ES2255253T3 - Metodo de fase solida para determinaciones de antigeno y de anticuerpos en serologia de grupo sanguineo y equipo de pruebas. - Google Patents
Metodo de fase solida para determinaciones de antigeno y de anticuerpos en serologia de grupo sanguineo y equipo de pruebas.Info
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Abstract
Método para determinar en una muestra un analito, seleccionado entre un antígeno de grupo sanguíneo presente en eritrocitos o un anticuerpo que se une a dicho antígeno de grupo sanguíneo, que comprende el tratamiento de la muestra en una zona de incubación de un recipiente de reacción con un reactivo que contiene un asociado de unión al analito, cuyo asociado de unión al analito, en el caso en el que el analito es un antígeno de grupo sanguíneo presente sobre eritrocitos, es un anticuerpo capaz de unión al antígeno del grupo sanguíneo, y en el caso en el que el analito es un anticuerpo de unión a un antígeno de grupo sanguíneo, es el antígeno de grupo sanguíneo presente sobre eritrocitos, de manera que, en la zona de incubación, si la muestra contiene el analito, se forma un complejo de antígeno de grupo sanguíneo presente sobre eritrocitos y anticuerpo unido al mismo, o bien un complejo de un antígeno de grupo sanguíneo presente en eritrocitos y anticuerpo unido al mismo, así como un complejo de factores complementarios unidos a estos eritrocitos si el anticuerpo se une a complementos, comprendiendo, además, la separación de eritrocitos, formando complejo o no, con respecto a anticuerpos no unidos, utilizando un medio de separación situado en el recipiente de reacción bajo la zona de incubación, de una densidad superior a la del fluido que contiene los anticuerpos, pero inferior a la densidad de los eritrocitos, de manera que los eritrocitos pasan a través del medio de separación y los anticuerpos no unidos permanecen en la zona de incubación, separando los eritrocitos que forman complejo de los eritrocitos que no forman complejo al unir los eritrocitos que forman complejo en una zona de inmovilización del recipiente de reacción, descargando los eritrocitos que no forman complejo a una zona de recogida del recipiente de reacción, y detectando los eritrocitos en la zona de inmovilización y/o zona de recogida, de manera que dicha zona de inmovilización comprende una matriz degel que lleva anticuerpo de unión a IgM o fragmento de anticuerpo, unido a la matriz de gel por unión covalente directa o por intermedio de un brazo separador.
Description
Método de fase sólida para determinaciones de
antígeno y de anticuerpos en serología de grupo sanguíneo y equipo
de pruebas.
La presente invención se refiere al sector de la
serología de grupos sanguíneos y se refiere más particularmente a
un método y equipo de pruebas para determinar antígenos de grupo
sanguíneo o anticuerpos dirigidos a los mismos en una muestra.
El objetivo de los ensayos de grupo sanguíneo y
de examen de anticuerpos en trabajo clínico consiste,
frecuentemente, en obtener preparados compatibles de eritrocitos
para transfusión. La invención se refiere a la detección e
identificación de anticuerpos y de antígenos y se puede utilizar
para ensayo de grupo sanguíneo, rastreo de anticuerpos y su
identificación, y para llevar a cabo pruebas cruzadas. La prueba no
se basa en la hemoaglutinación, sino en el principio de fase sólida
que no comporta etapas de lavado.
Las reacciones de transfusión de sangre que son
inducidas por alo-anticuerpos con respecto a
eritrocitos se llaman reacciones de transfusión hemolíticas porque
se ven acompañadas en su mayor parte por un fraccionamiento, con
frecuencia muy fuertemente acelerado, de los eritrocitos. El
objetivo consiste por lo tanto en prevenir reacciones de
transfusión hemolíticas mediante un cuidadoso examen del grupo
sanguíneo.
Los anticuerpos de grupo sanguíneo son casi
siempre inmunoglobulinas de los tipos IgG o IgM. La interacción
antígeno-anticuerpo depende entre otras cosas del
enlace iónico, puentes de hidrógeno y efectos hidrofóbicos
(desplazamiento de agua). La resistencia de la unión entre un lugar
de unión de un anticuerpo y un epítope se designa como
"afinidad". Los anticuerpos que son capaces de aglutinar
eritrocitos en todas las condiciones son llamados aglutininas o
anticuerpos completos (principalmente IgM). Los anticuerpos que se
unen a los eritrocitos pero no proporcionan aglutinación
(sensibilización) se llaman anticuerpos incompletos (principalmente
IgG).
Existe una amplia variedad de pruebas
serológicas. Las técnicas más importantes en la actualidad son el
método del tubo, la prueba de columna y pruebas en placas de
microtitulación. Se puede hacer una distinción entre técnicas que
se basan en hemoaglutinación y técnicas que se basan en el principio
de base sólida.
La prueba con tubo de ensayo es una prueba
utilizada de manera amplia en la que son posibles también
incubaciones prolongadas con anticuerpos. Los eritrocitos, después
de la reacción con anticuerpos, pueden ser sedimentados o
centrifugados para acelerar la reacción de aglutinación. Una prueba
importante y ampliamente aplicada es la prueba de la antiglobulina
o prueba de Coombs. La prueba de antiglobulina se basa en el
principio de que los eritrocitos cargados, por ejemplo, con
anticuerpos de tipo IgG pueden ser aglutinados por el suero
antiglobulina. En la prueba se pueden distinguir tres fases. La
primera fase es la fase de sensibilización. Durante esta fase los
anticuerpos se unen a las estructuras de antígeno correspondientes
de los eritrocitos (sensibilización de eritrocitos).Cuando la unión
es óptima la segunda fase, es decir, la fase de lavado, tiene lugar.
En esta fase todos los anticuerpos no unidos son retirados de la
mezcla de incubación. La retirada insuficiente de los anticuerpos
no unidos puede llevar a la inactivación del suero de antiglobulina
por el hecho de que dichos anticuerpos se unen a la antiglobulina.
La tercera fase es la fase antiglobulina, en la que la antiglobulina
es añadida a las células sensibilizadas y lavadas, de manera que
las células sensibilizadas son acopladas entre sí (aglutación de
los eritrocitos).
Una simplificación adicional de las pruebas
serológicas ha sido llevada a cabo por la centrifugación de los
eritrocitos en una columna de gel (Sephadex) o gránulos de cristal.
La utilización de partículas transparentes, inertes, sólidas, para
distinguir los aglutinados y no aglutinados ha sido ya descrito por
Dalton y otros en 1970 (Becton, Dickinson & Co. Patente USA
3.492.396). El sistema por el que el material de gel es utilizado
para la detección de las reacciones de
eritrocito-anticuerpo ha sido descrito por LaPierre
y otros (Transfusion 1990; 30: 109-113, Patentes
Europeas 0 194 212 y 0 305 337). En este sistema de prueba se
utilizan pequeñas columnas llenas de gel Sephadex. Se pueden
utilizar columnas que no contienen anticuerpos (por ejemplo, para
tipificación ABO inversa). Como segunda posibilidad una columna de
gel puede contener también anticuerpos que son dirigidos a ciertos
antígenos de eritrocitos (por ejemplo, para tipificación). Para la
prueba antiglobulinas, se utilizan columnas de gel que contienen
suero de antiglobulina. Después de una incubación las columnas de
gel son centrifugadas. En el caso de una reacción negativa todos los
eritrocitos terminarán en el fondo del tubo; si la prueba es
positiva, los aglutinados de eritrocitos serán captados en la parte
superior o en el propio gel. En el caso de reacciones débiles, los
eritrocitos se sedimentarán parcialmente.
Una ventaja principal de esta prueba es que en el
caso de la prueba de antiglobulina no son necesarias etapas de
lavado, dado que durante la centrifugación tiene lugar la separación
de eritrocitos y suero o componentes de plasma. Una segunda ventaja
consiste en el hecho de que los resultados de la prueba puedan ser
fijados de manera apropiada. La prueba descrita se utiliza por
DiaMed AG (Sistema de Microtipificación
DiaMed-ID).
Una desventaja de esta prueba es que ocurren
frecuentemente problemas en la demostración de aglutinados débiles,
por ejemplo en el caso de incompatibilidades ABO débiles
(Cummins&Downham, Lancet 1994; 343: 1649 and Philips y otros,
Transfusion Medicine 1997; 7:47-53), posiblemente
por el hecho de que las llamadas "fuerzas de cizalladura"
durante la centrifugación provocan que los aglutinados más grandes
se desintegren en varios aglutinados pequeños, o en un caso
extremo, en eritrocitos individuales (sensibilizados). A pesar de la
acción de criba del gel solamente se observan entonces reacciones
desde débiles a negativas, resultando en un incremento del número
de reacciones falsas-negativas.
Otro enfoque es la utilización del principio de
fase sólida como alternativa a las reacciones directas e indirectas
de aglutinación para ensayo de grupo sanguíneo, rastreo de
anticuerpos, identificación de anticuerpos y pruebas cruzadas. Se
han descrito la aplicación y ventajas de la utilización de técnicas
de fase sólida en los sectores mencionados por Rosenfield
(Abstracts, 15th Cong. Int. Soc. Blood Trans., París pp.
27-33, 1976 Patente US 4.275.053, 1981). En este
caso, se utilizaron, entre otros, eritrocitos que habían sido
acoplados a la superficie de tubos de plástico. Más recientemente,
se han descrito sistemas por Plapp y otros (Am. J. Clin. Path. 82:
719-721, 1984), Bayer y otros (Patente US 4.608.246,
1986), Rachel y otros(Transfusion 25: 24-26,
1985), Plapp y otros (The Lancet 1465-1466, 1986) y
Uthemann y otros (US Patent 4.925.786, EP 363 510 y Transfusion 30:
114-116, 1990). Placas de microtitulación en
combinación con el principio de fase sólida son utilizadas entre
otros por Biotest AG (Solidscreen II para diagnóstico de
anticuerpos), Immucor Inc. (Sistemas de inmunocaptura
Capture-R para rastreo de anticuerpos y su
identificación) y CLB (Microtipo para tipificación de antígenos de
eritrocitos) y se han descrito además por Llopis y otros (Vox
Sanguinis 1996; 70:152-156 y Vox Sanguinis 1997;
72:26-30), Ohgama y otros (Transfusion Medicine
1996; 6:351-359), Chateau y otros (La Gazette de la
Transfusion 1997; 131:38-41, FR 94 05123) y Den Boer
y otros
(WO 98/02752).
(WO 98/02752).
Las pruebas de fase sólida no están limitadas a
placas de microtitulación. Pernell (Sanofi Pasteur, EP 0 594
506)describe una prueba de gel de afinidad en la que una
sustancia de unión de inmunoglobulina (tal como proteína A,
proteína G o IgG anti-humano) es inmovilizada sobre
el gel. La incubación de eritrocitos y de anticuerpos tiene lugar
sobre el gel. Después de esa fase de incubación tiene lugar la
centrifugación de la columna de gel. Si los anticuerpos están
unidos a los eritrocitos, estos eritrocitos sensibilizados se unirán
al material del gel de unión con la inmunoglobulina y por lo tanto
se unirán a la parte superior de la columna de gel. Las células a
las que no se han unido anticuerpos, no quedarán unidas y terminarán
en el fondo de la columna. Este principio de unión de células
sensibilizadas a una fase sólida ha sido descrita con anterioridad
por Pharmacia (Cell Affinity Chromatography; Uppsala, Suecia;
1984). Pharmacia describe en dicho documento la purificación de
eritrocitos en base a la presencia o ausencia de ciertos antígenos
del grupo sanguíneo utilizando la proteína
A-sefarose 6MB. Los eritrocitos con el antígeno A en
la superficie (eritrocitos de grupo sanguíneo A) a los que están
unidos anticuerpos A, pueden ser separados por unión a dicho
material de gel (a través de la proteína A)a partir de
eritrocitos que no poseen el antígeno A. La prueba descrita por
Sanofi Pasteur es por lo tanto una combinación de este principio y
la etapa de centrifugación para separar eritrocitos, tanto si se
utilizan anticuerpos sensibilizados o no y anticuerpos no unidos,
por ejemplo, en el sistema de columna de DiaMed.
Una desventaja de la prueba de gel de afinidad
que se ha descrito, en la que los ligandos descritos son proteína
A, proteína G o una antiglobulina, es que no hay factores
complementarios unidos. Algunos anticuerpos se unen a complementos
(por ejemplo, anticuerpos anti-Jk): la unión de una
única molécula de anticuerpo a un antígeno de eritrocito específico
conduce a la unión de muchas moléculas complementarias sobre la
membrana del eritrocito. Como consecuencia, muchos
alo-anticuerpos, por ejemplo, pueden ser demostrados
con una sensibilidad mucho mayor con anticuerpos
anti-complemento que con anticuerpos
anti-inmonuglobulina. En realidad se han descrito
muchos ejemplos de anticuerpos que podrían ser demostrados
exclusivamente con anticomplemento (Mollison et. Al., Blood
Transfusion in Clinical Medicine, Blackwell Scientific Publications
1992). De acuerdo con ello, las pruebas que no muestran actividad
anti-complemento tienen una oportunidad de
reacciones falsas-negativas.
La desventaja de la utilización de proteína A
como material de unión de inmunoglobulina es que no se pueden
demostrar anticuerpos de tipo IgG3 (el hecho es que la proteína A se
une solamente a las subclases de IgG, IgG1, IgG2 y IgG4), aunque
éstas pueden ser clínicamente relevantes. Los anticuerpos IgM, que
son también clínicamente relevantes, se indica que no son unidos
por la proteína G y solamente en parte por la proteína A.
La presente invención da a conocer un método para
la determinación en una muestra de un analito seleccionado de un
antígeno de grupo sanguíneo presente en eritrocitos, o un anticuerpo
que se une a dicho antígeno de grupo sanguíneo,
comprendiendo el tratamiento de la muestra en una
zona de incubación de un recipiente de reacción con un reactivo que
contiene un asociado de unión al analito, cuyo asociado de unión al
analito, en el caso de que el analito es un antígeno de grupo
sanguíneo presente en eritrocitos, es un anticuerpo capaz de unión
al antígeno del grupo sanguíneo, y en el caso en el que el analito
es un anticuerpo que se une a un antígeno de grupo sanguíneo, es el
antígeno del grupo sanguíneo presente en eritrocitos, de manera que,
en la zona de incubación, si la muestra contiene el analito, se
forma o bien un complejo de un antígeno de grupo sanguíneo presente
en eritrocitos y anticuerpo unido al mismo o se forma un complejo
de antígeno de grupo sanguíneo presente en eritrocitos y anticuerpo
unido al mismo, así como un complejo de factores complementarios
unidos a estos eritrocitos si el anticuerpo se une al com-
plemento,
plemento,
comprendiendo además la separación de
eritrocitos, formando complejo o no, de anticuerpos no unidos
utilizando un medio de separación situado en el recipiente de
reacción por debajo de la zona de incubación, de una densidad
superior a la del fluido que contiene los anticuerpos pero más baja
que la densidad de los eritrocitos, de manera que los eritrocitos
pasan a través del medio de separación y los anticuerpos no unidos
permanecen en la zona de in-
cubación,
cubación,
separación de eritrocitos con forma de complejo
de los eritrocitos sin forma de complejo por unión de los
eritrocitos con forma de complejo en una zona de inmovilización de
recipiente de reacción,de manera que la zona de inmovilización
comprende una matriz de gel que lleva anticuerpo de unión a
IgM,unido a la matriz de gel por unión directa covalente o con
intermedio de un brazo separador, descargando los eritrocitos sin
forma de complejo a una zona de recogida del recipiente de
reacción, y
detección de eritrocitos en la zona de
inmovilización y/o zona de recogida.
La presente invención da a conocer también un
equipo de pruebas apropiado para su utilización en un método para
la determinación de un analito en una muestra, siendo el analito un
antígeno de grupo sanguíneo presente en eritrocitos o un anticuerpo
que se une a dicho antígeno de grupo sanguíneo, comprendiendo:
- (i)
- un reactivo que contiene un asociado de unión al analito que,en el caso en el que el analito es un antígeno de grupo sanguíneo presente en eritrocitos, es un anticuerpo capaz de unión al anticuerpo del grupo sanguíneo, y en el caso en el que el analito es un anticuerpo que se une a un antígeno de grupo sanguíneo,es el antígeno de grupo sanguíneo presente en eritrocitos,
- (ii)
- un recipiente de reacción que comprende una zona de incubación, una zona de inmovilización y una zona de recogida, en el que la zona de inmovilización comprende una matriz del gel que lleva anticuerpo de unión a IgM o un fragmento de anticuerpo unido a la matriz del gel por acoplamiento covalente directo o por intermedio de un brazo separador y llevando además, opcionalmente, un anticuerpo de unión a complemento o un fragmento de anticuerpo unido a la matriz de gel por acoplamiento covalente directo o con intermedio de un brazo separador.
- iii)
- un medio de separación que tiene una densidad inferior a la densidad de los eritrocitos pero superior a la densidad de un fluido que contiene anticuerpos.
Figura 1: esta figura muestra una tarjeta de
pruebas con seis microcolumnas en la misma. En una microcolumna (9)
cerrada en el fondo, se ha dispuesto una matriz de partículas
inertes (1) para soportar una delgada capa de la matriz de gel de
afinidad, (2). Sobre esta matriz de gel de afinidad existe una capa
de medio de separación de alta densidad (3). El compartimiento de
incubación (4) está formado por un ensanchamiento en la parte
superior de la microcolumna. Un sistema de pruebas de microcolumnas
(7) puede estar integrado en una placa de base (8) y puede estar
situado en una centrifugadora utilizando elementos de soporte y de
guiado (11), (12), (13).
Los numerales de referencia indican:
- (1)
- matriz de partículas inertes
- (2)
- matriz de gel de afinidad
- (3)
- medio de separación de alta densidad
- (4)
- compartimiento de incubación
- (5)
- pared de la microcolumna
- (6)
- fondo de la microcolumna
- (7)
- tarjeta de pruebas
- (8)
- placa de base
- (9)
- microcolumna
- (10)
- rebaje
- (11)
- superficie superior
- (12)
- ranura
- (13)
- soporte
Figura 2: esta figura muestra las diferentes
intensidades de reacción posibles. La forma en la que muchos
eritrocitos sensibilizados se unirán a la matriz de gel de afinidad
depende de varios parámetros, tales como la densidad del antígeno
sobre los eritrocitos, la concentración o titulación del anticuerpo
en cuestión y la afinidad del anticuerpo para el antígeno del
eritrocito en cuestión. En general, en reacciones más débiles de
4+, los eritrocitos se encontrarán también en el fondo de la
microcolumna.
Las indicaciones de intensidad son las
siguientes:
- 4+
- todas las células unidas a la matriz de afinidad, no hay células en el fondo
- 3+
- más células unidas a la matriz de afinidad que en el fondo
- 2+
- tantas células unidas a la matriz de afinidad como en el fondo
- 1+
- menor número de células unidas a la matriz de afinidad que al fondo
- 0,5
- pocas células unidas a la matriz de afinidad, muchas células en el fondo
- +/-
- casi ninguna célula unida a la matriz de afinidad, casi todas las células en el fondo
- neg
- no hay células unidas a la matriz de afinidad, todas las células en el fondo
La presente invención se refiere a un método para
la demostración de anticuerpos y de antígenos, basándose la
aplicación de este método principalmente en el sector de la
serología de grupo sanguíneo: determinación de grupo sanguíneo,
rastreo de anticuerpos e identificación de anticuerpos, y pruebas
cruzadas.
La invención se refiere a una mejora de la prueba
de fase sólida, tal como se ha descrito por Pernell (Sanofi
Pasteur, EP 0 594 506). Una desventaja de esta prueba de gel de
afinidad de Sanofi Pasteur, en la que una sustancia de
inmovilización de inmunoglobulina (tal como proteína A, proteína G o
IgG anti-humano) está inmovilizada en la matriz de
gel, es que no hay factores complementarios unidos y que los
anticuerpos IgM no están unidos o solamente lo están en parte. No
obstante, en serología, además de anticuerpos IgG, también son
relevantes los anticuerpos IgM, tal como lo son los eritrocitos
cargados con factores de complemento (por ejemplo, en la
demostración de anticuerpos de unión a complementos tales como
anticuerpos anti-Jk, a los que también se hace
referencia como anticuerpos dependientes de complementos). Para
tener la capacidad de demostrar asimismo estos anticuerpos IgM y/o
anticuerpos dependientes de complemento con una alta sensibilidad,
en la presente invención, además de sustancias de unión a IgG,
también se inmovilizan sobre la matriz del gel anticuerpos o
fragmentos de anticuerpos de unión a IgM y, opcionalmente, de unión
a complementos, lo que conduce a un número más bajo de reacciones
falso-negativo. La invención comprende además la
posibilidad de que se utilice, inmovilizado en la matriz de gel, un
anticuerpo de unión de IgM o un fragmento de anticuerpo solo, sin la
sustancia de unión a IgG.
De acuerdo con la invención, se pueden unir
eritrocitos sensibilizados directamente a esta matriz de afinidad
sin intervención de un suero antiglobulina.
Por encima de la matriz de afinidad, existe un
medio fluido que tiene una densidad comprendida entre la densidad
de los eritrocitos y la densidad del fluido que contiene el
anticuerpo. La presencia de esta capa genera que no se requiera
fase de lavado separada para separar anticuerpos no unidos de los
eritrocitos sensibilizados o no. Por encima de esta capa, tiene
lugar la incubación de eritrocitos y de anticuerpos. Después de la
fase de incubación, tiene lugar una fase de centrifugación, de
manera tal que los eritrocitos son centrifugados a través del medio
de alta densidad. El fluido que contiene el anticuerpo permanece por
encima de este medio de alta densidad. De esta manera, por lo
tanto, los eritrocitos son separados de los anticuerpos no unidos,
procedentes, por ejemplo, del suero o plasma. Si factores
complementarios y/o anticuerpos IgG y/o anticuerpos IgM están
unidos a los eritrocitos, estos eritrocitos sensibilizados se unirán
a la matriz de afinidad y, de igual manera, se unirán a la parte
superior de la columna de gel. Las células que no han sido
sensibilizadas no serán unidas a la matriz de afinidad y pueden
pasar fácilmente a través de ella.
De acuerdo con la invención, se ha descubierto
que es de importancia esencial que, además de la sustancia opcional
de unión de IgG, una sustancia de unión de complemento y/o una
sustancia de unión de IgM se inmovilicen de forma covalente sobre
la fase sólida y no se añadan de manera libre a la fase sólida, tal
como puede ser el caso, por ejemplo, en la prueba de aglutinación
descrita por Lapierre. Utilizando la combinación de sustancias de
unión de IgG, de unión de IgM y de unión a complementos,
inmovilizadas de forma covalente sobre la matriz de gel, se ha
alcanzado un resultado positivo inesperado. En primer lugar, se ha
descubierto que es posible demostrar, además de anticuerpos IgG,
anticuerpos dependientes de complementos con una elevada
sensibilidad. Además, también ha resultado posible demostrar
aglutininas (anticuerpos del grupo sanguíneo del tipo IgM, de
importancia en la realización de pruebas cruzadas con suero del
receptor y eritrocitos del donante) con una elevada sensibilidad,
incluyendo aglutininas
débiles.
débiles.
De acuerdo con ello, la invención da a conocer
una fase sólida compuesta y un método para determinación en una
muestra de un analito seleccionado a partir de un antígeno de grupo
sanguíneo presente en eritrocitos o un anticuerpo IgG y/o
anticuerpo IgM y/o anticuerpos dependientes de complementos que se
unen a dicho antígeno de grupo sanguíneo.
La presente invención da a conocer además un
equipo de pruebas, que comprende:
- (i)
- un reactivo que contiene un asociado de unión al analito, el cual, en el caso en el que el analito es un antígeno de grupo sanguíneo presente en eritrocitos, es un anticuerpo capaz de unirse al antígeno del grupo sanguíneo y, en el caso en el que el analito es un anticuerpo IgG y/o anticuerpo IgM y/o anticuerpo dependiente de complemento que se une a un antígeno de grupo sanguíneo, es el antígeno del grupo sanguíneo presente en eritrocitos,
- (ii)
- un recipiente de reacción que comprende una zona de incubación, una zona de inmovilización y una zona de recogida, en el que dicha zona de inmovilización comprende una matriz de gel que lleva un anticuerpo IgM o fragmento de anticuerpo unido a la matriz de gel acoplamiento covalente directo o con intermedio de un brazo separador y, opcionalmente, un anticuerpo de unión a complemento o fragmento de anticuerpo unido a la matriz de gel por enlace covalente directo con intermedio de un brazo separador, y
- (iii)
- un medio de separación que tiene una densidad menor que la densidad de los eritrocitos pero superior a la densidad de un fluido que contiene anticuerpos.
La invención que se describe tiene la ventaja
sobre técnicas existentes de que la sensibilidad de la prueba,
debida a la combinación utilizada de las sustancias de unión de IgG,
de unión de IgM y de unión a complementos, inmovilizada sobre la
matriz de gel, es inesperadamente alta. Tanto las aglutininas,
incluyendo aglutininas débiles, como los anticuerpos dependientes
de complementos, se pueden demostrar con una sensibilidad altamente
incrementada con respecto a las pruebas de microcolumna
convencionales. De acuerdo con ello, esto conduce a un número más
reducido de reacciones de falso-negativo.
La invención descrita puede ser aplicada a las
pruebas actuales de fase sólida dentro de la serología de grupo
sanguíneo, incluyendo pruebas de rastreo para anticuerpos,
identificación de anticuerpos, pruebas cruzadas, determinación de
antígenos, determinación de grupo sanguíneo y titulación de
anticuerpo. La invención puede ser utilizada, por ejemplo, para
determinar los siguientes antígenos del grupo sanguíneo y
anticuerpos de estos antígenos: ABO, Kell (K), cellano (k), Duffy
(Fy^{a} y Fy^{b}), Kidd (Jk^{a}) y Jk^{b}), Lutheran
(Lu^{a} y Lu^{b}), el sistema Rhesus (D, E, e, C, c), MNS, Lewis
(Le^{a} y Le^{b}), etcétera.
A título de ejemplo, la invención puede ser
utilizada en los siguientes ensayos:
- -
- Pruebas en las que se hace uso de un antisuero de una especificidad conocida y eritrocitos de un compuesto de antígeno desconocido (ensayo de grupo sanguíneo, ensayo de antígeno).
- -
- Pruebas en las que se hace utilización de sueros que contienen un anticuerpo desconocido o anticuerpos desconocidos y eritrocitos que tienen un compuesto antígeno conocido (rastreo de anticuerpos, identificación de anticuerpos, ensayo de halo-anticuerpos, a los que también se hace referencia como agrupación inversa). En este caso, se hace utilización frecuentemente de (un panel de) eritrocitos de composición conocida de antígeno. Además, la prueba puede ser también utilizada para la detección de auto-anticuerpos. En este caso, los anticuerpos están ya unidos a los correspondientes antígenos sobre los eritrocitos, de manera que los eritrocitos están ya sensibilizados y se pueden unir directamente a la fase sólida compuesta.
- -
- Pruebas que utilizan suero procedente del receptor y eritrocitos del donante para demostrar cualesquiera anticuerpos en el suero del receptor (prueba cruzada).
- -
- Las pruebas llevadas a cabo de acuerdo con la presente invención se basan todas ellas en el mismo principio: eritrocitos a los que están unidos anticuerpos (eritrocitos sensibilizados) se pueden unir a la fase sólida compuesta, en contraste con eritrocitos no sensibilizados.
La muestra consistirá, de manera típica, en
sangre o un material derivado de la misma, tal como plasma
sanguíneo, suero de la sangre o una fracción de la sangre, por
ejemplo, eritrocitos aislados de la sangre. No obstante, dado que
la invención puede ser también utilizada para otras finalidades, tal
como selección de hibridomas que producen anticuerpos monoclonales
que se unen a un antígeno de cuerpo sanguíneo, la muestra puede
también consistir en materiales de un tipo distinto, por ejemplo,
de un sobrenadante de un hibridoma.
Es esencial que, durante la incubación de
anticuerpos con eritrocitos y la etapa de centrifugación, no exista
contacto entre esta mezcla de incubación y la fase sólida compuesta,
por cuya razón se ha aplicado un medio de alta densidad a la fase
sólida compuesta. Son además de importancia esencial: la elección de
sustancias de unión a inmunoglobulina y de unión a complementos, la
elección del material para incrementar la densidad del medio y la
elección del material de la matriz de gel. Estos puntos se
explicarán brevemente a continuación.
La elección de sustancias de unión a
inmunoglobulina que se pueden inmovilizar en la fase sólida es
amplia. Son útiles, por ejemplo, anticuerpos policlonales o
monoclonales dirigidos a la inmunoglobulina G(IgG),
inmunoglobulina A(IgA) y/o inmunoglobulina M(IgM), o
bien los fragmentos Fab o F(ab)'_{2} de las mismas. A
efectos de incrementar la sensibilidad, o para detectar una gama lo
más amplia posible de anticuerpos, es también posible inmovilizar
una combinación de varias sustancias de unión a inmunoglobulinas
sobre la fase sólida.
También es posible utilizar sustancias de unión a
la inmunoglobulina de un origen distinto, por ejemplo, procedentes
de bacterias. Las proteínas bacterianas de unión a inmunoglobulinas
se utilizan, por ejemplo, en inmunología; bioquímica y
biotecnología. Se ha aislado y caracterizado una serie de proteínas
de unión a inmunoglobulinas.
Las más importantes son la proteína A (Forsgren y
otros J. Immunol. 1966; 97:822) y la proteína G (Björck y otros
J.Immunol, 1984; 133:969; Reis y otros J. Immunol. 132:3091).
Para las pruebas de anticuerpos IgG
(identificación de anticuerpo, rastreo de anticuerpo y pruebas
cruzadas), se puede utilizar una fase sólida con una sustancia de
unión de IgG de una alta afinidad, de manera que se asegura la
unión óptima de células sensibilizadas a una fase sólida. Una
sustancia de unión de inmunoglobulina, además de la inmunoglobulina
antihumana, nuevamente la proteína G, puede ser utilizada. Es
preferible una fase sólida sobre la que se inmovilizan tanto las
sustancias de unión a IgG como las sustancias de unión a IgM,
porque, en este caso, se puede demostrar una gama más amplia de
especificidades de anticuerpos. Cualesquiera
halo-anticuerpos IgA están siempre acompañados,
hablando en términos normales, por anticuerpos IgG de la misma
especificidad.
Cuando el complemento es activado después de la
unión de anticuerpos de unión a complementos a un antígeno de
eritrocito, los productos de activación de los factores de
complementos C4 y especialmente C3, C4b y C3b, respectivamente,
están unidos a la membrana del eritrocito. De acuerdo con ello, son
útiles como sustancias de unión a complementos, por ejemplo,
anticuerpos policlonales o monoclonales dirigidos contra
determinantes antigénicos en factores de complemento relevantes,
tal como, por ejemplo, C3c, C3d y C3g en el factor complementario
C3b, o combinaciones de los mismos.
c. Las sustancias para incrementar la densidad
del medio pueden ser de muchos tipos, incluyendo, por ejemplo,
albúmina, dextran, Ficoll, iodixanol, diatrizoato sódico, Percoll,
etc. La densidad del medio debe ser más elevada que la del fluido
que contiene anticuerpo, pero más baja que la de los eritrocitos, de
manera que la densidad se debe encontrar entre 1,01 y 1,09 g/ml,
preferentemente entre 1,02 y 1,06 g/ml.
Son materiales adecuados para la matriz, por
ejemplo, la agarosa (por ejemplo, Sepharose 4 Fast Flow, Sepharose
High Performance (Pharmacia)) o una resina acrílica. También son de
importancia las dimensiones de las partículas: en una matriz con
partículas más grandes, y por lo tanto, espacios intermedios más
grandes, la unión de los eritrocitos sensibilizados tendrá lugar
lentamente, de manera que se puede unir un número insuficiente de
células. Una matriz más fina conducirá a un contacto más intenso de
las células sensibilizadas con las sustancias de unión a
inmunoglobulina y de unión al complemento, de manera que es posible
una unión óptima de las células. No obstante, una matriz demasiado
fina llevará al taponamiento. El diámetro de las partículas tendrá
que encontrarse, por lo tanto, entre 10 y 125 \mum,
preferentemente entre 20 y 50 \mum.
Las sustancias de unión a inmunoglobulina y de
unión a complementos son inmovilizadas sobre la fase sólida a
través de unión covalente directa, o con intermedio de un brazo
separador. Este brazo separador puede tener una longitud de cadena,
por ejemplo, de 5-10 átomos de carbono y tiene como
ventaja que las sustancias de unión (ligandos) resultan más
accesibles a los eritrocitos sensibilizados por el hecho de que se
reduce el impedimento estérico. En la utilización de Sepharose
(Pharmacia) activada por NHS como fase sólida, por ejemplo, un
brazo separador se encuentra ya presente sobre este material de
matriz; cuando, en este caso, se presenta un ligando con grupos
amino primarios, se produce con fraccionamiento de la
N-hidroxisuccinimida a partir del compuesto de
éster activado, una fase sólida a la que se unen los ligandos con
intermedio de un separador de 6 átomos de carbono (es decir, un
puente con una longitud de cadena de 6 átomos de C). También es
posible, no obstante, inmovilizar,en primer lugar, por ejemplo, la
proteína G sobre la matriz de gel y, a continuación, acoplar
complemento anti-humano y/o IgB
anti-humano a la propia proteína G, directamente o
con intermedio de los llamados puentes ligandos, por ejemplo,
anticuerpos formadores de puentes, que se acoplan, en primer lugar,
a la proteína G y que están dirigidos a anticuerpos
humanos.
humanos.
Para llevar a cabo la prueba, es preferible un
sistema de prueba que consiste en una tarjeta con microcolumnas
fabricadas a partir de un material plástico inerte transparente,
permitiendo la realización de pruebas simples y múltiples (ver
también figura 1). En estas microcolumnas, se dispone una matriz de
partículas inertes (por ejemplo gránulos de cristal (Supelco) o
Streamline (basada en cuarzo, Pharmacia)). Esta matriz inerte sirve
para soportar una delgada capa de matriz de gel sobre la que se han
inmovilizado sustancias de unión a inmunoglobulinas y sustancias de
unión a complementos. Dispuesta sobre esta matriz de gel de
afinidad, se encuentra una capa de un medio de separación de una
densidad superior a la del fluido que contiene el anticuerpo pero
inferior a la de los eritrocitos. Esta capa es de importancia para
la invención, puesto que la presencia de la misma elimina la
necesidad de una etapa separada de lavado para separar los
anticuerpos no unidos con respecto a los eritrocitos
(sensibilizados). La incubación de eritrocitos y de anticuerpos
puede tener lugar en un compartimiento formado por un
ensanchamiento en la parte superior de la microcolumna. Después de
la fase de incubación, en la que los anticuerpos se pueden unir a
las células, los eritrocitos, sensibilizados o no, son separados de
los anticuerpos no unidos por centrifugación a través del medio de
separación mencionado, y transportados a la matriz de gel de
afinidad, después de lo cual las células sensibilizadas se adherirán
a la matriz de gel de afinidad, mientras que las células no
sensibilizadas serán transportadas a través de la matriz de gel de
afinidad al fondo de la microcolumna. El protocolo de centrifugación
requerido, en lo que respecta a la fuerza centrífuga (valor de g) y
a la duración, depende, entre otros factores, de la cantidad de
eritrocitos a utilizar, la densidad del medio de separación
mencionado, y el tamaño de partículas de la matriz de gel. Es
posible, por ejemplo, escoger un protocolo de centrifugación del
tipo llamado lineal, en el que el valor de g aumenta en un periodo
de tiempo determinado (por ejemplo, 1 minuto) hasta un valor máximo
determinado (por ejemplo, 2000xg), que es mantenido durante un
periodo determinado de tiempo (por ejemplo, 9 minutos). Al aumentar
el valor de g, los eritrocitos serán transportados a través del
medio de separación, permitiendo que los eritrocitos sensibilizados
se unan a la matriz de afinidad. Después de ello, durante el periodo
de máximo valor de g, todos los eritrocitos no sensibilizados serán
transportados a través de la matriz de afinidad al fondo de la
microcolumna. Para llevar a cabo la prueba, es preferible un
protocolo de centrifugación del tipo llamado discontinuo, en el
que, durante la primera fase, a un valor específico de g (por
ejemplo, 10-60 seg a 400-1000xg,
preferentemente 20-40 seg a
400-500xg), los eritrocitos serán transportados a
través del medio de separación, después de lo cual, en la 2ª fase,
para un valor de g más reducido (por ejemplo, 10-60
seg a 50-400xg, preferentemente
20-40 seg a 100-300xg), los
eritrocitos sensibilizados se pueden unir a la matriz de afinidad,
después de lo cual, en la última fase, a valor de g máximo (por
ejemplo, 1-13 min a 1000-2500xg,
preferentemente 7-10 min a
1800-2000xg) todos los eritrocitos no sensibilizados
son transportados a través de la matriz de afinidad al fondo de la
microcolumna. Es de importancia esencial que todas las células no
sensibilizadas terminen en el fondo, a efectos de prevenir
reacciones falso-positivo, de manera que la
centrifugación en la última fase debe ser relativamente larga y a
elevada velocidad.
La detección de las células unidas sobre la
matriz de gel de afinidad y células no unidas en el fondo de la
microcolumna se puede realizar simplemente tanto de forma visual
como de forma automática. Los diferentes modelos de reacción
posibles se han mostrado en la figura 2. La cantidad de eritrocitos
sensibilizados que se unirán a la matriz de gel de afinidad depende
de varios parámetros, tales como la densidad del antígeno sobre los
eritrocitos, la titulación del anticuerpo en cuestión, y la afinidad
del anticuerpo para el antígeno del eritrocito en cuestión. En
general, en las reacciones más débiles de 4+, se encontrarán las
células también en el fondo de la microcolumna.
Se ha demostrado de esencial importancia para la
invención que las sustancias de unión a las inmunoglobulinas y
sustancias de unión a complementos sean inmovilizadas de forma
covalente sobre la fase sólida, y que no se añadan de forma libre a
la matriz de gel, tal como es el caso, por ejemplo, en la prueba de
aglutinación de columna descrita por Lapierre (EP 0 305 337). Se
utilizan preferentemente como sustancias de unión a inmunoglobulinas
la proteína G, y anticuerpos dirigidos contra IgM humano (IgM
anti-humano). Como sustancias de unión a los
complementos, se utilizan preferentemente anticuerpos que son
dirigidos contra el factor de complemento humano C3d (C3d
anti-humano). Utilizando la combinación de proteína
G, IgM anti-humano y C3d anti-humano
inmovilizado sobre la matriz de gel, se consiguió un resultado
positivo inesperado:
En primer lugar, resultó posible demostrar de
manera apropiada anticuerpos dependientes de complementos. Cuando,
por otra parte, se inmovilizó la proteína G sola sobre la matriz de
gel, estos anticuerpos dependientes de complementos eran
demostrables solamente de forma débil. Cuando las sustancias de
unión a inmunoglobulinas y sustancias de unión a complementos no se
inmovilizaron, sino que se añadieron de forma libre a la matriz de
gel (en este caso, IgG anti-humano y C3d
anti-humano, de manera que, en realidad, se obtuvo
una prueba de antiglobulina indirecta, tal como se describió por
Lapierre), los anticuerpos dependientes de complementos se
demostraban en todo caso de forma muy difícil.
En segundo lugar, se observó asimismo que era
posible demostrar las aglutininas de manera apropiada:
- -
- los anticuerpos de grupo sanguíneo de tipo IgM, que proporcionaron todavía sensibilización de los eritrocitos pero no proporcionaron aglutinación visible en el tubo de pruebas, eran todavía demostrables de forma apropiada en la presente prueba, en contraste con la situación en la que la proteína G era la única inmovilizada sobre la matriz de gel. Cuando se añadieron IgM anti-humano y C3d anti-humano de forma libre a la matriz de gel, los anticuerpos de grupo sanguíneo de IgM diluido eran, en todo caso, difícilmente demostrables. Cuando se utilizó la matriz de gel sola, sin ligandos, los anticuerpos del grupo sanguíneo de IgM diluidos no eran demostrables. Este resultado inesperado se pudo explicar por el hecho de que la presente prueba es una prueba de afinidad, que no depende de la acción de criba de la matriz de gel para retener los aglutinados, sino que, en ella, los eritrocitos individuales sensibilizados pueden ser unidos todavía a la matriz de gel.
- -
- cuando se comprobaron incompatibilidades débiles a ABO, por ejemplo, incompatibilidad de eritrocitos A.B/B-plasma, las reacciones eran demostrables de manera apropiada en la presente prueba, en contraste con la situación en la que solo estaba inmovilizada la proteína G sobre la matriz de gel. Cuando se añadieron IgM anti-humano y C3d anti-humano de manera libre a la matriz de gel, las reacciones eran en todo caso difícilmente demostrables. Cuando se utilizó la matriz de gel sola, sin ligandos, las reacciones no eran demostrables. Es un hecho bien sabido que las pruebas "neutrales" y de microcolumna de antiglobulina tienen problemas en la demostración de incompatibilidades débiles de ABO (Cummins & Downham, Lancet 1994; 343: 1649 y Philips y otros, Transfusion Medicine 1997; 7:47-53), por el hecho de que las llamadas "fuerzas de cizalladura", durante la centrifugación, provocan que los aglutinados más grandes se desintegren en varios aglutinados pequeños, o bien, en un caso extremo, en eritrocitos individuales (sensibilizados). A pesar de la acción de cribado del gel, solamente se observan reacciones entre débiles y negativas, resultando de ello en un incremento del número de reacciones de falso negativo. Como solución posible a este problema, en el artículo de Philips y otros, la prueba Diamed es llevada a cabo de acuerdo con un protocolo de centrifugación discontinuo, modificado: al reducir la fuerza centrífuga y triplicar el tiempo de centrifugación, se observa que se demuestran mejor los aglutinados débiles, no obstante, esta modificación es calificada como no apropiada para utilización rutinaria. Por lo tanto, la presente invención tiene la ventaja de que los aglutinados más pequeños e incluso eritrocitos individuales sensibilizados pueden ser todavía unidos a la matriz de afinidad, de manera que este tipo de reacciones débiles se pueden demostrar todavía satisfactoriamente.
En relación con ello, se ha observado que es
posible demostrar las aglutininas débiles, descritas igualmente
bien con una combinación de proteína G solamente y de IgM
anti-humano, inmovilizados en la matriz de gel, y
asimismo con IgM anti-humano solo, inmovilizado en
la matriz de gel.
De manera similar, se ha observado que es posible
demostrar los anticuerpos dependientes de complementos de manera
igualmente satisfactoria con una combinación de proteína G solamente
y C3d anti-humano, inmovilizados en la matriz de
gel, y asimismo con C3d anti-humano solo,
inmovilizado en la matriz de gel.
Cuando estas cuatro realizaciones variantes se
utilizan además de la variante descrita con la combinación
inmovilizada de proteína G, IgM anti-humano y C3d
anti-humano, se puede discriminar si una muestra
determinada contiene anticuerpos IgG y/o anticuerpos IgM y/o
anticuerpos dependientes de complementos.
La invención se explicará adicionalmente mediante
los siguientes ejemplos. Es importante apreciar, no obstante, que
estos ejemplos tienen solamente objetivo ilustrativo y explican la
implementación de la invención, pero no constituyen en modo alguno
las condiciones definitivas de los diferentes métodos de ensayo ni
limitan el ámbito de la invención en modo alguno.
Se lavaron dos veces gránulos de cristal
(Supelco) en una solución salina con tampón de fosfato (PBS) y se
incluyeron en un tampón de fosfato 20 mM, conteniendo adicionalmente
70 mM NaCl, 20 mM EDTA, 30 mM de glucosa, 5% de dextrano, 1,5% de
BSA, 0,02% de gelatina, pH 8,8 (tampón gel).
Se lavaron 10 ml de Sepharose HP que tenían
inmovilizada proteína G (capacidad de unión para IgG humano:
20-30 mg/ml gel, Pharmacia, Uppsala, Suecia)), de
acuerdo con las instrucciones del suministrador, y se incluyó en un
tampón que contenía 20 mM Tris y 150 mM NaCl. Se añadió a ello IgG
de ratón monoclonal, dirigido a IgM humano, hasta una concentración
final de 100 \mug/ml gel e IgG de ratón monoclonal, dirigido a C3d
humano, hasta una concentración final de 75 \mug/ml gel. Después
de un período de incubación de 12 horas a 4ºC, el gel de afinidad
fue lavado dos veces en un tampón de gel. Después de cada etapa de
lavado, el sobrenadante fue comprobado para detectar la presencia
de IgM anti-humano libre y de C3d
anti-humano: estos componentes no fueron
demostrables, de manera que la totalidad del IgM
anti-humano y C3d anti-humano
añadidos tenía que estar acoplada a la proteína G. Este gel de
afinidad se incluyó a continuación en un tampón de gel de 25 ml.
Por cada microcolumna se añadieron: gránulos de cristal de 15 \mul
depositados en un tampón de gel. Se añadió a ello: 15 \mul de una
suspensión de gel de afinidad en un tampón de gel (20%). Este gel de
afinidad se sedimentó dentro de 15 minutos en la parte superior de
los gránulos de cristal. El tampón de gel sobrenadante funciona
como medio de separación de alta densidad.
Los eritrocitos del grupo sanguíneo 0^{+} (es
decir, grupo sanguíneo 0, positivo a rhesus D) se sensibilizaron
con anti-D y, a continuación, se lavaron 3 veces en
una solución de LISS modificada (solución salina de baja
concentración iónica). De estos eritrocitos, se preparó una
suspensión al 0,5% en LISS. A continuación, se introdujo una gota
de esta suspensión en el compartimiento de incubación de la
microcolumna. A ello se añadió una gota de suero normal de un
donante de grupo sanguíneo 0^{+}. Después de un período de
incubación de 15 minutos a 37ºC, la microcolumna fue centrifugada
de acuerdo con el siguiente protocolo: 30 segundos a 500xg, seguido
de 30 segundos a 200xg, seguido de 9 minutos a 1950xg. A
continuación, el resultado fue evaluado de la forma siguiente:
todos los eritrocitos se habían unido a la parte superior de la
matriz de gel de afinidad (intensidad de la reacción 4+). Como
control, se repitió el procedimiento descrito con eritrocitos
sensibilizados del grupo sanguíneo 0^{+}. Estas células no
estaban unidas a la matriz de gel de afinidad.
Se utilizó el sistema de prueba descrito en el
Ejemplo 1.
De eritrocitos positivos Duffy-a
(Fy^{d}) (fenotipo Fy^{a+b+}) se realizó una suspensión al 0,5%
en LISS. A continuación, 1 gota de esta suspensión fue introducida
en el compartimiento de incubación de la microcolumna. A ella se
añadió una gota de anti-Fy^{a} (antisuero IgG
policlonal, CLB, Amsterdam, Holanda). Después de un período de
incubación de 15 minutos a 37ºC, la microcolumna fue centrifugada de
acuerdo con el protocolo del Ejemplo 1. Después de ello, el
resultado fue evaluado: todos los eritrocitos estaban unidos al lado
superior de la matriz de gel de afinidad (intensidad de la reacción
4+). Como experimento de control, se comprobaron eritrocitos
correspondientes no sensibilizados. Estas células no se unieron a la
matriz de gel de afinidad.
Este experimento fue repetido para los siguientes
antígenos: Fy^{b} (con un suero anti-Fy^{b} con
una célula Fy^{a+b+}), Jk^{a} (con suero
anti-JK^{a} y células Jkd^{a+b+}), Jk^{b} (con
suero anti-Jk^{b} y células JK^{a+b+}), Kell
(con suero anti-K y células K^{+}k^{+}), celano
(con antisuero k y células K^{+}k^{+}), Lu^{a} (con suero
anti-Lu^{a} y células Lu^{a+b+}), Lu^{b} (con
suero anti-Lu^{b} y células
Lu^{a-b+}), S (con suero anti-S y
células S^{+}s^{+}) y s (con suero anti-s y
células S^{+}s^{+}). Los resultados estaban de acuerdo con lo
que se ha descrito para Fy^{a}. En todos los casos, la unión
completa de los eritrocitos sensibilizados a la matriz de gel de
afinidad tuvo lugar, mientras que los eritrocitos no sensibilizados
de los experimentos de control no se unieron a la matriz de
afinidad.
En los siguientes ejemplos, se utilizaron los
siguientes sistemas de prueba:
Sistema 1: el sistema de prueba, tal como se
describe en el Ejemplo 1, que tiene como ligandos inmovilizados en
la matriz de gel: proteína G, IgM anti-humano y C3d
anti-humano.
Sistema 2: igual que el sistema 1, pero con la
proteína G sola como ligando inmovilizado sobre la matriz de
gel.
Sistema 3: igual que el sistema 1, pero con IgM
anti-humano solo como ligando inmovilizado sobre la
matriz de gel. Con este objetivo, se acopló una cantidad óptima de
IgM anti-humano a Sepharose HP activado con NHS, de
acuerdo con las instrucciones del suministrador (Pharmacia). Después
del acoplamiento, cualesquiera grupos activados residuales fueron
inactivados y el gel de afinidad fue lavado dos veces con tampón de
gel. Después de cada etapa de lavado, el sobrenadante fue
comprobado para determinar la presencia de IgM
anti-humano libre. Ello no fue demos-
trable, de manera que todo el IgM anti-humano que se había añadido tenía que haber sido acoplado a la matriz de gel.
trable, de manera que todo el IgM anti-humano que se había añadido tenía que haber sido acoplado a la matriz de gel.
Sistema 4: igual que el sistema 1, pero sin
ligandos inmovilizados sobre la matriz de gel. Con este objetivo,
se inactivó la Sepharose HP activada con NHS, de acuerdo con las
instrucciones del suministrador (Pharmacia).
Sistema 5: igual que el sistema 4, excepto que, a
continuación, para cada microcolumna, se añadieron de manera libre
cantidades óptimas de sustancias de unión a las inmonoglobulinas y
de unión a los complementos, IgG anti-humano y C3d
anti-humano, de manera que se distribuyó de forma
homogénea sobre gránulos de cristal, matriz de gel y tampón de gel
sobrenadante. Esto proporciona en realidad un sistema de prueba
antiglobulina.
Sistema 6: igual que el sistema 5, excepto que,
inmediatamente antes de la implementación de la prueba, el tampón
de gel sobrenadante con IgG anti-humano libre en el
mismo y C3d anti-humano fue sustituido por un tampón
de gel normal, de manera que el IgG anti-humano
añadido de manera libre y el C3d anti-humano fueron
dispuestos solamente en la sección con matriz de gel y gránulos de
cristal.
Sistema 7: igual que el sistema 4, excepto que,a
continuación,se añadieron de manera libre,para cada
microcolumna,cantidades óptimas de sustancias de unión a
inmonoglobulinas y sustancias de unión a complementos, IgM
anti-humano y C3d anti-humano,
respectivamente, de manera que se distribuyeron de manera homogénea
sobre los gránulos de cristal, matriz de gel y tampón de gel
sobrenadante. Esto proporciona,en realidad,un sistema de pruebas de
antiglobulina.
Sistema 8: igual que el sistema 7, excepto que,
inmediatamente antes de la implementación de la prueba, el tampón
de gel sobrenadante con el IgM anti-humano y C3d
anti-humano libres sobre el mismo fue sustituido por
un tampón de gel normal, de manera que el IgM
anti-humano y el C3d anti-humano
añadidos de forma libren fueron dispuestos solamente en la sección
con matriz de gel y gránulos de cristal.
Una serie de los sistemas de pruebas antes
mencionados fue examinada en cuanto a su capacidad para demostrar
anticuerpos dependientes de los complementos. Con este objetivo, se
comprobaron los sueros de dos pacientes que se sabía que contenían
anticuerpos anti-jk^{a} dependientes de
complementos (IgG). Se preparó una suspensión al 0,5% en LISS de
células Jk^{a+b-}. Entonces se introdujo una gota de esta
suspensión en el compartimento de incubación de la microcolumna. Se
añadió a ello una gota de suero del paciente. Como control, este
experimento fue llevado a cabo con suero AB en vez de suero del
paciente. Después de un período de incubación de 15 minutos a 37ºC,
la microcolumna fue centrifugada de acuerdo con el protocolo del
Ejemplo 1. Después de ello, el resultado fue evaluado. Las
intensidades de la reacción se resumen en la Tabla 1:
| sistema 1 | sistema 2 | sistema 5 | sistema 6 | |
| suero de paciente 1 | 3+ | 1+ | 0,5 | 0,5 |
| suero de paciente 2 | 1+ | +/- | -- | -- |
| suero-AB | -- | -- | -- | -- |
Se examinó una serie de los sistemas de pruebas
antes mencionados en cuanto a su capacidad para demostrar
aglutinaciones débiles. Con este objetivo, se diluyó un anticuerpo
anti-D monoclonal humano del tipo IgM
(anti-D pelikloon, CLB) en
suero-AB, de manera tal que tenía lugar todavía la
sensibilización de eritrocitos de pruebas 0^{+}, pero no ocurrió
ninguna aglutinación visible en un tubo de pruebas de aglutinación
normal en una solución de sal fisiológica. De los eritrocitos de
prueba 0º (CLB), se preparó una suspensión en LISS al 0,5%. A
continuación, se introdujo una gota de esta suspensión en el
compartimiento de incubación de la microcolumna. A ello se añadió
una gota de anti-D diluido. Como control, este
experimento fue llevado a cabo con suero-AB.
Después de un período de incubación de 15 minutos a 37ºC, la
microcolumna fue centrifugada de acuerdo con el protocolo del
Ejemplo 1. Entonces el resultado fue evaluado. Las intensidades de
la reacción se indican en la Tabla 2:
| sistema 1 | sistema 2 | sistema 3 | sistema 4 | sistema 7 | sistema 8 | |
| anti-D, diluido | 2+ | 0,5 | 2+ | -- | -- | -- |
| suero-AB | -- | -- | -- | -- | -- | -- |
Se examinó una serie de los sistemas de pruebas
antes mencionados en cuanto a su capacidad en demostrar aglutininas.
Con este objetivo, se comprobó la incompatibilidad AB0, es decir,
una muestra de eritrocito A_{2}B con un plasma de grupo sanguíneo
B que, en una prueba de aglutinación normal, en una solución
fisiológica salina dio todavía reacción 1+. De los eritrocitos
A_{2}B, se preparó una solución al 0,5% en LISS. A continuación,
se introdujo 1 gota de esta suspensión en el compartimiento de
incubación de la microcolumna. A ello se añadió una gota del
plasma-B. Como control, este experimento fue llevado
a cabo con plasma A_{2}B del donante de eritrocitos A_{2}B
(autocontrol). Después de un período de incubación de 15 minutos a
37ºC, la microcolumna fue centrifugada de acuerdo con el protocolo
del Ejemplo 1. Después de ello, el resultado fue evaluado. Las
intensidades de reacción son las indicadas en la Tabla 3:
| sistema 1 | sistema 2 | sistema 3 | sistema 4 | sistema 7 | sistema 8 | |
| plasma B | 2+ | 0,5 | 2+ | -- | +/- | -- |
| A_{2}B plasma | -- | -- | -- | -- | -- | -- |
Queda evidente de las Tablas 2 y 3 que, con el
sistema 2 (proteína G sola como ligando inmovilizado sobre la
matriz de gel), se obtiene una reacción que, si bien es menos
intensa, es todavía positiva. Dado que con un gel neutro sin
ligandos (sistema 4) se obtiene una reacción negativa, éste es
aparentemente el resultado de la unión de complejos de
IgM-eritrocito a la proteína G.
Claims (11)
1. Método para determinar en una muestra un
analito, seleccionado entre un antígeno de grupo sanguíneo presente
en eritrocitos o un anticuerpo que se une a dicho antígeno de grupo
sanguíneo,
que comprende el tratamiento de la muestra en una
zona de incubación de un recipiente de reacción con un reactivo que
contiene un asociado de unión al analito, cuyo asociado de unión al
analito, en el caso en el que el analito es un antígeno de grupo
sanguíneo presente sobre eritrocitos, es un anticuerpo capaz de
unión al antígeno del grupo sanguíneo, y en el caso en el que el
analito es un anticuerpo de unión a un antígeno de grupo sanguíneo,
es el antígeno de grupo sanguíneo presente sobre eritrocitos, de
manera que, en la zona de incubación, si la muestra contiene el
analito, se forma un complejo de antígeno de grupo sanguíneo
presente sobre eritrocitos y anticuerpo unido al mismo, o bien un
complejo de un antígeno de grupo sanguíneo presente en eritrocitos
y anticuerpo unido al mismo, así como un complejo de factores
complementarios unidos a estos eritrocitos si el anticuerpo se une
a complementos,
comprendiendo, además, la separación de
eritrocitos, formando complejo o no, con respecto a anticuerpos no
unidos, utilizando un medio de separación situado en el recipiente
de reacción bajo la zona de incubación, de una densidad superior a
la del fluido que contiene los anticuerpos, pero inferior a la
densidad de los eritrocitos, de manera que los eritrocitos pasan a
través del medio de separación y los anticuerpos no unidos
permanecen en la zona de incubación,
separando los eritrocitos que forman complejo de
los eritrocitos que no forman complejo al unir los eritrocitos que
forman complejo en una zona de inmovilización del recipiente de
reacción,
descargando los eritrocitos que no forman
complejo a una zona de recogida del recipiente de reacción, y
detectando los eritrocitos en la zona de
inmovilización y/o zona de recogida,
de manera que dicha zona de inmovilización
comprende una matriz de gel que lleva anticuerpo de unión a IgM o
fragmento de anticuerpo, unido a la matriz de gel por unión
covalente directa o por intermedio de un brazo separador.
2. Método, según la reivindicación 1,
caracterizado porque la muestra consiste en sangre, plasma
sanguíneo, suero de sangre, fracción sanguínea o sobrenadante de un
hibridoma.
3. Método, según una o varias de las
reivindicaciones 1-2, caracterizado porque la
matriz de gel comporta además anticuerpo de unión a complementos o
fragmento de anticuerpo, unidos a la matriz de gel por unión
covalente directa o con intermedio de un brazo separador.
4. Método, según la reivindicación 3,
caracterizado porque el anticuerpo de unión al complemento o
fragmento de anticuerpo se une a un producto de activación del
factor de complemento C4 o el factor del complemento C3.
5. Método, según la reivindicación 4,
caracterizado porque se utiliza un anticuerpo dirigido contra
un antígeno determinante sobre C3B ó C4b, por ejemplo, contra C3c,
C3d ó C3g en C3b.
6. Método, según una o varias de las
reivindicaciones 1-5, caracterizado porque el
brazo separador contiene una cadena de 5-10 átomos
de carbono, preferentemente 6 átomos de carbono.
7. Método, según una o varias de las
reivindicaciones 1-6, caracterizado porque
como matriz de gel de la zona de inmovilización, se utiliza
Sepharosa activada por NHS.
8. Método, según una o varias de las
reivindicaciones 1-7, caracterizado porque el
analito es un antígeno de grupo sanguíneo presente sobre
eritrocitos.
9. Método, según una o varias de las
reivindicaciones 1-8, caracterizado porque el
analito es un anticuerpo que se une a un antígeno de grupo
sanguíneo.
10. Método, según una o varias de las
reivindicaciones 1-9, caracterizado porque se
lleva a cabo una prueba cruzada, utilizando eritrocitos de un
compuesto de antígeno de grupo sanguíneo desconocido y anticuerpos
de especificidad de grupo sanguíneo desconocido.
11. Equipo de pruebas adecuado para su
utilización en un método para determinar un analito en una muestra,
cuyo analito es un antígeno de grupo sanguíneo presente en
eritrocitos o un anticuerpo que se une a dicho antígeno de grupo
sanguíneo, comprendiendo:
- (i)
- un reactivo que contiene un asociado de unión a anolito que, en el caso en el que el analito es un antígeno de grupo sanguíneo presente en eritrocitos, es un anticuerpo capaz de unión al antígeno del grupo sanguíneo, y en el caso en el que el analito es un anticuerpo que se une a un antígeno de grupo sanguíneo, es el antígeno de grupo sanguíneo presente en eritrocitos,
- (ii)
- un recipiente de reacción que comprende una zona de incubación, una zona de inmovilización y una zona de recogida, y
- (iii)
- un medio de separación que tiene una densidad inferior a la densidad de los eritrocitos pero superior a la densidad de un fluido que contiene anticuerpo,
en el que la zona de inmovilización comprende una
matriz de gel que lleva un anticuerpo de unión a IgM o un fragmento
de anticuerpo, unido a la matriz de gel por enlace covalente directo
o por intermedio de un brazo separador, y la matriz de gel lleva
además, opcionalmente, un anticuerpo o fragmento del mismo que se
une a complementos, unido a la matriz de gel por enlace covalente
directo o por intermedio de un brazo separador.
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