ES2317380T3

ES2317380T3 - Metodo y aparato para preparar especimenes tisulares para un analisis paralelo.

Info

Publication number: ES2317380T3
Application number: ES06016017T
Authority: ES
Inventors: Stephen B Leighton; Juha Kononen; Olli Kallioniemi
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1998-02-25
Filing date: 1999-02-24
Publication date: 2009-04-16
Anticipated expiration: 2019-02-24
Also published as: EP1068528A2; JP4374139B2; ES2272057T3; AU2875799A; ATE335199T1; WO1999044063B1; EP1715340B1; PT1715340E; JP2002505432A; DE69932607T2; CY1105756T1; ATE407360T1; DK1715340T3; CA2318984C; EP1980852A1; CY1108634T1; JP2009244269A; PT1068528E; DK1068528T3; WO1999044063A3

Abstract

Un método para preparar especímenes tisulares para un análisis paralelo, que comprende: obtener una pluralidad de especímenes donantes alargados de un bloque (30) donante; emplazar cada espécimen donante en una localización asignada de una matriz receptora hecha de una matriz de receptáculos formados en un bloque (70) receptor; teniendo los receptáculos un tamaño y una conformación de la sección transversal complementarios de un tamaño y una conformación de la sección transversal de los especímenes donantes; obtener una pluralidad de secciones (76) procedentes de la matriz receptora cortando secciones (76) delgadas de la matriz receptora después de que los especímenes donantes se emplacen en las localizaciones asignadas de la matriz receptora, de modo que cada sección (76) contenga una pluralidad de especímenes donantes que mantengan sus localizaciones asignadas después de que la matriz receptora se haya cortado.

Description

Método y aparato para preparar especímenes tisulares para un análisis paralelo.

Campo de la invención

La presente invención trata de un método y un aparato para preparar especímenes tisulares para un análisis paralelo.

Antecedentes de la invención

Los mecanismos biológicos de muchas enfermedades se han clarificado mediante el examen microscópico de especímenes tisulares. El examen histopatológico también ha permitido el desarrollo de tratamientos médicos eficaces para una variedad de dolencias. En la patología anatómica estándar, un diagnóstico se hace sobre la base de las características de morfología y tinción de células. Los especímenes tumorales, por ejemplo, pueden examinarse para caracterizar el tipo de tumor y predecir si el paciente responderá a una forma particular de quimioterapia. Aunque este examen microscópico y la clasificación de tumores han mejorado el tratamiento médico, la apariencia microscópica de un espécimen tisular teñido mediante métodos estándar (tales como hematoxilina y eosina) a menudo sólo puede revelar una cantidad limitada de información diagnóstica o molecular.

Los avances recientes en medicina molecular han proporcionado una oportunidad aún mayor de comprender los mecanismos celulares de la enfermedad, y seleccionar tratamientos apropiados con la mayor probabilidad de éxito. Algunas células tumorales de mama dependientes de hormonas, por ejemplo, tienen una expresión incrementada de receptores de estrógenos sobre sus superficies celulares, lo que indica que el paciente del que se extraía el tumor probablemente respondería a ciertos tratamientos con fármacos estrogénicos. Otros cambios celulares para diagnóstico y pronóstico incluyen la presencia de antígenos de la superficie celular específicos de tumores (como en un melanoma), la producción de proteínas embrionarias (tales como la fenoproteína \alpha en el cáncer de hígado y el antígeno glicoproteínico carcinoembrionario producido por tumores gastrointestinales), y anormalidades genéticas (tales como oncogenes activados en tumores). Ha surgido una variedad de técnicas para detectar la presencia de estas anormalidades celulares, incluyendo inmunofenotipaje con anticuerpos monoclonales, hibridación in situ con sondas y amplificación de DNA usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Sin embargo, el desarrollo de nuevos marcadores moleculares ha sido impedido por la incapacidad para agrupar un gran número de tejidos dentro de una pequeña superficie. Solo puede estar disponible una cantidad limitada de sobrenadante de hibridoma, particularmente durante la fase temprana de la generación de anticuerpos monoclonales, lo que limita el número de especímenes que pueden analizarse. Sin embargo, incluso si están disponibles grandes cantidades del agente inmunohistológico, los reactivos son costosos y pueden variar en reactividad. Estos problemas condujeron a Battifora et al. a proponer en Lab. Invest. 55:244-248 (1986) y en la Patente de EE. UU. Nº 4.820.504 que múltiples especímenes tisulares pueden agruparse conjuntamente sobre un solo portaobjetos para permitir que los especímenes sean rastreados simultáneamente mediante la aplicación de una sola gota de sobrenadante de hibridroma. Los especímenes se prepararon usando una cuchilla de afeitar sostenida con la mano para cortar especímenes tisulares desparafinados y deshidratados en rodajas, que a continuación se agruparon en haces aleatoriamente, se envolvieron en revestimiento para salchichas y se embebieron de nuevo en parafina. Esta técnica requería un alto grado de destreza manual e incorporaba las muestras en un bloque compuesto de un modo que hacía difícil encontrar e identificar especímenes particulares de interés.

Una modificación de este procedimiento fue descrita por Wan et al., J. Immunol. Meth. 103:121-129 (1987), y Furmanski et al. en la Patente de EE. UU. Nº 4.914.022, en la que se obtenían núcleos de tejido embebido en parafina a partir de bloques de tejido estándar. Los núcleos se reblandecieron y se estiraron tratándolos con rodillo manualmente sobre una superficie caliente, y a continuación se formaron como un haz dentro de una pajilla de bebida convencional. Se decía que este método era adecuado para una prueba histológica simultánea de múltiples especímenes tisulares, por ejemplo en la caracterización de anticuerpos monoclonales. La técnica de Miller y Groothuis, A.J.C.P. 96:228-232 (1991), trataba con rodillo de forma similar tiras de tejido en "troncos" a partir de los cuales se tomaban secciones transversales para ser embebidas en parafina. Sin embargo, las técnicas de las pajillas y los troncos exigían mucho trabajo, requerían un alto grado de destreza manual y además disponían las muestras aleatoriamente de un modo que complicaba la identificación de especímenes de interés.

Battifora y Mehta, Lab. Invest. 63:722-724 (1990), y la Patente de EE. UU. Nº 5.002.377 intentaron vencer algunos de los problemas del emplazamiento aleatorio cortando los especímenes en una pluralidad de tiras estrechas, que se colocaron individualmente en ranuras rectangulares paralelas en un molde. Las tiras de tejido se embebieron en gel de agar que se vertió en las ranuras para producir un miembro laminar con una serie de salientes. Varias de las láminas con salientes se apilaron conjuntamente y se embebieron en parafina para formar un bloque de tejido. Un sistema similar fue propuesto por Sundblad, A.J.C.P. 102:192-193 (1993), en el que las tiras de tejido se emplazaron en cuñas triangulares en lugar de ranuras rectangulares. Cortar en rodajas el tejido, disponerlo en filas y embeberlo en varias etapas para formar el bloque era un método que requería mucho tiempo, lo que reducía la eficacia para examinar un gran número de especímenes tisulares.

Todas estas técnicas han sido inadecuadas para la preparación eficaz de una matriz de especímenes tisulares que pueda usarse para el análisis paralelo rápido de una variedad de marcadores moleculares independientes. Esta ineficacia ha sido un problema significativo en campos tales como la investigación sobre el cáncer, debido a que el desarrollo y el avance del cáncer es un proceso multietápico que implica pérdidas, redisposiciones y amplificaciones secuenciales de varias regiones cromosómicas y múltiples genes. Estos episodios conducían a una desregulación de rutas de transducción de señales críticas para el crecimiento, la muerte y la diferenciación celulares. Los detalles de este complejo proceso siguen sin comprenderse completamente, en parte debido a que no están disponibles estrategias ni técnicas de alto rendimiento para analizar tales cambios genéticos en grandes números de tumores humanos no cultivados.

Por ejemplo, puede ser necesario un análisis simultáneo de varios genes dentro de rutas de transducción de señales iguales o relacionadas para identificar etapas limitativas de la velocidad críticas en la desregulación del crecimiento de células cancerosas. Por otra parte, el análisis de cambios estructurales y numéricos que afectan a varios cromosomas, loci y genes al mismo tiempo puede ser necesario para comprender los patrones de acumulación de cambios genéticos en diferentes fases del avance del cáncer. Finalmente, después de que se hayan identificado nuevos genes y cambios genéticos de importancia potencial en el cáncer, se requiere habitualmente una investigación adicional sustancial para determinar la significación diagnóstica, de pronóstico y terapéutica de estos marcadores moleculares en la oncología clínica.

Puesto que la cantidad de tejido se convierte a menudo en limitativa de la velocidad para tales estudios, es importante la capacidad para obtener, fijar, almacenar y distribuir eficazmente tejido para análisis molecular de un modo que minimice el consumo de especímenes tumorales valiosos únicos. Por lo tanto, un objetivo de esta invención es realizar un perfilado molecular a gran escala de especímenes tisulares (tales como tumores) con requerimientos mínimos de tejido, de un modo que permita el análisis paralelo rápido de las características moleculares (tales como dosificación y expresión génicas) de cientos de especímenes tumorales morfológicamente controlados.

US-A-4 684 613 se refiere a un dispositivo para llevar a cabo extracciones de muestras de medios semisólidos por medio de un troquel.

Sumario de la invención

Los objetivos precedentes se alcanzan mediante un método como el definido en la reivindicación 1.

En una realización más particular del método, se forma un bloque receptor a partir de un medio rígido de imbibición tal como parafina que puede cortarse con un troquel o un microtomo y también se forma un bloque donante separado embebiendo un espécimen biológico en el medio de imbibición. Núcleos de receptáculo cilíndricos se taladran en el bloque receptor para formar una matriz de receptáculos en posiciones fijas, y se obtienen núcleos de muestra donantes cilíndricos a partir del espécimen biológico embebido del bloque donante. Los núcleos de muestra donantes se emplazan a continuación en los receptáculos cilíndricos en localizaciones asignadas de la matriz, y el bloque receptor se corta en rodajas para obtener una sección transversal de los núcleos de muestra donantes de la matriz, sin perturbar las localizaciones asignadas de la matriz. Puede realizarse un análisis histológico diferente en cada sección, por ejemplo usando anticuerpos monoclonales diferentes que reconocen distintos antígenos, o una combinación de anticuerpos monoclonales y sondas de ácido nucleico (por ejemplo, RNA y DNA) antigénicamente distintos en secciones secuenciales. El resultado de cada análisis histológico distinto en cada posición de la matriz se compara, por ejemplo para determinar si un tejido que expresa un receptor de estrógeno también tiene evidencia de que se ha activado un oncogén particular.

En una realización más particular del método, se forma un bloque receptor a partir de un medio de imbibición rígido, tal como parafina, que puede cortarse con un troquel o un microtomo, y también se forma un bloque donante separado embebiendo un espécimen biológico en el medio de imbibición. Se taladran núcleos de receptáculo cilíndricos en el bloque receptor para formar una matriz de receptáculos en posiciones fijas, y se obtienen núcleos de muestra donantes cilíndricos a partir del espécimen biológico embebido del bloque donante. Los núcleos de muestra donantes se emplazan a continuación en los receptáculos cilíndricos en localizaciones asignadas de la matriz, y el bloque receptor se corta en rodajas para obtener una sección transversal de los núcleos de muestra donantes de la matriz sin perturbar las localizaciones asignadas de la matriz. Puede realizarse un análisis histológico diferente en cada sección, por ejemplo usando anticuerpos monoclonales diferentes que reconocen distintos antígenos, o una combinación de anticuerpos monoclonales y sondas de ácido nucleico (por ejemplo, RNA y DNA) antigénicamente distintos en secciones secuenciales. El resultado de cada análisis histológico distinto en cada posición de la matriz se compara, por ejemplo para determinar si un tejido que expresa un receptor de estrógeno también tiene evidencia de que se ha activado un oncogén particular. La presencia o ausencia del receptor de estrógeno y el oncogén pueden correlacionarse a continuación con información clínica o patológica acerca del tejido (tal como la presencia de enfermedad metastática o el grado histológico de un tumor). Este análisis paralelo simultáneo de múltiples especímenes ayuda a clarificar la interrelación de múltiples características moleculares y clínicas del tejido.

La descripción también incluye un método para obtener muestras alargadas pequeñas de tejido procedente de un espécimen tisular, tal como un tumor, y someter el espécimen a análisis de laboratorio, tal como análisis histológico o molecular. La muestra de tejido alargada puede tomarse de una región de interés del espécimen tisular, y el tamaño de la muestra es lo suficientemente pequeño para que la característica que se analiza sea sustancialmente homogénea en toda la muestra pequeña. En una realización descrita, la muestra es una muestra cilíndrica troquelada del espécimen tisular, en donde el espécimen cilíndrico tienen aproximadamente 1-4 mm de largo y tiene un diámetro de aproximadamente 0,1-4 mm, por ejemplo aproximadamente 0,3-2,0 mm. En realizaciones específicas, el diámetro del cilindro es menor de aproximadamente 1,0 mm, por ejemplo 0,6 mm. Preferiblemente, la muestra se conserva de un modo (tal como fijación con etanol) que no interfiera con el análisis de ácidos nucleicos, y, por lo tanto, la muestra puede someterse a cualquier tipo de análisis molecular, tal como cualquier tipo de análisis molecular basado en DNA o RNA aislado.

La invención también incluye un aparato para preparar especímenes para análisis paralelo de secciones de una matriz de material biológico, como el indicado en la reivindicación 18. El aparato puede incluir una plataforma, un bloque donante de tejido sobre la plataforma y un troquel que troquela o taladra un espécimen tisular procedente del bloque donante. La plataforma también puede tener un bloque receptor en el que el troquel forma una matriz de receptáculos en posiciones seleccionadas. Cada receptáculo puede colocarse de modo que un espécimen tisular pueda ser expulsado del troquel recíproco hacia el interior del receptáculo. Un dispositivo de colocación x-y mueve incrementalmente el troquel o el bloque receptor uno con respecto al otro cuando el troquel tiene movimiento alternativo, para formar la matriz de receptáculos. El dispositivo de colocación x-y también alinea receptáculos secuenciales del bloque receptor con el troquel para aportar especímenes tisulares desde el troquel al receptáculo. Un estilete puede introducirse en el troquel para expulsar el contenido del troquel, que puede ser bien parafina procedente del bloque receptor o bien tejido procedente del bloque donante. Las regiones de interés del espécimen tisular se localizan colocando un portaobjetos para secciones delgadas sobre el bloque donante, para alinear estructuras de interés en el portaobjetos para secciones delgadas con regiones del espécimen tisular correspondientes del bloque donante.

En una realización preferida, la invención hace uso de un sistema aplicado informáticamente para el análisis paralelo de secciones consecutivas de matrices tisulares, en el que una plataforma de colocación x-y mueve una bandeja hasta una pluralidad de coordenadas que corresponden a las posiciones de una matriz del bloque receptor. Un troquel para el receptáculo troquela a continuación un núcleo de receptáculo de un bloque receptor que está sobre la plataforma de colocación, y un estilete expulsa el núcleo de receptáculo del troquel para el receptáculo. Un troquel para el donante (que puede ser el mismo o estar separado del troquel para el receptor) troquela un espécimen donante de un bloque donante que está sobre la plataforma de colocación, y un estilete expulsa el espécimen donante del troquel para el donante al interior del receptáculo cuando el troquel para el donante se introduce en el receptáculo. El espécimen donante tiene adecuadamente un diámetro que es sustancialmente el mismo que el diámetro del receptáculo, de modo que el espécimen donante se ajusta con seguridad en el receptáculo. El sistema informático identifica el tejido por su localización en la matriz receptora, de modo que, cuando el bloque donante se secciona, una posición correspondiente de cada matriz en sección contendrá tejido procedente del espécimen donante idéntico.

Los precedentes y otros objetivos, rasgos característicos y ventajas de la invención se harán más evidentes a partir de la siguiente descripción detallada de realizaciones preferidas que procede con referencia a los dibujos adjuntos.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 es una vista esquemática en perspectiva de una primera realización del dispositivo troquelador de la presente invención, que muestra el alineamiento del troquel sobre una región de interés de tejido donante de un bloque donante.

La Fig. 2 es una vista similar a la Fig. 1, pero en la que el troquel se ha hecho avanzar para obtener una muestra de espécimen donante.

La Fig. 3 es una vista esquemática en perspectiva de un bloque receptor en el que se ha emplazado el espécimen donante.

Las Figs. 4-8 ilustran etapas en la preparación de matrices de secciones delgadas procedentes del bloque receptor.

La Fig. 9 en una vista en perspectiva de un dispositivo de bloqueo para mantener un espécimen montado en un portaobjetos por encima del tejido del bloque donante para localizar una región de interés.

La Fig. 10A es una vista de una matriz tisular de secciones delgadas teñida con H&E montada sobre un portaobjetos para examen microscópico.

La Fig. 10B es una vista ampliada de una porción del portaobjetos de la Fig. 10A, que muestra resultados de la hibridación in situ de mRNA de erbB2 en una matriz tisular procedente del pequeño rectángulo de la Fig. 10A.

La Fig. 10C es un gel de electroforesis que muestra que puede extraerse DNA y RNA de alto peso molecular de los especímenes de cáncer de mama.

La Fig. 10D es una vista ampliada de una de las muestras de tejido de la matriz de la Fig. 10A, que muestra una tinción con inmunoperoxidasa para el antígeno erbB2.

La Fig. 10E es una vista similar a la Fig. 10D, que muestra la amplificación de alto nivel de gen de erbB2, detectada mediante hibridación fluorescente in situ (FISH) de tejido de la matriz mediante una sonda de DNA de erbB2.

La Fig. 11 es una vista esquemática que ilustra un ejemplo de un análisis paralelo de matrices obtenidas mediante el método de la presente invención.

La Fig. 12 es una vista ampliada de una porción de la F1G. 11.

La Fig. 13 es una vista en planta de una segunda realización de un dispositivo para formar las matrices de la presente invención.

La Fig. 14 es una vista frontal del dispositivo mostrado en la Fig. 13, que ilustra la formación de un receptáculo en un bloque receptor con un troquel para el receptor.

La Fig. 15 es una vista similar a la Fig. 14, pero que muestra la expulsión de un tapón procedente del troquel para el receptor a una bandeja de descarte.

La Fig. 16 es una vista que muestra un troquel para el donante que obtiene un espécimen tisular de un bloque donante.

La Fig. 17 es una vista que muestra la inserción del tejido donante en un receptáculo del bloque receptor.

La Fig. 18 es una vista ampliada del troquel para el donante alineado por encima de una estructura de interés del bloque donante, que se muestra en sección transversal.

La Fig. 19 es una vista en sección transversal ampliada del troquel para el receptor, mientras que la Fig. 20 es una vista del troquel para el donante, que ilustra los diámetros relativos de las secciones transversales de los dos troqueles.

La Fig. 21 es una vista en sección transversal del bloque receptor con los especímenes donantes dispuestos en la matriz receptora, y mostrándose líneas de secciones de microtomo del bloque receptor.

La Fig. 22 es una vista esquemática de un sistema informático en el que puede aplicarse el método de la presente invención.

La Fig. 23 es un algoritmo que ilustra un ejemplo del método aplicado informáticamente de la presente invención.

Descripción detallada Realización de las Figs. 1-10

Una primera realización de un dispositivo para elaborar las micromatrices de la presente invención se muestra en las Figs. 1-2, en las que se muestra un bloque 30 donante en un recipiente 31 rectangular montado sobre una plataforma 32 estacionaria que tiene una guía 34 con borde en forma de L que mantiene el recipiente 31 para el donante en una orientación predeterminada sobre la plataforma 32. Un aparato 38 troquelador está montado sobre la plataforma 32, e incluye una placa 40 vertical de guía y una placa 42 horizontal de colocación. La placa 42 de colocación está montada sobre un estrado x-y (no mostrado) que puede colocarse precisamente con un par de micrómetros digitales.

La placa 40 vertical de guía tiene una cara frontal plana que proporciona una superficie de guía de precisión contra la que una base 44 del troquelador recíproco puede deslizarse a lo lardo de un carril 46 entre una posición retraída mostrada en la Fig. 1 y una posición extendida mostrada en la Fig. 2. Una banda 48 elástica ayuda a controlar el movimiento de la base 44 a lo largo de esta trayectoria, y los límites de avance y retracción de la base 44 son fijados por el miembro 46 de carril, que forma un tope que limita la amplitud de oscilación de la base 44. Un troquel 50 tubular de acero inoxidable de paredes delgadas con bordes anteriores afilados se monta sobra la cara inferior plana de la base 44, de modo que el troquel 50 pueda hacerse avanzar y retraerse con respecto a la plataforma 32 y el recipiente 31 que está sobre la plataforma. El interior hueco del troquel 50 es continuo con un orificio cilíndrico a través de la base 44, y el orificio se abre en la abertura 51 en un reborde 53 horizontal de la base 44.

La Fig. 1 muestra que puede obtenerse una sección delgada de tejido del bloque 30 donante y montarse sobre un portaobjetos 52 (con preparación y tinción apropiadas) de modo que puedan localizarse en el bloque 30 estructuras anatómicas y microanatómicas de interés. El portaobjetos 52 puede mantenerse por encima del bloque 30 donante mediante un soporte 54 de brazo articulado (Fig. 9) con una pinza 56 que mantiene seguramente un borde de un portaobjetos 58 de soporte transparente. El soporte 54 de brazo puede estar articulado en la articulación 60, para bascular entre una primera posición en la que el portaobjetos 58 de soporte está bloqueado en su posición por encima del recipiente 31 y una segunda posición en la que el portaobjetos 58 de soporte se mueve horizontalmente lejos de la posición mostrada en la Fig. 9 para permitir el acceso libre al troquel 50.

Durante el funcionamiento, el recipiente 31 rectangular se sitúa sobre la plataforma 32 (Fig. 1) con los bordes del recipiente 31 entrando en contacto con las guías 34 de borde para mantener el recipiente 31 en una posición seleccionada. Un bloque 30 donante se prepara embebiendo un espécimen tisular grueso (tal como un espécimen 62 tumoral tridimensional) en parafina. Se rebana una sección delgada de bloque 30 donante, y se monta sobre el portaobjetos 52 como la sección 64 delgada, y el portaobjetos 52 se emplaza a continuación sobre el portaobjetos 58 de soporte y se coloca por encima del bloque 30 donante como se muestra en la Fig. 9. El portaobjetos 52 puede moverse alrededor sobre el portaobjetos 58 de soporte hasta que los bordes de la sección 64 delgada se alinean con los bordes del espécimen 62 patológico grueso, según se muestra mediante las líneas de puntos en la Fig. 9. El brazo 54 se bloquea entonces en la primera posición, a la que el brazo puede volver subsiguientemente después del desplazamiento a una segunda posición.

Una estructura microanatómica o histológica de interés 66 puede localizarse a continuación examinando la sección delgada a través de un microscopio (no mostrado). Si el espécimen tisular es, por ejemplo, un adenocarcinoma de la mama, entonces la localización de interés 66 puede ser un área del espécimen en la que la arquitectura celular sugiere metaplasia (por ejemplo, núcleos picnóticos, pleomorfismo, invasividad). Una vez que se ha localizado la estructura de interés 66, la región correspondiente de espécimen 62 tisular a partir de la cual se obtenía la estructura de sección delgada de interés 66 se localiza inmediatamente debajo de la estructura de interés 66. Según se muestra en la Fig. 1, la placa 42 de colocación puede moverse en las direcciones x e y (bajo el control de los micrómetros digitales o una palanca de mando), o el bloque donante puede moverse a lo largo de distancias mayores, para alinear el troquel 50 en posición por encima de la región de interés del bloque 30 donante, y a continuación el portaobjetos 58 de soporte se hace pivotar horizontalmente lejos de su posición por encima del bloque 30 donante alrededor de la articulación 60 pivotante (Fig. 9).

El troquel 50 se introduce a continuación en la estructura de interés del bloque 30 donante (Fig. 2) haciendo avanzar la placa 40 vertical de guía a lo largo del carril 46 hasta que la placa 44 alcanza su posición tope (que está prefijada por el aparato 38). A medida que el troquel 50 avanza, su borde anterior afilado taladra un espécimen tisular cilíndrico del bloque 30 donante, y el espécimen es retenido dentro del troquel cuando el troquel se mueve alternativamente de nuevo a su posición retraída mostrada en la Fig. 1. El espécimen tisular cilíndrico puede liberarse posteriormente del troquel 50 haciendo avanzar un estilete (no mostrado) dentro de la abertura 51. Por ejemplo, el espécimen tisular se libera del troquel 50 y se introduce en un receptáculo cilíndrico de conformación y tamaño complementarios de una matriz de receptáculos de un bloque 70 receptor mostrado en la Fig. 3.

Pueden prepararse uno o más bloques 70 receptores antes de obtener el espécimen tisular del bloque 30 donante. El bloque 70 puede prepararse emplazando un bloque de parafina sólida en el recipiente 31 y usando el troquel 50 para hacer troquelados cilíndricos en el bloque 70 en un patrón regular que produce una matriz de receptáculos cilíndricos del tipo mostrado en la Fig. 3. La matriz regular puede generarse colocando el troquel 50 en un punto de partida por encima del bloque 70 (por ejemplo, una esquina de la matriz prospectiva), haciendo avanzar y a continuación retrayendo el troquel 50 para retirar un núcleo cilíndrico de una coordenada específica del bloque 70, a continuación liberando el núcleo del troquel introduciendo un estilete dentro de la abertura 51. El aparato troquelador o el bloque receptor se mueve a continuación en incrementos regulares en las direcciones x y/o y, hasta la siguiente coordenada de la matriz, y la etapa de troquelado se repite. En la realización descrita específica de la Fig. 3, los receptáculos cilíndricos de la matriz tienen diámetros de aproximadamente 0,6 mm, estando los centros de los cilindros separados una distancia de aproximadamente 0,7 mm (de modo que hay una distancia de aproximadamente 0,05 mm entre los bordes adyacentes de los receptáculos).

En un ejemplo específico, biopsias tisulares nucleares que tenían un diámetro de 0,6 mm y una altura de 3-4 mm, se tomaron de regiones representativas seleccionadas de bloques tumorales embebidos en parafina "donantes" individuales y se dispusieron precisamente en forma de matriz en un nuevo bloque de parafina "receptor" (20 mm x 45 mm). Secciones teñidas con H&E se colocaron por encima de los bloques donantes y se usaron para guiar el muestreo desde zonas representativas de los tumores. Aunque el diámetro del troquelado de la biopsia puede variarse, se ha encontrado que los cilindros de 0,6 mm son adecuados debido a que son suficientemente grandes para evaluar patrones histológicos en cada elemento de la matriz tumoral, y sin embargo son suficientemente pequeños para provocar solamente un mínimo daño a los bloques de tejido donantes originales, y para aislar bloques de tejido razonablemente homogéneos. Hasta 100 de tales cilindros de tejido pueden situarse en un bloque de parafina receptor de 20 x 45 mm. Diámetros descritos específicos de los cilindros son 0,1-4,0 mm, por ejemplo 0,5-2,0 mm, y lo más específicamente menos de 1 mm, por ejemplo 0,6 mm. La automatización del procedimiento, con el emplazamiento guiado por ordenador de los especímenes, permite que especímenes muy pequeños se emplacen muy juntos en la matriz receptora.

La Fig. 4 muestra la matriz del bloque receptor después de que los receptáculos de la matriz se hayan cargado con cilindros de especímenes tisulares. La superficie superior del bloque receptor se cubre a continuación con una película 74 adhesiva de un sistema de seccionamiento con cinta revestida con adhesivo (Instrumedics) para ayudar a mantener las secciones cilíndricas de tejido en la matriz una vez que se corta. Con la película adhesiva en su lugar, una sección de 4-8 \mum del bloque receptor se corta transversal al eje longitudinal de los cilindros de tejido (Fig. 5) para producir una sección 76 de micromatriz delgada (que contiene secciones cilíndricas de especímenes tisulares en forma de discos) que se transfiere a un portaobjetos 78 para especímenes convencional. La sección 76 de micromatriz se adhiere al portaobjetos 78, por ejemplo mediante un adhesivo sobre el portaobjetos. La película 74 se despega a continuación del miembro 76 de micromatriz subyacente para exponerla al procesamiento. Un borde 80 oscurecido del portaobjetos 78 es adecuado para etiquetar o manejar el portaobjetos.

Un espécimen tisular de cáncer de mama se fijó en etanol frío para ayudar a conservar DNA y RNA de alto peso molecular, y 372 de los especímenes se fijaron de este modo. Al menos 200 secciones de una matriz tumoral de 4-8 \mum consecutivas pueden cortarse de cada bloque, proporcionando dianas para análisis in situ correlacionados del número de copias o la expresión de múltiples genes. Este análisis se realiza probando diferentes amplificaciones génicas en secciones de la matriz separadas, y comparando los resultados de las pruebas en coordenadas idénticas de la matriz (que corresponden a especímenes tisulares procedentes del mismo cilindro de tejido obtenido del bloque donante). Este sistema permite la medida de virtualmente cientos de características moleculares de cada tumor, facilitando de ese modo la construcción de una gran serie de características genotípicas o fenotípicas correlacionadas de tumores humanos no cultivados.

Un ejemplo de una micromatriz 76 que contiene 645 especímenes se muestra en la Fig. 10A. Una sección ampliada de la micromatriz (remarcada por un rectángulo en la Fig. 10A) se muestra en la Fig. 10B, en la que un autorradiograma de la hibridación in situ de mRNA de erbB2 ilustra que dos especímenes adyacentes de la matriz demuestran una fuerte señal de hibridación. La Fig. 10C ilustra geles de electroforesis que demuestran que DNA y RNA de alto peso molecular pueden extraerse de especímenes de cáncer de mama fijados en etanol a 4ºC durante la noche en un horno de vacío.

Uno de los especímenes tisulares que diera las señales "positivas" fluorescentes también se analizaría mediante tinción con inmunoperoxidasa, según se muestra en la Fig. 10D, donde se confirmaba (por la mancha oscura) que estaba presente el producto génico de erbB2. Se usó una sonda de DNA para el gen de erbB2 para realizar hibridación fluorescente in situ (FISH). La Fig. 10D muestra uno de los elementos de la matriz tumoral, que demostraba una amplificación de alto nivel del gen de erbB2. El inserto de la Fig. 10E muestra tres núcleos con numerosas señales de hibridación de erbB2 estrechamente aglomeradas y dos copias de la sonda de referencia centrómera. Detalles adicionales acerca de estos ensayos se dan en los Ejemplos 1-4 posteriormente.

El potencial de la tecnología de matrices de la presente invención para realizar un análisis molecular paralelo rápido de múltiples especímenes tisulares se ilustra en la Fig. 11, en la que el eje y de las gráficas corresponde a porcentajes de tumores en grupos específicos que tienen características clinicopatológicas o moleculares definidas. Este diagrama muestra correlaciones entre características clínicas e histopatológicas de los especímenes tisulares de la micromatriz. Cada caja pequeña en las filas alineadas de la Fig. 11B representa una localización de coordenadas de la matriz. Coordenadas correspondientes de secciones delgadas consecutivas del bloque receptor están alineadas verticalmente unas sobre otras en las filas que se extienden horizontalmente. Estos resultados muestran que los especímenes tisulares podrían clasificarse en cuatro clasificaciones de tumores (Fig. 11A) basadas en la presencia o ausencia de expresión de receptor de estrógeno de la membrana celular y la presencia o ausencia de la mutación p53 en el DNA celular. En la Fig. 11B, la presencia de la mutación p53 se muestra mediante una caja oscurecida. La categorización en cada uno de los cuatro grupos (ER-/p53+, ER-/p53-, ER+/p53+ y ER+/p53-) se muestra mediante líneas de puntos entre las Figs. 11A y 11B, que dividen las categorías en los Grupos I, II, III y IV correspondientes al estado ER/p53.

La Fig. 11B también muestra características clínicas que estaban asociadas al tejido en cada coordenada respectiva de la matriz. Una caja oscurecida de Edad indica que la paciente es premenopáusica, una caja N oscurecida indica la presencia de enfermedad metastática en los nódulos linfáticos regionales, una caja T oscurecida indica un tumor en estadio 3 ó 4 que está más avanzado clínicamente y una caja oscurecida para el grado indica un tumor de alto grado (al menos grado III), que está asociado con una malignidad incrementada. La correlación del estado ER/p53 puede realizarse comparando las cuatro líneas superiores de las cajas de indicadores clínicos (Edad, N, T, Grado) con las dos líneas medias de las cajas (estado ER/p53). Los resultados de esta correlación cruzada se muestran en el gráfico de barras de la Fig. 11A, donde puede observarse que los tumores ER-/p53+ (Grupo I) tienden a ser de grado superior que los otros tumores, y tenían una frecuencia particularmente alta de amplificación de myc, mientras que los tumores ER+/p53+ (Grupo III) eran más propensos a tener nódulos positivos en el momento de la resección quirúrgica. El ER-/p53- (Grupo II) mostraba que el gen más común amplificado en ese grupo era erbB2. Se observó que los tumores ER-/p53- (Grupo II) y ER+/p53- (Grupo IV), en contraste, tenían menos indicadores de enfermedad grave, sugiriendo así una correlación entre la ausencia de la mutación p53 y un mejor pronóstico.

Este método también se usó para analizar el número de copias de varios otros oncogenes de cáncer de mama principales en los 372 especímenes de cáncer de mama primario matriciales en experimentos de FISH consecutivos, y esos resultados se usaron para determinar correlaciones entre las clasificaciones ER/p53 y la expresión de estos otros oncogenes. Estos resultados se obtuvieron usando sondas para cada uno de los oncogenes separados, en secciones sucesivas del bloque receptor, y comparando los resultados en coordenadas correspondientes de la matriz. En la Fig. 11B, un resultado positivo para la amplificación del oncogén o marcador específico (mybL2, 20q13, 17q23, myc, cnd1 y erbB2) se indica mediante una caja oscurecida. El oncogén erbB2 se amplificó en el 18% de los 372 especímenes matriciales, myc en el 25% y la ciclina D1 (cnd1) en el 24% de lo tumores.

Se encontró que las dos regiones de amplificación frecuente de DNA descubiertas recientemente en el cáncer de mama, 17q23 y 20q 13, se amplificaban en el 13% y 6% de los tumores, respectivamente. Se encontró que el oncogén mybL2 (que se localizó recientemente en 20q13.1 y se encontró que se sobreexpresaba en líneas celulares de cáncer de mama) se amplificaba en el 7% del mismo grupo de tumores. MybL2 se amplificaba en tumores con un número de copias normal del locus 20q13 principal, indicando que puede definir una región independientemente seleccionada de amplificación en 20q. Las líneas de puntos entre las Figs. 11B y 11C dividen de nuevo los patrones de coamplificación complejos de estos genes en los Grupos I-IV que corresponden a ER-/p53+, ER-/p53-, ER+/p53+ y ER+/p53-.

Las Figs. 11C y 11D muestran que 70% de los especímenes ER-/p53+ eran positivos para uno o más de estos oncogenes, y que myc era el oncogén predominante amplificado en este grupo. En contraste, solo el 43% de los especímenes en el grupo ER+/p53- mostraba coamplificación de uno de estos oncogenes, y esta información podía a su vez correlacionarse con los parámetros clínicos mostrados en la Fig. 11A. De ahí que la tecnología de micromatrices permita que se rastree convenientemente y rápidamente un gran número de especímenes tumorales con respecto a estas muchas características, y se analice con respecto a patrones de expresión génica que pueden relacionarse con la presentación clínica del paciente y la evolución molecular de la enfermedad. En ausencia de la tecnología de micromatrices de la presente invención, estas correlaciones son más difíciles de obtener.

Un método específico para obtener estas correlaciones se ilustra en la Fig. 12, que es una ampliación de la porción derecha de la Fig. 11B. La micromatriz 76 (Fig. 10A) está dispuesta en secciones que contienen diecisiete filas y nueve columnas de localizaciones circulares que corresponden a secciones transversales de especímenes tisulares cilíndricos procedentes de diferentes tumores, en donde cada localización de la micromatriz puede representarse mediante las coordenadas (fila, columna). Por ejemplo, los especímenes de la primera fila de la primera sección tienen las posiciones de coordenadas (1,1), (1,2)... (1,9), y los especímenes de la segunda fila tienen posiciones de coordenadas (2,1), (2,2)... (2,9). Cada una de estas coordenadas matriciales puede usarse para localizar especímenes tisulares procedentes de posiciones correspondientes o secciones secuenciales del bloque receptor, para identificar especímenes tisulares de la matriz que se cortaban del mismo cilindro de tejido.

Según se muestra en la Fig. 12, la matriz rectangular se convierte en una representación lineal en la que cada caja de la representación lineal corresponde a una posición de coordenadas de la matriz. Cada una de las líneas de las cajas está alineada de modo que cada caja que corresponde a una posición de coordenadas matricial idéntica está localizada por encima de otras cajas de la misma posición de coordenadas. De ahí que las cajas conectadas por la línea 1 de puntos correspondan a los resultados que pueden obtenerse consultando los resultados de la posición de coordenadas (1,1) en secciones delgadas sucesivas del bloque donante, o datos clínicos que pueden no haberse obtenido de la micromatriz, pero que pueden introducirse en el sistema para identificar adicionalmente tejido procedente de un tumor que corresponde a esa posición de coordenadas. De forma similar, las cajas conectadas por la línea 10 de puntos corresponden a los resultados que pueden encontrarse en la posición de coordenadas (2,1) de la matriz, y las cajas conectadas por la línea 15 de puntos corresponden a los resultados de la posición de coordenadas (2,6) de la matriz. Las letras a, b, c, d, e, f, g y h corresponden a secciones sucesivas del bloque donante que se cortan de la matriz.

Comparando las caja alineadas a lo largo de la línea 1 en la Fig. 12, puede observarse que se obtenía un tumor de una mujer posmenopáusica sin enfermedad metastática en los nódulos linfáticos en el momento de la resección quirúrgica, en la que el estadio del tumor era menor de 3, pero en la que la histología del tumor era al menos Grado III. Se tomo un bloque de tejido de este tumor y se introdujo en la matriz receptora en la posición de coordenadas (1,1) y, una vez que la matriz se completaba, se seccionó en ocho secciones paralelas (a, b, c, d, e, f, g y h), cada una de las cuales contenía una sección representativa de la matriz cilíndrica. Cada una de estas secciones se analizó con una sonda específica diferente para un atributo molecular particular. En la sección a, los resultados indicaban que ese espécimen tisular era p53+; en la sección b que era ER-; en la sección c que no mostraba amplificación del oncogén mybL2; en las secciones separadas d, e, f, g y h que era positivo con respecto a la amplificación de 20q13, 17q23, myc, cnd1 y erbB2.

Comparaciones similares de las características moleculares del cilindro de espécimen tumoral que se emplazaba en la posición de coordenadas (2,1) pueden realizarse siguiendo la línea 10 vertical en la Fig. 12, que conecta la décima caja de cada línea, y corresponde a la segunda fila, primera columna (2,1) de la matriz 76 en la Fig. 10(A). De forma similar, las características de las secciones del cilindro de espécimen tumoral de la posición de coordenadas (2,6) pueden analizarse siguiendo la línea 15 vertical descendentemente a través de la caja 15ª de cada fila. De esta manera, puede conseguirse una información paralela acerca de las secciones separadas de la matriz para las 372 posiciones de la matriz. Esta información puede presentarse visualmente para el análisis como en la Fig. 12, o introducirse en una base de datos para el análisis y la correlación de diferentes características moleculares (tales como patrones de amplificación de oncogenes y la correspondencia de esos patrones de amplificación con la presentación clínica del tumor).

El análisis de secciones consecutivas procedentes de las matrices permite la colocalización de cientos de diferentes dianas de DNA, RNA o proteína en las mismas poblaciones celulares en regiones morfológicamente definidas de cada tumor, lo que facilita la construcción de una base de datos de un gran número de características genotípicas o fenotípicas correlacionadas de tumores humanos no cultivados. La evaluación de hibridaciones in situ de mRNA o la tinción inmunohistoquímica también se facilita con micromatrices de tejido tumoral, debido a que se usan pequeñas cantidades de los reactivos idénticos para cada análisis. Las matrices tumorales también reducen sustancialmente el consumo de tejido, el uso de reactivos y la carga de trabajo cuando se comparan con procesar especímenes convencionales individuales para seccionamiento, tinción y evaluación. Los análisis combinados de varias dianas de DNA, RNA y proteína proporcionan un medio potente para la estratificación de especímenes tumorales en virtud de sus características moleculares. Tales patrones serán provechosos para detectar rasgos moleculares previamente inapreciados pero importantes de los tumores que pueden surgir para tener utilidad de diagnóstico o pronóstico.

Estos resultados muestran que los cilindros muy pequeños usados para preparar matrices tisulares pueden proporcionar en la mayoría de los casos una información exacta, especialmente cuando la zona para muestro tisular del bloque donante se selecciona para contener estructuras histológicas que son las más representativas de las regiones tumorales. También es posible recoger muestras de múltiples regiones histológicamente definidas de un solo boque donante para obtener una representación más exhaustiva del tejido original, y para analizar directamente la correlación entre el fenotipo (morfología tisular) y el genotipo. Por ejemplo, podría construirse una matriz para incluir cientos de tejidos que representan diferentes estadios del avance del cáncer de mama (por ejemplo, tejido normal, hiperplasia, hiperplasia atípica, cáncer intraductal, cáncer invasivo y metastático). La tecnología de matrices tisulares se usaría a continuación para analizar los episodios moleculares que corresponden al avance del tumor.

Un empaquetamiento más estrecho de cilindros y un bloque receptor mayor también pueden proporcionar un número aún más alto de especímenes por matriz. Archivos completos procedentes de laboratorios de patología podrían emplazarse en micromatrices tisulares de 1000 especímenes de réplica para el perfilado molecular. Usando automatización del procedimiento para el muestreo y la formación de matrices, es posible elaborar docenas de matrices tumorales de réplica, proporcionando cada una cientos de secciones para análisis moleculares. Las mismas estrategia e instrumentación desarrolladas para matrices tumorales también permiten la microdissección de cilindros de tejido para el aislamiento de RNA y DNA de alto peso molecular de elementos de tejido tumoral morfológicamente definidos óptimamente fijados, permitiendo de ese modo el análisis correlacionado de los mismos tumores mediante técnicas basadas en PCR para RNA y DNA. Cuando se planea el análisis de ácidos nucleicos, el espécimen tisular se fija preferiblemente (antes de embeber en parafina) en etanol o Molecular Biology Fixative (Streck Laboratories, Inc., Omaha, NE) en vez de en formalina, debido a que la formalina puede reticular y dañar de otro modo el ácido nucleico. El cilindro de tejido de la presente invención proporciona una gran cantidad de DNA o RNA sobre la que realizar una variedad de análisis moleculares.

El potencial de esta tecnología de matrices se ha ilustrado en el análisis por FISH de amplificaciones génicas en el cáncer de mama. La FISH es un método excelente para la visualización y la detección exacta de redisposiciones genéticas (amplificaciones, deleciones o translocaciones) en células morfológicamente definidas individuales. La tecnología de matrices tumorales combinada permite que la FISH se convierta en un potente de alto rendimiento que permite el análisis de cientos de especímenes al día.

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Realización de las Figs. 13-23

Un ejemplo de un sistema automatizado para la preparación de las micromatrices a alta velocidad se muestra en las Figs. 13-23. El sistema incluye un estrado 100 que tiene un motor 102 x y un motor 104 y, cada uno de los cuales hace girar respectivamente un eje 106, 108 motor. El eje 108 mueve un banco 110 para especímenes en una dirección y, mientras que el eje 106 mueve una bandeja 112 sobre el banco 110 en una dirección x. Montados en una fila frontal de la bandeja 112 hay tres recipientes 116, 118 y 120 para receptores, cada uno de los cuales contiene un bloque 122, 124 ó 126 receptor de parafina, y un recipiente 128 para donante que contiene un bloque 130 donante de parafina, en el que está embebido un espécimen 132 tisular. En una fila posterior de la bandeja hay dos bandejas 132, 134 para donantes de múltiples pocillos (que contienen múltiples recipientes para mantener especímenes en medio líquido), y un recipiente 136 de descarte.

Dispuesto por encima del estrado 100 hay un aparato 140 troquelador que se mueve hacia arriba y hacia abajo en una dirección z. El aparato 140 incluye un motor 142 para el estilete, dispuesto verticalmente, central, en el que un estilete 144 tiene un movimiento alternativo. El aparato 140 también incluye un motor 146 para el troquel para el receptor inclinado y un motor 148 para el troquel para el donante inclinado. El motor 146 para el troquel incluye un pistón 150 alternativo que tiene un troquel 156 tubular para el donante en su extremo distal, y un motor 148 para el troquel incluye un pintón 152 alternativo que tienen un troquel 156 tubular para el donante en su extremo distal. Cuando el pistón 150 se extiende (Fig. 14), el troquel 154 para el receptor se coloca con la parte superior abierta de su taladro tubular alineada con el estilete 144, y cuando el pistón 152 está extendido (Fig. 16), el troquel 156 para el donante se coloca con la parte superior abierta de su taladro tubular alineada con el estilete 144.

El funcionamiento secuencial del aparato 140 se muestra en las Figs. 13-17. Una vez que el dispositivo está montado como en la Fig. 13, puede usarse un sistema informático para hacer funcionar el aparato para alcanzar una alta eficacia. De ahí que el sistema informático pueda iniciarse determinando la localización de los recipientes en la bandeja 112 mostrada en la Fig. 13. Los motores 102, 104 x e y se activan a continuación para mover el banco 110 y la bandeja 112 hasta la posición mostrada en la Fig. 14, de modo que la activación del pistón 150 extienda el troquel 154 para el receptor hasta una posición superior (1,1) en el bloque 122 receptor. Una vez que el troquel 154 está en posición, el aparato se mueve descendentemente en la dirección z para troquelar un taladro cilíndrico en la parafina del bloque receptor. El aparato 140 se mueve a continuación ascendentemente en la dirección z para elevar el troquel 154 fuera del bloque 122 receptor de parafina, pero el troquel 154 retiene un núcleo de parafina que deja un receptáculo cilíndrico en el bloque 122 receptor. Los motores x-y se activan a continuación para mover el banco 110 y colocar el recipiente 136 de descarte debajo del troquel 154. El motor 142 para el estilete se activa a continuación para hacer avanzar el estilete 144 hacia dentro de la parte superior abierta del troquel 154 alineado, para liberar el núcleo de parafina del troquel 154 hacia el recipiente 136 de descarte.

El estilete 144 se retrae del troquel 154 para el receptor, el pistón 150 se retrae y el motor x-y mueve el banco 110 y la bandeja 112 para emplazar el recipiente 128 donante en una posición (mostrada en la Fig. 16) tal que el avance del pistón 152 haga avanzar el troquel 156 para el donante hasta una localización deseada sobre el bloque 130 donante. El aparato 140 se mueve a continuación descendentemente en la dirección z para troquelar un núcleo cilíndrico de tejido fuera del bloque 130 donante, y el aparato 140 se mueve a continuación en la dirección z para extraer el troquel 156 para el donante, con el espécimen tisular cilíndrico retenido en el troquel. El motor x-y mueve a continuación el banco 110 y la bandeja 112 hasta la posición mostrada en la Fig. 17, de modo que el movimiento del aparato 140 haga avanzar descendentemente el troquel 156 para el donante en la dirección z hacia el receptáculo de la posición de coordenadas (1,1) del bloque 122 del que se ha retirado el troquel para el receptor. El troquel 156 para el donante se alinea bajo el estilete 144, y el estilete se hace avanzar para liberar el cilindro de tejido retenido del troquel 156 para el donante, de modo que el cilindro de tejido del donante permanezca en el receptáculo del bloque 122 receptor cuando el aparato 140 se mueve ascendentemente la dirección z para retraer el troquel 156 para el donante de la matriz receptora. El pistón 152 se retrae a continuación.

Este procedimiento puede repetirse hasta que se haya formado un número deseado de receptáculos receptores y se hayan rellenado con tejidos donantes cilíndricos en las localizaciones de coordenadas deseadas de la matriz. Aunque este método ilustrado muestra la formación alternativa secuencial de cada receptáculo y la introducción del cilindro de tejido en el receptáculo formado, también es posible formar todos los receptáculos en bloques 122, 124 y 126 receptores como una etapa inicial, y a continuación moverse hasta la etapa para obtener los especímenes tisulares e introducirlos en los receptáculos preformados. El mismo espécimen 132 tisular puede usarse repetidamente, o el espécimen 132 puede cambiarse después de que se obtenga cada espécimen tisular donante, introduciendo un nuevo bloque 130 donante en el recipiente 128. Si el bloque 130 donante se cambia después de que se obtenga cada cilindro de tejido, cada coordenada de la matriz puede incluir tejido procedente de un espécimen diferente.

Un dispositivo de colocación se muestra en la Fig. 18, que ayuda a localizar estructuras de interés de las que pueden tomarse especímenes donantes. El dispositivo de colocación incluye un portaobjetos 160 de soporte que se extiende entre paredes opuestas del recipiente 128 para el donante, para soportar el portaobjetos 162 para especímenes sobre el que se monta una sección delgada teñida del espécimen 132 del bloque 130 donante. Usando un microscopio montado sobre el aparato 140 (el objetivo del microscopio se muestra en 166), pueden encontrarse estructuras microanatómicas de interés. La altura vertical correcta del aparato 140 por encima de la superficie superior del bloque 130 donante puede determinarse mediante el uso de dos lámparas 168, 170 de posicionamiento que están montadas en el aparato 140. Los haces 172, 174 de luz son proyectados desde las lámparas 168, 170 con un ángulo tal que los haces coinciden en un solo punto 176 cuando la altura vertical del aparato 140 por encima de la superficie superior de la lámpara está a un nivel z deseado. Este nivel z deseado colocara los troqueles 152, 154 a una altura apropiada para que penetren en la superficie del bloque 130 en la localización deseada, y hasta una profundidad deseada.

Es ventajoso que los cilindros de tejido troquelados del bloque 130 se ajusten seguramente en los receptáculos receptores que están formados para recibirlos. Si el troquel 156 para el donante tiene los mismos diámetros interno y externo que el troquel 154 para el receptor, entonces el espécimen tisular donante cilíndrico estará formado por el diámetro interno del troquel, y el receptáculo receptor estará formado por el diámetro externo del troquel. Esta discrepancia proporcionará un receptáculo que es ligeramente mayor que el cilindro de tejido donante. De ahí que, como se muestra en las Figs. 19 y 20, el troquel 154 para el receptor tenga preferiblemente un diámetro menor que el troquel 156 para el donante. Por lo tanto, el troquel para el receptor formará un receptáculo cilíndrico (que tiene un diámetro correspondiente al diámetro externo del troquel 154) que es sustancialmente el mismo diámetro que el del cilindro 180 de espécimen tisular, que se forma con un diámetro que está determinado por el diámetro interno del troquel 156 para el donante.

La Fig. 21 ilustra una sección transversal a través de la matriz receptora, una vez que los receptáculos 182 se han formado y rellenado con cilindros 180 de espécimen tisular. Pequeñas divisiones de material 122 parafínico separan los cilindros 180 de tejido y los receptáculos 182 que se ilustran son más profundos que los cilindros 180 de espécimen, de modo que está presente un pequeño hueco entre el espécimen y el fondo de los receptáculos. Una vez que se ha formado la matriz, puede usarse un microtomo para cortar una sección S delgada de la parte superior del bloque 122, de modo que la sección S pueda montarse sobre un portaobjetos 162 para especímenes (Fig. 18) para ayudar a localizar estructuras de interés en el espécimen 132 tisular. A continuación, el microtomo también corta secciones a, b, c, d, e, f, g y h paralelas delgadas que pueden someterse cada una a un análisis molecular diferente, como ya se ha descrito.

Entorno de Funcionamiento Ejemplar

La Fig. 22 y el siguiente análisis pretenden proporcionar una breve descripción general de un entorno informático adecuado en el que puede aplicarse la invención. La invención se aplica en una variedad de módulos programáticos. Generalmente, los módulos programáticos incluyen rutinas, programas, componentes, estructuras de datos, etc. que realizan tareas particulares o aplican tipos de datos abstractos particulares. La invención puede ponerse en práctica con otras configuraciones de sistemas informáticos, incluyendo dispositivos portátiles, sistemas multiprocesadores, dispositivos electrónicos basados en microprocesadores o programables, miniordenadores, ordenadores centrales y similares. La invención también puede ponerse en práctica en entornos informáticos distribuidos en los que las tareas son realizadas por dispositivos de procesamiento remotos que están conectados a través de una red de comunicaciones. En un entorno informático distribuido, los módulos programáticos pueden estar localizados en dispositivos de memoria tanto locales como remotos.

En referencia a la Fig. 22, un entorno funcional para una realización ilustrada de la presente invención es un sistema 220 informático con un ordenador 222 que comprende al menos una unidad 224 de procesamiento (CPU) de alta velocidad, junto con un sistema 226 de memoria, un dispositivo 228 de entrada y un dispositivo 230 de salida. Estos elementos están interconectados mediante al menos una estructura 232 de bus.

La CPU 224 ilustrada es de diseño familiar e incluye una ALU 234 para realizar cómputos, una colección de registros 236 para el almacenamiento temporal de datos e instrucciones, y una unidad 238 de control para controlar el funcionamiento del sistema 220. La CPU 224 puede ser un procesador que tiene cualquiera de una variedad de arquitecturas, incluyendo Alpha de Digital; MIPS de MIPS Technology, NEC, IDT, Siemens y otras; x86 de Intel y otras, incluyendo Cyrix, AMD y Nexgen; 680x0 de Motorola; y PowerPC de IBM y Motorola.

El sistema 226 de memoria incluye generalmente una memoria 240 principal de alta velocidad en la forma de un medio tal como dispositivos semiconductores de memoria de acceso aleatorio (RAM) y memoria de sólo lectura (ROM), y un almacenamiento 242 secundario en la forma de medios de almacenamiento a largo plazo, tales como discos flexibles, discos duros, cinta, CD-ROM, memoria flas, etc., y otros dispositivos que almacenan datos usando medios de grabación eléctricos, magnéticos, ópticos y otros. La memoria 240 principal también puede incluir memoria de pantalla de vídeo para presentar imágenes a través de un dispositivo de pantalla. Los expertos en la técnica apreciarán que la memoria 226 puede comprender una variedad de componentes alternativos que tienen una variedad de capacidades de almacenamiento.

Los dispositivos 228, 230 de entrada y salida también son familiares. El dispositivo 228 de entrada puede comprender un teclado, un ratón, un escáner, una cámara, una tarjeta de captura, un interruptor de fin de carrera (tal como interruptores domésticos, de seguridad o de estado), un transductor físico (por ejemplo, un micrófono), etc. El dispositivo 230 de salida puede comprender una pantalla, una impresora, un motor, un solenoide, un transductor (por ejemplo, un altavoz), etc. Algunos dispositivos, tales como una interfaz de red o un módem, pueden usarse como dispositivos de entrada y/o salida.

Como es familiar para los expertos en la técnica, el sistema 220 informático incluye además un sistema funcional y al menos un programa de aplicación. El sistema funcional es el conjunto de software que controla el funcionamiento del sistema informático y la dotación de recursos. El programa de aplicación es el conjunto de software que realiza una tarea deseada por el usuario, usando recursos informáticos puestos a disposición a través del sistema operativo. Ambos residen en el sistema 226 de memoria ilustrado.

Por ejemplo, la invención podría ejecutarse con un Power Macintosh 8500 disponible de Apple Computer, o un ordenador personal (PC) compatible con IBM. El Power Macintosh usa una CPU PowerPC 604 de Motorola y maneja un sistema operativo MacOS de Apple Computer tal como System 8. Los dispositivos de entrada y salida pueden interconectarse con la CPU usando la interfaz SCSI bien conocida o con tarjetas de expansión que usan el bus de interconexión de componentes periféricos (PCI). Una configuración típica de un Power Macintosh 8500 tiene 72 megabytes de RAM para la memoria principal de alta velocidad y un disco duro de 2 gigabytes para el almacenamiento secundario. Un PC compatible con IBM podría tener una configuración con 32 megabytes de RAM para la memoria de principal de alta velocidad y un disco duro de 2-4 gigabytes para el almacenamiento secundario.

De acuerdo con las prácticas de los expertos en la técnica de la programación informática, la presente invención se describe con referencia a actos y representaciones simbólicas de operaciones que son realizados por el sistema 220 informático, a no ser que se indique otra cosa. A menudo se hace referencia a que tales actos y operaciones son ejecutados informáticamente. Se apreciará que los actos y las operaciones representadas simbólicamente incluyen la manipulación por la CPU 224 de señales eléctricas que representan bits de datos que provocan una transformación o reducción resultante de la representación de la señal eléctrica, y el mantenimiento de bits de datos en localizaciones de memoria del sistema 226 de memoria para de ese modo reconfigurar o alterar de otro modo el funcionamiento del sistema informático, así como otro procesamiento de señales. Las localizaciones de memoria en las que se mantienen bits de datos son localizaciones físicas que tienen propiedades eléctricas, magnéticas u ópticas particulares correspondientes a los bits de datos.

Descripción del Sistema Matricial Informático

Un diagrama de bloques que muestra un sistema para llevar a cabo la invención se muestra en la Fig. 23. El hardware se inicia en la etapa 250, por ejemplo determinando la posición de los troqueles 154, 156, el banco 110 y la bandeja 112. El sistema puede ser configurado a continuación por el operador en la etapa 252, por ejemplo introduciendo datos o indicando al sistema que encuentre la localización (coordenadas x, y, z) de la esquina superior derecha de cada bloque 122-126 receptor, así como las localizaciones de las bandejas 130-136. El número de bloques donantes, receptáculos, la velocidad de funcionamiento, etc. también pueden introducirse en este momento.

En la etapa 254, el sistema solicita la introducción de información identificativa acerca del primer bloque 130 donante que se emplazará en la bandeja 128. Esta información identificativa puede incluir información de números de registro, información clínica acerca del espécimen y/u otra información que sería útil para analizar las matrices tumorales. En la etapa 256, el operador pulsa un botón de la función seleccionada, que eleva los troqueles 154, 156 y permite que una palanca de mandos mueva los especímenes usando los motores x-y. Los datos introducidos se presentan en la etapa 258 y se aprueban en 260.

El sistema obtiene entonces uno o más especímenes donantes procedentes del bloque donante identificado de la etapa 262, y solicita al usuario que introduzca información acerca del siguiente bloque donante. Si la información acerca de otro bloque se introduce, el sistema vuelve a la etapa 256 y obtiene el número deseado de especímenes procedentes del nuevo bloque. Después de que un nuevo bloque donante se haya emplazado en el recipiente 128 para el donante, el sistema también verifica la posición de los troqueles en la etapa 268. Si la información acerca de otro bloque no se introduce en la etapa 264, el sistema mueve la bandeja para donantes hasta la posición de recarga de modo que un bloque 130 de la bandeja para donantes pueda retirarse. Este sistema también es adaptable al muestreo de biopsias cilíndricas procedentes de zonas histológicamente controladas de los especímenes (tales como tumores) para el aislamiento de DNA/RNA.

La tecnología de matrices tumorales automatizada permite probar fácilmente docenas o cientos de marcadores del mismo grupo de tumores. Estos estudios pueden llevarse a cabo en un marco multicentralizado enviando bloques o secciones de matrices tumorales de réplica a otros laboratorios. El mismo sistema sería particularmente valioso para probar marcadores moleculares recientemente descubiertos con respecto de su utilidad diagnóstica, de pronóstico o terapéutica. La tecnología de matrices tisulares también facilita la investigación básica del cáncer al proporcionar una plataforma para la proliferación rápida de cientos o miles de tumores a niveles de DNA, RNA y proteínas, conduciendo a una construcción de una base de datos correlacionada de biomarcadores procedentes de una gran colección de tumores. Por ejemplo, la investigación sobre genes diana de amplificación requiere análisis correlacionados para la amplificación y expresión de docenas de posibles genes y loci en las mismas poblaciones de células. Tales análisis moleculares intensivos de una gran serie definida de tumores serían difíciles de llevar a cabo con tecnologías convencionales.

Ejemplos de Tecnología de Matrices

Las aplicaciones de la tecnología de matrices tisulares no se limitan a estudios del cáncer, aunque los siguientes Ejemplos 1-4 describen realizaciones de su uso en relación con el análisis de neoplasmas. El análisis de matrices también podía ser influyente para comprender la expresión y la dosificación de múltiples genes en otras enfermedades, así como en tejidos normales de seres humanos o animales, incluyendo reposiciones de tejidos procedentes de animales transgénicos diferentes o células cultivadas. Los siguientes ejemplos específicos ilustran algunas realizaciones particulares de la invención.

Ejemplo 1 Especímenes tisulares

Se usó un total de 645 especímenes de cáncer de mama para la construcción de una micromatriz de tejido tumoral de cáncer de mama. Las muestras incluían 372 tumores fijados con etanol recientemente congelados, así como 273 cánceres de mama fijados con formalina, tejidos normales y controles de fijación. El subgrupo de muestras de cáncer de mama congeladas se seleccionó aleatoriamente del banco de tumores del Instituto de Patología, Universidad de Basilea, que incluye más de 1500 cánceres de mama congelados obtenidos mediante resecciones quirúrgicas durante 1986-1997. Solo los tumores procedentes de este banco de tumores se usaron para los análisis moleculares. Este subgrupo fue revisado por un patólogo, que determinó que los especímenes incluían 259 carcinomas ductales, 52 lobulares, 9 medulares, 6 mucinosos, 3 cribriformes, 3 tubulares, 2 papilares, 1 histiocítico, 1 de células claras y 1 rico en lípidos. Había además 15 carcinomas ductales in situ, 2 carcinosarcomas, 4 carcinomas primarios que habían recibido quimioterapia antes de la cirugía, 8 tumores recurrentes y 6 metástasis. La graduación histológica solo se realizó en tumores primarios invasivos que no se habían sometido a quimioterapia previa. De estos tumores, el 24% era grado 1, el 40% grado 2 y el 36% grado 3. El estadio pT era pT1 en el 29%, pT2 en el 54%, pT3 en el 9% y pT4 en el 8%. Los nódulos linfáticos axilares se habían examinado en 282 pacientes (45% pN0, 46% pN1, 9% pN2). Todos los tumores no fijados previamente se fijaron en etanol frío a +4ºC durante la noche y a continuación se embebieron en parafina.

Ejemplo 2 Inmunohistoquímica

Después de la formación de la matriz y el seccionamiento del bloque donante, se usaron procedimientos de inmunoperoxidasa indirectos estándar para inmunohistoquímica (ABCElite, Vector Laboratories). Se usaron anticuerpos monoclonales de DAKO (Glostrup, Dinamarca) para la detección de p53 (DO-7, ratón, 1:200), erbB-2 (c-erbB-2, conejo, 1: 4000) y receptor de estrógeno (ER ID5, ratón, 1:400). Se realizó un pretratamiento con microondas para la recuperación de p53 (30 minutos a 90º) y antígeno erbB-2 (60 minutos a 90º). Se usó diaminobenzidina como un cromógeno. Se usaron tumores con positividad conocida como controles positivos. El anticuerpo primario se omitió para los controles negativos. Los tumores se consideraban positivos para ER o p53 si se observaba una positividad nuclear inequívoca en al menos el 10% de las células tumorales. La tinción de erbB-2 se graduó subjetivamente en 3 grupos: negativa (sin tinción), débilmente positiva (positividad membranosa débil), fuertemente positiva (positividad membranosa fuerte).

Ejemplo 3 Hibridación Fluorescente In Situ (FISH)

Se realizaron hibridaciones FISH bicromáticas usando sondas de ciclina D1, myc o erbB2 etiquetadas con Spectrum-Orange junto con sondas de referencia centrómeras etiquetadas con FITC correspondientes (Vysis). Se realizaron hibridaciones FISH monocromáticas con sondas de región común mínima de 20q13 (Vysis, y véase Tanner et al., Cancer Res. 54:4257-4260 (1994)), mybL2 y 17q23 (Barlund et al., Genes Chrom. Cancer 20: 372-376 (1997)) etiquetadas con Spectrum-Orange. Antes de la hibridación, las secciones de matriz tumoral se desparafinaron, se secaron al aire y se deshidrataron en etanol al 70, 85 y 100% seguido por desnaturalización durante 5 minutos a 74ºC en solución de formamida al 70%-2 X SSC. La mezcla de hibridación contenía 30 ng de cada una de las sondas y 15 \mug de DNA de Cot1 humano. Después de la hibridación durante la noche a 37ºC en una cámara humidificada, los portaobjetos se lavaron y se tiñeron por contraste con DAPI 0,2 \muM en una solución antidesvanecedora. Las señales de FISH se evaluaron con un microscopio de fluorescencia Zeiss equipado con filtros de paso de doble banda para la visualización simultánea de señales de FITC y Spectrum Orange. Más de 10 señales de FISH por célula o aglomerados estrechos de señales se consideraban criterios para la amplificación génica.

Ejemplo 4 Hibridación de mRNA In Situ

Para la hibridación de mRNA in situ, secciones de matriz tumoral se desparafinaron y se secaron al aire antes de la hibridación. Sondas oligonucleotídicas sintéticas dirigidas contra mRNA de erbB2 (número de registro de Genbank X03363, nucleótidos 350-396) se etiquetaron en el extremo 3' con ^{33}P-dATP usando desoxinucleotidil transferasa terminal. Las secciones se hibridaron en una cámara humidificada a 42ºC durante 18 horas con 1 X 10^{7} CPM/ml de la sonda en 100 \mul de mezcla de hibridación (formamida al 50%, sulfato de dextrano al 10%, sarcosilo al 1%, fosfato sódico 0,02 M, pH 7,0, 4 X SSC, 1 X solución de Denhardt y 10 mg/ml de ssDNA). Después de la hibridación, las secciones se lavaron varias veces en 1 X SSC a 55ºC para retirar la sonda no unida y se deshidrataron brevemente. Las secciones se expusieron durante tres días a pantallas Phosphorimager para visualizar la expresión de mRNA de ERBB2. Las secciones de control negativas se trataron con RNasa antes de la hibridación, lo que suprimía todas las señales de hibridación.

El presente método permite el análisis de alto rendimiento de cientos de especímenes por matriz. Por lo tanto, esta tecnología proporciona un incremento de órdenes de magnitud en el número de especímenes que puede analizarse, en comparación con bloques previos en los que unas pocas docenas de especímenes fijados con formalina individuales están en una configuración menos definida o no definida, y se usan para probar anticuerpos. Ventajas adicionales de la presente invención incluyen una destrucción insignificante de los bloques de tejido originales y un protocolo de fijación optimizado que aumenta la utilidad de esta técnica para la visualización de dianas de DNA y RNA. El presente método también permite una obtención y una distribución mejoradas de tejidos tumorales humanos con propósitos de investigación. La automatización del procedimiento permite un muestreo de especímenes y una formación de matrices eficaces en matrices de múltiples tejidos, proporcionando cada una tanto como 50, 100 o incluso hasta 200 secciones para análisis molecular. Los archivos completos de decenas de miles de tejidos fijados con formalina existentes procedentes de laboratorios de patología pueden emplazarse en unas pocas docenas de micromatrices de alta densidad para examinar muchos tipos de tumores, así como diferentes estadios de avance de los tumores. La estrategia de matrices tumorales también permite probar docenas o incluso cientos de marcadores moleculares de pronóstico o diagnóstico potenciales procedentes del mismo grupo de tumores. Alternativamente, las muestras de tejido cilíndricas proporcionan especímenes que pueden usarse para aislar DNA y RNA para el análisis molecular.

En vista de las muchas posibles realizaciones a las que pueden aplicarse los principios de esta invención, se apreciará que las realizaciones ilustradas son ejemplos preferidos de la invención, y no deben considerarse una limitación del alcance de la invención. Por el contrario, el alcance de la invención se define mediante las siguientes reivindicaciones. Por lo tanto, se reivindica como la presente invención todo lo que esté dentro del alcance de estas reivindicaciones.

Claims

1. Un método para preparar especímenes tisulares para un análisis paralelo, que comprende:

\quad: obtener una pluralidad de especímenes donantes alargados de un bloque (30) donante;

\quad: emplazar cada espécimen donante en una localización asignada de una matriz receptora hecha de una matriz de receptáculos formados en un bloque (70) receptor; teniendo los receptáculos un tamaño y una conformación de la sección transversal complementarios de un tamaño y una conformación de la sección transversal de los especímenes donantes;

\quad: obtener una pluralidad de secciones (76) procedentes de la matriz receptora cortando secciones (76) delgadas de la matriz receptora después de que los especímenes donantes se emplacen en las localizaciones asignadas de la matriz receptora, de modo que cada sección (76) contenga una pluralidad de especímenes donantes que mantengan sus localizaciones asignadas después de que la matriz receptora se haya cortado.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que cada espécimen donante se obtiene taladrando una muestra alargada de dicho bloque (30) donante.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en el que emplazar cada espécimen donante en una localización asignada de la matriz receptora comprende formar un receptáculo alargado en dicho bloque (30) receptor, y emplazar la muestra alargada en el receptáculo alargado de dicho bloque (70) receptor.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en el que formar el receptáculo alargado comprende formar un taladro cilíndrico en el bloque (70) receptor, y la muestra se obtiene taladrando un espécimen tisular cilíndrico del bloque (30) donante, en donde el diámetro del receptáculo alargado es sustancialmente el mismo que el diámetro de la muestra.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además asociar un parámetro clínico con cada localización asignada de la matriz receptora.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además realizar un análisis histológico diferente de cada sección (76), incluyendo realizar diferentes pruebas seleccionadas del grupo de un análisis inmunológico y una hibridación de ácido nucleico.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 6, que comprende además determinar si existen correlaciones entre los parámetros clínicos, el análisis inmunológico y la hibridación de ácido nucleico.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que los especímenes donantes son especímenes tisulares o preparaciones celulares, respectivamente.

9. El método de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además:

\quad: formar dicho bloque (30) donante embebiendo un espécimen biológico en un medio de imbibición.

10. El método de acuerdo con la reivindicación 9 como dependiente de la reivindicación 6, que comprende además comparar los resultados de los diferentes análisis histológicos de cada localización asignada con información clínica acerca del espécimen biológico de la localización asignada.

11. El método de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el espécimen biológico es un espécimen tisular procedente de un tumor.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 11, en el que los análisis histológicos comprenden un análisis inmunológico y un análisis de hibridación de ácido nucleico.

13. El método de acuerdo con la reivindicación 9, que comprende además alinear una sección delgada de tejido por encima del bloque (30) donante para identificar un área de interés de la que se toma uno de dichos especímenes donantes.

14. El método de acuerdo con la reivindicación 9, en el que cada espécimen donante alargado es cilíndrico y tiene un diámetro que es menor de aproximadamente 1 mm.

15. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que obtener una pluralidad de especímenes donantes comprende troquelar una muestra de tejido alargada de un espécimen tisular ex vivo.

16. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la localización desde la que se obtiene el espécimen donante del bloque donante se determina examinando una sección delgada cortada del bloque donante del que se obtiene el espécimen donante.

17. El método de acuerdo con la reivindicación 9, en el que obtener la pluralidad de especímenes donantes incluye obtener una pluralidad de núcleos de muestra donantes cilíndricos del espécimen biológico; taladrar núcleos receptores de un medio de imbibición receptor para formar la matriz receptora de receptáculos cilíndricos; en donde obtener la pluralidad de secciones incluye seccionar el medio de imbibición receptor para obtener una sección transversal de los núcleos de muestra donantes de la matriz mientras se mantienen las localizaciones asignadas de la matriz en secciones transversales consecutivas.

18. Un aparato para preparar especímenes para el análisis paralelo de secciones de matrices de material biológico, que comprende:

\quad: un troquel (156) para el donante dispuesto para troquelar un espécimen tisular del bloque (30) donante en una posición donante,

\quad: un troquel (154) para el receptor dispuesto para troquelar núcleos de receptáculo de un bloque (70) receptor en una posición receptora, para formar una matriz receptora de receptáculos que están cada uno colocados en una posición preseleccionada en relación con el troquel (156) para el donante;

\quad: en donde el troquel (156) para el donante está dispuesto para aportar un espécimen tisular a un receptáculo en la posición preseleccionada;

\quad: en donde el troquel (154) para el receptor tiene un diámetro externo que es menor que el diámetro externo del troquel (156) para el donante, de modo que los receptáculos tienen una conformación complementaria de la conformación del espécimen tisular.

19. El aparato de acuerdo con la reivindicación 18, que comprende además un soporte (31) colocado para mantener el bloque receptor en la posición receptora.

20. El aparato de acuerdo con la reivindicación 19, en el que el soporte (31) está colocado para mantener el bloque donante en la posición donante.

21. El aparato de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 20, en el que el soporte (31) comprende un dispositivo (102, 104) de colocación x-y que puede colocarse incrementalmente para alinear receptáculos secuenciales del bloque (70) receptor con el troquel (156) para el donante.

22. El aparato de acuerdo con la reivindicación 18, que comprende además un estilete (144) colocado para la introducción en el troquel (156) para el donante para expulsar el espécimen tisular del troquel (156) hacia dentro de uno de los receptáculos alineados con el troquel (156).

23. El aparato de acuerdo con la reivindicación 18, que comprende además un dispositivo de colocación dispuesto para soportar un portaobjetos para secciones delgadas sobre el bloque (30) donante y permitir la colocación del portaobjetos para secciones delgadas, para alinear estructuras de interés del portaobjetos para secciones delgadas con regiones del espécimen (62, 132) tisular correspondientes del bloque (30) donante.

24. El aparato de acuerdo con la reivindicación 18, en el que el troquel (154) para el receptor es capaz de ser colocado en una posición fija con relación al bloque (70) receptor para formar la matriz de receptáculos en el bloque (70, 122) receptor.

25. El aparato de acuerdo con la reivindicación 24, que comprende además un registrador para registrar las posiciones de los receptáculos en el bloque (70, 122) receptor.

26. El aparato de acuerdo con la reivindicación 25, en el que el registrador es un sistema (220) ejecutado informáticamente para registrar las posiciones de los receptáculos y una identificación del espécimen (62, 132) tisular que está emplazado en cada receptáculo.

27. El aparato de acuerdo con la reivindicación 19, en el que:

\quad: el soporte (31) es una plataforma de colocación x-y para mover una bandeja que soporta el bloque (70, 122) receptor hasta una pluralidad de coordenadas.

28. El aparato de acuerdo con la reivindicación 27, que comprende además un microscopio para observar el bloque (30, 130) donante y localizar una estructura de interés en un portaobjetos de referencia alineado con el bloque (30, 130) donante.

29. El aparato de acuerdo con la reivindicación 27, que comprende además un estilete (144) que se alinea alternativamente de forma selectiva con el troquel (156) para el donante y el troquel (154) para el receptor para desplazar el contenido fuera del troquel (154) para el receptor después de que el núcleo receptor se troquele del bloque (70, 122) receptor y para desplazar el contenido del troquel (156) para el donante hacia dentro de los receptáculos del bloque (70, 122) receptor después de que un espécimen tisular se troquele del bloque (30, 130) donante.