ES2272057T3 - Metodo y aparato para realizar una disposicion para la determinacion rapida de perfiles moleculares. - Google Patents

Abstract

Método para realizar una disposición para llevar a cabo un análisis de especímenes biológicos, que comprende: obtener especímenes donantes alargados de un material (30) donante biológico que ha de analizarse; proporcionar un elemento (70) receptor que tenga una disposición de receptáculos alargados para recibir los especímenes donantes; y colocar los especímenes donantes en los receptáculos, en ubicaciones asignadas fijas en el elemento (70) receptor, ubicaciones que se mantienen y graban, teniendo los receptáculos una forma complementaria a la forma de los especímenes donantes, en el que el proporcionar el elemento (90) receptor comprende proporcionar una disposición de receptáculos alargados en el elemento (70) receptor, extendiéndose los receptáculos transversalmente a un plano de la disposición que ha de analizarse y en el que cada espécimen donante se coloca en un receptáculo que tiene una forma y tamaño de sección transversal complementario a una forma y tamaño de sección transversaldel espécimen donante.

Description

Método y aparato para realizar una disposición para la determinación rápida de perfiles moleculares.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a dispositivos para el análisis microscópico, histológico y/o molecular de especímenes de tejido.

Antecedentes de la invención

Los mecanismos biológicos de muchas enfermedades se han clarificado mediante examen microscópico de especímenes de tejido. El examen histopatológico también ha permitido el desarrollo de tratamientos médicos para una diversidad de enfermedades. En la anatomía patológica convencional, se hace un diagnóstico basándose en la morfología celular y las características de tinción. Los especímenes de tumores, por ejemplo, pueden examinarse para caracterizar el tipo de tumor y predecir si el paciente responderá a una forma particular de quimioterapia. Aunque esta clasificación y examen microscópico de tumores ha mejorado el tratamiento médico, la apariencia microscópica de un espécimen de tejido teñido mediante métodos convencionales (tales como hematoxilina y eosina) a menudo únicamente puede revelar una cantidad limitada de información diagnóstica o molecular.

Los recientes avances en medicina molecular han proporcionado una oportunidad aún mayor de comprender los mecanismos celulares de la enfermedad, y seleccionar tratamientos apropiados con la mayor probabilidad de éxito. Algunas células de tumor de mama dependiente de hormonas, por ejemplo, tienen una mayor expresión de receptores de estrógenos en sus superficies celulares, lo que indica que es más probable que el paciente del que se tomó el tumor responda a ciertos tratamientos de fármacos antiestrogénicos. Otros cambios celulares pronósticos y diagnósticos incluyen la presencia de antígenos de superficie celular específicos de tumor (como en el melanoma), la producción de proteínas embrionarias (tales como \alpha-fetoproteína en el cáncer de hígado y antígeno de glicoproteína carcinoembrionaria producido por tumores gastrointestinales), y anomalías genéticas (tales como oncogenes activados en tumores). Se han desarrollado una diversidad de técnicas para detectar la presencia de estas anomalías celulares, incluyendo el inmunofenotipado con anticuerpos monoclonales, hibridación in situ con sondas, y amplificación de ADN usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

El desarrollo de nuevos marcadores moleculares, sin embargo, se ha visto obstaculizado por la incapacidad de agrupar un gran número de tejidos dentro de un área de superficie pequeña. Puede estar disponible únicamente una cantidad limitada de sobrenadante de hibridoma, particularmente durante la fase temprana de la generación de anticuerpos monoclonales, lo que limita el número de especímenes que pueden analizarse. Sin embargo, aún cuando estén disponibles grandes cantidades de agentes inmunohistológicos, los reactivos son caros y pueden variar en reactividad. Estos problemas llevaron a Battifora et al. a proponer en Lab. Invest. 55: 244-248 (1986), y en la patente de los EE.UU. número 4.820.504, que los múltiples especímenes de tejido pueden agruparse juntos en un único portaobjetos para permitir que los especímenes se examinen simultáneamente mediante la aplicación de una única gota de hibridoma como sobrenadante. Los especímenes se preparaban usando una cuchilla manual para cortar en láminas especímenes de tejido desparafinados y deshidratados, que se empaquetaban después al azar, se envolvían en tripa artificial, y volvían a incluirse en parafina. Esta técnica requería un alto grado de destreza manual, e incorporaba muestras en un bloque compuesto de una manera que hacía difícil encontrar e identificar especímenes particulares de interés.

Una modificación de este proceso se dio a conocer por Wan et al., J. Immunol. Meth. 103: 121-129 (1987), Furmanski et al. en la patente de los EE.UU. número 4.914.022, en la que se obtuvieron núcleos de tejido incluido en parafina a partir de bloques de tejido convencionales. Los núcleos se ablandaban y estiraban laminándolos manualmente sobre una superficie templada, y a continuación se empaquetaban dentro de una pajita para beber convencional. Se dijo que este método era adecuado para la prueba histológica simultánea de múltiples especímenes de tejido, por ejemplo, en la caracterización de anticuerpos monoclonales. De forma similar, la técnica de Miller y Groothuis, A.J.C.P. 96: 228-232 (1991) laminaba bandas de tejido en "troncos" ("logs") a partir de los cuales se tomaban secciones transversales para incluirse en parafina. Sin embargo, las técnicas de la pajita y de troncos, requerían mucha mano de obra, requerían un alto grado de destreza manual, y además las muestras se disponían al azar de una manera que complicaba la identificación de los especímenes de interés.

Battifora y Mehta, Lab. Invest. 63: 722-724 (1990) y la patente de los EE.UU. número 5.002.377, trataron de superar algunos de los problemas de la colocación aleatoria cortando los especímenes en una pluralidad de estrechas bandas, que se colocaron individualmente en acanaladuras rectangulares paralelas en un molde. Las bandas de tejido se incluyeron en gel agar que se vertía en las acanaladuras para producir un elemento similar a una placa con una serie de crestas. Varias de estas placas con crestas se apilaban juntas y se incluían en parafina para formar un bloque de tejido. Un enfoque similar se propuso por Sundblad, A.J.C.P. 102: 192-193 (1993), en el que las bandas de tejido se colocaban en cuñas triangulares en lugar de en acanaladuras rectangulares. Cortar en láminas el tejido, montarlo en filas, e incluirlo en varios pasos para formar el bloque era un método que llevaba mucho tiempo y que reducía la eficacia de examinar de un gran número de especímenes de tejido.

Todas estas técnicas han sido inadecuadas para una preparación eficaz de una disposición de especímenes de tejido que pueda usarse para un análisis en paralelo rápido de una diversidad de marcadores moleculares independientes. Esta ineficacia ha sido un problema significativo en campos tales como la investigación del cáncer, porque el desarrollo y la evolución del cáncer es un proceso de múltiples etapas que implica pérdidas, redisposiciones y amplificaciones secuenciales de diversas regiones cromosómicas y múltiples genes. Estos acontecimientos conducen a una desregulación de rutas de transducción de señales críticas para el crecimiento, la muerte y la diferenciación celular. Los detalles de este complejo proceso siguen sin comprenderse completamente, en parte porque todavía no están disponibles técnicas y estrategias de alto rendimiento para analizar tales cambios genéticos en un elevado número de tumores humanos no cultivados.

Por ejemplo, pueden ser necesarios análisis simultáneos de diversos genes dentro de las mismas rutas de transducción de señales, o relacionadas, para ubicar con exactitud etapas críticas, limitantes de velocidad en la desregulación del crecimiento de células cancerígenas. Además, puede ser necesario el análisis de cambios estructurales y numéricos que afectan a diversos cromosomas, loci y genes al mismo tiempo para comprender los patrones de acumulación de cambios genéticos en diferentes fases de la evolución del cáncer. Por último, después de haber identificado nuevos genes y cambios genéticos de potencial importancia en el cáncer, normalmente se requieren investigaciones sustancialmente adicionales para determinar el diagnóstico, pronóstico y la relevancia terapéutica de estos marcadores moleculares en la oncología clínica.

Como a menudo la cantidad de tejido se vuelve limitante de la velocidad para tales estudios, es importante la capacidad de procurar, fijar, almacenar y distribuir tejido eficazmente para el análisis molecular de una manera que minimice el consumo de especímenes tumorales preciosos y a menudo únicos. Es por tanto un objeto de esta invención llevar a cabo una determinación de perfiles moleculares a gran escala de especímenes de tejido (tales como tumores) con requisitos de tejido mínimos, de manera que permita un análisis en paralelo rápido de características moleculares (tales como la dosis y expresión génica) de cientos de especímenes tumorales morfológicamente controlados.

El documento US-A 4 684 613 se refiere a un dispositivo para retirar muestras de medios semi-sólidos mediante un punzón oscilante.

Sumario de la invención

Los objetos anteriores se logran mediante un método según la reivindicación 1. Puede obtenerse una pluralidad de secciones a partir de la disposición receptora de modo que cada sección contiene una pluralidad de especímenes donantes que mantienen sus ubicaciones asignadas. En cada sección se lleva a cabo un análisis histológico diferente, para determinar si existen correlaciones entre los resultados de los diferentes análisis en las ubicaciones correspondientes de la disposición. En realizaciones particulares, el espécimen donante se obtiene mediante la perforación de una muestra alargada, tal como un núcleo cilíndrico, a partir de un tejido donante, y la colocación del espécimen donante en un receptáculo de forma complementaria, tal como un núcleo cilíndrico, en la disposición receptora. Los análisis que pueden llevarse a cabo en los especímenes donantes incluyen análisis inmunológicos, hibridación de ácido nucleico y caracterización clínico-anatomopatológica del espécimen.

En una realización más particular del método, se forma un bloque receptor a partir de un medio de inclusión rígido tal como parafina que puede cortarse con un punzón o un microtomo, y también se forma un bloque donante por separado mediante la inclusión de un espécimen biológico en el medio de inclusión. Se perforan núcleos receptáculos cilíndricos en el bloque receptor para formar una disposición de receptáculos en posiciones fijas, y se obtienen núcleos de muestras donantes cilíndricas del espécimen biológico incluido en el bloque donante. Los núcleos de muestra donantes se colocan entonces en los receptáculos cilíndricos en ubicaciones asignadas en la disposición, y el bloque receptor se corta en láminas para obtener una sección transversal de los núcleos de muestra donante en la disposición, sin desbaratar las ubicaciones de disposición asignadas. Puede llevarse a cabo un análisis histológico diferente en cada sección, por ejemplo, usando anticuerpos monoclonales diferentes que reconozcan antígenos distintos, o una combinación de anticuerpos monoclonales distintos desde el punto de vista antigénico y sondas de ácido nucleico (por ejemplo, ARN y ADN) en secciones secuenciales. Se compara el resultado de cada análisis histológico distinto en cada posición de la disposición, por ejemplo, para determinar si un tejido que expresa un receptor de estrógeno también presenta evidencias de que se ha activado un oncogen en particular.

En una realización más particular del método, se forma un bloque receptor a partir de un medio de inclusión tal como parafina que puede cortarse con un punzón o un microtomo, y también se forma un bloque donante por separado mediante inclusión de un espécimen biológico en el medio de inclusión. Los núcleos receptáculos cilíndricos se perforan en el bloque receptor para formar una disposición de receptáculos en posiciones fijas, y se obtienen en el bloque donante núcleos de muestra donantes cilíndricos del espécimen biológico incluido. Los núcleos de muestra donantes se colocan entonces en los receptáculos cilíndricos en ubicaciones asignadas en la disposición, y el bloque receptor se corta en láminas para obtener una sección transversal de los núcleos de muestra donantes en la disposición, sin desbaratar las ubicaciones de disposición asignadas. En cada sección puede llevarse a cabo un análisis histológico diferente, por ejemplo, usando anticuerpos monoclonales diferentes que reconozcan antígenos distintos, o una combinación de anticuerpos monoclonales distintos desde el punto de vista antigénico y sondas de ácido nucleico (por ejemplo ARN y ADN) en secciones secuenciales. Se compara el resultado de cada análisis histológico distinto en cada posición de la disposición, por ejemplo, para determinar si un tejido que expresa un receptor de estrógeno también presenta evidencias de que se ha activado un oncogen en particular. Entonces puede correlacionarse la presencia o ausencia del receptor de estrógeno y el oncogen con información anatomopatológica o clínica sobre el tejido (tal como la presencia de enfermedad metastásica o el grado histológico de un tumor). Este análisis en paralelo simultáneo de múltiples especímenes ayuda a aclarar la interrelación de múltiples características moleculares y clínicas del tejido.

Pueden obtenerse muestras alargadas de tejido a partir de un espécimen de tejido, tal como un tumor, y el espécimen puede someterse a análisis de laboratorio, tal como análisis histológico o molecular. La muestra de tejido alargada puede tomarse de una región de interés del espécimen de tejido, y el tamaño de la muestra es suficientemente pequeño para que la característica que se está analizando sea sustancialmente homogénea en toda la pequeña muestra. En una realización descrita, la muestra es una muestra cilíndrica puncionada a partir del espécimen de tejido, siendo el espécimen cilíndrico aproximadamente de 1-4 mm de largo y con un diámetro de aproximadamente 0,1-4 mm, por ejemplo aproximadamente 0,3-2,0 mm. En realizaciones específicas, el diámetro del cilindro es inferior a aproximadamente 1,0 mm, por ejemplo, 0,6 mm. La muestra se conserva preferiblemente de una manera (tal como fijación en etanol) que no interfiera con el análisis de ácidos nucleicos, y que por tanto pueda someterse a la muestra a cualquier tipo de análisis molecular, tal como cualquier tipo de análisis molecular basado en ADN o ARN aislado.

La invención también incluye un aparato para preparar especímenes para el análisis en paralelo de secciones de disposiciones de material biológico, tal como se define en la reivindicación 17. El aparato puede incluir una plataforma y un bloque donante de tejido sobre la plataforma, un punzón que punciona o perfora un espécimen de tejido a partir del bloque donante. La plataforma también puede llevar un bloque receptor en el que el punzón forma una disposición de receptáculos en posiciones seleccionadas. Cada receptáculo puede posicionarse de tal manera que pueda expulsarse un espécimen de tejido desde el punzón oscilante hacia el receptáculo. Un dispositivo de colocación en x-y desplaza de manera incremental el punzón o el bloque receptor uno con respecto al otro a medida que el punzón oscila, para formar la disposición de receptáculos. El dispositivo de colocación en x-y también alinea receptáculos secuenciales del bloque receptor con el punzón para suministrar especímenes de tejido desde el punzón hacia el receptáculo. Puede introducirse un estilete en el punzón para expulsar el contenido del punzón, que puede ser o bien parafina del bloque receptor o tejido del bloque donante. Las regiones de interés del espécimen de tejido se ubican mediante el posicionamiento de un portaobjetos de sección fina sobre el bloque donante, para alinear estructuras de interés en el portaobjetos de sección fina con las regiones de espécimen de tejido correspondientes en el bloque donante.

Estos y otros objetos, características y ventajas de la invención serán más evidentes a partir de la siguiente descripción detallada de las realizaciones preferidas que se realiza con referencia a los dibujos adjuntos.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es una vista en perspectiva esquemática de una primera realización del dispositivo de punzón de la presente invención, que muestra un alineamiento del punzón por encima de una región de interés de tejido donante en un bloque donante.

La figura 2 es una vista similar a la figura 1, pero en la que se ha hecho avanzar el punzón para obtener una muestra de espécimen donante.

La figura 3 es una vista en perspectiva esquemática de un bloque receptor en el que se ha colocado el espécimen donante.

Las figuras 4-8 ilustran etapas en la preparación de disposiciones de sección fina a partir del bloque receptor.

La figura 9 es una vista en perspectiva de un dispositivo de bloqueo para sujetar un espécimen montado en un portaobjetos por encima del tejido en el bloque donante para ubicar una región de interés.

La figura 10A es una vista de una disposición de tejido de sección fina, teñida con H y E (hematoxilina y eosina) montada en un portaobjetos para examen microscópico.

La figura 10B es una vista ampliada de una parte del portaobjetos en la figura 10A, que muestra los resultados de la hibridación in situ de ARNm erbB2 en una disposición de tejido de la región en el pequeño rectángulo en la figura 10A.

La figura 10C es un gel de electroforesis que muestra que puede extraerse ADN y ARN de elevado peso molecular de los especímenes de cáncer de mama.

La figura 10D es una vista ampliada de una de las muestras de tejido de la disposición en la figura 10A, que muestra una tinción con inmunoperoxidasa para el antígeno erbB2.

La figura 10E es una vista similar a la figura 10D, que muestra un alto nivel de amplificación génica de erbB2 detectada por hibridación in situ fluorescente (FISH - fluorescent in situ hybridization) de tejido en la disposición de una sonda de ADN de erbB2.

La figura 11 es una vista esquemática que ilustra un ejemplo de análisis en paralelo de sondas obtenidas por el método de la presente invención.

La figura 12 es una vista ampliada de una parte de la figura 11.

La figura 13 es una vista desde arriba de una segunda realización de un dispositivo para formar las disposiciones de la presente invención.

La figura 14 es una vista frontal del dispositivo mostrado en la figura 13, que ilustra la formación de un receptáculo en un bloque receptor con un punzón receptor.

La figura 15 es una vista similar a la figura 14, pero que muestra la expulsión de un tapón del punzón receptor hacia una bandeja de desechos.

La figura 16 es una vista que muestra un punzón donante que obtiene un espécimen de tejido a partir de un bloque donante.

La figura 17 es una vista que muestra una inserción del tejido donante en un receptáculo del bloque receptor.

La figura 18 es una vista ampliada del punzón donante alineado por encima de una estructura de interés en el bloque donante, que se muestra en sección transversal.

La figura 19 es una vista en sección transversal ampliada del punzón receptor, mientras que la figura 20 es una vista similar del punzón donante, que ilustra los diámetros de sección transversal relativos de los dos punzones.

La figura 21 es una vista en sección transversal del bloque receptor con los especímenes donantes dispuestos en la disposición receptora, y mostrando líneas de secciones de microtomo del bloque receptor.

La figura 22 es una vista esquemática de un sistema informático en el que puede implementarse el método de la presente invención.

La figura 23 es un algoritmo que ilustra un ejemplo del método implementado por ordenador de la presente invención.

Descripción detallada Realizaciones de las figuras 1-10

En las figuras 1-2 se muestra una primera realización del dispositivo para elaborar las micro-disposiciones de la presente invención, en la que un bloque 30 donante se muestra en un recipiente 31 rectangular montado en una plataforma 32 estacionaria que tiene una guía 34 de borde en forma de L que mantiene el recipiente 31 donante en una orientación predeterminada en la plataforma 32. Se monta un aparato 38 de punzón por encima de la plataforma 32, e incluye una placa 40 de guía vertical y una placa 42 de posicionamiento horizontal. La placa 42 de posicionamiento se monta en una platina x-y (no mostrada) que puede colocarse de manera precisa con un par de micrómetros digitales.

La placa 40 de guía vertical tiene una cara frontal plana que proporciona una superficie de guía de precisión contra la cual puede deslizarse una base 44 de punzón oscilante a lo largo de un carril 46 entre una posición retraída mostrada en la figura 1 y una posición extendida mostrada en la figura 2. Una banda 48 elástica ayuda a controlar el movimiento de la base 44 a lo largo de esta trayectoria, y los límites de avance y retracción de la base 44 se establecen mediante un elemento 46 de carril, que forma un tope que limita la amplitud de la oscilación de la base 44. Se monta un punzón 50 de tubo de acero inoxidable y de pared fina con bordes anteriores afilados sobre la cara inferior plana de la base 44, de modo que el punzón 50 puede hacerse avanzar y retroceder con respecto a la plataforma 32, y el recipiente 31 sobre la plataforma. El interior hueco del punzón 50 es continuo con una perforación cilíndrica a través de la base 44, y la perforación se abre en la abertura 51 en un reborde 53 horizontal de la base 44.

La figura 1 muestra que puede obtenerse una sección fina de tejido a partir del bloque 30 donante y montarse sobre un portaobjetos 52 (con la preparación y tinción adecuadas) de tal modo que pueden ubicarse estructuras anatómicas y micro-anatómicas de interés en el bloque 30. El portaobjetos 52 puede sujetarse por encima del bloque 30 donante mediante una sujeción 54 de brazo articulado (figura 9) con una pinza 56 que sujeta de manera segura un borde de un portaobjetos 58 de soporte transparente. La sujeción 54 de brazo puede articularse en la unión 60, para girar entre una primera posición en la que el portaobjetos 58 de soporte está bloqueado en posición por encima del recipiente 31, y una segunda posición en la que el portaobjetos 58 de soporte se mueve horizontalmente alejándose de la posición mostrada en la figura 9 para permitir el acceso libre al punzón 50.

En funcionamiento, el recipiente 31 rectangular se coloca sobre la plataforma 32 (figura 1) estando contiguos los bordes del recipiente 31 a las guías 34 de borde para sujetar el recipiente 31 en una posición seleccionada. Un bloque 30 donante se prepara mediante inclusión en parafina de un espécimen de tejido bruto (tal como un espécimen 62 de tumor en tres dimensiones). Se corta una sección delgada del bloque 30 donante, se tiñe, y se monta en el portaobjetos 52 como una sección 64 delgada, y a continuación se coloca el portaobjetos 52 sobre el portaobjetos 58 de soporte y se coloca por encima del bloque 30 donante tal como se muestra en la figura 9. El portaobjetos 52 puede trasladarse por el portaobjetos 58 de soporte hasta que los bordes de la sección 64 delgada se alineen con los bordes del espécimen patológico bruto, tal como se muestra con las líneas de puntos en la figura 9. Entonces el brazo 54 se bloquea en la primera posición, a la que puede volver el brazo posteriormente tras el desplazamiento hasta una segunda posición.

Entonces puede ubicarse una estructura 66 micro-anatómica o histológica de interés mediante el examen de la sección delgada a través de un microscopio (no mostrado). Si el espécimen de tejido es, por ejemplo, un adenocarcinoma de mama, entonces la ubicación 66 de interés puede ser un área del espécimen en la que la arquitectura celular sugiera metaplasia (por ejemplo, núcleos picnóticos, pleomorfismo, capacidad de invasión). Una vez ubicada la estructura 66 de interés, la región correspondiente del espécimen 62 de tejido de la que se obtuvo la estructura 66 de sección delgada de interés se ubica inmediatamente por debajo de la estructura 66 de interés. Tal como se muestra en la figura 1, la placa 42 de posicionamiento puede moverse en las direcciones x e y (bajo el control de los micrómetros digitales o una palanca de mando), o el bloque donante puede moverse unas distancias mayores, para alinear el punzón 50 en posición por encima de la región de interés del bloque 30 donante, y a continuación se pivota el portaobjetos 58 de soporte de manera horizontal alejándose de su posición por encima del bloque 30 donante alrededor de la articulación 60 de pivote (figura 9).

El punzón 50 se introduce entonces en la estructura de interés en el bloque 30 donante (figura 2) haciendo avanzar la placa 40 de guía vertical a lo largo del carril 46 hasta que la placa 44 alcanza su posición de tope (que establece previamente el aparato 38). A medida que avanza el punzón 50, su borde anterior afilado perfora un espécimen de tejido cilíndrico a partir del bloque 30 donante, y el espécimen queda retenido dentro del punzón cuando el punzo oscila hacia atrás hasta su posición retraída mostrada en la figura 1. El espécimen de tejido cilíndrico puede sacarse posteriormente del punzón 50 haciendo avanzar un estilete (no mostrado) hacia la abertura 51. El espécimen de tejido se saca, por ejemplo, del punzón 50 y se introduce en un receptáculo cilíndrico de forma y tamaño complementarios en una disposición de receptáculos en un bloque 70 receptor mostrado en la figura 3.

Pueden prepararse uno o más bloques 70 receptores antes de obtener el espécimen de tejido del bloque 30 donante. El bloque 70 puede prepararse colocando un bloque de parafina sólida en un recipiente 31 y usando un punzón 50 para hacer punciones cilíndricas en el bloque 70 en un patrón regular que produce una disposición de receptáculos cilíndricos del tipo mostrado en la figura 3. La disposición regular puede generarse posicionando el punzón 50 en un punto inicial por encima del bloque 70 (por ejemplo una esquina de la futura disposición), haciendo avanzar y luego retrayendo el punzón para extraer un núcleo cilíndrico desde una coordenada específica en el bloque 70, sacando luego el núcleo del punzón introduciendo un estilete en la abertura 51. El aparato de punzón o el bloque receptor se mueve entonces en incrementos regulares en las direcciones x y/o y, a la segunda coordenada de la disposición, y se repite la etapa de perforación. En la realización específica descrita de la figura 3, los receptáculos cilíndricos de la disposición tienen diámetros de aproximadamente 0,6 mm, estando separados los centros de los cilindros por una distancia de aproximadamente 0,7 mm (de modo que existe una distancia de aproximadamente 0,05 mm entre los bordes adyacentes de los receptáculos).

En un ejemplo específico, se tomaron biopsias de tejido de núcleo con un diámetro de 0,6 mm y una altura de 3-4 mm, de regiones representativas seleccionadas de bloques tumorales incluidos en parafina "donantes" y se dispusieron de manera precisa en un nuevo bloque de parafina "receptor" (20 mm x 45 mm). Se colocaron las secciones teñidas con H y E por encimas de los bloques donantes y se usaron para guiar la toma de muestras de sitios morfológicamente representativos en los tumores. Aunque el diámetro del punzón de biopsia puede variarse, se ha visto que los cilindros de 0,6 mm son adecuados porque son lo suficientemente grandes para evaluar patrones histológicos en cada elemento de la disposición de tumor, aunque son lo suficientemente pequeños para producir sólo un daño mínimo a los bloques de tejido donante original, y para aislar bloques de tejido razonablemente homogéneos. Pueden disponerse hasta 1000 de tales cilindros en un bloque de parafina receptor de 20 x 45 mm. Los diámetros descritos específicos de los cilindros son de 0,1-4,0 mm, por ejemplo, 0,5-2,0 mm, y lo más específicamente inferior a 1 mm, por ejemplo de 0,6 mm. La automatización del procedimiento, con colocación de los especímenes guiada por ordenador, permite que se coloquen especímenes muy pequeños muy juntos en la disposición receptora.

La figura 4 muestra la disposición en el bloque receptor después de que los receptáculos de la disposición se hayan llenado con los cilindros de espécimen de tejido. La superficie superior del bloque receptor se cubre entonces con una película 74 adhesiva de un sistema de seccionamiento de cinta recubierta de adhesivo (Instrumedics) para ayudar a mantener las secciones de cilindro de tejido en su lugar en la disposición una vez que ésta se corta. Con la película adhesiva en su lugar, se corta una sección de 4-8 \mum del bloque receptor transversalmente al eje longitudinal de los cilindros de tejido (figura 5) para producir una sección 76 de microdisposición fina (que contiene secciones cilíndricas de espécimen de tejido en forma de discos) que se transfiere a un portaobjetos 78 de espécimen convencional. La sección 76 de microdisposición se adhiere a un portaobjetos 78, por ejemplo, mediante adhesivo sobre el portaobjetos. Entonces la película 74 se despega del elemento 76 de microdisposición subyacente para exponerlo al procesamiento. Resulta adecuado un borde 80 oscurecido para el marcado o el manejo del portaobjetos.

Se fijó un espécimen de tejido de cáncer de mama en etanol frío para ayudar a conservar ADN y ARN de elevado peso molecular, y de esta manera se fijaron 372 de los especímenes. Pueden cortarse de cada bloque al menos 200 secciones de disposición de tumor consecutivas de 4-8 \mum, proporcionando dianas para análisis in situ correlacionados de número de copias o expresión de múltiples genes. Este análisis se lleva a cabo realizando pruebas para determinar diferentes amplificaciones génicas en secciones de disposición independientes, y comparando los resultados de las pruebas en coordenadas idénticas (que se corresponden con especímenes de tejido del mismo cilindro de tejido obtenido a partir del bloque donante). Este enfoque permite la medición de prácticamente cientos de características moleculares de cada tumor, facilitando así la construcción de una gran serie de características genotípicas o fenotípicas correlacionadas de tumores humanos sin cultivar.

Un ejemplo de una única microdisposición 76 que contiene 645 especímenes se muestra en la figura 10A. En la figura 10B se muestra una sección ampliada de la microdisposición (destacada mediante un rectángulo en la figura 10A), en la que un autorradiograma de la hibridación in situ de ARNm de erbB2 ilustra que dos especímenes adyacentes en la disposición demuestran una fuerte señal de hibridación. La figura 10C ilustra geles de electroforesis que demuestran que puede extraerse ADN y ARN de elevado peso molecular de especímenes de cáncer de mama fijados en etanol a 4ºC durante la noche en una estufa al vacío.

Uno de los especímenes de tejido que dio señales "positivas" fluorescentes también se analizó mediante tinción con inmunoperoxidasa, tal como se muestra en la figura 10D, en la que se confirmó (mediante la tinción oscura) que el producto génico erbB2 estaba presente. Se usó una sonda de ADN para el gen erbB2 para llevar a cabo una hibridación in situ fluorescente (FISH). La figura 10D muestra uno de los elementos de disposición de tumor, que demostró un alto nivel de amplificación de genes erbB2. La inserción en la figura 10E muestra tres núcleos con numerosas señales de hibridación de erbB2 fuertemente agrupadas y dos copias de la sonda de referencia centromérica. Sobre estos ensayos se dan detalles adicionales en los ejemplos 1-4 más adelante.

El potencial de la tecnología de disposición de la presente invención para llevar a cabo análisis moleculares rápidos en paralelo de múltiples especímenes de tejido se ilustra en la figura 11, en la que el eje y de los gráficos se corresponde con los porcentajes de tumores en grupos específicos que tienen características clínico-anatomopatológicas o moleculares. Este diagrama muestra correlaciones entre características clínicas e histo-anatomopatológicas de los especímenes de tejido en la microdisposición. Cada recuadro pequeño en las filas alineadas de la figura 11B representa una ubicación de coordenadas en la disposición. Las coordenadas correspondientes de secciones delgadas consecutivas del bloque receptor se alinean verticalmente una encima de otra en las filas que se extienden horizontalmente. Estos resultados muestran que los especímenes de tejido podrían clasificarse en cuatro clasificaciones de tumores (figura 11A) basadas en la presencia o ausencia de expresión del receptor de estrógeno de membrana celular y la presencia o ausencia de la mutación de p53 en el ADN celular. En la figura 11B, la presencia de la mutación de p53 se muestra mediante un recuadro oscurecido, aunque la presencia de receptores de estrógeno también se muestra mediante un recuadro oscurecido. La categorización en cada uno de los cuatro grupos
(ER-/p53+, ER-/p53-, ER+/p53+ y ER+/p53-) se muestra mediante las líneas de puntos entre las figuras 11A y 11B, las cuales dividen las categorías en grupos I, II, III y IV correspondientes a la categoría de ER/p53.

La figura 11B también muestra características clínicas que se asociaron con el tejido en cada una de las coordenadas respectivas de la disposición. Un recuadro oscurecido para Edad indica que la paciente es premenopáusica, un recuadro N oscurecido indica la presencia de enfermedad metastásica en los ganglios linfáticos de la región, un recuadro T oscurecido indica un estadio 3 o 4, un tumor que está más avanzado desde el punto de vista clínico, y un recuadro oscurecido para el grado indica un tumor de grado elevado (al menos grado III) que está asociado con una mayor malignidad. La correlación de la categoría ER/p53 puede llevarse a cabo comparando las cuatro líneas superiores de los recuadros indicadores clínicos (Edad, N, T, Grado) con las dos líneas centrales de los recuadros (categoría ER/p53). Los resultados de esta correlación cruzada se muestran en el gráfico de barras de la figura 11A, en el que puede observarse que los tumores ER-/p53+ (grupo 1) tienden a tener un grado más elevado que los otros tumores, y presentaron una frecuencia particularmente más elevada de amplificación de myc, mientras que los tumores ER+/p53+ (grupo III) era más probable que tuvieran nodos positivos en el momento de la resección quirúrgica. Los tumores ER-/P53- (grupo II) mostraron que el gen más comúnmente amplificado en ese grupo era erbB2. Por el contrario, los tumores ER-/p53- (grupo II) y ER+/p53- (grupo IV) mostraron menos indicadores de enfermedad grave, sugiriendo así una correlación entre la ausencia de la mutación de p53 y un mejor pronóstico.

Este método también se usó para analizar los números de copias de varios de los principales oncogenes de cáncer de mama en los 372 especímenes de cáncer de mama primario dispuestos en experimentos de FISH consecutivos, y esos resultados se usaron para determinar correlaciones entre las clasificaciones ER/p53 y la expresión de estos otros oncogenes. Estos resultados se obtuvieron usando sondas para cada uno de los oncogenes por separado, en secciones sucesivas del bloque receptor, y comparando los resultados en coordenadas correspondientes de la disposición. En la figura 11B, se indica un resultado positivo para la amplificación del marcador u oncogen específico (mybL2, 20q13, 17q23, myc, cnd y erbB2) mediante un recuadro oscurecido. El oncogen erbB2 se amplificó en un 18% de los 372 especímenes dispuestos, myc en un 25% y ciclina D1 (cnd1) en un 24% de los tumores.

Se observó que las dos nuevas regiones recientemente descubiertas de amplificación de ADN frecuente en cáncer de mama, 17q23 y 20q13, se amplificaban en un 13% y un 6% de los tumores, respectivamente. Se observó que el oncogen mybL2 (que recientemente se ubicó en 20q13.1 y se observó que se sobreexpresaba en líneas celulares de cáncer de mama) se amplificaba en un 7% del mismo conjunto de tumores. MybL2 se amplificó en tumores con un número de copias normal del locus 20q13 principal, indicando que puede definir una región seleccionada de manera independiente de amplificación en 20q. Las líneas de puntos entre las figuras 11B y 11C dividen de nuevo los patrones de co-amplificación complejos de estos genes en los grupos I-IV que corresponden a ER-/p53+, ER-/p53-, ER+/p53+ y ER+/p53-.

Las figuras 11C y 11D muestra que el 70% de los especímenes ER-/p53+ fueron positivos para uno o más de estos oncogenes, y que myc fue el oncogen predominante amplificado en este grupo. Por el contrario, sólo el 43% de los especímenes en el grupo ER+/p53 mostró co-amplificación de uno de estos oncogenes, y esta información podría a su vez correlacionarse con los parámetros clínicos mostrados en la figura 11A. Por tanto, la tecnología de microdisposición permite examinar un gran número de especímenes tumorales conveniente y rápidamente para estas numerosas características, y analizar para determinar los patrones de expresión génica que pueden relacionarse con la presentación clínica del paciente y la evolución molecular de la enfermedad. En ausencia de la tecnología de microdisposición de la presente invención, es más difícil obtener estas correlaciones.

En la figura 12 se ilustra un método específico de obtención de estas correlaciones, que es una ampliación de la parte derecha de la figura 11B. La microdisposición 76 (figura 10A) está dispuesta en secciones que contienen diecisiete filas y nueve columnas de ubicaciones circulares que corresponden a las secciones transversales de especímenes de tejido cilíndricos de diferentes tumores, pudiendo representarse cada ubicación en la microdisposición mediante las coordenadas (fila, columna). Por ejemplo, los especímenes en la primera fila de la primera sección tienen posiciones de coordenadas (1, 1) (1, 2)...(1, 9), y los especímenes en la segunda fila tienen las posiciones de coordenadas (2, 1), (2, 2)...(2, 9). Cada una de estas coordenadas de disposición puede usarse para ubicar especímenes de tejido de posiciones correspondientes en secciones secuenciales del bloque receptor, para identificar especímenes de tejido de la disposición que se cortaron a partir del mismo cilindro de tejido.

Tal como se muestra en la figura 12, la disposición rectangular se convierte en una representación lineal en la que cada recuadro de la representación lineal se corresponde con una posición de coordenadas de la disposición. Cada una de las líneas de recuadros se alinea de tal modo que cada recuadro que se corresponde con una posición de coordenadas de disposición idéntica se ubica por encima de otros recuadros de la misma posición de coordenadas. Por tanto, los recuadros conectados por la línea de puntos I se corresponden con los resultados que pueden obtenerse observando los resultados en la posición de coordenadas (1, 1) en secciones delgadas sucesivas del bloque donante, o con los datos clínicos que pueden no obtenerse de la microdisposición, pero que pueden introducirse en el sistema para identificar adicionalmente el tejido de un tumor que corresponde a la posición de coordenadas. De manera similar, los recuadros conectados por la línea 10 de puntos se corresponden con los resultados que pueden observarse en la posición de coordenadas (2, 1) de la disposición, y los recuadros conectados por la línea 15 de puntos se corresponden con los resultados en la posición de coordenadas (2, 6) de la disposición. Las letras a, b, c, d, e, f, g, y h se corresponden con secciones sucesivas del bloque donante que se cortan para formar la disposición.

Comparando los recuadros alineados a lo largo de la línea 1 en la figura 12, puede observarse que se obtuvo un tumor de una mujer postmenopáusica sin enfermedad metastásica en sus ganglios linfáticos en el momento de la resección quirúrgica, en el que el tumor era inferior a un estadio 3, pero en el que el análisis histológico del tumor fue de al menos grado III. Se tomó un bloque de tejido a partir de este tumor y se introdujo en la disposición receptora en la posición de coordenadas (1, 1), y una vez completada la disposición se seccionó en ocho secciones paralelas (a, b, c, d, e, f, g, y h) cada una de las cuales contenía una sección representativa de la disposición cilíndrica. Se analizó cada una de estas secciones con una sonda específica diferente para un atributo molecular particular. En la sección a, los resultados indicaron que este espécimen de tejido era p53+; en la sección b que era ER-; en la sección c que no mostraba amplificación del oncogen mybL2; en las secciones d, e, f, g y h por separado, que eran positivas para la amplificación de 20q13, 17q23, myc, cnd1 y erbB2.

Pueden realizarse comparaciones similares de las características moleculares del cilindro de espécimen tumoral que se colocó en la posición de coordenadas (2, 1) siguiendo la línea 10 vertical siguiente en la figura 12, que conecta el décimo recuadro en cada línea, corresponde a la segunda fila, primera columna (2, 1) de la disposición 76 de la figura 10(A). De manera similar pueden analizarse las características de las secciones del cilindro de espécimen tumoral en la posición de coordenadas (2, 6) siguiendo la línea vertical 15 hacia abajo a través del recuadro número 15 de cada fila. De esta manera, puede realizarse información paralela sobre las secciones de la disposición por separado para todas las 372 posiciones de la disposición. Esta información puede presentarse visualmente para el análisis, tal como en la figura 12, o introducirse en una base de datos para el análisis y la correlación de las diferentes características moleculares (tales como patrones de amplificación de oncogen, y la correspondencia de esos patrones de amplificación con la presentación clínica del
tumor).

El análisis de secciones consecutivas de las disposiciones permite la co-localización de cientos de dianas de ADN, ARN o proteína diferentes en las mismas poblaciones celulares en regiones morfológicamente definidas de cada tumor, lo cual facilita la construcción de una base de datos para un gran número de características genotípicas o fenotípicas correlacionadas de tumores humanos no cultivados. También se facilita la puntuación de ARNm en hibridaciones in situ o tinción inmunohistoquímica de proteínas con microdisposiciones de tejidos de tumores, porque se usan pequeñas cantidades de reactivos idénticos para cada análisis. Las disposiciones de tumores también reducen sustancialmente el consumo de tejidos, el uso de reactivos, y la carga de trabajo cuando se compara con el procesamiento de especímenes convencionales individuales para seccionar, teñir y puntuar. El análisis combinado de varias dianas de ADN, ARN y proteínas proporciona un medio potente para la estratificación de especímenes de tumores en virtud de sus características moleculares. Tales patrones serán de ayuda para detectar propiedades moleculares importantes pero previamente no apreciadas de los tumores que pueden dar lugar a una utilidad diagnóstica o pronóstica.

Estos resultados muestran que los cilindros muy pequeños usados para preparar disposiciones de tejidos pueden proporcionar en la mayoría de los casos una información precisa, especialmente cuando el lugar para la toma de muestras de tejidos a partir del bloque donante se selecciona para que contenga estructuras histológicas que son las más representativas de regiones de tumor. También es posible recoger muestras a partir de múltiples regiones histológicamente definidas en un único bloque de tejido donante para obtener una representación más exhaustiva del tejido original, y para analizar directamente la correlación entre el fenotipo (morfología del tejido) y el genotipo. Por ejemplo, podría construirse una disposición para incluir cientos de tejidos que representaran diferentes estadios de la evolución de cáncer de mama (por ejemplo tejido normal, hiperplasia, hiperplasia atípica, cáncer intraductal, cáncer invasivo y metastásico). Entonces la tecnología de disposición de tejidos se usaría para analizar los acontecimientos moleculares que corresponden a la evolución del tumor.

Un empaquetamiento más fuerte de cilindros y un bloque receptor más grande también puede proporcionar un número incluso superior de especímenes por disposición. Podrían depositarse archivos enteros de laboratorios de anatomía patológica en microdisposiciones de tejidos de 1000 especímenes por duplicado para la determinación de perfil molecular. Usando la automatización del procedimiento para la toma de muestras y la disposición, es posible realizar docenas de disposiciones de tumores por duplicado, proporcionando cada una cientos de secciones para análisis moleculares. La misma estrategia e instrumentación desarrolladas para disposiciones de tumores también permiten microdisección de cilindros de tejido para el aislamiento de ARN y ADN de elevado peso molecular a partir de elementos de tejido de tumor fijados de manera óptima, definidos morfológicamente, permitiendo de este modo un análisis correlacionado de los mismo tumores mediante técnicas basadas en PCR para ADN y ARN. Cuando se planea un análisis de ácidos nucleicos, el espécimen de tejido se fija preferiblemente (antes de ser incluido en parafina) en etanol o Molecular Biology Fixative (fijador para biología molecular, Streck Laboratories, Inc., Omaha, NE) en vez de en formalina, porque la formalina puede reticular y dañar de otro modo el ácido nucleico. El cilindro de tejido de la presente invención proporciona una amplia cantidad de ADN o ARN en la que realizar una variedad de análisis moleculares.

El potencial de esta tecnología de disposición se ha ilustrado en análisis de FISH de amplificaciones génicas en cáncer de mama. El método FISH es un método excelente para la visualización y detección precisa de reestructuraciones genéticas (amplificaciones, deleciones o translocaciones) en células individuales, morfológicamente definidas. La tecnología de disposición de tumores combinada permite que el método FISH se convierta en un método de alto rendimiento, potente que permite el análisis de cientos de especímenes por día.

Realización de las figuras 13-23

En las figuras 13-23 se muestra un ejemplo de un sistema automatizado para una preparación a alta velocidad de las microdisposiciones. El sistema incluye una fase 100 que tiene un accionamiento 102 en x y un accionamiento 104 en y, cada uno de los cuales rota respectivamente un eje 106, 108 de accionamiento. El eje 108 desplaza una mesa 110 de laboratorio de especímenes en una dirección y, mientras que el eje 106 desplaza una bandeja 112 sobre la mesa 110 de laboratorio en una dirección x. Montados en una fila frontal de la bandeja 112 se encuentran tres recipientes 116, 118 y 120 receptores, cada uno de los cuales contiene un bloque 122, 124 o 126 de parafina receptor y un recipiente 128 donante que contiene un bloque 130 de parafina donante, en el que se incluye un espécimen 132 de tejido. En una fila posterior en la bandeja hay dos bandejas 132, 134 donantes de múltiples pocillos (que contienen múltiples recipientes para mantener los especímenes en medio líquido) y un recipiente 136 de desechos.

Dispuesto sobre la fase 100 hay un aparato 140 de punzón que puede desplazarse hacia arriba y abajo en una dirección z. El aparato 140 incluye un accionamiento 142 de estilete, dispuesto verticalmente y central en el que oscila un estilete 144. El aparato 140 también incluye un accionamiento 146 de punzón receptor inclinado, y un accionamiento 148 de punzón donante inclinado. El accionamiento 146 de punzón incluye un pistón 150 oscilante que lleva un punzón 154 receptor tubular en su extremo distal, y un accionamiento 148 de punzón incluye un pistón 152 oscilante que lleva un punzón 156 tubular donante en su extremo distal. Cuando el pistón 150 se extiende (figura 14), el punzón 154 receptor se coloca con la parte superior abierta de su perforación tubular alineada con el estilete 144, y cuando el pistón 152 se extiende (figura 16), el punzón 156 donante se coloca con la parte superior abierta de su perforación tubular alineada con el estilete 144.

El funcionamiento secuencial del aparato 140 se muestra en las figuras 13-17. Una vez que el dispositivo está montado como en la figura 13, puede usarse un sistema informático para hacer funcionar el aparato para conseguir una alta eficacia. Por tanto, el sistema informático puede inicializarse por sí solo determinando la localización de los recipientes en la bandeja 112 mostrada en la figura 13. Entonces se activan los accionamientos 102, 104 en x e y para desplazar la mesa 110 de laboratorio y la bandeja 112 hasta la posición mostrada en la figura 14, de modo que la activación del pistón 150 extiende el punzón 154 receptor hasta una posición sobre la posición (1, 1) en el bloque 122 receptor. Una vez que el punzón 154 se encuentra en posición, el aparato se desplaza hacia abajo en la dirección z para puncionar una perforación cilíndrica en la parafina del bloque receptor. El aparato 140 se desplaza entonces hacia arriba en la dirección z para extraer el punzón 154 del bloque 122 receptor de parafina, pero el punzón 154 retiene un núcleo de parafina que deja un receptáculo cilíndrico en el bloque 122 receptor. Entonces se activan los accionamientos en x-y para desplazar la mesa 110 de laboratorio y colocan el recipiente 136 de desechos por debajo del punzón 154. El accionamiento 142 de estilete se activa entonces para hacer avanzar el estilete 144 hacia la parte superior abierta del punzón 154 alineado, para sacar el núcleo de parafina del punzón 154 y hacia el recipiente 136 de desechos.

El estilete 144 se retrae del punzón 154 receptor, el pistón 150 se retrae, y el accionamiento en x-y desplaza la mesa 110 de laboratorio y la bandeja 112 para colocar el recipiente 128 donante en una posición (mostrada en la figura 16) de modo que el avance del pistón 152 hace que el punzón 156 donante avance hasta una ubicación deseada sobre el bloque 130 donante. A continuación el aparato 140 se desplaza hacia abajo en la dirección z para extraer mediante punzonado un núcleo cilíndrico de tejido a partir del bloque 130 donante y entonces el aparato 140 se desplaza en la dirección z para retirar el punzón 156 donante, reteniendo el espécimen de tejido cilíndrico en el punzón. Entonces el accionamiento en x-y desplaza la mesa 110 de laboratorio y la bandeja 112 hasta la posición mostrada en la figura 17, de modo que el desplazamiento hacia abajo del aparato 140 en la dirección z hace que el punzón 156 donante avance hacia el receptáculo en la posición de coordenadas (1, 1) en el bloque 122 del que se ha extraído el tapón receptor. El punzón 156 donante se alinea por debajo del estilete 144, y se hace avanzar el estilete para sacar el cilindro de tejido retenido del punzón 156 donante, de modo que el cilindro de tejido donante permanece en el receptáculo del bloque 122 receptor a medida que el aparato 140 se desplaza hacia arriba en la dirección z para retraer el punzón 156 donante de la disposición receptora. Entonces se retrae el pistón 152.

Este procedimiento puede repetirse hasta formar un número deseado de receptáculos receptores y rellenarlos con tejidos donantes cilíndricos en ubicaciones de coordenadas deseadas de la disposición. A pesar de que este método ilustrado muestra una formación alternante secuencial de cada receptáculo y la introducción del cilindro de tejido en el receptáculo formado, también es posible formar todos los receptáculos en bloques 122, 124 y 126 receptores como una etapa inicial, y luego ir a la etapa de obtención de especímenes de tejido e introducción de los mismos en los receptáculos formados previamente. Puede usarse repetidamente el mismo espécimen 132 de tejido, o puede cambiarse el espécimen 132 tras obtener cada espécimen de tejido donante, introduciendo un nuevo bloque 130 donante en el recipiente 128. Si se cambia el bloque 130 donante tras obtener cada cilindro de tejido, cada coordenada de la disposición puede incluir tejido de un espécimen de tejido diferente.

En la figura 18 se muestra un dispositivo de posicionamiento, que ayuda a ubicar estructuras de interés de las que puede tomarse especímenes donantes. El dispositivo de posicionamiento incluye un portaobjetos 160 de soporte que se extiende entre las paredes opuestas del recipiente 128 donante, para soportar un portaobjetos 162 de espécimen sobre el que se monta una sección delgada teñida del espécimen 132 en el bloque 130 donante. Usando un microscopio montado en el aparato 140 (el objetivo del microscopio se muestra en 166) pueden encontrarse estructuras microanatómicas de interés. La altura vertical correcta del aparato 140 sobre la superficie superior del bloque 130 donante puede determinarse usando dos luces 168, 170 de posicionamiento que están montadas en el aparato 140. Los haces 172, 174 de luz se proyectan desde las luces 168, 170 con un ángulo de forma que los haces coinciden en un único punto 176 cuando la altura vertical del aparato 140 sobre la superficie superior de la luz se encuentra a un nivel de z deseado. Este nivel de z deseado posicionará los punzones 152, 154 a una altura apropiada para penetrar en la superficie del bloque 130 en la ubicación deseada, y hasta una profundidad deseada.

Es ventajoso si los cilindros de tejido extraídos mediante puncionado a partir del bloque 130 se ajustan de manera segura en los receptáculos receptores que se forman para recibirlos. Si el punzón 156 donante tiene los mismos diámetros interno y externo que el punzón 154 receptor, entonces el espécimen de tejido donante cilíndrico se formará por el diámetro interno del punzón, y el receptáculo receptor se formará por el diámetro externo del punzón. Esta discrepancia proporcionará un receptáculo ligeramente mayor en diámetro que el cilindro de tejido donante. Por lo tanto, tal como muestran las figuras 19 y 20, el punzón 154 receptor tiene un diámetro inferior que el punzón 156 donante. Así, el punzón receptor formará un receptáculo cilíndrico (que tiene un diámetro correspondiente al diámetro externo del punzón 154) con sustancialmente el mismo diámetro que el cilindro 180 de espécimen de tejido, que se forma con un diámetro que se determina por el diámetro interno del punzón 156 donante.

La figura 21 ilustra una sección transversal a través de la disposición receptora, una vez que se han formado los receptáculos 182 y se han rellenado con los cilindros 180 de espécimen de tejido. Pequeñas particiones de material 122 de parafina separan los cilindros 180 de tejido y los receptáculos 182 tal como se ilustra son más profundos que los cilindros 180 de espécimen, de modo que entre el espécimen y la parte inferior de los receptáculos existe un pequeño espacio. Una vez que se ha formado la disposición, puede usarse un micrótomo para cortar una sección S delgada de la parte superior del bloque 122, de modo que la sección S puede montarse sobre un portaobjetos 162 de espécimen (figura 18) para ayudar a ubicar estructuras de interés en el espécimen 132 de tejido. Entonces el micrótomo también corta secciones a, b, c, d, e, f, g y h pudiendo someter cada una a un análisis molecular diferente, tal como ya se describió.

Entorno de trabajo ejemplar

La figura 22 y la siguiente discusión pretenden proporcionar una breve descripción general de un entorno informático adecuado en el que puede implementase la invención. La invención se implementa en una variedad de módulos de programa. Generalmente, los módulos de programa incluyen rutinas, programas, componentes, estructuras de datos, etc. que realizan tareas particulares o implementan tipos de datos abstractos particulares. La invención puede llevarse a cabo con otras configuraciones de sistema informático, incluyendo dispositivos manuales, sistema multiprocesador, sistemas electrónicos de usuario programables o basados en microprocesadores, miniordenadores, unidades centrales, y similares. La invención también puede llevarse a cabo en entornos informáticos distribuidos en los que las tareas se realizan mediante dispositivos de procesamiento remotos que se conectan a través de una red de comunicaciones. En un entorno informático distribuido, los módulos de programa pueden ubicarse tanto en dispositivos de almacenamiento de memoria remotos como locales.

Con referencia a la figura 22 un entorno de trabajo para una realización ilustrada de la presente invención es un sistema 220 informático con un ordenador 222 que comprende al menos una unidad 224 de procesamiento a alta velocidad (CPU), en combinación con un sistema 226 de memoria, un dispositivo 228 de entrada y un dispositivo 230 de salida. Estos elementos están interconectados mediante al menos una estructura 232 de bus.

La CPU 224 ilustrada es de un diseño familiar e incluye una UAL 234 para realizar cálculos, una colección de registros 236 para el almacenamiento temporal de datos e instrucciones, y una unidad 238 de control para controlar el funcionamiento del sistema 220. La CPU 224 puede ser un procesador que tenga cualquiera de una variedad de arquitecturas incluyendo Alpha de Digital; MIPS de MIPS Technology, NEC, IDT, de Siemens y otros; x86 de Intel y otros, incluyendo Cyrix, AMD, y Nexgen; 680x0 de Motorola; y PowerPC de IBM y Motorola.

El sistema 226 de memoria incluye generalmente una memoria 240 principal de alta velocidad en forma de un medio tal como una memoria de acceso aleatorio (RAM) y dispositivos semiconductores de memoria sólo lectura (ROM), y un almacenamiento 242 secundario en forma de medios de almacenamiento a largo plazo tales como disquetes, discos duros, cintas, CD-ROM, memoria flash, etc. y otros dispositivos que almacenan datos usando medios eléctricos, magnéticos, ópticos u otros medios de grabación. La memoria 240 principal también puede incluir una memoria de visualización de vídeo para mostrar imágenes a través de un dispositivo de visualización. Los expertos en la técnica reconocerán que la memoria 226 puede comprender una variedad de componentes alternativos que tengan una variedad de capacidades de almacenamiento.

Los dispositivos 228, 230 de entrada y salida también son familiares. El dispositivo 228 de entrada puede comprender un teclado, un ratón, un escáner, una cámara, una tarjeta de captura, un conmutador limitador (tal como conmutadores locales, de seguridad o estado), un transductor físico (por ejemplo un micrófono), etc. El dispositivo 230 de salida puede comprender una pantalla, una impresora, un controlador por motor, un solenoide, un transductor (por ejemplo un altavoz), etc. Pueden usarse algunos dispositivos, tales como una interfaz de red o un módem, como dispositivos de entrada y/o salida.

Como le es familiar a los expertos en la técnica, el sistema 220 informático incluye además un sistema operativo y al menos un programa de aplicación. El sistema operativo es el conjunto de software que controla el funcionamiento del sistema informático y la asignación de recursos. El programa de aplicación es el conjunto de software que realiza una tarea deseada por el usuario, usando recursos informáticos que se hacen disponibles a través del sistema operativo. Ambos residen en el sistema 226 de memoria ilustrado.

Por ejemplo, la invención podría implementarse con un Power Macintosh 8500 disponible de Apple Computer, o un ordenador personal (PC) compatible de IBM. El Power Macintosh usa una CPU PowerPC 604 de Motorola y ejecuta un sistema operativo
MacOs de Apple Computer tal como System 8. Los dispositivos de entrada y salida pueden interconectarse con la CPU usando la interfaz SCSI bien conocida o con tarjetas de expansión usando el bus de interconexión de componentes periféricos (PCI). Una configuración típica de un Power Macintosh 8500 tiene 72 megabytes de memoria RAM para una memoria principal de alta velocidad y un disco duro de 2 gigabytes para un almacenamiento secundario. Un PC compatible de IBM podría tener una configuración con 32 megabytes de memoria RAM para una memoria principal de alta velocidad y un disco duro de 2-4 gigabytes para un almacenamiento secundario.

Según las prácticas de los expertos en la técnica de programación informática, la presente invención se describe con referencia a actos y representaciones simbólicas de operaciones que realiza el sistema 220 informático, a no ser que se indique lo contrario. Algunas veces se hace referencia a tales actos y operaciones como ejecutados por ordenador. Se apreciará que los actos y operaciones representadas simbólicamente incluyen la manipulación por la CPU 224 de las señales eléctricas que representan bits de datos lo que da como resultado una transformación o reducción de la representación de señales eléctricas, y el mantenimiento de bits de datos en localizaciones de memoria en el sistema 226 de memoria para de este modo volver a configurar o modificar de otro modo el funcionamiento del sistema informático, así como otro procesamiento de señales. Las ubicaciones de memoria en las que se mantienen los bits de datos son localizaciones físicas que tienen propiedades eléctricas, magnéticas u ópticas particulares correspondientes a los bits de datos.

Descripción del sistema de disposición informática

En la figura 23 se muestra un diagrama de bloques que muestra un sistema para llevar a cabo la invención. El hardware se inicializa en la etapa 250, por ejemplo determinando la posición de los punzones 154, 156, la mesa 110 de laboratorio, y la bandeja 112. A continuación el sistema puede configurarse mediante el operador en la etapa 252, por ejemplo introduciendo datos o solicitando al sistema a que encuentre la ubicación (coordenadas x, y) de la esquina derecha superior de cada bloque 122-126 receptor, así como las localizaciones de las bandejas 130-136. En este momento pueden introducirse el número de bloques donantes, receptáculos, velocidad de funcionamiento, etc.

En la etapa 254 el sistema solicita la entrada de información de identificación acerca del primer bloque 130 donante que se colocará en la bandeja 128. Esta información de identificación puede incluir información del número de registro, información clínica acerca del espécimen, y cualquier/u otra información que sería útil para analizar disposiciones de tumores. En la etapa 256, el operador aprieta un botón de función de selección, que levanta los punzones 154, 156 y permite que una palanca de mando desplace los especímenes usando los accionamientos en x-y. Los datos introducidos se muestran en la etapa 258, y se aprueban en la 260.

A continuación el sistema obtiene uno o más especímenes donantes a partir del bloque donante identificado en la etapa 262, y solicita al usuario la entrada de información acerca del siguiente bloque donante. Si se introduce información acerca de otro bloque, el sistema vuelve a la etapa 256 y obtiene el número deseado de especímenes a partir del bloque nuevo. Tras haber colocado un nuevo bloque donante en el recipiente 128 donante, el sistema también comprueba la posición de los punzones en la etapa 268. Si en la etapa 264 no se introduce información acerca de otro bloque, el sistema desplaza la bandeja donante hasta la posición de recarga de modo que puede retirarse un bloque 130 en la bandeja donante. Este sistema también puede adaptarse para la toma de muestras de biopsias cilíndricas a partir de puntos de especímenes controlados histológicamente (tales como tumores) para el aislamiento de ADN/ARN.

La tecnología de disposición de tumores automatizada permite realizar de una manera sencilla pruebas de docenas o cientos de marcadores del mismo conjunto de tumores. Estos estudios pueden llevarse a cabo en un emplazamiento de múltiples centros mediante el envío de bloques de disposiciones de tumores duplicados o secciones a otros laboratorios. El mismo enfoque sería particularmente valioso para realizar pruebas de marcadores moleculares recientemente descubiertos para su utilidad de diagnóstico, pronóstico o terapéutica. La tecnología de disposición de tejidos también facilita la investigación básica del cáncer proporcionando una plataforma para una determinación de perfiles de cientos o miles de tumores en los niveles de ADN, ARN o proteínas, conduciendo a una construcción de una base de datos correlacionada de biomarcadores a partir de una amplia colección de tumores. Por ejemplo, la búsqueda de genes diana de amplificación requiere análisis correlacionados de amplificación y expresión de docenas de genes candidatos y loci en las mismas poblaciones celulares. Tales análisis moleculares extensos de una amplia serie de tumores definida serían difíciles de llevar a cabo con tecnologías convencionales.

Ejemplos de tecnología de disposición

Las aplicaciones de la tecnología de disposición de tejidos no se limitan a los estudios del cáncer, a pesar de que los ejemplos siguientes 1-4 describen realizaciones de su uso en relación a análisis de neoplasmas. Los análisis de disposiciones también podrían ser útiles para entender la expresión y la dosis de múltiples genes en otras enfermedades, así como en tejidos humanos o animales normales, incluyendo depósitos de tejidos de diferentes animales transgénicos o células cultivadas. Los ejemplos específicos siguientes ilustran algunas realizaciones particulares de la invención.

Ejemplo 1 Especímenes de tejido

Se usaron un total de 645 especímenes de cáncer de mama para la construcción de una microdisposición de tejido tumoral de cáncer de mama. Las muestras incluyeron 372 tumores fijados en etanol recién congelados, así como 273 cánceres de mama fijados en formalina, tejidos normales y controles de fijación. El subconjunto de muestras de cáncer de mama congeladas se seleccionó aleatoriamente del banco de tumores de instituto de Anatomía patológica, Universidad de Basilea, que incluye más de 1500 cánceres de mama congelados obtenidos mediante resecciones quirúrgicas durante 1986-1997. Sólo se usaron tumores de este banco de tumores para los análisis moleculares. Este subconjunto se revisó por un anatomopatólogo, que determinó que los especímenes incluían 259 carcinomas ductales, 52 lobulares, 9 medulares, 6 mucosos, 3 cribiformes, 2 papilares, 1 histiocíticos, 1 de células claras y 1 rico en lípidos. También había 15 carcinomas ductales in situ, 2 carcinosarcomas, 4 carcinomas primarios que habían recibido quimioterapia antes de la intervención, 8 tumores recurrentes y 6 metástasis. La clasificación histológica sólo se realizó en tumores primarios invasivos que no se habían sometido a quimioterapia previa. De estos tumores, el 24% era de grado 1, el 40% era de grado 2, y el 36% era de grado 3. El estadio pT fue pT1 en el 29%, pT2 en el 54%, pT3 en el 9%, y pT4 en el 8%. Se examinaron ganglios linfáticos axilares en 282 pacientes (el 45% pNO, el 46% pN1, el 9% pN2). Todos los tumores no fijados previamente se fijaron en etanol frío a +4ºC durante la noche y luego se incluyeron en parafina.

Ejemplo 2 Inmunohistoquímica

Tras la formación de la disposición y la sección del bloque donante, se usaron procedimientos estándar de inmunoperoxidasa indirecta para inmunohistoquímica (ABC-Elite, Vector Laboratories). Se usaron anticuerpos monoclonales de DAKO (Glostrup, Dinamarca) para la detección de p53 (DO-7, ratón, 1:200), erbB-2 (c-erbB-2, conejo, 1:4000), y receptor de estrógeno (ER ID5, ratón, 1:400). Se realizó un tratamiento previo de microondas para p53 (30 minutos a 90º) y recuperación del antígeno erbB-2 (60 minutos a 90º). Se usó diaminobenzidina como cromogen. Se usaron tumores con positividad conocida como controles positivos. Se omitió el anticuerpo primario para controles negativos. Los tumores se consideraron positivos para ER o p53 si se observaba una positividad nuclear inequívoca en al menos el 10% de células tumorales. Se clasificó subjetivamente la tinción de erbB-2 en 3 grupos: negativo (sin tinción), débilmente positivo (positividad membranosa débil), intensamente positivo (positividad membranosa intensa).

Ejemplo 3 Hibridación fluorescente in situ (FISH)

Se realizaron hibridaciones FISH de dos colores usando ciclina D1 marcada con Spectrum-Orange, sondas de myc o erbB2 junto con sondas de referencia centroméricas marcadas con FITC (Vysis). Se realizaron hibridaciones FISH de un color con una región común mínima de 20q13 marcada con espectro naranja (Vysis, y véase Tanner et al., Cancer Res. 54:4257-4260 (1994)), sondas de mybL2 y 17q23 (Barlund et al., Genes Chrom. Cancer20: 372-376 (1997)). Antes de la hibridación, se desparafinaron las secciones de la disposición de tumores, se secaron al aire y se deshidrataron en etanol al 70%, 85% y 100% seguido de desnaturalización durante 5 minutos a 74ºC en solución 2 X SSC de formamida al 70%. La mezcla de hibridación contenía 30 ng de cada sonda y 15 \mug de Cotl-ADN humano. Tras una hibridación durante la noche a 37ºC en una cámara humidificada, se lavaron los portaobjetos y se realizó una tinción de contraste con DAPI 0,2 \muM en una solución que evita la decoloración. Se marcaron las señales de FISH con un microscopio de fluorescencia Zeiss equipado con filtros de paso de doble banda para una visualización simultánea de señales FITC y Spectrum Orange. Se consideraron más de 10 señales de FISH por célula o agrupaciones fuertes de señales como criterios para la amplificación de genes.

Ejemplo 4 Hibridación in situ de ARNm

Para la hibridación in situ de ARNm se desparafinaron secciones de disposición de tumores y se secaron al aire antes de la hibridación. Se marcaron sondas de oligonucleótidos sintéticos frente a ARNm de erbB2 (número de acceso al banco de genes X03363, nucleótidos 350-396) en el extremo 3’ con ^{33}P-dATP usando desoxinucleotidil transferasa terminal. Se hibridaron las secciones en una cámara humidificada a 42ºC durante 18 horas con 1 x 10^{7} CPM/ml de la sonda en 100 \mul de mezcla de hibridación (formamida al 50%, sulfato de dextrano al 10%, sarcosil al 1%, fosfato de sodio 0,02 M, pH 7.0, SSC 4 X, solución de Denhardt 1 X y 10 mg/ml de ADNss). Tras la hibridación, se lavaron las secciones varias veces en 1 X SSC a 55ºC para eliminar la sonda no ligada y se deshidrataron brevemente. Se expusieron las secciones durante tres días a barridos con Phosphorimager (sistema de detección y cuantificación de la radiactividad) para visualizar la expresión de ARNm de ERBB2. Se trataron las secciones de control negativas con ARNasa antes de la hibridación, lo que abolió todas las señales de hibridación.

El presente método permite un análisis de alto rendimiento de cientos de especímenes por disposición. Por tanto esta tecnología proporciona un orden de incremento de magnitud en el número de especímenes que pueden analizarse, en comparación con bloques previos en los que algunas docenas de especímenes fijados en formalina individuales se encuentran en una configuración menos definida o indefinida, y usarse para realizar pruebas de anticuerpos. Las ventajas adicionales de la presente invención incluyen la destrucción insignificante de los bloques de tejido originales, y un protocolo de fijación optimizado que amplía la utilidad de esta técnica para la visualización de dianas de ADN y ARN. El presente método también permite una obtención y distribución mejoradas de tejidos de tumores humanos con fines de investigación. La automatización del procedimiento permite una toma de muestras de especímenes eficaz y una formación de disposiciones en múltiples disposiciones de tejidos, proporcionando cada una hasta 50, 100 o incluso hasta 200 secciones para análisis moleculares. Archivos completos de decenas de miles de tejidos fijados en formalina existentes de laboratorios de anatomía patológica pueden colocarse en algunas docenas de microdisposiciones de tejidos de alta densidad para examinar muchas clases de tipos de tumores, así como diferentes estadios en la progresión del tumor. La estrategia de la disposición de tumores también permite el ensayo de docenas o incluso cientos de marcadores moleculares diagnósticos o pronósticos potenciales del mismo conjunto de tumores. Alternativamente, las muestras de tejidos cilíndricas proporcionan especímenes que pueden usarse para asilar ADN y ARN para análisis moleculares.

En vistas de las muchas realizaciones posibles a las que pueden aplicarse los principios de la invención, deberá reconocerse que las realizaciones ilustradas son ejemplos preferidos de la invención, y no deberán considerarse como una limitación del alcance de la invención. Más bien, el alcance de la invención se define mediante las reivindicaciones siguientes. Por tanto se reivindica como invención todo lo que entra en el alcance de estas reivindicaciones.

Claims (25)

1. Método para realizar una disposición para llevar a cabo un análisis de especímenes biológicos, que comprende:

obtener especímenes donantes alargados de un material (30) donante biológico que ha de analizarse;

proporcionar un elemento (70) receptor que tenga una disposición de receptáculos alargados para recibir los especímenes donantes; y

colocar los especímenes donantes en los receptáculos, en ubicaciones asignadas fijas en el elemento (70) receptor, ubicaciones que se mantienen y graban, teniendo los receptáculos una forma complementaria a la forma de los especímenes donantes,

en el que el proporcionar el elemento (90) receptor comprende proporcionar una disposición de receptáculos alargados en el elemento (70) receptor, extendiéndose los receptáculos transversalmente a un plano de la disposición que ha de analizarse y en el que cada espécimen donante se coloca en un receptáculo que tiene una forma y tamaño de sección transversal complementario a una forma y tamaño de sección transversal del espécimen donante.

2. Método según la reivindicación 1, que comprende además obtener una pluralidad de secciones (76) a partir de la disposición receptora conteniendo cada sección (76) una pluralidad de especímenes donantes que mantienen sus ubicaciones asignadas.

3. Método según la reivindicación 1, en el que los receptáculos alargados son perforaciones cilíndricas en el elemento (70) receptor y cada espécimen se obtiene perforando un espécimen de tejido cilíndrico a partir del material (30) donante, en el que un diámetro de cada receptáculo alargado es sustancialmente idéntico al diámetro del espécimen que se coloca en el receptáculo.

4. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que además comprende asociar un parámetro clínico a cada ubicación asignada en la disposición receptora.

5. Método según la reivindicación 1, en el que la muestra biológica es un espécimen de tejido o preparación celular.

6. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que los receptáculos se encuentran en una disposición sustancialmente regular, separados por una distancia de 0,05 mm entre los bordes adyacentes de los receptáculos.

7. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que se espacian cientos de especímenes donantes en una disposición sustancialmente regular, preferiblemente 372 especímenes donantes.

8. Método según la reivindicación 1, que comprende las etapas de

proporcionar un bloque (30) donante que comprende dicho material (62) donante incluido en un medio de inclusión;

perforar uno o más núcleos de muestra donante a partir de dicho material (62) donante en el bloque donante;

perforar núcleos receptáculos de dicho elemento (70) receptor para formar dicha disposición de receptáculos en posiciones de coordinadas determinadas mediante un sistema automatizado; y

colocar dichos núcleos de muestra donante en los receptáculos complementarios en ubicaciones asignadas en la disposición, de modo que se mantienen las ubicaciones asignadas.

9. Método según la reivindicación 8, que además comprende seccionar el medio de inclusión receptor transversalmente a los núcleos de muestra donante para obtener una sección transversal de los núcleos de muestra donante en la disposición, mientras se mantienen las ubicaciones asignadas en la disposición en secciones transversales consecutivas.

10. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 8 o 9, que además comprende alinear una sección (76) de tejido delgado sobre el bloque (30) donante para identificar un área (66) de interés de la que se toma el núcleo de muestra donante.

11. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en el que cada núcleo de muestra donante es cilíndrico y tiene un diámetro de desde 0,1 mm hasta 4 mm.

12. Método según la reivindicación 1, en el que dicha disposición se forma mediante puncionado de receptáculos alargados con un punzón receptor en el elemento receptor, desplazamiento automático del elemento receptor o punzón de manera incremental para alinear el punzón con una posición de coordenadas nueva en el elemento receptor, y mediante puncionado de otro receptáculo alargado en la nueva posición.

13. Método según la reivindicación 1, en el que la etapa de proporcionar un elemento receptor comprende puncionar un núcleo receptáculo del elemento (122) receptor mediante un punzón (154) receptor y desplazar el núcleo receptáculo desde el punzón (156) receptor con un estilete (144), y en el que la etapa de colocar especímenes donantes en los receptáculos comprende puncionar un espécimen donante de un bloque (130) donante mediante un punzón (156) donante, estando alineado el punzón (156) donante con un receptáculo seleccionado en el bloque (122) receptor, y desplazándose el espécimen donante en el receptáculo seleccionado.

14. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que los especímenes donantes alargados son núcleos cilíndricos que tiene un diámetro inferior a 1 mm.

15. Aparato para preparar especímenes para el análisis en paralelo de secciones de disposiciones de material biológico, que comprende:

una sujeción de bloque donante adaptado para sujetar un bloque (30) donante de tejido en una posición donante; y

un punzón (156) donante posicionado en relación a la sujeción (31) para puncionar un espécimen (76) de tejido a partir del bloque (30) donante de tejido cuando el bloque (30) donante está en la posición donante; y

una sujeción de bloque receptor adaptado para sujetar un bloque (122) receptor en una posición receptora, en la que el bloque receptor comprende una disposición de receptáculos, pudiendo posicionarse cada uno de los receptáculos en una posición preseleccionada en relación al punzón (156) donante para recibir un espécimen de tejido desde el punzón (156) donante en un receptáculo en la posición preseleccionada, que comprende además un punzón (154) receptor separado que puede posicionarse en relación al bloque (122) receptor para puncionar la disposición de receptáculos en el bloque (122) receptor, siendo el punzón (154) receptor separado diferente del punzón (156) donante posicionado para puncionar el espécimen (132) a partir del bloque (130) donante de tejido, de modo que los receptáculos tienen una forma complementaria a la forma del espécimen de tejido.

16. Aparato según la reivindicación 15, que comprende además un dispositivo (102, 104) de posicionamiento en x-y que puede desplazarse de manera incremental para alinear los receptáculos y el punzón (156) donante.

17. Aparato según la reivindicación 15 o 16, que comprende además un estilete (144) situado para su introducción en un punzón (156) donante para expulsar el espécimen de tejido del punzón (156) hacia uno de los receptáculos alineados con el punzón.

18. Aparato según una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, que comprende además un dispositivo de posicionamiento para posicionar un portaobjetos de referencia sobre el bloque (30) donante, para alinear estructuras de interés en el portaobjetos de referencia con las regiones de espécimen (62, 132) de tejido correspondientes en el bloque (30, 130) donante.

19. Aparato según una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, que comprende además una grabadora para grabar posiciones de coordenadas de los receptáculos en el bloque (70, 122) receptor, siendo preferiblemente un sistema (220) implementado por ordenador para grabar las posiciones de los receptáculos, y grabar una identificación del espécimen (62, 132) de tejido que se coloca en cada receptáculo.

20. Aparato según una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, que además comprende un microtomo para seccionar el bloque (122) receptor en secciones que pueden someterse a diferentes análisis.

21. Aparato según una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20, para realizar disposiciones de especímenes biológicos para análisis en serie, comprendiendo el aparato además

un bloque receptor que tiene una disposición de receptáculos alargados espaciados en los que los diferentes especímenes (62, 132) biológicos pueden colocarse en posiciones fijas.

22. Aparato según la reivindicación 21 en el que el aparato comprende además un bloque (30, 130) donante que proporciona un espécimen biológico.

23. Aparato según la reivindicación 21 que comprende un estilete (144) que se alinea alternativamente de manera selectiva con el punzón (154) donante y el punzón (150) receptor, para desplazar el contenido del punzón (156) receptor después de puncionar un núcleo de receptáculo del bloque (122) receptor, y para desplazar el contenido del punzón (156) donante en receptáculos de la disposición del bloque (122) receptor después de puncionar un espécimen de tejido a partir del bloque (130) donante.

24. Aparato según la reivindicación 23, que comprende además un microscopio (140) para observar el bloque (130) donante, y ubicar una estructura de interés en un portaobjetos de referencia alineado con el bloque (130) donante.

25. Aparato según la reivindicación 21, en el que el punzón (156) de receptáculo tiene un diámetro que es inferior al diámetro del punzón (154) donante.