ES2272212T3 - Procedimiento y disposicion para la determinacion de fluoroforos en objetos, especialmente en el fondo de ojo vivo. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para la determinación de fluoróforos en objetos, especialmente en el fondo de ojo vivo, en el que el objeto se ilumina por puntos mediante una luz láser en forma de pulsos, así como se excita hasta la fluorescencia, y la luz fluorescente generada se explora para su valoración, detectándose la luz fluorescente generada tras la excitación en forma de pulsos en un recuento de fotones individuales correlacionado con el tiempo, y determinándose a partir del comportamiento fluorescente temporal que se determina a partir del recuento de fotones individuales correlacionado con el tiempo los tiempos de extinción de la fluorescencia, y extrapolándose a partir de los tiempos de extinción de la fluorescencia obtenidos los fluoróforos excitados para la fluorescencia en el objeto, caracterizado porque adicionalmente a la detección, que se lleva a cabo con recuento de fotones individuales correlacionado con el tiempo, de la luz fluorescente excitada en forma de pulsos del objeto se valora simultáneamente la luz de reflexión del objeto y a partir de ésta se determina una imagen de reflexión, que se superpone, o se enfrenta a la imagen de fluorescencia del objeto obtenida con el recuento de fotones individuales correlacionado con el tiempo.

Description

Procedimiento y disposición para la determinación de fluoróforos en objetos, especialmente en el fondo de ojo vivo.

La invención se refiere a un procedimiento y a una disposición para la determinación de fluoróforos en objetos, especialmente en el fondo de ojo vivo, según los preámbulos de la reivindicación 1 así como de la reivindicación 9.

Se conocen un procedimiento de este tipo y una disposición de este tipo a partir del documento DE-A-197 22 790, iluminándose el objeto por puntos mediante una luz láser en forma de pulsos para la determinación de fluoróforos en objetos, especialmente en el fondo de ojo vivo, así como excitándose hasta la fluorescencia y explorándose la luz fluorescente generada para su valoración. La luz fluorescente se detecta en un recuento de fotones individuales indirecto correlacionado con el tiempo mediante una operación de acumulación uni o bidimensional y a partir del comportamiento de fluorescencia temporal determinado de esta manera se determinan los tiempos de extinción de la fluorescencia. La luz de reflexión que aparece puede conducir a alteraciones no insignificantes de los resultados de medición.

Además se conoce a partir de la revista "REVIEW OF SCIENTIFIC INSTRUMENTS, AMERICAN INSTITUTE OF PHYSICS. NUEVA YORK, EE.UU, volumen 67, nº 10, 1. Octubre de 1996 (1996-10-01), páginas 3722-3731, AMMASI PERIASAMY ET AL: TIME-RESOLVED FLUORESCENCE LIFETIME IMAGING MICROSCOPY USING A PICOSECOND PULSED TUNABLE DYE LASER SYSTEM" la medición del tiempo de extinción de la fluorescencia por medio de recuento de fotones directo correlacionado con el tiempo. Por lo demás se describe en la revista "Proceedings of the SPIE - The International Society for Optical Engineering, 1994, EE.UU., THREE-DIMENSIONAL MICROSCOPY: IMAGE ACQUISITION AND PROCESSING, SAN JOSÉ, CA, EE.UU., 7-8 FEB. 1994, Volumen 2184, págs. 82-92, BRISMAR E: Time correlated single photon counting using a CSLM" el recuento de fotones individuales correlacionado con el tiempo y la determinación de tiempos de extinción.

Se sabe aprovechar la fluorescencia natural de los objetos, para el análisis de objetos, por ejemplo para la valoración del estado del metabolismo de tejido biológico vivo, tal como del fondo de ojo en los exámenes oftalmológicos. Por consiguiente mediante la excitación fluorescente de estos objetos puede deducirse en tejido biológico su estado de metabolismo de manera no invasiva mediante la valoración óptica de las autofluorescencias excitadas. Se necesita al menos un dato bidimensional de la distribución de diferentes fluoróforos en el objeto biológico sometido a
ensayo.

El ensayo del sistema de capilares del fondo de ojo en los exámenes oftalmológicos con ayuda de marcadores de fluorescencia, por ejemplo utilizando Fluoresceína sodio inyectada por vía intravenosa (rendimiento cuántico de aproximadamente 1) o verde de indocianina (ICG/indocyanine green) es el estado de la técnica en la rutina clínica. La medición de la autofluorescencia en el fondo de ojo es posible sólo con un rendimiento cuántico muy reducido, encontrándose adicionalmente concentraciones reducidas de los fluoróforos. Además resulta dificultoso, que para la excitación de la autofluorescencia deben respetarse los valores límite para la exposición a la luz máxima permitida (American Nacional Standard for Use of Lasers (Norma nacional americana para el uso de láseres), ANSI 136.1-1993). En el documento US 4.569.345 se propone, evaluar la oxigenación de la retina mediante la medición de la autofluorescencia a 520 nm y 540 nm, teniendo lugar la excitación a 450 nm. Es desventajoso, que la excitación a 450 nm conduce a una absorción en el cristalino, mediante lo cual se excita el cristalino hasta la fluorescencia. A partir de las mediciones de la fluorescencia a 520 nm y a 540 nm se pretende compensar la influencia de los medios oculares, tales como el cristalino, humor acuoso, córnea y humor vítreo. Dado que la fluorescencia del cristalino es aproximadamente tres órdenes de magnitud más intensa que la fluorescencia en el fondo de ojo, apenas es posible conseguir señales de fluorescencia valorables del fondo de ojo en intervalos de longitudes de onda estrechos y utilizar éstos para la compensación de la influencia de los medios oculares. Mediante la irradiación a 450 nm se excitan también productos de la peroxidación lipídica hasta la fluorescencia, que igualmente muestran una fluorescencia medible a 540 nm. Esto significa que las influencias de la fluorescencia del cristalino, de las flavoproteínas del fondo de ojo y de los productos de la peroxidación lipídica en el fondo de ojo incluso en espectros de fluorescencia conocidos de los fluoróforos individuales no pueden determinarse por separado mediante la medición de la fluorescencia de las dos longitudes de onda.

En el documento US 4.213.678 se expone el principio para la exploración confocal del fondo de ojo con un oftalmoscopio de barrido láser. Según este principio se obtienen imágenes de reflexión del fondo de ojo, tras irradiar un rayo láser luminoso continuo el fondo de ojo a modo de barrido y registrarse la luz de reflexión por parte de un detector. Utilizando marcadores fluorescentes (Fluoresceína sodio, ICG) puede tener lugar con esta técnica una valoración del sistema de capilares retinal o coroidal. Además se demostró por parte de v. Rückmann et al. (Br. J. Ophthalmol 1995; 79: 407-412), que especialmente en la degeneración macular senil (DMS) puede demostrarse una autofluorescencia, cuando se excita el fondo de ojo con luz de longitud de onda de 488 nm y se registra de manera integral toda la luz fluorescente globalmente por encima de una longitud de onda límite de 520 nm. Mediante la superposición de varias imágenes de fluorescencia se mejora la relación señal-ruido.

Para la caracterización principalmente del estado patológico mediante los espectros de la autofluorescencia de fluoróforos específicos en por ejemplo la degeneración macular senil (DMS) se publicaron diversos principios. Mediante la excitación de una región relativamente grande en el fondo de ojo y la medición del espectro de la autofluorescencia pudieron demostrar Delori et al. (Invest Ophthalmol Vis Sci. 1995; 36: 718-729) que el producto de degradación de la peroxidación lipídica, Lipofuscina, determina en gran medida la autofluorescencia en la DMS.

Mediante la aplicación de la espectrometría de imágenes, en la que tras la excitación de la autofluorescencia a lo largo de un línea se miden simultáneamente los espectros de la autofluorescencia de todos los lugares excitados del fondo de ojo, se demostró por parte de Schweitzer et al. (Invest Ophthalmol Vis Sci. 1998; 38: 387) tras la excitación en diferentes intervalos de longitudes de onda, que puede excitarse una autofluorescencia al menos para dos fluoróforos en el fondo de ojo. Mientras que la autofluorescencia de onda corta en los individuos con ojos sanos está más marcada, se produce en el caso de DMS un espectro de fluorescencia de onda larga más marcado. El tejido biológico, especialmente del fondo de ojo, tiene la propiedad de que por cualquier irradiación posible en el rango espectral visible se excitan varios fluoróforos, cuyos espectros de fluorescencia se superponen unos a otros. En este sentido el rendimiento cuántico de los fluoróforos naturales es muy pequeño. Dado que el fondo de ojo contiene los receptores sensibles a la luz del ojo, la intensidad de excitación debe ser tan pequeña, para que se descarte cualquier daño. Para una aplicación clínica de la autofluorescencia para la caracterización del estado de metabolismo o su modificación en un momento, antes de se reconozcan modificaciones morfológicas, se requiere por lo demás una medición bidimensional de la autofluorescencia con una resolución local lo más elevada posible, que conduce igualmente a una reducción de la luz fluorescente, que puede comprobarse desde cualquier punto. Cuanto más delicada sea la resolución local por punto de medición, menor será la intensidad de fluorescencia medible. Es especialmente dificultoso para la medición de la autofluorescencia en el fondo de ojo el hecho de que el ojo es un objeto móvil, que consigue sólo durante un tiempo limitado, fijar un objeto. Como consecuencia de estas condiciones de ensayo especiales ocurre que desde el punto de vista actual prácticamente no puede realizarse una separación de los fluoróforos eficaces en el fondo de ojo debido a los espectros de fluorescencia superpuestos y a la mala relación señal-ruido, con la que puede medirse la autofluorescencia en el fondo de ojo.

Sin embargo existe en el mundo técnico un gran interés, especialmente de detectar bidimensionalmente en el fondo de ojo la autofluorescencia de diferentes fluoróforos para la caracterización del estado de metabolismo, lo cual no es posible de manera eficaz con los métodos conocidos y en dichas condiciones oftalmológicas especiales.

Por tanto la invención se basa en el objetivo, de detectar de manera segura en espectros de excitación y/o de fluorescencia al menos parcialmente fluoróforos superpuestos de objetos también con intensidades de fluorescencia muy reducidas y seleccionarlos para una valoración con la posibilidad de una representación bidimensional.

Según la invención se proponen un procedimiento y una disposición, con el que o los que el objeto, por ejemplo el fondo de ojo para exámenes oftalmológicos, se ilumina con luz láser en forma de pulsos y se excita con una expansión bidimensional hasta la fluorescencia. La luz fluorescente generada momentáneamente tras la excitación mediante cualquier impulso láser se detecta en recuentos de fotones individuales correlacionados con el tiempo. A partir del comportamiento de fluorescencia temporal determinado mediante el recuento de fotones individuales correlacionado con el tiempo para cada punto se calculan las constantes temporales de fluorescencia. Dado que la constante de tiempo de fluorescencia es un rasgo característico de cada fluoróforo, se deducen a partir de las constantes de tiempo de fluorescencia los fluoróforos excitados en el objeto. Mientras que según el estado de la técnica conocido la diferenciación de distintos fluoróforos, especialmente del fondo de ojo, no puede alcanzarse de manera correspondiente a las normas de seguridad en una representación bidimensional con resolución local debido a los espectros de fluorescencia superpuestos y la intensidad de fluorescencia extremadamente reducida como consecuencia de la limitación de la potencia de radiación de excitación, es posible una diferenciación de los fluoróforos de manera correspondiente a su diferente tiempo de extinción de la fluorescencia. Sorprendentemente, resultó que las intensidades de fluorescencia extremadamente débiles, que pueden medirse del fondo de ojo, representan muy buenas condiciones para un recuento de fotones individuales correlacionado con el tiempo. La técnica del recuento de fotones individuales correlacionado con el tiempo requiere que se registre un fotón de fluorescencia mediante un impulso de excitación láser sólo con una probabilidad de 0,1. La repetición de los impulsos de excitación debe ser elevada, para que pueda registrarse un comportamiento de extinción valorable en un tiempo correspondientemente corto. El régimen de tiempo para el recuento de fotones individuales correlacionado con el tiempo se regula mediante los impulsos detectados de la luz láser que excita hasta la fluorescencia así como de la luz fluorescente que se genera en el objeto. A partir de los contenidos de registro de los contadores, en los que se lee el fotón de fluorescencia detectado en cada caso tras un impulso de excitación de manera correspondiente al tiempo de retardo entre el impulso de excitación y éste, se determinan para cada punto del objeto los tiempos de extinción de la breve autofluorescencia mediante la excitación por impulso, según los cuales se diferencian los fluoróforos. En las reivindicaciones dependientes 2-8 y 10-15 se representan realizaciones ventajosas del procedimiento mencionado en la reivindicación independiente 1 o de la disposición según la reivindicación independiente 9.

A continuación pretende explicarse con más detalle la invención mediante un ejemplo de realización representado en el dibujo.

La figura muestra la estructura principal de la disposición según la invención para la valoración de fluoróforos en el fondo de ojo.

La radiación de un láser 1 pulsado con una duración de impulso inferior a 0,5 ns y una frecuencia de repetición de aproximadamente 80 MHz se acopla a través de un espejo 2 parcialmente transparente en un oftalmoscopio 3 de barrido láser y se ilumina por puntos el fondo de un ojo 4 de un paciente que ha de examinarse mediante la desviación del impulso de radiación láser en dirección horizontal y vertical. Para discriminar la luz de reflexión de los medios oculares posteriores y para suprimir la luz fluorescente, que se excita en los medios oculares posteriores, especialmente en el cristalino, tiene lugar una separación geométrica de la trayectoria de los rayos de iluminación y la trayectoria de los rayos de detección mediante la distribución del diafragma de abertura en el plano del diafragma de abertura del ojo 4 del paciente (no representado en el dibujo por motivos de claridad). La luz reflejada por el fondo de ojo del ojo 4 del paciente experimenta durante un nuevo paso por el oftalmoscopio 3 de barrido láser un retorno de la fluorescencia (descanning) y se registra tras la desviación mediante un espejo 5 dicroico de manera conocida por parte de un detector 6, en el cual se representa de manera confocal el punto iluminado del fondo de ojo. A través de una capturadora (7) de vídeo sincronizada con el oftalmoscopio 3 de barrido láser se leen las imágenes de reflexión del fondo de ojo en un ordenador 8.

La radiación del láser 1 pulsado tiene una longitud de onda seleccionable, que en el presente ejemplo se selecciona con una longitud de onda inferior a 520 nm. Con esta radiación se excitan fluoróforos del fondo de ojo hasta una breve fluorescencia. La luz fluorescente experimenta igualmente mediante el oftalmoscopio 3 de barrido láser un retorno de la fluorescencia y alcanza el espejo 5 dicroico, cuyas propiedades se seleccionan de tal manera, que se transmite luz en el intervalo de longitudes de onda superiores a 520 nm mediante el espejo 5, mientras que se refleja la luz de excitación de menor longitud de onda para la fluorescencia en el espejo 5. La separación de la luz fluorescente y la luz de reflexión en el espejo 5 dicroico pueden seleccionarse también de tal modo, que la luz fluorescente se refleje en el mismo, mientras que la luz reflejada por el ojo 4 del paciente se transmita a través del mismo. La luz fluorescente pasa posteriormente a través de un filtro 9 de bloqueo, que bloquea completamente aquella luz de excitación, que debería bloquear de manera insuficiente el espejo 5 dicroico, así como dado el caso la luz parásita interna del aparato. La luz fluorescente se registra por parte de un detector 10 de fluorescencia de alta sensibilidad, que está conectado a una unidad 11 para el recuento de fotones individuales correlacionado con el tiempo.

Durante el recuento de fotones individuales correlacionado con el tiempo se inicia en el funcionamiento normal mediante cada impulso de excitación un proceso temporal, que se detiene mediante el fotón de fluorescencia individual registrado. Todo el proceso temporal se divide en fragmentos, a los que se asocian registros individuales de manera correspondiente al tiempo de retardo medido entre el impulso de excitación y el fotón de fluorescencia, que sucesivamente se cuentan una unidad más para cada fotón de fluorescencia registrado. Después de que una repetición de impulsos de excitación haya alcanzado el fondo de ojo, los contenidos de los contadores individuales de la unidad 11 representan el comportamiento de extinción temporal de la luz fluorescente excitada en forma de pulsos en un punto. En el ordenador 8 se determinan a partir del comportamiento de extinción temporal de la fluorescencia las constantes de tiempo (tiempo de extinción) del comportamiento de fluorescencia temporal. Mediante estas constantes de tiempo de la fluorescencia se diferencian los fluoróforos y su concentración. Una ventaja especial de esta diferenciación según la invención consiste en que la valoración es independiente de la intensidad de fluorescencia y por consiguiente también puede aplicarse en las intensidades de fluorescencia muy reducidas que aparecen en la oftalmología. Los fluoróforos que pueden diferenciarse de esta manera en la imagen de fluorescencia del fondo de ojo del ojo 4 del paciente se determinan en el ordenador 8 a partir de las correspondencias conocidas entre la constante de extinción y el fluoróforo con una longitud de onda de excitación conocida.

Para poder comprobar la fluorescencia registrada por el fondo de ojo de manera correspondiente al recuento de fotones individuales correlacionado con el tiempo, tiene lugar una sincronización temporal entre el láser 1 pulsado y la unidad 11 para el recuento de fotones individuales correlacionado con el tiempo. Para ello se refleja una parte del impulso de excitación láser mediante un espejo 2 parcialmente transparente y se registra por parte de un detector 12 rápido (detector de excitación) cuya señal de partida inicia el proceso temporal de la unidad 11 para el recuento de fotones individuales correlacionado con el tiempo. Teniendo en cuenta la exposición máxima permitida, la transmisión de la disposición óptica, así como el rendimiento cuántico para la excitación de la luz fluorescente en el fondo de ojo y el rendimiento cuántico del detector, la señal de partida del detector 10 de fluorescencia generada con una probabilidad de aproximadamente 0,1 detiene el proceso temporal de la unidad 11 para el recuento de fotones individuales correlacionado con el tiempo. El efecto funcional del impulso de excitación y el fotón de fluorescencia detectado para la generación de una señal de inicio y parada en el proceso temporal en principio también puede llevarse a cabo a la inversa (modo inverso), de manera que el fotón de fluorescencia inicia el proceso temporal y el siguiente impulso láser para la excitación de fluorescencia del fondo de ojo finaliza el proceso temporal.

La fluorescencia en el ojo 4 del paciente se excita en el caso de un barrido constante del fondo de ojo simultáneamente con una repetición elevada de impulsos láser (en el presente ejemplo una frecuencia de impulsos de 80 MHz). Dado que la señal de autofluorescencia es muy débil, debe llevarse a cabo una integración a través de un determinado intervalo de tiempo, lo que conduce como consecuencia del movimiento de barrido del haz de excitación a que se cubra una región determinada en el fondo de ojo, para obtener una fluorescencia con resolución en el tiempo. La consecuencia es que la resolución local para la representación bidimensional de la fluorescencia con resolución en el tiempo con aproximadamente 50 \mum es algo más reducida que en la imagen de reflexión registrada paralelamente. Para garantizar una correspondencia de las curvas de extinción de fluorescencia medidas con el punto de exploración respectivo de la exploración bidimensional, se sincroniza el proceso de barrido o de retorno de barrido en el oftlamoscopio 3 de barrido láser a través de un encaminador 13 con la unidad 11 para el recuento de fotones individuales correlacionado con el tiempo. Con el encaminador 13 se fija mediante la magnitud de una ventana de tiempo la resolución local, con la que tiene lugar una correspondencia de los fotones de fluorescencia medidos con respecto a la curva de extinción de la fluorescencia en un punto durante el recubrimiento continuo del fondo de ojo con el haz láser de excitación de barrido.

En la unidad 11 para el recuento de fotones individuales correlacionado con el tiempo se guarda para cada punto de la imagen explorado del fondo de ojo la curva de extinción de la autofluorescencia como contenido de registro y está por consiguiente a disposición para la determinación del tiempo de extinción de la fluorescencia para cada punto de la imagen, que se realiza en el ordenador 8. En una representación bidimensional en un monitor M conectado al ordenador 8 se superpone la imagen codificada mediante escala de grises o pseudocolores de los tiempos de extinción calculados, en la que ventajosamente pueden estar marcadas por colores en cada caso regiones con el mismo tiempo de extinción, con la imagen de reflexión para una mejor interpretación clínica. En la dispersión de los transcursos temporales de la fluorescencia se determinan tanto las constantes de tiempo de extinción, que corresponden al tipo de los fluoróforos, como los factores previos, que representan las concentraciones de los fluoróforos. Las informaciones sobre el tipo de los fluoróforos y sobre su concentración pueden representarse en imágenes separadas o comprimidas en una imagen. Por ejemplo es posible caracterizar los diferentes fluoróforos en sus regiones asociadas mediante colores, cuya saturación corresponde a la concentración. A partir del mezclado aditivo de los colores, que corresponden en cada caso a un componente fluorescente existente con una concentración determinada, puede calcularse un color mixto, que corresponde a la razón de concentración de los fluoróforos. La distribución bidimensional de los fluoróforos puede emitirse en lugar de por el monitor 14 o adicionalmente al mismo también en una impresora. Para una valoración y un cálculo eficaz de imágenes bidimensionales tras el tiempo de extinción de la fluorescencia se aproxima además la caída temporal de la fluorescencia también en varios componentes fluorescentes mediante una caída monoexponencial y se recurre a este respecto al tiempo de extinción eficaz calculado para la valoración.

Tanto antes del detector 6 para la luz de reflexión, como antes del detector 10 de fluorescencia pueden disponerse convenientemente diafragmas de campo que pueden modificarse, no representados en el dibujo, que posibilitan el registro confocal para el haz de excitación a diferentes profundidades del fondo de ojo para la luz de reflexión o para la fluorescente.

Mediante la acumulación de los contenidos de todos los registros de la unidad 11 para el recuento de fotones individuales correlacionado con el tiempo para el comportamiento de fluorescencia dependiente del tiempo de cada punto explorado en el fondo de ojo puede exponerse una imagen de la intensidad de fluorescencia integral.

Lista de los números de referencia utilizados

1

láser pulsado

2

espejo parcialmente transparente

3

oftalmoscopio de barrido láser

4

ojo del paciente

5

espejo dicroico

6

detector para luz de reflexión

7

capturadora de vídeo

8

ordenador

9

filtro de bloqueo

10

detector de fluorescencia

11

unidad para el recuento de fotones individuales correlacionado con el tiempo

12

detector

13

encaminador

14

monitor.

Claims (15)

1. Procedimiento para la determinación de fluoróforos en objetos, especialmente en el fondo de ojo vivo, en el que el objeto se ilumina por puntos mediante una luz láser en forma de pulsos, así como se excita hasta la fluorescencia, y la luz fluorescente generada se explora para su valoración, detectándose la luz fluorescente generada tras la excitación en forma de pulsos en un recuento de fotones individuales correlacionado con el tiempo, y determinándose a partir del comportamiento fluorescente temporal que se determina a partir del recuento de fotones individuales correlacionado con el tiempo los tiempos de extinción de la fluorescencia, y extrapolándose a partir de los tiempos de extinción de la fluorescencia obtenidos los fluoróforos excitados para la fluorescencia en el objeto, caracterizado porque adicionalmente a la detección, que se lleva a cabo con recuento de fotones individuales correlacionado con el tiempo, de la luz fluorescente excitada en forma de pulsos del objeto se valora simultáneamente la luz de reflexión del objeto y a partir de ésta se determina una imagen de reflexión, que se superpone, o se enfrenta a la imagen de fluorescencia del objeto obtenida con el recuento de fotones individuales correlacionado con el tiempo.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el objeto se ilumina mediante pulsos de láser con una duración de pulso a ser posible inferior a 0,5 ns, con frecuencia de repetición de aproximadamente 80 MHz y con una longitud inferior a 520 nm y se excita hasta la fluorescencia.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la distribución de los tiempos de extinción de la fluorescencia y/o los fluoróforos determinados tras su tiempo de extinción de la fluorescencia se representan de forma bidimensional en una imagen de fluorescencia del objeto.

4. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado porque las áreas correspondientes a los fluoróforos que deben distinguirse se representan en la imagen de fluorescencia en cada caso con diferentes colores.

5. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el recuento de fotones individuales correlacionado con el tiempo se inicia mediante los impulsos detectados de la luz láser y se detiene mediante los impulsos detectados de la luz fluorescente.

6. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el recuento de fotones individuales correlacionado con el tiempo se inicia mediante los impulsos detectados de la luz fluorescente y se detiene mediante los impulsos detectados de la luz de láser.

7. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque para la detección independiente de la luz de fluorescencia y de reflexión del objeto se separan ambas proporciones de luz una de otra y porque además se bloquea la luz de fluorescencia para el rango espectral de la luz de reflexión y dado el caso de luz de dispersión.

8. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque se sincroniza la asignación espacial del recuento de fotones individuales correlacionado con el tiempo con la excitación de la fluorescencia bidimensional del objeto.

9. Disposición para la determinación de fluoróforos en objetos, especialmente en el fondo de ojo vivo, constituida por un láser (1) pulsado y un sistema de barrido láser para la iluminación por puntos y la excitación de la fluorescencia bidimensional del objeto (42), así como para el retorno de la fluorescencia (descanning) de la luz fluorescente generada mediante la excitación para la fluorescencia en el objeto, estando en contacto la salida del sistema (3) de barrido láser, del que sale la luz fluorescente del objeto (4) excitada en forma de pulsos registrada, resuelta localmente, con un detector (10) de fluorescencia, llevándose a cabo un recuento de fotones individuales correlacionado con el tiempo y estando prevista un ordenador (8) con una unidad (14) de salida para el cálculo de los correspondientes tiempos de extinción de la fluorescencia de la luz de fluorescencia excitada en forma de pulsos, caracterizada porque para el recuento de fotones individuales correlacionado con el tiempo una unidad (11) está en contacto con el detector (10) de fluorescencia y además está conectada al ordenador (8), y porque en la trayectoria de los rayos de la luz de reflexión enmascarada por un espejo (5) dicroico del objeto (4) se dispone un detector (6) para la luz reflejada que, para el registro de una imagen de reflexión del objeto (4), está igualmente en contacto con el ordenador (8) a través de una capturadora (7) de vídeo.

10. Disposición según la reivindicación 9, caracterizada porque el láser (1) pulsado está en contacto a través de medios (2) que conducen los rayos con una entrada de control de tiempo de la unidad (11) para el recuento de fotones individuales correlacionado con el tiempo.

11. Disposición según la reivindicación 9, caracterizada porque la salida del sistema (3) de barrido láser, del que sale la luz de fluorescencia excitada en forma de pulsos registrada, resuelta localmente, está en contacto a través del espejo (5) dicroico con el detector (10) de fluorescencia para el recuento de fotones individuales correlacionado con el tiempo conectado a la unidad (11).

12. Disposición según la reivindicación 11, caracterizada porque se conecta previamente al detector (10) de fluorescencia un filtro (9) de bloqueo para bloquear el rango espectral de la luz de reflexión del objeto (4) y de luz de dispersión que aparece eventualmente.

13. Disposición según la reivindicación 9, caracterizada porque el sistema (3) de barrido láser está acoplado, con el fin de una sincronización del recuento dependiente del tiempo de los fotones de fluorescencia con la excitación para la fluorescencia bidimensional local del objeto (4), a través de un encaminador (13) con una entrada de control de la unidad (11) para el recuento de fotones correlacionado con el tiempo.

14. Disposición según una de las reivindicaciones 9 a 13, caracterizada porque está previsto un aparato de salida visual y archivador, por ejemplo un monitor (14), para la salida de las imágenes de fluorescencia y de reflexión registradas.

15. Disposición según una de las reivindicaciones 9 a 14, caracterizada porque antes del detector (10) de fluorescencia y/o del detector (6) para la luz reflejada se disponen diafragmas de campo visual ajustables para la detección de la luz de fluorescencia y/o de reflexión que provienen de diferentes planos del fondo del ojo.