ES2253235T3 - Composiciones cosmeticas y farmaceuticas que comprenden derivados del acido urocanico como secuestradores de radicales o antioxidantes. - Google Patents

Abstract

Una composición farmacéutica que comprende ácido urocánico y uno de sus productos de oxidación. La invención proporciona el uso del ácido urocánico y uno de sus productos de oxidación para la preparación de una composición farmacéutica o cosmética, por ejemplo para el tratamiento del estrés oxidativo, tal como se manifiesta, por ejemplo, en arrugas y otros signos del envejecimiento tisular, en particular de la piel. El estrés oxidativo en organismos vivos y sus tejidos, en particular la oxidación de proteínas, se ha relacionado con el fenómeno del envejecimiento, formación de arrugas, daño agudo de proteínas, isquemia-reperfusión, ateroesclerosis, y muchas enfermedades crónicas, tales como psoriasis, escleroderma, lupus eritematoso, dermatitis alérgica por contacto, vitiligo, liquen plano y enfermedad de injerto frente a hospedador, y para cuyo tratamiento la invención proporciona ahora una composición farmacéutica o cosmética que comprende el ácido urocánico o su equivalente funcional. Talcomposición también se usa de manera ventajosa para fines moduladores inmunitarios.

Description

Composiciones cosméticas y farmacéuticas que comprenden derivados del ácido urocánico como secuestradores de radicales o antioxidantes.

La invención se refiere a antioxidantes o secuestradores de radicales y sus productos de reacción.

El ácido trans-urocánico (trans-UCA) es un componente absorbente de radiación ultravioleta (UV) importante de la epidermis humana. La absorción de la radiación UV de la región UV-C (200-290 nm) a la región UV-A-I (340-400 nm) provoca la fotoisomerización del trans-UCA al cis-UCA in vivo e in vitro [1-3]. Debido a esta propiedad, el trans-UCA se ha usado como agente protector solar natural [4]. Este uso se ha minimizado posteriormente puesto que se hizo evidente que el fotoproducto cis-UCA puede mimetizar algunos de los efectos de la radiación UV sobre la inmunidad, sugiriendo que este compuesto es un mediador importante de la inmunosupresión inducida por radiación UV [5], no obstante, por el momento no está claro cual es el papel principal del UCA o su modo de acción en el contexto de la inmunomodulación. Aunque experimentos in vivo proporcionan evidencias del potencial inmunosupresor del cis-UCA (6-12), es notable que en una serie de cultivos celulares (in vitro) no se encontró supresión (13-17). Se pueden inducir niveles similares de cis-UCA mediante radiación UV-A y UV-B, pero sin embargo, la radiación UV-B es más potente en la supresión de la hipersensibilidad por contacto que la radiación UV-A (18).

El documento WO 94/22441 A describe el uso de ciertos isómeros, derivados y análogos del ácido urocánico para el tratamiento tópico de una dolencia de la piel que implica una respuesta inmunitaria sobreactivada.

Los RESÚMENES DE PATENTES DE JAPÓN, Vol. 18, Nº 236, 6 de mayo de 1994 (6-5-1994) y el documento JP 06 024978 A describen al 5-(carboximetil)imidazol como agente antialérgico.

La invención proporciona compuestos y composiciones para su uso en procedimientos para el secuestro de radicales o para la modulación de la respuesta inmunitaria que comprenden ácido urocánico y uno de sus productos de oxidación o que comprende un producto de oxidación del ácido urocánico. Dichos compuestos, composiciones y procedimientos según se proporcionan por la invención están basados en la nueva percepción de que los isómeros del ácido urocánico son secuestradores de radicales y sirven como antioxidantes naturales en el cuerpo, en particular en la piel. La exposición de la piel a la radiación UV provoca un nivel incrementado de estrés oxidativo con la formación inherente de radicales reactivos (hidroxilo). En el presente documento se muestra que (las sales de) los isómeros del ácido urocánico y uno de sus productos de oxidación o que comprende un producto de oxidación del ácido urocánico actúan como antioxidantes fisiológicos capaces de proteger eficazmente las fases lipidicas de las membranas biológicas y las sustancias proteináceas en entornos acuosos frente a la acción de radicales tales como hidroxilo, oxígeno singlete u otras especies electrónicas raras reactivas. Estas especies se pueden generar a partir de peróxido de hidrógeno tras la irradiación con luz UV, y a partir de peróxido de hidrógeno en presencia de iones metálicos (por ejemplo, Fe^{2+}), la reacción de Fenton. Ambos tipos de reacciones se pueden producir en la epidermis [6]. En condiciones de estrés oxidativo, potenciadas por la exposición a la radiación UV [7], es evidente que los isómeros del UCA se encontrarán con los radicales hidroxilo producidos aleatoriamente in situ.

El uso del ácido urocánico y uno de sus productos de oxidación o el uso de un producto de oxidación del ácido urocánico como antioxidante o secuestrador de radicales es ventajoso frente al uso de otros antioxidantes, tales como la vitamina E, que normalmente no son solubles en agua o sólo parcialmente, mientras que el ácido urocánico o sus análogos se disuelven fácilmente en disoluciones acuosas. Especialmente cuando dicha sustancia comprende un producto alimenticio o un producto cosmético, que normalmente están basados en agua, es ventajoso el uso del ácido urocánico o su equivalente funcional como se proporciona por la invención sobre antioxidantes insolubles en agua. Ambos isómeros son secuestradores de radicales hidroxilo solubles en agua y se pueden usar en la fase acuosa de numerosas emulsiones. Además, los isómeros del ácido urocánico, al ser componentes naturales del cuerpo, son esencialmente no tóxicos, que adicionalmente es una ventaja cuando se prepara un producto alimenticio o un producto cosmético.

La invención proporciona el uso del ácido urocánico y uno de sus productos de oxidación para la preparación de una composición farmacéutica o cosmética, por ejemplo para el tratamiento del estrés oxidativo, tal como se manifiesta, por ejemplo, en arrugas y otros signos del envejecimiento tisular, en particular de la piel. El estrés oxidativo en organismos vivos y sus tejidos, en particular la oxidación de proteínas, se ha relacionado con el fenómeno del envejecimiento, formación de arrugas, daño agudo de proteínas, isquemia-reperfusión, ateroesclerosis, y muchas enfermedades crónicas, tales como psoriasis, escleroderma, lupus eritematoso, dermatitis alérgica por contacto, vitiligo, liquen plano y enfermedad de injerto frente a hospedador, y para cuyo tratamiento la invención proporciona ahora una composición farmacéutica o cosmética que comprende el ácido urocánico o su equivalente funcional. Tal composición también se usa de manera ventajosa para fines moduladores inmunitarios.

En todavía otra forma de realización, la invención proporciona el uso de un producto de oxidación del ácido urocánico para la preparación de una composición farmacéutica, en particular, en la que dicho producto es un producto de fotooxidación. En el presente documento se usa la nueva perspectiva de que como consecuencia del secuestro de radicales, los isómeros del UCA epidémicos son convertidos por las especies reactivas de oxígeno (ROS) en los productos de oxidación con efectos biológicos, es decir, inmunomoduladores. En contraste con la fotoisomerización del UCA, aún no se ha prestado demasiada atención a la oxidación del UCA. En particular a la reacción de los isómeros del UCA con los radicales hidroxilo muy reactivos. Los radicales hidroxilo se pueden generar a partir de peróxido de hidrógeno tras la irradiación con luz UV, y a partir de peróxido de hidrógeno en contacto con iones metálicos reducidos, por ejemplo, iones ferrosos (Fe^{2+}). Ambos tipos de reacciones se pueden producir en la epidermis (6).

En condiciones de estrés oxidativo, potenciado por la exposición a la radiación UV (7), es evidente que los isómeros del UCA se encontrarán con los radicales hidroxilos producidos aleatoriamente. Ahora proporcionamos la perspectiva de que, en general, no es el ácido cis-urocánico per se el que proporciona la modulación o la represión de las respuestas inmunitarias, sino los productos de oxidación del ácido urocánico, que aparecen, por ejemplo, tras la exposición a la luz ultravioleta (UV) de, por ejemplo, la piel. En el presente documento, el ácido urocánico secuestra los radicales formados por exposición a la luz UV, oxidándose así a, por ejemplo, imidazoles que contienen derivados del ácido urocánico, tales como imidazol-4-carboxaldehído, ácido imidazol-4-acético o ácido imidazol-4-carboxílico, que posteriormente modulan, suprimen o mitigan una respuesta inmunitaria organizada del cuerpo al daño tisular inducido por la luz UV.

Proporcionando la percepción de este mecanismo natural, proporcionamos la percepción de que los mecanismos moduladores inmunitarios están en funcionamiento para mantener las respuestas inmunitarias (excesivamente fuertes), por ejemplo dirigida a la exposición a la radiación UV de día. La invención proporciona así el uso de una composición farmacéutica que comprende un producto de oxidación del ácido urocánico para la modulación de las respuestas inmunitarias frente a diversos estímulos, mimetizando así una acción natural, previamente desconocida, de dicho producto. La invención proporciona con ella un procedimiento para modular una respuesta inmunitaria de un animal, por ejemplo, un ser humano, que comprende el tratamiento de dicho animal con una composición farmacéutica que comprende un producto de oxidación del ácido urocánico, por ejemplo, en el que dicho producto es un imidazol tal como imidazol-4-carboxaldehído, ácido imidazol-4-acético o ácido imidazol-4-carboxílico o un derivado imidazolona del ácido urocánico tal como ácido 3-(4-imidazolon-2-il)-acrílico y ácido 3-(4-imidazolon-5-il)-acrílico. En particular la invención proporciona el uso de uno o más productos de la fotooxidación del UCA como modulador inmunitario en diversas enfermedades cutáneas, tales como psoriasis o dermatitis. Además, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende el ácido urocánico por sus propiedades secuestradoras de radicales, por lo que dicha composición se usa adicionalmente como modulador inmunitario, y que comprende sus productos de oxidación que tienen una función moduladora de la inmunidad.

La invención se explica en profundidad en la descripción detallada.

Descripción detallada

Se probaron el trans-UCA, el cis-UCA, los imidazoles relacionados y los compuestos no imidazol con respecto a su capacidad de competir con la deoxiribosa para secuestrar los radicales hidroxilo. Durante la exposición a los radicales hidroxilo la deoxiribosa se degradó a malondialdehído, que reacciona con el ácido tiobarbitúrico para formar un cromógeno rosa. Los secuestradores de radicales hidroxilo potentes compiten con la deoxiribosa, dando como resultado una cantidad reducida de malondialdehído [22]. Se probaron diez compuestos, el UCA, análogos del UCA, alanina y ácido úrico (Fig. 1) por su capacidad para secuestrar radicales hidroxilo.

Procedimiento: prueba de degradación de la deoxiribosa (dR). La prueba fue análoga al procedimiento descrito anteriormente [22]. Resumiendo, las reacciones se realizaron en tubos de vidrio de 5 ml con tapón a rosca en un volumen final de 1,0 ml de tampón fosfato sódico (50 mM; pH 7,2), que contienen 2-deoxi-D-ribosa 3,0 mM, peróxido de hidrógeno 0,5 mM y uno de los compuestos de prueba a concentraciones graduadas. La reacción se inició mediante la adición de una disolución premezclada de EDTA disódico y hierro ferroso con concentraciones finales de 0,5 mM y 0,2 mM, respectivamente. La mezcla se dejó durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de la adición de 1,0 ml de ácido tiobarbitúrico al 1% en NaOH 50 mM y 0,75 ml de ácido tricloroacético al 2,8%, los tubos se calentaron durante 20 minutos en un baño de agua hirviendo. El color rosa se leyó a 532 nm y los valores de absorción recíprocos se representaron frente a la concentración del compuesto de prueba después de la resta de los blancos correspondientes. Se empleó una serie de seis determinaciones duplicadas de las diluciones del compuesto de prueba para construir una pendiente gráfica para el cálculo del valor de la constante de velocidad. La media, la D.E., el número de las constantes de velocidad, y el porcentaje de inhibición de la degradación de la deoxiribosa, calculados para cada compuesto, se listaron. Resultados. Todas las constantes de velocidad de segundo orden para la reacción con los radicales hidroxilo y, además, el porcentaje de inhibición de la degradación de deoxiribosa con concentraciones equimolares (3 mM) del secuestrador se resumen en la Tabla 1. Una gráfica típica con pendientes con las que obtener las constantes de velocidad se presenta en la Fig. 2 para ambos isómeros del UCA. El trans-UCA y el cis-UCA son sustancialmente más potentes en el secuestro de radicales hidroxilo (8,0 y 7,1 x 10^{9} M^{-1}. s^{-1}, respectivamente), que los otros imidazoles 4-(5-)-sustituidos, incluyendo L-histidina (2,6 x 10^{9} M^{-1}.s^{-1}). La L-histidina, el precursor del UCA, se incluyó como secuestrador moderado conocido [22-24] con similitudes estructurales al UCA. La L-alanina se usó como mal secuestrador conocido [22]. El trans-FAA se probó como derivado del ácido acrílico no imidazólico, que en su lugar tiene un anillo furano. Esta sustitución dio una capacidad secuestradora muy mala.

Otros análogos de imidazol 4-(5-)-sustituidos, el ácido dihidrourocánico o el ácido 3-(imidazol-4-il)-propiónico y el ácido imidazol-4-acético, presentaron una capacidad secuestradora moderada, comparable a la histidina. El imidazol no sustituido y su 2-metilderivado parecen ser secuestradores más fuertes que los isómeros del UCA. El secuestrador de radicales hidroxilo, ácido úrico, muy conocido presentó una capacidad excelente (27,8 x 10^{9} M^{-1}.s^{-1}).

El trans-UCA y el cis-UCA, dos compuestos de la epidermis, son buenos secuestradores de radicales hidroxilo; su capacidad es inferior a la del ácido úrico, pero superior a la de los otros imidazoles 4-(5-)-sustituidos, por ejemplo, la histidina.

El trans-UCA y el cis-UCA son reconocidos en el presente documento como buenos secuestradores de radicales hidroxilo. Ambos isómeros existen en concentraciones considerables en la epidermis, el segundo en la piel expuesta a radiación UV. Hay evidencias sólidas de la existencia de radicales hidroxilo en la epidermis, especialmente tras la irradiación de luz UV [7]. La piel humana normal contiene hierro 200 \muM aproximadamente [26, 27], predominantemente complejado a ferritina. La liberación de los iones ferrosos libres por la irradiación de luz UV [28] y la presencia de peróxido de hidrógeno [29, 30] son requisitos previos para la generación de radicales hidroxilo. Otros informes indican la presencia de radicales hidroxilo inducida por radiación UV indirectamente puesto que sus efectos sobre los constituyentes epidémicos se podrían neutralizar con antioxidantes [31, 32].

El UCA es un compuesto imidazol y muchos otros derivados de imidazol ya han demostrado que son buenos secuestradores de radicales hidroxilo, por ejemplo, histidina [22-24], histamina [33], histidina que contiene dipéptidos [22, 34], cimetidina y otros antagonistas del receptor de histamina (H_{2}) [35]. Este estudio pone de manifiesto que muchos otros imidazoles presentan propiedades similares (Tabla 1). Los radicales hidroxilo pueden reaccionar con el anillo imidazol para formar derivados de imidazolona. Su formación ha llevado a proponer el uso de imidazolonas de histidina e histamina como marcadores del estrés oxidativo [23, 33]. La importancia del anillo imidazol en las moléculas del UCA también se demostró en nuestros experimentos. La pobre capacidad secuestradora del trans-FAA, que en su lugar tiene un anillo furano, fue un contraste notable. Además, la presencia del resto ácido acrílico en las moléculas del UCA conjugadas con el anillo imidazol puede justificar su capacidad secuestradora incrementada hacia los radicales hidroxilo comparada con los otros imidazoles 4-(5-)sustituidos. El imidazol no sustituido y su 2-metilderivado son secuestradores de radicales hidroxilo más potentes, recalcando que la presencia de un anillo imidazol es un requisito previo para una capacidad secuestradora de radicales hidroxilo suficiente. No obstante, estos compuestos no existen
fisiológicamente y son nocivos (DL_{50} oral en rata 220 mg/kg para el imidazol y 1500 mg/kg para el 2-metilimidazol).

El trans-UCA y el cis-UCA se dan fisiológicamente, principalmente en la epidermis, con concentraciones relativamente elevadas. Nuestros hallazgos apuntan a un nuevo papel fisiológico de los isómeros del UCA, aparte de los papeles sugeridos para el trans-UCA como agente protector solar natural y para el cis-UCA como inmunosupresor. El trans-UCA y el cis-UCA pueden ser los secuestradores de radicales hidroxilo epidérmicos principales, proporcionando una nueva visión de la situación antioxidante de la piel. Los hallazgos de que 1) los isómeros del UCA son buenos secuestradores de radicales hidroxilo, aunque no tan potentes como el ácido úrico, y de que 2) los isómeros del UCA ya existen en concentraciones relativamente elevadas en la piel, generan la posibilidad de aplicar los isómeros del UCA como aditivos antioxidantes no tóxicos en productos alimenticios y cosméticos en concentraciones relativamente elevadas. Se debería preferir el trans-UCA (disponible comercialmente), debido a que el cis-UCA puede ejercer efectos inmunosupresores.

En contraste a la fotoisomerización del UCA, todavía no se ha prestado demasiada atención a la oxidación del UCA. En particular, se debería investigar la reacción de los isómeros del UCA con los radicales hidroxilo muy reactivos. Los radicales hidroxilo se pueden generar a partir de peróxido de hidrógeno tras la irradiación de luz UV, y a partir de peróxido de hidrógeno en contacto con iones metálicos reducidos, por ejemplo, iones ferrosos (Fe^{2+}). La irradiación con luz UV-A del trans-UCA o del cis-UCA con peróxido de hidrógeno solamente da como resultado la fotoisomerización del UCA y no la fotooxidación del UCA. La ausencia de correlación entre la formación del cis-UCA inducida por radiación UV-A y la inmunosupresión (18) puede ser otro indicio del papel de los productos de la oxidación del UCA en la inmunología de la piel. Estos compuestos se pueden formar en presencia de peróxido de hidrógeno tras la irradiación con luz UV-B o mediante una reacción de Fenton; ambos tipos de reacciones conducen a una serie de productos de oxidación comparables determinados por patrones cromatográficos. Las especies oxidantes comunes de ambos tipos de reacción son, lo más probablemente, los radicales hidroxilo. Partiendo de la oxidación con trans-UCA o con cis-UCA se producen patrones cromatográficos similares. En relación con el secuestro de radicales hidroxilo de los isómeros del UCA, nótese que los isómeros del UCA también pueden interferir con la inmunosupresión inducida por radiación UV mediante el secuestro de las especies radicalarias. La presencia del resto ácido acrílico en las moléculas del UCA conjugado con el anillo imidazol puede justificar su capacidad secuestradora incrementada hacia los radicales hidroxilo comparada con imidazoles no conjugados, tales como histidina e histamina. También puede justificar la diversidad de los productos de oxidación formados.

Materiales y procedimientos Cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC)

El trans-UCA y el cis-UCA se separaron el uno del otro y de los diversos productos de oxidación del UCA en una columna de fase inversa de 4,6 x 250 mm Alltima C_{18} y Luna C_{18} (Alltech, Deerfield, II y Phenomenex, Torrence, CA, respectivamente) con un flujo de 0,8 ml/minuto, suministrado por bombas de HPLC P-3500 (Pharmacia, Uppsala, Suecia). Se inyectaron muestras de 20 a 200 \mul mediante un recolector de muestras automático Promis II (Spark Holland, Emmen, Países Bajos) y los datos cromatográficos se registraron en un integrador SP 4270 (Spectra Physics, San José, CA). Solamente se procesaron los datos del área del pico de las muestras en condiciones idénticas de HPLC. Se ajustó un detector de radiación UV (Applied Biosystems, modelo 759A, Foster City, CA) para la detección a 226 nm. Se realizó una elución isocrática con tampón de formato de amonio 10 mM, que contiene formato de tetrabutilamonio (TBA) 0,2-0,8 mM y acetonitrilo al 1% (pH 7,2). Las fracciones recogidas se acidificaron con ácido fórmico hasta una concentración final de 100 mM y se pasaron a través de columnas de extracción en fase sólida C_{18} (JT Baker, Deventer, Países Bajos) para eliminar el TBA.

Fotooxidación

Se colocó una cubeta de cuarzo de 1 cm, llena con 1,4 ml de muestra, paralela al rayo de una lámpara de arco de xenón de 1000 W filtrado (Oriel, Stratford, CT). Las muestras se agitaron magnéticamente durante la irradiación. Para minimizar la radiación infrarroja (calorífica) y visible, el rayo se pasó a través de un filtro de agua (7 cm), se reflejó con un espejo dicroico y se filtró a través de un filtro UG11 de 1 mm. La eliminación de las ondas de longitud de onda corta se realizó pasando el rayo a través de filtros WG280, WG305 o WG335 con un grosor de 3 mm cada uno (Schott-Jena, Mainz, Alemania). La emisión de la lámpara de xenón filtrada a través del WG280 incluye la radiación W-C, UV-B y W-A; a través del WG305 incluye W-B y W-A y a través del WG335 solamente incluye la radiación W-A. Se seleccionaron dos bandas estrechas en las regiones espectrales de W-B y W-A para controlar la emisión del arco de xenón. La sonda de un radiómetro EG&G 550 (Salem, MA, EE.UU.) calibrado se equipó con un filtro de densidad neutra y un filtro de banda estrecha del tipo UV-M-IL (Schott-Jena) con una transmisión máxima del 21% a 303 nm y una semi-anchura de 11,5 nm para controlar la radiación UV-B o del tipo UV-PIL (Schott-Jena) con una transmisión máxima del 46% a 363 nm y una semi-anchura de 7,7 nm para controlar la radiación UV-A. El espectro de transmisión
de los filtros ópticos se revisó en un espectrómetro Perkin Elmer Lambda 40 UV/VIS (Norwalk, CT, EE.UU.).

Se llevaron a cabo irradiaciones adicionales con tubos fluorescentes TL12, usados como fuente de radiación UV-B, y TL10R, usados como fuente de radiación UV-A (Phillips, Eindhoven, Países Bajos), sobre muestras agitadas magnéticamente en placas Petri pequeñas. La salida de radiación UV-B se midió con un radiómetro de fototerapia IL 443, equipado con una sonda detectora de silicio SEE 1240 y la salida de radiación UV-A se midió con un radiómetro de fototerapia IL 442A con una sonda detectora SEE 115 (International Light, Newburyport, MA, EE.UU.).

Oxidación de Fenton

Se oxidaron isómeros del UCA (10 ó 40 \muM) con un sistema generador de radicales hidroxilo constituido por diversas concentraciones de iones ferrosos (10-500 \muM) y una concentración de peróxido de hidrógeno fija de 500 \muM (reactivo de Fenton), en un medio de fosfato sódico (10 ó 20 mM) a pH 7,2, o en agua ultrapura. Además, se usaron dos sistemas generadores de radicales hidroxilo con iones cobre (Cu^{2+}), constituidos por Cu^{2+} 50 \muM con peróxido de hidrógeno 500 \muM o con ácido ascórbico 5 mM.

Síntesis del compuesto de referencia imidazol-4-carboxaldehído (4-formilimidazol)

El 4-(hidroximetil)imidazol-HCl (4 mmol) se agitó junto con bicarbonato sódico (6 mmol) en 4 ml de metanol durante 1 hora a temperatura ambiente. En metanol se evaporó y el residuo se extrajo con cloroformo/metanol 1:1. Después de centrifugar a 3500 rpm durante 5 minutos, el sobrenadante se evaporó y el residuo se recogió en 20 ml de dioxano caliente. Se añadieron 4,4 g de dióxido de manganeso (activado; para síntesis), seguido de la reacción a temperatura de reflujo durante 2 horas. El dióxido de manganeso se retiró por filtración y el filtrado se evaporó. La cristalización se llevó a cabo en metanol. El rendimiento fue de 95 mg de cristales finos blanquecinos, 25% de rendimiento máximo. El intervalo de fusión fue 168-169ºC:173-175ºC. El intervalo de fusión del material de partida era 108-111ºC
y el del producto de oxidación ácido imidazol-4-carboxílico de 294-295ºC. UV (agua) \lambda_{máx} (log \varepsilon) 257 nm (3,85).

Resultados Isómeros del UCA y fotooxidación

El enlace O-O del peróxido de hidrógeno se puede romper por la radiación UV para dar radicales hidroxilo. Debido a que ambos isómeros del UCA pueden secuestrar eficazmente los radicales hidroxilo, cabría esperar que el UCA se degrade y/o se convierta en los productos de oxidación. La capacidad de la radiación UV solar simulada de convertir el trans-UCA en presencia de peróxido de hidrógeno en los productos de fotooxidación se probó in vitro y se analizó por análisis HPLC de fase inversa. El peróxido de hidrógeno eluyó cerca del volumen nulo y el trans-UCA y el cis-UCA eluyeron con tiempos de elución marcadamente diferentes de 20 y 64 min (Fig. 3a-d). La muestra control no irradiada no presentó ninguna interacción entre el trans-UCA y el peróxido de hidrógeno (Fig. 3a). La exposición de trans-UCA 80 \muM en ausencia de peróxido de hidrógeno a pH 7,2 a la emisión del arco de xenón filtrada por WG280 (incluyendo UV-C y UV-B) solamente dio como resultado la formación de cis-UCA a través del proceso de fotoisomerización (Fig. 3b). No obstante, cuando el trans-UCA se irradió en presencia de peróxido de hidrógeno 500 \muM en condiciones idénticas, aparecieron muchos picos adicionales en los cromatogramas y los dos picos trans-UCA y cis-UCA se redujeron claramente (Fig. 3c), indicando una cierta conversión fotoquímica o una ruptura. Se identificaron ocho productos de fotooxidación principales en forma de nuevos picos basándose en los tiempos de retención y se asignaron en el cromatograma (Fig. 3c).

En contraste, cuando las exposiciones se realizaron con radiación solar simulada en la que se bloquearon ambas UV-C y UV-B mediante un filtro WG335, virtualmente no se encontraron productos de fotooxidación (Fig. 3d). Solamente fue evidente la fotoisomerización del UCA, que es coherente con los informes previos (2, 3). La relación de la fotoisomerización del trans-UCA al cis-UCA no se vio afectada por el grado de ruptura fotooxidativa. El bloqueo de la radiación UV-C mediante el uso del filtro WG305 mostró resultados intermedios (Tabla 2). Estas condiciones de irradiación presentan la simulación más cercana a la distribución espectral UV de la radiación solar terrestre producida por un sol de mediodía en un día brillante. Las pruebas con las lámparas fluorescentes TL12 (UV-B y W-A; algo de UV-C) y TL10R (UV-A) confirmaron los hallazgos anteriores de que la radiación UV-B y UV-C tiene capacidad fotooxidativa. A pesar de que la dosis de radiación UV-A de la lámpara fluorescente era mucho mayor que la de la radiación UV-B, el rendimiento de los productos de la fotooxidación del UCA fue mucho menor con la radiación UV-A (Tabla 2). La formación de los productos de fotooxidación se cuantificó sumando las áreas de los ocho picos principales (en unidades arbitrarias; picos A-H). El grado de ruptura fotooxidativa, el rendimiento de los productos de fotooxidación y el grado de fotoisomerización del UCA bajo condiciones de irradiación diferentes se resumen en la Tabla 2. Teniendo en cuenta las diversas fuentes de emisión de estas radiaciones UV, la capacidad fotooxidativa de la radiación UV se vuelve considerable a longitudes de onda inferiores a 320 nm aproximadamente. Los experimentos con el cis-UCA dieron resultados similares, excepto que las relaciones cis-UCA/trans-UCA fueron mayores en esta serie (datos no mostrados).

Isómeros del UCA y oxidación de Fenton

En la siguiente serie de experimentos estudiamos la oxidación de Fenton del UCA, que representa otro proceso de oxidación natural. Los isómeros trans-UCA y cis-UCA se oxidaron con el procedimiento de Fenton por iones ferrosos (Fe^{2+}) y peróxido de hidrógeno a concentraciones fisiológicas. La concentración inicial de peróxido de hidrógeno era de 500 \muM y la concentración de ión ferroso se varió entre 0 y 500 \muM. En todas las reacciones de oxidación de Fenton el grado de ruptura del isómero del UCA se calculó a partir de sus áreas de pico reducidas. La reacción de oxidación se debe completar en 2 minutos para todas las condiciones de reacción, debido a que no se observó una ruptura adicional después de una incubación prolongada. El peróxido de hidrógeno sin el Fe^{2+} no tuvo ningún efecto sobre los isómeros del UCA; no obstante, el Fe^{2+} sin el peróxido de hidrógeno dio como resultado una ruptura lenta de los isómeros del UCA después de una incubación prolongada (datos no mostrados).

La secuencia del orden de adición de los dos reactivos de Fenton no afectó notablemente a la ruptura del UCA y al rendimiento de los productos de oxidación, excepto a una baja concentración de UCA de 10 \muM. Cuando se añadió el Fe^{2+} después del peróxido de hidrógeno se observó una mayor ruptura y un menor rendimiento de los productos de oxidación de Fenton, mientras que el orden de secuencia inverso dio los resultados opuestos (datos no mostrados).

Cuando la reacción de Fenton se realizó en agua en lugar de tampón fosfato, la ruptura oxidativa del trans-UCA aumento independientemente de la concentración de UCA. La turbidez observada en las reacciones realizadas en tampón fosfato (10 mM) con una concentración elevada de Fe^{2+} (> 100 \muM) se debió probablemente a la formación de fosfato de hierro insoluble, reduciendo así la disponibilidad de Fe^{2+} libre. La Tabla 3 resume las diferencias entre el agua y el medio fosfato para el trans-UCA a una concentración inicial de 40 \muM con respecto a su ruptura y a la formación de los productos de oxidación de Fenton. De manera similar a los experimentos de fotooxidación, se sumaron las áreas de los picos de los 8 productos de oxidación principales. Se obtuvieron resultados comparables con el cis-UCA (datos no mostrados), cuyos hallazgos son coherentes con las constantes de velocidad comparables del trans-UCA y cis-UCA en el experimento de degradación de deoxiribosa (Tabla 1). Se observó una clara semejanza entre los patrones cromatográficos de los productos de oxidación de Fenton del UCA (no mostrados) y aquellos de los productos de la fotooxidación del UCA. Tres de ellos han sido identificados (véase a continuación).

Cuando se investigaron otros dos sistemas generadores de radicales hidroxilo basados en iones cobre (Cu^{2+}) con el trans-UCA, la combinación de Cu^{2+} (50 \muM) y ácido ascórbico (5 mM) sin peróxido de hidrógeno provocó una ruptura casi completa del trans-UCA (quedó el 3%), mientras que el sistema sin Cu^{2+} (50 \muM) y peróxido de hidrógeno (500 \muM) presentó un ligero efecto (quedó el 88% de trans-UCA). La evaluación de los datos fue difícil con el sistema ascorbato, debido a que se produjeron varios picos que interferirán en los cromatogramas, que probablemente proceden del ácido ascórbico y sus productos de oxidación. Ambos sistemas se considera que son de menor importancia para la situación in vivo, pero estos resultados indican similitudes en el comportamiento oxidativo de los isómeros del UCA, independientemente de la naturaleza del sistema generador de radicales hidroxilo.

Isómeros del UCA y oxidación de Fenton

En otra serie de experimentos estudiamos la oxidación de Fenton del UCA, que representa otro proceso de oxidación natural. La concentración inicial de peróxido de hidrógeno era de 500 \muM en todos los experimentos y la concentración de ión ferroso se varió entre 0 y 400 \muM. Se compararon en 4 grupos de condiciones: 1. Fe^{2+} en tampón fosfato a pH 7,2, 2. Fe^{2+} en tampón fosfato más EDTA, 3. Fe^{2+} sin tampón con un pH inicial de 5,5-5,3, y 4. Cu^{2+} en tampón fosfato más ascorbato. El grado de ruptura fue similar para ambos isómeros del UCA. La Tabla 3 muestra la ruptura oxidativa del trans-UCA con peróxido de hidrógeno en orden creciente: condiciones 1 < 2 < 4 <3.

La adición de Fe^{2+} en concentraciones finales de 100-400 \muM en tampón fosfato generó una disolución turbia de fosfato de hierro insoluble. Bajo estas condiciones se estableció el grado más bajo de ruptura. Se asumió una disponibilidad limitada de Fe^{2+} libre para reducir la ruptura oxidativa del UCA. Por otra parte, la complejación del Fe^{2+} al EDTA no generó una mezcla de reacción turbia y se estableció una ruptura mayor (Tabla 3). La mayor ruptura se observó en ausencia de tampón fosfato, con un valor de pH menos definido de 5,5 a 5,3, dependiendo de la concentración de UCA (40, 100 ó 250 \muM). Al comienzo de la reacción de Fenton en el medio no tamponado, hubo una rápida caída del valor del pH desde 5,1 a 3,4, con concentraciones iniciales de trans-UCA, peróxido de hidrógeno e iones ferrosos de 250, 500 y 400 \muM, respectivamente. Nosotros atribuimos este efecto a la liberación no tamponada de ácidos relativamente fuertes, tales como el ácido glioxílico (GLX). Se obtuvieron resultados de ruptura similares, aunque ligeramente menos pronunciados, con el cis-UCA (Tabla 4). Este hallazgo es coherente con las constantes de velocidad de segundo orden comparables del trans-UCA y del cis-UCA para el secuestro de radicales hidroxilo (8). El peróxido de hidrógeno sin Fe^{2+} no tuvo ningún efecto sobre los isómeros del UCA; no obstante, el Fe^{2+} sin el peróxido de hidrógeno dio como resultado una ruptura parcial de los isómeros del UCA después de una incubación prolongada de un día (datos no mostrados).

Los productos de oxidación principales formados son el imCHO y el GLX. En experimentos adicionales en los que se usó el imCHO como material de partida, se obtuvo virtualmente un rendimiento del 100% de imCOOH después de la fotooxidación u oxidación de Fenton. En las muestras del UCA que estaban muy oxidadas (que contenían <4% de UCA), el imCOOH era el compuesto principal que absorbía a 226 nm, mientras que la concentración de imCHO se redujo en gran parte. Un experimento adicional demostró que bajo estas condiciones oxidativas, el aldehído (imCHO) se oxida al ácido carboxílico (imCOOH). El GLX se detectó en cantidades inferiores al imCHO en todos los casos estudiados (Tabla 3), excepto para la oxidación de Fenton de UCA 40 \muM (Tabla 4, sección 3.1 y 3.4). El trans-UCA y el cis-UCA en una concentración relativamente elevada de 250 \muM se rompieron un 78% y un 75%, respectivamente, para el sistema de oxidación de Fenton no tamponado. La Tabla 4, sección 3, también muestra que el rendimiento de los productos de oxidación fue proporcional a la concentración inicial de UCA. De manera notable, el rendimiento del imCHO procedente del cis-UCA fue sustancialmente superior que procedente del trans-UCA. En el sistema de Fenton en tampón fosfato se registró una ruptura comparable y un rendimiento comparable de los productos de oxidación, independientemente del intervalo inicial de concentraciones de UCA entre 40 y 250 \muM (Tabla 4, sección 1, solamente se muestran los resultados de 40 \muM). En presencia de EDTA, se produjo una mayor ruptura y un mayor rendimiento de los productos de oxidación (en particular del imCHO) (Tabla 4, sección 2). Este rendimiento aumentó a medida que se usaron concentraciones iniciales de UCA superiores. En el sistema no tamponado se registró el mayor grado de ruptura de todos los sistemas probados. El rendimiento del producto de oxidación fue el mayor de todos los sistemas cuando la concentración inicial de UCA era elevada (250 \muM) (Tabla 4, sección 3).

Cuando se investigó otro sistema generador de radicales hidroxilo, basado en iones cobre (Cu^{2+}), la combinación de Cu^{2+}/ácido ascórbico/peróxido de hidrógeno causó una gran ruptura del trans-UCA (Tabla 3) y un rendimiento moderado de los productos de oxidación del UCA, en favor del imCOOH. Sin el ácido ascórbico, el sistema con Cu^{2+} (50 \muM) y peróxido de hidrógeno (500 \muM) presentó una ligera ruptura (quedó el 88% de trans-UCA; datos no mostrados). Para la situación in vivo, debe recordarse que el contenido en cobre de la piel es inferior al de hierro (29).

2.3.4. UCA comparado en la oxidación de Fenton y en la fotooxidación

Se observó una clara semejanza entre los patrones cromatográficos de los productos de oxidación de Fenton del UCA y aquellos de los productos de la fotooxidación del UCA (Fig. 5). En la fotooxidación también se observó un efecto inhibidor de la oxidación en tampón fosfato a pH 7,2, mientras que el rendimiento de los productos de oxidación estaba a favor del imCHO (Tabla 4, sección 4 frente a 5). En la fotooxidación, la ruptura del cis-UCA estaba sustancialmente disminuida en comparación con las del isómero trans (Tabla 4, sección 4-6). En la oxidación de Fenton, este efecto fue menos pronunciado. Los datos de la Tabla 4 se dan para disoluciones saturadas de aire. La purga con argón de las disoluciones, antes de la oxidación de Fenton o de la fotooxidación, potencia la ruptura del UCA así como el rendimiento de los productos de oxidación, ambos en un factor de 2 a 3. El calentamiento (a 37ºC) de las disoluciones purgadas con argón aumentó ligeramente el rendimiento del imCHO.

Los datos de la Tabla 4 indican una discrepancia ("vacío") entre los micromoles del isómero del UCA roto y los micromoles de los productos de oxidación formados. El "vacío" más pequeño, aún así del 52%, se encontró después de la oxidación del cis-UCA en el sistema no tamponado (sección 3). La cromatografía de capa fina (TLC) dio una mayor comprensión de los productos del "vacío", que no se observaron en la cromatografía de fase inversa, usando detección UV o detección de fluorescencia. La TLC llevada a cabo en sílice con el eluyente isopropanol/amoniaco al 25% (4:1) mostró una serie de manchas fluorescentes eluíbles parcialmente superpuestas y una mancha fluorescente en la posición inicial (datos no mostrados). No obstante, el peso inicial del trans-UCA, introducido en un experimento de fotooxidación con una amplia ruptura del UCA (quedó <4% de cada isómero del UCA), no disminuyó demasiado (\sim14%) después de una fotooxidación intensa. Este hallazgo indica una formación predominante de materiales sólidos no volátiles en lugar de compuestos gaseosos, tales como CO_{2} y agua. El patrón de la TLC y el experimento de pesaje apuntan a una posible reacción en cadena del UCA iniciada por el radical hidroxilo, que da como resultado la formación de sustancias que pueden cubrir el vacío anteriormente mencionado. Estas sustancias no se pueden detectar con todo detalle en las condiciones cromatográficas usadas para la determinación simultánea de los isómeros del UCA, el imCHO y el imCOOH.

2.3.5. Inhibición de la hipersensibilidad por contacto

Los efectos inhibidores de los productos de oxidación del UCA se ilustran en la Fig. 5. La máxima respuesta inflamatoria de la oreja se normalizó al 100%. La mayor reducción se obtuvo con el residuo del UCA intensamente fotooxidado (PO mix III), que contenía menos del 4% de cis-UCA residual. Dio como resultado una inflamación de la oreja de sólo el 19% (81% de reducción de la inflamación). Incluso una dilución de diez veces de esa mezcla (0,2 g/l) redujo notablemente la inflamación de la oreja (29% de inflamación de la oreja), que es de un nivel similar al efecto del cis-UCA a una concentración de 1 g/l (31% de inflamación de la oreja). Se obtuvo otro efecto notable mezclando los tres imidazoles identificados. Cuando probamos uno de los imidazoles solo (1 g/l), solamente se observó un efecto moderado, no obstante, cuando los probamos mezclados juntos (1 g/l, 0,33 g/l de cada imidazol), se observó un efecto sinérgico (26% de inflamación de la oreja). El ácido glioxílico y el ácido oxálico, en forma de sales de amonio, no presentaron una inhibición significativa del CHS.

Fotooxidación del UCA a escala preparativa

Las concentraciones de trans-UCA y peróxido de hidrógeno se incrementaron en gran medida, como lo fue la exposición a la radiación UV, para obtener mayores cantidades de los productos de fotooxidación del UCA en forma de fracciones recogidas de la columna de fase inversa para análisis posteriores. En la Fig. 4 se muestra un cromatograma típico. Finalmente se seleccionaron cuatro fracciones, denominadas R_{t} 8, R_{t} 10, R_{t} 14, R_{t} 17, para su identificación (pico A, 1-3 en la Fig.4). Previo al análisis, el tetrabutilamonio se retiró por extracción en fase sólida en
sílice C_{18}.

Identificación

El R_{t} 8 se identificó como imidazol-4-carboxaldehído (imCHO). Su espectro de UV era idéntico al del compuesto de referencia sintetizado (véase a continuación) con un máximo de absorción de 257 nm. La co-inyección de R_{t} 8 con el imidazol-4-carboxaldehído sintetizado dio como resultado un único pico cromatográfico con un tiempo de retención de 8,13 minutos. Se deben recopilar más evidencias (pico A en la Fig. 4). La cantidad de imCHO en la muestra de UCA fotooxidada se redujo gradualmente tras el almacenamiento a -20ºC.

El R_{t} 10 se identificó como ácido imidazol-4-acético. Su espectro de UV era idéntico con un máximo de absorción de 213 nm. El espectro de masas se obtuvo con la técnica de electropulverización y la muestra seca se trató con metanol/HCl y n-butanol/HCl antes del análisis. Se obtuvo un pico a una masa de 140 después de la metilación y a una masa de 183 después de la butilación. Por consiguiente, la masa del compuesto original era 126. La co-inyección de R_{t} 10 con ácido imidazol-4-acético disponible comercialmente dio como resultado un único pico cromatográfico con un tiempo de retención de 8,98 minutos (pico 1 en la Fig. 4).

El R_{t} 14 se identificó como ácido imidazol-4-carboxílico (imCOOH). Su espectro de W era idéntico al del compuesto de referencia obtenido comercialmente con un máximo de absorción de 226 nm. El análisis de resonancia protónica (RMN ^{1}H) se realizó en D_{2}O, mostrando protones imidazólicos en una relación 1:1 con desplazamientos químicos de 7,76 y 7,53 ppm. El espectro de masas se obtuvo con la técnica de electropulverización y la muestra seca se trató con metanol/HCl y n-butanol/HCl antes del análisis. Se obtuvo un pico a una masa de 126 después de la metilación y a una masa de 169 después de la butilación. Por consiguiente, la masa del compuesto original era 112. La co-inyección de R_{t} 14 con imCOOH disponible comercialmente dio como resultado un único pico cromatográfico con un tiempo de retención de 14,73 minutos (pico 2 en la Fig. 4). La cantidad de imCOOH en la muestra de UCA fotooxidada se incrementó gradualmente tras el almacenamiento a -20ºC.

Síntesis de imidazol-4-carboxaldehído (4-formilimidazol; FW = 134,5) a partir de 4-(hidroximetil)imidazol-HCl

Se disolvieron 538 mg del material de partida (4 mmol) en 4 ml de metanol y se añadieron 500 mg de NaHCO_{3} (6 mmol). El tubo se agitó ocasionalmente durante 60 min, alternativamente a 4ºC y a temperatura de agua caliente, el CO_{2} se dejó escapar del tubo de cristal. La mezcla se dividió en varios tubos Eppendorf y se sometió al tratamiento Speedvac durante 1 hora. Los residuos eran sólidos blancos con líquidos viscosos de color amarillo claro. Se añadió una mezcla 1:1 de cloroformo/metanol a los tubos con calentamiento y agitación suaves posterior. El NaHCO_{3} se separó por centrifugación de las fracciones combinadas a 3500 rpm durante 5 min. El sobrenadante claro se mantuvo a -20ºC durante toda la noche para permitir la precipitación de NaHCO_{3} adicional. A continuación, la disolución se aclaró por filtración y se evaporó hasta sequedad con un dispositivo Rotovapor. El residuo se recogió en 20 ml de dioxano con agitación magnética y se añadieron 4,4 mg de MnO_{2} (activado; para la síntesis) en el mismo matraz. El residuo no se pudo disolver completamente en un primer instante. La mezcla se calentó a temperatura de reflujo durante 2 horas en un baño de aceite de parafina. La disolución caliente se filtró y el MnO_{2} se lavó una vez con dioxano caliente. El dioxano se evaporó con el Rotovapor® dando un sólido cristalino fino amarillo y blanco. La cristalización se llevó a cabo en metanol repetidas veces. Fueron necesarios pequeños volúmenes de metanol debido a que el residuo se disuelve bien en metanol.

Rendimiento	\sim20 mg (bibl: \sim475 mg) de cristales finos blanquecinos
P.f.	167-168ºC (bibl: 173-175ºC)
P.f.	4-(hidroximetil)imidazol-HCl: 108-111ºC
P.f.	Ácido imidazol-4-carboxílico: 294-295ºC (bibl: Bettersby AR y col., J. Chem. Soc.
	(Perkin 1) 43-51, 1980)

Los resultados muestran que se pueden formar grupos similares de varios productos de oxidación del UCA con irradiación UV y sin irradiación UV (reacción de tipo Fenton). Hasta ahora se han identificado tres productos. Nosotros asumimos que estos productos también existen en la capa superior de la epidermis y se desarrollará un procedimiento para determinar los productos de oxidación del UCA in vivo. La ruptura del imCHO y la obtención de imCOOH después de la fotooxidación simultáneas nos ha llevado a especular que el imCHO se oxida lentamente a imCOOH durante el almacenamiento. Numerosos aldehídos se oxidan gradualmente a los ácidos carboxílicos correspondientes en contacto con especies reactivas de oxígeno.

Se podrían resolver los dos fenómenos, aparte del desconcertante mecanismo de inmunosupresión inducida por el cis-UCA, si los productos de oxidación del UCA tuvieran propiedades inmunosupresoras. Primero, la abrogación de la inmunosupresión mediante antioxidantes (19-21) en el modelo de hipersensibilidad por contacto que mide la respuesta inflamatoria de la oreja. En nuestro alcance, se previene la formación de los productos de oxidación del UCA debido a la neutralización de los radicales hidroxilo mediante antioxidantes. Segundo, la falta de correlación entre la formación de cis-UCA por radiación UV-B y UV-A (18). No se encontró inmunosupresión con irradiación de luz UV-A, a pesar de que se formó cis-UCA. En nuestro alcance, este hallazgo se puede explicar como la incapacidad de la radiación UV-A de fotooxidar al UCA. Por consiguiente, no se formaron productos de fotooxidación del UCA con radiación UV-A (sección de resultados) y debido a esto no se produjo inmunosupresión. Nuestros hallazgos y las suposiciones anteriores pueden apuntar a un papel importante para los productos de (foto)oxidación del UCA en el sistema inmunitario de la piel.

Leyendas de las figuras

Figura 1. Compuestos probados en este estudio por su capacidad secuestradora de radicales hidroxilo. (a) trans-UCA, (b) cis-UCA, (c) L-histidina, (d) dihidroUCA o ácido 3-(imidazol-4-il)propiónico, (e) ácido imidazolacético, (f) 2-metilimidazol, (g) imidazol, (h) L-alanina, (i) ácido trans-2-furilacrílico, (j) ácido úrico.

Figura 2. Una determinación de las constantes de velocidad de segundo orden del trans-UCA y cis-UCA con radicales hidroxilo. La constante de velocidad es la derivada de la pendiente de la curva (k = pendiente x k_{dR} x [dR] x A_{0}), en la que A_{0} es la absorbancia medida en ausencia del secuestrador de radicales hidroxilo. La k_{dR} se tomó como 3,1 x 10^{9} M^{-1}. s^{-1}, de los estudios de radiolisis pulsada [8], y [dR] = 3 mM. Las constantes de velocidad en este grupo particular fueron de 8,49 y 7,33 x 10^{9} M^{-1}. s^{-1} para el trans-UCA y el cis-UCA, respectivamente. Los otros secuestradores se estudiaron de manera similar.

Figura 3. Cromatogramas del ácido trans-urocánico 80 \muM en tampón fosfato 20 mM a pH 7,2. La concentración inicial de peróxido de hidrógeno era 500 \muM. El volumen de inyección fue 80 \mul.

a. con peróxido de hidrógeno; no irradiado, b. sin peróxido de hidrógeno; irradiado con una lámpara de arco de xenón filtrada con WG280, c. con peróxido de hidrógeno e irradiado como en 1b, d. con peróxido de hidrógeno e irradiado con una lámpara de arco de xenón filtrada con WG335. Los picos designados con A-H se corresponden con los productos de fotooxidación. La separación se realizó en una columna Alltima C_{18} con detección UV a 210 nm. El eluyente consistía en fosfato sódico 10 mM a pH 7,2, hidrogenosulfato de tetrabutilamonio 1,0 mM. En el texto se describen condiciones experimentales adicionales.

Figura 4. Patrones cromatográficos comparables en la formación de los productos de oxidación del UCA a partir de trans-UCA 80 \muM y peróxido de hidrógeno 500 \muM en agua (sin tampón). Izquierda: después de la oxidación de Fenton con Fe^{2+} 250 \muM y derecha: después de la fotooxidación con "toda" la radiación UV, que contenía una dosis de radiación UV-B de 32 kJ.m^{-2}. El pico del cis-UCA desapareció después de la oxidación de Fenton, debido a la ausencia de fotoisomerización. La designación de los picos (A-G) se realizó como en la Figura 1c. Los picos B, C y D se refieren al imidazol-4-carboxaldehído, ácido imidazol-4-acético y ácido imidazol-4-carboxílico, respectivamente. Las condiciones cromatográficas fueron idénticas a aquellas aplicadas en la Figura 3.

Figura 5. Inhibición de la hipersensibilidad por contacto en forma de una reducción de la respuesta inflamatoria de la oreja en ratones BALB/c. El control positivo (sin inhibición) se normalizó al 100%. La im-mix es una mezcla de los tres imidazoles identificados (véase las identificaciones) y la PO mix III es una mezcla de los tres imidazoles identificados entre otros diversos productos de oxidación del UCA no identificados, obtenidos tras una fotooxidación extensiva. Están presentes el trans- y el cis-UCA rudimentarios en cantidades inferiores al 3% (en peso).

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TABLA 1 La capacidad secuestradora de radicales hidroxilo de los isómeros del ácido urocánico y de compuestos relacionados

Secuestrador del	Constante de velocidad	% Inhibición de la degradación
radical hidroxilo	de 2º orden	de deoxiribosa [Sec] =
	M^{-1}s^{-1} x10^{9}	D.E	n^{(b)}	[Deoxir] = 3 mM
Imidazoles
\hskip0.5cm Ácido trans-urocánico (Ref)	8,0	0,9	8	67
\hskip0.5cm Ácido cis-urocánico (Ref)	7,1	0,6	6	64
\hskip0.5cm L-Histidina (Ref)	2,6^{(c)}	0,9	4	34
\hskip0.5cm Ácido dihidrourocánico	2,7	0,9	3	34
\hskip0.5cm Ácido imidazol-4-acético	2,2	0,1	3	30
\hskip0.5cm 2-Metilimidazol (Ref)	11,7	2,6	5	76
Otros Compuestos (Referencias)
\hskip0.5cm L-Alanina	0,1	0,0	3	2
\hskip0.5cm Ácido trans-2-furilacrílico^{(a)} (Ref)	<	- -	3	< 2
\hskip0.5cm Ácido úrico	27,8	3,0	4	91
a. El ácido trans-2-furilacrilico no se probó a concentraciones > 8 mM debido a su baja solubilidad.
b. n representa el número de pendientes a partir de las cuales se calculó la velocidad.
c. 2,3-3,0 x 109 M1. s-1 en la bibliografía [22]

TABLA 2 Isómeros^{(1)} del ácido urocánico (UCA) después de la fotooxidación

Fuente de	Carac.	Dosis	Restos de UCA	Rendim. de productos	% Fotoisomeri. ^{(1)}
radiación UV	espectrales	kJ.m^{-2}	% (\pmD.E.)^{(2)}	fotooxidación U.A. ^{(3)}	trans-UCA
		UV-B		(\pmD.E.)^{(2)}	cis-UCA
		UV-A			%(\pmD.E.)^{(2)}
Arco de Xe	WG280 270-400	37	43 (\pm11)	347 (\pm58)	41 (\pm2) 59
	nm	70
	UV-C,-B,-A
	incluid.
Arco de Xe	WG305 292-400	18	64 (\pm6)	219 (\pm14)	47 (\pm3) 53
	nm	70
	UV-B,-A
	incluid.
Arco de Xe	WG335 320-400	0	96 (\pm5)	45 (\pm8)	60 (\pm2) 40
	nm	66
	Sólo UV-A
	inclui.
TL12^{(5)}	280-366 nm sin	3,6	90 (\pm20)	149 (\pm51)	41 (\pm4) 59
	filtrar	4,5
TL10R^{(5)}	320-366 nm sin	0	99 (\pm3)	16 (\pm5)	84 (\pm7) 16
	filtrar	324
(1) La concentración inicial de trans-UCA o cis-UCA es 40 \muM y la del peróxido de hidrógeno es 500 \muM.
(2) Desviación estándar (D.E.) de las mediciones duplicadas.
(3) \begin{minipage}[t]{150mm} U.A.: Unidades arbitrarias de la integración del área del pico. Se sumaron los picos de los 8 productos principales.\end{minipage}
(4) Este listado sólo se aplica al ácido trans-urocánico como material de partida.
(5) \begin{minipage}[t]{145mm} Tubos fluorescentes de Phillips. Distribución espectral y mediciones radiométricas diferentes comparadas con las del arco de xenón.\end{minipage}

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TABLA 3 Ácido trans-urocánico después de la oxidación de Fenton

[Fe^{2+}]^{(2)} (\muM)	% Restos de ácido	Rendimiento de los productos de la
	trans-urocánico (\pmD.E.)^{(5)}	oxidación de Fenton U.A.^{(4)} (\pmD.E.)^{(5)}
	en tampón en agua	en tampón en agua
	fosfato^{(3)}	fosfato^{(3)}
0	100 (\pm1)	100 (\pm3)	< 10	< 10
50	97 (\pm1)	77 (\pm11)	< 10	194 (\pm34)
100	94 (\pm6)	48 (\pm7)	27 (\pm5)	272 (\pm6)
250	83 (\pm3)	19 (\pm8)	36 (\pm3)	423 (\pm76)
500	78 (\pm12)	< 4	49 (\pm9)	511 (\pm35)
(1) Concentración inicial de trans-UCA: 40 \muM.
(2) Fe^{2+} añadido antes del peróxido de hidrógeno.
(3) Tampón fosfato sódico 10 mM, pH 7,2.
(4) \begin{minipage}[t]{145mm} U.A.: Unidades arbitrarias de la integración del área del pico. Se sumaron los picos de los 8 productos principales.\end{minipage}
(5) Desviación estándar (D.E.) de las mediciones duplicadas.

Claims (16)

1. Una composición farmacéutica que comprende ácido urocánico y uno de sus productos de oxidación.

2. Uso del ácido urocánico y un producto de oxidación del mismo para la preparación de una composición farmacéutica para modular la respuesta inmunitaria de un animal.

3. Una composición farmacéutica que comprende un producto de oxidación del ácido urocánico, en el que dicho producto de oxidación es un imidazol o un derivado imidazolona del ácido urocánico.

4. Una composición farmacéutica según la reivindicación 3, en el que dicho derivado del ácido urocánico que contiene imidazol comprende imidazol-4-carboxaldehído, ácido imidazol-4-acético o ácido imidazol-4-carboxílico.

5. Una composición farmacéutica según las reivindicaciones 3 ó 4 en el que dicho derivado del ácido urocánico que contiene imidazolona comprende ácido 3-(4-imidazolon-2-il)-acrílico o ácido 3-(4-imidazolon-5-il)-acrílico.

6. Uso de un producto de oxidación del ácido urocánico, en el que dicho producto de oxidación es un imidazol o un derivado de imidazolona del ácido urocánico, para la preparación de una composición farmacéutica para modular la respuesta inmunitaria de un animal.

7. Uso según la reivindicación 6, en el que dicho derivado del ácido urocánico que contiene imidazol comprende imidazol-4-carboxaldehído, ácido imidazol-4-acético o ácido imidazol-4-carboxílico.

8. Uso según las reivindicaciones 6 ó 7 en el que dicho derivado del ácido urocánico que contiene imidazolona comprende ácido 3-(4-imidazolon-2-il)-acrílico o ácido 3-(4-imidazolon-5-il)-acrílico.

9. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 6-8, en el que dicho animal es un humano.

10. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en el que dicha modulación comprende el tratamiento de una enfermedad cutánea.

11. Uso según la reivindicación 10, en el que dicha enfermedad cutánea comprende psoriasis.

12. Uso según la reivindicación 10, en el que dicha enfermedad cutánea comprende dermatitis.

13. Una composición cosmética que comprende ácido urocánico y un producto de oxidación del mismo.

14. Una composición cosmética que comprende un producto de oxidación del ácido urocánico, en el que dicho producto de oxidación es un imidazol o un derivado imidazolona del ácido urocánico.

15. Uso del ácido urocánico y un producto de oxidación del mismo para la preparación de una composición cosmética.

16. Uso de un producto de oxidación del ácido urocánico, en el que dicho producto de oxidación es un imidazol o un derivado imidazolona del ácido urocánico, para la preparación de una composición cosmética.