ES2274259T3 - Proteccion a pacientes de posibles efectos adversos de la inhibicion de la via de señalizacion de shh mediante la supresion de testosterona. - Google Patents
Proteccion a pacientes de posibles efectos adversos de la inhibicion de la via de señalizacion de shh mediante la supresion de testosterona. Download PDFInfo
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Abstract
Uso de un compuesto que suprime la testosterona o su efecto en la fabricación de un medicamento para proteger a un paciente de sexo masculino de posibles efectos adversos de un tratamiento que involucra la inhibición de la vía de señalización de SHH en el paciente.
Description
Protección a pacientes de posibles efectos
adversos de la inhibición de la vía de señalización de SHH mediante
la supresión de testosterona.
La presente invención se relaciona con la
evitación de potenciales efectos colaterales indeseables cuando se
utilizan inhibidores de la señalización por SHH, tales como la
ciclopamina o sus derivados. También se relaciona con el uso de
estos compuestos en combinación con un compuesto que suprime la
testosterona en la fabricación de un medicamento para el
tratamiento de las enfermedades proliferativas, tales como el
cáncer.
La vía de señalización del HEDGEHOG SÓNICO (SHH)
regula las interacciones epitelio-mesenquimales
durante el desarrollo de muchos órganos. La proteína SHH se
sintetiza en las células epiteliales y, en muchas situaciones,
actúa como factor paracrino a través de su receptor PATCHED (PTC),
que se expresa en las células mesenquimales adyacentes (Bitgood y
McMahon, 1995; Roelink et al., 1994; Stone et al.,
1996). La disrupción de la señalización del SHH ha proporcionado
evidencias de sus importantes y numerosos roles en la organogésis.
Los ratones knockout para el Shh muestran numerosos defectos
del desarrollo, que incluyen ciclopia, defectos del tubo neural y
ausencia de estructuras distales de los miembros (Chiang et
al., 1996). La inhibición de la señalización del SHH utilizando
ciclopamina (Cy) ha demostrado mejor el papel de la señalización del
SHH en el desarrollo del tubo neural (Roelink et al., 1994),
el tracto gastrointestinal (Ramalho-Santos et
al., 2000; Sukegawa et al., 2000), el páncreas (Kim y
Melton, 1998), y en la morfogénesis de los folículos pilosos (Chiang
et al., 1999). La señalización del SHH es necesaria además
para la morfogénesis de las ramificaciones en el pulmón (Bellusci
et al., 1997ª; Pepicelli et al., 1998). Se ha
reportado la expresión del transcrito de Shh en el epitelio
del seno urogenital (UGS) (Bitgood y McMahon, 1995), donde es
necesario para la formación de los genitales externos (Haraguchi
et al., 2001; Perriton et al., 2002), y puede
desempeñar un papel importante en el desarrollo de la próstata
(Podlasek et al., 1999).
La organogénesis de la próstata es un proceso
dependiente de andrógeno que involucra la señalización recíproca
entre el epitelio y el mesénquima, pero se conoce poco acerca de los
mediadores moleculares que controlan dichas interacciones
epitelio-mesenquimales. Shh se expresa en el
epitelio del seno urogenital (UGS) y se ha demostrado su
importancia en el crecimiento de la próstata, mediante el bloqueo de
SHH por anticuerpos, que redujeron el crecimiento de la próstata a
partir de tejido UGS de machos trasplantado a ratones macho
receptores (Podlasek et al., 1999). Podlasek et al
informaron también que se incrementó la expresión del transcrito de
Shh en machos en respuesta a los andrógenis, con lo que
concluyeron que la expresión de Shh en la UGS inducida por
andrógeno es necesaria para la inducción prostática. Sin embargo,
BMP4, un posible efector de la señalización de la vía de
señalización de SHH (Bitwood y McMahon, 1995), se expresa en el
mesénquima del UGS de manera independiente de la acción de los
andrógenos (Lamm et al., 2001). Esta discrepancia sugirió que
el andrógeno quizás no regule a Shh en la próstata en
crecimiento, motivándonos a reexaminar este asunto en detalle. Hemos
analizado el papel de la señalización de SHH en la organogénesis de
la próstata, mediante el examen detallado de la expresión de los
transcritos de Shh y Ptc, y mediante la disrupción de
la vía de señalización de SHH en la próstata ventral (VPs)
cultivada in vitro. Nuestros resultados sugieren que la
expresión de los transcritos de Shh y Ptc no depende
de los andrógenos y que la señalización de SHH es necesaria para el
crecimiento de la VP. Además, demostramos que la inhibición de la
señalización de SHH durante el crecimiento de la VP afecta el
crecimiento, el desarrollo del patrón y la diferenciación del
epitelio, y produce conductos epiteliales prostáticos reminiscentes
de la neoplasia intraepitelial prostática cribiforme humana
(PIN).
(PIN).
Por tanto, el trabajo descrito sugiere por
primera vez que en el uso de compuestos que inhiben la vía de
señalización de SHH para el tratamiento médico de pacientes resulta
importante eliminar a los andrógenos o sus efectos.
WO 99/52534 describe el uso de derivados de
alcaloides esteroideos como inhibidores de las vías de señalización
de hedgehog. Las Patente US Nos. 6.291.516B1 y WO 01/27135 describe
a los reguladores de la vía de hedgehog. WO 02/30462 describe a los
antagonistas de hedgehog.
Un primer aspecto de la invención se relaciona
con el uso de un compuesto que suprime a testosterona o sus efectos
en la producción de un medicamento para la protección de un paciente
de posibles efectos adversos de un tratamiento que involucra la
inhibición de la vía de señalización de SHH en el paciente.
Por tanto, la invención incluye el uso de la
supresión de la testosterona o sus efectos en un paciente con el
objetivo de proteger al paciente contra posibles efectos adversos de
la inhibición de la vía de señalización de SHH sobre la próstata
del paciente.
Se sugiere la inhibición de la señalización de
SHH utilizando, por ejemplo, los compuestos que se describen en más
detalles más adelante, para el tratamiento de varias enfermedades y
estados. Por ejemplo, WO 02/30462 (incorporado aquí como
referencia) indica que varios de tales compuestos (como se discute
después en más detalle) son útiles para la inhibición de la
angiogénesis y para el tratamiento o la prevención de la
proliferación celular indeseada, se describe la inhibición de la
señalización de SHH para el tratamiento de enfermedades o dolencias
asociadas con la angiogénesis, incluyendo la enfermedad ocular
neovascular, la degeneración macular relacionada con la edad, la
retinopatía diabética, la retinopatía o la prematuridad, el rechazo
de injerto de la córnea, el glaucoma neovascular, la fibroplasia
retrolental, la queratoconjuntivitis epidérmica, la deficiencia de
vitamina A, el sobreuso de lentes de contacto, la queratitis
atópica, la queratitis límbica superior, el pterygium queratitis
sicca, el sjogrens, el acné rosacea, la filectenulosis, la sífilis,
las infecciones por micobacterias, la degeneración lipídica, las
quemaduras químicas, las úlceras bacterianas, las úlceras fúngicas,
las infecciones por Herpes simplex, las infecciones por Herpes
zoster, las infecciones protozoarias, el sarcoma de Kaposi, la
úlcera de Mooren, la degeneración marginal de Terrien, la queratosis
marginal, la artritis reumatoidea, el lupus sistémico, el trauma
poliarteritis, la sarcoidosis de Wegeners, la escleritis, la
enfermedad de Steven Jonson, la ceratotomía radial perifigoide, el
rechazo de injerto de córnea, la artritis reumatoidea, la
osteoantritis, la inflamación crónica (p.e., colitis ulcerativa, o
enfermedad de Crohn), el hemangioma, la enfermedad de
Osler-Weber-Rendu y la
telangiectasia hemorrágica hereditaria.
La angiogénesis también es importante en
determinados cánceres y metástasis, incluyendo tumores sólidos,
tales como el rabdomiosarcoma, el retinoblastoma, el sarcoma de
Swing, el neuroblastoma y el osteosarcoma, y tumores benignos tales
como el neuroma acústico, el neurofibroma, la traconia y los
granulomas piogénicos.
Se sugiere también tratar otras enfermedades,
tales como las enfermedades proliferativas de la piel, incluyendo
la soriasis y el carcinoma de célula escamosa, y la hiperplasia
benigna de próstata (BPH) mediante inhibidores de la señalización
de SHH.
Para evitar dudas, en este documento se
incorporan todas las enfermedades que se tratan con un inhibidor de
la señalización SHH, como se describe en WO 02/30462. De manera
similar, todas las enfermedades que se tratan con un inhibidor de
la señalización de SHH descritas en US 6.291.516 B1, WO 01/27135 o
WO 99/52534 se incorporan como referencia en este documento.
Se prefiere de manera particular utilizar la
supresión de la testosterona o sus efectos cuando un paciente se
encuentra sometido a tratamiento por cáncer que involucra la
inhibición de la vía de señalización de SHH.
Por tanto, un segundo aspecto de la invención se
relaciona con el uso de un inhibidor de la vía de señalización de
SHH en la preparación de un medicamento para el tratamiento de una
enfermedad proliferativa tal como el cáncer en un paciente al cual
se le administra un compuesto que suprime la testosterona o sus
efectos en el paciente.
Un tercer aspecto de la invención se relaciona
con el uso de un compuesto que suprime la testosterona o sus
efectos en un paciente para la fabricación de un medicamento para el
tratamiento de una enfermedad proliferativa como el cáncer en un
paciente al que se le administra un inhibidor de la vía de
señalización de SHH. Un cuarto aspecto de la invención se relaciona
con el uso de un inhibidor de la vía de señalización de SHH y un
compuesto que suprime la testosterona o sus efectos en un paciente
para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una
enfermedad proliferativa como el cáncer, en un paciente.
La vía de señalización de SHH incluye a SHH,
PTC, Smoothened, Gli-1, Gli-2 y
Gli-3. SHH es el ligando que se une a un complejo
receptor formado por PTC y Smoothened. Se cree que Smoothened es el
que transduce la señal y es un elemento clave en la vía de
señalización de SHH. Gli-1, Gli-2 y
Gli-3 son factores de transcripción. Se puede
encontrar más información acerca de la vía de señalización de SHH,
por ejemplo, en WO 02/30462.
Por lo regular, los inhibidores de la vía de
señalización de SHH causan cambios en el crecimiento y/o la
diferenciación. Por lo regular, un inhibidor de la vía de
señalización de SHH inhibe la producción de PTC y/o
BMP-4 (proteína morfogénica de huesos 4), como
respuesta a una señal de SHH.
Se prefieren los compuestos que inhiben SHH o
inhiben Smoothened o modulan PTC, o que inhiben la función de los
Glis.
En relación a los métodos de la invención, la
vía de señalización de SHH se puede inhibir mediante cualquier
inhibidor apropiado. WO 99/52534, que se incorpora como referencia a
este documento, señala que durante la biosíntesis, SHH sufre una
reacción de autoclivaje, mediada por su dominio carboxi terminal, la
que produce un fragmento amino terminal modificado por un lípido,
el cual es responsable de toda la actividad señalizadora conocida
de SHH. El autoprocesamiento de SHH provoca la unión covalente de
colesterol al extremo C terminal del fragmento N terminal de SHH.
WO 99/52534 describe compuestos que inhiben la vía de señalización
de SHH mediante, por ejemplo, la disrupción de la modificación
mediante la unión de colesterol, de las proteínas de hedgehog y/o,
la inhibición de la bioactividad de las proteínas de hedgehog. En
particular, los alcaloides esteroideos y sus análogos pueden
utilizarse para interferir las señales paracrinas y/o autocrinas
producidas por SHH, en particular, las formas de la proteína que se
encuentran modificadas por colesterol. Como se describe en más
detalles en WO 99/52534, el compuesto jervina, derivado de
Veratrum inhibe dicha señal y la respuesta biológica
concomitante de la célula.
La capacidad de la jervina y otros alcaloides
esteroideos de inhibir la señalización de SHH puede deberse a la
capacidad que poseen dichas moléculas para interactuar con la vía de
transducción de señales mediada por PTC o "smoothened". Por
ejemplo, los inhibidores pueden interactuar con el dominio o
dominios de detección de esteroles del receptor de SHH, PTC, o al
menos, interferir con la capacidad de SHH de interactuar con su
receptor u otras moléculas asociadas con el receptor u otras
proteínas involucradas en la transducción de señales mediada por
SHH. Además de ello, o de manera alternativa, los efectos de la
jervina sobre la señalización de SHH pueden ser resultado de
disrupciones de la homeostasis del colesterol que afecten el
autoprocesamiento mediado por colesterol de la proteína SHH y/o la
actividad o estabilidad de la proteína. Por tanto, otras moléculas
pequeñas, esteroideas y no esteroideas que, de manera similar,
interfieran con los aspectos dependientes de colesterol de la
actividad de PTC, inhibirán las señales mediadas por SHH.
Los "antagonistas de hedgehog" y los
compuestos que, como ejemplo, se describen en las páginas 28 a 38 de
WO 99/52534 se incorporan, de este modo, al presente documento
mediante referencia, como compuestos que inhiben la vía de
señalización de SHH. Se prefiere que el compuesto que inhibe la vía
de señalización de SHH sea uno de los compuestos representados por
las Fórmulas I, Ia, II, IIa, III, IIIa, IV, IVa, V, Va, VI, VIa, VII
y VIIa de WO 99/52534, todos los cuales se incorporan como
referencia al presente documento, incluyendo la definición y las
preferencias por los sustituyentes.
Al menos algunos de los compuestos se derivan de
análogos de alcaloides de los tipos Solanum o
Veratrum, y los compuestos incluyen derivados de la jervina,
la ciclopamina, la cicloposina, la mukiamina, la veratramina, la
verticina y la zigacina, la solanidina y la caconina.
WO 02/30462, incorporado en este documento
mediante referencia, describe también los inhibidores de la vía de
señalización de SHH. Estos, así como los compuestos que, como
ejemplos, se describen en las páginas 33 a 112 de WO 02/30462, se
incorporan al presente documento, mediante referencia, como
compuestos que inhiben la vía de señalización de SHH. Se prefiere
que el compuesto que inhibe la vía de señalización de SHH sea
cualquiera de los compuestos representados mediante las Fórmulas I,
Ia, II, IIa, III, IIIa, IV, IVa, V, Va, VI, VIa, VII, VIIa, VIII,
VIIIa, IX, IXa, X, Xa, XI, XIa, XII, XIIa, XIII, XIIIa, XIV, XIVa,
XV, XVI, XVII, XVIII, XIX, XX, XXI, XXII, XXIII, XXIV y XXV de WO
02/30462, todos los cuales se incorporan mediante referencia al
presente documento, incluyendo la definición y preferencias por los
sustituyentes. Los mutantes de antagonistas de hedgehog que se
describen en las páginas 93 y siguientes, y los antagonistas de
anticuerpos, que se describen en la página 102 y siguientes, y los
oligonucleótidos antisentido, ribozima y triplex, que se describen
en la página 103 y siguientes se incorporan también mediante
referencia al presente documento. De manera similar, los
antagonistas de anticuerpos, los oligonucleótidos antisentido
ribozima y triplex que inhiben cualquier parte de la vía de
señalización de SHH, tales como los que se encuentran dirigidos
contra PTC, Smoothened, o Gli-1,
Gli-2, o Gli-3, pueden también
resultar de utilidad. Las secuencias nucleotídicas y aminoacídicas
están disponibles en GenBank como sigue: Números de Acceso U43148
(PTC humano); L38518 (SHH humano); US4401 (Smoothened humano);
AF31673 (Gli-1 humano); AB007298
(Gli-2 humano); y M57609 (Gli-3
humano), todas incorporadas al presente documento como referencia.
Las secuencias pueden emplearse en el diseño y producción de
anticuerpos, ácidos nucleicos antisentido, ribozimas y
oligonucleótidos triplex, como se conoce bien en la técnica.
Los antagonistas hedgehog preferidos incluyen el
AY9944, el triparanol, la jervina, la ciclopamina y la tomatidina
(Figura 9), el compuesto A (Figura 10) y el compuesto B (Figura
11).
WO 01/27135, incorporado aquí mediante
referencia, describe también inhibidores de la vía de señalización
de SHH.
Los compuestos que se describen como ejemplos en
las páginas 32 a 49, incluyendo los de Fórmulas I, Ia, II, IIa,
III, IIIa, IV, IVa, V, Va, VI, VIa, VII y VIIa, se incorporan de
manera específica en el presente documento mediante referencia. De
manera similar, los compuestos descritos en las páginas 98 a 133,
hasta el punto en que inhiben la vía de señalización de SHH, se
incorporan al presente documento como referencia y, en particular,
los derivados de la ciclopamina y la jervina.
La patente US No. 6.291.516 B1, incorporada
mediante referencia al presente documento también describe
inhibidores de la vía de señalización de SHH. Los compuestos
descritos en las columnas 27 a 35, incluyendo los de Fórmulas I,
Ia, II, IIa, III, IIIa, IV, IVa, V, Va, VI, VIa, VII y VIIa se
incorporan específicamente mediante referencia al presente
documento.
Los compuestos llamados SANT-1,
SANT-2, SANT-3 y
SANT-4, como se describen en la Figura 3A de Chen
et al (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99,
14071-14076 son antagonistas de Smoothened (Smo) y,
por tanto, son inhibidores de la vía de señalización de SHH. Estas
estructuras se han incorporado mediante referencia al presente
documento.
Por lo regular, la vía de señalización de SHH se
inhibe mediante la administración de ciclopamina o un derivado de
la misma al paciente.
La vía de señalización de SHH puede ser inhibida
por agentes que interfieren con la transcripción de la vía.
Por tanto, el agente puede ser una secuencia
antisentido. Las secuencias antisentido, que constituyen agentes
para ser usados en la invención son capaces de hibridizar con la
secuencia nucleotídica. El término "secuencia antisentido"
incluye oligonucleótidos antisentido, tales como los que poseen
entre 10 y 30 nucleótidos de longitud, así como secuencias de mayor
longitud. Una persona versada en la técnica puede diseñar secuencias
antisentido, mediante referencia a las secuencias nucleotídicas que
codifican para SHH, PTC, Smoothened, Gli-1,
Gli-2,
Gli-3.
Gli-3.
\newpage
El término "hibridización" como se utiliza
en el presente documento incluye "el proceso mediante el cual una
hebra de ácido nucleico se une a una hebra complementaria mediante
apareamiento de bases" así como el proceso de amplificación como
se lleva a cabo in las tecnologías de reacción en cadena de la
polimerasa (PCR).
La presente invención también abarca el uso de
secuencias nucleotídicas que son capaces de hibridizar con las
secuencias que son complementarias a las secuencias presentadas en
este documento, o cualquier derivado, fragmento, o derivado del
mismo.
El término "variante" también comprende
secuencias que son complementarias a las secuencias capaces de
hibridizar con las secuencias nucleotídicas presentadas en esta
invención.
De preferencia, el término "variante"
comprende secuencias que son complementarias a secuencias capaces de
hibridizar bajo condiciones astringentes (pe, 50ºC y 0,2xSSC {1xSSC
= 0,15 M de NaCl, 0,015 M de Na_{3}citrato pH 7.0}) con las
secuencias nucleotídicas presentadas en esta invención.
Con mayor preferencia, el término
"variante" comprende secuencias que son complementarias a
secuencias capaces de hibridizar bajo condiciones de elevada
astringencia (pe, 65ºC y 0,1xSSC {1xSSC = 0,15 M de NaCl, 0,015 M
de Na_{3}citrato pH 7.0}) con las secuencias nucleotídicas
presentadas en esta invención.
La vía de señalización de SHH puede inhibirse
mediante un anticuerpo que se une a SHH, PTC, Smoothened,
Gli-1, Gli-2, o
Gli-3.
El "anticuerpo" tal como se utiliza en esta
invención incluye, pero no se limita, a policlonales, monoclonales,
quiméricos, cadenas simples, fragmentos Fab y fragmentos producidos
mediante una librería de expresión Fab. Tales fragmentos incluyen
fragmentos de anticuerpos completos que retienen su actividad de
unión por una sustancia blanco, fragmentos Fv, F(ab') y
F(ab')2, así como anticuerpos de una única cadena (scFv),
proteínas de fusión y otras proteínas sintéticas que contienen el
sitio de unión al antígeno del anticuerpo. Además los anticuerpos y
fragmentos de los mismos pueden ser anticuerpos humanizados, por
ejemplo, como se describe en
US-A-239400. Los anticuerpos
neutralizantes, o sea, aquellos que inhiben la actividad biológica
de los polipéptidos, se prefieren de manera especial para el
diagnóstico y la terapia.
Los anticuerpos pueden producirse mediante
técnicas estándar, tales como la inmunización con la sustancia de
la invención o mediante la utilización de una librería de fagos.
Si se desean anticuerpos policlonales se
inmuniza un mamífero seleccionado (pe, ratón, conejo, cabra,
caballo, etc.) con un polipéptido inmunogénico que contenga un
epítope obtenible a partir de un agente y/o sustancia identificado
de la presente invención. En dependencia de la especie receptora, se
pueden utilizar diversos adyuvantes para incrementar la respuesta
inmunológica. Tales adyuvantes incluyen, pero no se limitan a, el
de Freund, los geles minerales tales como el hidróxido de aluminio,
y las sustancias de superficie activa tales como lisolecitina,
polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite,
hemocianina de lapa californiana y dinitrofenol. El BCG (Bacilos
Calmette-Guerin) y el Corunebacterium parvum
son adyuvantes humanos potencialmente útiles, que pueden utilizarse
si el polipéptido purificado se administra a individuos
inmunológicamente comprometidos con el propósito de estimular las
defensas sistémicas.
Se colecta el suero de los animales inmunizados
y se trata de acuerdo con procedimientos conocidos. Si un suero que
contiene anticuerpos policlonales contra un epítope obtenible a
partir de agente y/o sustancia identificado de la presente
invención contiene además anticuerpos contra otros antígenos, se
puede purificar el anticuerpo policlonal mediante cromatografía de
inmunoafinidad. Se conocen en la técnica los procedimientos para la
producción y procesamiento de antisueros policlonales. Para
producir tales anticuerpos, la invención también proporciona
polipéptidos de la invención o fragmentos de los mismos haptenizados
a otro polipéptido para su utilización como inmunógenos en animales
o humanos.
Personas versadas en la técnica pueden también
producir fácilmente anticuerpos monoclonales dirigidos contra
epítopes particulares. La metodología general para producir
anticuerpos monoclonales a partir de hibridomas es bien conocida.
Se pueden crear líneas celulares inmortales productoras de
anticuerpos mediante fusión de células, y también mediante otras
técnicas tales como la transformación directa de linfocitos B con
DNA oncogénico, o transfección con virus de
Epstein-Barr. Se pueden analizar con respecto a
varias propiedades paneles de anticuerpos monoclonales producidos
contra epítopes órbita; pe, en busca de afinidad isotópica y
epitópica.
Se pueden preparar anticuerpos monoclonales
utilizando cualquier técnica que permita la producción de moléculas
de anticuerpo mediante líneas celulares continuas en cultivo. Estas
incluyen, pero no se limitan, a la técnica de hibridomas, descrita
originalmente por Koehler y Milstein (1975 Nature 256:
495-497), la técnica de hibridoma de célula B
(Kosbor et al (1983) Inmunol Today 4: 72; Cote et
al (1983) Proc Natl Acad Sci 80:
2026-2030) y la técnica de hibridoma de EBV (Cole
et al (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R
Liss Inc, pp 77-96). Además, se pueden utilizar
técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos
quiméricos", el splicing de genes de anticuerpos de ratón a
genes de anticuerpos de humano para obtener una molécula con
especificidad antigénica y biológica adecuadas (Morrison et
al (1984) Proc Natl Acad Sci 81:
6851-6855; Neuberger et al (1984)
Nature 312: 604-608; Takeda et
al (1985) Nature 314: 452-454).
De manera alternativa, se pueden adaptar técnicas descritas para la
producción de una única cadena de anticuerpos (patente US No.
4.946.779) para la producción de una única cadena de anticuerpos
contra la sustancia específica.
También se pueden producir anticuerpos mediante
la inducción de la producción in vivo en la población de
linfocitos o mediante el análisis de librerías de inmunoglobulina
recombinante o paneles de reactivos de elevada especificidad de
unión, como se muestra en Orlando et al (1989, Proc Natl
Acad Sci 86: 3833-3837), y Winter G y
Milstein (1991; Nature 349:
293-299).
También se pueden generar fragmentos de
anticuerpos que contienen sitios de unión específicos para la
sustancia. Por ejemplo, tales fragmentos incluyen, pero no se
limitan a, los fragmentos F(ab')2 que se pueden generar
mediante digestión con pepsina de la molécula de anticuerpo y de los
fragmentos Fab que se pueden generar reduciendo los puentes
disulfuro de los fragmentos F(ab')2. De manera alternativa,
se pueden construir librerías de expresión de Fab para permitir la
rápida y fácil identificación de los fragmentos de Fab monoclonales
con la especificidad deseada (Huse WD et al (1989)
Science 256: 1275-1281).
Dentro de la "supresión de la testosterona o
sus efectos en el paciente" se incluye la reducción de los
niveles endógenos de testosterona (por ejemplo, mediante la
inhibición de su producción), la inhibición de la conversión de
testosterona a dihidrotestosterona (por ejemplo, mediante la
inhibición de la testosterona 5\alpha reductasa), y mediante el
bloqueo del receptor de andrógeno (pe, mediante el uso de un
antagonista de andrógeno). Por tanto, se bloquea la vía de
señalización de testosterona.
También puede resultar posible bloquear la vía
de señalización de la testosterona, por ejemplo, con el empleo de
una molécula que suprime la producción del receptor de andrógeno
(AR), tal como una molécula antisentido específica para el AR.
Son bien conocidos en la técnica los agentes
capaces de suprimir la testosterona o sus efectos, y pueden
considerarse como agentes químicos de castración masculina. Se
puede suprimir la testosterona mediante castración quirúrgica del
macho, pero esto es menos preferido.
En la castración química y quirúrgica de los
machos se reducen los niveles de andrógenos, pero puede mantenerse
un bajo nivel de andrógenos producidos por las glándulas adrenales.
Por lo regular, los niveles de castración de la testrosterona se
encuentran alrededor de 2 nmol/l (o 0,5 ng/ml) en comparación con
los machos saludables que poseen valores normales de 3,5 a 10,0
ng/ml.
Se prefiere de manera particular que el nivel de
testosterona se suprima a los niveles de castración. De preferencia,
el nivel de testosterona, o sus efectos, se suprimen mediante la
administración al paciente de cualesquiera uno o más antagonistas
de GnRH (LHRH), un agonista de GnRH (LHRH), un antagonista de la
testosterona (andrógeno) o un inhibidor de la 5\alpha
reductasa.
Los agonistas de GnRH (LHRH) incluyen la
leuprorelina (Prostap suministrada por Wyeth, que puede
administrarse, por lo regular a un nivel de 3,75 mg cada 4 semanas
s.c./i.m. o 11,25 mg cada 3 meses s.c.); la buserelina (Suprefact
suministrada por Shire) que se administra, por lo regular, a un
nivel de 0,5 mg s.c. cada 8 horas ó 0,2 mg seis veces al día, por
vía intranasal; la goserelina (Zoladex suministrada por Astra
Zeneca) que se administra por lo regular como un implante s.c. de
3,6 mg cada 28 días, o implantes s.c. de 10,8 mg cad 12 semanas; la
triptorelina (Decapeptyl sr, suministrada por Ipsen) que se
administra por lo regular a un nivel de 3 mg cada 4 semanas; la
nafarelina (Synarel suministrada por Searle); la deslorelina
(Somagard suministrada por Shire); y la histrelina/supprelina
(Ortho Pharmaceutical Corp/Shire).
Los antagonistas de GnRH incluyen al teverelix
(conocido también como antarelix); el abarelix (Plenaxis
suministrado por Praecis Pharmaceuticals Inc); el cetrorelix
(Cetrotide suministrado por ASTA Medica) que se administra por lo
regular a un nivel de 0,25-0,3 mg s.c. diarios; el
ganirelix (Orgalutran suministrado por Organon) que se administra
por lo regular a un nivel de 0,25 mg diarios s.c.
Los antagonistas de la testosterona (andrógenos)
incluyen a las ciproteronas, como el acetato de ciproterona,
(Androcur suministrado por Schering Health) y administrado, por lo
regular, a un nivel de 50-100 mg dos o tres veces
al día p.o.; la bicalutamida (Carodex suministrada por Astra Zeneca)
que se administra por lo regular a un nivel de
50-150 mg por día p.o.: y la flutamida (Drgenil
suministrada por Schering-Plough) que se administra
por lo regular a un nivel de 250 mg tres veces al día p.o.
Los inhibidores de la testosterona 5\alpha
reductasa incluyen a la finasterida (Proscar suministrada por MSD)
que se administra por lo regular a un nivel de 5 mg diarios p.o.
Para no dejar dudas, s.c. significa vía
subcutánea; p.o. es peroral; e i.m. significa por vía
intramuscular.
Se prefiere que el paciente sea de sexo
masculino.
Se prefiere, de modo particular, que el paciente
sea un representante del sexo masculino
post-pubescente.
Cuando se utiliza la invención en el tratamiento
del cáncer, puede tratarse de cualquier cáncer, pero se prefiere
que el cáncer tratado sea un cáncer en el que la vía de señalización
de SHH desempeñe un papel en su crecimiento y diferenciación.
Los cánceres en los que se encuentra la vía de
señalización de SHH incluyen el carcinoma escamoso de pulmón
humano, el adenocarcinoma, el carcinoma de célula basal, el
méduloblastoma, el meningioma, el hemangioma, el rabdomiosarcoma,
el glioblastoma, el sarcoma, el carcinoma renal, el carcinoma de
tiroides, el cáncer de huesos, y los tumores de mamas, riñón,
vejiga, uréteres, próstata, glándula adrenal, estómago e intestinos.
Se contempla el tratamiento del cáncer de próstata, pero no se
prefiere.
En relación con todos los métodos de tratamiento
de la invención, la inhibición de la vía de señalización de SHH
puede tener lugar antes o después, o al mismo tiempo, que la
supresión de la testosterona o sus efectos en el paciente. Por
tanto, el inhibidor de la vía de señalización de SHH puede
administrarse al paciente antes, durante o después de que al
paciente se la administre un compuesto que suprima la testosterona o
sus efectos. Se prefiere que la testosterona o sus efectos se
supriman antes de que se administre al paciente el inhibidor de la
vía de señalización de
SHH.
SHH.
Se administra al paciente una o varias dosis
apropiadas del inhibidor de la vía de señalización de SHH y el
compuesto que suprime la testosterona o sus efectos con el objetivo
de proporcionar un efecto terapéutico.
Los regímenes terapéuticos convenientes,
incluyendo la dosificación y determinación del momento de la
administración pueden prepararse para el paciente de modo que le
sea administrada una cantidad adecuada de los compuestos
terapéuticos y en el momento apropiado para ejercer el efecto
terapéutico deseado. Un médico puede preparar regímenes
terapéuticos adecuados para el paciente. Por lo regular, las dosis y
los tiempos de administración son los mismos que cuando se utiliza
el compuesto terapéutico en solitario. Por tanto, se pueden emplear
regímenes conocidos de castración química, y se puede utilizar una
dosis y un régimen de tratamiento terapéuticamente efectivos para
el inhibidor de la vía de señalización de SHH, en dependencia de la
enfermedad o dolencia que se esté tratando.
Se pueden administrar los compuestos antes
mencionados para su utilización en la invención (o sea, el inhibidor
de la vía de señalización de SHH o el compuesto que suprime la
testosterona o sus efectos) o una formulación de los mismos por
medio de cualquier método convencional, incluyendo la inyección oral
y la parenteral (p.e. subcutánea o intramuscular). El tratamiento
puede consistir en una única dosis o una pluralidad de dosis en el
curso de cierto período de tiempo.
De preferencia, la formulación es una dosis
unitaria que contiene una dosis o unidad diaria, una subdosis
diaria o una fracción adecuada de la misma, del ingrediente
activo.
Normalmente los compuestos para el uso en la
invención se pueden administrar oralmente o por cualquier ruta
parenteral, en forma de una formulación farmacéutica que contenga el
ingrediente activo, opcionalmente, en la forma de una sal de
adición no tóxica, orgánica o inorgánica, ácida o base, en una forma
de dosificación farmacéuticamente aceptable. En dependencia del
síndrome y el paciente de que se trate, así como de la vía de
administración, se pueden administrar las composiciones en dosis
variables.
En la terapia humana, los compuestos para uso en
la invención pueden administrarse solos, pero, por lo general, se
administrarán en una mezcla con un excipiente farmacéutico
apropiado, o un transportador seleccionado con respecto a la vía de
administración que se pretende utilizar y a la práctica farmacéutica
estándar.
Por ejemplo, los compuestos para uso en la
invención pueden administrarse por vía oral, bucal o sublingual, en
forma de tabletas, cápsulas, óvulos, elíxires, soluciones o
suspensiones, que pueden contener agentes colorantes o
saborizantes, para aplicaciones de liberación inmediata, demorada o
controlada. Los compuestos de la invención también pueden
administrarse por medio de una inyección intravenosa.
Tales tabletas pueden contener excipientes tales
como la celulosa microcristalina, la lactosa, el citrato de sodio,
el carbonato de calcio, el fosfato dibásico de calcio y la glicina,
desintegrantes como el almidón (de preferencia, almidón de maíz,
patata o tapioca), glicolato de almidón de sodio, sodio
croscaramelosa y ciertos silicatos complejos, y adherentes de
granulación, tales como la polivinilpirrolidona, la hidroxipropil
metilcelulosa (HPMC), la hidroxipropil celulosa (HPC), la sacarosa,
la gelatina y la acacia. De manera adicional, se pueden incluir
agentes lubricantes, tales como el estearato de magnesio, el ácido
esteárico, el behenato de glicerilo y el talco.
Se pueden emplear también composiciones sólidas
de tipo similar como llenadores en cápsulas de gelatina. Los
excipientes preferidos en este sentido incluyen la lactosa, el
almidón, una celulosa, azúcar de leche o polietilén glicoles de
alto peso molecular. Para las suspensiones acuosas y/o elíxires, los
compuestos de la invención pueden combinarse con varios agentes
endulzantes o saborizantes, agentes colorantes o tinciones, con
agentes emulsificantes y/o suspensores y con diluyentes tales como
el agua, el etanol, el propilén glicol, y la glicerina, así como
combinaciones de los mismos.
Los compuestos para uso en la invención pueden
también administrarse por vía parenteral, por ejemplo, por vía
intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intrameníngea,
intraventricular, intranodular, intracraneal, intramuscular, o
subcutánea, o pueden administrarse mediante técnicas de infusión. La
mejor forma de utilizarlos es como soluciones acuosas estériles que
pueden contener otras sustancias, por ejemplo, suficientes sales o
glucosa para hacer la solución isotónica con la sangre. Las
soluciones acuosas deben ser tamponeadas de manera apropiada (de
preferencia a pH desde 3 hasta 9), si fuese necesario. La
preparación de formulaciones parenterales adecuadas bajo
condiciones estériles se logra fácilmente mediante técnicas
farmacéuticas estándar, que son bien conocidas para las personas
versadas en la técnica.
Las formulaciones adecuadas para la
administración parenteral incluyen soluciones para inyección estéril
que pueden ser acuosas o no acuosas, que pueden contener
antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que hacen la
formulación isotónica con la sangre del pretendido receptor; y
suspensiones estériles acuosas o no acuosas que pueden incluir
agentes suspensores y agentes que aumentan la densidad. Las
formulaciones pueden presentarse en contenedores de dosis unitarias
o múltiples dosis, por ejemplo, ámpulas y viales sellados, y pueden
almacenarse en condiciones de congelación-secado
(liofilización), que requiere solo la adición del transportador
líquido estéril, por ejemplo, agua para inyecciones, inmediatamente
antes de su utilización. Las soluciones y suspensiones de inyección
extemporánea pueden prepararse a partir de polvos estériles,
gránulos y tabletas de los tipos antes descritos.
Para la administración oral y parenteral a los
pacientes humanos, el nivel de dosis diaria de los compuestos para
uso en la invención será, por lo regular, de 1 a 5000 mg por adulto
(o sea, de alrededor de 0.015 a 75 mg/kg), administrados en una
dosis única o dosis divididas.
Así, por ejemplo, las tabletas o cápsulas del
compuesto para uso en la invención pueden contener desde 1 mg hasta
100 mg de compuesto activo para su administración en solitario, o
dos ó más a un tiempo, según sea apropiado. El médico, en cualquier
caso, determinará la dosis real que resultará más adecuada para cada
paciente individual y que variará con la edad, el peso y la
respuesta del paciente específico. Las dosis anteriores son ejemplos
del caso promedio. Puede haber, por supuesto, casos individuales
que ameriten el uso de dosis superiores o inferiores y tales casos
se encuentran dentro del alcance de esta invención.
Los compuestos para uso en la invención pueden
ser administrados también por vía intranasal o mediante inhalación
y son convenientemente suministrados en forma de un inhalador de
polvo seco, o como presentación en un spray de aerosol en un
contenedor presurizado, una bomba, un spray o nebulizador con la
utilización de un impulsor apropiado, p.e., diclorodifluorometano,
triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, un hidrofluoroalcano
tal como el 1,1,1,2-tetrafluoroetano (HFA 134A3) o
1,1,1,2,3,3,3-heptafluoropropano (HFA 227EA3),
dióxido de carbono u otro gas apropiado. En el caso de un aerosol
presurizado, la unidad de dosificación puede determinarse mediante
la provisión de una válvula para proporcionar una cantidad medida.
El contenedor presurizada, la bomba, el spray o nebulizador pueden
contener una solución o suspensión de un compuesto activo, p.e.
usando una mezcla de etanol y el impulsor como solvente, que puede
contener adicionalmente un lubricante, p.e., trioleato de sorbitán.
Se pueden formular las cápsulas y cartuchos (hechas, por ejemplo, de
gelatina) para uso de un inhalador o insuflador, de manera que
contengan una mezcla en polvo de un compuesto de la invención y una
base de polvo apropiada, tal como lactosa o almidón.
Las formulaciones de aerosol o polvo seco, de
preferencia, se preparan de modo que cada dosis medida o
"golpe" contenga al menos 1 mg de un compuesto para uso en la
invención para su suministro al paciente. Se apreciará que la dosis
diaria completa que se administra a un paciente variará de un
paciente a otro y puede administrarse en una única dosis o, más
usualmente, en dosis divididas a lo largo del día.
Alternativamente, los compuestos para uso en la
invención pueden administrarse en forma de un supositorio o
pesario, o pueden aplicarse tópicamente, en forma de una loción,
solución, crema, pomada o polvo. Los compuestos para uso en la
invención pueden también administrarse transdérmicamente, por
ejemplo, mediante el uso de un parche de piel. También pueden
administrarse por vía ocular, en particular para el tratamiento de
enfermedades del ojo.
Para uso oftálmico, los compuestos para el uso
en la invención pueden formularse como suspensiones micronizadas
salinas estériles, isotónicas, con pH ajustado o, de preferencia,
como soluciones salinas estériles, isotónicas, con pH ajustado, de
modo opcional en combinación con un preservante tal como el cloruro
de benzalconio. De manera alternativa, se pueden formular en una
pomada como el petrolato.
Para aplicación tópica a la piel, los compuestos
para uso en la invención pueden formularse como una pomada
apropiada que contenga el compuesto activo suspendido o disuelto en
ella, por ejemplo, una mezcla con uno o más de los siguientes:
aceite mineral, petrolato líquido, petrolato blanco, propilén
glicol, compuesto de polioxietileno polioxipropileno, cera
emulsificante, y agua. De manera alternativa, se pueden formular
como una loción o crema apropiada, suspendidos o disueltos en ella,
por ejemplo, una mezcla de uno o más de los siguientes: aceite
mineral, monoestearato de sorbitán, un polietilén glicol, parafina
líquida, polisorbato 60, cera de ésteres de cetilo, alcohol de
cetearilo, 2-octildodecanol, alcohol benzílico, y
agua.
Las formulaciones apropiadas para la
administración tópica en la boca incluyen las pastillas que
comprenden el ingrediente activo en una base saborizada, usualmente
sacarosa y acacia o goma tragacantos; pastillas que contienen el
ingrediente activo en una base inerte, tal como gelatina y
glicerina, o sacarosa y acacia; y lavados bucales que contienen el
ingrediente activo en un transportador líquido apropiado.
Por lo general, en humanos, la administración
oral o tópica de los compuestos de la invención, es la vía
preferida, siendo la más conveniente. En circunstancias en las que
el receptor padece de desórdenes al tragar o de impedimento de la
absorción de fármacos tras la administración oral, se puede
administrar el fármaco parenteralmente, p.e., por vía sublingual o
bucal.
Un tercer aspecto de la invención proporciona el
uso de un compuesto que suprime la testosterona o su efecto en la
fabricación de un medicamento para proteger a pacientes de sexo
masculino de los posibles efectos adversos de un tratamiento que
involucra la inhibición de la vía de señalización de SHH en el
paciente.
Un cuarto aspecto de la invención proporciona el
uso de un inhibidor de la vía de señalización de SHH en la
fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad
proliferativa, tal como el cáncer en un paciente al que se le
administra un compuesto que suprime la testosterona o sus efectos en
el paciente.
Un quinto aspecto de la invención proporciona el
uso de un compuesto que suprime la testosterona o sus efectos en un
paciente en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de
una enfermedad proliferativa tal como el cáncer en un paciente al
que se administra un inhibidor de la vía de señalización de SHH. En
relación con los aspectos tercero, cuarto o quinto de la invención,
el orden de administración puede no resultar crítico. Por tanto, al
paciente se le puede haber administrado el inhibidor de la vía de
señalización de SHH antes de la administración del compuesto que
suprime la testosterona o sus efectos en el paciente, o se
administra el inhibidor de la vía de señalización de SHH al mismo
tiempo que el inhibidor del compuesto que suprime la testosterona o
sus efectos en el paciente, o se administra el inhibidor de la vía
de señalización de SHH después de la administración del compuesto
que suprime la testosterona o sus efectos en el paciente. Sin
embargo, es preferible que la testosterona o sus efectos se
supriman en el paciente antes de la administración del inhibidor de
la vía de señalización de SHH.
Un sexto aspecto de la invención proporciona el
uso de una combinación de un inhibidor de la vía de señalización de
SHH y un compuesto que suprime la testosterona o sus efectos en un
paciente, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento
de una enfermedad proliferativa tal como el cáncer, en un
paciente.
Un séptimo aspecto de la invención proporciona
un sistema terapéutico para el tratamiento de une enfermedad
proliferativa tal como el cáncer en un paciente, cuyo sistema
comprende un inhibidor de la vía de señalización de SHH y un
compuesto que suprime la testosterona o sus efectos en el
paciente.
Un octavo aspecto de la invención proporciona
una composición que comprende un inhibidor de la vía de señalización
de SHH y un compuesto que suprime la testosterona o sus efectos en
el paciente.
Un noveno aspecto de la invención proporciona
una composición que comprende un inhibidor de la vía de señalización
de SHH y un compuesto que suprime la testosterona o sus efectos en
un paciente para el uso en medicina. Por tanto, la composición se
empaqueta y se presenta para el uso en medicina, por ejemplo, como
un medicamento. La composición puede utilizarse en humanos o en
medicina veterinaria; preferentemente, se utiliza en medicina
humana.
Por lo regular, la composición comprende además
un transportador farmacéuticamente aceptable. Por tanto, una
composición farmacéutica (o, formulación, como se le puede llamar)
que comprende un inhibidor de la vía de señalización de SHH, un
compuesto que suprime la testosterona o sus efectos en el paciente y
un transportador farmacéuticamente aceptable, resulta útil en la
puesta en práctica de la invención. El transportador o los
transportadores deben ser "aceptables" en el sentido de ser
compatibles con la composición de la invención y no ser deletéreo
para el receptor de la misma. Por lo regular, los transportadores
serán agua o solución salina que estarán estériles y libres de
pirógenos. Por tanto, un décimo aspecto de la invención proporciona
una composición farmacéutica que comprende un inhibidor de la vía de
señalización de SHH y un compuesto que suprime la testosterona o
sus efectos en el paciente y un transportador farmacéuticamente
aceptable. Los tipos ed composiciones (o formulaciones) se
describieron anteriormente con más detalles.
El paciente es, de preferencia, un humano,
aunque el paciente puede ser cualquier mamífero, tal como un gato,
un perro, un caballo, una vaca, una oveja, un caballo, un cerdo y,
por tanto, tiene aplicaciones veterinarias.
Para el uso veterinario, un compuesto para uso
en la invención se administra como una formulación apropiadamente
aceptable de acuerdo con la práctica veterinaria normal y el
cirujano veterinario determinará el régimen de dosificación y la
vía de administración que resultarán más apropiados para el animal
específico.
En relación con los aspectos segundo, tercero,
cuarto, quinto, sexto, séptimo, octavo, noveno y décimo de la
invención, los compuestos que se prefieren con respecto al primer
aspecto de la invención también se prefieren para dichos
aspectos.
A continuación se describirá en más detalle la
invención, mediante referencia a los siguientes Ejemplos y figuras,
de los cuales:
La Figura 1 es un análisis de la distribución
del transcripto de Shh mediante hibridización in situ.
Las ribosondas control sentido y antisentido, marcadas con ^{33}P
se hibridizaron con secciones de UGT de ratas macho P0 embebidas en
parafina, de 7 \mum. (A) La imagen de campo brillante muestra las
vesículas UR, VP y seminales (SV); (B) La imagen de campo oscuro de
(A) muestra los transcriptos de Shh en el epitelio uretral
(URE) y las yemas epiteliales (VPE) de VP en desarrollo. (C, D)
muestran ampliaciones de (A, B) respectivamente. (D) muestra
transcriptos de Shh expresados en las VPE. (E) La imagen de
campo brillante muestra la UR, VP, la próstata dorsal (DP) y la
próstata dorsolateral (DLP); (F) La imagen de campo oscuro de (E)
muestran transcriptos de Shh en el URE y la yema epitelial
(DPE, DLPE, y VPE) de los lóbulos en desarrollo de DP, DLP y VP. (G,
H) muestran ampliaciones de (E, F) respectivamente. Barra de
escala, 500 \mum.
La Figura 2 es un análisis de los transcriptos
de Shh y Ptc en UGT, VP, y UR de ratas macho, mediante
un ensayo de protección por RNAsa. El RNA se hibridizó con
ribosondas marcadas con ^{32}P para Shc, Ptc y,
utilizando la Ciclofilina (Cphn) o 28S como estándares
internos. Los niveles de los transcritos se normalizaron a
Cphn o 28S. Las figuras que se encuentran debajo de las
autorradiografías muestran los % de abundancia de transcriptos,
relativos a UGT P0 (A) o VP P0 (B, C), calculados como un promedio
de tres experimentos independientes. (A) Niveles de los
transcriptos de Shh y Ptc en el UGT en desarrollo de
ratas macho. (B) Niveles de los transcriptos de Shh y
Ptc en el VP postnatal. (C) Comparación de los niveles de los
transcriptos de Shh y Ptc entre VPs y URs
postnatales.
La Figura 3 es una comparación de los niveles de
los transcriptos de Shh y Ptc entre los UGTs masculino
y femenino, y entre VPs y URs cultivados con -/+T. Las figuras que
se encuentran debajo de las autorradiografías muestran los % de
abundancia relativa de los transcriptos, relativos al UGT de machos
P0 (A) o a -T (B, C), calculados como un promedio de dos
experimentos. (A) Comparación de la abundancia de los transcriptos
de Shh y Ptc entre los UGTs masculino y femenino. (B)
Comparación de los niveles de los transcriptos de Shh y
Ptc entre VPs P0 cultivados in vitro durante seis
días con ningún medio medio de suplementación (-T), 10^{-8} M de
testosterona (+T), o durante cinco días con 10^{-8} M de
testosterona, seguidos por un tratamiento de un día con 10^{-7} M
de acetato de ciproterona (+T +CA). (C) Comparación de los niveles
de los transcriptos de Shh y Ptc entre URs de P0
hembras, cultivado durante tres días sin medio de suplementación
(-T) o con 10^{-8} M de testosterona (+T).
La Figura 4 muestra el efecto de inhibición de
la vía de señalización de SHH, mediante anticuerpos
anti-SHH, sobre el crecimiento de VP. Los VPs de P0
se cultivaron en un medio libre de suero durante cinco días en
presencia o ausencia de 10^{-8} M de T y/o 100 \mug ml^{-1}
de anticuerpo anti-SHH (5E1). (A) Imágenes completas
de VPs cultivados. Barra de escala, 1 mm. (B) Gráfico que muestra
las áreas bidimensionales promedio de VPs cultivados, relativas a
-T +/- s.e.m.
La Figura 5 muestra el efecto de la inhibición
de la señalización de SHH mediante ciclopamina sobre VPs cultivados
in Vitro. Los VPs de ratas P0 se cultivaron en medios libres
de suero, durante seis días en presencia o ausencia de 10^{-8} M
de T y/o 10^{-6} M de Cy. (A) Imágenes completas de los VPs al
sexto día del cultivo. Barra de escala, 1 mm. (B) Gráfico que
muestra las áreas bidimensionales promedio de los VPs cultivados,
relativas a -T +/- s.e.m. (C) Gráfico que muestra el número medio
de puntas de yemas epiteliales alrededor de la periferia de VPs
cultivados, expresado como un cociente relativo al perímetro del
órgano (yemas promedio por perímetro de 1000 píxeles +/- s.e.m.).
(D) Gráfico que muestra el porcentaje promedio de células
proliferativas en yemas epiteliales +/- s.e.m. (Se visualizó la
incorporación de Inset-BrdU mediante
inmunohistoquímica (verde) y se localizó en el epitelio mediante
inmunohistoquímica para la pan-citoqueratina (azul);
los núcleos se contratiñeron con yoduro de propidio (rojo).).
La Figura 6 muestra el efecto de la ciclopamina
sobre la histología de los ductos epiteliales de la próstata. Las
secciones de VPs, cultivadas durante seis días en presencia o
ausencia de T y/o Cy se tiñeron con tricromo de Masson. (A, B)
órganos cultivados con -T, (C, D) órganos cultivados con -T+Cy; la
adición de Cy en ausencia de T no alteró la aparición de puntas de
epitelio. (E, F) órganos cultivados con +T; la adición de T provocó
la canalización de áreas de los conductos proximales a los UR
(flechas). (G, H) órganos cultivados con +T +Cy; la adición de Cy
en presencia de T provocó la canalización de los conductos
prostáticos a través del órgano, y la aparición de múltiples
lúmenes en los conductos alrededor de la periferia (flechas). Barras
de escala, 50 \mum.
La Figura 7 muestra el efecto de Cy sobre la
diferenciación de las células del epitelio prostático. Se tiñeron
secciones de parafina conteniendo VPs, cultivados durante seis días
en presencia o ausencia de T y Cy, con anti-p63 (A,
C, E, G), o anticuerpos anti-citoqueratina 14 (B, D,
F, H), para examinar la diferenciación epitelial. (A, B) VPs
cultivados sin suplementación en el medio (-T) mostraron manchas de
p63 (A) y citoqueratina 14 (CK14) (B) a través de las puntas del
epitelio distal. La expresión de p63 (C) y CK 14 (D) fue similar en
los VPs cultivados con -T +Cy (C, D) y en los VPs cultivados con -T
(A, B). (E, F) VPs cultivados con +T contenían una mezcla de puntas
de epitelio distal, donde la expresión de p63 (E) y CK 14 (F) estuvo
confinada a la capa basal de células en todas las puntas. La
expresión de CK 14 (H) se redujo de manera significativa en los VPs
cultivados con -T +Cy. Barra de escala,
50 \mum.
50 \mum.
La Figura 8 muestra la inmunotinción con p63 de
la enfermedad prostática humana. Se tiñeron secciones de parafina
que contenían biopsias de aguja de próstata humana con
anti-p63 para visualizar las células del epitelio
basal. (A) Conductos normales (asterisco) o ligeramente
hiperplásicos, que muestran solo pequeñas discontinuidades de la
capa basal. (B) Expansión de la capa basal de células (flecha) en
hiperplasia epitelial benigna. (C) Hiperplasia cribiforme benigna
con múltiples lúmenes (asteriscos), expansión focal de células
basales y hendiduras localizadas. (D) PIN de grado elevado, con un
patrón cribiforme mucho más compleja, expansión del tamaño del
conducto y hendiduras regulares en la capa basal. El sarcoma
invasivo adyacente (flecha) es p63-negativo. Barra
de escala,
100 \mum.
100 \mum.
La Figura 9 muestra la inducción prostática en
el UGT de ratones y ratas Shh null, cultivadas in
Vitro con ciclopamina. (A) UGT completo de e17,5 de ratón macho
Shh null, que muestra seno urogenital (UGS), vejiga (BL) y
el intestino posterior (HG). UGS de e17,5 de ratón macho Shh
null antes (B) y después (C), cultivado in vitro durante 5
días; las flechas muestran las yemas prostáticas. UGS de e16,5 de
rata macho cultivado in vitro durante 7 días, sin medio
suplementado (D), +T (E) o +T +Cy (F); las flechas muestran las
yemas prostáticas. Las barras de escala mostradas tienen 1 mm.
La Figura 10 muestra el efecto de la proteína
SHH recombinante exógena sobre VPs cultivados in vitro. Los
VPs de ratas P0 se cultivaron in vitro durante 3 días -/+ T
-/+ SHH recombinante. (A) Imágenes completas de VPs en el tercer
día del cultivo. Barra de escala, 1 mm. (B) Gráfica que muestra las
áreas bidimensionales promedio de VPs relativas a -T +/- s.e.m. (C)
Gráfico que muestra el número medio de yemas epiteliales alrededor
de la periferia de VPs cultivados, expresado como cociente respecto
al perímetro del órgano (yemas promedio por perímetro de 1000
píxeles +/- s.e.m.). (D) Gráfico que muestra el porciento promedio
de células proliferativas en las yemas del epitelio distal (a los 3
días) y el mesénquima que lo rodea (a los 2 días) +/- s.e.m.
La Figura 11 muestra la estructura del AY9944,
el triparanol, la jervina, al ciclopamina, la formatidina y el
colesterol.
La Figura 12 muestra la estructura del Compuesto
A de WO 02/30462.
La Figura 13 muestra la estructura del Compuesto
B de WO 02/30462.
Ejemplo
1
La vía de señalización de SONIC HEDGEHOG (SHH)
media la señalización entre el epitelio y el mesénquima en varios
tejidos, durante el desarrollo y la enfermedad. La organogénesis de
la próstata depende tanto de los andrógenos como de la señalización
epitelio-mesenquimal, y hemos investigado el papel
de al señalización de SHH en el desarrollo de la próstata ventral
(VP) de la rata. Nuestros datos sugieren que la señalización de SHH
es importante para el crecimiento, la ramificación, y la mitogénesis
de la VP y para la diferenciación del epitelio prostático. Hemos
demostrado que la expresión de Shh y Ptc en la VP no
está regulada por los andrógenos. La señalización de SHH se
interrumpió mediante anticuerpos anti-SHH o mediante
ciclopamina, y ambos tratamientos inhibieron el crecimiento de la
VP in vitro. La inhibición de la señalización de SHH provocó
un incremento del número de puntas de conductos, y una reducción de
la mitogénesis del epitelio de las puntas de los conductos. En
presencia de testosterona, la disrupción de la señalización de SHH
aceleró la canalización de los conductos del epitelio prostático, y
provocó la ocurrencia de conductos que mostraban algunas similitudes
con la neoplasia intraepitelial prostática (PIN). Se examinó la
diferenciación epitelial utilizando p63 y citoqueratina 14 (CK 14)
como marcadores, que probaron la ocurrencia de una diferenciación
precoz y aberrante de las células epiteliales de las puntas
distales. En conclusión, mostramos que es necesaria la señalización
de SHH para el crecimiento prostático, y que el crecimiento
estimulado por andrógenos en ausencia de señalización de la vía de
SHH provoca una diferenciación epitelial aberrante
reminiscente
del PIN.
del PIN.
Se micro-disecaron tractos
urogenitales (UGTs) enteros, VPs y URS tanto de ratas Wistar no
singénicas, como de ratones Shh null, o sus contrapartes
salvajes en un fondo CD 1 no singénico (Chiang et al (1996)
Nature 383, 407-413), donde el día de
la observación de la unión copulatoria se tomó como e0.5 y el día
del nacimiento se designó P0. El ARN total se preparó como está
descrito (Chomczynski y Sacchi, 1987).
Se sintetizaron moldes de ADN para las
ribosondas de Shh y Ptc mediante
RT-PCR a partir del ADNc de UGT de P0 y se
subclonaron en plásmidos pBluescript KSII+ (Stratagene, USA). Se
diseñaron cebadores de PCR utilizando las secuencias de DANc
publicadas en GenBank (Shh: No. de Acceso de GenBank
NM_017221; Cebadores: L-ACCGCAGCAAGTATGGCA (ID SEC
No 1), R-TCCAGGAAGGTGAGGAAG (ID SEC No 2);
Ptc No. de Acceso de GenBank AF079162; Cebadores:
L-GCATTGGCAGGAGGAGTTGATTGTG (ID SEC No 3),
R-CCACTCGGAT
GACACTGACA (ID SEC No 4)). Los moldes de AFN para las ribosondas de Ciclofilina (Cphn) y 28S procedían de Ambion, Inc., USA. Se transcribieron las ribosondas antisentido marcadas con ^{32}P, y se llevaron a cabo los ensayos de protección a la RNAsa como se describió en detalle anteriormente (Thomson et al., 1997). Los productos protegidos contra la RNasa obtenidos a partir de las ribosondas de Shh, Ptc, Cphn y 28S tenían 296 nucleótidos (nt), 322 nt, 103 nt y 155 nt respectivamente. Se revelaron los geles utilizando un fósforoimagenólogo (Molecular Dynamics, USA) y se determinó la abundancia de transcriptos a partir de las intensidades de las bandas, calculadas utilizando ImageQuant V.1.2 (Molecular Dynamics, USA). Las abundancias de los transcriptos se normalizaron a los estándares internos de Cphn o 28S (28S se utilizó como estándar interno en las muestras postnatales, ya que se encontró que la expresión de Cphn disminuía considerablemente con la edad).
GACACTGACA (ID SEC No 4)). Los moldes de AFN para las ribosondas de Ciclofilina (Cphn) y 28S procedían de Ambion, Inc., USA. Se transcribieron las ribosondas antisentido marcadas con ^{32}P, y se llevaron a cabo los ensayos de protección a la RNAsa como se describió en detalle anteriormente (Thomson et al., 1997). Los productos protegidos contra la RNasa obtenidos a partir de las ribosondas de Shh, Ptc, Cphn y 28S tenían 296 nucleótidos (nt), 322 nt, 103 nt y 155 nt respectivamente. Se revelaron los geles utilizando un fósforoimagenólogo (Molecular Dynamics, USA) y se determinó la abundancia de transcriptos a partir de las intensidades de las bandas, calculadas utilizando ImageQuant V.1.2 (Molecular Dynamics, USA). Las abundancias de los transcriptos se normalizaron a los estándares internos de Cphn o 28S (28S se utilizó como estándar interno en las muestras postnatales, ya que se encontró que la expresión de Cphn disminuía considerablemente con la edad).
Se llevó a cabo la hibridización in situ
en secciones embebidas en parafina de 7 \mum utilizando un
procedimiento ligeramente modificado a partir de protocolos
anteriormente descritos (Forman et al., 1990; Thomson y
Cunha, 1999). Se sintetizaron ribosondas antisentido y sentido,
control marcadas con ^{33}P, utilizando el mismo molde de ADN de
Shh y el mismo método que para la protección de RNasa. Se
sumergieron las láminas en emulsión G.5 (Ilford, UK) y se revelaron
de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las secciones se
examinaron utilizando microscopía de campo brillante y de campo
oscuro.
Se llevó a cabo un cultivo de órganos libre de
suero de VPs de rata Wistar P0, como se describió anteriormente
(Sugimura et al., 1996). Se suplementó el medio de cultivo
con 10^{-8} M de testosterona y/o 1 \muM, 5 \muM, o 10 \muM
de ciclopamina, o 100 \mug ml^{-1} de anticuerpo
anti-SHH (clon 5E1, Developmental Studies Hybridoma
Bank, University de Iowa, o 0.2 \mug/ml de proteína SHH
recombinante (Research Diagnostics, USA)). Se determinó el área
bidimensional y el perímetro de los órganos a partir de imágenes
capturadas en vivo utilizando el software de imágenes del NIH.
Se examinó la histología de secciones mediante
tinción por tricromo (Masson, 1929), o mediante tinción
inmunohistoquímica. Para la tinción con CK14 y p63, con detección
por diaminobenzamide (DAB), se cocinaron a presión las secciones,
en 10 mM de ácido cítrico, a pH 6.0 durante 2 minutos, antes de
seguir un protocolo publicado con anterioridad (Thomson et
al., 2002). El anticuerpo anti-CK14 se diluyó
1:100 y el anticuerpo anti-p63 (Santa Cruz
Biotechnologies Inc., USA) se diluyó 1:500. Se llevó a cabo la
localización inmunohistoquímica de BrdU y pancitoqueratina como se
ha descrito con anterioridad (Thomson et al., 2002),
utilizando una dilución1:300 del anticuerpo
anti-BrdU (Fitzgerald Industries Internacional
Inc., USA) y una dilución 1:200 del anticuerpo
anti-pancitoqueratina (Sigma, UK). Se detectó BrdU
mediante Alexofluor 488 (Molecular Probes Inc., USA) y se detectó la
pancitoqueratina con Cy5 (Amersham Biosciences, UK). Se calcularon
los índices mitóticos mediante el conteo del número de células
epiteliales positivas para pancitoqueratina que eran también
positivas para BrdU.
Se localizaron los transcriptos de Shh en
el epitelio uretral (URE), y los epitelios de la próstata ventral
en desarrollo (VPE), la próstata dorsal (DPE) y la próstata
dorsolateral (DLPE) de UGTs de machos P0, mediante hibridización
in situ (Fig. 1.). No se observaron los transcriptos de
Shh en el estroma del UGT. No se observó ninguna señal
usando una ribosonda sentido control (datos no mostrados).
Se examinaron los patrones de expresión temporal
de los ARNm de Shh y Ptc, mediante el ensayo de
protección de RNasa (Fig. 2). Los trancriptos de Shh y
Ptc eran más abundantes a e18,5 en el UGT de machos (Fig.
2A). Los niveles de los transcritos fueron bajos entre e19.5 y
e21.5, pero se elevaron a P0. Los niveles de los transcriptos de
Shh y Ptc fueron más elevados en el VP que en el UGT a
P0, lo que puede haberse debido a variación en las proporciones de
epitelio en estos tejidos. No pudo practicarse el análisis de los
transcriptos de Shh y Ptc en el VP antes de P0 debido
a dificultades en la microdisección de VP, ya que el rudimento del
órgano es pequeño y difícil de separar del UR.
En la VP postnatal los niveles de los
transcriptos de Shh y Ptc decrecieron al incrementarse
la edad (Fig. 2B). Los ARNm de Shh y Ptc fueron más
abundantes a P0 y P2, pero a la altura de P6, dichos niveles eran
cuatro veces menores que en P0. Los transcriptos de Shh y
Ptc eran casi indetectables a P20, cuando el crecimiento de
la VP se desacelera rápidamente, y están ausentes en adultos.
Una comparación de los niveles de los
transcriptos de Shh y Ptc entre la VP y la UR de ratas
macho postnatales mostraron que los transcriptos eran más
abundantes en la VP que en la UR de P0 a P2, pero que a la altura
de P4 esta situación se había revertido (Fig. 2C). A diferencia de
lo que sucede en la VP, la expresión en la UR se mantuvo más allá
de P20, separando las vías de desarrollo de estas estructuras.
Dado que el desarrollo de la próstata solo
ocurre en los machos, y se ha reportado regulación positiva
específica para los machos del ARNm de Shh en el UGS de
ratón (Podlasek et al., 1999), se compararon los niveles de
los transcriptos de Shh y Ptc entre los UGTs de ratas
machos y hembras (Fig. 3A). El análisis de RPA mostró que la
expresión de ARNm de Shh y Ptc era aproximadamente dos
y media veces mayor en las hembras que en los machos a e17.5,
mientras que a P0 y P6, los niveles de los transcriptos eran
similares en ambos sexos. A P20, la expresión de los transcriptos
de Shh y Ptc era mínima en los machos, pero se
mantenía aun en las hembras.
Los RPAs se llevaron a cabo para analizar los
niveles de los transcriptos de Shh y Ptc en las VPs y
los URs cultivados in Vitro. Las VPs se cultivaron durante
seis días, en presencia o ausencia de T; o durante cinco días con
T, seguidos por un tratamiento de un día con el antagonista de AR
acetato de cipropterona (Fig. 3B). No se observaron diferencias
significativas en la abundancia de transcripto para Shh ni
para Ptc. De manera similar, en lo cultivos de corto plazo
de VPs (durante siete horas o tres días) no se observaron cambios en
los niveles de transcriptos (datos no mostrados). El análisis de
los niveles de transcriptos en los URs microdisecados a partir de
UGTs femeninos, cultivados durante tres días en presencia o ausencia
de T, mostraron un incremento de dos veces y media en los niveles
de los transcriptos de Shh (Fig. 3C), aunque no se observaron
cambios significativos en los niveles de los transcriptos de
Ptc.
Se cultivaron VPs P0 in Vitro durante
cinco días en presencia (+) o ausencia (-) de T y con (+) o sin (-)
100 \mug ml^{-1} de anticuerpo anti-SHH (5E1)
(Fig. 4A), después de lo cual se midieron sus áreas bidimensionales
(Fig. 4B). La adición de 5E1 a los cultivos redujo el crecimiento de
la VP en 20%, tanto en -T, como en +T (o con un control de IgG no
específico, datos no mostrados). Estos datos proporcionan evidencias
que apuntan a un rol directo de la señalización de SHH en el
crecimiento de la VP, y demuestra que es probable que la
señalización a través de PTC/SMO dependa de SHH como ligando (en la
VP).
Dado que resultaba poco práctico obtener grandes
cantidades del anticuerpo 5E1, un estudio más abarcador de la
señalización por SHH en el crecimiento de la VP se llevó a cabo
utilizando el alcaloide esteroideo ciclopamina (Cy), que bloquea la
señalización a través de PTC/SMO (Incardona et al., 1998).
Las VPs P0 se cultivaron durante seis días -/+T, y -/+Cy (Fig. 5A),
y se midieron sus áreas bidimensionales (total de 100 VPs de cada
uno de los cuatro grupos de tratamiento, y 21 experimentos
independientes) (Fig. 5B). Los experimentos de respuesta a la dosis
mostraron que al concentración óptima de Cy para la inhibición del
crecimiento era 1 \muM. Los cultivos llevados a cabo utilizando
0,1 \muM de Cy mostraron poco o ningún efecto, mientras que 10
\muM de Cy, aparentemente resultaba tóxico, provocando una muerte
prematura de los órganos (datos no mostrados). La disrupción de la
señalización por SHH con Cy inhibió de manera significativa el
crecimiento de la VP en presencia y ausencia de T. La adición de Cy
a órganos cultivados con -T provocó una reducción del crecimiento
de 16% (-T vs. -T+Cy; t de Student, P = 3,0e^{-14}), y Cy redujo
el crecimiento de las VPs cultivadas con +T en un 27% (+T vs.
+T+Cy; t de Student, P = 1,4e^{-34}). Por tanto, al usar
ciclopamina, la inhibición de la señalización por SHH tuvo un
efecto mayor sobre la VP cultivada en presencia de T. Tanto
el anticuerpo 5E1 anti-SHH, como Cy causaron una reducción de 50% en el crecimiento inducido por T en las VPs.
el anticuerpo 5E1 anti-SHH, como Cy causaron una reducción de 50% en el crecimiento inducido por T en las VPs.
Decidimos llevar a cabo el análisis del efecto
de Cy sobre los epitelios prostáticos de VPs cultivadas in
vitro. Se contaron las puntas de las yemas epiteliales situados
en la periferia de las VPs (total de 60 VPs de cada uno de cuatro
grupos de tratamiento y 16 experimentos independientes) y se
expresaron como el cociente con respecto al perímetro del órgano,
para tomar en cuenta los cambios en el tamaño del órgano después de
los tratamientos (Fig. 5C). La adición de Cy a los órganos
cultivados con -T provocó un incremento significativo en el número
de puntas periféricas por unidad de perímetro (-T = 60,16 +/- 0,97
puntas de yemas promedio por unidad de perímetro, contra -T+Cy =
74,47 +/- 1,07; t de Student, P = 1,31e^{-17}). El incremento en
el número de puntas observadas en -T+Cy fue similar al observado
solo con +T (+T = 71,8 +/- 0,83), sin embargo, la adición tanto de
T como de Cy a los cultivos no tuvo un efecto aditivo sobre en
número de puntas periféricas (+T+Cy = 69,84 +/- 1,13). Es posible
que el número de puntas inducidas por T o por Cy fuera el máximo
para el sistema in vitro, por tanto, los efectos aditivos
pueden no resultar evidentes debido a las limitaciones del sistema.
La adición de Cy a los órganos cultivados con +T redujo de modo
ligero el número de puntas periféricas, en comparación con las VP
cultivadas solo en +T. Sin embargo, dicha reducción mostró baja
significación estadística (t de Student, P = 0,08). Un incremento
en el número de puntas periféricas se observó también en las VPs
cultivadas con el anticuerpo anti-SHH (5E1) en
ausencia de T (-T = 62,13 +/- 0,82 vs. -T +5E1 = 93,03 +/- 1,08),
con un número similar de puntas periféricas observado entre las VPs
cultivadas con +T y las cultivadas con +T+5E1 (+T = 74,32 +/- 0,69
vs. +T+5E1 = 79,21 +/- 1,28).
Se utilizó la incorporación de BrdU para
identificar la proliferación de células epiteliales en VPs
cultivadas con -/+T y -/+Cy, y para calcular un índice mitótico
(Fig. 5D). Se añadió BrdU a las VPs (cuatro experimentos, nueve
organismos en cada grupo de tratamiento) al sexto día del cultivo, y
se visualizó su incorporación mediante inmunohistoquímica. Se
confirmó la localización de BrdU en el epitelio mediante
inmunohistoquímica para pancitoqueratina (Fig. 5D, interior). El
porcentaje de células proliferativas se obtuvo a partir de tres
imágenes de las puntas periféricas de los órganos (distal), y tres
imágenes de los conductos más cercanos a la uretra (proximal),
totalizando 27 conteos distales y proximales para cada grupo de
tratamiento. Se observó una reducción significativa en la
proliferación en las puntas epiteliales distales de los órganos
cultivados con +Cy, tanto -T como +T (-T = 18,92% +/- 1,48% de
núcleos mitóticos, vs. -T+Cy = 13,48% +/- 0,93%, t de Student, P =
0,002; +T = 23,24% +/- 1,86% vs. +T+Cy = 16,28% +/- 0,74%, t de
Student, P = 0,0005). No se observaron diferencias significativas
en el porcentaje de células proliferativas en los conductos
proximales a la UR en respuesta a Cy (datos no mostrados). También
se demostró que aunque T incrementó la proliferación de las puntas
distales, se redujo la proliferación en los conductos proximales.
Concluimos que la inhibición de la señalización por SHH reduce la
velocidad de la proliferación de las células epiteliales en las
puntas de crecimiento de la VP. Por tanto, el número incrementado
de puntas distales que se observa en el grupo que recibió el
tratamiento -T+Cy no se debió a una proliferación incrementada de
las células epiteliales, sin, con mayor probabilidad, a un aumento
de la ramificación.
Los conductos prostáticos crecen, al comienzo,
como cuerdas sólidas, que luego canalizan, dando como resultado
conductos que contienen lúmenes. La canalización ocurre en una
dirección de proximal a distal (o sea, de la UR hacia afuera), y
puede ser el resultado de la diferenciación de las células
epiteliales (Hayward et al., 1996). Después del crecimiento
in Vitro, los lúmenes se encontrarían normalmente presentes
en los conductos proximales a la UR (Fig. 6E), pero no en las
puntas distales. Se observaron lúmenes en los conductos proximales
de las VPs en todos los grupos de tratamiento, pero las VPs
cultivadas con +T+Cy también presentaban lúmenes en las puntas
distales (Fig. 6G,H). También se observó que la morfología de los
conductos no era normal en las VPs cultivadas con +T+Cy. Los
conductos prostáticos normales en las ratas constan de células
luminales secretoras con células basales subyacentes, formando un
lumen único. La arquitectura de los conductos periféricos de las
VPs cultivadas con +T+Cy era más compleja, con entrecruzamientos
epiteliales que producían la apariencia de múltiples lúmenes y
algunas expansiones en el conducto. Esta apariencia cribiforme solo
se encontraba presente de manera focal en las VPs de los otros
grupos de tratamiento.
Las células epiteliales indiferenciadas de la
próstata en las puntas de crecimiento expresan de manera uniforme
la citoqueratina 14 (CK14) (Hayward et al., 1996) y la p63
(Parsons et al., 2001; Wang et al., 2000). A medida
que las células epiteliales se diferencian la expresión de CK14
(Hayward et al., 1996) y p63 (Parsons et al., 2001;
Wang et al., 2000) queda confinada a la capa basal de
células. Investigamos la localización de CK14 y p63 en VPs
cultivadas in vitro con -/+T y -/+Cy (Fig. 7).
La expresión de p63 era abundante en el tejido
epitelial de las puntas distales de los órganos cultivados con -T
(Fig. 7A), con -T+Cy (Fig. 7C) y con +T (Fig. 7E). La mayoría de las
puntas epiteliales distales en estos órganos mostraron una tinción
uniforme para p63, característica del estado indiferenciado, en
tanto que en otras hubo un incremento en el número de células p63
positivas hacia la membrana inferior. En contraste, en las VPs
cultivadas con +T+Cy, la expresión de p63 estaba confinada a la capa
basal de células de todas las puntas distales (Fig. 7G). La
expresión de p63 estaba localizada en la capa basal de células
epiteliales en los conductos proximales de las VPs de todos los
grupos de tratamiento
La expresión de CK14 mostró similitudes con la
de p63, aunque aparecieron menos células basales CK14 positivas que
p63 positivas. La mayoría de las puntas distales de las VPs
cultivadas en -T (Fig. 7B) y -T+Cy (Fig. 7D) expresaron
ampliamente CK14, al igual que las células epiteliales
indiferenciadas. Se observaron puntas distales tanto con expresión
uniforme de CK14 como con una capa definida de células basales que
expresaban CK14 en las VPs cultivadas con +T (Fig. 7F). Las VPs
cultivadas con +T+Cy mostraron muy pocas células CK14 positivas en
las puntas distales (Fig. 7H), en contraste con la abundancia
relativa de células p63 positivas. La expresión de CK14 estuvo
confinada a la capa basal de células en los conductos proximales de
las VPs de todos los grupos de tratamientos.
Se tiñeron biopsias de aguja de próstatas
humanas con una variedad de lesiones benignas, premalignas y
malignas, con anticuerpos anti-p63 para comparar
con nuestras VPs cultivadas (Fig. 8). Los conductos prostáticos
humanos normales tenían una única capa de células basales p63
positivas y células luminales p63 negativas, que formaban un único
lumen (Fig. 8A). La tinción anti-p63 mostró una
expansión del compartimiento de las células basales en la
hiperplasia epitelial benigna (Fig. 8B). Los conductos prostáticos
humanos que mostraban evidencias de una PIN de alto grado
presentaban una única capa discontinua de células basales p63
positivas. Las células luminales del conducto formaban un patrón
complejo, cribiforme de entrecruzamiento epitelial que daba la
apariencia de múltiples lúmenes, y expandía el conducto (Fig. 8C).
No había células basales p-63 positivas en el
adenocarcinoma invasivo (Fig. 8D). Se notaron similitudes entre la
morfología de las VPs cultivadas en +T+Cy (Fig. 7G) y la PIN humana
de alto grado (Fig. SC).
No se requiere la señalización de HH para la
inducción prostática. Se microdisecaron los UGTs de ratones
Shh null e17,5; los UGTs de ratones Shh null eran más
pequeñas que las de sus contrapartes de tipo salvaje (no mostrado),
y el intestino posterior era continuo con la vejiga (Fig. 9A). Dado
que la próstata no se encontraba bien desarrollada en los machos
mutantes (Fig. 9B) ni en los de tipo salvaje en este período, se
cultivaron explantes de UGS tanto de ratones Shh null como
de sus contrapartes, in vitro para determinar si se podía
inducir la gemación prostática (n = 3). Se presentaron las yemas
prostáticas al cabo de 3 días y aparecieron aumentadas después de 5
días tanto en los explantes provenientes de Shh null, como en
los de sus contrapartes (no mostrado). El Indian hedgehog
(Ihh) se expresa en la VP a niveles mucho más bajos que
Shh, mediante RT-PCR (datos no mostrados) y
resultaba posible que un incremento de Ihh (u otro miembro de
la familia Hh) pudiese haber compensado la ausencia de SHH
en los explantes de UGT de ratones Shh null. Por tanto, se
cultivaron in vitro explantes de UGS de ratas e16,5 durante
7 días -/+T y con -/+ 1 \muM, 5 \muM o 10 \muM de ciclopamina
(Cy) (n = 4), que bloquea la vía de señalización a través de
Smoothened y, por tanto, a todos los ligandos de la familia
Hh (Chen et al (2002) Genes Dev 16,
2743-2748; Incardona et al (1998)
Development 125, 3553-3562). No se
observaron yemas prostáticas en los explantes cultivados en -T (Fig.
9D); los buds prostáticos estaban presentes en explantes cultivados
con +T (Fig. 9E) y con +T+1 \muM de Cy (Fig. 9F) a niveles
similares. También estaban presentes yemas prostáticas en explantes
cultivados con +T +5 \muM Cy y con +T +10 \muM Cy (datos no
mostrados), aunque estas concentraciones de Cy eran tóxicas y
provocaban la muerte prematura de los órganos.
Efecto del SHH exógeno sobre el crecimiento y
la ramificación de la VP. Se examinaron los efectos de añadir
SHH recombinante a VPs cultivadas in vitro (Fig. 10). Se
cultivaron VPs durante 3 días con -/+T y -/+ proteína SHH
recombinante (n = 6). La adición de SHH a los cultivos provocó la
expansión del mesénquima alrededor de la periferia de las VPs,
tanto -T, como +T (Fig. 10A). La medición del área bidimensional de
las VPs cultivadas (n = 6, 14 VPs de cada grupo de tratamiento)
mostró que la adición de SHH provocó una ligera reducción en el
crecimiento general de la VP, tanto en -T, como en +T, que mostró
baja significación estadística (-T vs. -T+SHH % área = 100 +/- 3,56
vs. 90,12 -/+ 5,26, t de Student, P=0,07; +T vs. +T+SHH % área =
127,05 +/- 5,12 vs. 123,03 +/- 6,75, t de Student, P = 0,32) (Fig.
10B).
Se contó el número de puntas de yemas
periféricas de las VPs cultivadas, y se expresó como un cociente con
respecto al perímetro (Fig 10C). La adición de SHH a los cultivos
redujo de manera significativa el número de puntas de yemas
periféricas, tanto en -T, como en +T, teniendo, por tanto, un efecto
opuesto a la inhibición de la señalización de HH con Cy (-T vs.
-T+SHH promedio de puntas de yemas por perímetro de 1000 píxeles =
68,65 +/- 2,62 vs 48,09 +/- 3,35, t de Student, P = 3,13e^{-5};
+T vs. +T+SHH = 83,92 +/- 2,25 vs. 68,34 +/- 2,57, t de Student, P
= 5,37e^{-5}).
Se calculó el índice proliferativo de los
compartimientos celulares del epitelio y el mesénquima para las VPs
cultivadas con -/+T y con -/+SHH después de la adición de BrdU (Fig.
10D). Se calculó el índice de marcado epitelial el tercer día del
cultivo, mientras que el índice de marcado mesenquimal se calculó el
segundo día del cultivo, dado que nuestros datos indicaban que los
efectos sobre la proliferación del mesénquima eran más pronunciados
el día 2 en comparación con el día 3. En las VPs cultivadas con -T,
el SHH redujo la proliferación celular epitelial en un tercio (-T
vs. -T+SHH % de núcleo proliferativos = 27,95% +/- 1,15% vs. 18,62%
+/- 2,06%, t de Student, P = 1,84e^{-4}), pero solo en un 6% en
las VPs cultivadas en +T, lo que no resultó estadísticamente
significativo (+T vs. +T+SHH % de núcleos proliferativos = 32,54%
+/- 1,65% vs. 30,46% +/- 1,72%, t de Student, P = 0,19). En el
mesénquima, el SHH estimuló la proliferación en presencia o ausencia
de T (-T vs. -T+SHH % de núcleos proliefrativos = 14,96% +/- 0,89%
vs. 19,45% +/- 1,12%, t de Student, P = 0,002; +T vs. +T+SHH % de
núcleos proliferativos = 17,51% +/- 1,22% vs. 20,47% +/- 1,07%, t
de Student, P = 0,056).
Hemos demostrado aquí que la señalización de SHH
regula el crecimiento de la próstata, el epitelio prostático y la
diferenciación epitelial. La inhibición de la señalización por SHH
retardó el crecimiento de las VPs cultivadas in vitro, y
redujo la mitogénesis, e incrementó el número de puntas de conductos
en los epitelios prostáticos en crecimiento. En presencia de T, la
inhibición de la señalización por SHH produjo diferenciación
aberrante en los epitelios prostáticos. Proponemos que la
señalización por SHH es un regulador esencial de las interacciones
epitelio-mesénquima en la próstata.
Las interacciones recíprocas
epitelio-mesénquima desempeñan un rol esencial en el
direccionamiento del crecimiento de la próstata durante el
desarrollo y la enfermedad (Cunha y Chung, 1981; Gao et al.,
2001; Olumi et al., 1999). Bajo condiciones de desarrollo
normales, el crecimiento epitelial es controlado mediante la
señalización regulada por andrógeno proveniente del mesénquima
(Cunha y Chung, 1981), aunque el mecanismo exacto de esto permanece
oscuro. Este control paracrino del crecimiento epitelial se mantiene
en la próstata adulta normal, aunque en el cáncer de próstata
aparentemente el control androgénico del epitelio es autocrino (Gao
et al., 2001). Por el contrario, la señalización paracrina
del epitelio determina el patrón de diferenciación estromal durante
el desarrollo de la próstata, y mantiene el mesénquima/estroma en la
próstata adulta normal (Cunha et al., 1996; Hayward et
al., 1998). Se propone como hipótesis, que los carcinomas de
próstata poseen señalización paracrina alterada desde el epitelio,
dado que las células epiteliales parecen incapaces de
inducir/mantener la diferenciación del mesénquima/estroma (Cunha
et al., 1996).
Hasta el momento, las vías de señalización
identificadas para regular las interacciones
epitelio-mesénquima en el crecimiento prostático,
no son específicas de la próstata. La vía de señalización de SHH
regula las relaciones epitelio-mesénquima durante
el desarrollo de muchos órganos. En el UGT de los ratones, la
Shh se expresa en el epitelio del UGS (Bitgood y McMahon,
1995; Podlasek et al., 1999) y es esencial para la formación
de los genitales externos (Haraguchi et al., 2001; Perriton
et al., 2002). También se ha demostrado que la inhibición de
la señalización de SHH mediante el bloqueo por anticuerpos abroga la
morfogénesis de las ramificaciones de la próstata (Podlasek et
al., 1999).
El patrón de expresión espacial y temporal de
Shh en el UGT de ratas machos sugería un rol para Shh
en el crecimiento y desarrollo de la VP. Los transcriptos de
Shh se localizaron en el epitelio uretral y en las yemas
epiteliales de los lóbulos prostáticos en desarrollo de machos P0,
en concordancia con estudios anteriores de la distribución de
transcriptos de Shh (Bitgood y McMahon, 1995; Podlasek et
al., 1999). Los RPAs mostraron que los transcriptos de
Shh y Ptc eran más abundantes en e18,5, en correlación
con el sobrecrecimiento visible del epitelio uretral hacia la
almohadilla mesenquimal ventral (VMP), que define el comienzo del
desarrollo de la VP. Los niveles de transcriptos de Shh y
Ptc eran nuevamente elevados a P0, asociados al aumento del
crecimiento y la ramificación de la VP que ocurre en el período
neonatal. Se encontró que el patrón de expresión temporal de
Shh y Ptc en el UGT de machos reflejaba el de
Bmp4. Bmp4, un posible efector downstream de la
señalización de Shh (Bitgood y McMahon, 1995) se expresa en
el mesénquima que rodea las yemas epiteliales de la próstata (Lanun
et al., 2001). Se ha demostrado la coexpresión de Shh
y Bmp4 en varios sitios de interacción epitelio mesénquima,
incluyendo el UGS (Bitgood y McMahon, 1995). En la VP perinatal, se
observaron elevados niveles de transcriptos de Shh y
Ptc en el período de crecimiento y ramificación neonatal
temprano. Estos niveles decaían después de P6, de manera que los
transcriptos se hacían prácticamente indetectables hacia P20,
cuando el crecimiento de la VP se desacelera significativamente
hasta alcanzar la quiescencia en la adultez (Sugimura et
al., 1986). El patrón de expresión temporal de Shh y
Ptc en la VP se correlaciona con el de Fgf10, que se
expresa en el mesénquima alrededor de los buds epiteliales en
crecimiento (Thomson y Cunha, 1999).
Se compararon los niveles de los transcriptos de
Shh y Ptc entre la VP y la UR de machos postnatales.
Mientras los niveles de los transcriptos decrecieron en la VP a
medida que se aproximaba la adultez, la expresión de UR se mantuvo
a niveles similares a todo lo largo del desarrollo. Por tanto, las
vías del desarrollo de la VP y la UR aparentemente son separadas.
Estos datos sugieren que la señalización de SHH es necesaria para
el crecimiento y la ramificación de la VP, y proponemos que puede
ser necesaria la señalización de SHH mantenida para el continuado
elongamiento de la UR en la adultez, o para la formación de las
glándulas uretrales. Nuestros datos sugieren también que los altos
niveles de trasncriptos de Shh reportados en el UGS de
ratones macho postnatales (Podlasek et al., 1999) puede
haberse originado en la UR.
Las comparaciones de los niveles de transcriptos
entre el UGT masculino y femenino demostraron que en este último
existen niveles dos y media veces superiores de los ARNm de
Shh y Ptc que en el primero, a e17,5. Los niveles de
los transcriptos fueron similares a P0 y P6, pero a P20 había
significativamente más transcriptos de Shh y Ptc en
la hembra que en el macho. El nivel elevado de los transcriptos en
las hembras P20 con respecto a los machos puede ser el reflejo de
las diferencias anatómicas en nuestra definición del UGT. Aquí,
definimos el UGT femenino como UGS (o sea, UR) solamente, y el UGT
masculino, como UGS más lóbulos prostáticos y SVs acompañantes. Por
tanto, nuestras muestras de ARN de UGTs femeninos contienen una
proporción superior de ARN uretral que nuestras muestras de ARN de
los UGTs masculinos. Dado que la UR mantiene la expresión de los
ARNm de Shh y Ptc hasta al menos P20 (Fig. 2C), los
niveles más elevados de transcriptos de Shh y Ptc en
una muestra de UGT femenino podrían deberse a una proporción
relativa superior de ARN uretral. Se encontró que nuestros datos
contradecían los de Podlasek et al (1999) que reportaron una
expresión siete veces superior de Shh en el UGS masculino
que el femenino de ratones e19 (Podlasek et al., 1999). La
inclusión de la vagina en desarrollo dentro del UGT, con la
consiguiente dilución de la abundancia de los transcriptos de
Shh en la muestras de ARN femenino, en el estudio de
Podlasek et al (1999), podría explicar estas
discrepancias.
Para determinar si la señalización de SHH era
regulada por andrógenos en la VP, se compararon los niveles de
transcriptos de Shh y Ptc entre VPs cultivadas in
vitro durante seis días en -/+T, o durante cinco días en +T
seguido por un día con el antagonista de AR, acetato de ciproterona.
No se observó ninguna diferencia significativa en los niveles de
los transcriptos en este período de tiempo, o entre órganos tratados
con -/+T durante siete horas o tres días (datos no mostrados). Esto
indicó que es poco probable que la expresión de ARNm de Shh
y Ptc dependa de los andrógenos en la VP. En un estudio
anterior demostramos que FGF10 también actúa de manera
independiente de la acción del andrógeno en el crecimiento de la VP
(Thomson y Cunha, 1999). Esto sugiere que, mientras que se conoce
que el desarrollo de la próstata depende de los andrógenos, el
mecanismo puede ser indirecto sobre algunas vías de señalización.
Recientemente hemos demostrado que las interacciones
epitelio-mesénquima durante la inducción prostática
pueden ser reguladas por andrógenos que controlan la diferenciación
de la capa de musculatura lisa (Thomson et al., 2002).
Podlasek et al., reportaron un incremento
de cinco veces en los transcriptos de Shh en explantes de UGS
de ratones macho e15, cultivados durante tres días con
dihidrotestosterona. Esto podría ser específico para el UGS, dado
que la expresión del receptor de andrógeno (AR) no aparece en las
yemas epiteliales prostáticas hasta el nacimiento (Hayward et
al., 1996). En concordancia con esto, reportamos un incremento
de dos veces y media de los transcriptos de Shh en respuesta
a T en las URs de los UGTs femeninos. Esto no era igualado por el
incremento de Ptc, lo que ponía en entredicho el significado
funcional de la observación.
Se ha observado que los ratones Shh null
no expresan Nkx3.1 en el UGS (Schneider et al., 2000).
Mkx3.1 es el marcador más temprano conocido del epitelio
prostático prospectivo, y se expresa exclusivamente en el UGS
masculino, en regiones en las que aparecen las yemas prostáticas a
partir de los UGS (Bathia-Gaur et al.,
1999). No se requiere Nkx3.1 para la inducción prostática,
dado que mutantes Nkx3.1 null aun tienen próstata
(Bathia-Gaur et al., 1999; Schneider et
al., 2000), pero se requiere su expresión para la diferenciación
del epitelio durante el desarrollo, y el correcto funcionamiento de
la próstata durante la adultez (Bathia-Gaur et
al., 1999). Dado que Nkx3.1 solo se expresa en el UGT
masculino, resulta probable que sea regulado por andrógeno, y dado
que la expresión ocurre antes de que aparezca el AR funcional en el
epitelio, es probable que esta regulación por andrógeno sea mediada
a través del mesénquima (Bathia-Gaur et al.,
1999). La literatura actual quisiere que los andrógenos incrementan
la expresión de Shh en los machos (Podlasek et al.,
1999), lo que a su vez induce la expresión de Nkx3.1. Dado
que encontramos transcriptos de Shh tanto en el UGS masculino
como femenino, y que no existe un incremento específico de la
expresión de Shh, proponemos que Shh es un factor más
bien permisivo que inductivo, para la expresión de Nkx3.1 en
el UGS masculino.
Se demostró que SHH posee en rol en el
crecimiento y desarrollo de la VP, mediante la inhibición de la vía
de señalización de SHH. El bloqueo de la señalización de SHH
utilizando tanto anticuerpos anti-SHH como Cy
provocó una reducción del crecimiento de las VPs. La reducción del
crecimiento resultado del bloqueo por anticuerpos confirmó que,
durante el crecimiento y desarrollo de la VP, la señalización a
través de PTC/SMO depende de SHH como ligando. Se observaron en la
VP los transcriptos de Ihh, pero no los de Dhh,
mediante RT-PCR, pero los niveles de Ihh
eran muy inferiores a los de Shh (datos no mostrados). Se ha
demostrado que SHH es un péptido más potente que IHH (Pathi et
al., 2001), y proponemos que SHH es el regulador principal de la
señalización a través de PTC/SMO en la VP. Nuestros resultados
coinciden con experimentos que muestran que la implantación de una
cuenta en el inicio prostático del UGS de ratones e15, injertado
debajo de la cápsula renal de un receptor masculino, abrogó el
crecimiento y desarrollo de la próstata (Podlasek et al.,
1999).
La inhibición de la señalización de SHH
incrementó el número de puntas de buds epiteliales alrededor de la
periferia de las VPs a pesar de la reducción de la proliferación de
las células epiteliales, lo que sugiere que el incremento se debió
al incremento de la ramificación. En explantes de pulmón libres de
mesénquima, no se requiere el incremento de la proliferación de las
células epiteliales para la ramificación, pero sí se requiere para
al elongación (Nogawa et al., 1998). Si los efectos
mitogénicos de SHH tanto sobre el epitelio como sobre el mesénquima
de pulmón (Bellusci et al., 1997b) operan también en la
próstata, la señalización a través de SHH puede actuar para
promover la mitogénesis e inhibir la ramificación, lo que permitiría
la elongación de las puntas de las yemas epiteliales. Se ha
observado también un incremento significativo del número de puntas
de conductos y puntos de ramificación en las VPs de ratones
Bmp4 haploinsuficientes (Lamm et al., 2001). Se
postula que Bmp4 inhibe la ramificación lateral, permitiendo de esa
manera la elongación de los conductos del epitelio prostático (Lamm
et al., 2001). Shh y Bmp4 se encuentran
coespresados en diferentes sitios de la interacción
epitelio-mesénquima durante el desarrollo (Bitgood y
McMahon, 1995), y se ha demostrado que Shh puede modular la
expresión de Bmp4 (Haraguchi et al., 2001). Sugerimos
que Shh puede operar upstream de Bmp4 en una vía que
inhibe la formación de ramificaciones en la próstata.
Los conductos epiteliales prostáticos
inicialmente crecen como cuerdas sólidas que luego sufren
canalización. La canalización comienza en el extremo uretral del
conducto prostático (proximal) y continúa hacia la porción distal
del conducto (Hayward et al., 1996). Observamos que la
canalización había ocurrido en las puntas distales de las VPs
cultivadas en +T+Cy, mientras que en las VPs cultivadas en -T, -T+Cy
y +T, al canalización solo era evidente en los conductos
proximales, siendo esta más avanzada en las VPs cultivadas en +T.
Esto sugería que en presencia de T, la inhibición de la
señalización de SHH aceleraba la canalización, pero que la
disrupción de la señalización de SHH por sí solo no era suficiente.
Proponemos que la señalización de SHH inhibe la canalización de los
conductos epiteliales prostáticos in vivo, y, de esa manera,
desempeña un papel opuesto a la T, que promueve la canalización
(Hayward et al., 1996).
La morfología de las puntas distales de las VPs
cultivadas en +T+Cy era compleja, con un patrón cribiforme bien
desarrollado, y múltiples lúmenes. En la enfermedad humana, este
patrón cribiforme puede observarse en las formas severas de las
hiperplasias epiteliales benignas y en la PIN de alto grado, el
precursor del carcinoma invasivo. Una de las características usadas
en el diagnóstico diferencial es la presencia de núcleos normales
en la hiperplasia, que contrasta con los núcleos agrandados,
variables, con nucléolos visibles en la PIN. Sin embargo, las
últimas características también se ven en modelos de desarrollo de
próstata y fueron una característica consistente en todos nuestros
experimentos. Otra característica de la hiperplasia significativa
de las células luminales es que frecuentemente va acompañada por una
expansión correspondiente del compartimiento basal (Epstein, 1992),
lo que puede demostrarse bien mediante inmunotinción por p63 (Fig.
8B). Por otro lado, en lesiones de PIN existe por lo general una
única capa de células basales, frecuentemente, con grandes brechas
(Fig. 8C), como en nuestras VPs cultivadas en +T+Cy (Fig. 7G). Por
último, la hiperplasia epitelial benigna, no conduce, por regla
general, a una expansión del conducto, a diferencia de lo que sucede
en la PIN cribiforme (Fig. 8C) y en nuestras VPs cultivadas en
+T+Cy (Fig. 7G). Estas observaciones sugieren que los epitelios
prostáticos de nuestras VPs, cultivadas in vitro en +T+Cy
recapitulan algunas de las características de la PIN.
Existe una clara relación espacial y temporal
entre la canalización de los conductos prostáticos y la
diferenciación de las células epiteliales (Hayward et al.,
1996). La diferenciación de las células epiteliales de los conductos
prostáticos inmaduros en las células luminales y basales que se
encuentran en los conductos maduros está marcada por cambios en la
expresión de CK y p63 (Hayward et al., 1996; Wang et
al., 2000). Las células epiteliales prostáticas indiferenciadas
expresan de manera uniforme CK5, CK8, CK14, CK18 y p63. Las células
basales mantienen la expresión de CK5 y CK14 y p63, y pierden la
expresión de CK8 y CK18, mientras que las células luminales
mantienen la expresión de CK8 y CK18, y pierden la expresión de CK5,
CK14 y p63 (Hayward et al., 1996; Wang et al., 2000).
La inmunohistoquímica de p63 mostró que las células epiteliales de
todas las puntas distales de las VPs cultivadas en +T+Cy habían
sufrido diferenciación. En las VPs de todos los demás grupos de
tratamientos se presentaba una mezcla de puntas distales, que
contenían células epiteliales indiferenciadas o células basales
diferenciadas. Esto sugirió que la inhibición de la señalización de
SHH en presencia de T aceleraba la diferenciación de las células
epiteliales. El patrón de expresión de CK14 era similar al de p63,
con la excepción de que la mayoría de las células en las puntas
distales de VPs cultivadas en +T+Cy no expresaban CK14, aunque las
que sí lo hacían eran más basales, lo que resultaba un indicador de
diferenciación. La ausencia de una capa completa de células basales
Ck14 positivas está bien reconocida en la próstata humana, donde
están bien descritas variaciones en la expresión de subtipos de
queratina (Abrahams et al., 2002; Freeman et al.,
2002). Se desconoce la significación funcional de estas variaciones
en el perfil de queratina. No obstante, por lo general se ven menos
células CK positivas en la PIn que en las glándulas normales
((Bostwick y Brawer, 1987), observación personal, P. H.), y la
escasez relativa de las células CK14 positivas en las VPs cultivadas
en +T+Cy nuevamente, resulta reminiscente de la PIN. La pérdida
completa de las células basales se considera, desde hace mucho
tiempo, como una característica intrínseca del adenocarcinoma
prostático (Totten et al., 1953). Esta es una de las
características clave explotada por los patólogos dedicados al
diagnóstico para diferenciar las lesiones atípicas, pero benignas
del adenocarcinoma prostático, ya que la demostración de la
existencia de células basales excluye la posibilidad de enfermedad
invasiva. La capa basal resulta frecuentemente atenuada y difícil
de identificar mediante la morfología estándar, de ahí el valor de
los marcadores inmunohistoquímicos (Wojno y Epstein, 1995).
Nuestros datos sugieren que p63 puede ser expresada de modo más
consistente que las queratinas, y esto puede tener valor en el
diagnóstico patológico. Nuestros resultados han mostrado que la
señalización de SHH probablemente es independiente de la acción de
los andrógenos sobre el crecimiento de la VP. Sin embargo, se
infiere la involucración conjunta de la señalización de SHH y los
andrógenos durante la diferenciación del epitelio prostático; la
inhibición de la señalización de SHH tiene efectos diferentes sobre
la diferenciación de las puntas epiteliales distales en presencia y
ausencia de T. Esto puede estar relacionado con la mayor velocidad
de crecimiento de las VPs en presencia versus ausencia de T.
Hemos demostrado que las células epiteliales de las puntas distales
proliferan más rápidamente en presencia de T (Fig. 5B), por tanto,
tal vez el efecto de la inhibición de la señalización de SHH solo
muestra efecto sobre las células de crecimiento más rápido. No se
observó un efecto obvio sobre la diferenciación en los conductos
proximales de las VPs, cuyas células se dividen mucho más
lentamente que las células de las puntas distales después de seis
días en cultivo. Proponemos que cualquier interacción entre la
señalización de SHH y los andrógenos durante la diferenciación del
epitelio prostático tiene elevada probabilidad de ser indirecta y
compleja, y sobre la base de la evidencia actual no estamos en
condiciones de proponer un mecanismo mediante el cual esta
podría
ocurrir.
ocurrir.
La activación inapropiada de la vía de
señalización de SHH ha sido implicada en varios tipos de tumor
(revisado en (Ruiz Altaba et al., 2002)). Nuestros datos son
novedosos en el hecho de que la inactivación de la vía de
señalización de SHH durante el crecimiento resulta en lesiones que
sugieren enfermedades. La vía de señalización de SHH puede
controlar otros genes implicados en las enfermedades de la próstata.
Ya hemos discutido que Shh puede ser un factor permisivo
para la expresión de Nkx3.1 durante el crecimiento del
epitelio prostático. Además de los defectos del desarrollo, los
ratones mutantes de Nkx3.1 desarrollan lesiones reminiscentes
de PIN (Bathia-Gaur et al., 1999; Kim et
al., 2002), como en nuestras VPs cultivadas en +T+Cy.
Mediante la disrupción de la señalización de SHH
hemos demostrado que la señalización de SHH es necesaria para el
crecimiento de la próstata, y puede inhibir la morfogénesis de las
ramificaciones. La inhibición de la señalización de SHH durante el
crecimiento provoca diferenciación precoz y aberrante de las células
epiteliales, que resultan en lesiones semejantes a PIN humana
cribiforme. Este trabajo proporciona información nueva acerca de
los efectos sobre el desarrollo de la disrupción de la señalización
de SHH durante el crecimiento, y presta evidencias a la teoría de
que la regulación inapropiada de las vías de señalización activas
durante el crecimiento puede estar implicada en procesos de
enfermedades.
Ejemplo
2
A un paciente de sexo masculino que prestaba
carcinoma de célula basal se le administró leuprorelin (3,75 mg
cada cuatro semanas, por vía intramuscular) hasta que se alcanzaron
niveles de testosterona de castración (0,5 ng/ml). Luego, se le
administró ciclopamina al paciente en un régimen de dosificación
para mejorar el carcinoma de célula basal.
Ejemplo
3
A un paciente de sexo masculino, que presentaba
glioblastoma se le administró flutamida (250 mg tres veces al día
peroralmente) para suprimir los efectos de la testosterona. Al
paciente luego se le administró un inhibidor de la vía de
señalización de SHH en un régimen de dosificación para mejorar el
glioblastoma.
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Claims (14)
1. Uso de un compuesto que suprime la
testosterona o su efecto en la fabricación de un medicamento para
proteger a un paciente de sexo masculino de posibles efectos
adversos de un tratamiento que involucra la inhibición de la vía de
señalización de SHH en el paciente.
2. Uso de un inhibidor de la vía de señalización
de SHH en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de
una enfermedad proliferativa tal como el cáncer en un paciente al
cual se le administra un compuesto que suprime la testosterona o su
efecto, en el paciente.
3. Uso de un compuesto que suprime la
testosterona o sus efectos en un paciente para la fabricación de un
medicamento para el tratamiento de una enfermedad proliferativa tal
como el cáncer en un paciente, en el que al paciente se le
administra un inhibidor de la vía de señalización de SHH.
4. Uso de una combinación de un inhibidor de la
vía de señalización de SHH y un compuesto que suprime la
testosterona o sus efectos en un paciente en la fabricación de un
medicamento para el tratamiento de una enfermedad proliferativa tal
como el cáncer, en un paciente.
5. Uso de acuerdo a una cualquiera de las
Reivindicaciones 1 a 4, en el cual el inhibidor de la vía de
señalización de SHH es la ciclopamina o un derivado de la
misma.
6. Uso de acuerdo a cualquiera de las
Reivindicaciones 1 a 5, en el cual, el compuesto que suprime la
testosterona o sus efectos en el paciente es uno o más de: un
antagonista de GnRH, un agonista de GnRH, un antagonista del
andrógeno o un inhibidor de la 5\alpha reductasa.
7. Uso de acuerdo a una cualquiera de las
Reivindicaciones 1 a 6, en el que el paciente es de sexo masculino,
de preferencia, un hombre postpubescente.
8. Uso de acuerdo a una cualquiera de las
Reivindicaciones 1 a 7, en el que el cáncer es un cáncer en el que
la señalización de SHH desempeña un rol en su crecimiento y/o
diferenciación.
9. Uso de acuerdo a las Reivindicaciones 2 a 8,
en el que el cáncer es cualquiera de: carcinoma de célula basal,
glioblastoma, meduloblastoma, o cáncer de próstata.
10. Uso de acuerdo a una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la testosterona se suprime
hasta niveles de castración.
11. Un sistema terapéutico para tratar a un
paciente, cuyo sistema incluye un inhibidor de la vía de
señalización de SHH y un compuesto que suprime la testosterona o sus
efectos en el paciente.
12. Una composición que incluye un inhibidor de
la vía de señalización de SHH y un compuesto que suprime la
testosterona o sus efectos, en un paciente.
13. Una composición, de acuerdo con la
Reivindicación 12, para uso en medicina.
14. Una composición farmacéutica que comprende
un inhibidor de la vía de señalización de SHH y un compuesto que
suprime la testosterona o su efecto en un paciente, y un
transportador farmacéuticamente aceptable.
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