ES2260753T3

ES2260753T3 - Procedimiento de generacion de una diversidad estructural y funcional en una secuencia peptidica.

Info

Publication number: ES2260753T3
Application number: ES93902325T
Authority: ES
Inventors: Sacha Kallenbach; Noelle Doyen; Francois Rougeon
Original assignee: Institut Pasteur de Lille
Current assignee: Institut Pasteur de Lille
Priority date: 1991-12-11
Filing date: 1992-12-11
Publication date: 2006-11-01
Anticipated expiration: 2012-12-11
Also published as: ATE322543T1; FR2685004B1; DK0618965T3; JPH07504086A; PT618965E; US5756323A; EP0618965A1; EP0618965B1; FR2685004A1; WO1993012228A1; DE69233612T2; DE69233612D1; CA2125192A1

Abstract

PROCESO DE GENERACION DE UNA DIVERSIDAD ESTRUCTURAL Y FUNCIONAL EN UNA SECUENCIA PEPTIDICA POR DELECIONES E INSERCIONES ALEATORIAS DE NUCLEOTIDOS EN UNA SECUENCIA NUCLEOTIDICA QUE CODIFICA DICHA SECUENCIA PEPTIDICA. ESTE PROCESO PUEDE SER IMPLEMENTADO POR TRANSFECCION DE UNA PREPARACION CELULAR POR VECTORES QUE PERMITEN UNA EXPRESION DE LOS GENES RAG-1 Y RAG-2 Y EVENTUALMENTE DEL GEN DE LA TERMINAL DESOXINUCLEOTIDILO TRANSFERASA ASI COMO POR UN VECTOR QUE LLEVA LA SECUENCIA NUCLEOTIDICA QUE CODIFICA DICHA SECUENCIA PEPTIDICA.

Description

Procedimiento de generación de una diversidad estructural y funcional en una secuencia peptídica.

La presente invención tiene por objeto un procedimiento de generación de una diversidad estructural o funcional en una secuencia peptídica mediante la introducción de inserciones o deleciones de nucleótidos en la secuencia nucleotídica codificante para dicha secuencia peptídica.

La presente invención se refiere por otra parte a unas composiciones farmacéuticas, a unos medicamentos o a unos reactivos de diagnóstico que contienen unas proteínas o unos péptidos obtenidos por este procedimiento.

Los genes maduros codificantes para las cadenas que componen las inmunoglobulinas y los receptores de las células T son ensamblados precozmente durante el desarrollo de los linfocitos a partir de segmentos de genes denominados de variabilidad (V), de soldadura, o de unión (J), y en ciertos casos de diversidad (D).

Siete lugares son susceptibles de ser reordenados por recombinación de estos fragmentos.

Las secuencias de las señales de recombinación (RSS) adyacentes a cada gen suministran las dianas para la recombinación. Estas secuencias están compuestas por un heptámero palindrómico y por un nonámero rico en adenosina y timidina, separadas por una secuencia de 12 ó 23 pares de bases. Los reordenamientos tienen lugar entre unas RSS con secuencias de separación de longitudes diferentes.

Durante la recombinación se forman dos tipos de unión o soldadura: unas uniones codificantes creadas por la yuxtaposición de segmentos de genes y unas uniones no codificantes formadas por unas RSS contiguas. En este último caso, los heptámeros son unidos generalmente sin inserciones de nucleótidos o sin deleciones. En cuanto a las uniones codificantes, éstas están sujetas a modificaciones importantes.

Las variaciones en las uniones, durante el reordenamiento de los segmentos de genes codificantes para las inmunoglobulinas, constituyen una gran fuente de diversidad. Se pueden así eliminar varios nucleótidos y se pueden encontrar dos tipos de inserción.

La adición de nucleótidos de manera aleatoria se produce en la inserción de las zonas denominadas zonas N sobre las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas. Se ha planteado la hipótesis (Randau et al., Molecular and Cellular Biology, 1987, 3.2387-3.243) que la desoxinucleotidiltransferasa (TdT) es responsable de esta adición aleatoria de nucleótidos.

Las inserciones de nucleótidos del tipo P corresponden a la repetición inversa de unas secuencias adyacentes a las de las secuencias codificantes. Se ha planteado la hipótesis de que su adición corresponde a una etapa obligatoria del mecanismo de recombinación.

Unas experiencias de transfección con ayuda de ADN genómico han permitido aislar dos genes que intervienen de forma activa en la recombinación: los genes Rag-1 y Rag-2 (Oettinger et al., Science, Volumen 248, 1517-1523, 1990).

Se ha demostrado que los genes Rag-1 y Rag-2 son responsables de la recombinación "lugar específica".

Sin embargo, la combinación de los productos de los genes Rag-1 y Rag-2 no permite reconstituir la diversidad de los anticuerpos encontrados in vivo, es decir no permite añadir más secuencias N.

Se han puesto a punto diversos métodos para intentar modificar las cadenas pesadas y ligeras de las inmunoglobulinas o de los receptores.

El documento EP-368.684 se refiere a un método de clonado de las secuencias nucleotídicas que corresponden a los campos variables de las moléculas de la familia de las inmunoglobulinas. Este método consiste en fabricar un ADN complementario del campo variable de la inmunoglobulina.

En cuanto al documento EP-328.444, éste se refiere a un método de modificación de la estructura de un anticuerpo, conservando al mismo tiempo su especificidad funcional. Así, en particular, unos campos constantes son modificados mediante una manipulación clásica de la ingeniería genética.

No existe en conocimiento del solicitante, ningún método que permita obtener de manera eficaz unas inmunoglobulinas modificadas en sus estructuras, y esto con una gran diversidad en las modificaciones.

Por lo tanto el solicitante se ha consagrado en evidenciar unos mecanismos de recombinación que permitan al organismo obtener una gran diversidad en las inmunoglobulinas tales como las lgG, las lgM, las lgA las lgE, y en los receptores de las células linfoides.

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El solicitante se ha consagrado también en poner a punto un método general que permita obtener de forma aleatoria una gama muy diversificada de mutaciones, en particular por inserción aleatoria, en la secuencia nucleotídica que corresponde a unas proteínas, de estructuras y funciones diversas.

El solicitante ha mostrado así, de manera sorprendente, que la combinación de los productos de expresión de los genes Rag-1 y Rag- 2 permite obtener una recombinación lugar específica y que la introducción de la TdT provoca una diversidad de unión entre las secuencias DJ y VDJ equivalentes a las encontradas in vivo.

Por otra parte, el solicitante ha puesto en evidencia que se podía, utilizando los productos de Rag-1 y Rag-2 así como la terminal desoxinucleotidiltransferasa, obtener in vitro, la producción de anticuerpos que presentan unos reordenamientos y que estadísticamente, presentan una gran diversidad tanto estructural como funcional.

La presente invención tiene por lo tanto como objeto una composición que contiene en combinación, en unas cantidades sinérgicas, los productos de expresión de los genes Rag-1 y Rag-2 y una terminal desoxinucleotidiltransferasa o uno o varios de sus fragmentos biológicamente activos.

Por otra parte, la presente invención tiene por objeto una composición que contiene unas secuencias nucleotídicas previamente purificadas que son portadoras de los genes Rag-1, Rag-2 y el gen codificante para la TdT, en la que, ventajosamente, unos vectores son portadores de las secuencias nucleotídicas.

La presente invención se refiere además a una composición que comprende los plásmidos p Blue Rec (Kallenbach et al., Nucleic Acid Research (18, 6730, 1990), p Rag-1 y p Rag-2 (Oettinger et al., citado anteriormente) y pMTDT registrado en la CNCM con el nº I 1160.

La presente invención tiene también por objeto:

-: un procedimiento de generación de una diversidad estructural o estructural y funcional en una secuencia peptídica mediante deleciones o inserciones aleatorias de nucleótidos en una secuencia nucleotídica codificante para esta secuencia peptídica, comprendiendo dicho procedimiento la transfección de una preparación celular por uno o varios vectores de expresión de los productos de los genes Rag-1, Rag-2 y de la terminal desoxinucleotidiltransferasa (TdT) y por un vector idéntico o diferente portador de dicha secuencia nucleotídica bordeada a cada lado por una o varias secuencias de recombinación RSS,

-: un procedimiento de generación de una diversidad estructural o estructural y funcional en una secuencia peptídica mediante deleciones o inserciones aleatorias de nucleótidos en una secuencia nucleotídica codificante para esta secuencia peptídica, comprendiendo dicho procedimiento la tansfección de una preparación celular por un vector portador de dicha secuencia nucleotídica bordeada a cada lado por una o varias secuencias de recombinación RSS, y seguidamente en una segunda etapa por uno o varios vectores idénticos o diferentes de expresión de los productos de los genes Rag-1, Rag-2 y de la terminal desoxinucleotidiltransferasa.

Dichos procedimientos permiten así introducir de forma aleatoria unas inserciones y unas deleciones en unas secuencias nucleotídicas. Estas modificaciones de las secuencias permiten incrementar a voluntad la diversidad biológica.

Dichos métodos son, en particular, unos sustitutos interesantes de los métodos tradicionales de mutagénesis y de los métodos para la obtención por los hibridomas de anticuerpos monoclonales.

La posibilidad de obtener unos anticuerpos monoclonales, mediante un método distinto del de los hibridomas, es ventajosa en terapéutica humana puesto que las preparaciones de anticuerpos obtenidas son puras.

Se recuerda que se entienden por secuencias N unas inserciones aleatorias de nucleótidos, es decir que no son unas réplicas de secuencias preexistentes en la proximidad de las RSS.

Por lo tanto estas secuencias N son por tanto creadas al azar y debido a este echo presentan una diversidad muy grande, que no depende de la secuencia nucleotídica en la proximidad de las RSS.

Las secuencias P son por el contrario unas inserciones resultantes de la repetición inversa de las secuencias adyacentes a las RSS.

Debido a este hecho, presentan una menor diversidad que las zonas N.

Ventajosamente, el o los vectores recombinados portadores de la secuencia nucleotídica correspondiente a la secuencia peptídica son transferidos a unas bacterias con la finalidad de seleccionar las proteínas o los péptidos que presenten la estructura y/o la función deseada.

Debe observarse que es necesario escoger unos vectores de expresión de las proteínas o péptidos adaptados a las células, eucariotas o procariotas, utilizadas. Se pueden así utilizar los plásmidos pcDNAI (comercializado por In Vitrogen) o pRc/CMV (comercializado por In Vitrogen) para las células eucariotas o el plásmido pBlue Script. (comercializado por Stratagen).

La presente invención se refiere por otra parte a la realización preferida del procedimiento para la obtención de inmunoglobulinas, en particular de anticuerpos que presentan una gran diversidad estructural y funcional por reordenamientos separados de las cadenas ligeras y pesadas que componen las inmunoglobulinas y coexpresión en una misma célula de las dos cadenas.

Así, este modo de realización preferido permite obtener una gran cantidad de células que expresan diversas secuencias de las dos cadenas de las inmunoglobulinas. Una etapa posterior permite por ejemplo la selección de la inmunoglobulina específica de un agente patógeno determinado.

Ventajosamente la secuencia correspondiente a las cadenas pesadas utilizadas solo comprende la parte Fab. de estas cadenas. La parte Fc es añadida posteriormente.

De manera preferida, el reordenamiento de las cadenas ligeras se realiza en presencia de las secuencias nucleotídicas de los genes Rag-1 y Rag-2 y el reordenamiento de las cadenas pesadas se realiza en presencia de las secuencias nucleotídicas de los genes Rag-1 y Rag-2 y del gen de la terminal desoxinucleotidiltransferasa.

Para obtener la expresión de las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas se utilizarán vectores portadores de los segmentos V, D y J mientras que para las cadenas ligeras los vectores serán portadores de las secuencias V
y J.

Además, la presente invención se refiere a un procedimiento para la obtención de receptores de las células linfoides, y en particular de las células T, que presentan una gran diversidad estructural y funcional por reordenamiento de las cadenas alfa, beta, gamma y/o delta de los receptores de las células T.

Además la presente invención tiene por objeto un procedimiento, que comprende las etapas siguientes:

a): transfección de una preparación celular por uno o varios vectores portadores de una secuencia nucleotídica codificante para la secuencia peptídica de la que se quiere obtener la variabilidad y por uno o varios vectores idénticos o diferentes de expresión de los genes Rag-1 y Rag-2, y de la TdT;

b): aislamiento del ADN de los vectores de las preparaciones celulares;

c): eliminación de los vectores que no hayan sufrido recombinación;

d): transformación de los huéspedes celulares por los vectores que han sufrido una recombinación resultante de la etapa c), y

e): selección de los huéspedes celulares que expresan las moléculas que presentan la estructura y/o la función deseada.

De manera ventajosa, este procedimiento comprende las etapas siguientes:

a): cotransfección de una preparación celular por uno o varios vectores portadores de los genes codificantes para unas cadenas ligeras no reordenadas y por uno varios vectores que expresan unos genes codificantes para Rag-1 y Rag-2, y

b): cotransfección de otra preparación celular por uno o varios vectores portadores de los genes codificantes para unas cadenas pesadas no reordenadas y por uno varios vectores que expresan el gen de la terminal desoxinucleotidiltransferasa así como unos genes codificantes para Rag-1 y Rag-2;

c): aislamiento del ADN de los vectores de las dos preparaciones celulares;

d): eliminación de los vectores que no hayan sufrido recombinación,

e): transformación de al menos dos cultivos bacterianos respectivamente por las preparaciones de los vecto-res obtenidos en la etapa d), amplificación y preparación de los ADN de los vectores bacteria-nos,

f): colocación sobre un mismo vector de los genes codificantes para las cadenas pesadas y ligeras,

g): transformación de los huéspedes celulares por el vector obtenido en la etapa f), y

h): selección de los huéspedes celulares que expresan moléculas inmunoglobulinas completas.

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Se denominan huéspedes celulares a todas las bacterias o células eucariotas que pueden ser transformadas o transfectadas.

Se denomina vector, en la presente solicitud, a toda molécula de ADN autoreplicativa que puede ser transferida de una célula a otra. Se utilizan preferentemente unos plásmidos en las etapas a a h, pero se puede utilizar ventajosamente cualquier otro vector compatible con los sistemas celulares y bacterianos empleados.

De forma ventajosa, los vectores obtenidos en la etapa c) que no han sufrido recombinación son eliminados mediante digestión enzimática en un lugar específicamente reconocido por una endonucleasa de restricción.

Las células utilizadas preferentemente en las etapas a) y b) son unos fibroblastos o unas células linfoides, o cualquier otro tipo celular o descendencia de células eucariotas.

Debe observarse que los vectores utilizados contienen, preferentemente, la zona precoz de polioma con la finalidad de permitir su replicación en estado autónomo en unas células eucariotas.

La selección de las bacterias en la etapa h) es realizada ventajosamente mediante la réplica sobre filtro de las colonias bacterianas obtenidas por esparcido de las bacterias en cajas de Petri y cribado posterior ["Molecular cloning; a Laboratory Manual" (Sambrok et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989)] con unos antígenos para los que se quieren obtener unos anticuerpos específicos.

Se observará además que los vectores que expresan los anticuerpos o los receptores de las células linfoides buscados pueden ser modificados posteriormente de manera que permitan la expresión de inmunoglobulinas completas en unas células eucariotas, y en particular, de manera que permitan su glicosilación.

Los modos de realización de las etapas a) a h) están al alcance del experto en la materia. De forma general se puede hacer referencia a "Molecular cloning; a Laboratory Manual" (Sambrok et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989).

Se han descrito también unos sistemas prácticos de realización de estas etapas en el artículo de Huse et al. (Science, volumen 246, 1275-1281, 1989).

En particular, el vector utilizado en la etapa a) puede ser el plásmido p Blue Script que contiene una cassette del tipo fragmento EcoRI-Notl de lambda Lcl descrito en este artículo en el que son insertados un segmento V y un segmento J fusionado con la zona constante de la cadena ligera. Los segmentos VL y JL están bordeados por sus secuencias señal de recombinación.

El vector utilizado para la cotransformación de la etapa b) puede ser el plásmido p Blue Script que contiene una cassette del tipo fragmento Notl-EcoRI de lambda Hc2 descrito en este artículo en el que son insertados un segmento V, un segmento D y un segmento J fusionado con la zona CH1 de la cadena pesada. Los segmentos VH, DH, y JH están bordeados por sus secuencias señal de recombinación.

Los vectores de expresión de los genes Rag-1 y Rag-2 utilizados en las etapas a) y b) pueden ser los descritos por Oettinger et al. (Science, 248, 1517-1523, 1990).

El vector de clonado portador del gen codificante para la terminal desoxinucleotidiltransferasa puede ser en particular el plásmido pMTdT que es un pcDNAII en él que se ha insertado el ADN complementario de la terminal desoxiribonucleotidotransferasa del ratón.

Este plásmido, que ha sido registrado el 10 de Diciembre de 1991 en la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos del Instituto Pasteur con el nº I 1160, es otro objeto de la presente solicitud.

El artículo de Huse et al. citado anteriormente menciona por otra parte más en particular unos modos de realización prácticos que pueden ser utilizados en el marco de la presente invención.

En particular, los vectores utilizados en las etapas a) y b) pueden ser obtenidos a partir de una biblioteca que ha sido construida como se ha descrito en este artículo.

Esta biblioteca puede ser obtenida clonando los fragmentos de las cadenas ligeras y pesadas en, respectivamente, los vectores resultantes del fago lambda, lamda Lc1 y lambda Hc2. Estos vectores que sirven para el clonado en la etapa inicial de la construcción de la biblioteca pueden ser extirpados y dar origen a un plásmido que contiene unos fragmentos de oligonucleótidos que corresponden a cadenas pesadas y ligeras.

Estos vectores contienen diversos lugares de restricción, y una secuencia codificante para el péptido líder del gen bacteriano PeIB que ha sido utilizado con anterioridad con éxito en la E-coli para secretar fragmentos Fab, un lugar de unión de los ribosomas, y sobre el vector lambda Hc2 una secuencia que corresponde al decapéptido tag situado en el extremo C terminal de la inserción de la cadena pesada. El péptido tag permite la purificación de los productos de expresión mediante el paso sobre unas columnas de inmunoafinidad.

El ADN en la base de la preparación de la biblioteca de cadenas pesadas es preferentemente el ADN humano con el fin de minimizar los riesgos de rechazo por parte del organismo en el caso de utilizar estos anticuerpos en terapéutica humana.

Se puede realizar la etapa f), que consiste en la colocación sobre un mismo vector de los genes codificantes para las cadenas pesadas y ligeras, como se ha descrito en la página 1278 del artículo de Huse et al. citado anteriormente.

Así, se digiere la biblioteca de cadenas ligeras mediante la endonucleasa de restricción cortando por un lugar único, se desfosforilan los extremos 5’ resultantes, y se digieren seguidamente los productos, mediante otra endonucleasa de restricción Eco R1 cortando por un lugar único.

El ADN de los vectores que componen la biblioteca de las cadenas pesadas es escindido por la endonucleasa Hind-III y seguidamente desfosforilado y digerido por la endonucleasa Eco R1.

Los ADN así preparados son mezclados y reunidos por ligado.

Después del ligado, únicamente los clones que resultan de la combinación de un fragmento procedente de la biblioteca de cadenas pesadas y de un fragmento procedente de la biblioteca de cadenas ligeras, reconstituyen un fago viable.

Para la construcción de las bibliotecas de cadenas pesadas y ligeras, se pueden utilizar unas preparaciones de ADN mensajero aisladas partiendo de unas células del organismo o de unos hibridomas. Entonces se sintetizan, en un sistema de amplificación por PCR, unos ADN complementarios correspondientes. Estas técnicas son bien conocidas por el experto en la materia y son en particular descritas en "Molecular cloning; a Laboratory Manual" (Sambrok et al., 1989, citado anteriormente).

La selección de las bacterias que expresan las moléculas completas de la etapa h) es seguida por una etapa de selección de clones que sintetizan las moléculas que se desean obtener.

El ensamblado de las partes de las cadenas pesadas y de las cadenas ligeras obtenido de esta forma puede llevar únicamente a la obtención del fragmento Fab. El vector es entonces modificado de manera que pueda codificar para el fragmento Fc. El producto de expresión de este vector es entonces un anticuerpo.

En el caso de la selección de clones que sintetizan unos anticuerpos, un método de selección puede ser el utilizado por Huse et al. ( citado anteriormente) para la selección de clones que sintetizan unos anticuerpos dirigidos contra paranitrofenilfosfonamidato (NPN).

El método utilizado en este artículo consiste en hacer dobles, sobre hoja de nitrocelulosa, de clones extendidos sobre cajas de medio de cultivo gelificado y valorar la hibridación del NPN acoplado a suero de albúmina bovina marcado con I^{125}I.

Los productos de expresión en unas células eucariotas o procariotas transfectadas por unos plásmidos recombinantes portadores de los genes originarios del conejo o del ratón, se pueden utilizar, en unos cajetines de diagnóstico humano o veterinario.

La presente invención es ilustrada sin por ello ser limitada por los ejemplos de realización siguientes en los que:

La Figura 1 representa las secuencias de las uniones formadas sobre el plásmido pBlueRec después de una cotransfección con pRag-1 y p Rag-2 en unos fibroblastos NIH-3T3.

La Figura 2 representa las secuencias de las uniones formadas sobre el plásmido pBlueRec después de una cotransfección con unos vectores codificantes para Rag-1, Rag-2 y la TdT en unos fibroblastos NIH-3T3.

La Figura 3 representa las secuencias de uniones formadas sobre el plásmido pBlueRec después de cotransfección con unos vectores codificantes para Rag-1 y Rag-2 en unas descendencias celulares BW1J, CHO-K1 y A.9.

En estas tres figuras, las secuencias de los plásmidos recombinados están alineadas con la secuencia del plásmido de origen pBlueRec que es la primera secuencia a partir de la parte alta de las figuras.

En estas tres figuras, los nucleótidos que se suponen debidos a unas inserciones del tipo P están subrayados en las partes centrales de las figuras, mientras que las inserciones del tipo N que figuran en estas mismas partes no lo están. Las deleciones están representadas mediante unas líneas discontinuas.

Ejemplos Materiales y métodos utilizados en los ejemplos Descendencia celular

Los fibroblastos de unos embriones de ratón NIH-3T3 (ATCC CRL 6442) y las células A9 derivadas de las células L, (ATCC CRL 6319) son cultivadas en DMEM complementado con 10% de suero de feto de ternera.

Se cultivan células de hépatomas de ratón BW1J como han indicado Cassio D. & Weiss M.C. (Somat Cell Genet, 5, 719-738, 1979).

Se cultivan las células de ovarios de hamster chino CHO-K1 (ATCC CCL 61) en RPMI, complementadas con 10% de suero de feto de ternera.

Se cultivan las células pre-B BASP-1 (Choquet et al., Science, 235, 1211-1214,1987) en RPMI complementado con 10% de suero de feto de ternera y 50 \mum de \beta-mercaptoetanol.

Clonado del gen codificante para la terminal desoxinucleotidiltransferasa del ratón

Se prepara ARN a partir del timo del ratones con una edad de 5 semanas como ha sido descrito por Auffray y Rougeon (Europe J. Biochem.,107,303-314,980), utilizando tiocianato de guanidina 4M en vez de urea 6M.

El ARN poli-A es purificado utilizando una cromatografía celulosa oligo DT y es analizado por Northern blot. La síntesis de la rama simple es realizada a partir de 5 \mug de ARN poli-A inicializado con oligo DT utilizando la transcriptasa inversa del MMLV (comercializada por BRL).

La síntesis de la doble rama se realiza en presencia de la ADN polimerasa I y de RNasa H.

Se unen al CDNA preparado de manera adecuada unos adaptadores de doble rama portadores de los extremos BstX1 y son clonados en el lugar de restricción BstX1 del pCDNA2 (comercializado por In Nitrogen).

La biblioteca de ADN complementario del timo de ratón es cribada con dos oligonucleótidos mezclados que corresponden respectivamente a las secuencias 121-142 y 1471-1494 de la secuencia del ADN complementario de la TdT de ratón.

Los clones de ADN complementario positivos y que se suponen lo bastante largos para contener por entero el gen codificante para la TdT de ratón son secuenciados sobre las dos ramas mediante el método de la didesoxiterminación (Sanger et al., PNAS, 74, 5463-5467, 1977).

Vectores utilizados

El plásmido pBlueRec es descrito por Kallenbach et al. ((1990) Nucleic Acid Research 18, 6730).

p Rag-1 y p Rag-2 han sido suministrados por Oettinger et al. (citado anteriormente).

El ADN complementario de la TdT de ratón es clonado en el pCDNA1. La expresión de Rag-1, Rag-2 y de la Tdt están bajo el control del promotor del CMV.

Puesta en evidencia de la recombinación específica

Las transfecciones son realizadas por electroporación siguiendo las indicaciones dadas por Chu et al. (Nucleic Acid Research Res.,15, 1311-1326,1987).

Se transfectan 2.10^{6} células con 2,5 \mug de pBlueRec con ó sin 6 \mug de p Rag-1 o 4,8 \mug de p Rag-2.

Para determinar el efecto de la TdT sobre la inserción de la zona N, se añaden 4,5 \mug del vector de expresión de la TdT a los tres vectores mencionados más arriba.

Las células son recogidas después de 40 a 48 horas de incubación a 37ºC, lavadas con PBS y se prepara el ADN plasmídico según Bimboim y Doly (Nucleic Acids Res. 7, 1513-1523, 1979).

Los residuos del ADN son suspendidos de nuevo en 20 \mul de agua estéril. Se digieren 7 \mul de la solución de ADN con Dpnl con la finalidad de eliminar los plásmidos que no han sido replicados.

40 \mul de una bacteria competente XL1-Blue (comercializada por Stratagene) son transformados por electroporación y esparcidos en unas cajas de Agar LB que contienen XGal (80 \mug/ml), IPTG (150 \muM), ampicilina (100 \mug/ml) y tetraciclina (10 \mug/ml).

La frecuencia de reordenamiento es calculada como la cantidad de colonias azules x 3 sobre el número total de clones.

Secuenciado de los clones recombinantes

Las colonias azules son replicadas y aisladas sobre unas cajas de agar LB que contienen XGal, IPTG, ampicilina y tetraciclina.

Las preparaciones de ADN son realizadas según el método descrito por Sambrok et al., (Molecular cloning, Laboratory Manual citado anteriormente), seguidamente son tratadas con RNasa durante dos horas a temperatura ambiente antes de realizar el secuenciado de la doble rama.

Ejemplo 1

Comparación de las frecuencias de recombinación en los fibroblastos NIH-3T3 y en las descendencias celulares precursoras de las células B en presencia de Rag-1 y Rag-2

La actividad recombinatoria debida al Rag-1 y Rag-2 en los fibroblastos NIH-3T3 ha sido valorada por transfección transitoria.

p Rag-1 y p Rag-2 son cotransfectados en unos fibroblastos NIH3 con el plásmido sustrato para la recombinación pBlueRec.

Después de 48 horas, el ADN plasmídico es aislado y valorado con E.Coli para la recombinación.

La secuencia LacZ de pBlueRec es interrumpida por un fragmento de ADN de 280 pares de bases flanqueada de dos RSS.

El reordenamiento lugar específico eliminará la inserción y en un caso de cada tres restaurará el marco de lectura correcto, dando lugar a unos clones azules después de la transformación de E. coli.

Este ensayo rápido permite examinar un número importante de reordenamientos.

Unas experiencias de transfección con p Rag-1 o p Rag-2 no dan lugar por sí solas a unos clones recombinantes.

Como se ha indicado en la tabla I, se observa una frecuencia de recombinación importante cuando los dos plásmidos son cotransfectados. Además, la frecuencia (media geométrica=1,26) es comparable con la observada después de la transfección del sustrato de recombinación en las células preB, BASP 1 (media geométrica = 1,46).

Con la finalidad de comparar las uniones codificantes formadas después de la recombinación modulada por p Rag-1 y p Rag-2 en los fibroblastos, con las uniones observadas en las células linfoides, son secuenciadas las uniones sobre los plásmidos reordenados obtenidas después de la transfección de las células NIH-3T3.

Las secuencias indicadas en la figura 1 representan unos elementos de recombinación independientes, es decir resultado de diferentes experiencias de transfección.

Siete uniones sobre 17 no presentan ni deleciones ni inserciones.

Cuatro uniones tiene unas deleciones en un lado y otras cuatro tienen unas deleciones en los dos lados.

Únicamente una unión presenta una inserción del tipo P de dos pares de bases asociada a una deleción de dos pares de bases en uno de los lados de la unión.

La última unión presenta una deleción de un par de bases y la adición de un nucleótido, que puede ser atribuida al heptámero y es probablemente debida a una escisión imprecisa.

Ejemplo 2

Cotransfección por Rag-1 y Rag-2 y TdT de los fibroblastos NIH-3T3

Con la finalidad de intentar reconstituir, la diversidad de uniones observada en unas células preB o preT, se han transfectado unos fibroblastos NIH-3T3 con el vector de expresión de la TdT, así como con p Rag-1, p Rag-2 y pBlueRec.

Los plásmidos recombinanates son secuenciados.

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Las transfecciones testigo, que se han realizado con el vector pCDNAI sin el ADN complementario de la TdT, no han provocado ninguna inserción de las zonas N.

Como indica la figura 2, 88% de las uniones muestran que ha habido una inserción de las zonas N. La mayoría de las zonas N son de 1 a 4 nucleótidos con una media de 3 nucleótidos por unión.

De todas formas se observa una inserción excepcional de 18 nucleótidos.

La TdT incorpora con más eficacia que otros nucleótidos los residuos G. La frecuencia de las inserciones de nucleótidos de tipo P parece aumentar en este experimento. De todas formas se debe destacar que es imposible distinguirlos de las zonas N.

Ejemplo 3

Efecto de Raq-1 y Rag-2 en diferentes tipos de descendencias diferenciadas

Se ha mostrado en los Ejemplos anteriores, que Rag-1 y Rag-2 son capaces de provocar una actividad de recombinación en unas células relativamente indiferenciadas que son los fibroblastos NIH-3T3.

Se ha valorado por lo tanto la actividad de estos dos genes en unas células en unos estados diferenciados. Los resultados obtenidos de las descendencias celulares BW1J, CHO-K1 y A9 están indicados en la tabla 2.

Se han observado unas variaciones entre las diferentes descendencias celulares, pero de manera sorprendente, las frecuencias de reordenamiento en las descendencias BW1J y CHO-K1 son claramente superiores a las obtenidas por los fibroblastos 3T3.

Los reordenamientos podrán ser detectados 13 horas después de la cotransfección con pBlueRec, p Rag-1 y p Rag-2.

El secuenciado de los plásmidos recombinados muestra que las deleciones en las uniones codificantes tienen lugar en las tres descendencias celulares ensayadas (figura 3).

Se ha encontrado, en la unión de un clon recombinante, obtenido después de la transfección de las descendencias A9, una sola inserción de nucleótido del tipo P.

Conclusión

El conjunto de estos resultados muestra que se obtienen unas descendencias no diferenciadas de las deleciones nucleotídicas después de cotransfección por p Rag-1 y p Rag-2. Se observan además unas inserciones nucleotídicas del tipo P tales como las definidas por Lafaille et al. (Cell, 59, 859-870, 1989).

Se ha de destacar además que la coexpresión de Rag-1, Rag-2 y TdT en las células no diferenciadas lleva a unas inserciones del tipo N.

El conjunto de estos resultados indica por lo tanto que Rag-1 y Rag-2 bastan para inducir una recombinación lugar específica pero que la presencia de TdT, en combinación con Rag-1 y Rag-2, es necesaria para obtener unas inserciones del tipo N que son el reflejo de la expresión de la diversidad de síntesis de las inmunoglobulinas y de los receptores de las células linfoides.

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1

2

Claims

1. Composición que contiene unas secuencias nucleotídicas purificadas con anterioridad portadoras de los genes Rag-1 y Rag-2 y el gen codificante para la TdT.

2. Composición según la reivindicación 1, caracterizada porque las secuencias nucleotídicas purificadas con anterioridad son llevadas sobre unos vectores.

3. Composición que comprende los plásmidos pBlueRec, p Rag-1, p Rag-2 y pMTDT registrada en la CNCM con en nº I-1160.

4. Composición que contiene en combinación los productos de expresión anteriormente purificados de los genes Rag-1 y Rag-2 y la terminal desoxinucleotidiltransferasa.

5. Procedimiento de generación de una diversidad estructural o estructural y funcional en una secuencia peptídica por deleciones o inserciones aleatorias de nucleótidos en una secuencia nucleotídica codificante para esta secuencia peptídica, comprendiendo dicho procedimiento la transfección de una preparación celular por uno o varios vectores de expresión de los productos de los genes Rag-1, Rag-2 y de la terminal desoxinucleotidiltransferasa (TdT) y por un vector idéntico o diferente portador de dicha secuencia nucleotídica bordeada a cada lado por una o varias secuencias de recombinación RSS.

6. Procedimiento de generación de una diversidad estructural o estructural y funcional en una secuencia peptídica por deleciones o inserciones aleatorias de nucleótidos en una secuencia nucleotídica codificante para esta secuencia peptídica, comprendiendo dicho procedimiento la transfección de una preparación celular por un vector portador de dicha secuencia nucleotídica bordeada a cada lado por una o varias secuencias de recombinación RSS, y seguidamente en una segunda etapa por uno o varios vectores idénticos o diferentes de expresión de los productos de los genes Rag-1, Rag-2 y de la terminal desoxinucleotidiltransferasa.

7. Procedimiento según las reivindicaciones 5 a 6, caracterizado porque el o los vectores recombinados portadores de la secuencia nucleotídica que corresponde a la secuencia peptídica son transferidos a unas bacterias con la finalidad de seleccionar las proteínas que presenten la estructura y/o la función deseada.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 5 a 7, para la obtención de inmunoglobulinas y en particular de anticuerpos que presenten una gran diversidad estructural y funcional por reordenamiento separado de las cadenas ligeras y pesadas y coexpresión de las dos cadenas.

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones 5 a 7, para la obtención de receptores de las células linfoides, y en particular de las células T, que presenten una gran diversidad estructural y funcional por reordenamiento de las cadenas alfa, beta, gamma y/o delta de los receptores de las células T.

10. Procedimiento según la reivindicación 8, caracterizado porque el reordenamiento de las cadenas pesadas es realizado en presencia de las secuencias nucleotídicas de los genes Rag-1, Rag-2, y del gen de la terminal desoxinucleotidiltransferasa, siendo expresadas efectivamente dichas secuencias.

11. Procedimiento según una de las reivindicaciones 5 y 6, que comprende las etapas siguientes:

a): transfección de un preparación celular por uno o varios vectores portadores de una secuencia nucleotídica codificante para la secuencia peptídica de la que se desea obtener la variabilidad y por uno o varios vectores idénticos o diferentes de expresión de los genes Rag-1, Rag-2 y de la TdT;

b): aislamiento del ADN de los vectores de las preparaciones celulares;

c): eliminación de los vectores que no hayan sufrido recombinación;

d): transformación de los huéspedes celulares por los vectores que hayan sufrido recombinación resultante de la etapa c), y

e): selección de los huéspedes celulares que expresan las moléculas que presentan la estructura y/o la función buscada.

12. Procedimiento según la reivindicación 11, caracterizado porque dicha secuencia peptídica es una cadena alfa, beta, delta, ó gamma de los receptores de las células linfoides o uno de sus fragmentos o uno de sus deriva-
dos.

13. Procedimiento según una de las reivindicaciones 8 y 10, que comprende las etapas siguientes:

a): cotransfección de una preparación celular por uno o varios vectores portadores de las secuencias nucleotídicas codificantes para unas cadenas ligeras no reordenadas y por uno varios vectores que expresan los genes Rag-1 y Rag-2, y

b): cotransfección de otra preparación celular por uno o varios vectores portadores de las secuencias nucleotídicas codificantes para unas cadenas pesadas no reordenadas y por uno varios vectores que expresan el gen de la terminal desoxinucleotidiltransferasa así como los genes Rag-1 y Rag-2;

c): aislamiento del ADN de los vectores de las dos preparaciones celulares;

d): eliminación de los vectores que no hayan sufrido recombinación,

e): transformación de al menos dos cultivos bacterianos respectivamente por las dos preparaciones obtenidas en la etapa d), amplificación y preparación de los ADN de los vectores bacterianos,

h): selección de los huéspedes celulares que expresan unas moléculas de inmunoglobulinas completas.

14. Procedimiento según la reivindicación 13, caracterizado porque los vectores obtenidos en la etapa c) que no hayan sufrido recombinación son eliminados por digestión enzimática.

15. Procedimiento según la reivindicación 13, caracterizado porque las preparaciones celulares son unos fibroblastos o cualquier otra célula eucariota.

16. Procedimiento según la reivindicación 13, caracterizado porque el vector que expresa la terminal desoxiribonucleotidiltransferasa es el plásmido pMTdT portador del gen de la terminal desoxirribonucleotidotransferasa registrado en la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos con el Nº I-1160.