ES2274520T3

ES2274520T3 - Metodo para preparar acidos nucleicos para el analisis y estuches utiles para ello.

Info

Publication number: ES2274520T3
Application number: ES95934415T
Authority: ES
Inventors: Lisa S. Noeth; Mary Dasovich-Moody; Melissa Reardon Winget
Original assignee: Roche Diagnostics Operations Inc
Current assignee: Roche Diagnostics Operations Inc
Priority date: 1994-09-21
Filing date: 1995-09-13
Publication date: 2007-05-16
Anticipated expiration: 2015-09-13
Also published as: EP0784695A1; WO1996009404A1; DE69535284D1; JPH10506279A; US5538870A; EP0784695A4; JP3887014B2; EP0784695B1; CA2199835A1; CA2199835C; DE69535284T2

Abstract

SE DESCRIBEN METODOS UTILES EN PURIFICAR ACIDOS NUCLEICOS DE MUESTRAS DE CELULA COMPLETAS. ESTO SE LLEVA A CABO MEDIANTE LA ADICION DE UNO O AMBOS DE UN GRUPO DE NO FENILO QUE CONTENGA DETERGENTE NO IONICO O UN ACIDO POLICARBOXILICO RETICULADO. TAMBIEN SE DESCRIBEN KITS QUE PUEDEN SER UTILIZADOS EN LOS METODOS.

Description

Método para preparar ácidos nucleicos para el análisis y estuches útiles para ello.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la purificación de las moléculas de ácido nucleico. Más en particular, se refiere a la preparación de moléculas de ácido nucleico para su uso posterior en metodologías analíticas, especialmente en pruebas de amplificación.

Fundamento y modelo anterior

La determinación de moléculas de ácido nucleico especiales o bien la expresión o manifestación de estas moléculas es una faceta extremadamente importante de la química analítica y clínica. Se conocen un gran número de diferentes pruebas de ácido nucleico. Todas estas pruebas se puede decir que tienen un objetivo común, es decir, la identificación de moléculas de ácido nucleico especiales en las muestras. Conseguir este objetivo permite identificar infecciones, como infecciones bacterianas o víricas, tipificar tejidos, identificar individuos (lo que se llama "dactiloscopia del ADN") y así sucesivamente.

Uno de los problemas en las pruebas o análisis del ácido nucleico es que los materiales de referencia, es decir, una molécula de ácido nucleico en particular, existe como una única molécula o bien existen muy pocas copias. Por consiguiente, ha habido siempre un gran interés en purificar moléculas de ácido nucleico de manera que se maximizan las posibilidades de hallar realmente la molécula deseada.

Se han desarrollado una serie de técnicas clásicas para purificar las moléculas de ácido nucleico. Una de las más básicas es el método descrito por Maniatis y cols., en Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New Cork, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, pp.280-1). Este método muestra la lisis de las células diana usando proteasas, seguida de una extracción de fenol/cloroformo. El método tarda mucho tiempo en completar e implica el uso de sustancias carcinógenas, peligrosas. Algunos de los problemas asociados a este método se comentan en Millar y cols., WO89/07603 (24 de agosto, 1989). Además, las metodologías a base de fenol/cloroformo requieren todas ellas el uso de un agente que precipite el alcohol, como el etanol o el isopropanol para separar las moléculas de ácido nucleico de su disolvente. El riesgo de dañar el material deseado, así como de perderlo es muy grande.

La necesidad de una mejora continuada en esta tecnología tan básica se puede ver a través del gran número de patentes y publicaciones no patentadas que hablan sobre ella. Estas referencias van dirigidas a mejoras en cuanto a la obtención de las moléculas de ácido nucleico deseadas. Demuestran la gran variedad de métodos a los que se puede acceder.

La patente americana nr. 5.231.015 de Cummins, por ejemplo, muestra el uso de un ión metálico en soluciones de lisis. El ión es un cofactor de las polimerasas de moléculas de ácido nucleico que aparecen de forma natural. La teoría es que los iones metálicos mejoran la capacidad inherente de las polimerasas nativas para copiar la molécula de ácido nucleico de interés. Dicha técnica es especialmente útil en metodologías de amplificación, patente americana nr. 5.130.42 de Van Ness y cols., alegando mejoras en el uso de derivados de fenilo, como el alcohol de bencilo, en la extracción del ADN. La patente americana nr. 5.128.247 de Koller se refiere a lo mismo y muestra el uso de agentes caotrópicos para lisar células, seguido de un tratamiento con proteínas de polisacáridos sulfatadas, como la
heparina.

La patente americana nr. 5.010.183 de Macfarlane, aconseja sobre el uso de detergentes catiónicos para purificar ácidos nucleicos, mientras que la patente americana nr. 4.908.318 muestra la lisis basada en detergentes seguida de la solubilización de moléculas de ácido nucleico y posterior extracción de las mismas.

La patente americana nr. 5.284.940 de Lin y cols. sugiere el uso de transferrina, globina o albúmina sérica para prevenir la acción de los inhibidores de la polimerasa durante una reacción de amplificación.

La mayoría de las patentes comentadas tratan de la preparación de muestras para su uso posterior en ensayos de amplificación, especialmente la muy bien conocida reacción en cadena de la polimerasa, o técnica "RCP". Esta metodología, descrita en Mullis y cols., patente americana nr. 4.683.202, muestra como se pueden obtener múltiples copias de una molécula de ácido nucleico deseada mediante el uso de uno o dos cebadores de la molécula de ácido nucleico, junto con una polimerasa, como la Thermus aquaticus, o bien polimerasa "Taq". Sin embargo, el procedimiento por el cual se obtienen moléculas de ácido nucleico amplificadas es básicamente el de Maniatis y cols. El deseo de mejorar esta metodología se puede ver, por ejemplo, en Casareale y cols., "Improved Blood Simple Processing for PCR" en PCR Methods and Applications (Cold Spring Harbor Laboratorios, New York, 1992, pp. 149-153). El informe habla sobre las limitaciones inherentes en la RCP, que incluyen un volumen de muestra pequeño, la inhibición de la aplicación, la estabilidad de la muestra, y así sucesivamente. Casareale y colaboradores informan sobre mejoras en el aislamiento de ácidos nucleicos mediante el uso de calor y detergentes. El detergente usado era Nonidet P-40, cuyo nombre químico es etil fenol poli (etilenglicoléter)_{n} donde "n" es habitualmente un número entero aproximadamente 11. El éxito se atribuye a una reducción en la inhibición de la amplificación del ADN. Por ejemplo, otros han realizado afirmaciones similares, por ejemplo, en Ehrlich y cols., ed. PCR Technology: Principles & Applications for DNA Amplification pp.19-21, el uso de Nonidet P-40, en combinación con Tween 20 se dice que previene la inhibición de la polimerasa Taq en muestras lisadas donde el dodexilsulfato sódico (SDS) se utilizaba como agente de lisado. El efecto del SDS consiste en inhibir cualquier polimerasa utilizada en el proceso de amplificación. La combinación de detergentes se dice que alivia el problema, cuando el ADN y el Mg^{2+} (un cofactor de la polimerasa Taq) están presentes a 37ºC.

El uso de detergentes para neutralizar el SDS no es sorprendente en un sentido teórico. Haselbeck y cols., "Studies on the effect of the Incubation Conditions, Various Detergents and Protein Concentration on the Enzymatic Activity of N-glycosidase F (Glycopeptidase F) and Endoglycosidase F", en Topics in Biochemistry 8:1-4(1988), comenta el efecto inhibidor general del SDS en las enzimas. Luego Haselbeck y cols. demuestran que tanto el NP-40 como el Triton X-100 (octilfenolpolietilenglicoléter)_{n} donde "n" es 10, inhiben el efecto del SDS en las enzimas mencionadas. Ciertamente no se hacen generalizaciones, tal como se comentará, e infrageneralizaciones de hecho no se pueden realizar en cuanto al efecto en los detergentes para eliminar el impacto del SDS en los procesos de amplifi-
cación.

La parte central de principales puntos discutidos se centra en uno de los problemas tratados en la invención. Brevemente, los agentes utilizados para lisar las células y con ello los ácidos nucleicos libres para la amplificación, incluyen frecuentemente el dodecilsulfato sódico, o bien "SDS". Sin embargo, el SDS tiene el efecto indeseable de inhibir la polimerasa necesaria para llevar a cabo las reacciones de amplificación.

Otro problema es la necesidad de obtener muestras de ácido nucleico muy puras en un periodo de tiempo lo más corto posible. Cuando las células son lisadas, se liberan otros materiales distintos de las moléculas de ácido nucleico y estos se pueden considerar contaminantes. En el caso de muestras de sangre entera, existe un problema especialmente serio causado por la cantidad enorme de proteína liberada, respecto a la cantidad de ácido nucleico. En estas proteínas se incluyen los inhibidores de la polimerasa. Los compuestos que contienen el anillo de porfirina, especialmente heme y sus derivados, son muy bien conocidos, como inhibidores de la polimerasa. Claramente, es muy importante eliminar estos materiales de las muestras.

El método de precipitación del alcohol, tan comentado, es una forma de eliminar las moléculas de ácido nucleico de las impurezas. Los solicitantes no repetirán los inconvenientes de este método de nuevo. Sería deseable que uno pudiera obtener rápida- y eficazmente muestras puras de moléculas de ácido nucleico sin la necesidad de una etapa de precipitación del alcohol. Incluso todavía se desea más, que es disponer de un método donde las moléculas de ácido nucleico así purificadas se puedan usar inmediatamente en un proceso de amplificación.

En la patente americana nr. 5.234.824 de Mullis se revela un método de purificación rápida del ADN de una muestra biológica sin la necesidad de una etapa de precipitación del alcohol, donde se utilizan un tampón que contiene SDS y un filtro para retener componentes no necesarios.

En la patente americana nr. 5.294.981 de Krupey se describen una familia de moléculas de ácido polihidroxipolicarboxílico reticuladas, insolubles en agua. Las moléculas son:

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donde un grupo carbonilo de al menos un grupo maleoilo del mismo forma una unión covalente en cada ramificación con un grupo

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-HN[(H)_{p}(CH_{2})(OH)_{m}]NH

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para demostrar la presencia en el mismo de al menos un grupo reticulante de fórmula:

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donde R es un hidrógeno o grupo alquileno inferior o grupo alcoxi inferior de 1-4 átomos de carbono, o bien el grupo fenilo, z es un entero del 1-4, p es 0 o un entero de hasta z-1, m es 1 o un entero de hasta z, en el que el cociente de las reticulaciones respecto a las ramas de ácido polialquileno carbónico está entre 1 y aproximadamente 200 hasta 2, se describen como ser útiles para recuperar proteínas de medios acuosos. Las moléculas secuestran cualquier proteína en la muestra. Un producto basado en esta patente, conocido como PRO-CIPITATE, se encuentra disponible en el comercio.

Krupey describe el uso de sus moléculas nuevas en la separación del ADN de las proteínas en general; sin embargo, los métodos únicamente se describen en general y siempre se refieren al uso de tiocianato de guanidio acuoso, un caotropo y el agente de lisis. A estas metodologías se hace referencia en el contexto de los métodos donde también se usa la precipitación del ácido nucleico a través del uso de, por ejemplo, alcoholes.

Por consiguiente, existe otro problema en la forma en la que el deseo de separar proteínas está unido a la precipitación del ADN, lo que no se desea.

Actualmente se ha descubierto en primer lugar que las generalizaciones respecto a la inactivación del SDS basada en el detergente no se pueden efectuar en el contexto de preparar muestras para la amplificación del ácido nucleico. Esto es especialmente cierto para detergentes no iónicos donde se ha descubierto que los detergentes que contienen el grupo fenilo, como la familia "Triton" de detergentes, no funcionan para inhibir el dodecilsulfato sódico. Así pues, el problema que tiene que solucionar la invención consistirá en aportar un método alternativo para eliminar los efectos del SDS posteriores a la lisis en base al reconocimiento sorprendente de que detergentes no iónicos que no contengan un grupo fenilo se pueden utilizar solos, para inhibir el dodecilsulfato sódico, logrando con ello una purificación mejor de las muestras de ácido nucleico de las células enteras.

Además, también sorprendente, es que los ácidos polihidroxi policarboxílicos reticulados de fórmula

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En los que un grupo carbonilo de al menos un resto maleoilo del mismo en cada ramificación se une formando un enlace covalente a un grupo

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-NH[(H)_{p}(CH_{2})(OH)_{m}]NH

para verificar la presencia de al menos un grupo reticulante de fórmula:

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donde R es un hidrógeno o un grupo alquileno inferior o alcoxi inferior de 1-4 átomos de carbono, o bien un grupo fenilo, z es un entero de 1-4, p es 0 o bien un entero de hasta z-1, m es 1 o bien un entero de hasta z, donde el cociente de las reticulaciones respecto a las derivaciones de ácido poli(alquilencarbónico) es de 1 y aproximadamente 200 de hasta 2 se pueden usar para purificar ácidos nucleicos, donde una etapa de precipitación del alcohol se puede eliminar. El uso de estos compuestos además inhibe el SDS, y por consiguiente se podrá usar solo o junto con los detergentes comentados.

Estos y otros aspectos de la invención, se verán en la descripción que sigue a continuación.

Breve descripción de las figuras

Figura 1 muestra resultados obtenidos tras la reacción en cadena de la polimerasa en un segmento de 1,5 kilobases de \beta-globina del ADN de los glóbulos blancos humanos.

Figura 1A presenta estudios sobre el efecto del pH constante, donde las concentraciones salinas son variadas (a un pH de 6)

Figura 1B muestra los resultados obtenidos cuando el pH se mantenía constante, pero se variaba la concentración salina (a un pH de 7).

Figura 1C muestra otros resultados donde la concentración salina se mantenía constante y el pH variaba

En las figuras 1A y 1B, las concentraciones salinas usadas eran de 100 mM y 150 mM, mientras que en la figura 1C, era de 50 mM. El pH usado en la figura 1A era de 6, en la figura 1B 7 y en la figura 1C, tanto 6 como 7.

La figura 2 muestra los resultados obtenidos cuando el detergente no iónico Triton X-100 que contiene un grupo fenilo se utilizaba para inhibir el dodecilsulfato sódico.

La figura 3 muestra los resultados obtenidos cuando el grupo no fenilo que contiene el detergente no ionico Tween 20 se usaba para inhibir el dodecilsulfato sódico.

Descripción detallada de las configuraciones preferidas Ejemplo 1

Este ejemplo establece el protocolo para llevar a cabo la reacción en cadena de la polimerasa ("RCP")a la que se hace referencia en los ejemplos 2 y 3 siguientes.

Después de la preparación de muestra, se amplificaba un segmento de 1,5 kilobases del gen \beta-globina. La muestra se combinaba con un reactivo de la RCP, del modo siguiente:

: Agua destilada: 70 partes

: Tampón de reacción: 10 partes

: MgCl_{2} 25 mM: 6 partes

: Muestra de ADN: 10 partes

: dNTPs: 2 partes

: Cebador A: 1 parte

: Cebador B: 1 parte

La secuencia del cebador A era:

: GTACGGCTGT CATCACTTAG ACCTCA

: (SEQ ID NO: 1)

La secuencia del cebador B era:

: AGCACACAGA CGAGCACGTT

: (SEQ ID NO: 2)

Una muestra de 0,5 \mul de polimerasa de ADN de Thermus aquaticus (2,5 U) se añadía a estos reactivos, tal como se explica en el siguiente protocolo de ciclo:

El primer ciclo era el siguiente:

: Desnaturalización (97ºC, 7 minutos)

: Recocido (59ºC, 1 minuto)

Pausa, luego añadir 0,5 \mul (2,5 U) de polimerasa Taq ADN a cada muestra manteniendo una temperatura de 59ºC.

: Polimerizar (72ºC, 2 minutos)

Esto se llevaba a cabo una vez, seguido de 30 ciclos tal como sigue:

: Desnaturalización (94ºC, 1 minuto)

: Recocido (60ºC, 2,5 minutos)

: Polimerizado (72ºC, 2 minutos)

Finalmente, se llevaba a cabo 1 ciclo para ampliar (72ºC, 7 minutos). El ADN se fraccionaba en un 2,0% de geles de agarosa LE, con marcadores de peso molecular dispuestos en bandas que eran una parte del gel, así como con los controles. Los geles se disponen como figuras, explicadas dentro de los ejemplos que siguen.

Ejemplo 2

Para este y posteriores experimentos, se usaban los reactivos siguientes:

(i): tampón de lisis de glóbulos rojos: NH_{4}Cl 140 mM, Tris 17 mM (pH 7,65);

(ii): tampón de lisis de glóbulos blancos: una de seis alternativas distintas: en cada una de las seis alternativas, se combinaban Tris 10 mM y un 0,1% de SDS. Se utilizaba una de estas concentraciones salinas diferentes (NaCl 50, 100 o 150 mM). El pH era de 6 ó 7. Esto da lugar a seis tampones de lisis, por ejemplo:

: NaCl 50 mM, Tris 10 mM, 0,1% SDS (pH 6 ó pH 7);

: NaCl 100 mM, Tris 10 mM, 0,1% SDS (pH 6 ó pH 7);

: NaCl 150 mM, Tris 10 mM, 0,1% SDS (pH 6 ó pH 7).

En cada recorrido de muestra, se añadían 500 \mul de sangre entera a 1 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos. La mezcla luego se incubaba durante 5 minutos, después de lo cual se centrifugaba a 2500 rpm durante 5 minutos. Los tiempos de incubación pueden variar según se desee. Esto daba lugar a un gránulo y a un sobrenadante. El sobrenadante se descartaba, y el gránulo se volvía a suspender en 1 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos. La nueva solución se agitaba durante 3 minutos a 2500 rpm. Los gránulos resultantes se suspendían luego en uno de los seis tampones de lisis de glóbulos blancos. La nueva suspensión se calentaba a 5ºC durante 5 minutos. Tras el calentamiento, la muestra se usaba en una de las alternativas que siguen.

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Ejemplo 3 comparativo

Las suspensiones preparadas en el ejemplo 2 se combinaban con 700 \mul de PRO-CIPITATE. La mezcla se incubaba durante 5 minutos y luego se agitaba a toda velocidad en una centrífuga durante 5 minutos.

Las muestras se utilizaban en reacciones en cadena de la polimerasa, tal como se muestra en el ejemplo 1. Tras la amplificación, los productos de amplificación se hacían circular por un 2,0% de geles de agarosa LE.

Los resultados se presentan en las figuras 1A, 1B y 1C adjuntas, que definen los geles de los experimentos. En cada caso:

: Línea 1 del gel muestra los marcadores de peso molecular.

: Línea 2 es un control.

En la figura 1A, las líneas 3 y 4 muestran los resultados cuando se utilizaban NaCl 100 mM, Tris 10 mM y 0,1% SDS (pH 6) sin PRO-CIPITATE, mientras las líneas 5 y 6 muestran los resultados obtenidos cuando al tampón se añadía el PRO-CIPITATE. En las líneas 9 y 10, se usaban los tampones salinos más elevados, con PRO-CIPITATE.

La figura 1B muestra los mismos resultados paralelamente a los que aparecen en la figura 1A pero a pH 7.

En la figura 1C, los resultados se presentan en paralelo 1A y 1B. Sin embargo, en este caso la línea 3 usaba NaCl 50 mM, Tris 10 mM, 0,1% de SDS a un pH de 6. Las líneas 4 y 5 son idénticas, a excepción de que se usa PRO-CIPITATE. La línea 6 es paralela a la línea 3, excepción de que el pH es 7. La línea 7 es paralela a las líneas 4 y 5 a excepción de que el pH es 7.

Los resultados presentados en las figuras 1A, 1B y 1C demuestran que cuando se utilizaba PRO-CIPITATE, la señal era claramente mejor. Este resultado era independiente de dicha concentración o bien del pH y por consiguiente el efecto solamente puede atribuirse a la presencia de PRO-CIPITATE.

Ejemplo 4

Este experimento describe el uso de detergente no iónico en combinación con SDS. Demuestra que el primero neutralizaba el efecto del último, permitiendo con ello el análisis de la RCP de una muestra.

Una muestra de 500 \mul de sangre entera se combinaba con 1 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos comentado en el ejemplo 3. Los materiales se incubaban durante cinco minutos y luego se agitaban durante cinco minutos a 2500 rpm. Como en el ejemplo 2, los tiempos de incubación pueden variar según se desee. El gránulo se combinaba con un 1 ml adicional de tampón de glóbulos rojos, se volvía a suspender y se agitaba durante tres minutos a 2500
rpm.

Los gránulos resultantes se combinaban luego con 500 \mul de un tampón de lisis de glóbulos blancos. El tampón de lisis contenía uno de los siguientes, en un primer grupo de ensayos:

a.: SDS solamente;

b.: Triton X-100 únicamente;

c.: SDS + Triton X-100;

d.: SDS + Tween 20;

e.: Tween 20 solamente.

En un segundo grupo de ensayos, el PRO-CIPITATE se combinaba también con los tampones, del modo siguiente:

a.: SDS (tampón de lisis), luego PRO-CIPITATE, luego Tween 20;

b.: SDS (tampón de lisis), luego Tween 20, luego PRO-CIPITATE;

c.: SDS + Tween 20 (tampón de lisis), luego PRO-CIPITATE;

d.: SDS (tampón de lisis), luego PRO-CIPITATE.

En el primer grupo de ensayos, las muestras se combinaban con el tampón de lisis y luego se calentaban durante cinco minutos a 65ºC, después de lo cual se llevaban a cabo las reacciones en cadena de la polimerasa de acuerdo con el ejemplo 1. En el segundo grupo de experimentos, el tampón de lisis se añadía primero (SDS solo, en "a", "b" y "d", o bien SDS + Tween 20 en "c"), luego las muestra se calentaban como en el primer grupo de experimentos. Luego se añadían el resto de reactivos (en "a" primero PRO-CIPITATE luego Tween 20; en "b" primero Tween 20 luego PRO-CIPITATE; en "c" y "d", solo PRO-CIPITATE).

Las figuras 2 y 3 reflejan los resultados.

En la figura 2, las líneas 1 y 11 son marcadores del peso molecular. Las líneas 2 y 3 son resultados garantizados cuando el SDS se usaba solo. Las líneas 4 y 5 son los resultados del Triton X-100 solo. Las líneas 6 y 7 son combinaciones de SDS y Triton, mientras las líneas 8 y 9 muestran el uso secuencial del SDS y del Triton X-100, antes que su uso simultáneo. La línea 10 es un control.

Observar que las bandas en las líneas 4 y 5 cuando se usaba Triton X-100. No aparecían bandas cuando el SDS estaba presente, no obstante, lo que demostraba que el Triton X-100 era incapaz de inactivar el SDS.

Sin embargo, en contraste con ello, los resultados que aparecen en la figura 2b demuestran que el Tween 20 de hecho inactivaba el SDS. En la figura 2b, la línea 1 muestra los marcadores del peso molecular. Las líneas 2 y 3 muestran el uso del SDS + Tween 20 (uso simultáneo). Las líneas 4 y 5 presentan los resultados cuando los materiales se usaban en secuencia. Las líneas 6 y 7 eran el resultado del uso del SDS solo y las líneas 8 y 9, solamente Tween 20. La línea 10 es un control.

En las figuras 3A y 3B, se muestra el trabajo con PRO-CIPITATE. En la figura 3A, la línea 1 es un marcador molecular y la línea 12 es un control. Las líneas 2 y 3 usaban SDS y PRO-CIPITATE, mientras que las líneas 4 y 5 usaban Triton X-100 luego PRO-CIPITATE. Las líneas 6 y 7 usaban SDS combinado con Triton X-100, seguido de PRO-CIPITATE. En las líneas 8 y 9, al SDS seguía el PRO-CIPITATE y luego el Triton X-100. En las líneas 10 y 11, al SDS seguía el Triton X-100 luego el PRO-CIPITATE. En la figura 3B, las líneas 1 y 12 son las mismas que en la línea 3A. Las líneas 2 y 3 muestran el uso del SDS, luego PRO-CIPITATE, luego Tween 20. Las lineas 4 y 5 muestran el SDS, seguido del Tween 20 y luego el PRO-CIPITATE. Las líneas 6 y 7 usaban SDS con Tween 20, seguido por PRO-CIPITATE, mientras que las líneas 8 y 9 usaban SDS con Tween 20, seguido de PRO-CIPITATE, mientras que las líneas 8 y 9 muestran el SDS seguido del PRO-CIPITATE. Las líneas 10 y 11 eran valores blancos.

En cada caso, el PRO-CIPITATE facilitaba la amplificación de la secuencia de referencia.

En un aspecto que no es parte de la invención, las muestras de células enteras son lisadas para liberar las moléculas de ácido nucleico contenidas en ellas. A esto sigue la adición de al menos un ácido policarboxílico polihidroxi, reticulado, insoluble en agua de la fórmula descrita en la patente nr. 5.294.681 de Krupey. Los reactivos que contienen dichos materiales se encuentran disponibles bajo la marca registrada PRO-CIPITATE®, pero no se permiten valores específicos de las formulaciones. Sin embargo, la patente de Krupey tiene una información completa sobre como fijar los ácidos policarboxílicos.

Tras la adición de los ácidos policarboxílicos, los ácidos nucleicos en la muestra pueden ser recuperados directamente, sin el paso tradicional de añadir un alcohol para precipitarlos. Como resultado de ello, se puede si se desea poner la muestra inmediatamente en contacto con los reactivos necesarios para llevar a cabo la amplificación del ácido nucleico. Dichos reactivos incluyen, por ejemplo, polimerasas como las polimerasas del nucleótido Thermus Aquaticus, o bien otras enzimas equivalentes, por ejemplo, la polimerasa PWO. Los reactivos pueden incluir también, por ejemplo, los cebadores adecuados, deoxinucleótidos, tampones y así sucesivamente, de acuerdo con cualquiera de los múltiples protocolos conocidos para la amplificación del ácido nucleico. Entre las familias de pruebas de amplificación del ácido nucleico se encuentran la clásica reacción en cadena de la polimerasa o "RCP", la reacción en cadena de la ligasa, o la "RCL" y otras, siendo todas bien conocidas por el experto y que aquí no es preciso
mencionar.

Las metodologías aquí descritas se pueden usar para fijar los ácidos nucleicos de cualquier célula que los contenga. (Observe que, en este contexto los glóbulos rojos no contienen ácidos nucleicos). Preferiblemente, se tratan las células eucarióticas, como las células mamarias siendo las células humanas las preferidas. De todas las células humanas se prefieren los glóbulos blancos, tanto en una muestra purificada como parte de una muestra de sangre entera.

La metodología preparatoria, comentada con anterioridad, se puede adaptar para diversos tipos de células. Es bien sabido tal como se ha indicado que células diferentes son lisadas preferiblemente para liberar sus ácidos nucleicos por diferentes agentes de lisado. Por consiguiente, cuando una muestra de célula entera está siendo tratada, es conveniente utilizar dos tampones de lisis distintos, uno para glóbulos rojos y uno para glóbulos blancos. De nuevo, el experto está familiarizado con un montón de tampones distintos.

Se prefiere especialmente si se usan ácidos policarboxílicos, calentar la muestra tras la lisis pero antes de añadir el ácido policarboxílico. Este calentamiento es preferible a una temperatura del orden de unos 50ºC hasta unos 70ºC, durante al menos un minuto. Preferiblemente, la etapa de calentamiento dura no más de 10 minutos.

También se puede utilizar una etapa de centrifugación después de añadir el ácido policarboxílico a la muestra, de manera que se purifiquen los ácidos nucleicos de la muestra. De nuevo, los protocolos de centrifugación son bien conocidos.

Tras la separación de los ácidos nucleicos, se pueden almacenar los ácidos nucleicos para un uso posterior, o bien llevar a cabo inmediatamente la amplificación. En este último caso, los reactivos de amplificación se añadirán directamente a una parte alícuota de los ácidos nucleicos liberados, y se dejará que la reacción siga su curso.

La invención descrita, por ejemplo, por los ejemplos es el uso de detergentes que (i) son no iónicos y (ii) no contienen grupos fenilo, en los tampones de lisis que también contienen dodecilsulfato sódico o "SDS". SDS es un estándar y casi un material omnipresente en los agentes de lisis. Como resaltan los ejemplos, utilizando un grupo no fenilo que contenga detergentes no iónicos, puede evitarse el problema de la inhibición enzimática por parte del SDS.

Resulta preferible el uso de un grupo no fenilo que contenga un detergente no iónico conocido como Tween 20, conocido más expresamente como poli(oxietilen)_{n}-sorbitan-monolaurato, donde "n" es habitualmente 20. Otros materiales útiles de acuerdo con la invención incluyen el Tween 20 ya que es un monooleato antes que un mono-laurato, "MEGA-10", que es el N-(D-gluco-2,3,4,5,6-pentahidroxihexil)-N-metildecanamida; Deoxi-BIGCHAP, que es el N,N-bis-(3-D-gluconaamidopropil)-deoxicolamida, 1-O-n-dodecil-\beta-D-glucopiranosil(1\rightarrow4)\alpha-D-glucopiranosida, 6-O-(N-heptil-carbamoil)-metil-\alpha-D-glucopiranosida, N-(D-gluco-2,3,4,5,6-pentahidroxihexil)-N-metiloctanamida, 1-O-n-octil-\beta-D-glucopiranosida, éster de sacarosa de ácido laúrico "Brij-35" o dodecilpoli (oxietilenglicoleter)_{23}, "Genapol X-080" o bien isotridecilpoli(etilenglicoléter)_{n}, donde n es 8, "Synperonic PE/F68", que es un copolímero de polietilencol-polipropilenglicol, "Thesit", que es un dodecilpoli/etilenglicoléter)_{n}, donde "n" es 9. Se excluyen específicamente los detergentes "Triton" que incluyen grupos fenilo en su estructura. La lista de detergentes excluidos e incluidos está lejos de ser exhaustiva; sin embargo, se asume que el especialista está familiarizado con los detergentes no iónicos además de los que aquí se utilizan. Como con el uso de los ácidos policarboxílicos comentados, una vez completada la lisis, se pueden utilizar las moléculas de ácido nucleico liberadas por ellos en las reacciones de amplificación, incluyendo las anteriormente mencionadas.

El experto observará que la invención también abarca, por ejemplo, estuches que se usan para purificar, recuperar y/o amplificar las moléculas de ácido nucleico. Dichos estuches comprenden un tampón de lisis que contiene dodecilsulfato sódico, y el segundo elemento en el estuche es un grupo no fenílico que contiene un detergente no iónico. Estos estuches también incluyen una muestra de polimerasa Thermus aquaticus o alguna otra enzima polimerizante. Para utilizar en un sistema específico, como una prueba de HIV, o bien otra prueba similar, se incluyen también partes separadas de los principales cebadores.

Otros rasgos de la invención quedan claros para el experto ya experimentado y no es preciso repetirlos aquí.

(1) INFORMACIÓN GENERAL

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(i): SOLICITANTE: Noeth, Lisa S.; Dasovich-Moody, Mary; Winget, Reardon Melissa

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Método para preparar ácidos nucléicos para el análisis y estuches útiles para ello

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 2

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(iv): DIRECCIÓN DE LA CORRESPONDENCIA:

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(A): DIRECCIÓN: Felfe & Lynch

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(B): CALLE: 805 Third Avenue

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(C): CIUDAD: Nueva York ciudad

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(D): ESTADO: Nueva York

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(E): ZIP: 10022

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(v): FORMA LEGIBLE EN EL ORDENADOR:

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(A): TIPO DE MEDIO: Diskette, 5,25 pulgadas, 360 kb

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(B): ORDENADOR: IBM PS/2

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(C): SISTEMA DE OPERACIÓN: PC-DOS

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(D): SOFTWARE: Wordperfect

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(vi): DATOS DE SOLICITUD HABITUALES:

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD: 08/309.575

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(B): FECHA CADUCIDAD: 21 SEPTIEMBRE 1994

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(C): CLASIFICACIÓN: 435

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(vii): INFORMACIÓN DEL AGENTE/APODERADO:

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(A): NOMBRE: Hanson, Norman D

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(B): NÚMERO DE REGISTRO: 30.946

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(C): NÚMERO DE REFERENCIA: BMC 274

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(viii): INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

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(A): TELÉFONO: (212)688-9200

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(B): TELEFAX: (212)838-3884

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(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 26 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): RAMIFICACIÓN: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEG ID NO: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTACGGCTGT CATCACTTAG ACCTCA

\hfill

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(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): RAMIFICACIÓN: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEG ID NO: 2:

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGCACACAGA CCAGCACGTT

\hfill

20

Claims

1. Método para prepara una muestra que contenga células enteras para la amplificación del ácido nucleico, que comprenda:

(i) poner en contacto dicha muestra que contenga células enteras con un tampón de lisis que contenga dodecilsulfato sódico y

(ii) añadir a dicha muestra una cantidad de un detergente no iónico que contenga un grupo no fenilo, en una cantidad suficiente para inhibir los efectos inhibidores enzimáticos del dodecilsulfato sódico.

2. El método de la reivindicación 1, en el que dicho detergente no iónico es Tween 20.

3. El método de la reivindicación 1, que comprende además el calentamiento de dicha muestra después de la etapa (i) a una temperatura entre 50ºC y 70ºC, durante un periodo de al menos un minuto.

4. Método para amplificar una molécula de ácido nucleico de interés, que comprenda:

(i) poner en contacto una muestra de células enteras que contenga dicha molécula de ácido nucleico de interés con un dodecilsulfato sódico que contenga un tampón de lisis;

(ii) añadir a dicha muestra una cantidad de detergente no iónico que contenga un grupo no fenilo, en una cantidad suficiente para inhibir los efectos inhibidores enzimáticos del dodecilsulfato sódico, y

(iii) añadir a dicha muestra un reactivo de amplificación para amplificar dicha molécula de ácido nucleico de interés.

5. El método de la reivindicación 4, donde dicho reactivo de amplificación comprende al menos dos cebadores y una polimerasa de ADN

6. Estuche útil en la recuperación de ácidos nucleicos de células que contienen ácido nucleico, que comprende un medio adaptado para conservar una parte independiente de cada uno de:

(i) un tampón de lisis que contiene dodecilsulfato sódico;

(ii) una muestra de detergente no iónico que contiene un grupo fenilo, y

(iii) un reactivo de amplificación que comprende al menos un par de cebadores y un enzima polimerizante

7. El estuche de la reivindicación 6, en el que dicho detergente no iónico es Tween 20.