JPH07504086A - ペプチド配列の構造と機能を多様化させる方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ペプチド配列の構造と機能を多様化させる方法本発明はペプチド配列をコードす るヌクレオチド配列にヌクレオチドを挿入または欠失させることによってペプチ ド配列を構造的かつ機能的に多様化する方法に関するものである。

本発明はさらに上記方法で得られた蛋白質またはペプチドを含む薬理組成物、医 薬または診断試薬に関するものである。

免疫グロブリンを構成する鎖をコードする成熟遺伝子およびＴ細胞受容体は、い わゆる可変部遺伝子（■）、結合部または接合部遺伝子（Ｊ）、場合によっては さらに多様性遺伝子（Ｄ）の遺伝子セグメントからリンパ球が発育する前に結合 される。

これらセグメントを組み換えることによって７つの遺伝子座を再配置することが できる。

各遺伝子に隣接した組み換え信号配列（Ｒ５Ｓ）を組み換えの目印にすることが できる。この紹み換え信号配列（Ｒ３Ｓ）は１２または２３個の塩基対配列を介 して互いに分離されたバリドロームなヘプタメール（ｆｌｅｐｔａｍｅｒｅ）と アデノシンおよびチミジンに富んだノナメール（ｎｏｎａｍｅｒｅ）とによって 構成されている。

再配置はＲ３Ｓ間の配列が異なる長さで分離して起こる。

組み換え時には２種類の接合または結合、すなわち遺伝子セグメントが並んで生 じるコード接合（ｊｏｎｃｔｉｏｎｓ　ｃｏｄａｎｔｅｓ）とＲ５Ｓが隣りにき た時に形成される非コード接合（ｊｏｎｃｔｉｏｎｓ　ｎｏｎｃｏｄａｎｔｅｓ ）との２種類の接合が形成される。非コード接合の場合には、ヘプタメールは一 般にヌクレオチドの挿入や欠失なしに接合される。コード接合の場合に大きな変 更を受ける。

免疫グロブリンをコードする遺伝子セグメントの再配置時の接合のバリニージョ インが多様性の一つの大きな要因であり、複数のヌクレオチドが欠失し、２種類 の挿入が起こることがある。

ヌクレオチドを無作為に加えると免疫グロブリンの重鎮上のいわゆるＮ領域に挿 入される。このヌクレオチドの無作為添加にはデゾオキシヌクレオチジルトラン スフェラーゼ（Ｔ　ｄ　Ｔ）が係わっているという仮説がある（Ｒａｎｄａｕ達 、Ｍｏ１ｅｃｕｌｅｒ　ａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　（１９８７ ）　３，２３７〜３．２４３＞。

Ｐ型ヌクレオチドの挿入はコードする配列と隣接した配列の逆方向の繰り返しに 対応する。このヌクレオチドの挿入が組み換え機構の必須段階に対応するという 仮説が発表されている。

ゲノムＤＮＡを用いたＤＮＡ）ランスフェクション実験によって、組み換えにア クティブに関与する２つの遺伝子、すなわちＲａｇ−１およびＲａｇ−２を単離 することができた（Ｏｅｔｔｉｎｇｅｒ達、５ｃｉｅｎｃｅ、　２４８．１５１ ７〜１５２３．１９９０）。

これらの遺伝子Ｒａｇ−１とＲａｇ−２が部位特異的組み換えに関係するという ことは分っている。

しかし、これら遺伝子Ｒａｇ−１およびＲａｇ−２から得られた産物を組み合わ せてもインビボで見られる抗体の多様性を再構成することはできない。換言すれ ば、Ｎ配列をさらに加えることはできない。

免疫グロブリンの重鎮および軽鎖または受容体を変えるための方法は種々開発さ れている。

ヨーロッパ特許第３６８．６８４号には、免疫グロブリンの分子の可変領域に対 応したヌクレオチド配列をクローニングする方法が記載されている。この方法で は免疫グロブリンの可変領域の相補性ＤＮＡを作る。

ヨーロッパ特許第３２８．４４４号には、機能特異性を保持したまま抗体の構造 を変える方法、すなわち一定の領域を通常の遺伝子工学的操作で変える方法が記 載されている。

しかし、免疫グロブリンの構造を効率的かつ極めて大きな多様性で変える方法は 本出願人の知る限り存在しない。

本出願人はｌ＋；Ｇ　、　ＩｇＭ　、ＩｇＡ　、　ＩｇＢ等の免疫グロブリンや リンパ細胞の受容体において生体が大きな多様性を獲得する組み換え機構を研究 してきた。

さらに、本出願人は各種の蛋白、構造および機能に対応したヌクレオチド配列に 極めて多様な突然変異を任意に起こさせ、特に無作為挿入によって起こさせる一 般的な方法を研究してきた。

その結果、驚くべきことに、遺伝子Ｒａｇ−１とＲａｇ−２の発現生成物を組み 合わせることによって部位特異的組み換えができるということ、そして、ＴｄＴ を導入することによってインビボで見られるものと同じ接合の多様性を配列ＤＪ 間およびＶＤＪ間に導入できるということを見出した。

本出願人は、さらに、Ｒａｇ−１およびＲａｇ−２の発現生成物と末端デオキシ ヌクレオチジルトランスフエラーゼとを用いることによって、統計的に構造上お よび機能上で大きな多様性を示す再配列を有する抗体をインビトロで得ることが できるということを見出した。

従って、本発明の対象は、遺伝子Ｒａｇ−１およびＲａｇ−２の発現生成物と末 端デオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼとを相乗効果が生じる量だけ含む か、生物学的に活性なこれらのフラグメントを含む組成物にある。

本発明の他の対象は、遺伝子Ｒａｇ−１およびＲａｇ−２または遺伝子Ｒａｇ− １およびＲａｇ−２の発現生成物を合成可能なフラグメントまたは生物学的に活 性なその誘導体と、ＴｄＴをコードする遺伝子あるいはそのフラグメントまたは 生物学的に活性なその誘導体とを有するヌクレオチド配列を含む組成物にある。

このヌクレオチド配列はベクターに支持されているのが好ましい。

本発明は、さらに、プラスミドｐ　Ｂｌｅｕ　Ｒｅｃ　（にａｌｌｅｎｂａｃｌ ＋達、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　（１８，６７３０，１９ ９０＞）と、ｐ　Ｒａｇ−１＃よびｐ　Ｒａｇ−２（Ｏｅｔｔｉｎｇｅｒ達、前 掲）とを含む組成物にも関スル。

本発明の他の対象は下記の方法にある：（１）　ペプチド配列をコードするヌク レオチド配列でヌクレオチドを無作為に欠失または挿入させることによってペプ チド配列に構造的または機能的な多様性を発生させる方法において、Ｒａｇ−１ 遺伝子、Ｒａｇ−２遺伝子および末端デゾオキシヌクオチジルトランスフェラー ゼ（ＴｄＴ）またはこれらの誘導体の産生物を発現することが可能な１つまたは 複数のベクターと、組み換え配列Ｒ３Ｓによって区切られるか、Ｒ８Ｓ配列の生 物学的に活性な誘導体によって区切られた上記ヌクレオチド配列を有する同一ま たは異なるベクターとによって細胞調製物をトランスフェクションする方法。

（２）ペプチド配列をコードするヌクレオチド配列でヌクレオチドを無作為に欠 失または挿入させることによってペプチド配列に構造的または機能的な多様性を 発生させる方法において、１つまたは複数の組換え配列Ｒ３Ｓによって区切られ ているか、Ｒ３Ｓ配列の生物学的に活性な１つまたは複数の誘導体によって区切 られている上記ヌクレオチド配列を有するベクターによって細胞調製物をトラン スフェクションし、次いで、第２段階としてＲａｇ−１遺伝子、Ｒａｇ−２遺伝 子および末端デゾオキシヌクオチジルトランスフエラーゼまたはそれらの誘導体 の産生物を発現可能な１つまたは複数のベクターで細胞調製物をトランスフェク ションする方法。

（３）　組み換え配列Ｒ３Ｓに近接した配列を逆方向に繰り返すことによってペ プチド配列に対応するヌクレオチド配列に挿入または欠失を導入する、ペプチド 配列に構造的または機能的な多様性を発生させる方法において、Ｒａｇ−１遺伝 子およびＲａｇ−２遺伝子またはこれらの誘導体の産生物を発現することが可能 な１つまたは複数のベクターと、組み換え配列Ｒ３Ｓによって区切られるか、Ｒ ３Ｓ配列の生物学的に活性な誘導体によって区切られた上記ヌクレオチド配列を 有する同一または異なるベクターとによって細胞調製物をトランスフェクション する方法。

（４）組み換え配列Ｒ３Ｓに近接した配列を逆方向に繰り返すことによってペプ チド配列に対応するヌクレオチド配列に挿入または欠失を導入する、ペプチド配 列に構造的または機能的な多様性を発生させる方法において、１つまたは複数の 組換え配列Ｒ３Ｓによって区切られているか、Ｒ３Ｓ配列の生物学的に活性な１ つまたは複数の誘導体によって区切られている上記ヌクレオチド配列を有するベ クターによって細胞調製物をトランスフェクションし、次いで、第２段階として Ｒａｇ−１遺伝子およびＲａｇ−２遺伝子またはこれらの誘導体の産生物を発現 可能な１つまたは複数のベクターで細胞調製物をトランスフェクションする方法 。

これらの方法によって、ヌクレオチド配列に無作為に挿入と欠失を導入すること ができる。この配列の変更によって生物学的多様性を任意に増加させることがで きる。

本発明方法は、特に従来の突然変異生成法や／％４ブリドーマによるモノクロナ ル抗体の製造法の代わりとなる点で重要である。

本発明方法で得られる抗体の調製物は純粋であるので、ノｚ４ブリドーマ以外の 方法でモノクロナル抗体ができる可能性ができたことはヒトの治療において有利 である。

「Ｎ配列」とはヌクレオチドの無作為挿入を意味する。換言すればＲ３Ｓの近傍 に既に存在していた配列の複製ではない。

このＮ配列は偶然に生成され、そのため極めて大きな多様性を示し、Ｒ３Ｓ近傍 のヌクレオチド配列とは無関係である。

「Ｐ配列」とはＲ３Ｓに近接した配列を逆方向に繰り返した挿入である。従って 、領域Ｎより多様性を小さい。

ペプチド配列に対応したヌクレオチド配列を有する１つまたは複数の組み換えベ クターをバクテリアに移して、所望の構造および／または機能を有する蛋白また はペプチドを選び出すのが好ましい。

使用する真核細胞または原核細胞に合わせて蛋白またはペプチド発現ベクターを 選択することが必要である。真核細胞の場合はプラスミドｐｃＯＮＡＩ　（Ｉｎ 　Ｖｉｔｒｏｇｅｎから市販）やＩＩＲＣ／ＣＭＶ（Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏｇｅｎか ら市販）またはプラスミドｐＢＩｕｅ　Ｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎから 市販）を用いることができる。

本発明は、さらに、免疫グロブリン、特に免疫グロブリンを構成する軽鎖および 重鎮の個別な再編成と、２つの鎖の同一細胞での共発現とにより構造および機能 が大きな多様性を示す抗体を得る方法にも関するものである。

本発明のこの方法の好ましい実施例では、免疫グロブリンの２つの鎖の各配列を 発現する多量の細胞を得ることができ、それから次の段階で、例えば所定病原体 に特異な免疫グロブリンを選び出すことができる。

使用した重鎮に対応する配列はこの鎖のＦａｂ部分のみを含み、Ｆｃ部分は後で 加えるのが好ましい。

軽鎖の再配置は、Ｒａｇ−１遺伝子およびＲａｇ−２遺伝子あるいはＲａｇ−１ 遺伝子とＲａｇ−２の産生物の生物学的に活性な誘導体または断片を合成する遺 伝子のヌクレオチド配列の存在下で行い、重鎮の再配置はＲａｇ−１遺伝子と、 Ｒａｇ−２遺伝子と、末端デゾキシヌクレオチジルトランスフェラーゼの遺伝子 あるいはＲａｇ−１、Ｒａｇ−２遺伝子またはＴｄＴの生物学的に活性な断片の ヌクレオチド配列の存在下で行うのが好ましい。

免疫グロブリンの重鎮を発現させるにはＶ、Ｄおよびｊセグメントを有するベク ターを使用し、軽鎖の場合にはＶおよびＪ配列を有するベクターを使用する。

本発明はさらにリンパ細胞、特にＴ細胞受容体のα、β、Ｔおよび／またはδ鎖 を再配列して、構造上かつ機能上の多様性が大きなＴ細胞受容体を得る方法に関 するものである。

本発明の他の対象は下記段階を有する方法にある：ａ）　多様化したいペプチド 配列をコードするヌクレオチド配列を有する１つまたは複数のベクターと、Ｒａ ｇ−１遺伝子およびＲａｇ−２遺伝子を発現するか、Ｒａｇ−１、Ｒａｇ−２お よびＴｄＴ遺伝子を発現する同一または異なる１つまたは複数のベクターとによ って細胞調製物をトランスフェクションし、ｂ）細胞調製物のベクターからＤＮ Ａを単離し、Ｃ）組み換えられなかったベクターを除去し、ｄ）　ｃ段階で得ら れたベクターで宿主細胞を形質転換し、ｅ）所望の構造および／または機能を有 する分子を発現させる宿主細胞を選び出す。

この方法は下記段階を有するのが好ましい：ａ）再配列されない軽鎖をコードす るヌクレオチド配列を有する１つまたは複数のベクターと、Ｒａｇ−１およびＲ ａｇ−２遺伝子を発現する１つまたは複数のベクターあるいはこれらの誘導体お よび／または断片とで細胞調製物を共トランスフェクションし、 ｂ）再配列されない重鎮をコードするヌクレオチド配列を有する１つまたは複数 のベクターと、末端デゾキシヌクレオチジルトランスフェラーゼの遺伝子とＲａ ｇ−１およびＲａｇ−２遺伝子を発現する１つまたは複数のベクター、その誘導 体および／または断片とで共トランスフェクションし、ｃ）　２つの細胞調製物 のベクターからＤＮＡを単離し、ｄ）組み換えられないベクターを除去し、ｅ） 　ｄ段階で得られた２つの調製物で少なくとも２つの細菌培養で形質転換し、細 菌ベクターのＤＮＡを増殖、調製し、ｆ）重鎮および軽鎖をコードする遺伝子を １つの同じベクター上へ配置し、 ｇ）　ｆ段階で得られたベクターにより宿主細胞を形質転換し、１１）完全な免 疫グロブリン分子を発現する宿主細胞を選び出す。

「宿主細胞」とは形質転換またはトランスフェクションが可能な全ての細菌また は真核細胞を意味する。

「ベクター」とは１つの細胞から別の細胞へ移ることが可能系統に合った他の任 意のベクターを用いることもできる。

Ｃ段階で得られる組み換えられていないベクターは制限エンドヌクレアーゼによ って特に認識された部位で酵素消化によって除去するのが好ましい。

ａ段階とｂ段階で用いる細胞は繊維芽細胞またはリンパ細胞が好ましいが、その 他の任意種類の細胞または真核細胞株を用いることもできる。

用いるベクターは真核細胞内で自律的に複製ができるようにするためにポリオー マの早熟型領域を含むのが好ましい。

ｈ段階での細菌の選び出しは、特定の抗体を得るための抗原と共にンヤーレに細 菌を広げ、スクリーニング（’Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ；　ａ　Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”　（Ｓａｍｂｒｏｋ　ｅｔ　ａｌ、Ｃｏ１ｄ 　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙ ｏｒｋ、１９８９）　）　Ｌ／て得られる細菌コロニーをフィルタ上で複製して 行うのが好ましい。

真核細胞で完全な免疫グロブリンを発現させ、特に、グリコジル化ができるよう に、抗体を発現させるベクターまたは所望のリンパ細胞受容体をさらにモディフ ァイすることもできる。

ａ　−ｈ段階の実施法は当業者には自明である。必要であれば”Ｍｏ１ｅｃｕｌ ａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ；　ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ″（Ｓａｍ ｂｒｏｋ達、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　 Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８９）を参照されたい。

これらの段階の実際の実施法はヒユーズ（Ｈｕｓｅ）達の論文にも記載されてい る　（Ｓｃｉｅｎｃｅ、　Ｖｏｌｕｍｅ　２４６．２７５１〜１２８１．１９８ ９）。

ａ段階で用いるベクターはこの文献に記載のλＬｃｌの断片型ＥｃｏＲＩ−Ｎｏ ｔｌのカセットを含むプラスミドｐ　Ｂｌｕｅ　５ｃｒｉｐｔにすることができ る。これは軽鎖の一定の領域に融合セグメン）ＶとセグメントＪが挿入されたも のである。セグメントＶＬとＪＬはそれらの組み換え信号配列で区切られている 。

ｂ段階の共形質転換で用いられるベクターは上記文献に記載のλｆｌｃ２の断片 型Ｎｏｔｌ−ＥｃｏＲＩのカセットを含むプラスミドｐＢｌｕｅ　５ｃｒｉｐｔ にすることができる。これは重鎮のＣＨＩ領域に融合セグメン）Ｖ、セグメント ＤおよびセグメントＪが挿入されたものである。セグメントＶＨ，ＤＨおよび、 Ｊ　Ｈはこれらの組み換え信号配列で区切られている。

ａ及びｂ段階で用いる遺伝子Ｒａｇ−１とＲａｇ−２の発現ベクトルはオティン ガー（Ｏｅｔｔｉｎｇｅｒ）達の文献（Ｓｃｉｅｎｃｅ、　２４８．１５１７〜 １５２３、１９９０）に記載のものにすることができる。

末端デゾオシキヌクレオチジルトランスフエラーゼをコードする遺伝子を有する クローニングベクターはネズミの末端デオンキリボヌクレオチドトランスフエラ ーゼの相補性ＤＮＡが挿入されたｐｃＯＮＡＩＩであるプラスミドｐＭＴｄＴに することができる。

このプラスミドは、１９９１年１２月１０日に国立微生物研究所（ｌａＣｏｌｌ ｅｃｔｉｏｎ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　ｄｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　ｄｅｓ　Ｍｉｃｒｏ ｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ）ｌこ第１　１１６０号として委託しである。このプラス ミドも本発明の対象である。

上記ヒユーズ（ｌｌｕｓｅ）達の文献には本発明で使用可能な実施方法がさらに 詳細に記載されている。

ａ段階とｂ段階で使用されるベクターはこの文献に記載のように構成されたライ ブラリーから得ることができる。

このライブラリーはλファージ、λ　Ｌｃｌ、λｆｌｃ２に由来するベクターで 軽鎖および重鎮の断片を各々クローニングして得られる。ライブラリー形成の初 期段階でクローニングに用いられるこれらのベクターを切除し、軽鎖と重鎮とに 対応するオリゴヌクレオチドの断片を含むプラスミドを生じさせることができこ れらのベクターは種々の制限部位を含み、Ｈ，Ｃｏ１１でＦａｂ断片の分泌に成 功した細菌遺伝子Ｐｅ１．Ｂのリーダーペプチドをコードする配列とりボゾーム の接続部位とを含み、λ１（ｃ２ベクターは重鎮の挿入末端Ｃにあるデカペプチ ドタグに対応する配列を含んでいる。このペプチドタグによって免疫−アフィニ ティーカラムを通過させることによって発現生成物を精製することができる。

ヒトの治療で使用した場合に抗体が生体によって拒絶される危険性を最小にする ために、重鎮のライブラリー作製の基礎となるＤＮＡはヒトのＤＮＡにするのが 好ましい。

ｆ段階は重鎮および軽鎖をコードする遺伝子の同じベクターで行われ、上記ヒユ ーズ（ｌｌｕｓｅ）達の文献の第１２７８頁に記載の方法で実行することができ る。

すなわち、１つの部位のみを切断する制限エンドヌクレアーによって軽鎖のライ ブラリーを消化し、得られた端部５°を脱ホスホリル化し、次いで１つの部位の みを切断する別の制限エンドヌクレアーゼＥｃｏ　Ｒ１で産生物を消化する。

重鎮のライブラリーを構成するベクターのＤＮＡはエンドヌクレアーゼｔｌｉｎ ｄ−Ｉ１１で分割し、次いで、脱ホスホリル化し、エンドヌクレアーＥｃｏ　Ｒ １で消化する。

こうして調製したＤＮＡを混合し、連結反応（Ｉ　ｉｇａｔｉｏｎ）で連結する 。

連結反応後、重鎮のライブラリーに由来する断片と、軽鎖のライブラリーに由来 する断片とを組み合わせて得られたクローンのみで生育力のあるファージを再形 成する。

重鎮と軽鎖のライブラリーは生体細胞またはハイブリドーマから単離されたメツ センジャーＤＮＡの調製物を用いて構成することもできる。その場合には、対応 する相補性ＤＮＡをＰＣＲによって増加系内で合成する。この方法は当業者に周 知であり、上記＝Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｙ　Ｍａｎｕａｌ’（Ｓａｍｂｒｏｋ達、１９８９　）に記載されている。

ｈ段階の完全な分子を発現させる細菌のスクリーニングの後には所望の分子を合 成するクローンのスクリーニング段階が来る。

こうして得られた重鎮と軽鎖の部分の組み合わせ物からＦａｂ断片を得ることが できる。Ｐｃ断片をコードできるようにベクターを変える。このベクターの発現 生成物が抗体である。

抗体を合成するクローンのスクリーニングで用いる方法はバラニトロフェニルホ スホンアミデート（ＮＰＮ）と逆の方向ヲ向く抗体を合成するクローンのスクリ ーニングでヒユーズ（ｆｌｕｓｅ）達が用いた方法（前掲）にすることができる 。

この文献で用いている方法は、ニトロセルロースシート上でゲル化された培地に クローンを二重に拡げ、　＋２Ｓ（でマーキングしたウシのアルブミン血清と結 合したＮＰＮのハイブリッド化をテストする方法である。

本発明の別の対象は、本発明方法で得られた生成物を含む薬理組成物、医薬およ び診断薬にある。

特に、ウサギまたはネズミ起源の遺伝子を有する組み換えプラスミドでトランス フェクションされた真核細胞または原核細胞での発現産生物は人間または獣医学 での診断具（ｃｏｆｆｒｅｔ）として利用することができる。

本発明のさらに他の対象は、本発明方法で得られる免疫原性組成物と抗体にある 。

以下、本発明の詳細な説明するが、本発明が下記実施例に限定されるものではな い。

第１図は繊維芽細胞Ｎ　Ｉ　Ｈ−３Ｔ３でｐ　Ｒａｇ−１およびｐ　Ｒａｇ−２ を共トランスフェクション（ｃｏｔｒａｎｓｆｅｃ’ｔｉｏｎ）　Ｌ／た後にプ ラスミドρＢＩｕｅＲｅｃに形成された接合配列を示す図。

第２図は繊維芽細胞Ｎｌ８−３Ｔ３でＲａｇ−１、Ｒａｇ−２およびＴｄＴをコ ードするベクターを共トランスフェクションした後にプラスミドρ旧ｕｅ　Ｒｃ ｃに形成された接合配列を示す図。

第３図は細胞株ＢＷＩＪ、　Ｃｌ−１０−ＫｌおよびＡ９においてＲａｇ−１お よびＲａｇ、−２をコードするベクターで共トランスフェクションした後にプラ スミドｐＢＩｕｅＲｅｃに形成された接合配列を示す図。

これら３つの図では、組み換え後のプラスミド配列を元のプラスミド配列ｐＢｌ ｕｃＲｅｃ　（図の上から数えて第１番目の配列）と整合させて示しである。

これら３つの図では、Ｐ型挿入と仮定されたヌクレオチドは図の中央部分で下線 を付けてあり、Ｎ型挿入には下線が付けてない。削除は点線で示しである。

ネズミの胎児繊維芽細胞Ｎｌｌ＋−３Ｔ３　（ＡＴＣＣＣＲＬ　６４４２）とＬ 細胞から誘導すした細胞Ａ　９　（ＡＴＣＣＣＲＬ　６３１９）！−１子牛（Ｄ 胎児血ａ１０％と共に相補性ＤＭＥＭで培養した。

ネズミのへブタトーマ（ｈｅｐｔａｔｏｍｅ）細胞Ｂｌ’ｌｌＪはカッジオとヴ アイスの方法で培養した（Ｃａｓｓｉｏ　Ｄ、、　Ｗｅｉｓｓ　Ｍ、Ｃ，、”　 ＳｏｍａｔＣｅｌｌ　Ｇｅｎｅｔ’　５．７１９〜７３８．１９７９）。

中国ハムスターの卵巣細胞Ｃｌｌ０−Ｋｌ　（ＡＴＣＣＣＣＬ　６１）は子牛の 胎児の血清１０％と共に相補性ＤＭＥＭで培養した。

ブレＢ　ＢＡＳＰ−１細胞（Ｃｈｏｑｕｅｔ達、５ｃｉｅｎｃｅ　２３５．１２ １１〜１２１４゜１９８７＞は子牛の胎児の血清１０％とβ−メルカプト−エタ ノール５０μｍと共に相補性ＲＰＭＩで培養した。

ネズミの末端デゾキシヌクレオチジル トランスフェラーゼをコードする遺伝子のクローニングオーフレーとルージョン （Ａｕｆｆｒａｙ、　Ｒｏｕｇｅｏｎ）の方法（ＥｕｒｏｐｅＪ、Ｂｉｏｃｈｅ ｍ、　１０７．３０３〜３０４．１９８０＞で５週齢のネズミの胸腺からＲＮＡ を調製した。なお、６Ｍ尿素の代わりに４Ｍグアニジンチオシアネートを用いた 。

ポリ−Ａ　ＲＮＡはオリゴＤＴセルロースクロマトクラフィを用いて精製し、ノ ザンブロッティング法で分析した。−重鎮はＭＭＬＶの逆トランスクリブターゼ （ＢＲＬから市販）を用いてオリゴＤＴで初期化したボＩＪ−Ａ　ＲＮＡ５μｇ から合成した。

二重鎖はＤＮＡポリメラーゼ１とＲＮａｓｅ　Ｉｆの存在下で合成した。

末端ＢｓｔＸＩを有する二重鎖アダプターは十分に調製したｃＤＮＡに接続し、 ｐ　ＣＤＮＡ　２　（Ｉｎ　Ｎｉｔｒｏｇｅｎから市販）のＢｓｔｘ１制限部位 でクローニングした。

ネズミの胸腺の相補性ＤＮＡのライブラリーはネズミのＴｄＴの相補性ＤＮＡ配 列の１２１−１４２配列および１４７１−１４９４配列に対応する２つのオリゴ ヌクレオチドの混合物でスクリーニングした。

ネズミのＴｄＴをコードする遺伝子を完全に含むだけの十分な長さを有すると考 えられる正の相補性ＤＮＡクローンをジブジキシ末端化法で２重鎮上に配列する （Ｓａｎｇｅｒ達、ＰＮＡＳ、　７４．５４６３〜５４６７、１９７７）。

使用したベクター プラスミドｐＢＩｕｅＲｅｃは、カレンバック　（Ｋａ　Ｉ　Ｉｅｎｂａｃｈ） 達、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　１ｇ、　６７３０．１９ ９０）に記載されている。

ｐ　Ｒａｇ−１およびｐ　Ｒａｇ−２はオディンガー（Ｏｅｔｔ　ｌｎｇｅｒ） 達の方法（前掲）で得た。

ネズミのＴｄＴの相補性ＤＮＡＨｐＣＤＮＡ１でクローニングした。Ｒａｇ−１ 、Ｒａｇ−２およびＴＤＴはＣＭＶプロモータの制御下で発現させた。

特異的組み換えの証明 トランスフェクションはチュー（Ｃｈｕ）達の指示に従ってエレクトロボレージ ョンで行った（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｒｅｓ、　１５ ゜１３１１〜１３２６．１９８７＞。

２Ｘ１．０’の細胞を、６ｔｔｇのｐ　Ｒａｇ−１または４．８ｔｔｇのｐＲａ ｇ−２と一緒またはそれ無しで、２，５１１ｇのｐＢＩｕｅＲｅｃでトランスフ ェクションした。

Ｎ領域へのＴｄＴの効果を測定するためにＴｄＴの発現ベクター４．５μｇを上 記の３つのベクターに加えた。

３７℃で４０〜４８時間培養した後に細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄し、ビルンボ イム止ドリー（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ　、　Ｄｏｌｙ）の方法（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃ ｉｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、７．　１５１３〜１５２３．　１９７９）でプラスミ ドＤＮＡを調製した。

ＤＮＡ残滓を殺菌水２０μｌに再懸濁させ、複製されていないプラスミドを除去 するためにＤＮＡ溶液７μｌをＤｐｎ　Ｉで消化した。

４０ｔｔ（ｌのコンピテント細菌ｘ１，１−ロ１ｕｅ　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ 社から市販）をエレクトロポレーションによって形質転換し、ＸＧａ１　（８０ μｇ／献＞　、ＩＰＴＧ（１５０μＭ）　、７；／ビシ’）　７　（１００μｇ ／ａｆ）およびテトラシフリン（１０μｇ／ｒｎ！！、）を含むアガーＬＢ上に 拡げる。

組み換え頻度はクローン総数に対する旧ｕｅのコロニー量×３として計算される 。

組み換えクローンの配列決定 旧ＩＪｅのコロニーを複製し、ＸＧａ１、ＩＰＴＧ、アンピシリンおよびテトラ シフリンを含むアガーＬＢ上で単離した。

ＤＮＡの調製はサムプロッタ（Ｓａｍｂｒｏｃｋ）達の方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａ ｒｃｌｏｎｉｎｇ、前掲のラボラトリイマニュアル）で行い、次いで室温で２時 間、ＲＮａｓｅで処理した後、二重鎖の配列決定を行った。

繊維芽細胞Ｎｌｌ＋−３７３でのＲａｇ−１およびＲａｇ−２による組み換え活 性を一時的トランスフェクションでテストした。

ｐ　Ｒａｇ−Ｉ　Ｌｐ　Ｒａｇ−２を組み換え用プラスミド基質ｐＢｌｕｅＲｅ ｃで繊維芽細胞Ｎ１１１３で共トランスフェクションした。

４８時間後、プラスミドＤＮＡを単離し、Ｅ、　Ｃｏ１１で組み換えテストをし た。

ｐＢｌｇｅＲｅｃの配列ＬａｃＺが両側に２つのＲ３Ｓを有する２８０組の塩基 対のＤＮＡ断片で中断された。

この部位特異的再配列は挿入を無くし、３回に１回は正確な読出しフレームを復 元し、Ｂ、　Ｃｏ１１の形質転換で青色のクローンを生じさせる。

このテストは迅速に行えるので、多数の再配列を検査するこまができる。

ｐ　Ｒａｇ−１またはｐ　Ｒａｇ−２単独でのトランスフェクション実験では組 み換えクローンはできない。

第１表に示すように、２つのプラスミドを共トランスフェクションした時に組み 換え頻度が大きくなるのが観察され、その組す換え頻度（幾何平均−１，２６） は、Ｂプレ細胞ＢＡＳＰＩでの組み換えの基質のトランスフェクション後に観察 される頻度（幾何平均＝　１．４６）に匹敵する。

繊維芽細胞をｐ　Ｒａｇ−１およびρＲａｇ−，７で組換えて変化させた後に形 成されるコード接合を、リンパ細胞中で観察される接合と比較するため、細胞Ｎ ｌｌ＋−３Ｔ３のトランスフェクションで得られた再配列後のプラスミド上での 接合の配列決定をした。

第１図に示した配列は互いに独立し、た組み換え要素、すなわち互いに異なるト ランスフェクション実験で得られた要素を示している。

１７の接合のうち、７つの接合には欠失も挿入もない。

４つの接合は片側が欠失し、別の４つの接合は両側が欠失する。

１゛つの接合のみに２組の塩基対がＰ型に挿入され、それと共にこの接合の片側 で２組の塩基対が欠失する。

最後の接合では１組の塩基対が欠失し、ヌクレオチドが加わっている。これはへ ブタメールに起因するものと考えられ、恐らく切除が不正確であったためと考え られる。

実施例２ ブレＢ細胞またはブレＴ細胞で観察される接合の多様性を再構成するために、繊 維芽細胞Ｎｌｌ＋−３７３をＴｄＴ発現ベクターおよびｐ　Ｒａｇ−１、ｐ　Ｒ ａｇ−２およびｐＢＩｕｅＲｅｃでトランスフェクションした。

組ろ換えプラスミドの配列決定をした。

Ｔｃ１Ｔの相補性ＤＮＡ無しにＰＣＤＮＡＩベクターで行った対照トランスフェ クションではＮ領域に全く挿入されなかった。

第２図は８８％の接合がＮ領域に挿入されたことを示している。

Ｎ領域の大部分は１〜４のヌクレオチドを有し、接合によるヌクレオチドの平均 は３個である。

しかし、例外的に１８のヌクレオチドが挿入された場合も観察される。

ＴｄＴは他のヌクレオチドよりＧをより効率的に含む。この実験ではＰ型のヌク レオチド挿入頻度が大きくなるようである。

しかし、それらをＮ領域から区別することは不可能であることに注意しなければ ならない。

上記２つの実施例は、相対的に差が無い細胞（繊維芽細胞Ｎ１１ｌ−３Ｔ３）で Ｒａｇ−］およびＲａｇ−２が組み換え活性を示すことを示している。

本実施例では、互いに異なる状態にある細胞でのこれら２っの遺伝子の活性をテ ストした。

第２表は細胞株ＢＷＩＪ　、　Ｃｌ０−ＫｌおよびＡ９で得られた結果を示して いる。

細胞株が違うと変化が見られるが、驚くべきことに、細胞株ＢＷＩＪ　とＣ１１ ０−に１での組換え頻度は繊維芽細胞３Ｔ３で得られる頻度より明らかに大きい 。

再配列は　ｐＢｌｕｅＲｅｃＳｐ　Ｒａｇ−１および　ｐ　Ｒａｇ−２で共トラ ンスフェクションしてから１３時間後に検出できる。

組み換えプラスミドの配列決定によって、３つのテストした細胞株ではコード接 合で欠失が起こることが示された（第３図）。

Ｐ形のヌクレオチドの挿入は細胞株Ａ９のトランスフェクションで得られた組み 換えクローンの接合にのみ見られた。

上記の各結果は、細胞株の種類とは無関係にｐ　Ｒａｇ−１およびｐ　Ｒａｇ− ２の共トランスフェクションによってヌクレオチドが欠失することを示している 。さらに、ラファイユ（Ｌａｒａｉｌｌｅ）達が定義するＰ型のヌクレオチド挿 入が観察される（Ｃｅｌｌ、　５９．８５９〜８７０．１９８９＞。

また、細胞株の種類とは無関係にＰ　ｉｌａｇ−１、Ｐ　Ｒａｇ−２およびＴｄ ＴＯ共発現でＮ型が挿入されることが分かる。

これらの結果は、Ｒａｇ−１およびＲａｇ−２で部位特性的組み換えを誘導する のに十分であるが、免疫グロブリンおよびリンパ細胞受容体の合成の多様性の発 現を現すＮ型挿入を得るためには、Ｒａｇ−１＃よびＲａｇ−２の組み合わせと ＴｄＴの存在が必要であることを示している。

ｆ’ｉｇｕｒｅ　１ ＣＣＧＣＴＣＴ／−、Ｇλ入Ｃ″：λＧＴＳＧλＴＣＣ−Ｃ入Ｃ入ＧＴＧ〜（１ ２）（２二）−ＣλＣＴＧ丁Ｇ−ＧＴＣＧ入に了ＣＧ入ＧＧＧＧＦｉｇｕｒｅ　 ２ ＣＣＧＣＴＣＴ：、Ｇλ；、ＣＴＡＧ了ＧＧλ丁ＣＣ−０入ｃｙｓｃ：ｃ−＋　 １２１１２３１−ＣＡＣＴＧＴＧ−ＧＴＣＧ：、ＣＣＴＣＧ入ＧＧＧＧＦｉｇｕ ｒｅ　３ 国際調査報告 一□、ＰＣＴ／ＦＲ９２１０１１７８ 、ＰＣＴ／ＦＲ９２１０１１７Ｂ 、、　ＰＣＴ／ＦＲ９２１０１１７８

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. １．Ｒａｇ−１遺伝子およびＲａｇ−２遺伝子あるいはＲａｇ−１遺伝子および Ｒａｇ−２遺伝子の生産物の生物学的に活性な断片または誘導体を合成すること ができる遺伝子と、ＴｄＴをコードする遺伝子あるいは生物学的に活性なその断 片または誘導体とを有するヌクレオチド配列を含む組成物。
2. ２．ヌクレオチド配列がベクターに支持されている請求項１に記載の組成物。
3. ３．プラスミドｐＢＩｕｅＲｅｃと、ｐＲａｇ−１と、ｐＲａｇ−２とを含む組 成物。
4. ４．Ｒａｇ−１遺伝子およびＲａｇ−２遺伝子の発現生成物と、末端デゾキシヌ クレオチジルトランスフェラーゼあるいは生物学的に活性なその断片または誘導 体とを相乗効果が生じる量だけ組み合わせて含む組成物。
5. ５．ペプチド配列をコードするヌクレオチド配列でヌクレオチドを無作為に欠失 または挿入させることによってペプチド配列に構造的または機能的な多様性を発 生させる方法において、Ｒａｇ−１遺伝子、Ｒａｇ−２遺伝子および末端デゾオ キシヌクオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）またはこれらの誘導体の産生物 を発現することが可能な１つまたは複数のベクターと、組換え配列ＲＳＳによっ て区切られるか、ＲＳＳ配列の生物学的に活性な誘導体によって区切られた上記 ヌクレオチド配列を有する同一または異なるベクターとによって細胞調製物をト ランスフェクションすることを特徴とする方法。
6. ６．ペプチド配列をコードするヌクレオチド配列でヌクレオチドを無作為に欠失 または挿入させることによってペプチド配列に構造的または機能的な多様性を発 生させる方法において、１つまたは複数の組み換え配列ＲＳＳによって区切られ ているか、ＲＳＳ配列の生物学的に活性な１つまたは複数の誘導体によって区切 られている上記ヌクレオチド配列を有するベクターによって細胞調製物をトラン スフェクションし、次いで、第２段階としてＲａｇ−１遺伝子、Ｒａｇ−２遺伝 子および末端デゾオキシヌクオチジルトランスフェラーゼまたはそれらの誘導体 の産生物を発現可能な１つまたは複数のベクターで細胞調製物をトランスフェク ションすることを特徴とする方法。
7. ７．組み換え配列ＲＳＳに近接した配列を逆方向に繰り返すことによってペプチ ド配列に対応するヌクレオチド配列に挿入または欠失を導入する、ペプチド配列 に構造的または機能的な多様性を発生させる方法において、 Ｒａｇ−１遺伝子およびＲａｇ−２遺伝子またはこれらの誘導体の産生物を発現 することが可能な１つまたは複数のベクターと、組み換え配列ＲＳＳによって区 切られるか、ＲＳＳ配列の生物学的に活性な誘導体によって区切られた上記ヌク レオチド配列を有する同一または異なるベクターとによって細胞調製物をトラン スフェクションすることを特徴とする方法。
8. ８．組み換え配列ＲＳＳに近接した配列を逆方向に繰り返すことによってペプチ ド配列に対応するヌクレオチド配列に挿入または欠失を導入する、ペプチド配列 に構造的または機能的な多様性を発生させる方法において、 １つまたは複数の組み換え配列ＲＳＳによって区切られているか、ＲＳＳ配列の 生物学的に活性な１つまたは複数の誘導体によって区切られている上記ヌクレオ チド配列を有するベクターによって細胞調製物をトランスフェクションし、次い で、第２段階としてＲａｇ−１遺伝子およびＲａｇ−２遺伝子またはこれらの誘 導体の産生物を発現可能な１つまたは複数のベクターで細胞調製物をトランスフ ェクションすることを特徴とする方法。
9. ９．ペプチド配列に対応するヌクレオチド配列を有する１つまたは複数の組み換 えベクターをバクテリアにトランスフェクションして所望の構造および／または 機能を有する蛋白を選ぶ請求項５〜８のいずれか一項に記載の方法。
10. １０．軽鎖と重鎖の個別の再配列と、２つの鎖の共発現とによる極めて多様な構 造および機能を有する免疫グロブリン、特に抗体を得るための請求項５〜９のい ずれか一項に記載の方法。
11. １１．Ｔ細胞受容体のα、β、γおよび／またはδ鎖の再配列によって極めて多 様な構造および機能を有するリンパ細胞、特にＴ細胞受容体を得るための請求項 ５〜９のいずれか一項に記載の方法。
12. １２．軽鎖の組み換えを、Ｒａｇ−１遺伝子およびＲａｒ−２遺伝子あるいはＲ ａｇ−１遺伝子およびＲａｇ−２遺伝子の産生物の生物学的に活性な誘導体また は断片を合成する遺伝子のヌクレオチド配列の存在下で行う請求項１０に記載の 方法。
13. １３．重鎮の組み換えを、Ｒａｇ−１遺伝子、Ｒａｇ−２遺伝子および末端デゾ キシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子の存在下あるいはＲａｇ−１、Ｒ ａｇ−２およびＴｄＴの生物学的に活性な誘導体または断片を合成する遺伝子の ヌクレオチド配列の存在下で行う請求項１０に記載の方法。
14. １４．下記の段階で構成される請求項５〜８のいずれか一項に記載の方法： ａ）多様化したいペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を有する１つまた は複数のベクターと、Ｒａｇ−１遺伝子およびＲａｇ−２遺伝子を発現するか、 Ｒａｇ−１、Ｒａｇ−２およびＴｄＴ遺伝子を発現する同一または異なる１つま たは複数のベクターとによって細胞調製物をトランスフェクションし、ｈ）細胞 調製物のベクターからＤＮＡを単離し、ｃ）組換えされなかったベクターを除去 し、ｄ）ｃ段階で得られたベクターで宿主細胞を形質転換し、ｅ）所望の構造お よび／または機能を有する分子を発現させる宿主細胞を選び出す。
15. １５．ペプチド配列がリンパ細胞受容体のα、β、δまたはγ鎖あるいはその断 片または誘導体である請求項１４に記載の方法。
16. １６．下記の段階で構成される請求項１０、１２、１３のいずれか一項に記載の 方法： ａ）再配列されない軽鎖をコードするヌクレオチド配列を有する１つまたは複数 のベクターと、Ｒａｇ−１およびＲａｇ−２遺伝子を発現する１つまたは複数の ベクターあるいはこれらの誘導体および／または断片とで細胞調製物を共トラン スフェクションし、 ｂ）再配列されない重鎖をコードするヌクレオチド配列を有する１つまたは複数 のベクターと、末端デゾキシヌクレオチジルトランスフェラーゼの遺伝子とＲａ ｇ−１およびＲａｇ−２遺伝子を発現する１つまたは複数のベクター、その誘導 体および／または断片とで共トランスフェクションし、ｃ）２つの細胞調製物の ベクターからＤＮＡを単離し、ｄ）組み換えられないベクターを除去し、ｅ）ｄ 段階で得られた２つの調製物で少なくとも２つの細菌培養で形質転換し、細菌ベ クターのＤＮＡを増殖、調製し、ｆ）重鎖および軽鎖をコードする遺伝子を１つ の同じベクター上へ配置し、 ｇ）ｆ段階で得られたベクターにより宿主細胞を形質転換し、ｈ）完全な免疫グ ロブリン分子を発現する宿主細胞を選び出す。
17. １７．ｃ段階で得られる組み換えられないベクターを酵素消化で除去する請求項 １６に記載の方法。
18. １８．細胞調製物が繊維芽細胞またはその他任意の真核細胞である請求項１６に 記載の方法。
19. １９．国立微生物研究所【配列があります】に第Ｉ１１６０号として委託された 末端デゾキシリポヌクレオチジルトランスフェラーゼの遺伝子を有するプラスミ ドｐＭＴｄＴ。
20. ２０．末端デゾキシリポヌクレオチジルトランスフェラーゼを発現するベクター が請求項１９に記載のプラスミドである請求項１６に記載の方法。
21. ２１．請求項４〜１８、２０のいずれか一項に記載の方法で得られた少なくとも １種の蛋白またはペプチドを有効量と、薬学的に許容される１種または複数の希 釈剤または佐剤とを含む薬理組成物。
22. ２２．請求項４〜１８、２０のいずれか一項に記載の方法で得られた少なくとも １種の蛋白またはペプチドを含む医薬。
23. ２３．請求項４〜１８、２０のいずれか一項に記載の方法で得られた少なくとも １つの蛋白またはペプチドを含む診断薬。
24. ２４．請求項２２に記載の少なくとも１種の医薬を含む診断具。
25. ２５．請求項４〜１８、２０のいずれか一項に記載の方法で得られた少なくとも １種の蛋白またはペプチドを含む免疫原性組成物。
26. ２６．請求項４〜１８、２０のいずれか一項に記載の方法で得られた抗体。