ES2253755T3 - Estabilizacion por las ciclodextrinas de soluciones acuosas de esteroides utilizadas como materia de referencia en los dosificados inmunologicos. - Google Patents
Estabilizacion por las ciclodextrinas de soluciones acuosas de esteroides utilizadas como materia de referencia en los dosificados inmunologicos.Info
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Abstract
LAS SOLUCIONES ACUOSAS DE COMPUESTOS ESTEROIDEOS QUE POSEEN ACTIVIDAD BIOLOGICA Y PRESENTAN TENDENCIA A LA DEGRADACION OXIDATIVA A UNAS TEMPERATURAS ENTRE 2 Y 8 EN EXCESO DURANTE VARIOS MESES SON ESTABILIZADAS MEDIANTE LA ADICION DE CICLODEXTRINA.
Description
Estabilización por las ciclodextrinas de
soluciones acuosas de esteroides utilizadas como materia de
referencia en los dosificados inmunológicos.
A los compuestos esteroideos, y en concreto a los
compuestos esteroideos biológicamente activos susceptibles de
degradación por oxígeno, en medios acuosos conteniendo proteína, se
les da una estabilidad al almacenamiento mejorada por la adición de
ciclodextrinas.
Un método extensamente empleado para analizar
fluidos biológicos, por ejemplo los fluidos corporales de seres
humanos, para la presencia o cantidad de compuestos biológicamente
activos, sintéticos o de origen natural, es mediante un
inmunoensayo. Se mide la interacción entre el analito de interés y
un anticuerpo que reconozca este analito. Esto proporciona a menudo
un método relativamente rápido y barato para cuantificar la
cantidad de un analito dado. La reacción
analito-anticuerpo puede ser medida mediante una
variedad considerable de técnicas. Una técnica es el ensayo
competitivo en el que un anticuerpo anti-analito es
inmovilizado sobre una fase sólida, y hecho reaccionar después con
una cantidad conocida de un analito marcado y una muestra
sospechosa de contener el analito. Luego, el analito en la muestra
compite con el analito marcado para unirse al anticuerpo
inmovilizado. Después, la cantidad de marcador capturado por el
anticuerpo inmovilizado se relaciona, por ejemplo en algún tipo de
manera inversa, con la cantidad de analito presente en la
muestra.
Todas las técnicas analíticas requieren alguna
referencia hacia un estándar, pero tal referencia es
particularmente importante para los inmunoensayos. Los reactivos
utilizados en tales ensayos incluyen materiales biológicos cuya
reactividad no es exactamente reproducible, sino reproducible
únicamente dentro de un intervalo dado. Además, la unión
inmunológica entre un anticuerpo y su analito puede estar
influenciada por factores sutiles que no siempre pueden ser
controlados. Con respecto a esto, demasiados intentos rigurosos
para obtener la reproducibilidad precisa son incoherentes con el
objetivo de un ensayo rápido y barato.
Por lo tanto, la práctica ha desarrollado el
proporcionar uno o más estándares a incluir con cada aplicación del
inmunoensayo. Por ejemplo, el instrumento IMx®, fabricado por Abbott
Laboratories, puede analizar por encima de veinte muestras por
aplicación. En cada aplicación es típico incluir varias muestras
que tengan una cantidad conocida de analito, para proporcionar una
medida de la variabilidad. Tales muestras patrón son comúnmente
conocidas como controles.
Además, es típico también proporcionar algunas
muestras que tengan cantidades conocidas de analito, para calibrar
y, de vez en cuando, recalibrar el analizador. Tales muestras patrón
son comúnmente mencionadas como calibradores.
Para calibradores y controles ha sido conveniente
utilizar un diluyente que muestre en el ensayo un comportamiento
similar al del fluido corporal que se va a ensayar para el analito.
Por ejemplo, si se va a analizar suero humano, los calibradores y
controles pueden ser preparados con suero humano normal tratado
adecuadamente. Alternativamente, se puede utilizar un medio acuoso
que tenga un contenido de proteína similar al suero, por ejemplo
una solución tamponada de albúmina de suero bovino (BSA).
Una clase de analitos de interés, los esteroides,
exhiben una tendencia a degradarse con el tiempo, en tales medios
acuosos tamponados conteniendo proteína. Esta tendencia ha sido
observada en suero humano depurado con carbón vegetal y en
soluciones acuosas de BSA. Con respecto a esto, el suero humano que
se pretende utilizar como matriz o soporte del calibrador o control
es depurado con carbón vegetal para eliminar cualquier esteroide
endógeno que pudiera estar presente. De este modo, el contenido
inicial de esteroides puede ser controlado con precisión, añadiendo
simplemente una cantidad medida de suero depurado.
Sin embargo, el proceso de depuración con carbón
vegetal introduce iones metálicos adicionales dentro de la matriz,
los cuales catalizan la destrucción del analito. El carbón vegetal
puede ser sumamente difícil de eliminar, y puede requerir varias
filtraciones para su eliminación. Muchas de las preparaciones
tienen un rendimiento muy pobre. La matriz resultante es a menudo
muy cara, algo imprevisible con respecto a la estabilidad del
analito, con riesgo biológico, y sujeta a frecuentes problemas de
disponibilidad.
El único método que demostró mejorar la
estabilidad de los esteroides en los calibradores ha sido la
congelación. Desafortunadamente, este método aumenta la comodidad
del cliente y las consecuencias de la ejecución del ensayo
resultantes de las macropartículas que se forman al descongelar (a
menudo llamado desprendimiento).
De este modo, existe la necesidad de soluciones
de calibrador y de control que manifiesten una estabilidad
prolongada al almacenamiento bajo condiciones de campo normales. En
concreto, existe la necesidad de soluciones tales que no se
degraden significativamente cuando se almacenen durante periodos
prolongados a temperaturas entre unos 2 y 8ºC. Es particularmente
deseable que tales soluciones sean estables por encima de seis
meses.
Otra consecuencia que tiene que ver con los
inmunoensayos es la de la recuperación del analito. La recuperación
se define típicamente como igual a la concentración
observada/concentración real x 100%. Desafortunadamente, las
soluciones tamponadas sin proteínas, conteniendo esteroides,
muestran típicamente datos de sobrerrecuperación, muchas veces
igual a tanto como el 200% o más. Debido a esto, ha existido una
desgana a alejarse de las matrices conteniendo proteína. De este
modo, también existe la necesidad en la técnica de soluciones de
control estabilizadas para esteroides, utilizadas en inmunoensayos
que exhiban adicionalmente unos datos de recuperación aceptables, y
particularmente, una recuperación igual a aproximadamente el
100%.
US A 4727064 revela preparaciones farmacéuticas
constando de un fármaco con hidrosolubilidad sustancialmente baja y
amorfo, mezclas basadas en ciclodextrinas hidrosolubles en las que
se puede conseguir un estado amorfo estable.
EP 0349091 describe composiciones farmacéuticas
conteniendo un esteroide y
dimetil-\beta-ciclodextrina para
administración nasal.
Es, por lo tanto, un objeto de la presente
invención proporcionar el almacenamiento y la estabilidad de larga
duración de esteroides que se utilizan en inmunoensayos.
Otro objeto de a invención es emplear
ciclodextrina en una solución de calibradores y de control para
inmunoensayos para esteroides.
Un objeto adicional de la invención es la
estabilización de compuestos esteroideos biológicamente activos,
utilizando ciclodextrina.
Otro objeto es proporcionar soluciones de
calibradores y de control para inmunoensayos para esteroides, que
exhibirán una estabilidad en el almacenamiento durante varios meses
a temperaturas en el intervalo de unos 2 a 8ºC.
Todavía otro objeto de la invención es
proporcionar un método para el almacenamiento de larga duración de
esteroides, para su uso en inmunoensayos que utilizan componentes
que no afecte adversamente los datos de recuperación para el
esteroide.
Los compuestos esteroideos se hacen más estables
al almacenamiento por la adición de ciclodextrinas. Especialmente
preferidos como parte de la invención son los compuestos
esteroideos, biológicamente activos, que sean susceptibles de
degradación por oxidación en soluciones acuosas, y que sean
apropiados para la estandarización de inmunoensayos de fluidos
corporales humanos. Los esteroides de interés particular incluyen,
por ejemplo, los esteroides hormonales de origen natural tales como
el estradiol y la progesterona. Los medios acuosos de interés
pueden ser tamponados a un pH entre aproximadamente 6 y 9. Las
soluciones de interés particular incluyen aquellas con una
concentración del esteroide entre unos 2'5 x 10^{-11} y 1'0 x
10^{-7} g/ml, y una concentración de ciclodextrinas mayor de
aproximadamente 0'1 mM, preferentemente entre aproximadamente 0'2 y
25 mM.
También son excelentes los datos de recuperación
para inmunoensayos que utilicen soluciones de calibradores y de
control estabilizadas con ciclodextrinas.
La Figura 1 es un gráfico de los Efectos de las
Alfa, Beta y Gamma-Ciclodextrinas en la
Recuperación de Progesterona.
La Figura 2 es un gráfico de los Efectos de la
Recuperación con Beta-Ciclodextrina en Diversas
Matrices.
La Figura 3 es un gráfico de los Efectos de la
Concentración de Beta-Ciclodextrina en la
Recuperación con Trazador en el Ensayo para Estradiol.
La Figura 4A es un gráfico de la Estabilidad de
la Progesterona a 56ºC en Suero y Diversas Matrices conteniendo
Beta-Ciclodextrina.
La Figura 4B es un gráfico de la Estabilidad de
la Progesterona a 45ºC en Suero y Diversas Matrices conteniendo
Beta-Ciclodextrina.
La Figura 4C es un gráfico de la Estabilidad de
la Progesterona a 37ºC en Suero y Diversas Matrices conteniendo
Beta-Ciclodextrina.
La Figura 5A es un gráfico de las Concentraciones
de Progesterona (0-35 ng/ml) de Paneles Congelados,
determinadas utilizando calibradores almacenados a
2-8ºC.
La Figura 5B es un gráfico de las Concentraciones
de Progesterona (0-7 ng/ml) de Paneles Congelados,
determinadas utilizando calibradores almacenados a
2-8ºC, eje y ampliado.
La Figura 6 es un gráfico de la Estabilidad de la
Progesterona a 37ºC en Plasma Diagnostic Base, con y sin
Beta-ciclodextrina.
Los esteroides apropiados para su uso con la
invención son alguno o más de los numerosos compuestos orgánicos
liposolubles, de origen natural, que tienen como base un anillo de
17 átomos de carbono, e incluyendo, por ejemplo, los esteroles y
ácidos biliares, muchas hormonas, algunas drogas naturales tales
como los compuestos digitálicos y los precursores de algunas
vitaminas.
De interés particular con respecto a la presente
invención son aquellos esteroides que muestran actividad biológica
en humanos, y tienen tendencia a experimentar degradación oxidativa
en un medio acuoso tal como un fluido biológico. Estos esteroides
son dianas apropiadas para inmunoensayo y, por consiguiente, son
apropiados para ser utilizados como patrones para tales ensayos.
Tales patrones utilizan típicamente medios acuosos para presentar
el esteroide de referencia al ensayo en un medio similar a un fluido
biológico, por ejemplo un fluido corporal, en el que se está
conduciendo el inmunoensayo. Entre estos esteroides están los
esteroides hormonales de origen natural, y los de interés particular
son aquellos cuyos niveles biológicos normales fluctúan, tales como
las hormonas sexuales femeninas. Incluidas dentro de este grupo
están la progesterona, la estrona y el estradiol. Otros esteroides
de interés incluyen el cortisol y la testosterona. Por aquellos
especializados en la técnica se pueden contemplar todavía otros
esteroides para su uso en inmunoensayos, y están, por lo tanto,
dentro del campo de aplicación de la invención.
Las ciclodextrinas, como subproductos del maíz,
son muy preferidas para estabilizar los esteroides mencionados,
bajo condiciones apropiadas para el inmunoensayo. Especialmente
preferidas son la ciclodextrinas beta, gamma, y beta modificada.
Aquellos especializados en la técnica reconocerán que la
beta-ciclodextrina modificada es la
2-hidroxipropil-beta-ciclodextrina.
De los compuestos mencionados, es particularmente deseada la
beta-ciclodextrina.
La estructura anular de las ciclodextrinas en
general, y la molécula de beta-ciclodextrina en
particular, comunica unas propiedades que son diferentes de las de
los carbohidratos no cíclicos en un intervalo de peso molecular
similar, incluyendo la estabilidad en soluciones básicas calientes,
la resistencia a la hidrólisis por la mayor parte de los ácidos
orgánicos y algunas alfa amilasas, la resistencia total a la
fermentación por levaduras y a la hidrólisis por beta amilasa, y una
notablemente alta temperatura de descomposición de 300ºC. La
disposición molecular y las propiedades asociadas con esa
disposición dan a las ciclodextrinas mencionadas, y en particular a
la \beta-ciclodextrina, una propiedad única: la
capacidad de formar complejos de inclusión, atrapando moléculas
huéspedes dentro de ellos mismos, protegiéndolas e incluso
alterando alguna de sus propiedades. El interior hidrófobo de la
\beta-ciclodextrina, por ejemplo, es tal que las
moléculas esteroideas pueden entrar para su acomplejación, sin
cambiar su estructura actual. De este modo, la molécula de
\beta-ciclodextrina proporciona un mecanismo de
almacenamiento de largo plazo para los esteroides, y cuando están
listos para ser utilizados en inmunoensayos, los esteroides salen
con su estructura física intacta. Esto es, quizás, una razón por la
que la \beta-ciclodextrina es una ciclodextrina
particularmente preferida para su uso en la invención.
Es sumamente preferido que las ciclodextrinas,
como parte de la invención, estén incluidas en medios acuosos, y en
concreto, en aquellos medios acuosos que estén sustancialmente
libres de contenido de proteína. Aunque puede ser a menudo
conveniente para los patrones para un inmunoensayo que sean
transportados en un medio que sea similar o imite el comportamiento
de un fluido corporal humano tal como el suero, en algunos casos es
necesario utilizar un contenido de proteína drásticamente diferente
al del fluido corporal humano a ensayar. Esto puede permitir la
modificación de otras características del fluido corporal.
Se prefiere que el medio acuoso esté
sustancialmente libre de fibrinógeno. De este modo, es más
conveniente usar medios que no sean plasma. Con respecto a esto,
también se prefiere evitar medios que contengan componentes
formadores de material particulado.
En aquellas formas de realización algo menos
preferidas, en donde se utilizan medios basados en proteína, es
conveniente que la concentración de proteína varíe desde entre unos
10 y 300 mg/ml, o aproximadamente el 1 al 30%, con unos 50 mg/ml
siendo típicos para el suero. Se prefiere un intervalo de
concentración de aproximadamente el 2'5 al 25%, siendo especialmente
conveniente el 2'5 al 5%. Este contenido de proteína puede estar
presente de forma natural, por ejemplo en suero humano normal, o
puede ser añadido tal como un cinco por ciento en peso por volumen
de solución acuosa de albúmina de suero bovino (BSA). También se
pueden utilizar preparaciones disponibles comercialmente tales como
Plasma Diagnostic Base (PDB), las cuales son después depuradas por
carbón vegetal, así como SeraSub (TM).
Se prefiere que cualquier solución de proteína
esté esencialmente libre de esteroide endógeno. De este modo, si la
solución de proteína tiene que ser suero humano normal, se depura
por carbón vegetal, muy preferente, para eliminar los esteroides de
origen natural. Por otra parte, en algunos casos también se pueden
utilizar preparaciones de proteína de las se han eliminado los
esteroides mediante otras técnicas, tales como el comercialmente
disponible BSA sin esteroides, depurado con carbón vegetal. Entre
estas están aquellas obtenidas mediante el lavado con una fase
orgánica. Se es consciente de que el carbón vegetal puede aportar
metales de transición indeseables tales como el hierro. Se es
consciente de que la proteína, por sí misma, puede ser a menudo una
fuente de metales de transición indeseables. Se sabe que las
proteínas se acomplejan con metales en formas que hacen difícil
obtener proteína sin metales de transición.
Se prefiere, aunque no es necesario, que el medio
acuoso tenga un pH similar al de los fluidos corporales humanos. Es
particularmente conveniente que el medio acuoso tenga un pH entre
aproximadamente 6 y 9, siendo especialmente preferido un pH entre 7
y 8'5. El pH del medio acuoso se ajusta convenientemente con
cualquiera de los tampones comunes utilizados con las materias
biológicas, tales como el tris(hidroximetil) aminometano,
comúnmente conocido como TRIS. Como ejemplo, se puede utilizar una
concentración de TRIS 0'1M. Pueden estar disponibles otros tampones
para aquellos especializados en la técnica, junto con intervalos de
concentración no establecidos específicamente hasta este
momento.
Las concentraciones de esteroide de las
soluciones acuosas de interés deberían abarcar el intervalo de
concentraciones de esteroide encontrado al ensayar fluidos
corporales humanos. Típicamente, los diversos esteroides se ensayan
para niveles entre unos 5 picogramos por ml y 100 nanogramos por
ml. De interés particular son las concentraciones entre unos 5 x
10^{-11} y 4 x 10^{-8} gramos por ml.
Las ciclodextrinas, como parte de la invención,
deberían ser utilizadas en cantidades eficaces para inhibir la
degradación oxidativa de las soluciones acuosas de esteroides. Se
prefiere utilizarlas en cantidades superiores a aproximadamente 0'1
mM, y es particularmente preferido utilizarlas en cantidades entre
aproximadamente 0'2 y 25 mM. Es particularmente ventajoso utilizar
una concentración de ciclodextrina de al menos un 1 mM. Parece ser
una ventaja limitada utilizar concentraciones de ciclodextrina
superiores a unos 25 mM. Sin embargo, el utilizar concentraciones
superiores no parece tener mucha desventaja que no sea el
coste.
Una concentración especialmente preferida de
ciclodextrina, para su uso en la invención, estaría en el intervalo
de unos 2 mM a 6 mM, preferentemente unos 2'5 mM a 5 mM. En muchas
formas de realización es especialmente conveniente utilizar unos 2'4
mM a unos 2'7 mM de ciclodextrina para estabilizar las
formulaciones de esteroide. Las concentraciones mencionadas son a
menudo muy específicas de los esteroides y, por lo tanto, aquellos
especializados en la técnica pueden encontrar otras concentraciones
que mejor convengan a sus propias necesidades particulares, y pueden
variar algo dependiendo del esteroide concreto utilizado. Muy a
menudo, una cantidad sumamente conveniente de ciclodextrina a
utilizar es una que permita una recuperación de esteroide del 100%,
como se trató aquí adicionalmente.
La concentración de ciclodextrina utilizada como
parte de la invención debería no poner en peligro los datos de
recuperación del esteroide concreto en cuestión en los
inmunoensayos. Es sumamente conveniente que exista una recuperación
de aproximadamente el 100% para el esteroide, basada en la
concentración concreta de ciclodextrina que se utilice en la
correspondiente solución de calibrador. Las beta y
gamma-ciclodextrinas permiten una recuperación del
100% del esteroide y, por lo tanto, mitigan adicionalmente la
necesidad de una matriz conteniendo proteína para almacenar el
esteroide. Puesto que la proteína contribuye a la descomposición
del esteroide, muchas veces existe una ventaja distinta al no
utilizar este medio. Sin embargo, los medios basados en proteína
pueden, en muchos casos, mostrar aún unos datos de recuperación
aceptables, o incluso excelentes.
La inhibición de la degradación oxidativa lograda
por las ciclodextrinas, y particularmente por la
\beta-ciclodextrina, puede ser valorada
convenientemente acentuando las soluciones acuosas de esteroide a
elevadas temperaturas durante varias veces, y observando la pérdida
de contenido de esteroide detectable mediante inmunoensayo. Los
resultados obtenidos por pruebas a elevadas temperaturas son
proféticos de la estabilidad a largo plazo de las soluciones de
esteroide mantenidas a temperaturas inferiores.
Los estándares de esteroides para inmunoensayos
son típicamente mantenidos a temperaturas entre unos 2 y 8ºC, y
tienen convenientemente estabilidades superiores a unos seis meses,
esto es, no muestran una degradación significativa antes de los
seis meses. Es particularmente conveniente que los estándares
muestren una pérdida de señal en un inmunoensayo inferior a
aproximadamente el 10 por ciento, preferentemente menos de un 5 por
ciento, e incluso más convenientemente menos de un 1 por ciento.
Tales estabilidades pueden ser convenientemente
proyectadas a partir de la termomaduración a unos 37ºC, y superior,
por encima del transcurso de entre, por ejemplo, 2 a 5 semanas. Se
espera que las composiciones que muestren menos de alrededor de un
10% de pérdida durante cuatro semanas tengan unas estabilidades
superiores a unos seis meses. Se pueden esperar resultados similares
para composiciones que exhiban también menos de un 5% de pérdida
después de aproximadamente 2'5 semanas.
Los ejemplos siguientes son ilustrativos de la
invención, y de ningún modo son para ser interpretados como
limitando el campo de aplicación de la invención, como se define en
las reivindicaciones. Se apreciará que un especializado en la
técnica pueda concebir muchos otros dispositivos y métodos de
empleo a los que se pueda aplicar los presentes conceptos
inventivos.
Los ensayos de estradiol fueron realizados con el
siguiente formato, en cartuchos desechables IMx® de Abbott
Laboratories, mediante un instrumento IMx®. Se mezclaron setenta y
cinco microlitros (75 \mul) de una muestra de suero con 35 \mul
de tampón de
5-\alpha-dihidrotestosterona
(DHT), 50 \mul de micropartículas recubiertas de anticuerpo
anti-estradiol, y 90 \mul de Tampón IMx®. La
mezcla de reacción fue incubada durante 27'5 minutos a 35ºC. El
tampón DHT estaba compuesto de 2 \mug/ml de
5-\alpha-dihidrotestosterona,
0'75% (p/v) de saponina, 0'5 M de glicina, 0'25 mM de citrato sódico
y 0'12% de metil isotiazolinona, todo a pH 4'5. Las micropartículas
recubiertas con anticuerpo anti-estradiol
(0'005-0'02% de sólidos) fueron suspendidas en
tampón para micropartículas, el cual estaba compuesto de 0'1 M de
bis-(2-hidroxietil)iminotris(hidroximetil)metano
(Bis-Tris), 0'1 M de cloruro sódico, 13'6% de
sacarosa, 0'1% de azida sódica, y 0'2 mg/ml de IgG de conejo
normal, todo a pH 6'5. El Tampón IMx® estaba compuesto de 0'3 M de
ClNa, 0'1 M de TRIS [tris(hidroximetil)aminometano],
0'1% de azida sódica, todo a pH 7'5. Los reactivos para IMx®
Estradiol (incluyendo el tampón DHT, las micropartículas
recubiertas con anticuerpo anti-estradiol de conejo,
estrógeno conjugado y sustrato de fosfato de metilumbeliferona),
Tampón IMx®, cartuchos desechables IMx®, e instrumentos IMx® están
disponibles por Abbott Laboratories, Abbott Park, IL, y están
descritos en US 5.342.760, EP-A-288
793, y en Fiore y col., Clin. Chem. 34/9:
1.726-1.732, 1988.
Se transfirieron ciento setenta y cinco
microlitros (175 \mul) de la mezcla de reacción a la matriz de
fibra de un cartucho desechable IMx®. La matriz de fibra está
colocada sobre una almohadilla absorbente del cartucho IMx®. Las
micropartículas fueron capturadas por la matriz de fibra, y la
solución fue absorbida por la almohadilla absorbente. Después, las
micropartículas fueron lavadas con Tampón IMx®. Se añadieron
sesenta microlitros (60 \mul) de un conjugado de
esteroide-fosfatasa alcalina a la matriz, se incubó
durante 12 segundos a 37ºC, y después se lavó nuevamente con Tampón
IMx®. El conjugado (2-8 \mug/ml de fosfatasa
alcalina) estaba en tampón conjugado compuesto de 0'1 M de
Bis-Tris, 0'5 M de cloruro sódico, 1% de caseína, 1
mM de cloruro magnésico, 0'1 mM de cloruro de zinc, 0'1% de azida
sódica, todo a pH 6'5.
A la matriz se añadió sesenta y cinco microlitros
(65 \mul) de una solución 1'2 mM de fosfato de
4-metilumbeliferona en tampón de
2-amino-2-metil-1-propanol
0'1M, pH 9, y se midió la velocidad de formación de
4-metilumbeliferona mediante reflectancia de la
fluorescencia. El instrumento IMx® midió la fluorescencia con un
fluorómetro que utilizaba una lámpara de arco de mercurio como
fuente de luz (como se describió en Fiore y col., Clin. Chem. 34/9:
1.726-1.732, 1988.
Los ensayos de progesterona fueron realizados en
cartuchos desechables IMx®, mediante un instrumento IMx®,
utilizando un formato similar al ensayo de estradiol en el Ejemplo
1, con las modificaciones siguientes.
Se mezclaron 30 microlitros (30 \mul) de una
muestra de suero con 50 \mul de un reactivo de conjugado de
anti-progesterona/fosfatasa alcalina, y 49 \mul de
Tampón IMx®. La mezcla de reacción fue incubada durante 10'2
minutos a 35ºC. A la reacción se añadieron 51 \mul de reactivo de
micropartículas recubiertas con anticuerpo
anti-fluoresceína, 50 \mul de reactivo de
bihapteno, y 3 \mul de Tampón IMx®, y se continuó la incubación
durante 10'2 minutos a 35ºC. Se transfirió ciento ochenta
microlitros (180 \mul) de la mezcla de reacción a la matriz de
fibra de un cartucho desechable IMx®. Después, los complejos fueron
lavados con Tampón IMx®, y dejados incubar durante 10'2 minutos a
35ºC. La adición de fosfato de 4-metilumbeliferona
y la cuantificación de la velocidad de formación de
4-metilumbeliferona fueron como se describió en el
Ejemplo 1.
El reactivo de conjugado de anticuerpo
anti-progesterona/fosfatasa alcalina fue preparado
utilizando fosfatasa alcalina de intestino de ternero (disponible
por Boehringer Mannheim, Alemania) y un anticuerpo monoclonal
anti-progesterona (Universidad de Surrey,
Inglaterra). La fosfatasa fue modificada con iminotiolano (reactivo
de Traut), y las dos proteínas fueron unidas con un conector
heterobifuncional de maleimida/succinimida. El reactivo de
conjugado contiene 100 mM de TRIS, pH 7'5, 500 mM de cloruro sódico,
0'1% (p/v) de azida sódica, 1% (p/v) de caseína, 1 mM de cloruro
magnésico, 0'1 mM de cloruro de zinc, y 0'5 mg/ml de suero de
oveja. Las concentraciones de trabajo típicas son aproximadamente de
0'3 \mug/ml con respecto al anticuerpo.
El reactivo de micropartículas
anti-fluoresceína se preparó utilizando
micropartículas de látex modificadas en el carboxilo (disponibles
por Seradyne, Indianápolis, IN) y un anticuerpo monoclonal
anti-fluoresceína (Abbott). El anticuerpo fue
covalentemente unido a la micropartícula utilizando
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida
(EDAC). El reactivo de micropartículas contiene 150 mM de TRIS, pH
7'2, 200 mM de cloruro sódico, 13'6% (p/v) de sacarosa, 0'1% (p/v)
de azida sódica, 0'1% (v/v) de Tween 20 (TM), y 0'1 mg/ml de IgG de
ratón. Las concentraciones de trabajo típicas de las micropartículas
son aproximadamente de 0'02% de sólidos de látex.
El reactivo de hapteno contiene
progesterona-11
alfa-hemisuccinato-5-(aminoacetamido)
fluoresceína en un tampón conteniendo 100 mM de TRIS, pH 7'5, 500
mM de cloruro sódico, 0'1% (p/v) de azida sódica, 1% (p/v) de
ca-
seína, 1 mM de cloruro magnésico, y 0'1 mM de zinc. Las concentraciones de trabajo típicas del bihapteno son 5 nm.
seína, 1 mM de cloruro magnésico, y 0'1 mM de zinc. Las concentraciones de trabajo típicas del bihapteno son 5 nm.
Los ensayos de progesterona fueron realizados en
cartuchos desechables AxSYM®, mediante un instrumento AxSYM®,
utilizando un formato similar al ensayo IMx® en el Ejemplo 2, con
las modificaciones siguientes.
Se mezclaron 42 microlitros (42 \mul) de una
muestra de suero con 76 \mul de un reactivo de conjugado
anti-progesterona/fosfatasa alcalina, y 68 \mul de
Tampón de Ensayo AxSYM® Progesterona conteniendo aditivos
proteicos. La mezcla de reacción fue incubada durante 10 minutos a
31ºC. Después se añadió 120 \mul de la reacción a 95 \mul de un
reactivo que contiene el equivalente de ambos reactivos de
micropartículas y de bihapteno del Ejemplo 2. Se continuó la
incubación durante 9'2 minutos a 31ºC. Se transfirió ciento treinta
y cinco microlitros (135 \mul) de la mezcla de reacción a la
matriz de fibra de un cartucho desechable AxSYM®. Luego, los
complejos fueron lavados con Tampón AxSYM®, se añadió 50 \mul de
fosfato de 4-metilumbeliferona, y se cuantificó la
velocidad de formación de 4-metilumbeliferona.
Se preparó el reactivo de conjugado anticuerpo
anti-progesterona/fosfatasa alcalina como se
describe en el Ejemplo 2, excepto que se utilizó una fosfatasa
alcalina recombinante (Abbott). El reactivo combinado contiene
micropartículas y bihapteno, similares a aquellos descritos en el
Ejemplo 2, en un tampón conteniendo 150 mM de TRIS, pH 6'2, 200 mM
de cloruro sódico, 18% (p/v) de sacarosa, 0'1% (p/v) de azida
sódica, 0'1% (v/v) de Tween 20 (TM), y 0'1 mg/ml de IgG de
ratón.
Se examinaron los efectos de las ciclodextrinas
en la recuperación de progesterona, en los experimentos resumidos
en la Fig. 1. Se añadió progesterona, hasta una concentración final
de 4 ng/ml, a suero y a soluciones diversas de ciclodextrina. Las
soluciones de ciclodextrina contenían 0-10 mM de
alfa, beta (3 lotes, 2 proveedores) o
gamma-ciclodextrina en 100 mM de TRIS, pH 8, (las
ciclodextrinas están disponibles por Sigma Chemical Co., St. Louis,
MO; e ICN, Irving, CA). Las concentraciones aparentes de
progesterona de estas muestras fueron determinadas utilizando el
ensayo de progesterona en el instrumento IMx® (Ejemplo 2). La
concentración observada de progesterona en la muestra de suero (4'08
ng/ml) representa el 100% de recuperación. La recuperación de
progesterona de las muestras con beta y
gamma-ciclodextrina variaron del 20 al 190%
(Recuperación = observada/4'08 x 100%). Basado en este experimento,
una solución de 2'7 mM de beta-ciclodextrina o 1'3
mM de gamma-ciclodextrina mostrarían una
recuperación equivalente a la observada con suero. La
alfa-ciclodextrina no afecta significativamente a la
recuperación de progesterona por encima de las concentraciones de
ciclodextrina examinadas en este estudio.
Se examinaron los efectos de las ciclodextrinas
en la recuperación de progesterona en diversas matrices sintéticas
de calibrador, en los experimentos resumidos en la Fig. 2. Se
añadió progesterona, hasta una concentración final de 20 ng/ml, a
suero y a diversas matrices sintéticas de calibrador conteniendo
0-10 mM de beta-ciclodextrina. Las
matrices sintéticas incluían TRIS 100 mM, pH 8, conteniendo 2'5%
(p/v) de Albúmina de Suero Bovino (BSA) (disponible por Miles
Pentex, Kankakee, IL), y SeraSub^{TM} (disponible por Creative
Scientific Technology Inc., Great Neck, NY). Las concentraciones
aparentes de progesterona de estas muestras fueron determinadas
utilizando el ensayo de progesterona en el instrumento IMx® (Ejemplo
2). La concentración observada de progesterona de 20 ng/ml
representa el 100% de recuperación. La recuperación de progesterona
de las muestras de ciclodextrina variaron del 20 al 330%
(Recuperación = observada/20 x 100%). Las concentraciones de
ciclodextrina necesarias para lograr el 100% de recuperación son muy
similares para las matrices no conteniendo proteína (TRIS 100 mM,
pH 8; SeraSub^{TM}). Los efectos en la modulación de la
recuperación de proteína y ciclodextrina son aditivos. A altas
concentraciones de proteína (>12%), no se necesita ciclodextrina
para el 100% de recuperación (datos no mostrados).
Se examinaron los efectos de las ciclodextrinas
en la recuperación de estradiol, en los experimentos resumidos en
la Fig. 3. Se añadió estradiol, hasta una concentración final de 1
ng/ml, a suero y a soluciones de TRIS 100 mM, pH 8, conteniendo
0-10 mM de beta-ciclodextrina. Las
concentraciones aparentes de estradiol de estas muestras fueron
determinadas utilizando el Ensayo IMx® de Estradiol (Ejemplo 1). En
la Fig. 3 se examinaron dos formatos de ensayo de estradiol. Los
formatos se diferenciaban en la fuente de
anti-estradiol de conejo utilizada en el reactivo de
micropartículas (Conejo 583 o Conejo 581, Abbott). La recuperación
de estradiol de las muestras con ciclodextrina variaron del 5 al
330% (Recuperación = observada (ciclodextrina)/observada (suero) x
100%). Basado en este experimento, una solución de aproximadamente
1'5 a 1'75 mM de beta-ciclodextrina mostraría una
recuperación equivalente a la observada con suero.
Se examinaron los efectos de la
beta-ciclodextrina en la estabilidad de la
progesterona, en los experimentos resumidos en las Figs.
4A-C. Se añadió progesterona, hasta una
concentración final de 4 ng/ml, a suero y a dos matrices sintéticas
de calibrador conteniendo 2'5 mM de
beta-ciclodextrina. Las matrices sintéticas fueron
TRIS 100 mM, pH 8, y SeraSub (TM). Estas muestras fueron repartidas
en partes iguales, e incubadas a 56, 45, 37, ó -20ºC durante hasta
17 días. En los puntos temporales designados, se determinaron las
concentraciones aparentes de progesterona de estas muestras,
utilizando el ensayo de progesterona en el instrumento IMx®
(Ejemplo 2). Para estos experimentos, en la misma serie de ensayo
con las alícuotas del ensayo se incluyó una muestra de suero con 0
ng/ml. Se determinaron las concentraciones para cada muestra de
ensayo dividiendo la señal de frecuencia del instrumento IMx®, de la
muestra termoforzada o congelada, por la señal de la muestra con 0
ng/ml, y trazando el diagrama del resultado en una curva de de
desplazamiento [frecuencia (calibrador)/frecuencia (0 ng/ml) frente
a concentración] desarrollada previamente para este ensayo. El
porcentaje de pérdida se determina dividiendo la diferencia entre
los estados congelado y forzado por la concentración obtenida por
la alícuota congelada. Los resultados se exhiben como porcentaje de
pérdida, esto es [(Congelado-Forzado)/Congelado] x
100%.
El porcentaje de pérdida observado con las
muestras conteniendo ciclodextrina es significativamente menor que
el observado con el suero. A 56ºC, se perdió el 98% de la
progesterona de la muestra de suero, mientras que las muestras con
TRIS y SeraSub TM no mostraron pérdida prácticamente.
Se diseñó la composición de las muestras con
ciclodextrina para que estas muestras exhibieran una recuperación
equivalente a la del suero. En estos experimentos, el empleo como
control de TRIS 0'1M o SeraSub TM no conteniendo ciclodextrina fue
inapropiado debido a cuestiones relativas a la sobrerrecuperación,
solubilidad y adherencia del esteroide a la pared del recipiente
bajo tal condición.
Se examinaron los efectos de la
beta-ciclodextrina en la estabilidad a largo plazo
de la progesterona, en los experimentos resumidos en las Figs. 5A y
B. Se prepararon calibradores de beta-ciclodextrina
en TRIS 100 mM, pH 8, a 0, 0'7, 2'0, 7'0, 20 y 40 ng/ml, y se
almacenaron a 2-8ºC. Se prepararon paneles basados
en suero a aproximadamente 1'3 (Baja), 6 (Media), y 22 (Alta) ng/ml,
y después se congelaron, un estado en el que la progesterona es
estable. En los puntos temporales designados, se determinaron las
concentraciones de progesterona de estos paneles con los
calibradores almacenados, utilizando el Ensayo AxSYM® de
Progesterona (Ejemplo 3). Los datos en las Figs. 5A y 5B indican que
las concentraciones de los paneles permanecen constantes con el
tiempo. Si hubiera una pérdida de progesterona en los calibradores
almacenados a 2-8ºC, las concentraciones aparentes
de progesterona en los paneles congelados hubieran tendido hacia
arriba. (Nota: los calibradores utilizados para el punto temporal
de la semana 16 fueron almacenados congelados. Los calibradores
utilizados para todos los otros puntos temporales fueron almacenados
a 2-8ºC) (Las barras de error representan dos
desviaciones estándar, n=18 para cada punto temporal).
Se examinaron los efectos de la
\beta-ciclodextrina en la estabilidad de la
progesterona en matrices conteniendo proteína, en los experimentos
resumidos en la Fig. 6. Se añadió progesterona, hasta una
concentración final de 4 ng/ml, a solamente Plasma Diagnostic Base
(PDB, Intergen Co., Nueva York) depurado con carbón vegetal, y a
PDB depurado con carbón vegetal conteniendo 1'5 mM de
\beta-ciclodextrina. En esta segunda matriz, se
diluyó un poco el PDB para compensar el efecto de la
\beta-ciclodextrina en la recuperación de
progesterona. Estas muestras se repartieron en partes iguales y se
incubaron a 37 ó 20ºC, durante hasta 28 días. En los puntos
temporales designados se determinaron las concentraciones aparentes
de progesterona de estas muestras, utilizando el ensayo de
progesterona en el instrumento IMx® (Ejemplo 2). El método utilizado
para calcular la concentración y el % de pérdida de progesterona
fue el mismo que en el Ejemplo 7. El % de pérdida de progesterona
es significativamente menor en el PDB conteniendo
\beta-ciclodextrina que en el PDB solo. Durante
los 28 días de incubación a 37ºC, solamente se pierde el 13% de la
concentración original de progesterona, en comparación con el 56%
en el PDB no conteniendo \beta-ciclodextrina. Este
ejemplo demuestra que las ciclodextrinas, y en particular la
\beta-ciclodextrina, pueden ser utilizadas para
estabilizar las formulaciones de esteroides en medios conteniendo
proteína.
Claims (17)
1. El empleo de una composición para un
inmunoensayo de esteroides, comprendiendo un esteroide y una
ciclodextrina en una concentración eficaz para lograr un nivel de
recuperación de esteroides que imite la recuperación de esteroides
de suero humano en un medio acuoso.
2. El empleo de la composición según la
Reivindicación 1, comprendiendo un esteroide biológicamente activo y
al menos una ciclodextrina seleccionada del grupo que se compone de
ciclodextrina beta, gamma, y beta modificada en un medio acuoso sin
proteína.
3. El empleo de la composición según la
Reivindicación 1, comprendiendo un esteroide biológicamente activo,
susceptible de degradación, y \beta-ciclodextrina
en un medio acuoso sin proteína.
4. El empleo de la composición según la
Reivindicación 1, comprendiendo un esteroide sensible al oxígeno y
\beta-ciclodextrina disueltos en un fluido
biológico.
5. El empleo de la composición según la
Reivindicación 1, en donde la composición es una composición acuosa
de calibrador de esteroides, estable al almacenamiento, apropiada
para su uso en inmunoensayos, comprendiendo:
- 1)
- al menos un compuesto esteroideo; y
- 2)
- al menos una ciclodextrina seleccionada del grupo que se compone de ciclodextrina beta, gamma y beta modificada.
6. El empleo de la composición de calibrador de
la Reivindicación 5, en un ensayo inmunodiagnóstico de suero o
plasma humano comprendiendo:
- 1)
- un compuesto esteroideo biológicamente activo, degradable por oxígeno; y
- 2)
- \beta-ciclodextrina
7. El empleo de la composición de la
Reivindicación 6, en donde el esteroide es estradiol o
progesterona.
8. El empleo de la composición de la
Reivindicación 7, en donde el esteroide es estradiol.
9. El empleo de la composición según la
Reivindicación 3, en donde el medio acuoso está libre de
fibrinógeno.
10. El empleo de la composición según la
Reivindicación 3, en donde el medio acuoso es otra cosa que
plasma.
11. El empleo de la composición según la
Reivindicación 1, constando además de proteína seleccionada del
grupo que se compone de suero humano y albúmina de suero bovino.
12. El empleo de la composición según la
Reivindicación 11, en donde dicho suero humano está depurado con
carbón vegetal.
13. El empleo de la composición de la
Reivindicación 5, en donde la composición comprende además proteína
seleccionada del grupo que se compone de suero humano y albúmina de
suero bovino.
14. El empleo de la composición de la
Reivindicación 13, en donde dicho suero humano está depurado con
carbón vegetal.
15. El empleo de la composición según la
Reivindicación 1, en donde el esteroide tiene una concentración de
2'5 x 10^{-11} a 1'0 x 10^{-7} g/ml, y la concentración de la
ciclodextrina es mayor de 0'1 mM.
16. El empleo de la composición según la
Reivindicación 1, en donde el esteroide tiene una concentración de
2'5 x 10^{-11} a 1'0 x 10^{-7} g/ml, y la concentración de la
ciclodextrina es de 0'2 mM a 25 mM.
17. El empleo de la composición según la
Reivindicación 1, en donde el esteroide tiene una concentración de
2'5 x 10^{-11} a 1'0 x 10^{-7} g/ml, y la concentración de la
ciclodextrina es de 2 mM a 6 mM.
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| JP3787161B2 (ja) | 2006-06-21 |
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| DE69635275T2 (de) | 2006-07-20 |
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