JP4226246B2 - 肝線維症および肝硬変の処置および予防のための薬剤組成物 - Google Patents
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Description
【０００１】
発明の分野
本発明は、肝線維症(liver fibrosis)および肝硬変の処置及び予防を目的とする薬剤組成物に関するものである。特に、本発明は、５−（２−ピラジニル）−４−メチル−１，２−ジチオール−３−チオン[5-(2-pyrazinyl)-4-methyl-1,2-dithiol-3-thione]（オルティプラズ(oltipraz)）及びジメチル−４，４’−ジメトキシ−５，６，５’，６’−ジメチレンジオキシビフェニル−２，２’−ジカルボキシレート(dimethyl-4,4'-dimethoxy-5,6,5',6'-dimethylene dioxybiphenyl-2,2'-dicarboxylate)（ＤＤＢ）を主要な活性成分として含む、肝線維症および肝硬変の処置及び予防を目的とする薬剤組成物に関するものである。
【０００２】
発明の背景
肝臓は、非生体物質の代謝及び内因性物質の代謝において鍵となる役割を果たし、調和する酵素反応及びエネルギー代謝を有する重要な器官である。大韓民国における多くの慢性の病気のうち、肝炎、肝硬変及び肝癌が心臓血管系の病気の次に最も普及した及び生命を脅かす病気である。大韓民国は先進国と比べた場合比較的大きな酒飲み集団であるので、および飲みすぎから生じる肝臓障害はかなり高いので、肝臓病を処置するのには多くの注意が払われてきた。ウィルス感染またはアルコール摂取から生じる慢性の肝臓損傷は、しばしば、肝硬変または肝癌を引き起こす。肝組織の生理学的な特徴及び重要性を考慮すると、および肝臓病を処置する及び予防する重要性の観点から、肝臓損傷に対する治療のための及び予防のための薬剤の根本的な開発に対する要求が高い。
【０００３】
幾つかの合成化合物及びガレヌス製剤などの、様々な物質がインビトロ及びインビボ双方において肝保護機能を示す。シリマリン(silymarin)またはベタインはサイトカイン阻害の作用メカニズムを有しかつグルタチオンのレベルを増加する保護作用を有するものの、その有効性の低さから、治療効果は予想し難い。肝臓病に対する適当な治療剤が現在使用できないので、該薬剤は臨床試験でしばしば使用される。その適用が肝線維症の処置である、マロチレート及びその誘導体は毒性のある化学物質から肝臓を保護し、可能性のある作用メカニズムはフェーズＩＩ共役酵素(phase II conjugating enzyme)の誘導及びシトクロムＰ４５０の阻害を含む。しかしながら、上記化合物は、幾つかのシトクロムＰ４５０を非選択的に阻害し、予防効果のみを示す。
【０００４】
十字形植物で天然に生じる硫黄含有ジチオールチオンの幾つかの置換体が肝臓保護効果を有することが知られている。これらのうち、オルティプラズは下記式を有する住血吸虫症に対する治療剤として使用された。
【０００５】
【化１】
【０００６】
オルティプラズは、細胞のチオール含量を増加し、グルタチオン（ＧＳＨ）プールを維持し、組織を求電子性分子から解毒するのに応答できる酵素の発現を誘導する。下記酵素の活性がオルティプラズによって向上する：ＮＡＤ（Ｐ）Ｈキノンレダクターゼ、ミクロソームのエポキシドヒドロラーゼ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）及びＵＤＰ−ＧＴ。特に、ＧＳＴは、肝臓を四塩化炭素またはアセトアミノフェン等の毒性のある化学物質から保護する(Ansher SS, Dolan P, and Bueding E. Chemoprotective effects of two dithiolthiones and of butylhydroxyanisole against carbon tetrachloride and acetaminophene toxicity, 1983 Hepatology 3, 932-935)。
【０００７】
さらに、オルティプラズは、ベンゾ［ａ］ピラン、ＮＤＥＡ、及びウラシルマスタードによって引き起こされる化学発癌、さらにはアフラトキシンＢ１で誘導される肝腫瘍形成及びアゾキシメタンで誘導される結腸発癌を阻害する(Bolton MG, Munoz A, Jacobson LP, Groopman JD, Maxuitenko YY, Roebuck BD, and Kensler TW. Transient intervention with oltipraz protects against aflatoxin-induced hepatic tumorigenesis. 1993, Cancer Res. 53, 3499-3504)。
【０００８】
オルティプラズによる既知の発癌阻害メカニズムは、以下のとおりである。第一に、オルティプラズが、組織中の、抗酸化剤、還元ＧＳＨのレベルを増加する。第二に、これはシトクロムＰ４５０等のフェーズＩ酵素(phase I enzyme)を阻害することによって発癌性物質の生理活性化を阻害する。第三に、これは、ＧＳＴ及びＵＤＰ−ＧＴを含むフェーズＩＩ解毒酵素(phase II detoxifying enzyme)を誘導することによって発癌性物質の解毒を促進する。第四に、オルティプラズはインビトロでヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）タイプＩの複製を阻害する。第五に、これは、チオールレベルを増加することによって細胞における反応性中間体を除去し、ＤＮＡの修復を促進する。オルティプラズは、ほとんどの組織でＧＳＨレベルを増加し、放射線によって生じる遊離ラジカルまたは非生体物質を除去することが報告されている。また、オルティプラズは細胞のホメオスタシスを維持することを助けることによって放射線に対する保護剤として機能することも知られている。
【０００９】
上記説明に関して、より詳細な情報を以下に提示するであろう。癌は、体細胞におけるＤＮＡの損傷によって引き起こされると考えられる制御されない細胞の成長及び分化である(Cancer Biology, 3rd ed. Raymond W. Ruddon, pp. 61-95, 497-507, Oxford Press)。化学物質の抗癌効果は、主として、その抗突然変異誘発効果または癌細胞への形質転換若しくは癌細胞の増殖を抑制する活性による。オルティプラズは、癌の化学的予防剤として研究されてきた(Ansher et al., 1983; Bolton et al., 1993)。オルティプラズの癌の化学的予防効果は、シトクロムＰ４５０ ３Ａの阻害とのみでなく、フェーズＩＩ解毒酵素(phase II detoxifying enzyme)の誘導とも関連する。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の発現は細胞及び動物でオルティプラズによって向上し(Clapper et al., 1994; Davidson et al., 1990)、これは毒で誘導される組織の障害及び発癌の抑制と関連する(Kensler et al., 1987; Maxuitenko et al., 1998)。オルティプラズは、放射線によって引き起こされる組織の損傷に対して肝臓を保護し(Kim et al., 1997)、従来の研究で知られているＧＳＴの誘導は細胞の適応応答を意味する。オルティプラズはまた、毒に対して肝臓を保護する(Ansher et al., 1983)。オルティプラズによるアフラトキシンＢ１で誘導される発癌の阻害は、発癌性物質のシトクロムＰ４５０ ３Ａで触媒される代謝活性化の介入によって仲介される。近年の臨床試験によると、オルティプラズは、肝癌の危険性の高い人々のアフラトキシンＢ１の血漿レベルを下げるのに有効であった。動物におけるアフラトキシンＢ１で誘導される発癌はまた、オルティプラズの適用によって抑制された。
【００１０】
オルティプラズは、ＨＢＶ ＤＮＡを含むプラスミドで感染させた、２．２．１５細胞でのＢ型肝炎ウィルス（ＨＩＶ）の複製を阻害することが報告された。したがって、オルティプラズは、Ｂ型肝炎ウィルス遺伝子の転写を阻害し、ｐ５３タンパク質の発現を上昇し(Chi et al., 1998)、さらに、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）の複製を阻害する(Prochaska et al., 1995)。
【００１１】
肝臓の発癌に対するオルティプラズの化学的予防効果に関する臨床試験が中国で行なわれた。その結果から、オルティプラズは肝臓の発癌に対して弱い保護効果を有することが示された。また、オルティプラズは、少なくとも適度に、毒で誘導される肝毒性に対して肝臓を保護することが知られている。加えて、オルティプラズの安全性はラット及びイヌで行なわれた毒性研究で証明されている(Fund. Appl. Toxicol. 1997 Jan; 35(l):9-21)。
【００１２】
ＤＤＢ（ジメチル−４，４’−ジメトキシ−５，６，５’，６’−ジメチレンジオキシビフェニル−２，２’−ジカルボキシレート）、シザンドラエ(Shizandrae)由来の成分は、大韓民国を含む、東アジアで臨床的に使用される肝炎の処置を目的とする治療剤である。ＤＤＢは、四塩化炭素で、ガラクトサミンで、チオアセトアミドでまたはブレドニゾロンで誘導される障害に対して肝組織を保護し、抗体の生産を促進する。肝炎の患者に対する臨床試験で有効であることが知られているため、ＤＤＢは臨床セッティングで広範に使用される。本発明者らは、ＤＤＢの薬理効果がＮＦ−κＢの活性化及びＴＮＦ−αの生産の阻害と関連することを報告した。さらに、ＤＤＢは薬剤を代謝する酵素の発現に影響を与えないことが見出された。ＮＦ−κＢは炎症反応を仲介する転写因子として知られているので、ＮＦ−κＢの阻害剤は全身性の炎症反応を阻害できるであろう。
【００１３】
肝線維症は、肝炎等の慢性の肝臓病における損傷を受けた肝組織が正常組織では修復されないが、インビボでの適応応答の一部としてコラーゲン等の線維組織に変換される予備病理学的な状態(prepathological state)を意味する。肝線維症は組織の損傷に応答したインビボでの修復プロセスの結果であるが、損傷を受けた肝組織が線維組織に置き換わって、もはや正常に機能できなくなる（例えば、インビボ代謝または胆汁の製造）。連続した及び再発した肝線維症は肝硬変を引き起こし、その結果死に至らせるため、肝線維症を処置する新規な薬剤を開発することが重要である。しかしながら、肝臓の線維形成の正確なメカニズムは不明であるため、適当な治療剤はいまだ開発されていない。
【００１４】
近年の研究から、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ−β）、肝臓のクッパー及び伊東細胞から分泌されるサイトカインは、肝線維症における重要なメディエイターであることが明らかになった。加えて、ＴＧＦ−β抗体、アンチセンスＲＮＡ、及びＴＧＦ−βレセプターへの修飾を使用することによるＴＧＦ−β活性の遮断は肝線維症を有意に抑制することが報告された。しかしながら、当該研究の効果は実験レベルでしか確認されていない。肝線維症及び肝硬変に対する臨床的に価値のある薬剤は報告されていない。
【００１５】
発明の目的
本発明の目的は、肝線維症および肝硬変の処置有効性を最大限にし、予防剤としても使用できる薬剤組成物を提供することである。
【００１６】
本発明の他の目的は、肝線維症および肝硬変の処置及び予防のための薬剤の調製に使用される薬剤組成物の使用を提供することである。
【００１７】
本発明のさらなる他の目的は、哺乳動物に薬剤組成物を投与することを有する肝線維症および肝硬変の処置または予防方法を提供することである。
【００１８】
発明の要約
本発明は、５−（２−ピラジニル）−４−メチル−１，２−ジチオール−３−チオン（オルティプラズ(oltipraz)）及びジメチル−４，４’−ジメトキシ−５，６，５’，６’−ジメチレンジオキシビフェニル−２，２’−ジカルボキシレート（ＤＤＢ）を主成分として含む、肝線維症および肝硬変の処置および予防のための薬剤組成物を提供するものである。当該組成物のオルティプラズ及びＤＤＢの割合は、好ましくは２５：０〜２５、より好ましくは５：０〜５、および最も好ましくは５：１である。本発明によるオルティプラズ／ＤＤＢ製剤は、驚くべきことに、肝線維症及び肝硬変の処置及び予防に良好な効果を発揮し、ヒトの体内で低い毒性を有する安全な薬剤である。
【００１９】
図面の詳細な説明
図１ａは、ＤＭＮをラットに投与した際の肝組織でのＴＧＦ−β１ ｍＲＮＡの発現に関するオルティプラズの阻害効果を示す写真である。
【００２０】
図２ａは、正常な動物の肝組織の写真（ヘマトキシリン−エオジン染色(H&E staining)）である。
【００２１】
図２ｂは、正常な動物の肝組織の写真（ヘマトキシリン−エオジン染色）である。
【００２２】
図３ａは、ＤＭＮが投与された群の肝組織の写真（ヘマトキシリン−エオジン染色）である。
【００２３】
図３ｂは、ＤＭＮが投与された群の肝組織の写真（マッソンの三重染色）である。
【００２４】
図４ａは、ＤＭＮ及びオルティプラズ（２５ｍｇ／ｋｇ）／ＤＤＢ（５ｍｇ／ｋｇ）が一緒に投与された群の肝組織の写真（ヘマトキシリン−エオジン染色）である。
【００２５】
図４ｂは、ＤＭＮ及びオルティプラズ（２５ｍｇ／ｋｇ）／ＤＤＢ（５ｍｇ／ｋｇ）が一緒に投与された群の肝組織の写真（マッソンの三重染色）である。
【００２６】
図５ａは、ＤＭＮ及びオルティプラズ（１５ｍｇ／ｋｇ）／ＤＤＢ（１５ｍｇ／ｋｇ）が一緒に投与された群の肝組織の写真（ヘマトキシリン−エオジン染色）である。
【００２７】
図５ｂは、ＤＭＮ及びオルティプラズ（１５ｍｇ／ｋｇ）／ＤＤＢ（１５ｍｇ／ｋｇ）が一緒に投与された群の肝組織の写真（マッソンの三重染色）である。
【００２８】
図６ａは、ＤＭＮ及びオルティプラズ（５ｍｇ／ｋｇ）／ＤＤＢ（２５ｍｇ／ｋｇ）が一緒に投与された群の肝組織の写真（ヘマトキシリン−エオジン染色）である。
【００２９】
図６ｂは、ＤＭＮ及びオルティプラズ（５ｍｇ／ｋｇ）／ＤＤＢ（２５ｍｇ／ｋｇ）が一緒に投与された群の肝組織の写真（マッソンの三重染色）である。
【００３０】
本発明の詳細な説明
本発明者らは、オルティプラズが肝線維症及び肝硬変を処置及び予防する予想できない驚くべき効果を有するという新規な発見をした。さらに、本発明者らは、オルティプラズの処置及び予防の有効性がＤＤＢと組み合わせた際に有意に向上することを発見した。
【００３１】
線維症、肝硬変の初期段階は、重篤な損傷が様々な因子によって肝臓になされる際に起こる。肝硬変は、部分的に発癌に関連し、被害者での肝癌の危険性を顕著に増加する。しかしながら、肝硬変の病理学的なメカニズムは、肝癌とは明らかに異なる。すなわち、肝線維症は肝組織に慢性で重篤な損傷がある場合に起こる。肝臓の障害の原因因子としては、ウィルス、寄生虫、アルコールの消費、化学物質、及び医薬が挙げられる。肝線維症は、クッパー細胞、星状細胞等の、肝組織での非実質細胞の活性化によって引き起こされる細胞外マトリックス（例えば、タイプＩ、ＩＩＩ及びＩＶコラーゲン）の過剰な生産により生じる。より詳細には、線維症は、筋線維芽細胞への星状細胞の活性化及び次のトランスフォーメーションから生じる。次に、活性化された星状細胞は、過剰な細胞外マトリックスを生産する。さらに、線維症及び肝硬変は、ウィルス性肝炎及び肝癌とは病理学的な現象として明らかに異なる。ゆえに、それらのそれぞれの処置及び予防もまた異なる。しかしながら、現在、肝硬変に関する臨床上価値のある薬剤は存在しない。
【００３２】
本発明は、肝癌の予防に有効であることが知られている、オルティプラズが、肝癌とはその病理学的メカニズムが完全に異なる、肝線維症及び肝硬変に対しても有効であるという発見に基づくものである。さらに、本発明は、肝線維症及び肝硬変の処置及び予防に予想を超える有効性を提供する、オルティプラズの、従来肝炎に対してのみ有効であることが知られている、ＤＤＢとの併用を特徴とするものである。これらの事実を、下記実験で証明する。
【００３３】
オルティプラズまたはオルティプラズ／ＤＤＢは、線維症の評点及びクノーデルの評点(Knodell score)、ジメチルニトロソアミン（ＤＭＮ）で加速された線維症の指標を減少する。これは、典型的な組織顕微鏡検査結果と一致する。加えて、投与時に、オルティプラズまたはオルティプラズ／ＤＤＢは、ＡＬＴ、ＡＳＴ、ビリルビン、及びγ−グルタミルトランスペプチダーゼ（γ−ＧＴ）などの肝毒性の指標を有意に阻害する。これから、オルティプラズまたはオルティプラズ／ＤＤＢは、その応答プロセスを遅延することによって線維症を緩和するかもしれないことが示される。オルティプラズまたはオルティプラズ／ＤＤＢによる線維症の阻害メカニズムは、ＴＧＦ−βの発現の阻害を思い起こさせる。定量的なＲＴ−ＰＣＲ結果により、オルティプラズまたはオルティプラズ／ＤＤＢは、ジメチルニトロソアミンによって加速されたＴＧＦ−β ｍＲＮＡの発現を完全に阻害する。これは、オルティプラズが肝線維症及び肝硬変の発症及び悪化を阻害できる薬剤であるという証拠である。オルティプラズは、肝臓解毒酵素ＧＳＴ及びｍＥＨを誘導し、ＧＳＨを増加し、さらにラジカル共役活性を発揮する；これに対して、ＤＤＢは、解毒酵素を誘導しない。上記を考慮すると、オルティプラズ及びＤＤＢは補足的な薬理効果を有すると考えられる。より詳しくは、ヒト肝臓ミクロソーム中でのＤＤＢによるＣＹＰ３Ａ代謝活性の阻害は次にオルティプラズの代謝を阻害すると考えられるので、低投与量のオルティプラズでも、有効な肝臓の保護を提供し、薬剤の有効期間を伸ばすかもしれない。
【００３４】
本発明において、肝線維症に関するオルティプラズ／ＤＤＢの併用の治療効果は、ＤＭＮが投与されたラットにおいて様々な割合で観察された。試験を、オルティプラズ：ＤＤＢの重量比を２５：５、１５：１５及び５：２５（ｍｇ／ｋｇ）で行なった。その結果、ＤＭＮを投与すると（観察は３週間投与してから１週間に行なった）、ＡＬＴ、ＡＳＴ、ビリルビン、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（γ−ＧＴ）、線維症の評点及びクノーデルの評点(Knodell score)は、コントロール群のものに比べて優位に増加した。これに対して、オルティプラズ／ＤＤＢを投与すると、これらの値は減少した。オルティプラズ（２５ｍｇ／ｋｇ）／ＤＤＢ（５ｍｇ／ｋｇ）が、最も高い肝線維症の阻害効果を示した。これから、オルティプラズ及びＤＤＢは肝障害及び線維症を抑制するのに相乗作用を示すことが分かり、また、これらの最適な割合は５：１であることが示唆される。さらに、オルティプラズ／ＤＤＢの組み合わせの投与は、オルティプラズ（５０ｍｇ／ｋｇ）単独よりも、血中の生化学指数、即ち、肝線維症の評点及びクノーデルの評点を減少した。したがって、オルティプラズをＤＤＢと共に使用すると、胃腸管の不全、手や足の知覚異常などの、副作用を抑制でき、これは高いオルティプラズの投与量で得られると考えられる。オルティプラズは、ＴＧＦ−βの発現を防止し、抗酸化酵素の発現を増加し、ＧＳＨの増加を誘導すると同時に、ＤＤＢは、ＤＭＮによって誘導される炎症反応を阻害する。このメカニズムによって、オルティプラズ／ＤＤＢは、肝線維症の処置及び予防効果を最大にする。ゆえに、オルティプラズ／ＤＤＢは、肝臓保護について補足的な効果を利用する。さらに、オルティプラズ／ＤＤＢは、ほとんど副作用を示さないので、臨床で使用できる。
【００３５】
本発明の薬剤組成物は、個々に配合された薬剤を合わせることによって、または薬剤の混合物から構成される混合製剤を調製することによって使用されることが好ましい。本発明の薬剤組成物を実際に使用しようとする場合には、経口投与に適する単位服用形態(unit dosage form)が、適当な製薬分野における慣習に従って配合、投与される。これを達成するために、経口用製剤は、硬質または軟質カプセル、錠剤、粉末などを有する。経口用製剤は、薬理活性のある物質としてのオルティプラズ／ＤＤＢに加えて、一以上の薬理学的に活性のない公知の担体媒質を含んでもよい。例えば、経口用製剤は、添加剤としてデンプン、ラクトース、カルボキシメチルセルロース、カオリン、及び同様の賦形剤；水、ゼラチン、アルコール、グルコース、アラビアゴム、トラガカントゴム、及び同様の結合剤；デンプン、デキストリン、アルギン酸ナトリウム、及び同様の崩壊剤；タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、流動パラフィン、及び同様の潤滑剤を含んでもよい。溶解酸をさらに添加してもよい。
【００３６】
本発明の一日の投与量は、患者の肝障害の程度、肝炎の発症時期、年齢、健康状態、合併症などの様々な要因によって異なる。しかしながら、平均的な成人では、オルティプラズ／ＤＤＢ組成物は、一日の全投与量が５〜２００ｍｇ、より好ましくは２５〜５０ｍｇで一日に１回または２回、投与される。しかしながら、重篤な肝障害を有する患者ではまたは肝癌切除後に再発防止剤として使用する場合には、本発明は、上記薬剤組成物の概念から逸脱しても、また多くの投与量を使用してもよい。最も好ましくは、２５ｍｇのオルティプラズ及び５ｍｇのＤＤＢを含む１または２回の服用投与量を、一日に２回経口投与する。
【００３７】
本発明の薬剤組成物は、必要であれば、顕著な線維症阻害及び肝臓保護特性を有する、オルティプラズを、優れた炎症反応抑制効果を有する、ＤＤＢと共に補足してもよい。上記によって、肝線維症及び肝硬変の阻害が得られ、これは、毒性が低く、また、副作用がほとんどない。ゆえに、本発明は、肝線維症および肝硬変の処置及び予防に長期間安全に使用される。
【００３８】
本発明を、下記実施例を参照しながらより詳細に説明する。しかしながら、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３９】
試験例
試験例１：オルティプラズの抗線維症効果（１）
４週間にわたってジメチルニトロソアミン（ＤＭＮ）を常時投与したラットでは、血漿中のアラニンアミノトランスフェラーゼ及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼが４倍増加した。５０ｍｇ／ｋｇのオルティプラズで予め処置すると、血漿中のＡＬＴ及びＡＳＴ活性化の増加は５０％阻害された（表１）。
【００４０】
血漿中のγ−グルタミルトランスペプチダーゼ（γ−ＧＴ）活性及びビリルビン含量を、肝機能の指標として使用する。オルティプラズは、ＤＭＮ投与ラットにおいてγ−ＧＴの活性化の増加を７０％〜８０％阻害した。これに対して、ＤＭＮを投与すると、ビリルビン含量はコントロール群に比して８倍増加した。５０ｍｇ／ｋｇのオルティプラズ及びＤＭＮを同時に投与すると、血漿中のビリルビンの増加は６５％阻害された。
【００４１】
【表１】
【００４２】
各値は、平均値±標準偏差によって表わされる。使用された動物数は８〜１６の範囲であった。各群の有意性は、マルチプル分析(multiple analysis)のニューマン−コイルステスト(Newman-Keuls test)によって示された。有意性の印は以下のとおりである：＊＝コントロールに比してｐ＜０．０５、＃＝ＤＭＮ処置群に比してｐ＜０．０５である。
【００４３】
試験例２：オルティプラズの抗線維症効果（２）
ＤＭＮで誘導された肝線維症へのオルティプラズの組織病理学的効果を動物試験モデルで観察した。明らかな線維症が、週に３回、４週間にわたってＤＭＮを投与されたラットで観察された。オルティプラズ（４週間にわたって、週に３回、５〜５０ｍｇ／ｋｇの投与量で経口投与した）及びＤＭＮを同時に投与すると、肝組織での線維症は、ＤＭＮのみを投与したのに比べて抑制された。肝組織の壊死及び線維症を、肝組織病理指標、即ち、ヴァン・ギーソン染色及びマッソンの三重染色を用いて病理学的に決定した（表２）。
【００４４】
５０ｍｇ／ｋｇのオルティプラズ投与量が、有効にＤＭＮで誘導された線維症を緩和した（表２）。線維症の程度を、肝臓の損傷及び線維症の程度を示す、線維症及びクノーデルの評点を評価することによって決定した。ＤＭＮのみの群に比べて、ＤＭＮ＋オルティプラズの群はより低い線維症及びクノーデルの評点を示したことから、肝臓の損傷及び線維症の治療が示された。
【００４５】
【表２】
【００４６】
各値は、平均値±標準偏差によって表わされる。使用された動物数は８〜１６であった。各群の有意性は、マルチプル分析(multiple analysis)のニューマン−コイルステスト(Newman-Keuls test)によって決定される。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。線維症の程度 ０＝正常、１＝弱い線維症組織の存在、２＝線維症組織の適度な存在、３＝線維症組織の明らかな存在、４＝重篤な線維症の証拠。クノーデルの評点では、門脈周囲の架橋（最大＝１０）、小葉内の細胞の損失（最大＝４）、門脈の炎症（最大＝４）、及び線維症（最大＝４）の値の合計である。
【００４７】
試験例３：抗線維症におけるオルティプラズの薬理メカニズム
ＴＧＦ−β１は、組織の損傷時の線維症中の発現を上昇する基本的なサイトカインである。動物のＴＧＦ−β１ ｍＲＮＡの発現が、ＤＭＮのみの投与ならびにＤＭＮ及びオルティプラズの同時の投与中でＲＴ−ＰＣＲ分析方法で観察された。４週間にわたってＤＭＮを投与された動物では、不可逆的な過剰な線維形成がＴＧＦ−β１ ｍＲＮＡの発現の観察を防止した。ＴＧＦ−β１ ｍＲＮＡの発現は、ＤＭＮのみを投与した動物で観察された。ＤＭＮを投与してから１８時間後に、オルティプラズを投与した。次に、ＴＧＦ−β１ ｍＲＮＡの発現をそれから２４時間後に観察した。ＤＭＮを投与したラットでは、ＴＧＦ−β１ ｍＲＮＡが肝組織中で顕著に増加した。ＴＧＦ−β１ ｍＲＮＡのＤＭＮで誘導された発現は、１００ｍｇ／ｋｇのオルティプラズの投与によって完全に阻害された。ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの発現は、ＤＭＮのみの投与またはＤＭＮ及びオルティプラズの同時投与のいずれでも変化しなかった。したがって、オルティプラズは、ＴＧＦ−β１の発現を抑制する薬理メカニズムにより肝線維症を阻害することが示される（図１）。
【００４８】
試験例４：ＴＧＦ−β生産を阻害するオルティプラズの評価
試験を、ＲＡＷ２６４．７マクロファージ細胞を用いて行ない、オルティプラズが、マクロファージ中で過剰発現する、ＴＧＦ−βの生産を直接阻害するかどうかを観察し、また、関連する分子薬理メカニズムを評価した。オルティプラズを直接、ＴＧＦ−βの発現が増加した、ＲＡＷ２６４．７細胞に添加すると、オルティプラズが投与量に依存してＴＧＦ−βの発現を阻害することが見出された。これらの結果から、オルティプラズはＴＧＦ−βの生産を阻害することによって肝臓のクッパー細胞で抗線維症剤として機能するかもしれないことが示される。さらに、ＴＧＦ−βの発現の増加は、チロシンキナーゼの阻害剤である、ＥＧＴＡまたはゲニステインによって阻害される。この結果から、オルティプラズによるＴＧＦ−β生産の阻害は細胞内カルシウム調節及びタンパク質キナーゼ活性の変化の結果であるかもしれないことが示される。
【００４９】
【表３】
【００５０】
試験例５：ＤＤＢの抗炎症メカニズム（ＮＦ−κＢ活性化の阻害）
ＮＦ−κＢの活性化が炎症反応と関連することは知られている。ＤＤＢを投与する際の肝組織におけるＮＦ−κＢ活性を、ＤＤＢを投与しない場合と比較するために、下記試験を行なった。約１５０ｇ体重のＳＤオスラットを使用した。１群、７匹のラットを使用した。コントロール群（ベヒクルを投与）及び試験群（２０〜１００ｍｇ／ｋｇ／日のＤＤＢを投与）について、エンドトキシン（リポ多糖、ＬＰＳ）の処置によるＮＦ−κＢ活性を、電気泳動移動度シフトアッセイ(Electrophoresis Mobility Shift Assay)（ＥＭＳＡ）を用いることによって測定した。
【００５１】
ＬＰＳ処置（１μｇ／ｋｇ）により、ＮＦ−κＢ核転写ｐ５０及びｐ６５複合体のレベルが増加した。しかしながら、ＬＰＳ処置の２時間前にＤＤＢ処置（２０〜１００ｍｇ／ｋｇ）を行なうことにより、核へのＮＦ−κＢ複合体の転座及びその活性が遮断された。これらの結果から、ＤＤＢはラット肝臓でＬＰＳで誘導可能なＮＦ−κＢ活性化を阻害できることが示される。
【００５２】
Ｒａｗ２６４．７細胞を１μｇ／ｋｇのＬＰＳで刺激すると、３０分〜１時間後にＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性が増加した。０．１、０．３及び１ｍＭの濃度のＤＤＢが、濃度に依存してＮＦ−κＢ活性を阻害した。これらの結果は、ＤＤＢで処置されたラットの肝臓で得られた結果と一致した（表４）。
【００５３】
【表４】
【００５４】
Ｉ−κＢα分解の阻害
ＮＦ−κＢの核への転座を、Ｉ−κＢαサブユニットのリン酸化及びタンパク質分解によって先に行なった。この試験は、ＮＦ−κＢ活性化へのＤＤＢの効果がＩ−κＢα分解の阻害と関連するかどうかを確かめるために行なわれた。Ｉ−κＢαタンパク質のレベルは、ＬＰＳでラットを処置してから３０分で減少した。これに対して、ＬＰＳ（１μｇ／ｋｇ）で処置する２時間前にＤＤＢで処置すると、ＬＰＳによるＩ−κＢαタンパク質の減少が減退した。また、ＲＡＷ２６４．７細胞では、ＤＤＢは、０．３〜１ｍＭの濃度で濃度に依存してＩ−κＢαタンパク質の分解を阻害した。これらの結果から、ＤＤＢはＩ−κＢαの分解および得られるＮＦ−κＢ活性化を阻害することが示される（表５）。
【００５５】
【表５】
【００５６】
試験例６：ＤＤＢの抗炎症メカニズム
（ＴＮＦ−α生産及びＲＮＡ発現の阻害）
ＴＮＦ−αは、ＬＰＳへの応答の基本的なメディエイターであり、炎症プロセスに関わりがある。血液中に放出されるＴＮＦ−αの量がＮＦ−κＢ活性がＤＤＢによって阻害される際に減少するかどうかをＥＬＩＳＡによって測定した。ＬＰＳ処置（１μｇ／ｋｇ、静脈内(i.v.)）を１回投与すると、投与してから２時間で１ｍｌ血漿当たり３５から５１６０ｐｇにＴＮＦ−αレベルが増加した。２０、５０または１００ｍｇ／ｋｇの投与量でのＤＤＢ処置によって、それぞれ、１ｍｌ血漿当たり１３５０、１２３０または６９０ｐｇであり、ＬＰＳによって血漿中ＴＮＦ−αレベルの上昇が防止された。ＲＡＷ２６４．７細胞では、ＤＤＢはＬＰＳによるＴＮＦ−αの生産を抑制した。これらの結果から、ＤＤＢはマクロファージにおける及び肝臓におけるＴＮＦ−αの発現を阻害することが示される。
【００５７】
【表６】
【００５８】
試験例７：オルティプラズ／ＤＤＢ組み合わせの抗線維症効果（１）
オルティプラズ／ＤＤＢ組み合わせの抗線維症効果を、組み合わせの成分比を変えることによって評価した。成分比による組み合わせの効果を評価するために、ＤＭＮの投与スケジュールを部分的に修飾した。すなわち、成分比による組み合わせの効果を評価するために、試験例１及び２では、ＤＭＮを４週間にわたって、週に３回、１回の投与当たり１０μｌ／ｋｇの投与量で全１２回ラットに投与したが、本実施例では、ＤＭＮを３週間にわたって、週に３回、１回の投与当たり１０μｌ／ｋｇの投与量で全９回ラットに投与した後、残りの１週間は投与しない、肝臓の損傷が抑制された動物モデルを用いた。
【００５９】
３週間にわたってＤＭＮを投与してから１週間後、動物では２．９の線維症の評点及び１１．７のクノーデルの評点が示された。ゆえに、３．７の線維症の評点及び１６．１のクノーデルの評点を有する４週間にわたってＤＭＮが投与された動物と比較すると、肝線維症の抑制が動物で示された。
【００６０】
週３回、３週間にわたってＤＭＮを投与してから１週間後、動物の血漿中のＡＬＴ及びＡＳＴ活性は、コントロール群のものと比較すると約４倍増加した。
【００６１】
オルティプラズ及びＤＤＢを、ＤＭＮをそれぞれ投与してから１日目から３週間にわたって（週３回）２５：５、１５：１５及び５：２５ｍｇ／ｋｇの投与割合で投与した動物では、動物の血漿中のＡＬＴ及びＡＳＴの活性の増加が、ＤＭＮのみが投与された動物のものに比べて有意に阻害された。組み合わせの成分比間の有効性を比較すると、オルティプラズ及びＤＤＢが１５：１５ｍｇ／ｋｇの投与割合で投与された動物群も血漿中のＡＬＴ及びＡＳＴ活性の有意な阻害を示すものの、阻害の程度は、オルティプラズ及びＤＤＢが２５：５ｍｇ／ｋｇの投与割合で投与された動物のものに比べて小さかった（表７）。
【００６２】
血漿中のγ−ＧＴ活性及びビリルビン含量を、肝機能の代表的な指標として使用する。オルティプラズ及びＤＤＢを３週間にわたって２５：５、１５：１５及び５：２５ｍｇ／ｋｇの投与割合で投与したラットでは、ＤＭＮで誘導されたビリルビン含量の増加が統計学的に有意な程度阻害された。ＡＬＴ及びＡＳＴ値の結果と同様、ビリルビンの増加は、オルティプラズ及びＤＤＢが投与された動物群の中で、オルティプラズ及びＤＤＢが２５：５ｍｇ／ｋｇの投与割合で投与された動物で最も良好に阻害された。
【００６３】
血液中の全タンパク質含量及びアルブミンレベルが、肝組織でのタンパク質合成の指標である。肝硬変が発達すると、血液中の全タンパク質含量は、一般的に減少する。３週間にわたってＤＭＮを投与してから１週間では、全タンパク質含量は処置動物では有意に減少したが、オルティプラズ及びＤＤＢが２５：５及び１５：１５ｍｇ／ｋｇの投与割合で投与された動物群では正常なコントロール群レベルにまで回復した（表７）。
【００６４】
これらの結果から、試験例で使用されたオルティプラズ及びＤＤＢの成分比のうち、２５：５ｍｇ／ｋｇのオルティプラズ及びＤＤＢが投与された動物群がＤＭＮによって誘導される肝線維症に対して最も大きな阻害効果を示すことが示唆される。また、オルティプラズ（２５ｍｇ／ｋｇ）／ＤＤＢ（５ｍｇ／ｋｇ）が投与された動物群でのこのような効果は、試験例１で５０ｍｇ／ｋｇのオルティプラズが単独で投与された動物で観察された薬剤の効果と同等またはそれ以上であることも留意されうる。事実、ＤＭＮによるＡＬＴ増加の阻害率（％）は５０ｍｇ／ｋｇのオルティプラズが単独で投与された動物群では４０％であり、２５：５ｍｇ／ｋｇのオルティプラズ及びＤＤＢが投与された場合には肝線維症の阻害率（％）は４３％であった。他の指標の場合でも、同様の結果が得られた。
【００６５】
【表７】
【００６６】
各値は、平均値±標準偏差によって表わされる。使用された動物数は８〜１０であった。各群の有意性は、マルチプル分析(multiple analysis)のニューマン−コイルステスト(Newman-Keuls test)によって決定される。有意性の印は以下のとおりである：＊＝コントロールに比してｐ＜０．０５、＃＝ＤＭＮ処置群に比してｐ＜０．０５である。
【００６７】
試験例８：オルティプラズ／ＤＤＢの抗線維症効果（２）
ＤＭＮで誘導された肝線維症に関する様々なオルティプラズ／ＤＤＢの組み合わせの組織病理学的効果を、動物試験モデルで観察した。正常なラットでは肝線維症は観察されなかった（図２ａ及び２ｂ）。週３回、３週間にわたってＤＭＮを投与してから１週間のラットでは、肝組織中で明らかな線維症が観察された（図３ａ及び３ｂ）。オルティプラズ及びＤＤＢを、ＤＭＮを投与してから１日目から３週間にわたって（週３回）２５：５及び１５：１５ｍｇ／ｋｇの投与割合で投与すると、肝組織での線維症は、ＤＭＮ単独を投与した場合に比べて有意に抑制された。特に、オルティプラズ及びＤＤＢを２５：５ｍｇ／ｋｇの投与割合で投与した動物群（図４ａ及び４ｂ）は、オルティプラズ及びＤＤＢを１５：１５ｍｇ／ｋｇ（図５ａ及び５ｂ）及び５：２５ｍｇ／ｋｇ（図６ａ及び６ｂ）の投与割合で投与した動物群に比べて、薬剤の優れた効能を示し、肝線維症の悪化を強く阻害した。
【００６８】
肝組織の壊死及び線維症は、コラーゲンの蓄積に関する病理学的な指標、即ち、マッソンの三重染色を用いて病理学的に測定された。肝線維症の程度は、肝臓の損傷及び線維症の程度を示す、線維症の値及びクノーデルの評点を評価することによって、測定した。
【００６９】
【表８】
【００７０】
各値は、平均値±標準偏差によって表わされ、使用された動物数は８〜１０であった。各群の有意性は、マルチプル分析(multiple analysis)のニューマン−コイルステスト(Newman-Keuls test)によって決定される。有意性の印は以下のとおりである：＊＊＝ＤＭＮ処置群に比してｐ＜０．０１。線維症の程度は以下のような評点がつけられる：０＝正常、１＝弱い線維症組織の存在、２＝線維症組織の適度な存在、３＝線維症組織の明らかな存在、４＝重篤な線維症の証拠。クノーデルの評点では、門脈周囲の架橋（最大＝１０）、小葉内の細胞の損失（最大＝４）、門脈の炎症（最大＝４）、及び線維症（最大＝４）の値の合計である。
【００７１】
試験例９：ＴＧＦ−β発現に関するオルティプラズ／ＤＤＢの組み合わせの効果
上述したように、ＴＧＦ−βは、肝臓の線維症を引き起こし、肝臓の線維症の発達に関連することが知られているサイトカインである。表９は、ＲＴ−ＰＣＲ方法によるＴＧＦ−β ｍＲＮＡの存在の変化を示すものである。
【００７２】
ＤＭＮ投与群は、コントロール群に比べてＴＧＦ−βの生産の有意な増加を示した。様々なオルティプラズ／ＤＤＢの組み合わせ比で投与された動物では、ＴＧＦ−βの発現に関する定量的なＲＴ−ＰＣＲ結果から、３０ｍｇ／ｋｇのオルティプラズの投与ならびに２５：５ｍｇ／ｋｇのオルティプラズ及びＤＤＢの同時投与がＴＧＦ−βの発現を完全に阻害したことが示される。しかしながら、オルティプラズに対するＤＤＢの比が増加すると、ＴＧＦ−βの発現の阻害が徐々に失われる。ＤＤＢ単独を投与した動物群では、ＴＧＦ−βの発現は阻害されなかった。したがって、ＴＧＦ−βの発現の阻害はオルティプラズによって起こると考えられる。これをもとにして、ＤＤＢに対するオルティプラズの最良な組み合わせ比は５：１である（表９）。
【００７３】
【表９】
【００７４】
実施例
＜実施例１＞
オルティプラズ ２５ｍｇ
ＤＤＢ １ｍｇ
ラクトース ５０ｍｇ
デンプン １０ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム 適量
上記成分を混合し、錠剤を、公知の錠剤調製方法によって調製する。
【００７５】
＜実施例２＞
オルティプラズ ５０ｍｇ
ＤＤＢ １ｍｇ
ラクトース ５０ｍｇ
デンプン １０ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム 適量
上記成分を混合し、錠剤を、公知の錠剤調製方法によって調製する。
【００７６】
＜実施例３＞
オルティプラズ ５ｍｇ
ＤＤＢ １０ｍｇ
ラクトース ５０ｍｇ
デンプン １０ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム 適量
上記成分を混合し、錠剤を、公知の錠剤調製方法によって調製する。
【００７７】
＜実施例４＞
オルティプラズ ２５ｍｇ
ＤＤＢ ５ｍｇ
ラクトース ３０ｍｇ
デンプン ２８ｍｇ
タルク ２ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム 適量
上記成分を混合し、カプセル製剤を、公知のカプセル調製方法によりこの混合物を硬質ゼラチンカプセルに充填することによって調製する。
【００７８】
＜実施例５＞
オルティプラズ ２５ｍｇ
ＤＤＢ ５ｍｇ
ラクトース ３０ｍｇ
デンプン ２８ｍｇ
タルク ２ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム 適量
上記成分を混合し、カプセル製剤を、公知のカプセル調製方法によりこの混合物を硬質ゼラチンカプセルに充填することによって調製する。
【００７９】
＜実施例６＞
オルティプラズ １ｍｇ
ＤＤＢ ５０ｍｇ
ラクトース ３０ｍｇ
デンプン ２８ｍｇ
タルク ２ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム 適量
上記成分を混合し、カプセル製剤を、公知のカプセル調製方法によりこの混合物を硬質ゼラチンカプセルに充填することによって調製する。
【００８０】
＜実施例７＞
オルティプラズ ５ｍｇ
ＤＤＢ ２５ｍｇ
ラクトース ３０ｍｇ
デンプン ２８ｍｇ
タルク ２ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム 適量
上記成分を混合し、カプセル製剤を、公知のカプセル調製方法によりこの混合物を硬質ゼラチンカプセルに充填することによって調製する。
【００８１】
＜実施例８＞
オルティプラズ ２５０ｍｇ
ＤＤＢ ５０ｍｇ
異性化糖 １０ｇ
糖 ３０ｍｇ
ＣＭＣナトリウム １００ｍｇ
レオンフレーバー 適量
（全容積が１００ｍｌになるように純水を添加）
懸濁液を、公知の懸濁液製造方法に従って上記成分で調製する。１００ｍｌの褐色びんにこの懸濁液を充填して、滅菌する。
【００８２】
＜実施例９＞
オルティプラズ ５０ｍｇ
ＤＤＢ ２５０ｍｇ
異性化糖 ２０ｇ
糖 ２０ｇ
アルギン酸ナトリウム １００ｍｇ
オレンジフレーバー 適量
（全容積が１００ｍｌになるように純水を添加）
懸濁液を、公知の懸濁液製造方法に従って上記成分で調製する。１００ｍｌの褐色びんにこの懸濁液を充填して、滅菌する。
【００８３】
＜実施例１０＞
オルティプラズ ２５ｍｇ
ＤＤＢ ５ｍｇ
ラクトース ３０ｍｇ
デンプン ２０ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム 適量
上記成分を混合し、ポリエチレン被覆薬袋(envelope)に充填して、密閉して粉末を調製する。
【００８４】
＜実施例１１＞
以下を含む１個の軟質カプセル：
オルティプラズ ２５ｍｇ
ＤＤＢ ５ｍｇ
ポリエチレングリコール４００ ４００ｍｇ
濃縮グリセリン ５５ｍｇ
純水 ３５ｍｇ
ポリエチレングリコールを濃縮グリセリンと混合した後、純水を添加する。混合物を６０℃に維持しながら、オルティプラズをこの混合物に添加する。この混合物を約１，５００ｒｐｍで攪拌する。混合物を均一に合わせた後、混合物を、ゆっくり攪拌しながら、室温に冷却する。気泡を真空ポンプで除去して、軟質カプセルの内容物を残す。
【００８５】
この軟質カプセル膜を、１カプセル当たり、ゼラチン１３２ｍｇ、濃縮グリセリン５２ｍｇ、７０％ジソルビトール溶液６ｍｇ、適当量のエチルバニリン着香料、及びコーティング剤としてのカルナウバワックスを含む広く知られている軟質ゼラチン−可塑剤配合(formula)を用いて公知の調製方法に従って製造する。
【００８６】
産業上の利用可能性
本発明によるオルティプラズ／ＤＤＢ製剤は、驚くべきことに、肝線維症及び肝硬変の処置及び予防に良好な効果を発揮する。ゆえに、これは、肝線維症及び肝硬変の処置及び予防に臨床的に使用されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ＤＭＮをラットに投与した際の肝組織でのＴＧＦ−β１ ｍＲＮＡの発現に関するオルティプラズの阻害効果を示す写真である。
【図２】 図２ａは、正常な動物の肝組織の写真（ヘマトキシリン−エオジン染色(H&E staining)）であり、図２ｂは、正常な動物の肝組織の写真（ヘマトキシリン−エオジン染色）である。
【図３】 図３ａは、ＤＭＮが投与された群の肝組織の写真（ヘマトキシリン−エオジン染色）であり、図３ｂは、ＤＭＮが投与された群の肝組織の写真（マッソンの三重染色）である。
【図４】 図４ａは、ＤＭＮ及びオルティプラズ（２５ｍｇ／ｋｇ）／ＤＤＢ（５ｍｇ／ｋｇ）が一緒に投与された群の肝組織の写真（ヘマトキシリン−エオジン染色）であり、図４ｂは、ＤＭＮ及びオルティプラズ（２５ｍｇ／ｋｇ）／ＤＤＢ（５ｍｇ／ｋｇ）が一緒に投与された群の肝組織の写真（マッソンの三重染色）である。
【図５】 図５ａは、ＤＭＮ及びオルティプラズ（１５ｍｇ／ｋｇ）／ＤＤＢ（１５ｍｇ／ｋｇ）が一緒に投与された群の肝組織の写真（ヘマトキシリン−エオジン染色）であり、図５ｂは、ＤＭＮ及びオルティプラズ（１５ｍｇ／ｋｇ）／ＤＤＢ（１５ｍｇ／ｋｇ）が一緒に投与された群の肝組織の写真（マッソンの三重染色）である。
【図６】 図６ａは、ＤＭＮ及びオルティプラズ（５ｍｇ／ｋｇ）／ＤＤＢ（２５ｍｇ／ｋｇ）が一緒に投与された群の肝組織の写真（ヘマトキシリン−エオジン染色）であり、図６ｂは、ＤＭＮ及びオルティプラズ（５ｍｇ／ｋｇ）／ＤＤＢ（２５ｍｇ／ｋｇ）が一緒に投与された群の肝組織の写真（マッソンの三重染色）である。
発明の分野
本発明は、肝線維症(liver fibrosis)および肝硬変の処置及び予防を目的とする薬剤組成物に関するものである。特に、本発明は、５−（２−ピラジニル）−４−メチル−１，２−ジチオール−３−チオン[5-(2-pyrazinyl)-4-methyl-1,2-dithiol-3-thione]（オルティプラズ(oltipraz)）及びジメチル−４，４’−ジメトキシ−５，６，５’，６’−ジメチレンジオキシビフェニル−２，２’−ジカルボキシレート(dimethyl-4,4'-dimethoxy-5,6,5',6'-dimethylene dioxybiphenyl-2,2'-dicarboxylate)（ＤＤＢ）を主要な活性成分として含む、肝線維症および肝硬変の処置及び予防を目的とする薬剤組成物に関するものである。
【０００２】
発明の背景
肝臓は、非生体物質の代謝及び内因性物質の代謝において鍵となる役割を果たし、調和する酵素反応及びエネルギー代謝を有する重要な器官である。大韓民国における多くの慢性の病気のうち、肝炎、肝硬変及び肝癌が心臓血管系の病気の次に最も普及した及び生命を脅かす病気である。大韓民国は先進国と比べた場合比較的大きな酒飲み集団であるので、および飲みすぎから生じる肝臓障害はかなり高いので、肝臓病を処置するのには多くの注意が払われてきた。ウィルス感染またはアルコール摂取から生じる慢性の肝臓損傷は、しばしば、肝硬変または肝癌を引き起こす。肝組織の生理学的な特徴及び重要性を考慮すると、および肝臓病を処置する及び予防する重要性の観点から、肝臓損傷に対する治療のための及び予防のための薬剤の根本的な開発に対する要求が高い。
【０００３】
幾つかの合成化合物及びガレヌス製剤などの、様々な物質がインビトロ及びインビボ双方において肝保護機能を示す。シリマリン(silymarin)またはベタインはサイトカイン阻害の作用メカニズムを有しかつグルタチオンのレベルを増加する保護作用を有するものの、その有効性の低さから、治療効果は予想し難い。肝臓病に対する適当な治療剤が現在使用できないので、該薬剤は臨床試験でしばしば使用される。その適用が肝線維症の処置である、マロチレート及びその誘導体は毒性のある化学物質から肝臓を保護し、可能性のある作用メカニズムはフェーズＩＩ共役酵素(phase II conjugating enzyme)の誘導及びシトクロムＰ４５０の阻害を含む。しかしながら、上記化合物は、幾つかのシトクロムＰ４５０を非選択的に阻害し、予防効果のみを示す。
【０００４】
十字形植物で天然に生じる硫黄含有ジチオールチオンの幾つかの置換体が肝臓保護効果を有することが知られている。これらのうち、オルティプラズは下記式を有する住血吸虫症に対する治療剤として使用された。
【０００５】
【化１】
オルティプラズは、細胞のチオール含量を増加し、グルタチオン（ＧＳＨ）プールを維持し、組織を求電子性分子から解毒するのに応答できる酵素の発現を誘導する。下記酵素の活性がオルティプラズによって向上する：ＮＡＤ（Ｐ）Ｈキノンレダクターゼ、ミクロソームのエポキシドヒドロラーゼ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）及びＵＤＰ−ＧＴ。特に、ＧＳＴは、肝臓を四塩化炭素またはアセトアミノフェン等の毒性のある化学物質から保護する(Ansher SS, Dolan P, and Bueding E. Chemoprotective effects of two dithiolthiones and of butylhydroxyanisole against carbon tetrachloride and acetaminophene toxicity, 1983 Hepatology 3, 932-935)。
【０００７】
さらに、オルティプラズは、ベンゾ［ａ］ピラン、ＮＤＥＡ、及びウラシルマスタードによって引き起こされる化学発癌、さらにはアフラトキシンＢ１で誘導される肝腫瘍形成及びアゾキシメタンで誘導される結腸発癌を阻害する(Bolton MG, Munoz A, Jacobson LP, Groopman JD, Maxuitenko YY, Roebuck BD, and Kensler TW. Transient intervention with oltipraz protects against aflatoxin-induced hepatic tumorigenesis. 1993, Cancer Res. 53, 3499-3504)。
【０００８】
オルティプラズによる既知の発癌阻害メカニズムは、以下のとおりである。第一に、オルティプラズが、組織中の、抗酸化剤、還元ＧＳＨのレベルを増加する。第二に、これはシトクロムＰ４５０等のフェーズＩ酵素(phase I enzyme)を阻害することによって発癌性物質の生理活性化を阻害する。第三に、これは、ＧＳＴ及びＵＤＰ−ＧＴを含むフェーズＩＩ解毒酵素(phase II detoxifying enzyme)を誘導することによって発癌性物質の解毒を促進する。第四に、オルティプラズはインビトロでヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）タイプＩの複製を阻害する。第五に、これは、チオールレベルを増加することによって細胞における反応性中間体を除去し、ＤＮＡの修復を促進する。オルティプラズは、ほとんどの組織でＧＳＨレベルを増加し、放射線によって生じる遊離ラジカルまたは非生体物質を除去することが報告されている。また、オルティプラズは細胞のホメオスタシスを維持することを助けることによって放射線に対する保護剤として機能することも知られている。
【０００９】
上記説明に関して、より詳細な情報を以下に提示するであろう。癌は、体細胞におけるＤＮＡの損傷によって引き起こされると考えられる制御されない細胞の成長及び分化である(Cancer Biology, 3rd ed. Raymond W. Ruddon, pp. 61-95, 497-507, Oxford Press)。化学物質の抗癌効果は、主として、その抗突然変異誘発効果または癌細胞への形質転換若しくは癌細胞の増殖を抑制する活性による。オルティプラズは、癌の化学的予防剤として研究されてきた(Ansher et al., 1983; Bolton et al., 1993)。オルティプラズの癌の化学的予防効果は、シトクロムＰ４５０ ３Ａの阻害とのみでなく、フェーズＩＩ解毒酵素(phase II detoxifying enzyme)の誘導とも関連する。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の発現は細胞及び動物でオルティプラズによって向上し(Clapper et al., 1994; Davidson et al., 1990)、これは毒で誘導される組織の障害及び発癌の抑制と関連する(Kensler et al., 1987; Maxuitenko et al., 1998)。オルティプラズは、放射線によって引き起こされる組織の損傷に対して肝臓を保護し(Kim et al., 1997)、従来の研究で知られているＧＳＴの誘導は細胞の適応応答を意味する。オルティプラズはまた、毒に対して肝臓を保護する(Ansher et al., 1983)。オルティプラズによるアフラトキシンＢ１で誘導される発癌の阻害は、発癌性物質のシトクロムＰ４５０ ３Ａで触媒される代謝活性化の介入によって仲介される。近年の臨床試験によると、オルティプラズは、肝癌の危険性の高い人々のアフラトキシンＢ１の血漿レベルを下げるのに有効であった。動物におけるアフラトキシンＢ１で誘導される発癌はまた、オルティプラズの適用によって抑制された。
【００１０】
オルティプラズは、ＨＢＶ ＤＮＡを含むプラスミドで感染させた、２．２．１５細胞でのＢ型肝炎ウィルス（ＨＩＶ）の複製を阻害することが報告された。したがって、オルティプラズは、Ｂ型肝炎ウィルス遺伝子の転写を阻害し、ｐ５３タンパク質の発現を上昇し(Chi et al., 1998)、さらに、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）の複製を阻害する(Prochaska et al., 1995)。
【００１１】
肝臓の発癌に対するオルティプラズの化学的予防効果に関する臨床試験が中国で行なわれた。その結果から、オルティプラズは肝臓の発癌に対して弱い保護効果を有することが示された。また、オルティプラズは、少なくとも適度に、毒で誘導される肝毒性に対して肝臓を保護することが知られている。加えて、オルティプラズの安全性はラット及びイヌで行なわれた毒性研究で証明されている(Fund. Appl. Toxicol. 1997 Jan; 35(l):9-21)。
【００１２】
ＤＤＢ（ジメチル−４，４’−ジメトキシ−５，６，５’，６’−ジメチレンジオキシビフェニル−２，２’−ジカルボキシレート）、シザンドラエ(Shizandrae)由来の成分は、大韓民国を含む、東アジアで臨床的に使用される肝炎の処置を目的とする治療剤である。ＤＤＢは、四塩化炭素で、ガラクトサミンで、チオアセトアミドでまたはブレドニゾロンで誘導される障害に対して肝組織を保護し、抗体の生産を促進する。肝炎の患者に対する臨床試験で有効であることが知られているため、ＤＤＢは臨床セッティングで広範に使用される。本発明者らは、ＤＤＢの薬理効果がＮＦ−κＢの活性化及びＴＮＦ−αの生産の阻害と関連することを報告した。さらに、ＤＤＢは薬剤を代謝する酵素の発現に影響を与えないことが見出された。ＮＦ−κＢは炎症反応を仲介する転写因子として知られているので、ＮＦ−κＢの阻害剤は全身性の炎症反応を阻害できるであろう。
【００１３】
肝線維症は、肝炎等の慢性の肝臓病における損傷を受けた肝組織が正常組織では修復されないが、インビボでの適応応答の一部としてコラーゲン等の線維組織に変換される予備病理学的な状態(prepathological state)を意味する。肝線維症は組織の損傷に応答したインビボでの修復プロセスの結果であるが、損傷を受けた肝組織が線維組織に置き換わって、もはや正常に機能できなくなる（例えば、インビボ代謝または胆汁の製造）。連続した及び再発した肝線維症は肝硬変を引き起こし、その結果死に至らせるため、肝線維症を処置する新規な薬剤を開発することが重要である。しかしながら、肝臓の線維形成の正確なメカニズムは不明であるため、適当な治療剤はいまだ開発されていない。
【００１４】
近年の研究から、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ−β）、肝臓のクッパー及び伊東細胞から分泌されるサイトカインは、肝線維症における重要なメディエイターであることが明らかになった。加えて、ＴＧＦ−β抗体、アンチセンスＲＮＡ、及びＴＧＦ−βレセプターへの修飾を使用することによるＴＧＦ−β活性の遮断は肝線維症を有意に抑制することが報告された。しかしながら、当該研究の効果は実験レベルでしか確認されていない。肝線維症及び肝硬変に対する臨床的に価値のある薬剤は報告されていない。
【００１５】
発明の目的
本発明の目的は、肝線維症および肝硬変の処置有効性を最大限にし、予防剤としても使用できる薬剤組成物を提供することである。
【００１６】
本発明の他の目的は、肝線維症および肝硬変の処置及び予防のための薬剤の調製に使用される薬剤組成物の使用を提供することである。
【００１７】
本発明のさらなる他の目的は、哺乳動物に薬剤組成物を投与することを有する肝線維症および肝硬変の処置または予防方法を提供することである。
【００１８】
発明の要約
本発明は、５−（２−ピラジニル）−４−メチル−１，２−ジチオール−３−チオン（オルティプラズ(oltipraz)）及びジメチル−４，４’−ジメトキシ−５，６，５’，６’−ジメチレンジオキシビフェニル−２，２’−ジカルボキシレート（ＤＤＢ）を主成分として含む、肝線維症および肝硬変の処置および予防のための薬剤組成物を提供するものである。当該組成物のオルティプラズ及びＤＤＢの割合は、好ましくは２５：０〜２５、より好ましくは５：０〜５、および最も好ましくは５：１である。本発明によるオルティプラズ／ＤＤＢ製剤は、驚くべきことに、肝線維症及び肝硬変の処置及び予防に良好な効果を発揮し、ヒトの体内で低い毒性を有する安全な薬剤である。
【００１９】
図面の詳細な説明
図１ａは、ＤＭＮをラットに投与した際の肝組織でのＴＧＦ−β１ ｍＲＮＡの発現に関するオルティプラズの阻害効果を示す写真である。
【００２０】
図２ａは、正常な動物の肝組織の写真（ヘマトキシリン−エオジン染色(H&E staining)）である。
【００２１】
図２ｂは、正常な動物の肝組織の写真（ヘマトキシリン−エオジン染色）である。
【００２２】
図３ａは、ＤＭＮが投与された群の肝組織の写真（ヘマトキシリン−エオジン染色）である。
【００２３】
図３ｂは、ＤＭＮが投与された群の肝組織の写真（マッソンの三重染色）である。
【００２４】
図４ａは、ＤＭＮ及びオルティプラズ（２５ｍｇ／ｋｇ）／ＤＤＢ（５ｍｇ／ｋｇ）が一緒に投与された群の肝組織の写真（ヘマトキシリン−エオジン染色）である。
【００２５】
図４ｂは、ＤＭＮ及びオルティプラズ（２５ｍｇ／ｋｇ）／ＤＤＢ（５ｍｇ／ｋｇ）が一緒に投与された群の肝組織の写真（マッソンの三重染色）である。
【００２６】
図５ａは、ＤＭＮ及びオルティプラズ（１５ｍｇ／ｋｇ）／ＤＤＢ（１５ｍｇ／ｋｇ）が一緒に投与された群の肝組織の写真（ヘマトキシリン−エオジン染色）である。
【００２７】
図５ｂは、ＤＭＮ及びオルティプラズ（１５ｍｇ／ｋｇ）／ＤＤＢ（１５ｍｇ／ｋｇ）が一緒に投与された群の肝組織の写真（マッソンの三重染色）である。
【００２８】
図６ａは、ＤＭＮ及びオルティプラズ（５ｍｇ／ｋｇ）／ＤＤＢ（２５ｍｇ／ｋｇ）が一緒に投与された群の肝組織の写真（ヘマトキシリン−エオジン染色）である。
【００２９】
図６ｂは、ＤＭＮ及びオルティプラズ（５ｍｇ／ｋｇ）／ＤＤＢ（２５ｍｇ／ｋｇ）が一緒に投与された群の肝組織の写真（マッソンの三重染色）である。
【００３０】
本発明の詳細な説明
本発明者らは、オルティプラズが肝線維症及び肝硬変を処置及び予防する予想できない驚くべき効果を有するという新規な発見をした。さらに、本発明者らは、オルティプラズの処置及び予防の有効性がＤＤＢと組み合わせた際に有意に向上することを発見した。
【００３１】
線維症、肝硬変の初期段階は、重篤な損傷が様々な因子によって肝臓になされる際に起こる。肝硬変は、部分的に発癌に関連し、被害者での肝癌の危険性を顕著に増加する。しかしながら、肝硬変の病理学的なメカニズムは、肝癌とは明らかに異なる。すなわち、肝線維症は肝組織に慢性で重篤な損傷がある場合に起こる。肝臓の障害の原因因子としては、ウィルス、寄生虫、アルコールの消費、化学物質、及び医薬が挙げられる。肝線維症は、クッパー細胞、星状細胞等の、肝組織での非実質細胞の活性化によって引き起こされる細胞外マトリックス（例えば、タイプＩ、ＩＩＩ及びＩＶコラーゲン）の過剰な生産により生じる。より詳細には、線維症は、筋線維芽細胞への星状細胞の活性化及び次のトランスフォーメーションから生じる。次に、活性化された星状細胞は、過剰な細胞外マトリックスを生産する。さらに、線維症及び肝硬変は、ウィルス性肝炎及び肝癌とは病理学的な現象として明らかに異なる。ゆえに、それらのそれぞれの処置及び予防もまた異なる。しかしながら、現在、肝硬変に関する臨床上価値のある薬剤は存在しない。
【００３２】
本発明は、肝癌の予防に有効であることが知られている、オルティプラズが、肝癌とはその病理学的メカニズムが完全に異なる、肝線維症及び肝硬変に対しても有効であるという発見に基づくものである。さらに、本発明は、肝線維症及び肝硬変の処置及び予防に予想を超える有効性を提供する、オルティプラズの、従来肝炎に対してのみ有効であることが知られている、ＤＤＢとの併用を特徴とするものである。これらの事実を、下記実験で証明する。
【００３３】
オルティプラズまたはオルティプラズ／ＤＤＢは、線維症の評点及びクノーデルの評点(Knodell score)、ジメチルニトロソアミン（ＤＭＮ）で加速された線維症の指標を減少する。これは、典型的な組織顕微鏡検査結果と一致する。加えて、投与時に、オルティプラズまたはオルティプラズ／ＤＤＢは、ＡＬＴ、ＡＳＴ、ビリルビン、及びγ−グルタミルトランスペプチダーゼ（γ−ＧＴ）などの肝毒性の指標を有意に阻害する。これから、オルティプラズまたはオルティプラズ／ＤＤＢは、その応答プロセスを遅延することによって線維症を緩和するかもしれないことが示される。オルティプラズまたはオルティプラズ／ＤＤＢによる線維症の阻害メカニズムは、ＴＧＦ−βの発現の阻害を思い起こさせる。定量的なＲＴ−ＰＣＲ結果により、オルティプラズまたはオルティプラズ／ＤＤＢは、ジメチルニトロソアミンによって加速されたＴＧＦ−β ｍＲＮＡの発現を完全に阻害する。これは、オルティプラズが肝線維症及び肝硬変の発症及び悪化を阻害できる薬剤であるという証拠である。オルティプラズは、肝臓解毒酵素ＧＳＴ及びｍＥＨを誘導し、ＧＳＨを増加し、さらにラジカル共役活性を発揮する；これに対して、ＤＤＢは、解毒酵素を誘導しない。上記を考慮すると、オルティプラズ及びＤＤＢは補足的な薬理効果を有すると考えられる。より詳しくは、ヒト肝臓ミクロソーム中でのＤＤＢによるＣＹＰ３Ａ代謝活性の阻害は次にオルティプラズの代謝を阻害すると考えられるので、低投与量のオルティプラズでも、有効な肝臓の保護を提供し、薬剤の有効期間を伸ばすかもしれない。
【００３４】
本発明において、肝線維症に関するオルティプラズ／ＤＤＢの併用の治療効果は、ＤＭＮが投与されたラットにおいて様々な割合で観察された。試験を、オルティプラズ：ＤＤＢの重量比を２５：５、１５：１５及び５：２５（ｍｇ／ｋｇ）で行なった。その結果、ＤＭＮを投与すると（観察は３週間投与してから１週間に行なった）、ＡＬＴ、ＡＳＴ、ビリルビン、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（γ−ＧＴ）、線維症の評点及びクノーデルの評点(Knodell score)は、コントロール群のものに比べて優位に増加した。これに対して、オルティプラズ／ＤＤＢを投与すると、これらの値は減少した。オルティプラズ（２５ｍｇ／ｋｇ）／ＤＤＢ（５ｍｇ／ｋｇ）が、最も高い肝線維症の阻害効果を示した。これから、オルティプラズ及びＤＤＢは肝障害及び線維症を抑制するのに相乗作用を示すことが分かり、また、これらの最適な割合は５：１であることが示唆される。さらに、オルティプラズ／ＤＤＢの組み合わせの投与は、オルティプラズ（５０ｍｇ／ｋｇ）単独よりも、血中の生化学指数、即ち、肝線維症の評点及びクノーデルの評点を減少した。したがって、オルティプラズをＤＤＢと共に使用すると、胃腸管の不全、手や足の知覚異常などの、副作用を抑制でき、これは高いオルティプラズの投与量で得られると考えられる。オルティプラズは、ＴＧＦ−βの発現を防止し、抗酸化酵素の発現を増加し、ＧＳＨの増加を誘導すると同時に、ＤＤＢは、ＤＭＮによって誘導される炎症反応を阻害する。このメカニズムによって、オルティプラズ／ＤＤＢは、肝線維症の処置及び予防効果を最大にする。ゆえに、オルティプラズ／ＤＤＢは、肝臓保護について補足的な効果を利用する。さらに、オルティプラズ／ＤＤＢは、ほとんど副作用を示さないので、臨床で使用できる。
【００３５】
本発明の薬剤組成物は、個々に配合された薬剤を合わせることによって、または薬剤の混合物から構成される混合製剤を調製することによって使用されることが好ましい。本発明の薬剤組成物を実際に使用しようとする場合には、経口投与に適する単位服用形態(unit dosage form)が、適当な製薬分野における慣習に従って配合、投与される。これを達成するために、経口用製剤は、硬質または軟質カプセル、錠剤、粉末などを有する。経口用製剤は、薬理活性のある物質としてのオルティプラズ／ＤＤＢに加えて、一以上の薬理学的に活性のない公知の担体媒質を含んでもよい。例えば、経口用製剤は、添加剤としてデンプン、ラクトース、カルボキシメチルセルロース、カオリン、及び同様の賦形剤；水、ゼラチン、アルコール、グルコース、アラビアゴム、トラガカントゴム、及び同様の結合剤；デンプン、デキストリン、アルギン酸ナトリウム、及び同様の崩壊剤；タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、流動パラフィン、及び同様の潤滑剤を含んでもよい。溶解酸をさらに添加してもよい。
【００３６】
本発明の一日の投与量は、患者の肝障害の程度、肝炎の発症時期、年齢、健康状態、合併症などの様々な要因によって異なる。しかしながら、平均的な成人では、オルティプラズ／ＤＤＢ組成物は、一日の全投与量が５〜２００ｍｇ、より好ましくは２５〜５０ｍｇで一日に１回または２回、投与される。しかしながら、重篤な肝障害を有する患者ではまたは肝癌切除後に再発防止剤として使用する場合には、本発明は、上記薬剤組成物の概念から逸脱しても、また多くの投与量を使用してもよい。最も好ましくは、２５ｍｇのオルティプラズ及び５ｍｇのＤＤＢを含む１または２回の服用投与量を、一日に２回経口投与する。
【００３７】
本発明の薬剤組成物は、必要であれば、顕著な線維症阻害及び肝臓保護特性を有する、オルティプラズを、優れた炎症反応抑制効果を有する、ＤＤＢと共に補足してもよい。上記によって、肝線維症及び肝硬変の阻害が得られ、これは、毒性が低く、また、副作用がほとんどない。ゆえに、本発明は、肝線維症および肝硬変の処置及び予防に長期間安全に使用される。
【００３８】
本発明を、下記実施例を参照しながらより詳細に説明する。しかしながら、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３９】
試験例
試験例１：オルティプラズの抗線維症効果（１）
４週間にわたってジメチルニトロソアミン（ＤＭＮ）を常時投与したラットでは、血漿中のアラニンアミノトランスフェラーゼ及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼが４倍増加した。５０ｍｇ／ｋｇのオルティプラズで予め処置すると、血漿中のＡＬＴ及びＡＳＴ活性化の増加は５０％阻害された（表１）。
【００４０】
血漿中のγ−グルタミルトランスペプチダーゼ（γ−ＧＴ）活性及びビリルビン含量を、肝機能の指標として使用する。オルティプラズは、ＤＭＮ投与ラットにおいてγ−ＧＴの活性化の増加を７０％〜８０％阻害した。これに対して、ＤＭＮを投与すると、ビリルビン含量はコントロール群に比して８倍増加した。５０ｍｇ／ｋｇのオルティプラズ及びＤＭＮを同時に投与すると、血漿中のビリルビンの増加は６５％阻害された。
【００４１】
【表１】
各値は、平均値±標準偏差によって表わされる。使用された動物数は８〜１６の範囲であった。各群の有意性は、マルチプル分析(multiple analysis)のニューマン−コイルステスト(Newman-Keuls test)によって示された。有意性の印は以下のとおりである：＊＝コントロールに比してｐ＜０．０５、＃＝ＤＭＮ処置群に比してｐ＜０．０５である。
【００４３】
試験例２：オルティプラズの抗線維症効果（２）
ＤＭＮで誘導された肝線維症へのオルティプラズの組織病理学的効果を動物試験モデルで観察した。明らかな線維症が、週に３回、４週間にわたってＤＭＮを投与されたラットで観察された。オルティプラズ（４週間にわたって、週に３回、５〜５０ｍｇ／ｋｇの投与量で経口投与した）及びＤＭＮを同時に投与すると、肝組織での線維症は、ＤＭＮのみを投与したのに比べて抑制された。肝組織の壊死及び線維症を、肝組織病理指標、即ち、ヴァン・ギーソン染色及びマッソンの三重染色を用いて病理学的に決定した（表２）。
【００４４】
５０ｍｇ／ｋｇのオルティプラズ投与量が、有効にＤＭＮで誘導された線維症を緩和した（表２）。線維症の程度を、肝臓の損傷及び線維症の程度を示す、線維症及びクノーデルの評点を評価することによって決定した。ＤＭＮのみの群に比べて、ＤＭＮ＋オルティプラズの群はより低い線維症及びクノーデルの評点を示したことから、肝臓の損傷及び線維症の治療が示された。
【００４５】
【表２】
各値は、平均値±標準偏差によって表わされる。使用された動物数は８〜１６であった。各群の有意性は、マルチプル分析(multiple analysis)のニューマン−コイルステスト(Newman-Keuls test)によって決定される。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。線維症の程度 ０＝正常、１＝弱い線維症組織の存在、２＝線維症組織の適度な存在、３＝線維症組織の明らかな存在、４＝重篤な線維症の証拠。クノーデルの評点では、門脈周囲の架橋（最大＝１０）、小葉内の細胞の損失（最大＝４）、門脈の炎症（最大＝４）、及び線維症（最大＝４）の値の合計である。
【００４７】
試験例３：抗線維症におけるオルティプラズの薬理メカニズム
ＴＧＦ−β１は、組織の損傷時の線維症中の発現を上昇する基本的なサイトカインである。動物のＴＧＦ−β１ ｍＲＮＡの発現が、ＤＭＮのみの投与ならびにＤＭＮ及びオルティプラズの同時の投与中でＲＴ−ＰＣＲ分析方法で観察された。４週間にわたってＤＭＮを投与された動物では、不可逆的な過剰な線維形成がＴＧＦ−β１ ｍＲＮＡの発現の観察を防止した。ＴＧＦ−β１ ｍＲＮＡの発現は、ＤＭＮのみを投与した動物で観察された。ＤＭＮを投与してから１８時間後に、オルティプラズを投与した。次に、ＴＧＦ−β１ ｍＲＮＡの発現をそれから２４時間後に観察した。ＤＭＮを投与したラットでは、ＴＧＦ−β１ ｍＲＮＡが肝組織中で顕著に増加した。ＴＧＦ−β１ ｍＲＮＡのＤＭＮで誘導された発現は、１００ｍｇ／ｋｇのオルティプラズの投与によって完全に阻害された。ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの発現は、ＤＭＮのみの投与またはＤＭＮ及びオルティプラズの同時投与のいずれでも変化しなかった。したがって、オルティプラズは、ＴＧＦ−β１の発現を抑制する薬理メカニズムにより肝線維症を阻害することが示される（図１）。
【００４８】
試験例４：ＴＧＦ−β生産を阻害するオルティプラズの評価
試験を、ＲＡＷ２６４．７マクロファージ細胞を用いて行ない、オルティプラズが、マクロファージ中で過剰発現する、ＴＧＦ−βの生産を直接阻害するかどうかを観察し、また、関連する分子薬理メカニズムを評価した。オルティプラズを直接、ＴＧＦ−βの発現が増加した、ＲＡＷ２６４．７細胞に添加すると、オルティプラズが投与量に依存してＴＧＦ−βの発現を阻害することが見出された。これらの結果から、オルティプラズはＴＧＦ−βの生産を阻害することによって肝臓のクッパー細胞で抗線維症剤として機能するかもしれないことが示される。さらに、ＴＧＦ−βの発現の増加は、チロシンキナーゼの阻害剤である、ＥＧＴＡまたはゲニステインによって阻害される。この結果から、オルティプラズによるＴＧＦ−β生産の阻害は細胞内カルシウム調節及びタンパク質キナーゼ活性の変化の結果であるかもしれないことが示される。
【００４９】
【表３】
試験例５：ＤＤＢの抗炎症メカニズム（ＮＦ−κＢ活性化の阻害）
ＮＦ−κＢの活性化が炎症反応と関連することは知られている。ＤＤＢを投与する際の肝組織におけるＮＦ−κＢ活性を、ＤＤＢを投与しない場合と比較するために、下記試験を行なった。約１５０ｇ体重のＳＤオスラットを使用した。１群、７匹のラットを使用した。コントロール群（ベヒクルを投与）及び試験群（２０〜１００ｍｇ／ｋｇ／日のＤＤＢを投与）について、エンドトキシン（リポ多糖、ＬＰＳ）の処置によるＮＦ−κＢ活性を、電気泳動移動度シフトアッセイ(Electrophoresis Mobility Shift Assay)（ＥＭＳＡ）を用いることによって測定した。
【００５１】
ＬＰＳ処置（１μｇ／ｋｇ）により、ＮＦ−κＢ核転写ｐ５０及びｐ６５複合体のレベルが増加した。しかしながら、ＬＰＳ処置の２時間前にＤＤＢ処置（２０〜１００ｍｇ／ｋｇ）を行なうことにより、核へのＮＦ−κＢ複合体の転座及びその活性が遮断された。これらの結果から、ＤＤＢはラット肝臓でＬＰＳで誘導可能なＮＦ−κＢ活性化を阻害できることが示される。
【００５２】
Ｒａｗ２６４．７細胞を１μｇ／ｋｇのＬＰＳで刺激すると、３０分〜１時間後にＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性が増加した。０．１、０．３及び１ｍＭの濃度のＤＤＢが、濃度に依存してＮＦ−κＢ活性を阻害した。これらの結果は、ＤＤＢで処置されたラットの肝臓で得られた結果と一致した（表４）。
【００５３】
【表４】
Ｉ−κＢα分解の阻害
ＮＦ−κＢの核への転座を、Ｉ−κＢαサブユニットのリン酸化及びタンパク質分解によって先に行なった。この試験は、ＮＦ−κＢ活性化へのＤＤＢの効果がＩ−κＢα分解の阻害と関連するかどうかを確かめるために行なわれた。Ｉ−κＢαタンパク質のレベルは、ＬＰＳでラットを処置してから３０分で減少した。これに対して、ＬＰＳ（１μｇ／ｋｇ）で処置する２時間前にＤＤＢで処置すると、ＬＰＳによるＩ−κＢαタンパク質の減少が減退した。また、ＲＡＷ２６４．７細胞では、ＤＤＢは、０．３〜１ｍＭの濃度で濃度に依存してＩ−κＢαタンパク質の分解を阻害した。これらの結果から、ＤＤＢはＩ−κＢαの分解および得られるＮＦ−κＢ活性化を阻害することが示される（表５）。
【００５５】
【表５】
試験例６：ＤＤＢの抗炎症メカニズム
（ＴＮＦ−α生産及びＲＮＡ発現の阻害）
ＴＮＦ−αは、ＬＰＳへの応答の基本的なメディエイターであり、炎症プロセスに関わりがある。血液中に放出されるＴＮＦ−αの量がＮＦ−κＢ活性がＤＤＢによって阻害される際に減少するかどうかをＥＬＩＳＡによって測定した。ＬＰＳ処置（１μｇ／ｋｇ、静脈内(i.v.)）を１回投与すると、投与してから２時間で１ｍｌ血漿当たり３５から５１６０ｐｇにＴＮＦ−αレベルが増加した。２０、５０または１００ｍｇ／ｋｇの投与量でのＤＤＢ処置によって、それぞれ、１ｍｌ血漿当たり１３５０、１２３０または６９０ｐｇであり、ＬＰＳによって血漿中ＴＮＦ−αレベルの上昇が防止された。ＲＡＷ２６４．７細胞では、ＤＤＢはＬＰＳによるＴＮＦ−αの生産を抑制した。これらの結果から、ＤＤＢはマクロファージにおける及び肝臓におけるＴＮＦ−αの発現を阻害することが示される。
【００５７】
【表６】
試験例７：オルティプラズ／ＤＤＢ組み合わせの抗線維症効果（１）
オルティプラズ／ＤＤＢ組み合わせの抗線維症効果を、組み合わせの成分比を変えることによって評価した。成分比による組み合わせの効果を評価するために、ＤＭＮの投与スケジュールを部分的に修飾した。すなわち、成分比による組み合わせの効果を評価するために、試験例１及び２では、ＤＭＮを４週間にわたって、週に３回、１回の投与当たり１０μｌ／ｋｇの投与量で全１２回ラットに投与したが、本実施例では、ＤＭＮを３週間にわたって、週に３回、１回の投与当たり１０μｌ／ｋｇの投与量で全９回ラットに投与した後、残りの１週間は投与しない、肝臓の損傷が抑制された動物モデルを用いた。
【００５９】
３週間にわたってＤＭＮを投与してから１週間後、動物では２．９の線維症の評点及び１１．７のクノーデルの評点が示された。ゆえに、３．７の線維症の評点及び１６．１のクノーデルの評点を有する４週間にわたってＤＭＮが投与された動物と比較すると、肝線維症の抑制が動物で示された。
【００６０】
週３回、３週間にわたってＤＭＮを投与してから１週間後、動物の血漿中のＡＬＴ及びＡＳＴ活性は、コントロール群のものと比較すると約４倍増加した。
【００６１】
オルティプラズ及びＤＤＢを、ＤＭＮをそれぞれ投与してから１日目から３週間にわたって（週３回）２５：５、１５：１５及び５：２５ｍｇ／ｋｇの投与割合で投与した動物では、動物の血漿中のＡＬＴ及びＡＳＴの活性の増加が、ＤＭＮのみが投与された動物のものに比べて有意に阻害された。組み合わせの成分比間の有効性を比較すると、オルティプラズ及びＤＤＢが１５：１５ｍｇ／ｋｇの投与割合で投与された動物群も血漿中のＡＬＴ及びＡＳＴ活性の有意な阻害を示すものの、阻害の程度は、オルティプラズ及びＤＤＢが２５：５ｍｇ／ｋｇの投与割合で投与された動物のものに比べて小さかった（表７）。
【００６２】
血漿中のγ−ＧＴ活性及びビリルビン含量を、肝機能の代表的な指標として使用する。オルティプラズ及びＤＤＢを３週間にわたって２５：５、１５：１５及び５：２５ｍｇ／ｋｇの投与割合で投与したラットでは、ＤＭＮで誘導されたビリルビン含量の増加が統計学的に有意な程度阻害された。ＡＬＴ及びＡＳＴ値の結果と同様、ビリルビンの増加は、オルティプラズ及びＤＤＢが投与された動物群の中で、オルティプラズ及びＤＤＢが２５：５ｍｇ／ｋｇの投与割合で投与された動物で最も良好に阻害された。
【００６３】
血液中の全タンパク質含量及びアルブミンレベルが、肝組織でのタンパク質合成の指標である。肝硬変が発達すると、血液中の全タンパク質含量は、一般的に減少する。３週間にわたってＤＭＮを投与してから１週間では、全タンパク質含量は処置動物では有意に減少したが、オルティプラズ及びＤＤＢが２５：５及び１５：１５ｍｇ／ｋｇの投与割合で投与された動物群では正常なコントロール群レベルにまで回復した（表７）。
【００６４】
これらの結果から、試験例で使用されたオルティプラズ及びＤＤＢの成分比のうち、２５：５ｍｇ／ｋｇのオルティプラズ及びＤＤＢが投与された動物群がＤＭＮによって誘導される肝線維症に対して最も大きな阻害効果を示すことが示唆される。また、オルティプラズ（２５ｍｇ／ｋｇ）／ＤＤＢ（５ｍｇ／ｋｇ）が投与された動物群でのこのような効果は、試験例１で５０ｍｇ／ｋｇのオルティプラズが単独で投与された動物で観察された薬剤の効果と同等またはそれ以上であることも留意されうる。事実、ＤＭＮによるＡＬＴ増加の阻害率（％）は５０ｍｇ／ｋｇのオルティプラズが単独で投与された動物群では４０％であり、２５：５ｍｇ／ｋｇのオルティプラズ及びＤＤＢが投与された場合には肝線維症の阻害率（％）は４３％であった。他の指標の場合でも、同様の結果が得られた。
【００６５】
【表７】
各値は、平均値±標準偏差によって表わされる。使用された動物数は８〜１０であった。各群の有意性は、マルチプル分析(multiple analysis)のニューマン−コイルステスト(Newman-Keuls test)によって決定される。有意性の印は以下のとおりである：＊＝コントロールに比してｐ＜０．０５、＃＝ＤＭＮ処置群に比してｐ＜０．０５である。
【００６７】
試験例８：オルティプラズ／ＤＤＢの抗線維症効果（２）
ＤＭＮで誘導された肝線維症に関する様々なオルティプラズ／ＤＤＢの組み合わせの組織病理学的効果を、動物試験モデルで観察した。正常なラットでは肝線維症は観察されなかった（図２ａ及び２ｂ）。週３回、３週間にわたってＤＭＮを投与してから１週間のラットでは、肝組織中で明らかな線維症が観察された（図３ａ及び３ｂ）。オルティプラズ及びＤＤＢを、ＤＭＮを投与してから１日目から３週間にわたって（週３回）２５：５及び１５：１５ｍｇ／ｋｇの投与割合で投与すると、肝組織での線維症は、ＤＭＮ単独を投与した場合に比べて有意に抑制された。特に、オルティプラズ及びＤＤＢを２５：５ｍｇ／ｋｇの投与割合で投与した動物群（図４ａ及び４ｂ）は、オルティプラズ及びＤＤＢを１５：１５ｍｇ／ｋｇ（図５ａ及び５ｂ）及び５：２５ｍｇ／ｋｇ（図６ａ及び６ｂ）の投与割合で投与した動物群に比べて、薬剤の優れた効能を示し、肝線維症の悪化を強く阻害した。
【００６８】
肝組織の壊死及び線維症は、コラーゲンの蓄積に関する病理学的な指標、即ち、マッソンの三重染色を用いて病理学的に測定された。肝線維症の程度は、肝臓の損傷及び線維症の程度を示す、線維症の値及びクノーデルの評点を評価することによって、測定した。
【００６９】
【表８】
各値は、平均値±標準偏差によって表わされ、使用された動物数は８〜１０であった。各群の有意性は、マルチプル分析(multiple analysis)のニューマン−コイルステスト(Newman-Keuls test)によって決定される。有意性の印は以下のとおりである：＊＊＝ＤＭＮ処置群に比してｐ＜０．０１。線維症の程度は以下のような評点がつけられる：０＝正常、１＝弱い線維症組織の存在、２＝線維症組織の適度な存在、３＝線維症組織の明らかな存在、４＝重篤な線維症の証拠。クノーデルの評点では、門脈周囲の架橋（最大＝１０）、小葉内の細胞の損失（最大＝４）、門脈の炎症（最大＝４）、及び線維症（最大＝４）の値の合計である。
【００７１】
試験例９：ＴＧＦ−β発現に関するオルティプラズ／ＤＤＢの組み合わせの効果
上述したように、ＴＧＦ−βは、肝臓の線維症を引き起こし、肝臓の線維症の発達に関連することが知られているサイトカインである。表９は、ＲＴ−ＰＣＲ方法によるＴＧＦ−β ｍＲＮＡの存在の変化を示すものである。
【００７２】
ＤＭＮ投与群は、コントロール群に比べてＴＧＦ−βの生産の有意な増加を示した。様々なオルティプラズ／ＤＤＢの組み合わせ比で投与された動物では、ＴＧＦ−βの発現に関する定量的なＲＴ−ＰＣＲ結果から、３０ｍｇ／ｋｇのオルティプラズの投与ならびに２５：５ｍｇ／ｋｇのオルティプラズ及びＤＤＢの同時投与がＴＧＦ−βの発現を完全に阻害したことが示される。しかしながら、オルティプラズに対するＤＤＢの比が増加すると、ＴＧＦ−βの発現の阻害が徐々に失われる。ＤＤＢ単独を投与した動物群では、ＴＧＦ−βの発現は阻害されなかった。したがって、ＴＧＦ−βの発現の阻害はオルティプラズによって起こると考えられる。これをもとにして、ＤＤＢに対するオルティプラズの最良な組み合わせ比は５：１である（表９）。
【００７３】
【表９】
実施例
＜実施例１＞
オルティプラズ ２５ｍｇ
ＤＤＢ １ｍｇ
ラクトース ５０ｍｇ
デンプン １０ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム 適量
上記成分を混合し、錠剤を、公知の錠剤調製方法によって調製する。
【００７５】
＜実施例２＞
オルティプラズ ５０ｍｇ
ＤＤＢ １ｍｇ
ラクトース ５０ｍｇ
デンプン １０ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム 適量
上記成分を混合し、錠剤を、公知の錠剤調製方法によって調製する。
【００７６】
＜実施例３＞
オルティプラズ ５ｍｇ
ＤＤＢ １０ｍｇ
ラクトース ５０ｍｇ
デンプン １０ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム 適量
上記成分を混合し、錠剤を、公知の錠剤調製方法によって調製する。
【００７７】
＜実施例４＞
オルティプラズ ２５ｍｇ
ＤＤＢ ５ｍｇ
ラクトース ３０ｍｇ
デンプン ２８ｍｇ
タルク ２ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム 適量
上記成分を混合し、カプセル製剤を、公知のカプセル調製方法によりこの混合物を硬質ゼラチンカプセルに充填することによって調製する。
【００７８】
＜実施例５＞
オルティプラズ ２５ｍｇ
ＤＤＢ ５ｍｇ
ラクトース ３０ｍｇ
デンプン ２８ｍｇ
タルク ２ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム 適量
上記成分を混合し、カプセル製剤を、公知のカプセル調製方法によりこの混合物を硬質ゼラチンカプセルに充填することによって調製する。
【００７９】
＜実施例６＞
オルティプラズ １ｍｇ
ＤＤＢ ５０ｍｇ
ラクトース ３０ｍｇ
デンプン ２８ｍｇ
タルク ２ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム 適量
上記成分を混合し、カプセル製剤を、公知のカプセル調製方法によりこの混合物を硬質ゼラチンカプセルに充填することによって調製する。
【００８０】
＜実施例７＞
オルティプラズ ５ｍｇ
ＤＤＢ ２５ｍｇ
ラクトース ３０ｍｇ
デンプン ２８ｍｇ
タルク ２ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム 適量
上記成分を混合し、カプセル製剤を、公知のカプセル調製方法によりこの混合物を硬質ゼラチンカプセルに充填することによって調製する。
【００８１】
＜実施例８＞
オルティプラズ ２５０ｍｇ
ＤＤＢ ５０ｍｇ
異性化糖 １０ｇ
糖 ３０ｍｇ
ＣＭＣナトリウム １００ｍｇ
レオンフレーバー 適量
（全容積が１００ｍｌになるように純水を添加）
懸濁液を、公知の懸濁液製造方法に従って上記成分で調製する。１００ｍｌの褐色びんにこの懸濁液を充填して、滅菌する。
【００８２】
＜実施例９＞
オルティプラズ ５０ｍｇ
ＤＤＢ ２５０ｍｇ
異性化糖 ２０ｇ
糖 ２０ｇ
アルギン酸ナトリウム １００ｍｇ
オレンジフレーバー 適量
（全容積が１００ｍｌになるように純水を添加）
懸濁液を、公知の懸濁液製造方法に従って上記成分で調製する。１００ｍｌの褐色びんにこの懸濁液を充填して、滅菌する。
【００８３】
＜実施例１０＞
オルティプラズ ２５ｍｇ
ＤＤＢ ５ｍｇ
ラクトース ３０ｍｇ
デンプン ２０ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム 適量
上記成分を混合し、ポリエチレン被覆薬袋(envelope)に充填して、密閉して粉末を調製する。
【００８４】
＜実施例１１＞
以下を含む１個の軟質カプセル：
オルティプラズ ２５ｍｇ
ＤＤＢ ５ｍｇ
ポリエチレングリコール４００ ４００ｍｇ
濃縮グリセリン ５５ｍｇ
純水 ３５ｍｇ
ポリエチレングリコールを濃縮グリセリンと混合した後、純水を添加する。混合物を６０℃に維持しながら、オルティプラズをこの混合物に添加する。この混合物を約１，５００ｒｐｍで攪拌する。混合物を均一に合わせた後、混合物を、ゆっくり攪拌しながら、室温に冷却する。気泡を真空ポンプで除去して、軟質カプセルの内容物を残す。
【００８５】
この軟質カプセル膜を、１カプセル当たり、ゼラチン１３２ｍｇ、濃縮グリセリン５２ｍｇ、７０％ジソルビトール溶液６ｍｇ、適当量のエチルバニリン着香料、及びコーティング剤としてのカルナウバワックスを含む広く知られている軟質ゼラチン−可塑剤配合(formula)を用いて公知の調製方法に従って製造する。
【００８６】
産業上の利用可能性
本発明によるオルティプラズ／ＤＤＢ製剤は、驚くべきことに、肝線維症及び肝硬変の処置及び予防に良好な効果を発揮する。ゆえに、これは、肝線維症及び肝硬変の処置及び予防に臨床的に使用されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ＤＭＮをラットに投与した際の肝組織でのＴＧＦ−β１ ｍＲＮＡの発現に関するオルティプラズの阻害効果を示す写真である。
【図２】 図２ａは、正常な動物の肝組織の写真（ヘマトキシリン−エオジン染色(H&E staining)）であり、図２ｂは、正常な動物の肝組織の写真（ヘマトキシリン−エオジン染色）である。
【図３】 図３ａは、ＤＭＮが投与された群の肝組織の写真（ヘマトキシリン−エオジン染色）であり、図３ｂは、ＤＭＮが投与された群の肝組織の写真（マッソンの三重染色）である。
【図４】 図４ａは、ＤＭＮ及びオルティプラズ（２５ｍｇ／ｋｇ）／ＤＤＢ（５ｍｇ／ｋｇ）が一緒に投与された群の肝組織の写真（ヘマトキシリン−エオジン染色）であり、図４ｂは、ＤＭＮ及びオルティプラズ（２５ｍｇ／ｋｇ）／ＤＤＢ（５ｍｇ／ｋｇ）が一緒に投与された群の肝組織の写真（マッソンの三重染色）である。
【図５】 図５ａは、ＤＭＮ及びオルティプラズ（１５ｍｇ／ｋｇ）／ＤＤＢ（１５ｍｇ／ｋｇ）が一緒に投与された群の肝組織の写真（ヘマトキシリン−エオジン染色）であり、図５ｂは、ＤＭＮ及びオルティプラズ（１５ｍｇ／ｋｇ）／ＤＤＢ（１５ｍｇ／ｋｇ）が一緒に投与された群の肝組織の写真（マッソンの三重染色）である。
【図６】 図６ａは、ＤＭＮ及びオルティプラズ（５ｍｇ／ｋｇ）／ＤＤＢ（２５ｍｇ／ｋｇ）が一緒に投与された群の肝組織の写真（ヘマトキシリン−エオジン染色）であり、図６ｂは、ＤＭＮ及びオルティプラズ（５ｍｇ／ｋｇ）／ＤＤＢ（２５ｍｇ／ｋｇ）が一緒に投与された群の肝組織の写真（マッソンの三重染色）である。
Claims (4)
- ５−（２−ピラジニル）−４−メチル−１，２−ジチオール−３−チオン（オルティプラズ）およびジメチル−４，４’−ジメトキシ−５，６，５’，６’−ジメチレンジオキシビフェニル−２，２’−ジカルボキシレートを５０〜１：１〜５０の重量比で含む、肝線維症および肝硬変の悪化を予防するおよび処置するための薬剤組成物。
- 該組成物は、カプセル、錠剤、軟質カプセル、懸濁液、シロップ、注射剤、及び粉末からなる群より選択される形態として配合される、請求項１に記載の薬剤組成物。
- 該組成物は、経口投与用である、請求項１に記載の薬剤組成物。
- 肝線維症および肝硬変の悪化を予防するおよび処置するための薬剤の製造における請求項１〜３の１項に記載の薬剤組成物の使用。
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