣(psoriasis)；诸如糖尿病视网膜病变(Diabetic Retinopathy)、早产儿视网膜病变(retinopathyof prematurity)、黄斑部变性(macular degeneration)、角膜移植排斥(cornealgraft rejection)、血管增生性青光眼(neovascular glaucoma)、晶体后组织增生(retrolental fibroplasias)、潮红(rubeosis)等视觉性血管增生疾病；Osler-Webber综合征；心肌血管增生；空斑血管增生；毛细管扩张；血友病患者的关节病，；血管角质瘤；伤口肉芽；肠粘连(Intestinal adhesions)；克隆氏症；动脉硬化症；硬皮病；以及肥厚性疤痕(Hypertrophic scars)，也就是瘢痕瘤(keloid)。

治疗病患的方法是，给患病的哺乳类动物足以抑制血管增生剂量的A₆₁和/或p22。此方法可以适用于任何涉及非必要血管增生的疾病与状态，特别是癌症肿瘤的生长。这里所谓的哺乳类动物最好是人类，并且A₆₁和/或p22最好是人体多肽。A₆₁和/或p22也可以和一些其他因子结合起来，治疗一些特殊疾病，例如，其他治疗癌症的抗癌物质。

细胞毒素的因子也可以和A₆₁或p22结合起来，成为治疗癌细胞的一种组合。这类细胞毒素因子包括篦麻毒素，脱氧核糖核酸酶(亦称DNase)，白喉毒素，假单胞菌外毒素，核糖核酸酶等等。

基因治疗法也包括在此项发明的范畴内。这包括将此项发明中的多聚核苷酸，或该多聚核苷酸在载体系统中的组合，例如，可以将多聚核苷酸片断，传送到病人特定细胞内的无感染性病毒载体等。化学方法也可以用来传送多聚核苷酸，其中包括与微脂粒(liposome)相结合，以及与脂肪感染素(lipofectin)或与细胞感染素(cytofectin)连结在一起。

体内体外连合方法(ex vivo)亦包括在此项发明的范畴内，这包括将此项发明中的多聚核苷酸传送到病体的细胞内，然后将经此处理过的细胞，注入病人体内。A₆₁或p22亦可用来抑制血管内皮细胞的增殖。这些细胞可以用于细胞体内，也可用于细胞体外。这种方法包括将适量的A₆₁或p22或者它们的一个组合物，传送到细胞内，以抑制内皮细胞的增殖。

此项发明还包括A₆₁或p22多肽或多聚核苷酸的治疗或制药成分。该成分包括，可接受的制药配方中，其所蕴含的能够治疗病人血管增生疾病或状态的有效含量。可通过药物的标准传递途径去使用该药物配方，例如：局部性，透过皮肤，进入腹膜腔内，头骨内，大脑室内，大脑内，阴道内，子宫内，口服性，直肠内，静脉内，脊椎内，皮下，或者肌肉内等途径。A₆₁和p22分子也可以和一些可以提供较佳制药或药效性质的因子结合或连结在一起。例如，A₆₁和p22可以和聚乙二醇连接，以提供更理想的药物(代谢)动力学参数。这个领域里已知的传送方法有：利用迷你渗透泵将药物传送到肿瘤部位的定点传送法等等。外用法可以和注射法产生一样快的效果，也可以使其在一定时间内慢慢注入或慢慢释放，以发挥作用。

这项发明中的配方组合，通常是依药品调配的方式来使用。这些调配方式均是在制药界广为人知的方式。其中一种较佳的方式乃是使用生理盐水作工具，其他可以被制药界接受的传送工具也可以使用，例如：其它无毒的生理溶液，5％的葡萄糖溶液，无菌水，或其它类似溶液。适当的缓冲液也应列入配方组合中。当需要时，这些溶液可以被冻干后，储存在消过毒的容器里以备后用，当要使用时，加入无菌水即可用来注射。主要溶液可以是水溶性的也可以是非水溶性的。这项发明中的配方组合，可以是一个在生物学上和母体相容的固体或半固体聚合体，例如，一个可以被植入需要治疗的细胞组织内的聚合体。这项发明中的配方组合可以被植入体内，定点治疗某一特定的肿瘤所在部位，或将其植入诸如肿瘤所在部位等处慢慢释放其药性，亦或将其植入体内某处以使血管增生阻断素得以规律性的慢慢释放。

传送工具可以包括制药界-可接受的，用来修正或保持配方pH值，渗透性，粘性，透明度，颜色，无菌性，稳定性，稀释比率，或气味的赋形剂。同样的，传送工具可以包括其它制药界-可接受的，用来修正或保持穿透血-脑障碍所使用之赋形剂的释放性，或吸收性，或渗透性。非经肠的给药法通常使用这类赋形剂去配药，不论是单剂量或复剂量形式的药，或是连续不间断的或间歇式的直接注入脑脊髓液形式的药。

相同剂量的重复使用需根据该配方的药物动力学的代谢参数，以及服用途径来决定。

我们认为，含有A₆₁和p22的某些配方可以口服。这些配方最好是放在胶囊中而且是用适当的传送工具配制的固体药物。列举一些适当的传送工具，赋形剂，或稀释液的例子，这包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯橡胶树胶、磷酸钙、藻酸盐、硅化钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、凝胶、糖浆、甲基纤维素、甲基-基苯甲酸丙脂、云母、镁、硬脂酸盐、水、矿物油等等类似物质。该物质还可以包括润滑剂、湿润剂、乳化剂和悬浮剂，防腐剂，甜味剂或调味剂。当病人接受医学界广为人知的程序进行治疗后，可以将这些配方调配为具有加速，维持或者延缓药效释放的作用。这些配方亦可以包括具有削弱蛋白质降解作用以及促进吸收的一些物质，例如表面活性剂。

药物的特定剂量是根据患者的大约体重或表体面积或用药部位体积来计算的。同时也必需根据所选择的服药途径去记算药物的剂量。而使用医药领域的一般性技述去进一步确定治疗所需的适当剂量，乃是一种例行公事。医药领域里熟练的科技人员不必进行太多的实验便可从事记算，这为此处所描述的定点细胞传送法的测定准备工作，提供了光明的前景。准确剂量的确定必需和标准剂量-反应研究工作结合在一起。一般皆知，实际的药物用量乃是由开业医生决定的，因为包括病患的病情，服用的药物成分，年纪，体重，各个病人的反应，病患症状的严重程度，以及所选择的服药途径等相关因素，均需列入考虑。

这项发明的具体表现陈述在下面的例子里。至于该发明内容所涉及到的其他具体表现，则是对该领域里熟练的科技人员而言，实乃是显而易见的，有关这项发明的详细内容及实际操作所涉及到的考虑。这里所作的详细描述以及所举的例子，仅是供参考用的范例而已，这项发明所含盖的范围和精神，详述在范例之后的发明项目中。

实施例一：

这个实例阐述的是A₆₁血浆酶原片断的产生和识别，血浆酶原断片是在无细胞系统中由血浆酶(原)自动分解而生成的。

先前发表的研究论文(Gately et al.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94：10868-10872；US Patent 5,801,012 to Soff et al.)指出，一个含有三环域1-4结构，分子重量为50kDa的血浆酶原裂解产物(其分子量是通过在非还原条件下所进行的十二烷基硫酸钠-聚丙烯胶电泳分析法得出的)，是在含有血浆酶原，U-血浆酶原催化剂，以及硫氢基供体N-乙酰基-L-半胱氨酸的无细胞系统中产生的。研究论文还指出，三环域1-4血浆酶原A-链片断的形成，完全得仰赖诸如N-乙酰基-L-半胱氨酸这类硫氢基供体的存在才行。

在重新检视通过血浆酶自动分解而形成，含有三环域1-4结构的血浆酶原片断，其对N-乙酰基-L-半胱氨酸硫氢基供体的依赖程度时，此项发明的科学家们，出乎意料地观察到，在没有硫氢基供体的情况下，血浆酶(原)自体分解产生出崭新的分子种类。这些分子种类包括一个分子重量为61kDa的主要片断，以及一个分子重量为64kDa的次要分解片断，这些分子被统称为A₆₁，以避免与血浆酶原片断血管增生阻断素(angiostatin)相混淆。

要产生A₆₁须在以下条件中进行：在37℃的环境下，将「谷氨酸」血浆酶原(40μM)(不含硫氢基供体)放在缓冲液中培育一夜，该缓冲液含有50mM的三(釋甲基)氨基甲烷盐酸缓冲液(pH值为9.0)，20mM的L-赖氨酸，100mM的氯化钠(NaCl)，1mM的乙二胺四乙酸(EDTA)，0.17μM的双链u-血浆酶原催化剂(尿酸激酶)，由此形成了当中含有A₆₁的混合液。在培育之后，用含有20mM Hepes(其pH值为7.4)以及140mM氯化钠的缓冲剂稀释四倍，在缓冲剂中加入1mM的二异丙基氟磷酸盐，放到一个在使用前，已经用含有20mM Hepes(其pH值为7.4)以及140mM氯化钠的平衡缓冲液，先行平衡过的L-赖氨酸琼脂糖亲合色谱柱(Pharmacia公司)上。经过5柱容量的平衡缓冲液清洗后，将色谱柱用具有0-125mMε-氨基-n-癸酸线状倾斜度浓度变化的溶液加以处里后，一个单蛋白质峰会被洗脱出来，然后将其汇集及浓缩。此单蛋白质峰是通过监测样品在280nm紫外线下的吸光度观察得到的。然后将这个浓缩的单蛋白质峰放到一个，在使用前已经用平衡缓冲液先行平衡过的Sephacryl-S-100型柱(Pharmacia公司)中，去进行分离过程，一个单蛋白质峰会被洗脱出来。先将这个蛋白质峰的各洗脱成分汇集起来，然后将它们分成若干份，贮存在零下80℃的环境中准备后用。从单蛋白质峰采集出的标本，是使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯胶电泳分析法去进行分析的(SDS-PAGE；Laemmli，U.K.(1970)Nature 227：680-685)。

至于蛋白质印迹法，我们使用Bio-Rad公司生产的转移印迹(transblot)仪器，将微型胶体放在4℃中一小时，或将大型胶体放在4℃中一整夜后，蛋白质会从胶体转移到0.45-μm孔径的硝化纤维素薄膜上。然后将薄膜放在含有5％脱脂牛奶的TPBS(TPBS是一种磷酸盐缓冲盐液，其中含有137nM的氯化钠，8mM的Na₂HPO₄，1.4mM的KH₂PO₄，2.7mM的KCl〔其pH值为8.0〕，以及0.1％的Tween-20清洁剂)溶液中，置于室温一小时，然后在含有1％脱脂牛奶的TPBS溶液中，与初级抗体一起置于4℃中培育一整夜，初级抗体的稀释过程如下：将1mg/ml的单克隆抗人体血浆酶原三环域1-3结构的抗体稀释5000倍；或将0.1mg/ml的单克隆抗人体血管增生阻断素的抗体(GF-47型)稀释500倍；或将多克隆抗鼠血管增生阻断素的抗体稀释500倍。在室温下，用TPBS溶液去洗涤印迹，至少6次(每次10分钟)，然后在含有1％脱脂牛奶的TPBS溶液中，将抗鼠或抗兔辣根過氧化物-綴合二级抗体稀释1000倍，置于37℃培育一小时。然后用TPBS溶液去洗涤薄膜，至少6次(每次10分钟)，采用超灵敏试剂(Pierce公司)的化学发光去进行显相。

图3陈列的是，在无细胞系统内所进行的A₆₁的产生和分离过程。要产生A₆₁须在以下条件中进行：将[谷氨酸]血浆酶原(40μM)放在缓冲液中培育，该缓冲液含有50mM的三(釋甲基)氨基甲烷鹽酸缓冲液(pH值为9.0)，20mM的L-赖氨酸，100mM的氯化钠(NaCl)，1mM的乙二胺四乙酸(EDTA)，0.17μM的双链u-血浆酶原催化剂(泳道一)。将该反应混合液置于37℃环境中，培育一整液(泳道2)。将该混合剂用加入了1mM二异丙基氟磷酸盐的平衡缓冲液稀释四倍，放到一个在使用前，已经用平衡缓冲液先行平衡过的赖氨酸-琼脂糖柱上。经过5柱容量的平衡缓冲液清洗后，将赖氨酸-琼脂糖柱用具有0-125mM ε-氨基-n-癸酸线状倾斜度浓度变化的溶液加以处里。这些包括分子重量为61kDa和64kDa的血浆酶原片断的组分被收集与汇集(泳道3)，通过超滤过程去浓缩，放到已经用平衡缓冲液先行平衡过的Sephacryl凝胶渗透色谱柱上。随后蛋白质峰被汇聚起来(泳道4)。汇聚的各份组分是通过在还原条件下(A)与非还原条件下(B)所进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯胶电泳分析法来进行分析的，并且用考马斯氏蓝色染色法去染色。另外，也可以通过在非还原条件下进行的十二烷基硫酸钠-聚丙烯胶体电泳分析法(SDS-PAGE)去分析各份组分，并将其转移到硝化纤维薄膜上，然后采用抗人类血浆酶原三环域1-3结构的单克隆抗体作为初级抗体，去进行免疫印迹法分析(图3C)。

在还原条件下，将染色色带与在凝胶上用来测量尺寸的标准刻度分子相比较，可以确立此蛋白质峰包含两个分离物质，这其中包括M_r 61000的主蛋白质和M_r64000的次蛋白质。因此，这些A链断片被统称为A₆₁。A₆₁的浓度是用一个ε_1％，280nm13.6以及质量为61Kda的分子来决定的。100mg的谷氨酸血浆酶原可回收51mg的A₆₁。将谷氨酸血浆酶原换成赖氨酸血浆酶原，也可回收差不多量的A61。

为了研究A₆₁生产的机理，需在还原条件与非还原条件下，使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯胶电泳分析法，去检查从血浆酶原和u-血浆酶原活化剂产生A₆₁的时间进程。这些实验是，将「谷氨酸」血浆酶原(8.7μM)置于37℃的环境下，放在缓冲液中培育，该缓冲液含有50mM的三(釋甲基)氨基甲烷鹽酸缓冲液(pH值为9.0)，100mM的氯化钠(NaCl)，1mM的乙二胺四乙酸(EDTA)，以及20mM的L-赖氨酸。如图4所指，样品在不同时间内被提取出来，然后在十二烷基硫酸钠-聚丙烯胶电泳分析法样品缓冲液中(有或没有还原剂)，通过稀释和加热样品使反应停止，然后在还原或非还原环境下，使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯胶电泳分析法去分析此样品。

图4陈列的是，血浆酶原分裂为A₆₁的时间进程分析。「谷氨酸」血浆酶原(8.7μM)按前述方法培育。加入39nM的u-血浆酶原活化剂来激发该反应。反应的各组分在不同时间内被提取出来，通过在还原条件下(图4A)与非还原条件下所进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯胶电泳分析法(图4B)进行分析，并且用考马斯氏蓝色染色法去染色。Pm_H代表血浆酶重链，Pm_L代表血浆酶轻链。

图4的数据显示，加入u-血浆酶原活化剂(39nM)去激发反应，反应进行5分钟后，〔谷氨酸〕血浆酶原(8.7μM)完全被转化为血浆酶。不过，在这个反应点观察不到A₆₁。在反应进行了大约1小时后，血浆酶重链和轻链的降解过程变得很明显。反应开始后大约2-4小时，由十二烷基硫酸钠-聚丙烯胶电泳分析法所得到的反应产物显示，A₆₁很明显的，在还原环境下，在凝胶表面有其M_r标准刻度大约为61,000和64,000的物质，而在非还原环境下，在凝胶表面有其M_r标准刻度大约为50,000的物质。

不同的实验证明了，无催化功能的人类血浆酶原重组体(S741C型)，在转化成血浆酶后，是不会转化成A₆₁的(Horrevoets，A.J.G..et al.(1997)Journal ofBiological Chemistry 272：2176-2182。然而此项发明并不局限于此理论，这些结果显示，u-血浆酶原活化剂可以使血浆酶原通过分裂生成血浆酶，然后血浆酶通过自体分解产生A₆₁。由於A₆₁可以通过血浆酶自体蛋白质溶解产生，因此除了用u-血浆酶原活化剂使血浆酶原通过分裂生成血浆酶外，还可以通过其它方法生产血浆酶，例如：采用其他诸如组织纤溶-血浆酶原活化剂或溶栓酶，将血浆酶原转换成血浆酶，或者采用重组DNA法产生血浆酶，这些均是可通过自体蛋白质溶解形成A_61 的血浆酶的其它生成方法。

血浆酶可以在无硫氢基供体的条件下进行自身消化，并不是新发现。其他的实验室已经发现，血浆酶自身消化涉及双分子反应，在该反应中，重链、轻链都产生蛋白质溶解现象[参考文献：〔Walther，P.J.，et al.，(1974)J.Biol.Chem.249，1173-1181；Grimard，M.(1976)Biochimie(Paris)58，1409-1412；Gaffney，P.J.，et al.，(1977)Haemostasis 6，72-88；Reddy，K.N.，and Wagner，C.J.(1980)Biochem.Biophys.Res.Commun.92，1016-1022；Jespersen，J.，et al.，(1986)Thromb.Res.41，395-404；Wu，H.L.，et al.，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84，8793-8795；Shi，G.Y.，and Wu，H.L.(1988)Thromb.Res.51，355-364〕。两篇与人体血浆酶有关的自体分解过程是由Wu和其实究研同仁共同发表的(Shi，G.Y.，and Wu，H.L.(1988)Thromb.Res.51，355-364)。这些科学家发现，在微酸性溶液中，血浆酶轻链比血浆酶重链分裂得快。血浆酶轻链的分裂情况与血浆酶活性损失有关。在pH质6.5至pH质11.0的条件下，轻链和重链均被分裂。另一方面，当pH质为碱性时，重链更易分裂。分裂重链的分子重量为50,000(在还原条件下进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯胶体电泳分析法)或58,000(Shi，G.Y.，and Wu，H.L.(1988)Thromb.Res.51，355-364)。M_r 58,000片断的半羟基酸-终端是精氨酸⁵³⁰。这些资料导出了如下的理论，由于它们的血浆酶原结构相似，半胱氨酸⁵¹²和半胱氨酸⁵³⁶之间以及半胱氨酸⁴⁶²和半胱氨酸⁵⁴¹之间的二硫键，能够被氢氧基离子分裂。我们不希望此发明受理论所局限，半胱氨酸⁴⁶²和半胱氨酸⁵⁴¹之间的二硫键片断，很可能解释了在没有硫氢基供体或血浆酶还原酶的条件下，血浆酶的自体分解作用是如何生成A₆₁的。

实施例二：

这个实例阐述的是A₆₁血浆酶(原)片断的产生与识别，这些A₆₁血浆酶原断片是在体外，通过血浆酶原与细胞的接触而产生的。

许多细胞可与血浆酶原结合，并在细胞表面将其转化为血浆酶，早已是定论。反之，通过诸如u-血浆酶原活化剂等血浆酶原活化剂的作用，血浆酶原可以在细胞表面被转化为血浆酶，近期发表的研究报指出，其他血浆酶原片断也可以在细胞表面上生成[(参考文献：Gately，S.，et al.(1996)Cancer Res.56：4887-4890；O’Mahony，C.A.，et al.(1998)J.Surg.Res.77：55-58；Westphal，J.R.，etal.(2000)Int.J.Cancer 86：760-767]。将细胞表面生成的血浆酶原片断和A₆₁相比较，人体HT1080纤维肉瘤细胞与〔谷氨酸〕血浆酶原共同培育，而由细胞产生的血浆酶原片断，则可通过在还原或非还原条件下所进行的十二烷基硫酸钠-聚丙烯胶体电泳分析法和免疫印迹法进行分析。

要在细胞的辅助下产生A₆₁，需将人类HT1080细胞或者牛毛细胞内皮细胞，置于37℃的环境中，放在装有DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)培养基的T75型组织培养瓶中生长(DMEM：JRH Biosciences公司或GIBCO-BRL公司)，该培养基的补充液含有10％经过热处理过的牛胎儿血清，2mM，L-谷氨酰胺酸，10单位/毫升的青霉素G，10μM的链霉素硫酸盐。将将每毫升含有大约1×10⁵细胞数的细胞加入24-井的组织培养盘中，置于37℃的环境内，培育大约24小时后，会形成细胞单层。用磷酸盐缓冲液(PBS，137nM NaCl，8mM Na₂HPO₄，1.4mM KH₂PO₄，2.7mM KCl，pH值为8.0)将该细胞单层清洗3次，然后将0.5~8μM溶在DMEM培养基中的〔谷氨酸〕血浆酶原加入各井中，含有A₆₁的混合物便在井中形成了。收集培育了一整夜的培养基(大约100毫升)，在4℃及2000xg的条件下，将其用离心机离心大约30分钟，以除去细胞残骸。经过离心的样品，其浮在表面的上层清液，被放到一个在使用前已经用平衡缓冲液先行平衡过的L-赖氨酸-琼脂糖亲合色谱柱上。经过5柱容量的平衡缓冲液清洗后，色谱柱经由具有0-125mM ε-氨基-n-癸酸的线状倾斜度之浓度变化的溶液处里后，清洗出A₆₁。在有还原剂或无还原剂的条件下，用十二烷基硫酸钠-聚丙烯胶电泳分析法去分析样品片断，然后在免疫印迹法中采用抗人体血浆酶原三环域1-3结构的单克隆抗体作为初级抗体(如下)去分析该样品片断。包含A₆₁的蛋白质峰片断被汇聚，浓缩起来。用交联葡聚糖PD-10柱(Amersham Pharmacia Biotech公司)进行蛋白质脱盐，使其转化到无内毒素的PBS(Life Technologies，Inc.公司)溶液中，将它们分成若干份，冷冻在零下80℃的环境中。使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯胶电泳分析法和免疫印迹法所进行的分析指出，部分(并非全部)哺乳类动物的细胞种类能够通过血浆酶(原)产生A₆₁。

图13陈列的是，A₆₁用细胞所产生的血浆酶原片断的比较。在这些实验中，将含有指定浓度之〔谷氨酸〕血浆酶原的DMEM培养基，与HT1080细胞一起培育。经过一整夜的培育后，用15％在还原条件下(图13A)和非还原条件下(图13B)所进行的十二烷基硫酸钠-聚丙烯胶体电泳分析法分析该培养基，然后用抗人体血浆酶原三环域1-3结构的单克隆抗体作为初级抗体的免疫印迹法去进行分析：〔谷氨酸〕血浆酶原标准样品(泳道1)；在无细胞条件下培育一整夜的〔谷氨酸〕血浆酶原(8μM)(泳道2)。将如下浓度的〔谷氨酸〕血浆酶原与HT1080细胞一起培育；0.5μM(泳道3)；1μM(泳道4)；2μM(泳道5)，4μM(泳道6)，8μM的〔谷氨酸〕血浆酶原(泳道7)；A₆₁标准样品(泳道8)。

如图13C所示，在DMEM中，人体〔谷氨酸〕血浆酶原(8μM)与不同种类的细胞系培育一整夜。培育一整夜后，用12.5％在还原条件下所进行的十二烷基硫酸钠-聚丙烯胶体电泳分析法分析该培养基，然后在免疫印迹法中用抗人体血浆酶原三环域1-3结构的单克隆抗体作为初级抗体去进行分析。血浆酶原标准样品(泳道1)以及A₆₁标准样品(泳道2)亦陈列在图13C。，血浆酶(原)与下列细胞系相接触而产生的血浆酶(原)和其分解物，乃是透过免疫印迹法分析获得的：HT1080细胞(泳道3)，海拉细胞(泳道4)，牛毛细血管内皮细胞(泳道5)，或HUVECSs细胞(泳道6)。

实验结果显示，HT1080细胞和BCE细胞均可将血浆酶(原)转化成一种分子，这种分子与在无细胞系统中产生的A₆₁，用免疫印迹法是无法区分的，首先，我们发现，人工培育的细胞能产生一种，其分子大小与A₆₁相似的血浆酶原片断，这表示由细胞所产生的主要A链片断，至少包括4个完整的三环域结构。其次，牛毛细血管内皮细胞能产生一个类似A₆₁的蛋白质，这一结果指出，并非只有癌细胞才可形成A链片断。此外，由HT1080细胞或牛毛细血管内皮细胞所产生，类似A₆₁的血浆酶原片断N-终端序列，证明了由细胞所产生的A₆₁N-终端，与在无细胞系统中产生的A₆₁是相同的。

为了证明经由细胞与血浆酶原相接触而产生的A₆₁，其在体外对内皮细胞增殖的抑制效应，我们在下面的实施例5中，描述了抑制生长的实验过程。在这些实验中，人体〔谷氨酸〕血浆酶原(2.7μM)与HT1080细胞或牛毛细血管内皮细胞放在一起培育一整夜(图13D)。用L-赖氨酸-琼脂糖亲合色谱柱，将A₆₁从HT1080细胞(闭合环)和牛毛细血管内皮细胞(开环)的人工培养基中纯化出来。将由细胞产生的不同浓度的A₆₁加入牛毛细血管内皮细胞中，牛毛细血管内皮细胞生长受到A₆₁的抑制程度，陈述在实施例5中。由HT1080细胞或牛毛细血管内皮细胞所产生的，与A₆₁相似的蛋白质，具有很强的抗血管增生活性，这个结果进一步支持了我们的论点：未被激发的正常细胞能够产生抗血管增生的血浆酶原断片。

由于在无细胞系统中产生的血浆酶(原)，以及由牛毛细血管内皮细胞或HT1080细胞与血浆酶原相接触而产生的血浆酶(原)，其分子和生物特性相同，因此一般咸信，这些方法全部可以用来生成A₆₁。

实施例三：

这个实例阐述的是A₆₁存在予健康或染病的哺乳类动物(包括老鼠在内)的血清中。

初期的研究认为，通过在还原条件下进行的十二烷基硫酸钠-聚丙烯胶体电泳分析法所获得的，分子量为38000~43000的血管增生阻断素片断血浆酶原，存在于有Lewis肺癌肿瘤老鼠的尿及血清中，但不存在于正常或肿瘤被切除的老鼠的血清中(参考文献：0Reilly，M.S.，et al.，(1994)Cell 79：315-328]。对此，我们检查了血清以判断类似A₆₁的片断是否存在。在这些实验中，将200μl的老鼠血清或人体血清，在室温下，与50μl在使用前已经用平衡缓冲液先行平衡过，而且平衡缓冲液与凝胶的比率为1:1的L-赖氨酸-琼脂糖凝胶悬浮液，一起培育30分钟。将该凝胶用5柱容量的相同平衡缓冲液清洗。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯胶体电泳分析法样品缓冲液与凝胶共同煮沸，以洗堤粘附的蛋白质，然后将每一个样品取出20μl，用在非还原条件下进行的十二烷基硫酸钠-聚丙烯胶体电泳分析法和免疫印迹法进行分析。

图5将A₆₁和存在于老鼠血清中的血浆酶原片断作了比较，从老鼠体内收集来的血清，用50μl的L-赖氨酸-琼脂糖(凝胶)〔在混合了20mM Hepes(pH质为7.4)，140mM NaCl的平衡缓冲液中平衡〕，在室温下培育30分钟。将该凝胶用5柱容量的平衡缓冲液清洗，与十二烷基硫酸钠-聚丙烯胶体电泳分析法样品缓冲液共同煮沸，用在非还原条件下进行的十二烷基硫酸钠-聚丙烯胶体电泳分析法进行分析。然后用抗-老鼠血管增生阻断素的兔子抗体(图5A)或抗-人体血浆酶原三环域1-3结构的单克隆抗体作(图5B)，去进行免疫印迹法。图5A所示泳道如下：控制组老鼠血清(泳道1和泳道2)；从两只长了14天Leuis肺癌肿瘤老鼠体内取得的血清(见下面的实施例5)，(泳道3和泳道4)；从两只肿瘤切除14天后的老鼠体内取得的血清(泳道5和泳道6)。图5B所示泳道如下：A₆₁标准样品(泳道1)；长了14天肿瘤的老鼠(泳道2)；肿瘤切除3天后的老鼠(泳道3)；肿瘤切除6天后的老鼠(泳道4)；肿瘤切除9天后的老鼠(泳道5)；肿瘤切除12天后的老鼠(泳道6)；肿瘤切除15天后的老鼠(泳道7)。

A组试验结果在所有受测试的老鼠中是一致的，受测试组包含21只正常老鼠，9只长肿瘤的老鼠，29只肿瘤被切除的老鼠。

如图6所示，图5A和图5B中所示，由免疫印迹法所得到的结果证明了，在正常的，长肿瘤的，以及肿瘤切除的老鼠血清中，均可检测到类似A₆₁的血清酶原片断。在这些实验中，用抗-人体血浆酶原三环域1-3结构的人体单克隆抗体(图6，a’)或抗-老鼠癌细胞血管阻断素的兔子抗体(图6，b’)来检测类似A₆₁的血清酶原片断。而用这些抗体标记的老鼠血浆酶原片断，在非还原条件下进行的十二烷基硫酸钠-聚丙烯胶体电泳分析法中，其分子量大约为50,000，也可以用抗人体三环域1-3结构的单克隆抗体检测出来(图5C，a’)。与血管增生阻断素不同的是，类似A₆₁的蛋白质既存在于正常动物的血清中，亦存在于长肿瘤动物的血清中，而且动物体内的肿瘤在切除后3~15天内，类似A₆₁血浆酶原片断的浓度，并没有明显的变化(图5B，以及图6，b’)。

由于健康与长肿瘤的老鼠血清中，存在类似A₆₁的蛋白质，接下来便是去调查，人体内是否也存在类似A₆₁的蛋白质。图7比较了A₆₁与人体血清中的血浆酶原断片。先将身体正常的志愿者(A)与癌症病人(B)的冷冻血清解冻，然后与50μl的L-赖氨酸-琼脂糖(凝胶)(在混合了20mM Hepes(pH质为7.4)，140mM NaCl的平衡缓冲液中平衡)，在室温下培育30分钟。将该凝胶用5柱容量的平衡缓冲液清洗后，与十二烷基硫酸钠-聚丙烯胶体电泳分析法样品缓冲液共同煮沸，用在非还原条件下进行的十二烷基硫酸钠-聚丙烯胶体电泳分析法进行分析。然后用抗-人体血管增生阻断素的单克隆抗体去进行免疫印迹法。A，血管增生阻断素标准样品(250ng)(泳道1)；A₆₁标准样品(250ng)(泳道2)；身体正常的实验室志愿者的血清(泳道3至泳道11)。B、血管增生阻断素(Calbiochem公司)标准样品(250ng)(泳道1)；A₆₁标准样品(250ng)(泳道2)；睾丸肿瘤(泳道3)；头和颈肿瘤(泳道4至泳道5)；睾丸肿瘤(泳道6至泳道8)；头和颈肿瘤(泳道9至泳道10)。

如图7所示，与血管增生阻断素不同的是，每个受检者的血清中，均存在类似A₆₁的血浆酶原片断。由于它存在健康与非健康的老鼠和人体的血清中，由此推断，与血管增生阻断素不同的是，类似A₆₁的血浆酶原片断是哺乳类动物血清的正常组分，而使用在此描述的技术，可以将该片断分离。此发明并不局限于已知理论，血清中所产生的类似A₆₁的分子，乃是透过血浆酶的自体分解而形成的。尽管血清中所产生的类似A₆₁的分子，其生物活性尚未经过测试，但是我们可以采用诸如：配基亲合法，胶体过滤法，离子交换法，反相法，以及疏水交互色谱法等色谱法的标准技术，去进一步分离该血清组分。

实施例四：

这个实例阐述的是A₆₁的生物化学和生物物理特性。

由于A₆₁很容易大量生产，因此A₆₁的N-末端序列和C-末端序列可以被确认出来。只要使用标准技术去操作商业设备，便可确认末端序列。通过Edman降解法我们确认出N-末端序列，通过Hewlett-Packard公司出产的HP G1000A型C-末端蛋白质定序器，以及Applied Biosystems公司出产的477C Procise C型C-末端蛋白质定序器我们确认出C-末端序列。从这些定序器获得的结果相当一致。Hewlett-Packard公司出产的HP G1000A型C-末端蛋白质定序器，使用的是化学2.0版，它采用二苯基磷酸同种硫氰酸盐(diphenylphosphorylisothiocyanate)作活化剂(参考文献：Bailey，J.M.et al.(1992)Protein Sci.1：1622-1633)，采用锂乙硫氨基酪酸盐(lithium ethiolate)作裂解剂(美国专利号码5,986,071 Graham et al.)，这是一个修改过的裂解系统。Applied Biosystems公司出产的477C Procise C型C-末端蛋白质，则采用前述的标准化学试剂〔Boyd，V.L.(1992)Analytical Biochemistry 206：344-352〕。

A₆₁的N-末端序列为：赖氨酸⁷⁸-谷氨酸⁸³。主要的和次要的C-末端序列分别为赖氨酸⁴⁶⁸-氨基乙酸⁴⁶⁵和精氨酸⁴⁷¹-氨基乙酸⁴⁶⁷(表1)。是以，将N-末端和C-末端序列和已知的血浆酶原序列进行对比，我们可以确定血浆酶的蛋白质自体水解分裂点为赖氨酸⁷⁷-赖氨酸⁷⁸，赖氨酸⁴⁶⁸-氨基乙酸⁴⁶⁹，和精氨酸⁴⁷¹-氨基乙酸⁴⁷²。因此，A₆₁的主要种类含有赖氨酸⁷⁸-赖氨酸⁴⁶⁸的初级氨基酸序列。而A₆₁的次要种类则含有赖氨酸⁷⁸-精氨酸⁴⁷¹的初级氨基酸序列。从这个氨基酸序列预测出来的平均分子重量为44.1Kda。

表I^a—人体A₆₁的氨基-末端序列和羧基-末端序列

 

血浆酶原	氨基乙酸<sub>465</sub>	天冬酰胺酸<sub>466</sub>	氨基乙酸<sub>467</sub>	赖氨酸<sub>468</sub>	氨基乙酸<sub>469</sub>	酪氨酸<sub>470</sub>	精氨酸<sub>471</sub>
								A<sub>61</sub> C-序列A			氨基乙酸	赖氨酸	氨基乙酸	酪氨酸	精氨酸
A<sub>61</sub> C-序列B	氨基乙酸	天冬酰胺酸	氨基乙酸	赖氨酸
								血浆酶原	赖氨酸<sub>78</sub>	缬氨酸<sub>79</sub>	酪氨酸<sub>80</sub>	亮氨酸<sub>81</sub>	丝氨酸<sub>82</sub>	谷氨酸<sub>83</sub>
A<sub>61</sub> N-序列	赖氨酸	缬氨酸	酪氨酸	亮氨酸	X	谷氨酸

^a文中所述在非细胞系统中产自人体血浆酶原和uPA的人体A₆₁。A₆₁C-序列A与C-序列B的库尔比率为2:5。

N-末端和C-末端序列的确定，使得包含赖氨酸⁷⁸-赖氨酸⁴⁶⁸氨基酸序列的A₆₁初级结构，得以被准确的发表出来。虽然其他A链片断也已被发表出来，但是由于不知道C-末端序列，因此难以确定这些片断。血浆酶原被金属弹性酶，基质金属蛋白酶，和丝氨酸蛋白酶等多种蛋白酶分裂后，产生三环域1-3，三环域1-4，以及三环域1-4.5片断(表2)。一般而言，A链片断终止在介于K3和K4之间连结域的氨基酸残基处(三环域1-3结构的C-末端为缬氨酸338/354残基)，K4和K5之间的连结域(三环域1-4结构的C-末端为丙氨酸440或脯氨酸446/447)，或者在K5的残基中(三环域1-4.5结构的C-末端为精氨酸530，)。是以，A₆₁是一种崭新的A链片断，该片断属于A链片断的三环域1-4.5类结构，只不过A₆₁只包含三环域5结构中的7个残基。

表II：各种A链片断的比较

 

结构	分子量(kDa)	三环域结构	IC<sub>50</sub>(nM)	血浆酶原的分裂方法	参考文献
						Y80-A440	51-54	K1-4	70	弹性蛋白酶	(Takada et al.，1988)
Y80-V338/354	41-44	K1-3	135	弹性蛋白酶	(Takada et al.，1988)
						N60-P447	55	K1-4		基质金属蛋白酶-3	(Lijnen etal.，1988)
K78-P447	58	K1-4		基质金属蛋白酶-7	(Patterson &Sang，1997)
						K78-P446	58	K1-4		基质金属蛋白酶-9	(Patterson &Sang，1997)
K78-K468	61	K1-4+7rK5	35	自体消化	(Kassam et al，2001)
						K78-R530(？)	66，60，57	K1-4+69rK5		血浆酶还原酶和丝氨酸蛋白酶	(Stathakis et al.，1999)
K78-？	50*	K1-4(？)	300	还原和自体消化	(Gately et al.，1997)
						K77-？	42，48，50*	K1-4(？)		自体消化	(Falcone et al.，1998)
K78-R530	55	K1-4+69rK5	0.050	自体消化(pH值为11)	(Cao et al.，1999)
						L74-L451	49，51*	K1-4	17	重组	(Sim et al.，1997)
L74-P349	36*	K1-3		重组	(MacDonald etal.，1999)

 

未知的

38

K1-(？)

巨噬细胞金属弹性酶

(Dong et al.，1997)

表II缩写说明如下：K指三环域结构；r指氨基酸残基，MME指巨噬细胞金属弹性酶。表II的编号方式是依据人体血浆酶原序列(791个残基)，其中不包括19个，结束于蛋氨酸-19，开始于谷氨酸-1(Forsgren et al.，1987)的氨基酸信号缩氨酸。分子量是通过在还原条件下与非还原条件下(*)所进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯胶电泳分析法获得的。A链片断的抗血管增生阻断素的活性，IC₅₀，是指要达到50％抑制牛毛细血管内皮细胞增殖效果所需之A链片断的浓度。为了直接比较抗血管增生阻断素的活性，我们汇集了一些实验报告的相关结果(Cao etal.，1996)。问号(？)代表C-末端序列尚未被确定的结构。

为了研究A₆₁转译后被修饰的可能性(除了蛋白质水解分裂之外)，我们使用以母体基质作支援的激光解吸电离(MALDI)质谱测定器的技术，去测量A₆₁的分子重量。我们采用的是Voyager DE-STR型(PE Biosystems公司)的MALDI质量分光计去获得质谱图。在作该项分析时，A₆₁的样品须分四次，每次以4-μl为一次量，单独加入预先平衡过的ZipTips(Millipore公司)中，以除去盐分并达到特定浓度。然后用2μl再结晶过的Sinapinic(3，5-dimethoxy-4-hydroxycinnamicacid)母体基质溶液，从尖端洗堤每份样品，每次将1μl的样品洗堤到具有100-井位的不锈钢样品板上。将样品板放到质量分光计中后，采用线性MALDI法去获取样品的质谱图。在该线性MALDI法中，采用20-kV的加速电压，氮激光(337nm，UV波长)，以及350-ns的萃取延缓时间。每组数据均经过除杂信号过滤，拂平线曲两次，中央化后，再去除同位素，以除去源自质心-变异物光谱的同位素。A₆₁的质谱图显示，在大约1-kDa宽度范围内，有一条很宽的特征群。当中央化并去除同位素后，群中主要种类被拂平其分子重量为46,616道尔顿。这个测量出来的分子重量，比用氨基酸序列推测出来大约为44.1kDa的平均分子质量大得多。用质谱法测量出来的A₆₁片断的分子重量为44.6-kDa，用蛋白质氨基酸序列推测出来A₆₁片断的分子重量为44.5kDa，两相比较后得知，A₆₁和其母体分子，血浆酶原，很类似，它亦会被糖基化(参考文献：Hayes，M.L.，and Castellino，F.J.(1979)J.Biol.Chem.254：8772-8776；Hayes，M.L.，and Castellino，F.J.(1979)J.Biol.Chem.254：8777-8780)。血浆酶原在三环域3结构处含有与N相连的醣类残基，在三环域2-三环域3的Ser249连结处以及三环域3-三环域4的Thr346连结处含有与O相连的醣类。糖基化作用所扮演的角色我们并不清楚，但是针对A-链片断所作的研究显示，糖基化的程度可能会影响蛋白质在循环过程中的生物活性，甚或会使其生命周期减半(参考文献：Pirie-Shepherd，S.R.(1999)J.Lab.Clin.Med.134，553-560)。

A₆₁的氨基酸序列与其它A-链片断的比较，陈列在表II中。表中的比较数据证明A₆₁是一个崭新的A-链片断。分子序列则显示，与目的为抑制内皮细胞增殖的血管增生阻断素和其他血浆酶原断片不同的是，A₆₁乃是由血浆酶原的前四个三环域结构，加上三环域4-三环域5结构的连结域，以及三环域5结构的7个残基所组成。

有了大量的A₆₁后，我们得以研究A₆₁的二级结构。为了明嘹A₆₁的二级结构，我们测了A₆₁分子样品的圆二色散仪光谱(图8)。我们通过Jasco J-810型分光偏振计测得该圆二色散仪光谱。使用分光偏振计前，须先用再结晶的氨盐基d-10-camphorsulfonate水溶液校正分光偏振计。将A₆₁(0.4-0.6mg/ml)置于10mM的三(釋甲基)氨基甲烷缓冲液(pH值为7.5)，150mM的氯化钠，含有或不含有配基的条件下，在室温中，培育20分钟。将样品(0.1ml)放在石英试管(长度为0.5mm)中扫描，扫描的波长范围为178~260nm，扫描速度为20nm/min，频带宽度为1nm，反应时间为4秒钟。将扫描所得的三个波长加以平均，以此获得蛋白质的圆二色散仪光谱，减去缓冲液的扫描结果，或者在适当情况下，减去缓冲液中配合基的扫描结果，以此校正蛋白质的圆二色散仪光谱。实验结果以△ ε_(M-1-cm-1)表示。可通过CDsstr 1.8版计算机程式(参考文献：Johnson，W.C.(1999)Proteins 35：307-312)对A₆₁的二级结构内容进行评估。

在A₆₁的远-紫外线圆二色散仪光谱图中，在波长202nm处有一道很强的负波段，在波长227nm处有一道较弱的正波段。这个光谱和已发表的包含A-链片断的其他三环域结构的光谱很相似，例如：三环域4结构的光谱[参考文献：Cleary，S.，et al.(1989)Biochemistry28：1884-1891；Castellino，F.J.，et al.(1986)Arch.Biochem.Biophys.247：312-320；Misselwitz，R.，et al(1994)Int.J.Biol.Macromol.16：187-194]。圆二色散仪光谱对二级结构内容的分析结果是，大约有21％为链状型，14％为扭转型，18％为31-螺旋状型，8％为310-螺旋状型，以及40％为无序型。A₆₁不包含任何α-螺旋结构，这点和其他包含三环域结构的结构体是很相似的。这些实验结果证明，在无细胞系统中缺乏硫氢基供体的条件下所产生的A₆₁并不会导致分子改变其本性。

图8陈列的是A₆₁的圆二色散仪光谱图。这是在20℃，10mM三(釋甲基)氨基甲烷缓冲液(pH值为7.5)，150mM氯化钠的条件下所进行的波长扫描。A₆₁的蛋白质浓度为8.5μM，穿过各点的线代表最吻合由二级结构各计算组合的平均值推算出来的数据。

通过CDsstr所进行的远-紫外线圆二色散仪光谱分析，其结果显示A₆₁中缺乏α-螺旋结构，CDsstr是一种最近才出来的计算机程序[参考文献：Johnson，W.C.(1999)Proteins 35：307-312]。总的来说，A₆₁的二级结构相当于其他含有三环域结构的蛋白质。最近，我们发现包含三环域结构的蛋白质其实含有相当多的3₁-螺旋结构。由于视觉上不易看见，因此早先的X-射线结构论文报告中并没有提及该结构。然而，远-紫外线圆二色散仪光谱对3₁-螺旋结构却非常敏感。A₆₁中含有3₁-螺旋结构的论点，和近期论文报告中所提，诸如血浆酶原等其他含有三环域结构的物质中含有3₁-螺旋结构的论点乃是一致的[参考文献：Marti，D.N.，etal.，(1999)Biochemistry 38：15741-15755]。在赖氨酸或赖氨酸同类物存在的条件下，A₆₁的内部荧光放射光谱会增加，我们由此推断，A₆₁的三环域结构其功能乃是十分活跃的。

通过内部荧光放射光谱学可以研究A₆₁的三环域结构的功能。我们采用Perkin-Elmer Life Sciences公司所出产，配备了恒温保存器的LS 50B型荧光分光计，去收集激发光谱和放射光谱。激发光谱和放射光谱的纵切宽度分别设定在5nm和10nm处。上述光谱是在以下条件下收集起来的：在25℃的环境下，将A₆₁(3.7μM)置于缓冲液中，缓冲液包括20mM的Hepes(pH质为7.4)以及140μM的氯化钠，其中含有或不含有配基。由於加入配基会导致些微析释，因此数据要加以修正。

图9陈列的是含有及不含有反式(trans)-4-氨基甲基环已胺羧酸(AMCHA)的A₆₁内部荧光光谱。图中包括无配合基(实线)的，以及被AMCHA浸透(虚线)的A₆₁的激发光谱(Ex)与放射(Em)光谱。光谱是在以下条件下测定的：20℃，20μM的Hepes(pH质为7.4)和140μM的氯化钠。A₆₁的浓度为3.7μM。

诸如ε-氨基-n-山羊酸的赖氨酸型两性离子，与血浆酶原三环域结构相结合后，可使内部蛋白质荧光增强大约7％左右[参考文献：Violand，B.N.，et al.(1978)J.Biol.Chem.253：5395-5401]。这导致我们去检查，由A₆₁与浅在配基相接触所造成的A₆₁在内部荧光光谱中的转移现象。图8陈列的是A_61的内部荧光放射光谱。激发与放射最大值分别出现在283nm和342nm处。与诸如ε-氨基-n-山羊酸以及N-乙酰基-L-赖氨酸(它和C-末端赖氨酸的结构相仿)等赖氨酸和其它赖氨酸类似物相结合，可以使内部荧光放射光谱大为增强。的结果可使内部荧光发射光谱(强度)增加很多，AMCHA酸使放射光谱的荧光强度增加了27％，与其他物质相比，这是最多的。但是N-乙酰基-L-赖氨酸甲酯(一种和内部赖氨酸残基的结构相仿的赖氨酸类似物)却未能使放射光谱的荧光强度发生太大的变化。表III中归纳总结了这些实验数据。由於A₆₁的内部荧光放射光谱在赖氨酸或赖氨酸类似物存在的条件下会增强，因此A₆₁的三环域结构其功能是活跃的，它并且能与自由赖氨酸残基或C-末端赖氨酸残基相结合，但不能与内部赖氨酸残基相结合。

实施例五：

这个实例阐述的是A₆₁的生物特性。

要检测A₆₁对内皮细胞生长的影响，需将牛毛细血管内皮细胞(BCE细胞)与A₆₁相接触。做这些实验时，先将细胞放在DMEM(JRH Biosciences公司)培养基中培养，该培养基的补充液包括：10％的小牛血清，2mM L-谷氨酸盐，10单位/毫升的青霉素G，10μM的链霉素硫酸盐，以及3ng/nl的碱性纤维质母细胞生长因子(bFGF；Calbiochem)。然后将第3代细胞至第5代细胞放到24-井的组织培养盘中(3000个细胞/每井)，在37℃的环境中，培育24小时。换用含有5％小牛血清的新鲜DMEM培养基，其中含有或不含有A₆₁(由无细胞法产生的)，而A₆₁在使用的前一刻，已经用Detoxe-胶体柱(Pierce公司)除去内毒素〔通过Pyrotell鱟变形细胞裂解测定(Pyrotell Limulus amoebocyte lysate assay)(Associates of Cape Cod，Inc.，Falmouth，MA)内毒素的浓度低于45pg/ml(0.4内毒素单位/ml)〕。在含有A₆₁的条件下，将细胞培育30分钟后，加入最终浓度为1ng/ml的碱性纤维质母细胞生长因子，继续将细胞培育72小时，细胞受胰蛋白酶作用，在Isoton II溶液中再度悬浮，以计数器计算细胞数。

当使用上述方法测定A₆₁对内皮细胞增殖的影响时，其结果显示，A₆₁对牛毛细血管内皮细胞生长的抑制效果，和其剂量密切相关(图9)。从血浆酶原产生的A₆₁，要达到50％的抑制效果，在无外生硫氢基供体条件下制备的A₆₁，其浓度需为35±10nM(±标准误差，n＝4)。A₆₁浓度大约为200nM时，其对牛毛细血管内皮细胞的增殖作用，可达到最大的抑制效果。在具有硫氢基供体N-乙酰基半胱氨酸条件下制备的A₆₁，对牛毛细血管内皮细胞的增殖作用具有相同的抑制效果。然而，IC₅₀为35nM比Soff及其工作同仁所发表的IC₅₀为300nM[参考文献：Gately，S.，et al.，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94，10868-10872]要低相当多，因而它代表了相当大的改进。浓度高达2μM的A₆₁对HT1080纤维肉瘤细胞，海拉细胞，以及293细胞等数种非内皮细胞的增殖没有抑制效果。

图10陈列了A₆₁的生物活性。A、对牛毛细血管内皮细胞增殖的抑制性。将牛毛细血管内皮细胞在如下的条件中进行培育，1ng/ml的碱性纤维质母细胞生长因子以及各种浓度的A₆₁，其中A₆₁可在具有(开环)，或不具有(闭环)硫氢基供体N-乙酰基半胱氨酸的条件下制备。经过72小时的培育后，牛毛细血管内皮细胞受胰蛋酶作用，在Isoton II溶液中再度悬浮，以Coulter计数器计算细胞数。B、对体内转移性肿瘤生长的抑制性。在原始肿瘤切除之后，立即将磷酸盐-缓冲液盐水或含有A₆₁的磷酸盐-缓冲液盐水(2.5mg/kg/day)注射到老鼠的腹膜中。在特定时间间隔下摘除肺部，然后比较肺部的重量。

我们用Lewis肺癌肿瘤测定(参考文献：O’Reilly et al的US Patent5.776，704)去研究A₆₁在体内的抗肿瘤活性。培育Lewis肺癌细胞，当癌细胞达到快速增长期时将之收集起来，并且再度悬浮于磷酸盐-缓冲液盐水。将大约10⁶个细胞注射到6~8星期大的C57BL/6形雄鼠的背中部皮下组织中。当老鼠体内的肿瘤长到约为1500mm³大小时(约在注射14天之后)，将雄鼠随机分为两组。将第一组用外科手术去除肿瘤，将第二组施以虚拟的外科手术过程使其肿瘤虽经处理但完好无损。将肿瘤去除组的雄鼠随机分为试验组与控制组。对于试验组的老鼠，每日在其腹腔膜内注射含有A₆₁的磷酸盐-缓冲液盐水(剂量为2.5mg/kd/day)，对于控制组的老鼠，则仅注射磷酸盐-缓冲液盐水。肿瘤切除后的每隔3天将受试老鼠杀死，称其肺重量。

肿瘤被切除，仅注射过磷酸盐-缓冲液盐水的老鼠，其肺重量随着时间的增长而逐渐增加(图11)。在肿瘤切除18天后，与老鼠肿瘤的总重量相关联的老鼠肺重量，达到770±42mg(±标准误差，n＝4)。两相对照下，每日注射含有A₆₁剂量的老鼠，其平均肺重量仅增加到250±14mg(±表示标准误差，n＝4)。正常老鼠与肿瘤长了18天的老鼠，其平均肺重量分别为191±25mg(±标准误差，n＝4)和199±20mg(±标准误差，n＝4)。肿瘤切除的老鼠，其肺重量的增加和可观察到的转移性焦点值的增加，彼此是一致的。这些实验结果证明了A₆₁是一种很强的抗肿瘤因子。我们不希望此发明受以下理论所局限，我们认为，A₆₁的抗肿瘤活性乃是基于A₆₁的抗内皮细胞增殖的活性，这证明A₆₁在体内具有抗血管增生的活性。2.5mg/kg/day的抗肿瘤活性所需剂量，比Soff及其工作同仁所提出的15mg/kg/day的抗肿瘤活性所需剂量[参考文献：Gately，S.，et al.，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94，10868-10872]要低相当多。因此，A₆₁作为一种抗肿瘤因子，其抗肿瘤效力的提高，代表它的抗肿瘤效力远远超越其它抗血管增生血浆酶原衍生物的抗肿瘤效力。

实施例六：

这个实例阐述的是，用无细胞法从A₆₁中产生p22的过程。

生物界近来逐渐浮现出一种新观点：某些无活性的先驱蛋白质能够在体内分裂，以产生有生物活性的片断。例如，丝氨酸蛋白酶激肽释放酶(kallikrein)经蛋白水解后产生微肽原(kinonogen)，可导致一种有效的血管扩张物质—缓缴肽(bradykinin)的释放(参考文献：Schmaier，2000 Curr.Opin.Hematol.7：261-265)。相同的道理，胶原质(collagen)XVIII经蛋白质水解后，可导致一种有效的抗血管增生物质—蛋白质内皮细胞抑制素(endostatin)的产生(参考文献：O’Reilly et al.，1997 EXS 79：273-294)。具有生物调控功能的蛋白质水解过程这个新观点，强烈表现在血浆酶原分裂系统中，在血浆酶原中，分子的蛋白质水解分裂，能够产生多样的蛋白酶，血浆酶，或经进一步分裂后，能够产生抗血管增生的血浆酶原片断。虽然通过血浆酶(原)的蛋白质水解消化或者基因重组技术，可以在体外产生许多不同的血浆酶原片断，但是我们还不清楚，在生理环境下能够产生什么样的抗血管增生的血浆酶原片断。所有已知的抗血管增生的血浆酶原片断，至少包含一个三环域结构域。

三环域结构域是小型的蛋白质区域，它大约包含80个氨基酸，并且有一个很有特色的三-二硫化物键结构。这些区域被认为是独立的结构单位，在这些单位的N-末端和C-末端有一个半胱氨酸残基。在尿激酶(参考文献：Gunzler et al.，1982 Hoppe Seylers.Z.Physiol.Chem.363：1155-1165.)和因子XII(参考文献：McMullen and Fujikawa，1985 J.Biol.Chem.260：5328-5341)中有一个三环域结构域，在组织型-血浆酶原活化剂及凝血素中有两个三环域结构域(参考文献：Pennica et al.，1983)，在肝细胞生长因子中有四个三环域结构域(参考文献：Tashiro et al.，1990 Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87：3200-3204)，在血浆酶原中有五个三环域结构域，在阿朴脂蛋白(a)中有四十个三环域结构域(参考文献：McLean et al.，1987 Nature 330：132-137；Castellino and McCance，1997 Ciba Found Symp.212：46-60；Castellino and Beals，1987 J.Mol.Evol.26：358-369)。三环域结构中的关键结构之一是它与赖氨酸的结合位置。总的来说，三环域结构中与赖氨酸的结合位置与标靶蛋白质的C-末端赖氨酸残基，彼此会进行交互作用。例如，通过与暴露的赖氨酸支链相连接，血浆酶原的三环域结构域与纤维素彼此会进行交互作用。此外，血浆酶原的三环域结构域，可以通过与诸如膜联蛋白II四聚物的C-末端赖氨酸的受体蛋白质相结合，或与它们主要的血浆抑制剂，α2-抗血浆酶相结合(参考文献：Kassam et al.，1998 Biochemistry37：16958-16966；Longstaff and Gaffney，1991 Biochemistry 30：979-986；Christensen et al.，1996 FEBS Lett.387：58-62)的方式和细胞表面相结合。实验结果还证明，通过三环域结构与内链赖氨酸残基的交互作用，三环域结构可以调节分子间的交互作用(参考文献：Ryan and Keegan，1985 Biochim.Biophys.Acta 830：187-194；Menhart et al.，1995 Biochemistry 34：1482-1488；McCanceand Castellino，1995 Biochemistry 34：9581-9586；Takada et al.，1993 Thromb.Res.50：285-294)。

血浆酶原的三环域结构已经被广泛深入的研究。这些三环域结构有48％~50％的相同性，但是它们的功能并不相同。例如，三环域结构与模仿C-末端赖氨酸的结构而形成的N-乙酸基-L-赖氨酸的结合力，依大小次序为三环域1>三环域4>三环域2。三环域5与该赖氨酸相似物的结合力很弱，Kingle3则不能与该赖氨酸相似物相结合(参考文献：Marti et al.，1997)。有趣的是，三环域1，三环域2，三环域4，三环域5结构与模仿内链赖氨酸所形成的赖氨酸相似物的结合力相似(参考文献：Marti et al.，1997 Biochemistry 38：15741-15755)。血浆酶原的三环域结构可能有非常明确的结合伙伴。例如，三环域2结构只与A组的链状球菌表面蛋白质的内链赖氨酸，PAM，相结合(参考文献：Marti et al.，1997Biochemistry 38：15741-15755)。同样地，三环域4结构只与α2-抗血浆酶原的C-末端赖氨酸残基相结合(参考文献：Christensen et al.，1996 FEBS Lett.387：58-62)。

此项发明的发明者发现，癌细胞和正常细胞能将血浆酶原转化成一种新型的，分子量为22kDa的片断，这种片断具有抗肿瘤的活性，此即为p22。p22是在生理环境下所形成的最小的血浆酶原片断。由於p22片断中只包含一个三环域结构域，所以这个发明的重要优点是，p22的结构简单，它的氨基酸序列很短，而且它没有糖基化，这两点对进一步研究与生产p22提供了方便。迄今为止，p22是在生理环境下所产生的最小的血浆酶原片断。由于p22片断只含有一个三环域结构域，因此未来对这个蛋白质的抗增殖活性所作的结构-功能分析，将会比针对含有多个三环域结构域的血浆酶原片断(例如A₆₁)所作的类似研究更容易进行。血浆酶原的三环域结构域被认为是重组的蛋白质，这使得它们的生物活性得以和p22的生物活性进行对比。通过内皮细胞增殖测定，每一个血浆酶原三环域结构域各有其不同的抗增殖活性。三环域5、三环域1和三环域3结构表现出很强的抑制活性，三环域2表现出较弱的抑制活性，而三环域4则不具备抑制活性(参考文献：Cao et al 1996.，J.Biol.Chem.271：29461-29467；Cao et al.，1997 J.Biol.Chem.272：22924-22928)。这些三环域结构对内皮细胞迁移的抑制功能也各不相同。三环域5、三环域4表现出很强的抑制活性，三环域2和三环域3表现出较弱的抑制活性，三环域1则几乎没有抑制的活性(参考文献：Ji et al.，1998Biochem Biophys Res Commun 247：414-419；Ji et al.，1998 FASEB J.12：1731-1738)。有趣的是，抑制活性的强弱与三环域结构的完整性密切相关，但是抑制活性的强弱与三环域结构中赖氨酸的结合位置似乎关系不大(参考文献：Ji et al.，1998 Biochem Biophys Res Commun 247：414-419；Cao et al.，1996J.Biol.Chem.271：29461-29467)。

要在无细胞系统中产生p22，须将在无细胞系统中产生的A₆₁(7μM)与0.1μM的血浆酶以及包含20mM Hepes缓冲剂(pH值为7.4)、140mM氯化钠、和100μM二硫蘇糖醇的缓冲液，置于37℃环境中，一起培育2小时。加入1mM Pefabloc(Roche公司)使反应停止，将混合物放到一个在使用前，已经用含有20mM Hepes(其pH值为7.4)以及140mM氯化钠的平衡缓冲液，先行平衡过的L-赖氨酸-琼脂糖色谱柱上。将从赖氨酸-琼脂糖柱上收集起来的流动组分，再放入一个在使用前，已经用含有20mM Hepes(其pH值为7.4)以及4M氯化钠的平衡缓冲液，先行平衡过的辛基-琼脂糖树脂上。从辛基-琼脂糖色谱柱上收集起来的流动组分可产生毫克量的纯化蛋白质(其中产量的多少取决于实施例1中所叙述的紫外吸光度)。该蛋白质的Mr为22,000，这是使用实施例1中叙述的，在还原条件下进行的十二烷基硫酸钠-聚丙烯胶电泳分析法分析出来的。这个被称之为p22的纯化蛋白质，在20mM Hepes(pH值为7.4)，20mM氯化钠的条件下，进行透析。经透析后的p22蛋白质被分成数份，储存于-70℃的环境中，以供后用。

图12陈列了无细胞系统中p22的产生过程。将A₆₁(泳道1)和血浆酶(0.1μM)以及二硫苏糖醇(100μM)置于37℃中，培育2小时(泳道2)。用L-赖氨酸-琼脂糖色谱柱纯化p22(泳道3)，将其浓缩(泳道4)，用辛基-琼脂糖色谱柱进一步纯化p22(泳道5)。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯胶电泳分析法去分析样品，然后用考马斯氏蓝色染色法去染色分析，便可看到蛋白质染色带。

实施例七：

这个实例阐述的是，通过在细胞体外与A₆₁接触，以产生p22的过程。

要在细胞的辅助下产生p22，需将人类HT1080细胞，放在DMEM(GIBCO-BRL公司)培养基中培养，该培养基的补充液包括：10％经过热处理过的牛胎儿血清，10单位/毫升的青霉素G，10μM的链霉素硫酸盐。将每毫升含有大约1×10⁵细胞数的细胞，加入24-井组织培养盘中的每一个井中，置于37℃的环境内，培育大约24小时，然后会形成细胞单层。用DMEM培养基将该细胞单层清洗3次，然后将0.5~8μM溶在DMEM培养基中的〔谷氨酸〕-血浆酶原加入各井中。经过大约18小时的培育后，将媒质物除去，并用含有β-巯基乙醇还原剂的十二烷基硫酸钠-聚丙烯胶电泳分析法样品缓冲液将其稀释，然后用实施例1中所描述的十二烷基硫酸钠-聚丙烯胶电泳分析法和免疫印迹法去进行分析。

当在免疫印迹法中采用抗人体血浆酶原三环域1-3结构的单克隆抗体作为初级抗体时，我们可以检测到一个分子量约为22,000的蛋白质。此外，如果改变加入细胞内血浆酶原的浓度，p22的剂量也会随之改变。例如，当血浆酶原的浓度为1μM时，我们观察到p22的产量，大约为循环中之血浆酶原的生理浓度。

当用〔赖氨酸〕-血浆酶原代替〔谷氨酸〕-血浆酶原时，我们得到类似的结果。其他诸如BCE细胞，海拉细胞等细胞，亦可转化为p22。然而，在同样的试验条件下，人体脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)没有产生可以检测到的p22。此外，基于p22在还原条件下所进行的十二烷基硫酸钠-聚丙烯胶体电泳分析法中的极动性，它比人体血浆酶原的重组三环域1结构(rK1)稍微大一些，但是比分子量分别为38,000或25,000的重组三环域1-3结构或重组三环域2-3结构小一些〔参考文献：Rejante，M.R.and Llinas，M.(1994)European Journal ofBiochemistry 221：939-49；An，S.S.et al.，(1998)Protein Sci.7：1947-1959〕。因此，我们推断p22是一种仅含有一个三环域结构域的新型血浆酶原片断。

图13陈列了由HT-1080细胞所产生的新型血浆酶原片断(p22)的确认过程。(A)在含有指定浓度〔谷氨酸〕-血浆酶原的DMEM培养基中培育HT-1080细胞。经过一整夜的培育后，用15％胶体浓度，在还原条件下进行的十二烷基硫酸钠-聚丙烯胶体电泳分析法去分析该媒质物，然后在免疫印迹法中采用抗人体血浆酶原三环域1-3结构的单克隆抗体作为初级抗体去进行分析。在无细胞的条件下，培育一整夜的〔谷氨酸〕-血浆酶原(8μM)(泳道1)，及A₆₁标准样品(泳道7)。将HT-1080细胞和以下浓度的〔谷氨酸〕血浆酶原一起培育：0.5μM(泳道2)；1μM(泳道3)；2μM(4)；4μM(泳道5)；8μM(泳道6)。(B)在含有(A)项指定浓度〔赖氨酸〕血浆酶原的DMEM培养基中，培育HT-1080细胞。(C)在含有8μM〔谷氨酸〕血浆酶原的DMEM培养基中，培育HT-1080细胞(泳道5)，BCE细胞(泳道6)，人体脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)(泳道7)，经过一整夜的培育后，用12.5％胶体浓度，在还原条件下进行的十二烷基硫酸钠-聚丙烯胶体电泳分析法去分析该媒质物，然后在免疫印迹法中采用抗人体血浆酶原三环域1-3结构的单克隆抗体作为初级抗体去进行分析。用〔赖氨酸〕血浆酶原去培育海拉细胞(泳道8)。其它的标准样品显示如下：血浆酶原(泳道1)；A₆₁(泳道2)；p22(泳道3)；重组三环域1结构(泳道4)。

实施例八：

这个实例阐述的是p22的生物化学和生物物理特性。

为了确认能分裂产生p22的血浆酶(原)区域，我们用Edman降解法去分析，经由HT-1080细胞作用而产生的p22其N-末端序列。p22的N-末端相当于血浆酶原的赖氨酸⁷⁸。然而，由于p22比血浆酶(原)的三环域1大一些(见图12)，因此我们推断，p22内含有血浆酶(原)的三环域1结构，以及一些能在血浆酶(原)第一个和第二个三环域结构间，建立连接的氨基酸残基。

用前述A₆₁所使用的分析方法，去分析在无细胞系统所产生的p22其N-末端序列。这项分析显示，p22的N-末端氨基酸，和A₆₁一样，也是表IV中所陈列的赖氨⁷⁸。如前所述，人体p22是由人体抗血管增生血浆酶原片断，A₆₁，以及尿激酶型血纤维蛋白溶酶原激激活剂(uPA)在无细胞系统中产生的。

表IV：人体p22的氨基-末端及羧基-末端序列

 

血浆酶原	氨基乙酸176 赖氨酸177 异亮氨酸178 丝氨酸179赖氨酸180 苏氨酸181
		p22的C-末端序列	赖氨酸 异亮氨酸 丝氨酸 赖氨酸
血浆酶原	赖氨酸78 缬氨酸79 酪氨酸80 亮氨酸81 丝氨酸82

 

p22的N-末端序列

赖氨酸 缬氨酸 酪氨酸 亮氨酸 丝氨酸

而且，经由将血浆酶原和HT1080细胞一起培育所产生的p22，和在无细胞系统中所产生的p22相比，用十二烷基硫酸钠-聚丙烯胶体电泳分析法是不能将它们区别开的(图12)。用前述A₆₁所使用的方法去分析C-末端序列，结果显示采用血浆酶原与细胞接触法或无细胞系统法所产生的p22，其C-末端均是赖氨酸¹⁸⁰。因此，p22乃是一个从赖氨酸⁷⁸延伸至赖氨酸¹⁸⁰的新型血浆酶原片断，它包含了6个N-末端残基，血浆酶原三环域1结构，三环域1、三环域2连接区的3个残基，以及三环域2结构的15个残基。

图14陈列的是p22的结构图形。图中用英文字母缩写去标示各氨基酸。阴影区域代表p22的结构。

不同氨基酸的3个字母和1个字母的缩写如下：丙胺酸-ala-A；精氨酸-arg-R，无冬酰胺酸-asn-N；天门冬氨酸-asp-D，半胱氨酸-cys-C；谷氨酸盐-gln-Q；谷氨酸-glu-E；氨基乙酸-gly-G；组氨酸-his-H；异亮氨酸-ile-I；亮氨酸-leu-L；赖氨酸-lys-K；蛋氨酸-met-M；苯基丙氨酸-phe-F；脯氨酸-pro-P；丝氨酸-ser-S；苏氨酸-thr-T；色氨酸-trp-W；酪氨酸-tyr-Y；缬氨酸-val-V。

用实施例四中所述，A₆₁所采用的方法去分析p22及重组三环域1结构(三环域1结构乃是血浆酶原的一个单结构片断，Carnegie Melon大学的Dr.M.Llinas赠送)，结果显示p22不会被糖基化。用p22的氨基酸列序推算出来的p22分子重量为Mr 11,825。相较之下，用实施例四中所述的质谱法测量出来的p22分子重量则为Mr 11,821。由於用p22的氨基酸列序推算出来的p22分子重量，与用质谱法测量出来的p22分子重量非常接近，因而排除了p22被糖基化，以及转译后蛋白质被修饰的可能性。对照之下，用氨基酸列序推算出来的重组三环域1结构的分子重量为Mr 9,926，用质谱法测量出来的重组三环域1结构的分子重量为Mr9,815。推算数据与测量数据的差异证明，重组三环域1结构与p22结构明显不同。

采用实施例一中所描述的圆二色散仪(CD)光谱去检测p22(以及重组三环域1结构以进行对比)的二级结构。p22的圆二色散仪光谱图中，我们观察到在227.5nm处有一道正波段，在202.7nm处有一道很强的负波段，这显示p22中的蛋白质没有α-螺旋结构。在200nm附近的负椭圆率，与p22二级结构中存在的聚脯氨酸-螺旋结构(3₁-螺旋结构)是一致的。通过变数挑选法(参考文献：Johnson，W.C.(1999)Proteins 35：307-312)估计p22的二级结构物，结果显示p22大约包含17％的3₁-螺旋结构(见表IV)。相较之下，重组三环域1结构的圆二色散仪光谱，在227.5nm处出现一道正波段，在197.4nm处出现一道很强的负波段。

表V：p22次级结构和K1结构之比较

 

结构	p22	K1
			α-螺旋结构	0	3
3<sub>10</sub>螺旋结构	3	3
			β-折叠	21	25
β-转角	15	7
			3<sub>1</sub>螺旋结构	17	19
无序	43	24

图15陈列的是p22及K1的圆二色散仪光谱。波长扫描是在20℃，10mM三(釋甲基)氨基甲烷缓冲液(pH值为7.5)，150mM氯化钠的条件下进行的。p22及K1的浓度分别为41μM和25μM。穿过各点的线代表最吻合由二级结构各计算组合的平均值所推算出来的数据。

我们采用内部荧光光谱去研究p22三环域结构的功能。用实施例一中所描述的方法去取得p22及重组三环域1结构的内部荧光光谱。p22内部荧光的激发光谱最大值与放射光谱最大值，分别为283nm和332nm。相较之下，重组三环域1结构内部荧光的激发光谱最大值与放射光谱最大值则分别为283nm和229nm，将赖氨酸的类似物反式(trans)-4-氨基甲基环已胺羧酸(AMCHA)与p22相结合后，p22的内部荧光放射光谱大为增强(22％)。然而，将重组三环域1结构与AMCHA相结合后，重组三环域1结构的内部荧光放射光谱虽然增强了20％，但是重组三环域1结构的发射光谱最大值却从339nm转移到331nm。这些实验结果指出，p22的三环域结构域与重组三环域1结构二者截然不同。虽然我们不希望被理论所束缚，数据资料指出，p22的N-末端或C-末端的氨基酸，与p22的三环域结构域彼此会进行交互作用，且前者对后者有调节作用。

图16陈列的是p22及重组三环域1结构的内部荧光光谱。其中包括无配合基的激发光谱(Ex)与放射光谱(Em)(以实线表示)，以及被1mM AMCHA浸透过的A₆₁(以虚线表示)，光谱需在20mM Hepes(pH值为7.4)，140mM氯化钠中，20℃的条件下进行测量。p22与三环域1结构的浓度分别为25mM和10mM。

实施例九：

这个实例阐述的是，p22的生物活性。

按照实施例一中所示方法培育BCE细胞，以此检查p22对内皮细胞生长的抑制效果，只要将用无细胞法产生的A₆₁代之以p22便可。我们观察到，p22的剂量会左右BCE细胞生长的抑制幅度。要达到50％的抑制效果(IC₅₀)，所需的p22浓度为14.3±2.3nM(±表示标准误差，n＝3)，要达到最大的抑制效果，所需的p22浓度为50nM。然而和IC_50＝35nM的A₆₁以及IC_50＝39.5±9.7nM(±表示标准误差，n＝3)的重组三环域1结构比较起来，p22的IC₅₀较低些。

图17陈列了p22与重组三环域1结构对牛毛细血管内皮细胞增殖的抑制作用。在含有1ng/ml碱性纤维质母细胞生长因子(bFGF)的条件下，将不同浓度的p22或重组三环域1结构与BCE细胞一起培育。经过72小时的培育后，BCE细胞受到胰蛋白酶作用，悬浮于Isoton II溶液中，然后用Coulter计数器计算细胞数。实验结果显示p22对牛细血管内皮细胞的增殖具有很强的抑制作用。

为了确定p22在细胞体内是否具有抗血管增生阻断素的活性，我们检测了p22对小鸡绒膜尿囊膜(简称CAMS)上新生血管生长的影响。做该项实验时，先将受精3天的白色来亨鸡蛋(Lillydale公司，Calgary，Alberta Canada)打破，将含有蛋黄的小鸡晶胚放入100×20mm的培养皿中。将其置于37℃环境中，5％二氧化碳的条件下，培育3天后，将含有磷酸盐-缓冲液盐水(简称PBS；137mM NaCl，8mM Na₂HPO₄，1.4mM KH₂PO₄，2.7mM KCl，pH 7.4)的甲烷基木纤维质或5μg的p22(8.3μM浓度中的70μl)移植到小鸡绒膜尿囊膜上。经过48小时的培育后，在立体显微镜下分析晶胚和小鸡绒膜尿囊膜在无血管地带的形成机理，将影像放大40倍后拍照。比较当采用磷酸盐-缓冲液盐水作为控制组时，5μg的p22在相同环境下对血管生长的抑制效果。

图18陈列了p22对小鸡绒膜尿囊膜上新生血管的抑制作用。将含有磷酸盐-缓冲液盐水或是含有5μg的p22的甲烷基木纤维质圆盘，移植到6天大的小鸡晶胚的小鸡绒膜尿囊膜上。经过48小时的培育后，在立体显微镜下分析无血管地带的形成机理。所得照片代表10项实验的结果。A、C格中的虚线圆指出了甲烷基木纤维质圆盘的位置。(A)经含有p22的甲烷基木纤维质圆盘处理过的小鸡绒膜尿囊膜。用箭头将无血管区标示出来。(B)在A格中标示”R”的插入放大图，陈列的是无血管区附近的复原血管(以箭头标示)。(C)用含有磷酸盐-缓冲液盐水的甲烷基木纤维质圆盘作为小鸡绒膜尿囊膜的控制组。这些实验结果进一步证明了p22具有抗血管增生的活性。

我们用Lewis肺癌肿瘤测定(参考文献：O’Reilly et al的US Patent5.776，704)去研究p22在体内的抗肿瘤活性。培育Lewis肺癌细胞，当癌细胞达到快速增长期时将之收集起来，并且再度悬浮于磷酸盐-缓冲液盐水。将大约10⁶个细胞注射到6~8星期大的C57BL/6形雄鼠的背中部皮下组织中。当老鼠体内的肿瘤长到约为1500mm³大小时(约在注射14天之后)，将雄鼠随机分为两组。将第一组用外科手术去除肿瘤，将第二组施以虚拟的外科手术过程使其肿瘤虽经处理但完好无损。将肿瘤去除组的雄鼠随机分为试验组与控制组。对于试验线的老鼠，每日在其腹腔膜内注射含有p22的磷酸盐-缓冲液盐水(剂量为2.5mg/kd/day，也就是说，使用500μl浓度为8.3μM的p22)，对于控制组的老鼠，则仅注射磷酸盐-缓冲液盐水。14天后将所有受试老鼠杀死，称其肺重量，计算肺转移性焦点的数值。

仅注射磷酸盐-缓冲液盐水的老鼠，在肿瘤切除后，其肺重量为38±4(±标准误差，n＝18)转移性焦点值，而注射含有p22磷酸盐-缓冲液盐水的老鼠，其肺重量则为3±2(±标准误差，n＝18)转移性焦点值。原始肿瘤切除后仅被注射磷酸盐-缓冲液盐水的老鼠，其肺重量会随着时间的增长而增加，在原始肿瘤切除14天后，其肺重量达到646.5±123mg((±标准误差，n＝18)。和仅注射磷酸盐-缓冲液盐水的老鼠肺重量不同的是，每日被注射p22的老鼠，其平均p22到191.8±31mg(±标准误差，n＝18)。相较之下，正常老鼠或原始肿瘤长了14天的老鼠，其肺重量分别为191±25mg(±标准误差，n＝5)及199±20mg(±为标准误差，n＝10)。这些实验结果证明了p22是一种有效的抗转移因子。

图18陈列了老鼠肺部转移性肿瘤生长的抑制过程。在原始肿瘤切除之后，立即将磷酸盐-缓冲液盐水或含有p22的磷酸盐-缓冲液盐水(2.5mg/kg/day)注射到老鼠的腹膜中。实验表明，p22能抑制肺转移性焦点值的生长(A)，并且在原始肿瘤切除之后(C)，阻止肺重量的增加(B)。在老鼠体内原始肿瘤被切除14天之后，用视觉比较注射了磷酸盐-缓冲液盐水的老鼠与注射了含有p22磷酸盐-缓冲液盐水的老鼠的肺部。图18也陈列了正常老鼠与长了主要肿瘤老鼠的肺重。我们不希望此发明受以下理论所局限：我们认为，p22的抗转移活性乃是基于p22的抗内皮细胞增殖的活性，这证明p22在体内具有抗血管增生的活性。

实施例十：

这个实例阐述的是，内皮细胞受体四聚物(简称膜联蛋白II四聚物)所拌演的血浆酶原细胞外受体的角色，以及它在血浆酶原片断的形成过程中所起的作用。

对于与Ca²⁺-结合的蛋白质而言，内皮细胞受体四聚物是血浆酶原的主要细胞外受体。该四聚物能调节血浆酶原转化为血浆酶的过程，以及血浆酶的自体蛋白质水解过程(参考文献：Kassam et al.，Biochimitry 37，16958-16966，1998a；Kassam et al.，J.Biol.Chem.273：4790-4799，1998b；Fitzpatrick et al.，Biochemistry 39：1021-1028，2000；Kang et al.，Trends Cardiovasc.Med.9：92-102，1999)。这些研究表明，内皮细胞受体四聚物能与组织血浆酶原活化剂，血浆酶原，以及血浆酶紧密结合。我们并且发现，可以抗血管增生的血浆酶原片断A₆₁也能与该四聚物紧密结合(见图20)。在该项研究中，须将塑料盘的每个井涂上磷脂，和内皮细胞受体四聚物一起培育，然而充分洗涤。将各种不同浓度的¹²⁵I-A₆₁，放在涂有内皮细胞受体回聚物的井中进行培育，其培育条件包括：井中不含有(黑白实心圆点)及含有1mg/ml牛血清蛋白(黑白实心正方块)，或者含有10nM的氨基山羊酸(空心圆点)。

由於血浆酶原或血浆酶是抗血管增生血管酶原片断的前体，因此A₆₁、p22，以及其他任何会影响内皮细胞受体四聚物或其子组(膜联蛋白II或p11)活性的因子，均会影响抗血管增生血浆酶原片断的产生与毁坏。例如，由於海拉细胞被一个含有反义链的表达载体，转染到内皮细胞受体四聚物的p11子组中，因而造成细胞外内皮细胞受体四聚物的减少，如此一来，p22的产量就减少了(见图21)。在上述研究中，海拉细胞是被一个含有反义链的p11的表达载体转染的。用血浆酶原培育海拉细胞，培育特定时间后，用十二烷基硫酸钠-聚丙烯胶体电泳分析法去分析血浆酶原片断。有趣的是，当海拉细胞被一个含有有义链的p11的表达载体，稳定的转染后，并造成p11子组的细胞外浓度增加时，p22的产量会增加(见图22)。因此，我们认为，内皮细胞受体四聚物(及/或)其内皮细胞受体或p11子组，通过调节它们在细胞表面的形成过程，在抗血管增生血浆酶原片断的效果上，拌演了关鉴性的角色。

我们所得到的体外数据，同样支持以下结论：膜联蛋白四聚物参与了A₆₁及p22的生产过程。如图22所陈列，只有在加入膜联蛋白四聚物之后，和A₆₁一起培育的血浆酶，才会产生p22。这说明了，在A₆₁到p22的血浆酶裂解过程中，膜联蛋白四聚物是必要因素。

由於A₆₁与膜联蛋白四聚物之间会进行交互作用(陈列在图22中)，因此我们认为，膜联蛋白四聚物可以调节内皮细胞上抗血管增生血浆酶原片断的细胞毒素作用，其方式是拌演它们的细胞外受体的角色。

从以上的阐述我们可以看出，这项发明具有很多优点，它并且获得了一些前瞻性的结果。

由於上述的方法及组合可以在许多变化后，仍不脱离这项发明的范畴，因此包含在上列描述中的所有事项，仅应视为这项发明的说明，而非这项发明的范畴介限。

上列详细说明中所引用的参考资料，仅供参考而已。此处针对所有参考资料所作的讨论，只不过总结这些参考资料作者的看法，并非意指其中任何参考资料构成了前述的技术。本发明的申请者对所有引用参考资料的准确性及适切性，保留质疑的权利。

序列表

<110>大卫M.崴斯曼(Waisman，David M)

<120>抗血管增生的多肽

<130>7368-000002

<140>PCT/US01/44515

<141>2001-11-01

<150>US 60/253725

<151>2000-11-28

<160>8

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>391

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>1

<210>2

<211>394

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>2

<210>3

<211>103

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>3

<210>4

<211>810

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>4

<210>5

<211>309

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>5

<210>6

<211>1173

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>6

210>7

211>1182

212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>7

<210>8

<211>714

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>8

Claims (35)

1、一种被分离出来的A₆₁、其变异同族体，其特征在于，所述多肽分别是SEQID NO：1、SEQ ID NO：2的序列。

2、第1项权利要求中提及的被分离出来的A₆₁、或其变异同族体，至少包含一个自由硫氢基。

3、被分离出来的多肽，其序列为SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2。

4、第3项权利要求中提及的被分离出来的多肽，其多肽中至少包含一个自由硫氢基。

5、一种包含权利要求1所述的A₆₁或其变异同族体和一种细胞毒素因子的结合物。

6、在第5项权利要求中提及的结合物中，A₆₁或其变异同族体是通过交叉连结物质和细胞毒素相结合的。

7、在第6项权利要求中提及的结合物中，细胞毒素因子为篦麻毒素，脱氧核糖核酸素酶，白喉毒素，假单胞菌外毒素或核糖核酸酶。

8、第7项权利要求中提及的结合物，是一种溶合蛋白质。

9、一个核酸，编码SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的氨基酸序列的核苷酸序列。

10、一个含有第9项权利要求中所提核苷酸的载体。

11、一个含有第10项权利要求中所提载体的原核细胞或真核细胞。

12、第10项权利要求中提及的细胞是哺乳类动物的细胞。

13、一个核酸或其互补核酸，是SEQ ID NO：6、或SEQ ID NO：7的序列。

14、制备权利要求1所述的A₆₁、和/或其变异同族体的方法，这些方法包括：将血浆酶原与哺乳类动物细胞相接触；培育细胞，用以制造一种含有A₆₁和/或其变异同族体的混合物；从混合物中分离出A₆₁、和/或其变异同族体。

15、第14项权利要求中提及的方法，其哺乳类动物细胞是人体细胞。

16、第15项权利要求中提及的方法，其人体细胞是HT1080细胞。

17、第15项权利要求中提及的方法，其人体细胞是海拉细胞。

18、第14项权利要求中提及的方法，其哺乳类动物细胞是牛毛细血管的内皮细胞。

19、第14项权利要求中提及的方法，其血浆酶原中含有谷氨酸-血浆酶原。

20、第14项权利要求中提及的方法，其血浆酶原中含有赖氨酸-血浆酶原。

21、第14项权利要求中提及的方法，其分离方法包括用亲合色谱法进行分离。

22、制备利要求1所述的A₆₁、或其变异同族体的方法，这些方法包括：将血浆酶原与血浆酶原活化剂相结合以形成一种混合物，在碱性的溶液中培育混合物，如此便可制成A₆₁；从混合物中分离出A₆₁。

23、第22项权利要求中提及的方法，其血浆酶原活化剂是u-血浆酶原活化剂。

24、第22项权利要求中提及的方法，其碱性溶液的pH值是9。

25、第22项权利要求中提及的方法，其培育时间至少需要2小时。

26、第22项权利要求中提及的方法，其分离方法包括用亲合色谱法所进行的分离。

27、权利要求1所述的A₆₁、或其变异同族体的用途，其特征在于，用于制备在哺乳类动物中治疗抗-血管增生的药物，所述药物是通过施给该哺乳类动物足以抑制血管增生份量的权利要求1所述的A₆₁、或其变异同族体或其混合物。

28、第27项权利要求中提及的用途，其哺乳类动物是指人类。

29、第27项权利要求中提及的用途，其足以抑制血管增生的A₆₁的份量，是指人体使用的份量。

30、第27项权利要求中提及的用途，其A₆₁、或其变异同族体分别是SEQ IDNO：1，SEQ ID NO：2的序列。

31、一种权利要求1所述的A₆₁、或其变异同族体的用途，其特征在于，用于制备在哺乳类动物中治疗血管内皮包括给予细胞足以抗-增殖的权利要求1所述所述的A₆₁、其变异同族体或其混合物的份量。

32、第31项权利要求中提及的用途，其血管内皮细胞是一种哺乳类动物的血管内皮细胞。

33、第32项权利要求中提及的用途，其哺乳类动物的血管内皮细胞是指人类的血管内皮细胞。

34、第31项权利要求中提及的用途，其A₆₁、其变异同族体分别是SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2的序列。

35、第34项权利要求中提及的用途，其A₆₁的序列为SEQ ID NO：1，或SEQ IDNO：2。

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