ES2267722T3

ES2267722T3 - Composicion farmaceutica para el tratamiento y prevencion de la fibrosis y cirrosis hepatica.

Info

Publication number: ES2267722T3
Application number: ES01910188T
Authority: ES
Inventors: Sang Geon Kim; Keon Wook Kang
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2000-03-02
Filing date: 2001-03-02
Publication date: 2007-03-16
Anticipated expiration: 2021-03-02
Also published as: RU2250768C2; RU2002126216A; CN1218698C; JP4226246B2; EP1263435B1; JP2004538239A; EP1263435A1; DE60121426T2; CN1407891A; BR0108732A; AU2001237768A1; ATE332693T1; DE60121426D1; WO2001064215A1; EP1263435A4

Abstract

Una composición farmacéutica para prevenir y tratar el progreso de la fibrosis y cirrosis hepática, que comprende 5-(2-pirazinil)-4-metil-1, 2-ditiol-3- tiona (oltipraz) y dimetil-4, 4''-dimetoxi-5, 6, 5'', 6''-dimetilen dioxibifenil-2, 2''- dicarboxilato (DDB).

Description

Composición farmacéutica para el tratamiento y prevención de la fibrosis y cirrosis hepática.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a una composición farmacéutica para el tratamiento y prevención de fibrosis y cirrosis hepática. Específicamente, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica para el tratamiento y prevención de fibrosis y cirrosis hepática, que comprende 5-(2-pirazinil)-4-metil-1,2-ditiol-3-tiona (oltipraz) y dimetil-4,4'-dimetoxi-5,6,5',6'-dimetilen dioxibifenil-2,2'-dicarboxilato (DDB) como ingredientes activos principales.

Antecedentes de la invención

El hígado juega un papel fundamental en el metabolismo de xenobióticos y en el metabolismo de sustancias endógenas y es un órgano importante con reacciones enzimáticas consistentes y metabolismo de la energía. Entre muchas enfermedades crónicas en Corea, hepatitis, cirrosis, y cáncer hepático son las más extendidas y las enfermedades que amenazan la vida más próximas a las enfermedades cardiovasculares. Como Corea tiene una población relativamente grande de bebedores comparado con los países desarrollados, y como las lesiones del hígado resultantes de beber en exceso son bastante elevadas, se ha prestado mucha atención al tratamiento de las enfermedades hepáticas. A menudo la lesión crónica en el hígado resultante de infección viral o por beber alcohol provoca cirrosis o cáncer hepático. Considerando las características fisiológicas y la importancia de los tejidos hepáticos, y a la luz de la importancia del tratamiento y prevención de las enfermedades hepáticas, hay una gran demanda de un desarrollo total de fármacos terapéuticos y preventivos contra la lesión en el hígado.

Diversas sustancias, incluyendo varios compuestos sintéticos y preparaciones galénicas, muestran funciones hepatoprotectoras tanto in vitro como in vivo. Aunque ya se sabía que silimarina o betaína tienen efectos protectores del hígado con el mecanismo de acción de inhibición de citoquina y aumento en el nivel de glutatión, un efecto curativo sería más difícil de esperar debido a su baja eficacia. Como actualmente no hay disponibles agente curativos apropiados contra enfermedades hepáticas, dichos agentes se usan frecuentemente para ensayos clínicos. Malotilato y sus derivados, que están indicados para el tratamiento de fibrosis del hígado, protegen al hígado de compuesto químicos tóxicos y el posible mecanismo de acción incluye la inducción de enzimas conjugantes de fase II y la inhibición de los citocromos P450. Sin embargo, los compuestos no inhiben selectivamente varios citocromos P450 y muestran sólo un efecto preventivo.

Se sabe que varios sustituyentes de ditioltiona que contiene azufre de origen natural en plantas crucíferas, tienen efectos protectores del hígado. Entre ellos, se usó oltipraz como agente curativo contra la esquistosomiasis con la siguiente fórmula.

1

Oltipraz aumenta el contenido celular de tiol e induce la expresión de las enzimas responsables del mantenimiento de la agrupación de glutatión (GSH) y de detoxificar el tejido de moléculas electrófilas. Oltipraz aumenta las actividades de las siguientes enzimas: NAD(P)H quinona reductasa, epóxido hidrolasa microsomal, glutatión S transferasa (GST) y UDP-GT. En particular, GST protecte el hígado de algunos compuestos químicos tóxicos tales como tetracloruro de carbono o acetaminofeno (Ansher SS, Dolan P, y Bueding E. Chemoprotective effects de two dithiolthiones and de butylhydroxyanisole contra carbon tetrachloride and acetaminophen toxicity. 1983 Hepatology 3,
932-935).

Adicionalmente, oltipraz inhibe la carcinogénesis química provocada por benzo[a]pireno, NDEA, y mostaza de uracilo así como la tumorigénesis hepática inducida por B1 y carcinogénesis de colon inducida por azoximetano (Bolton MG, Munoz A, Jacobson LP, Groopman JD, Maxuitenko YY, Roebuck BD, y Kensler TW. Transient intervention with oltipraz protects contra aflatoxin-induced hepatic tumorigenesis. 1993, Cancer Res. 53, 3499-3504).

Los mecanismos inhibidores conocidos de carcinogénesis por oltipraz son los siguientes. En primer lugar, oltipraz aumenta el nivel de un antioxidante, GSH reducido, en tejidos. En segundo lugar, inhibe la bioactivación de carcinógenos inhibiendo las enzimas en fase I tales como citocromo P450. En tercer lugar, promueve la detoxificación de carcinógenos induciendo enzimas en fase II detoxificantes incluyendo GST y UDP-GT. En cuarto lugar, oltipraz inhibe la replicación del virus de inmunodeficiencia humana (HIV) de tipo I in vitro. En quinto lugar, retira los intermedios reactivos en células aumentando los niveles de tiol y promueve la reparación del ADN. Se ha informado de que oltipraz aumenta los niveles de GSH en la mayoría de tejidos y retira los radicales libres generados por la radiación o los xenobióticos. Se sabe también que oltipraz funciona como un agente protector contra la radiación ayudando a mantener la homeostasis celular.

Respecto a la descripción anterior, a continuación se mostrará información más detallada. El cáncer es crecimiento celular incontrolado y la diferenciación provocada presumiblemente por el ADN daña las células somáticas (Cancer Biology, 3rd ed. Raymond W. Ruddon, pág. 61-95, 497-507, Oxford Press). Los efectos anticancerosos de los agentes químicos dependen fundamentalmente de sus efectos anti-mutagénesis o de su actividad en la supresión de la transformación en células cancerosas o la proliferación de células cancerosas. Oltipraz se ha estudiado como agente quimiopreventivo canceroso (Ansher et al., 1983; Bolton et al., 1993). Los efectos quimiopreventivos cancerosos de oltipraz están asociado no sólo con la inhibición del citocromo P450 3A, sino también con la inducción de enzimas en fase II detoxificantes. Oltipraz aumenta la expresión de glutatión S-transferasa (GST) en células y animales (Clapper et al., 1994; Davidson et al., 1990), que está asociado con la supresión en heridas en tejido inducidas por tóxicos y carcinogénesis (Kensler et al., 1987; Maxuitenko et al., 1998). Oltipraz protege el hígado contra lesiones en el tejido provocadas por radiación (Kim et al., 1997), e inducción de GST conocida del estudio anterior significa una respuesta celular adaptativa. Oltipraz protege también el hígado contra tóxicos (Ansher et al., 1983). La inhibición de la carcinogénesis inducida por aflatoxina B1 por oltipraz está mediada por la intervención de la activación metabólica catalizada por el citocromo P450 3A de carcinógeno. De acuerdo con recientes ensayos clínicos, oltipraz fue eficaz en la disminución de los niveles de aflatoxina B1 en plasma de personas con alto riesgo de cáncer hepático. La carcinogénesis inducida por aflatoxin B1 en animales se redujo también por la aplicación de oltipraz.

Se ha informado de que oltipraz inhibe la replicación del virus de la hepatitis B (HBV) en células 2.2.15, que se infectaron con plásmido que contiene ADN de HBV. Por lo tanto, oltipraz inhibe la transcripción del gen del virus de la hepatitis B, aumenta la expresión de la proteína p53 (Chi et al., 1998), e inhibe la replicación del virus de inmunodeficiencia humana (HIV) (Prochaska et al., 1995).

Se han realizado ensayos clínicos respecto al efecto quimiopreventivo de oltipraz contra la carcinogénesis del hígado en China. Los resultados mostraron que oltipraz tenía efectos protectores débiles con la carcinogénesis del hígado. Se sabe también que oltipraz protege al hígado contra la hepatotoxicidad producida por tóxicos, al menos moderadamente. Además, la seguridad de oltipraz se ha demostrado en estudios de toxicidad realizados en ratas y perros (Fund. Appl. Toxicol. 1997 Jan; 35(1): 9-21).

DDB (dimetil-4,4'-dimetoxi-5,6,5',6'-dimetilen dioxibifenil-2,2'-dicarboxilato), un componente derivado de
Shizandrae, es un agente curativo para el tratamiento de hepatitis usado clínicamente en Asia del Este, incluyendo Corea. DDB protecte al tejido hepático contra lesiones inducidas por tetracloruro de carbono, galactosamina, tioacetamida o prednisolona y potencia la producción de anticuerpos. Sabiendo que es eficaz en ensayo clínico para los pacientes con hepatitis, DDB se usa ampliamente en el campo clínico. Los presentes inventores informaron de que el efecto farmacológico de DDB estaba asociado con la inhibición de la activación de NF-\kappaB y la producción de TNF-\alpha. Además, se descubrió que DDB no afectaba a la expresión de las enzimas que metabolizan el fármaco. Como NF-\kappaB se conoce como un factor de transcripción que media en la respuesta inflamatoria, un inhibidor de NF-\kappaB sería capaz de inhibir una respuesta inflamatoria sistémica.

La fibrosis del hígado indica un estado prepatológico en el que los tejidos hepáticos dañados en enfermedades hepáticas crónicas tales como hepatitis no se reparan dando tejidos normales, sino que se convierten en tejidos fibrosos tales como colágeno como parte de una respuesta adaptativa in vivo. Aunque la fibrosis del hígado es un resultado de un procedimiento de reparación in vivo como respuesta a la lesión del tejido, los tejidos hepáticos dañados se sustituyen por tejidos fibrosos, que nunca más pueden funcionar normalmente (por ejemplo metabolismo in vivo o producción de jugo biliar). Como una fibrogénesis del hígado continua y recurrente conduce a cirrosis y finamente provoca la muerte, es crucial desarrollar nuevos fármacos para tratar la fibrosis del hígado. Sin embargo, como no se conoce el mecanismo preciso de la fibrogénesis del hígado, aún no se han desarrollado del fármacos curativos apropiados.

Estudios recientes han puesto de manifiesto que el factor de crecimiento transformante beta (TGF-\beta), una citoquina secretada por células Kupffer e Ito en el hígado, era un mediador importante en la fibrosis del hígado. Además, se informó de que bloqueando la actividad de TGF-\beta empleando anticuerpos de TGF-\beta, ARN antisentido, y modificaciones para los receptores de TGF-\beta disminuye significativamente la fibrosis del hígado. Sin embargo, los efectos de dicha investigación sólo se han confirmado a nivel experimental. Aún no se ha informado sobre los fármacos clínicamente viables para la fibrosis y cirrosis hepática.

Objeto de la invención

El objeto de la presente invención es proporcionar una composición farmacéutica que maximiza la eficacia del tratamiento de la fibrosis y cirrosis hepática, y que puede usarse también como agente preventivo.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar un uso de una composición farmacéutica usada en la preparación de medicina para el tratamiento y prevención de la fibrosis y cirrosis hepática.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona una composición farmacéutica para el tratamiento y prevención de la fibrosis y cirrosis hepática, que comprende 5-(2-pirazinil)-4-metil-1,2-ditiol-3-tiona (oltipraz) y dimetil-4,4'-dimetoxi-5,6,5',6'-dimetilen dioxibifenil-2,2'-dicarboxilato (DDB) como componentes principales. La proporción de oltipraz y DDB de dicha composición es preferiblemente 25:0-25, más preferiblemente 5:0,1-5, y más preferiblemente aún 5:1. Las formulaciones de oltipraz/DDB de acuerdo con la presente invención muestran sorprendentemente un buen efecto sobre el tratamiento y prevención de la fibrosis y cirrosis hepática, y son fármacos seguros que tienen baja toxicidad en el cuerpo humano.

Breve descripción de las ilustraciones

La Fig. 1a es una fotografía que muestra la inhibición del efecto de oltipraz sobre la expresión del ARNm de TGF-\beta 1 en tejido hepático cuando se administra DMN a una rata.

La Fig. 2a es una fotografía de tejido hepático de un animal normal (tinción H & E).

La Fig. 2b es una fotografía de tejido hepático de un animal normal (tinción H & E).

La Fig. 3a es una fotografía de tejido hepático del grupo al que se administró DMN (tinción H & E).

La Fig. 3b es una fotografía de tejido hepático del grupo al que se administró DMN (tinción tricrómica de Masson).

La Fig. 4a es una fotografía de tejido hepático del grupo al que se co-administraron DMN y oltipraz (25 mg/kg)/
DDB (5 mg/kg) (tinción H & E).

La Fig. 4b es una fotografía de tejido hepático del grupo al que se co-administraron DMN y oltipraz (25 mg/kg)/
DDB (5 mg/kg) (tinción tricrómica de Masson).

La Fig. 5a es una fotografía de tejido hepático del grupo al que se co-administraron DMN y oltipraz (15 mg/kg)/
DDB (15 mg/kg) (tinción H & E).

La Fig. 5b es una fotografía de tejido hepático del grupo al que se co-administraron DMN y oltipraz (15 mg/kg)/
DDB (15 mg/kg) (tinción tricrómica de Masson).

La Fig. 6a es una fotografía de tejido hepático del grupo al que se co-administraron DMN y oltipraz (5 mg/kg)/DDB (25 mg/kg) (tinción H & E).

La Fig. 6b es una fotografía de tejido hepático del grupo al que se co-administraron DMN y oltipraz (5 mg/kg)/DDB (25 mg/kg) (tinción tricrómica de Masson).

Descripción detallada de la presente invención

Los presentes inventores han realizado un descubrimiento sin precedentes de que oltipraz tiene un efecto inesperadamente sorprendente para tratar y prevenir la fibrosis y cirrosis hepática. Además, han descubierto que la eficacia de tratamiento y prevención de oltipraz aumenta significativamente cuando se combina con DDB.

La fibrosis, una etapa previa de la cirrosis, ocurre cuando se causa un daño grave al hígado por diversos factores. La cirrosis está parcialmente relacionada con la carcinogénesis y aumenta notablemente el riesgo de cáncer hepático en sus víctimas. Sin embargo, el mecanismo patológico de la cirrosis es claramente distinguible del cáncer hepático. Es decir, la fibrosis hepática ocurre cuando hay un daño crónico y grave al tejido hepático. Los factores causantes del daño hepático incluyen virus, parásitos, consumo de alcohol, productos químicos, y medicinas. La fibrosis hepática ocurre mediante la sobre-producción de la matriz extracelular (por ejemplo, colágeno de tipo I, III y IV) provocado por la activación de las células no parenquimales en tejido hepático, tales como células Kupffer, células radiadas, etc. Más específicamente, la fibrosis ocurre por la activación y posterior transformación de células radiadas en miofibroblastos. Las células radiadas activadas producen pues un exceso de matrices extracelulares. Adicionalmente, fibrosis y cirrosis son claramente distinguibles como fenómenos patológicos aparte de hepatitis viral y cáncer hepático. Por lo tanto, sus tratamientos y prevenciones respectivos también son distinguibles. Sin embargo, actualmente, no hay un fármaco clínicamente viable para la cirrosis hepática.

La presente invención se basa en el descubrimiento de que oltipraz, que se sabe que es eficaz en la prevención del cáncer hepático, es eficaz también contra la fibrosis y cirrosis hepática, que son completamente diferentes en sus mecanismos patológicos respecto al cáncer hepático, y que el uso de oltipraz con DDB, que ya se conocía anteriormente que era eficaz solo contra hepatitis, proporciona eficacia más allá de lo esperado en el tratamiento y prevención de la fibrosis y cirrosis hepática. Estos hechos se han demostrado en los experimentos descritos a continuación.

Oltipraz o oltipraz/DDB disminuye las puntuacións de fibrosis y las puntuacións de Knodell, indicadores de fibrosis acelerada por dimetilnitrosamina (DMN). Esto coincide con los exámenes microscópicos de tejido ejemplares. Adicionalmente, tras la administración, oltipraz o oltipraz/DDB inhiben significativamente los indicadores de hepatotoxicidad tales como ALT, AST, bilirrubina, y gamma-glutamil transpeptidasa (gamma-GT). Esto muestra que oltipraz o oltipraz/DDB puede mejorar la fibrosis retardando sus procedimientos respectivos. El mecanismo de inhibición de fibrosis por oltipraz o oltipraz/DDB gira alrededor de la inhibición de la expresión de TGF-\beta. De acuerdo con resultados cuantitativos de RT-PCR, oltipraz o oltipraz/DDB inhiben completamente la expresión del ARNm de TGF-\beta acelerada por dimetilnitrosamina. Esto sirve como evidencia de que oltipraz es un fármaco que es capaz de inhibir la génesis y progresión de la fibrosis y cirrosis hepática. Oltipraz induce las enzimas de detoxificación hepática GST y mEH, aumenta GSH, y muestra una actividad de conjugación radical; al contrario, DDB no induce las enzimas de detoxificación. A la vista de lo anterior, se cree que oltipraz y DDB tienen efectos farmacológicos complementarios. Más específicamente, como la inhibición de la actividad metabólica de CYP3A por DDB en microsomas de hígado humano se cree que inhibe posteriormente el metabolismo de oltipraz, incluso una baja dosificación de oltipraz puede proporcionar una potente protección del hígado y prolongar la duración eficaz del fármaco.

En la presente invención, se observaron los efectos curativos de las combinaciones oltipraz/DDB sobre la fibrosis hepática a diversas proporciones en ratas a las que se había administrado DMN. El ensayo se realizó para la proporción en peso de 25:5, 15:15 y 5:25 (mg/kg) de oltipraz:DDB. En los resultados, cuando se administró DMN (la observación se realizó 1 semana después de 3 semanas de administración), ALT, AST, bilirrubina, gamma-glutamil transpeptidasa (\gamma-GT), las puntuacións de fibrosis y las puntuacións de Knodell aumentaron significativamente comparadas con las del grupo de control. En contraste, cuando se administró oltipraz/DDB, estos valores disminuyeron. Oltipraz (25 mg/kg)/DDB (5 mg/kg) mostró el mayor efecto inhibidor de fibrosis hepática. Esto demuestra que oltipraz y DDB muestran sinergia en la supresión de lesión del hígado y fibrosis, y muestra que la proporción óptima entre ellos es de 5:1. Además, la administración de la combinación oltipraz/DDB redujo los índices bioquímicos en la sangre, es decir, la fibrosis de las puntuacións del hígado y las puntuacións de Knodell, más que oltipraz (50 mg/kg) solo. En consecuencia, se cree que usando oltipraz con DDB puede reducir los efectos secundarios, tales como trastornos del tracto gastrointestinal, parestesia de las manos y los pies, etc., que puede ser el resultado de altas dosificaciones de oltipraz. DDB inhibe la respuesta inflamatoria inducida por DMN, mientras que oltipraz evita la expresión de TGF-\beta, aumenta la expresión de enzimas antioxidantes e induce aumentos en GSH. Por este mecanismo, oltipraz/DDB maximiza el efecto de tratar y prevenir la fibrosis del hígado. Por lo tanto, oltipraz/DDB utiliza efectos complementarios para la protección del hígado. Además, oltipraz/DDB puede usarse clínicamente ya que casi no muestra efectos
secundarios.

Es preferible que la composición farmacéutica de la presente invención se use combinando fármacos formulados independientemente, o preparando una formulación de combinación compuesta por una mezcla de fármacos. Cuando la composición farmacéutica de la presente invención se va a usar realmente, las formas de dosificación unitaria adecuadas para administración oral deben formularse y administrarse de acuerdo con los convenios del campo farmacéuticos propiamente dicho. Para conseguir esto, la formulación oral comprende una cápsula dura o blanda, comprimido, polvo, etc. La formulación oral, además de oltipraz/DDB como agente farmacológicamente activo, puede contener uno o más medios portadores convencionales farmacológicamente no activos. Por ejemplo la formulación oral puede contener como aditivos almidón, lactosa, carboximetilcelulosa, caolín, y excipientes similares; agua, gelatina, alcohol, glucosa, goma arábiga, goma tragacanto y aglutinantes similares; almidón, dextrina, alginato sódico, y disgregantes similares; talco, ácido esteárico, estearato de magnesio, parafina líquida, y lubricantes similares. Pueden añadirse también adyuvantes de disolución.

La dosificación diaria de la presente invención depende de diversos factores tales como el grado de lesión del hígado del paciente, tiempo de comienzo de la hepatitis, edad, salud, complicaciones, etc. Sin embargo, para el adulto medio, la composición de oltipraz/DDB se administra una o dos veces al día para una dosificación diaria total de 5 a 200 mg, más preferiblemente de 25 a 50 mg. Sin embargo, en pacientes con lesión grave en el hígado o cuando se usa como agente anti-recurrente después de carcinectomía hepática, la presente invención puede alejarse del alcance de la composición farmacéutica anterior y emplea dosificaciones aún mayores. Más preferiblemente, una o dos dosificaciones unitarias que contienen 25 mg de oltipraz y 5 mg de DDB se administran por vía oral dos veces al día.

La composición farmacéutica de la presente invención complementa óptimamente oltipraz, que tiene cualidades notables de inhibición de fibrosis y de protección del hígado, con DDB, que tiene una excelente efecto supresor de la respuesta inflamatoria. Lo anterior proporciona inhibición de la fibrosis y cirrosis hepática, tiene baja toxicidad, y casi ningún efecto secundario. Por lo tanto, la presente invención puede usarse de forma segura a largo plazo para el tratamiento y prevención de la fibrosis y cirrosis hepática.

La presente invención se explicará con más detalle mediante los siguientes ejemplos de trabajo. Sin embargo, la presente invención no se limita a estos ejemplos de trabajo.

Ejemplos de ensayo

Ejemplo de Ensayo 1

Efecto anti-fibrótico de oltipraz (1)

Ratas a las que se administró constantemente dimetilnitrosamina (DMN) durante un periodo de 4 semanas presentaron un aumento de cuatro veces en la alanina aminotransferasa y aspartato aminotransferasa en plasma. Tras el pretratamiento de 50 mg/kg de oltipraz, los aumentos de la activación de ALT and AST en plasma sanguíneo se inhibieron en un 50% (Tabla 1).

La actividad de gamma-glutamil transpeptidasa (gamma-GT) en plasma y el contenido de bilirrubina se usan como indicadores de la funcionalidad hepática. Oltipraz inhibió los aumentos de la activación de gamma GT en un 70%-80% en ratas a las que se había administrado DMN. Por otro lado, cuando se administró DMN, el contenido de bilirrubina aumentó ocho veces comparado con el grupo de control. Cuando se administraron simultáneamente 50 mg/kg de oltipraz y DMN el aumento de bilirrubina en plasma se inhibió en un 65%.

TABLA 1 Valores de ALT, AST, gamma-GT, Bilirrubina

Grupo	ALT	AST	gamma-GT	Bilirrubina
Control	49 \pm 2	113 \pm 6	0,2 \pm 0,1	0,2 \pm 0,01
DMN	190 \pm 12*	412 \pm 39*	12,1 \pm 4,1*	0,9 \pm 0,2*
DMN + Oltipraz	116 \pm 4^{#}	246 \pm 32^{#}	2,6 \pm 0,5^{#}	0,3 \pm 0,03^{#}
50 mg/kg

Cada valor está representado por la media \pm la desviación típica. El número de animales usado varió de 8 a 16. La significancia de cada grupo se indicó mediante el ensayo de Newman-Keuls de análisis múltiple. Los marcadores de significancia son: * = p < 0, 05 comparado con el control, ^{#} = p < 0, 05 comparado con el grupo tratado con DMN.

Ejemplo de Ensayo 2

Efecto anti-fibrótico de oltipraz (2)

El efecto patológico sobre el tejido de oltipraz sobre fibrosis hepática inducida por DMN se observó en un modelo de ensayo animal. Se observó fibrosis clara en ratas a las que se administró con DMN durante un periodo de 4 semanas, 3 veces por semana. Cuando oltipraz (administrado por vía oral en dosis de 5-50 mg/kg, 3 veces por semana, durante 4 semanas) y DMN se administraron simultáneamente, la fibrosis en el tejido hepático se redujo cuando se comparó la administración de DMN solo. La necrosis del tejido hepático y la fibrosis se determinaron patológicamente usando indicadores de patología del tejido hepático, es decir, tinción de Van Gieson y tinción tricrómica de Masson (Tabla 2).

Una dosis de 50 mg/kg de oltipraz mejoró eficazmente la fibrosis inducida por DMN (Tabla 2). El grado de fibrosis se determinó evaluando las puntuacións de fibrosis y Knodell, que muestran grados de lesión en el hígado y fibrosis. Comparado con el grupo de solo DMN, el grupo de DMN+oltipraz mostró menores puntuacións de fibrosis y Knodell, lo que muestra una curación de la lesión del hígado y de la fibrosis.

TABLA 2 Inhibición del Efecto de Oltipraz sobre la Fibrosis del Tejido Hepático

Grupo	Valores de Fibrosis	Valores Knodell
Control	0	0
DMN	3,7 \pm 0,5	16,1 \pm 2,9
DMN+Oltipraz 5 mg/kg	3,1 \pm 0,4*	11,1 \pm 1,7*
DMN+Oltipraz 15 mg/kg	2,9 \pm 0,8*	12,1 \pm 1,9*
DMN+Oltipraz 50 mg/kg	2,5 \pm 0,9**	8,0 \pm 1,6**

Cada valor está representado por la media \pm la desviación típica. El número de animales usado fue de 8 a 16. La significancia de cada grupo se determina mediante el ensayo de Newman-Keuls de análisis múltiple.* p < 0,05, ** p < 0, 01. Grado de fibrosis 0 = Normal, 1 = Presencia de tejido fibroso débil, 2 = Presencia moderada de tejido fibroso, 3 = Presencia obvia de tejido fibroso, 4 = Evidencia de fibrosis grave. La suma de valores del puente periportal (Greatest = 10), pérdida de célula intralobular (Greatest = 4), inflamación portal (Greatest = 4), y fibrosis (Greatest = 4) produce la puntuación de Knodell.

Ejemplo de Ensayo 3

Mecanismo farmacológico de oltipraz en anti-fibrosis

TGF-\beta 1 es una citoquina principal que aumenta de expresión durante la fibrosis tras la lesión del tejido. Se observó la expresión de ARNm de TGF-\beta 1 animal con procedimiento analíticos de RT-PCR durante la administración solo con DMN y la administración simultánea de DMN y oltipraz. En animales a los que se ha administrado DMN durante 4 semanas, el exceso irreversible de fibrogénesis impidió la observación de la expresión de ARNm de TGF-\beta 1. La expresión de ARNm de TGF-\beta 1 se observó en animales a los que solo se había administrado DMN. 18 horas después de la administración de DMN, se administró oltipraz. La expresión de ARNm de TGF-\beta 1 se observó después 24 horas más tarde. En ratas a las que se administró DMN, ARNm de TGF-\beta 1 aumentó notablemente en tejido hepático. La expresión de ARNm de TGF-\beta 1 inducida por DMN se inhibió completamente mediante la administración de 100 mg/kg de oltipraz. La expresión de ARNm de GAPDH no cambió después de la administración de solo DMN ni después de la administración simultánea de DMN y oltipraz. Por lo tanto, se demuestra que oltipraz inhibe la fibrosis hepática mediante el mecanismo farmacológico que reduce la expresión de TGF-\beta 1 (Figura 1).

Ejemplo de Ensayo 4

Evaluación de oltipraz en la inhibición de la producción de TGF-\beta

Se realizó un ensayo usando células macrófagas RAW264.7 para observar si oltipraz inhibía directamente la producción de TGF-\beta, que se sobre-expresa en macrófagos, y para evaluar los mecanismo moleculares farmacológicos relacionados. Cuando oltipraz se añadió directamente a las células RAW264.7, que tenían una expresión aumentada de TGF-\beta, se descubrió que oltipraz inhibía la expresión de TGF-\beta de una manera dependiente de la dosis. Estos resultados muestran que oltipraz puede funcionar como un agente anti-fibrótico en células Kupffer hepáticas inhibiendo la producción de TGF-\beta. Adicionalmente, el aumento de la expresión de TGF-\beta se inhibe mediante EGTA o genisteína, que es un inhibidor de tirosina quinasa. Este resultado muestra que la inhibición de la producción de TGF-\beta por oltipraz puede ser el resultado de la regulación intracelular de calcio y los cambios en la actividad de la proteína quinasa (Tabla 3).

TABLA 3 Inhibición de la Expresión de TGF-\beta por Oltipraz en Macrófagos

	Control	Oltipraz 30 \muM	Oltipraz 100 \muM	EGTA 1 mM	Genisteína 100 \muM
Porcentaje de	0	30	60	80	80
inhibición de
TGF-\beta (%)

Ejemplo de Ensayo 5

Mecanismo anti-inflamatorio de DDB (Inhibición de la activación de NF-\kappaB)

Se sabe que la activación de NF-\kappaB está asociada con las respuestas inflamatorias. Para comparar la actividad de NF-\kappaB en el tejido hepático cuando se administra DDB con cuando no se administra DDB, se realizó el siguiente ensayo. Se usaron ratas SD macho con un peso de aproximadamente 150 g. Para un grupo se usaron 7 ratas. Para el grupo de control (se les administró vehículo) y el grupo de ensayo (se les administraron de 20 a 100 mg/kg/día de DDB), la actividad de NF-\kappaB de acuerdo con el tratamiento de endotoxina (lipopolisacárido, LPS) se midió usando un Ensayo de Desplazamiento de Movilidad por Electroforesis (EMSA).

El tratamiento con LPS (1 \mug/kg) dio como resultado un aumento en el nivel de la transcripción nuclear de NF-\kappaB de los complejos p50 y p65. Sin embargo, el tratamiento con DDB (20-100 mg/kg) 2 h antes del tratamiento con LPS bloqueó la translocación del complejo NF-\kappaB dentro del núcleo y su actividad. Estos resultados demuestran que DDB es capaz de inhibir la activación de NF-\kappaB inducible por LPS en el hígado de rata.

La estimulación de células Raw264.7 con 1 \mug/kg de LPS provocó un aumento en la actividad de unión del ADN de NF-\kappaB después de 30 min a 1 h. DDB a las concentraciones de 0,1, 0,3 y 1 mM inhibió la actividad de NF-\kappaB de una manera dependiente de la concentración. Estos resultados fueron consistentes con los obtenidos en los hígados de ratas tratadas con DDB (Tabla 4).

TABLA 4 Efecto de DDB sobre la Activación de NF-\kappaB

Grupo	LPS	LPS +	LPS +	LPS +	LPS +	LPS +	LPS +
	1 \mug/kg o	DDB	DDB	DDB	DDB	DDB	DDB
	1 \mug/ml	20 mg/kg	50 mg/kg	100 mg/kg	0,1 mM	0,3 mM	1,0 mM
% de inhibición
de la activación	0	42	63	73	33	35	65
de NF-\kappaB

Inhibición de la degradación de I-\kappaB\alpha

La translocación de NF-\kappaB al núcleo fue precedida por la fosforilación y degradación proteolítica de la subunidad I-\kappaB\alpha. Este ensayo se realizó para determinar si el efecto de DDB sobre la activación de NF-\kappaB está asociado con la inhibición la degradación de I-\kappaB\alpha. El nivel de la proteína I-\kappaB\alpha se redujo 30 min después del tratamiento de ratas con LPS (1 \mug/kg). En contraste, el tratamiento con DDB 2 h antes del tratamiento con LPS atenuó la disminución en la proteína I-\kappaB\alpha por LPS. También con células RAW264.7, DDB inhibió la degradación de la proteína I-\kappaB\alpha de una manera dependiente de la concentración a las concentraciones de 0,3 a 1 mM. Estos resultados demuestran que DDB inhibe la degradación de I-\kappaB\alpha y la activación resultante de NF-\kappaB (Tabla 5).

TABLA 5 Efecto de DDB sobre la Degradación de I-\kappaB\alpha

Grupo	LPS	LPS + DDB	LPS + DDB	LPS + DDB	LPS + DDB
	1 \mug/kg	100 mg/kg	0,1 mM	0,3 mM	1,0 mM
	o 1 \mug/ml
% de inhibición
de la degradación	0	67	22	34	65
de I-\kappaB\alpha

Ejemplo de Ensayo 6

Mecanismo anti-inflamatorio de DDB (Inhibición de la producción de TNF-\alpha y de la expresión de ARNm)

TNF-\alpha es el principal mediador de las respuestas a LPS y está implicado en procedimientos inflamatorios. Se determinó por ELISA si la cantidad de TNF-\alpha liberado a la sangre disminuye cuando la actividad de NF-\kappaB fue inhibida por DDB. Una dosis única de tratamiento con LPS (1 \muig/kg, i.v.) aumentó el nivel de TNF-\alpha de 35 a 5160 pg por ml de plasma 2 h después de la administración. El tratamiento con DDB a una dosis de 20, 50 o 100 mg/kg evitó la elevación del nivel de TNF-\alpha en plasma por LPS, dando como resultado 1350, 1230 o 690 pg por ml de plasma, respectivamente. Con las células RAW264.7, DDB disminuyó la producción de TNF-\alpha por LPS. Estos resultados demuestran que DDB inhibió la expresión de TNF-\alpha en macrófagos y en el hígado (Tabla 6).

TABLA 6 Efecto de DDB sobre la Producción de TNF-\alpha en Plasma

Grupo	LPS	LPS + DDB	LPS + DDB	LPS + DDB	LPS + DDB
	1 \mug/kg	20 mg/kg	50 mg/kg	100 mg/kg	0,1 mM
	o 1 \mug/ml
% de inhibición
de la activación	0	74	76	87	65
de NF-\kappaB

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Ejemplo de Ensayo 7

Efecto anti-fibrótico de la combinación oltipraz/DDB (1)

Se evaluó la actividad anti-fibrótica de la combinación oltipraz/DDB cambiando la proporción de componentes de la combinación. Para evaluar el efecto de la combinación de acuerdo con la proporción de componentes, el programa de dosificación de DMN se modificó parcialmente. Es decir, mientras se administró DMN a una rata 12 veces en total en dosificaciones de 10 \mul/kg por administración durante un periodo de 4 semanas, 3 veces por semana en los ejemplos de ensayo 1 y 2, para evaluar el efecto de la combinación de acuerdo con la proporción de componentes, se usó un modelo animal con lesión de hígado reducida en el que se administró DMN a una rata 9 veces en total en dosificaciones de 10 \mul/kg por administración durante un periodo de 3 semanas, 3 veces por semana, y después no se administró durante una semana en el ejemplo de ensayo.

Una semana después de administrar DMN durante 3 semanas, se encontraron puntuaciones de fibrosis de 2,9 y a Knodell de 11,7 en los animales. Por lo tanto, se encontró una reducción de fibrosis del hígado en los animales cuando se comparó con animales a los que se había administrado DMN durante un periodo de 4 semanas que tenían una puntuación de fibrosis de 3,7 y una puntuación de Knodell de 16,1.

Una semana después de administrar DMN durante un periodo de 3 semanas, 3 veces por semana, la actividad de ALT y AST en el plasma de los animales aumentó aproximadamente 4 veces cuando se comparó con aquellos del grupo de control.

En los animales en los que se administraron oltipraz y DDB con una proporción de dosificación de 25:5, 15:5 y 5:25 mg/kg durante un periodo de 3 semanas (3 veces por semana) un día después de cada administración de DMN, los aumentos en las actividades de ALT y AST en el plasma de los animales se inhibieron significativamente cuando se compararon con aquellos de los animales a los que sólo se administró DMN. Comparando las eficacias entre las proporciones de componentes de las combinaciones, aunque el grupo de animales al que se administraron oltipraz y DDB con una proporción de dosificación de 15:15 mg/kg mostró también una inhibición significativa de las actividades de ALT y AST en plasma, el grado de inhibición fue menor que el de los animales a los que se administraron oltipraz y DDB con una proporción de dosificación de 25:5 mg/kg (Tabla 7).

La actividad de \gamma-GT y el contenido de bilirrubina en plasma se usa como indicador representativo de la funcionalidad hepática. En ratas en las que se administraron oltipraz y DDB con una proporción de dosificación de 25:5, 15:5 y 5:25 mg/kg durante un periodo de 3 semanas, el aumento del contenido de bilirrubina inducido por DMN se inhibió en un grado estadísticamente significativo. Similar a los resultados de los valores de ALT y AST, los aumentos de bilirrubina se inhibieron mejor en los animales en los que se administraron oltipraz y DDB con la proporción de dosificación de 25:5 mg/kg entre los grupos de animales a los que se administraron oltipraz y DDB.

El contenido de proteína total y el nivel de albúmina en sangre son indicadores de la síntesis de proteína en tejido hepático. Cuando se desarrolla la cirrosis hepática, contenido de proteína total en sangre generalmente disminuye. Una semana después de administrar DMN durante un periodo de 3 semanas, el contenido de proteína total disminuyó significativamente en animales tratados, aunque el contenido de proteína total volvió a la normalidad los niveles del grupo de control en los grupos de animales a los que se administraron oltipraz y DDB con una proporción de dosificación de 25:5 y 15:5 mg/kg (Tabla 7).

Estos resultados sugieren que entre las proporciones de componentes de oltipraz y DDB usadas en el ejemplo de ensayo, el grupo de animales al que se administraron 25:5 mg/kg de oltipraz y DDB mostró el mayor efecto inhibidor contra la fibrosis hepática inducida por DMN. También, puede observarse que dicho efecto en el grupo de animales al que se administró oltipraz (25 mg/kg)/DDB(5 mg/kg) es igual o mayor que el del fármaco que se observó en el animal al que se administraron 50 mg/kg de oltipraz solo en ejemplo de ensayo 1. De hecho, el porcentaje de inhibición de ALT aumentado por DMN fue del 40% en el grupo de animales en el que se administraron 50 mg/kg de oltipraz solo, mientras que el porcentaje de inhibición de la fibrosis hepática fue del 43% cuando se administraron 25:5 mg/kg de oltipraz y DDB. En el caso de otros indicadores, se obtuvieron resultados similares.

TABLA 7 Valor de ALT, AST, Bilirrubina, Albúmina y Contenido de Proteína Total

2

Cada valor está representado por la media \pm la desviación típica. El número de animales usado fue de 8 a 10. La significancia de cada grupo se determina mediante el ensayo de Newman-Keuls de análisis múltiple. Los marcadores de significancia son: * = p < 0,05 comparado con el control, ^{#} = p < 0,05 comparado con el grupo tratado con DMN.

Ejemplo de Ensayo 8

Efecto anti-fibrótico de oltipraz/DDB (2)

Se observó el efecto patológico sobre el tejido de diversas combinaciones de oltipraz/DDB sobre la fibrosis hepática inducida por DMN en un modelo de ensayo animal. No se observó fibrosis hepática en ratas normales (Fig. 2a y 2b). Se observó fibrosis clara en el tejido hepático en ratas una semana después de administrar DMN durante un periodo de 3 semanas, 3 veces por semana (Fig. 3a y 3b). Cuando se administraron oltipraz y DDB con una proporción de dosificación de 25:5 y 15:15 mg/kg durante un periodo de 3 semanas (3 veces por semana) un día después de la administración de DMN, la fibrosis en el tejido hepático se redujo significativamente cuando se comparó con la administración de DMN solo. Especialmente, el grupo de animales en el que se administraron oltipraz y DDB con una proporción de dosificación de 25:5 mg/kg (Fig. 4a y 4b) mostró una mayor eficacia del fármaco que el grupo de animales en el que se administraron oltipraz y DDB con una proporción de dosificación de 15:15 mg/kg (Fig. 5a y 5b) y 5:25 mg/kg (Fig. 6a y 6b), e inhibió fuertemente el progreso de la fibrosis hepática.

La necrosis y fibrosis del tejido hepático se determinaron patológicamente usando indicadores patológicos para la acumulación de colágeno, es decir, tinción tricrómica de Masson. El grado de fibrosis hepática se determinó evaluando el valor de fibrosis valor y la puntuación de Knodell, que muestran grados de lesión en el hígado y fibrosis.

TABLA 8 Efecto de Inhibición de la Combinación Oltipraz/DDB sobre Fibrosis de Tejido Hepático

Grupo	Valores de Fibrosis	Valores Knodell
Control	0	0
DMN	2,9 \pm 0,9	11,7 \pm 1,8**
DMN + Oltipraz 25 : DDB 5 mg/kg	0,3 \pm 0,5**	2,0 \pm 1,5**
DMN + Oltipraz 15 : DDB 15 mg/kg	0,3 \pm 0,5**	4,0 \pm 1,2**
DMN + Oltipraz 5 : DDB 25 mg/kg	1,2 \pm 0,6**	6,0 \pm 1,3**

Cada valor está representado por la media \pm la desviación típica y el número de animales usado fue de 8 a 10. La significancia de cada grupo se determina mediante el ensayo de Newman-Keuls de análisis múltiple. Los marcadores de significancia son: ** = p < 0,01 comparado con el grupo tratado con DMN. El grado de fibrosis se clasificó como 0 = Normal,1 = Presencia de tejido fibroso débil, 2 = Presencia moderada de tejido fibroso, 3 = Presencia obvia de tejido fibroso, 4 = Evidencia de fibrosis grave. La suma de valores del puente periportal (Greatest = 10), pérdida de célula intralobular (Greatest = 4), inflamación portal (Greatest = 4), y fibrosis (Greatest = 4) produce la puntuación de Knodell.

Ejemplo de Ensayo 9

Efecto de las combinaciones de oltipraz/DDB sobre la expresión de TGF-\beta

Como se ha indicado anteriormente, TGF-\beta es una citoquina que provoca fibrosis hepática y se sabe que está relacionada con el desarrollo de la fibrosis hepática. La Tabla 9 muestra cambios en presencia de ARNm de TGF-\beta por procedimientos RT-PCR.

El grupo al que se administró DMN mostró un aumento significativo en la producción de TGF-\beta comparado con el grupo de control. En animales a los que se administró con con proporciones alteradas de la combinación oltipraz/DDB, los resultados cuantitativos de RT-PCR respecto a la expresión de TGF-\beta muestra que las administraciones de 30 mg/kg de oltipraz y co-administraciones de 25:5 mg/kg de oltipraz y DDB inhibieron completamente la expresión de TGF-\beta. Sin embargo, según aumenta la proporción de DDB a oltipraz, la inhibición de la expresión de TGF-\beta se pierde progresivamente. En el grupo de animales a los que solo se administró DDB, la expresión de TGF-\beta no se inhibió. Por lo tanto, se considera que la inhibición de la expresión de TGF-\beta está provocada por oltipraz. Por esta razón, la mejor proporción de combinación de oltipraz a DDB es 5:1 (Tabla 9).

TABLA 9 Inhibición Relativa de la expresión de TGF-\beta por la combinación oltipraz/DDB

	DMN 10	DMN +	DMN +	DMN +	DMN +	DMN +
	\mug/kg	oltipraz	DDB	oltipraz 25	oltipraz 15	oltipraz 5
		30 mg/kg	30 mg/kg	+ DDB 5 mg/kg	+ DDB 15 mg/kg	+ DDB 25 mg/kg
% de Inhibición
de la expresión	0	65	0	65	30	0
de ARNm de
TGF-\beta

Ejemplos de trabajo

Ejemplo de Trabajo 1

Oltipraz	25 mg
DDB	1 mg
Lactosa	50 mg
Almidón	10 mg
Estearato de magnesio	Cantidad apropiada

Los componentes anteriores se mezclan y se prepara un comprimido mediante un procedimiento convencional de preparación de comprimidos.

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Ejemplo de Trabajo 2

Oltipraz	50 mg
DDB	1 mg
Lactosa	50 mg
Almidón	10 mg
Estearato de magnesio	Cantidad apropiada

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Ejemplo de Trabajo 3

Oltipraz	5 mg
DDB	10 mg
Lactosa	50 mg
Almidón	10 mg
Estearato de magnesio	Cantidad apropiada

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Ejemplo de Trabajo 4

Oltipraz	25 mg
DDB	5 mg
Lactosa	30 mg
Almidón	28 mg
Talco	2 mg
Estearato de magnesio	Cantidad apropiada

Los componentes anteriores se mezclan y se prepara una preparación de cápsula llenando una cápsula de gelatina dura con la mezcla por un procedimiento convencional de preparación de cápsulas.

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Ejemplo de Trabajo 5

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Ejemplo de Trabajo 6

Oltipraz	1 mg
DDB	50 mg
Lactosa	30 mg
Almidón	28 mg
Talco	2 mg
Estearato de magnesio	Cantidad apropiada

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Ejemplo de Trabajo 7

Oltipraz	5 mg
DDB	25 mg
Lactosa	30 mg
Almidón	28 mg
Talco	2 mg
Estearato de magnesio	Cantidad apropiada

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Ejemplo de Trabajo 8

Oltipraz	250 mg
DDB	50 mg
Azúcar isomerizada	10 g
Azúcar	30 mg
CMC sódico	100 mg
Aroma de limón	Cantidad apropiada
(añadir agua purificada hasta un volumen total de 100 ml)

Se prepara una suspensión con los componentes anteriores de acuerdo con procedimientos convencionales de producción de suspensión. Se llena una botella marrón de 100 ml con la suspensión y se esteriliza.

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Ejemplo de Trabajo 9

Oltipraz	50 mg
DDB	250 mg
Azúcar isomerizada	20 g
Azúcar	20 mg
Alginato sódico	100 mg
Aroma de naranja	Cantidad apropiada
(añadir agua purificada hasta un volumen total de 100 ml)

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Ejemplo de Trabajo 10

Oltipraz	25 mg
DDB	5 mg
Lactosa	30 mg
Almidón	20 mg
Estearato de magnesio	Cantidad apropiada

Los componentes anteriores se mezclan y se llenan en un sobre recubierto con polietileno y se sella para preparar un polvo.

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Ejemplo de Trabajo 11

1 cápsula blanda que contiene

Oltipraz	25 mg
DDB	5 mg
Polietilenglicol 400	400 mg
Glicerina concentrada	55 mg
Agua purificada	35 mg

Se mezcla polietilenglicol con glicerina concentrada, y después se añade agua purificada. Manteniendo la mezcla a 60ºC, se añade oltipraz a la mezcla. La mezcla se agita a aproximadamente 1.500 rpm. Después de que la mezcla se haya combinado uniformemente, la mezcla se enfría a temperatura ambiente mientras se agita lentamente. Las burbujas de aire se retiran con una bomba de vacío, dejando los contenidos de la cápsula blanda.

La membrana de la cápsula blanda se fabrica de acuerdo con procedimiento de preparación convencionales usando una fórmula gelatina blanda-plastificante muy conocida que contiene gelatina 132 mg, glicerina concentrada 52 mg, solución de disorbitol al 70% 6 mg por cápsula, una cantidad apropiada de agente aromatizante de etil vanillina, y cera de carnauba como agente de recubrimiento.

Aplicabilidad industrial

Las formulaciones de oltipraz/DDB de acuerdo con la presente invención presentan sorprendentemente un buen efecto sobre el tratamiento y prevención de la fibrosis y cirrosis hepática. Por lo tanto, pueden usarse clínicamente para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y prevención de la fibrosis y cirrosis hepática.

Claims

1. Una composición farmacéutica para prevenir y tratar el progreso de la fibrosis y cirrosis hepática, que comprende 5-(2-pirazinil)-4-metil-1,2-ditiol-3-tiona (oltipraz) y dimetil-4,4'-dimetoxi-5,6,5',6'-dimetilen dioxibifenil-2,2'-dicarboxilato (DDB).

2. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la composición se formula como una forma seleccionada entre un grupo compuesto por una cápsula, un comprimido, una cápsula blanda, una suspensión, un jarabe, una inyección, y un polvo.

3. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la composición es para administración oral.

4. Una composición farmacéutica de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3, comprendiendo la composición oltipraz y DDB en una proporción en peso de 50-1:1-50.

5. Un uso de la composición farmacéutica de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4 para la fabicación de una medicina para prevenir y tratar el progreso de la fibrosis y cirrosis hepática.