ES2253156T3

ES2253156T3 - Anticuerpos capaces de detectar de manera selectiva isoformas del prion prpsc.

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Publication number: ES2253156T3
Application number: ES00111108T
Authority: ES
Inventors: Dr. Blood Transfusion Ctr Slovenia Curin-Serbec
Original assignee: Blood Transfusion Centre of Slovenia
Current assignee: Blood Transfusion Centre of Slovenia
Priority date: 2000-05-23
Filing date: 2000-05-23
Publication date: 2006-06-01
Anticipated expiration: 2020-05-23
Also published as: EP1158003B2; ATE312848T1; DK1158003T3; DK1158003T4; CA2407905C; JP5042430B2; CN1250572C; KR20030014234A; DE60024787D1; HUP0302413A2; EP1158003B1; AU8435501A; AR029098A1; PL208292B1; ES2253156T5; DE60024787T2; HU229454B1; CA2407905A1; KR100829447B1; EP1158003A1

Abstract

Un anticuerpo unido exclusivamente a una isoforma PrPSc de la proteína prion y que reconoce el epitomé que tiene conformación tridimensional proporcionada por la secuencia de proteínas -Cys-Ile-Thr-Gln-TyrGlu-Arg-Glu-Ser-Gln-Ala-Tyr-Tyr-de la isoforma PrPSc de la proteína prion mientras que no se une a la forma PrPC, que se obtiene mediante un método que comprende el paso de inmunización de un animal con un enlace peptídico teniendo la secuencia de amino ácido -Cys-Ile-Thr-Gln-TyrGlu-Arg-Glu-Ser-Gln-Ala-Tyr-Tyr-o -Cys-Ile-Thr-Gln-Tyr-Gln-Arg-Glu-Ser-Gln-Ala-Tyr-Tyr-.

Description

Anticuerpos capaces de detectar de manera selectiva isoformas del prion PrP^{Sc}.

La presente invención pertenece a los anticuerpos originales dirigidos a la parte terminal C de la isoforma PrP^{Sc} de priones. En particular, el invento presente pertenece al uso de tales anticuerpos en el diagnóstico de encefalopatía espongiforme bovina (BSE), la nueva variante de la Enfermedad de Creutzfeld-Jacobs (vCJD), CJD esporádica y scarpie.

En 1986 en Reino Unido se diagnosticó una enfermedad degenerativa crónica. El ganado afectado por esta enfermedad experimentó una degeneración progresiva del sistema nervioso, manifestó cambios en el temperamento tales como nerviosismo o agresividad, posturas anormales, descoordinación y dificultad en el crecimiento, disminución de la producción de leche, o pérdida de peso a pesar de apetito continuo. El ganado afectado finalmente murió.

Esta enfermedad ha sido denominada Encefalopatía Espongiforme Bovina (BSE) y se suele referir a ella como "la enfermedad de las vacas locas". Durante los siguientes diez años, se confirmaron en Reino Unido aproximadamente 160.000 casos de esta nueva enfermedad de ganado, mientras también se encontraron casos en otros países europeos e incluso en el extranjero como en Canadá, las Islas Falkland y en el Sultanato Oman.

BSE se asocia con un agente transmisor cuya naturaleza aún se desconoce. El agente afecta al cerebro y a la médula espinal del ganado y las lesiones se caracterizan por cambios como los de las esponjas perceptibles a través de un microscopio. El agente es altamente estable, y resistente al calor a temperaturas normales e incluso a temperaturas más elevadas como las usadas para la pasteurización, esterilización, así como para la congelación o el secado.

En el ganado infectado con BSE, sólo se ha encontrado el agente BSE en el tejido cerebral, en la médula espinal y en la retina. Posteriores estudios han demostrado que también está presente en el íleo distal, la médula ósea, el ganglio dorsal y el ganglio trigeminal de terneros que han sido alimentados con partes del cerebro de animales infectados de BSE.

En seres humanos, se conoce un síndrome degenerativo similar que se denomina Enfermedad de Crutzfeld-Jacobs (CJD). CJD es una lenta enfermedad humana degenerativa del sistema central nervioso con la evidente disfunción, demencia progresiva y degeneración vascular del cerebro. Tan sólo se han dado un caso por cada millón de habitantes en el mundo infectado con CJD. Aún más raras son las condiciones relacionadas con TSE (Encefalopatía Espongiforme Transmisible) del síndrome Gerstmann-Straussler, kuru e insomnio.

En 1996, el Comité Consejero de Encefalopatía Esponjiforme (SEAC) anunció la identificación de 10 casos de una nueva variante de CJD (vCJD). Todos los pacientes desarrollaron la aparición de la enfermedad en 1994 y 1995. Sin embargo, los 10 casos difirieron en un alto grado de la forma esporádica de CJD. Los individuos afectados eran mucho más jóvenes que los pacientes clásicos de CJD. Normalmente, los pacientes de CJD tienen más de 63 años. Sin embargo, la media de edad de un paciente de la variante de CJD era de 28. El curso de la enfermedad en vCJD era de 13 meses en contraste con los 6 meses de la clásica CJD. En los casos de la variante, la actividad eléctrica electroencefalográfica (EEG) en el cerebro no era típica de la CJD esporádica. Aunque la patología del cerebro fue reconocida como CJD, el modelo fue diferente de la esporádica CJD, con más placas de proteína prion.

De acuerdo a SEAC, las víctimas habían comido carne de vaca o productos de carne de vaca en los últimos 10 años, indicando una relación entre CJD y BSE. Dos estudios publicados en 1997 confirmaron el supuesto de que el agente BSE es altamente probable para ser la causa de vCJD. Con este fin, un grupo de investigadores infectó tres paneles de ratones endogámicos y un panel de ratones cruzados con BSE, vCJD y CJD esporádico respectivamente. Resultados provisionales indicaron que los ratones inoculados con BSE mostraron el mismo patrón del tiempo de incubación, signos clínicos y lesiones cerebrales como los ratones inoculados con tejidos de pacientes con vCJD de lo cual se concluyó que BSE y CJD tienen la misma firma o son la misma variedad. Además, CJD esporádico y las conocidas variedades de SCARPIE no eran iguales a vCJD o BSE. Estos resultados han sido confirmados por otros investigadores para que se presente como verídico el hecho de que BSE puede ser transmitida a los seres humanos como resultado del desarrollo de vCJD.

Debido a la creciente preocupación pública y científica sobre la posibilidad de que BSE pueda ser transmitida a la población humana como resultado del consumo de productos derivados de ganado infectado se sugirió que se sacrificara el ganado que sufriera BSE y así evitar que sus restos fueran introducidos dentro de la cadena alimenticia humana. Sin embargo, dado que BSE tarda normalmente cinco o más años en manifestarse como resultado del comportamiento de un animal infectado y debido al hecho de que no ha habido ningún método rápido para asegurar la probabilidad de que una vaca esté sufriendo de BSE más que examinar el cerebro del animal sacrificado, se sugirió que la única medida que se podía adoptar, que además calmaría el miedo público a comer productos hechos con carne e vaca, era el sacrificio absoluto. Es casi inevitable que tal política diera como resultado el sacrificio de muchos cientos de reses que no estuvieran infectadas con BSE. Como consecuencia, hay una necesidad inmediata de un método que determine rápidamente BSE.

En el presente, un método disponible para determinar la presencia del agente BSE en tejidos es inocular animales, normalmente ratones, con material supuestamente infectado con BSE. Sin embargo, los estudios con la inoculación del ratón llevan mucho tiempo, en ocasiones hasta 700 días, y el fallo para identificarlo en tejidos podría indicar bien una verdadera ausencia del agente o simplemente la limitada sensibilidad de este método.

El agente responsable del desarrollo de BSE y otras enfermedades TSE, como CJD, es más pequeño que el menor virus conocido y aún no ha sido completamente descrito. Hay tres principales teorías sobre la naturaleza de este agente. (1) El agente es un virus con características poco comunes, (2) el agente es exclusivamente una proteína de código central ("prion") que se transforma en una forma parcialmente resistente a la proteasa después de la infección, y (3) el agente es un pequeño ácido nucleico, sin ningún código y cubierto con una proteína protectora derivada del huésped. El agente BSE es extremadamente resistente al calor y a los procesos normales de esterilización. No provoca ninguna respuesta inmune detectable ni una reacción inflamatoria en los animales huésped.

Recientemente se ha descubierto que el agente responsable de la enfermedad es diferente al de los virus. El agente puede existir en múltiples formas moleculares mientras que los virus existen en una única forma con distinta morfología ultra estructural. En segundo lugar, estos agentes no son inmunológicos, a diferencia de los virus, que casi siempre provocan una respuesta inmune. En tercer lugar, no hay evidencias para confirmar la existencia de un ácido nucleico esencial en la partícula infectada, considerando que los virus tienen un genoma de ácido nucleico que sirve como platilla para la síntesis del virus progenie. Por lo tanto, finalmente se concluyó que los priones son la causa de la enfermedad degenerativa, el único componente conocido es el prion, que es codificado por un gen cromosoma del propio individuo.

Los priones infectados están básicamente compuestos de una proteína designada "isoforma scarpie" de la proteína prion, abreviada como PrP^{Sc}. Un proceso post-transacional, aún no definido, obviamente genera PrP^{Sc} de la proteína prion celular ubicua. Ambos PrP^{Sc} y PrP^{C} son codificados por una única copia del gen cromosoma y se ha demostrado que el prion inoculado inicia la producción de PrP^{Sc} del huésped normal polipéptido PrP^{C}. A diferencia de la forma normal, que normalmente se encuentra en la superficie celular, las isoformas se acumulan en el interior de las células en la vesícula. Las isoformas también difieren en su estructura de conformación, presentada por un mayor contenido de capa Beta que podría ser una causa de la mayor resistencia a la proteasa de la isoforma PrP^{Sc} frente a la forma normal PrP^{C}.

DE 197 41 607 revela que los polipéptidos sintéticos contienen secuencias de PrP, y propone métodos para producir anticuerpos específicos PrP^{C}. El anticuerpo específico monoclonal 15B3 producido de acuerdo al método declarado es capaz de distinguir entre PrP^{C} y PrP^{Sc}, lo que sólo se lograría empleando una digestión de la proteasa de PrP^{C}.

WO 93 11155 revela polipéptidos sintéticos que tienen al menos una ubicación del antígeno de una proteína prion e informa sobre los anticuerpos unidos a tales péptidos.

Korth et al. report en Nature, 390 (1997), 74 - 77 sobre la producción de anticuerpos, obtenidos por la inmunización de ratones sin PrP con bovino recombinado con PrP. Uno de dichos anticuerpos, 6H4, fue reconocido como PrPC humano, de vaca y oveja. Mientras que otro anticuerpo, 15B3, era capaz de unirse a los homogéneos del cerebro BSE digeridos por la proteasa, indicando que 15B3 tiene una cierta preferencia por PrP^{Sc}.

Actualmente no existe ningún tratamiento ni vacuna para prevenir esta enfermedad. Esto puede ser debido a la evidente baja inmunología a los genes de la isoforma PrP^{Sc} que ha evitado la creación de anticuerpos que reconozcan específicamente la isoforma PrP^{Sc}, mientras que simultáneamente evite la actividad cruzada con la isoforma "normal", PrP^{C}.

Además, no hay una prueba adecuada para detectar la enfermedad en un animal vivo. Patólogos veterinarios podrían confirmar BSE mediante una autopsia microscópica del tejido cerebral. Aún así, cuando se desea detectar la presencia del agente BSE en tejidos, ésta se determina inoculando animales, normalmente ratones, con material que esté infectado con BSE. Por lo tanto, existe una necesidad inminente para proporcionar los medios con los con los que los agentes se responsabilicen del desarrollo de las enfermedades degenerativas del sistema nervioso, como BSE, CJD, vCJD o enfermedades relacionadas con TSE, como Scrapie y otras.

Por consiguiente, el problema del presente invento reside en proporcionar los medios que posibiliten al veterinario y/o físico detectar específicamente la presencia de agentes causantes de BSE, CJD, vCJD y/o enfermedades relacionadas con TSE.

Durante el curso de extensos estudios sobre el invento, los presentes inventores han descubierto que uno de los cambios de conformación, el PrP^{C} se transforma en PrP^{Sc}, reside en la modificación de la estructura trivalente de la región terminal C de PrP^{C}.

En las figuras,

Fig. 1 muestra un dibujo (10 veces ampliado) de una muestra de tejido cerebral humano de un individuo sujeto al esporádico CJD tratado con el anticuerpo CNCM I-2476.

Fig. 2 muestra un dibujo (60 veces ampliado) de una muestra de tejido cerebral humano de un individuo sujeto al esporádico CJD tratado con el anticuerpo CNCM I-2476.

Fig. 3 muestra un dibujo (60 veces ampliado) de una muestra de tejido cerebral humano de un individuo sujeto a la nueva variante CJD tratado con el anticuerpo CNCM I-2476.

Fig. 4 muestra un dibujo (20 veces ampliado) de una muestra de tejido cerebral humano de un individuo sujeto a la nueva variante CJD tratado con el anticuerpo CNCM I-2476.

Fig. 5 muestra un dibujo (20 veces ampliado) de una muestra de tejido cerebral bovino de un animal con muestras de BSE tratado con el anticuerpo CNCM I-2476.

Fig. 6 muestra un dibujo (10 veces ampliado) de una muestra de tejido cerebral de cabra sujeto a scrapie tratado con el anticuerpo CNCM I-2476.

Fig. 7 muestra los resultado de un experimento Dot Blot, en el que varias muestras de tejido cerebral normal se exponen al anticuerpo CNCM I-2476. Como control se emplea el peptídico de Secuencia ID. No. 2 y el conjugado de dicho péptido y KLH.

Por lo tanto, de acuerdo con una característica la presente invención proporciona un anticuerpo dirigido a la parte de la terminal C de la isoforma PrP^{Sc} o a una parte de la misma, esto es, una conformación tridimensional de dicha parte del polipéptido prion mostrado en la forma "mal plegada". Debido a que la forma PrP^{C} muestra una conformación tridimensional en esta parte del polipéptido prion diferente al PrP^{Sc}, los anticuerpos presentes se unen de forma selectiva a la isoforma PrP^{Sc} mientras no se unen a la forma PrP^{C}. Son por tanto capaces de distinguir entre las dos isoformas. Los anticuerpos son dirigidos a la región formada por aminoácidos números 190 a 214 de PrP^{Sc} preferiblemente a la secuencia comprendida entre 202 y 214 de PrP^{Sc} De acuerdo a las características la secuencia del aminoácido es

: -Cys-Ile-Thr-Gln-Tyr-Glu-Arg-Glu-Ser-Gln-Ala-Tyr-Tyr-

o

: -Cys-Ile-Thr-Gln-Tyr-Gln-Arg-Glu-Ser-Gln-Ala-Tyr-Tyr-.

Secuencia ID Número 1 muestra una parte de la región terminal C de la secuencia de aminoácido del polipéptido prion bovino que es del aminoácido número 180 al número 219 como se identifica en el presente invento.

100

Un anticuerpo como es descrito en el presente invento es capaz de diferenciar entre PrP^{Sc} y PrP^{C} a través de una unió selectiva a una conformación tridimensional proporcionada por la parte terminal C de la isoforma PrP^{Sc}, que no está presente en la forma PrP^{C}.

El anticuerpo puede ser policlonal o monoclonal aunque debido a razones de reactividad cruzada se prefieren los anticuerpos monoclonales. Además, fragmentos de los anticuerpos están también en el sentido de los anticuerpos presentes, en concreto esos fragmentos que enlazan con el centro, como las regiones F_{ab} o partes del mismo. Basándose en la necesidad respectiva la persona especializada será capaz de diseñar los fragmentos correspondientes.

El término anticuerpos también significa estar formados de anticuerpos quiméricos, como los anticuerpos humanos, donde la región constante se deriva de una fuente humana, mientras que la región variable se deriva de una fuente animal, como los ratones, para disminuir una respuesta del individual tratado al agente. Los anticuerpos bi-específicos también se consideran en el presente invento. Los anticuerpos bi-específicos son inmunoglobulares o fragmentos del mismo donde los dos fragmentos F_{ab} son dirigidos a diferentes destinos. De este modo, un fragmento F_{ab} será dirigido a la parte terminal C de PrP^{Sc} mientras que el otro fragmento F_{ab} será dirigido a cualquier fin, como el fin empleado en un ensayo.

El anticuerpo puede estar unido a indicadores comúnmente empleados para detectar destinos, como una etiqueta radioactiva, una etiqueta fluorescente o un tinte. De acuerdo a las características presentadas el anticuerpo es el anticuerpo producido por la línea celular hibridoma CNCM I-2476, según fue fijado en el Trato de Budapest con el Instituto Pasteur en París, Francia, el 10 de mayo del 2000.

Los anticuerpos descritos anteriormente se pueden emplear para el diagnóstico de Encefalopatía Espongiforme Bovina o Enfermedad de Creutzfeld-Jacobs o una forma variante de la misma o enfermedades relacionadas con TSE en mamíferos, como por ejemplo, ungulados o humanos, en los que el anticuerpo de forma selectiva se une a la isoforma PrP^{Sc}. Este rasgo de ser capaz de poder usar los presentes anticuerpos en diferentes especies, como en el ser humano, vaca, oveja, etc es una característica original e interesante de los presentes anticuerpos y palia los métodos de resolución tales como que sólo se necesita un anticuerpo para investigar todos los individuos.

Para determinar si un individuo está afectado por la enfermedad correspondiente se extrae una muestra del individuo para ser investigada, como un tejido (homogenizado o secciones) o un fluido corporal como sangre, saliva, orina o fluido cerebro espinal, y se examina por la presencia de la isoforma PrPSc, de tal modo que la muestra entre en contacto con el anticuerpo bajo las condiciones adecuadas.

El método de contacto entre la muestra y el anticuerpo no está sujeto a ninguna restricción en particular, y tan sólo dependerá de los medios disponibles y de la propia muestra. Por consiguiente, se pueden usar los anticuerpos en métodos de ELISA, Dot Blot, Western Blot, métodos de química inmunológica y otros, y todos ellos con los que la persona cualificada esté familiarizado.

Para posibilitar unas pruebas rápidas que indiquen la presencia de un prion asociado a la enfermedad, el presente invento también proporciona un equipo, que está formado de al menos un anticuerpo de acuerdo al presente invento. Además, el equipo también estará formado de amortiguadores, material de soporte y agentes indicadores adaptados a los respectivos ensayos llevados a cabo.

El método para obtener los anticuerpos del presente invento comprende el paso de inmunización del animal, como por ejemplo ratones o conejos con una cantidad inmunizadora de peptídico que está formado de aminoácidos de la parte terminal C del polipeptídico prion, preferiblemente un peptídico que tenga la siguiente secuencia:

: -Cys-Ile-Thr-Gln-Tyr-Gln-Arg-Glu-Ser-Gln-Ala-Tyr-Tyr-.

Para el proceso de inmunización es preferible emplear un peptídico que se ha derivado de la secuencia anterior y que sustituye el residuo Gln en la posición número 207 del polipeptídico prion por Glu para obtener la siguiente secuencia de aminoácido:

: -Cys-Ile-Thr-Gln-Tyr-Glu-Arg-Glu-Ser-Gln-Ala-Tyr-Tyr-.

Esta secuencia ha probado a provocar una respuesta inmune lo suficientemente fuerte como para ser capaz de producir fácilmente los anticuerpos específicos contra PrP^{Sc}. Sin basarse en ninguna otra teoría los sorprendentes resultados obtenidos con este peptídico podría residir en el hecho de que el residuo original Gln pueda forma enlaces de hidrógeno y tales puedan causar insolubilidad del peptídico, lo que no se desea cuando es parte de un epitope. Por otra parte, Glu, que está en la secuencia del humano PrP, parece no formar tales enlaces.

Empleando cualquiera de los citados peptídicos para el paso de la inmunización se cuenta con la ventaja de que no es necesaria la preparación de ratones, como cuando se emplea un completo prion polipeptídico. Para la inmunización es preferible el empleo de un conjugado del peptídico y un portador, en el que el peptídico está unido al portador a través de su terminal N. Se podría mostrar que esta medida evidentemente proporciona una mejor respuesta inmune frente al enlace del peptídico con el portador a través de la terminal C.

Después de inmunizar a los animales con el antigen los esplenocitos se aíslan y se funden con células mieloma de acuerdo a métodos y técnicas conocidas en la materia. La selección para las células fusionadas se lleva a cabo con un medio apropiado, que no apoya el crecimiento de células no fusionadas como el medio HAT. Las células mieloma fusionadas en el medio de selección son sometidas a una investigación para la producción de anticuerpos capaces de unirse al peptídico empleado para el paso de inmunización.

El presente invento también pertenece a las líneas de células hibridoma capaces de producir los anticuerpos del presente invento y que se pueden obtener a través del método mencionado. Se descubrió que las líneas obtenidas crecían extremadamente rápido, con un período doble de cerca de 8 horas. También se descubrió que la secreción de anticuerpos era muy alta en comparación con la secreción de un anticuerpo hibridoma normal. De acuerdo a las características presentadas la hibridoma es CNCM I-2476 según fue fijado en el Trato de Budapest con el Instituto Pasteur en París, Francia, el 10 de mayo del 2000.

Los siguientes ejemplos ilustran el invento sin limitarse exclusivamente al mismo.

Ejemplo 1 Preparación de un peptídico sintético

Para la inmunización de un peptídico largo aminoácido 13 de la estructura primaria se ha elegido PrP humano (proteína prior humana). El peptídico está situado cerca de la parte terminal C de la proteína prion del aminoácido 202 a 214. Se ha modificado el peptídico intercambiando el residuo Gln en la posición 207 con el residuo Glu para dar como resultado la siguiente secuencia de aminoácido

: H-Cys-Ile-Thr-Gln-Tyr-Glu-Arg-Glu-Ser-Gln-Ala-Tyr-Tyr-OH

El peptídico fue unido a través de la parte terminal N a la proteína portadora KLH, hemocianina de la capa central, que representa una característica novedosa de enlace potencial de peptídicos inmunogénicos a un portador, ya que normalmente el peptídico está enlazado al portador a través del la terminal C.

Ejemplo 2 Inmunización de animales

Los ratones BALB fueron inmunizados con una dosis por ratón un compuesto de peptídico de 0.2 mg de KLH (preparado de acuerdo con el ejemplo 1) de manera subcutánea en el adyuvante completo de Freund. (CFA) (200 \mul por ratón). Tras 14 días los ratones son de nuevo inmunizados con 0.1 mg de peptídico KLH por ratón en el adyuvante incompleto de Freund (IFA) de manera intraperitoneal (200 \mul por ratón). Después de dos semanas de ser inoculados subcutáneamente con 0.2 mg de peptídico KLH por ratón se vuelve a inmunizar intraperitonalmente en el adyuvante incompleto de Freund. 10 días después de la primera inoculación, se extrae sangre de la vena de la cola y se determinará por el indirecto ELISA la presencia de anticuerpos contra el compuesto. Se recubrieron las placas con KLH, peptídico KLH y peptídico libre. Se detectó el enlace de los anticuerpos mediante los anticuerpos de la cabra anti-ratón, compuestos con HRP. La respuesta inmune de todos los ratones fue sorprendentemente muy alta.

Finalmente se inyecta una inyección intravenosa en solución intravenosa (0.1 mg/ratón en 100 \mul).

Ejemplo 3 Producción de hibridomas

En el 4º día después de la inyección se sacrificaron los ratones y se extrajeron sus bazos. Los esplenocitos se aislaron y se enlazaron con las células mieloma NS1 del ratón (en radio 1 : 4) empleando el 50% de PEG durante 3 minutos de acuerdo a las técnicas de calidad (Liddel, J.E., Cryer, A., Una guía práctica a los anticuerpos monoclonales. John Wiiley&Sons, Nueva York, 1991). Las células se lavaron y se volvieron a suspender en los platos de los 96 pozos de microtítulos en DMEM (Flow, Reino Unido) complementado con el 13% de FCS (HyClone, USA) (en la siguiente designada DMEM) y con una capa afluente de los timocitos del ratón. El siguiente día se añadió HAT DMEM a todos los pozos. Después de 10-14 días se examinaron los sobrenadantes para la presencia de anticuerpos específicos mediante el indirecto ELISA. Para este fin, las placas de microtítulo (Nunc, Dinamarca) fueron cubiertas con 5 \mug/ml del peptídico o del compuesto del peptídico KLH o KLH solo (Bache, Suiza) en 50 mM de carbonato/bicarbonato buffer pH 9.6 durante la noche a +4ºC. Se lavaron las placas tres veces con PBS/Tween 20 (Sigma, USA) y tapadas durante 30 minutos con el 1% de BSA (Sigma, USA). Después de lavarlos con PBS/Tween20 se añadieron los sobrenadantes a los pozos y se incubaron durante 2 horas a 37ºC. Se lavaron las placas tres veces con PBS/Tween20 y se añadieron los inmunoglóbulos de cabra anti-ratón conjugados con HRP (Sigma, USA) a los pozos en disolución 1:5000 en 1% BSA. Después de dos horas de incubación a 37ºC las placas se lavan con PBS/Tween20 y se añade el sustrato a los pozos (ABTS/H202; Sigma, USA). Las placas se leen a 410 nm. Todos los volúmenes son 50 \mul.

Los hibridomas de pozos positivos se transfieren a volúmenes más grandes (placas de 24 pozos) en el medio HT DMEM. Mediante el indirecto ELISA se vuelve a determinar la presencia de anticuerpos específicos y se seleccionan líneas para ser transferidas al tejido en DMEM. Finalmente, los hibridomas seleccionados se clonan dos veces mediante el método de dilución limitado y el nitrógeno congelado en líquido.

Las líneas seleccionadas estuvieron creciendo extremadamente rápido en DMEM, esto es sin la necesidad de HT, con un período doble en torno a las 8 horas. También se encontró una muy alta secreción de anticuerpos. Uno de los clones que se obtuvieron se presentó al Instituto Pasteur y se recibió el depósito no. CNCM-2476.

Ejemplo 4 Pruebas de los anticuerpos

Se probó la reactividad de los cuerpos monoclonales con PrP utilizando los sobrenadantes de los clones almacenados. Se probaron los anticuerpos monoclonales mediante inmuno-histoquímica en el tejido cerebral de pacientes con CJD, pacientes con vCJD y en cerebros de ganado positivo en BSE y en cerebros de ovejas infectadas con scrapie. Para un control normal se emplearon cerebros de ser humano, de vaca y de oveja. La investigación fue también llevada a cabo por Western Blot y Dot Blot.

Preparación muestra para histoquímica

Se prepararon secciones de parafina de tejido cerebral derivado de diferentes fuentes (humano, bovino y de cabra) de acuerdo a las técnicas de calidad (máquina: Ventana), en las cuales se obtuvieron secciones en capas 6-8 \mum. Las muestras fueron tratadas con HCOOH (fig. 1, 5, 6) o no penetraron en absoluto (fig. 2, 4). Posteriormente, el peróxido endógeno era bloqueado empleando un kit provisto (Ventana, USA), se aplicaron los anticuerpos a una concentración de 4 \mug/ml, se diluyeron en Dako S-2022 (Dako, USA) y se incubaron durante 20 minutos a 42ºC.

Posteriormente, se aplica el anti-ratón y anti-conejo biotinilado (Ventana, USA) y se incuba durante 20 minutos a 42ºC, seguida por una incubación con HRP estreptavídino (Ventana) durante 20 minutos a 42ºC, DAB (diamino benzidino) con Cu durante 4 minutos.

Resultados

El modelo de las reacciones de inmunohistoquímica muestran que mAb CNCM I-2476 reacciona con todas las forma conocidas de TSE de diferentes especies (humana, bovina, de oveja) y sólo reacciona con la proteína patológica. No hay reacción en el tejido cerebral de individuos sanos y en pacientes con la enfermedad de Alzheimer.

Preparación de los neurohomogenados

El tejido cerebral (thalamus o médula o médula espinal) se homogenizó en un 10% de sacarosa, 20 mM HEPES pH 7.5, 2% de sarcosina y 5 mM EDTA con homogenizador (Potter) (5 veces, 0.1 g en 1 ml). Los homogenados se centrifugaron durante 45 minutos a +4ºC y a 14.000 rpm. El supernadante se congeló a -20ºC, y el gránulo se disuelve en 1 M NaOH. La concentración de proteínas en las muestras se determina midiendo la absorción a 280 y 260 nm.

Dot Blot

Se usaron como muestras los supernadantes o gránulos diluidos 10 veces. Se utilizaron bien naturales bien digeridos con proteína K (10 \mug/ml). Se hizo una electrofóresis en la célula Bio Rad con 25 mM Tris, 0.32 M glicina, 0.16% SDS (w/v) pH 8.3. La transferencia se llevó a cabo con 25 mM Tris, 192 mM glicina, 20% metanol (v/v), pH 8.3 en membrana 0.2 mm PVDF. La transferencia se efectuó durante 50 minutos a 100V. Después, las membranas se taparon con 5% de leche y se incubaron con anticuerpos monoclonales (para CNCM I-2476 \mug/ml) en un 1% de leche durante 1-2 horas (agitando suavemente). Después de lavara las membranas, se incubaron con anticuerpos secundarios, conjugados con HRP (anti-ratón de cabra, Sigma, USA), diluido 1 : 5000 en un 1% de leche (1-2 horas, agitando suavemente). Se lavaron las membranas y se detectó la reacción inmune empleando el kit de quimiluminiscencia (ECL, Amersham, USA).

Resultados

No hubo reacción de muestras de cerebro normal con el anticuerpo V5B2 (CNCM I-2476). El peptídico KLH se empleó como control positivo.

Los anticuerpos monoclonales proporcionados por el presente invento muestran una alta tendencia específica hacia PrP^{Sc}. Para reconocerlo no fue necesario utilizar la proteína K de digestión del PrP^{C} previa al método de investigación. No hubo reacción entre los tejidos de cerebro normal y el mAb bajo las mismas condiciones lo que indica que los anticuerpos producidos son muy específicos y reconocen exclusivamente PrP^{Sc}.

<110> Centro de Transfusión de Sangre de Eslovenia.

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<120> Anticuerpos capaces de detectar de modo selectivo las isoformas prion PrP^{Sc}

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<130> 80242

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<140>

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<141>

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<160> 3

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 40

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<212> PRT

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<213> Bos taurus

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<400> 1

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\sa{Thr Thr Lys Gly Glu Asn Phe Thr Glu Thr Asp Ile LYs Met Met Glu}

\sac{Arg Val Val Glu Gln Met Cys Ile Thr Gln Tyr Gln Arg Glu Ser Gln}

\sac{Ala Tyr Tyr Gln Arg Gly Ala Ser}

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<210> 2

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<211> 13

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<212> PRT

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<213> Bos taurus

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<400> 2

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\sa{Cys Ile Thr Gln Tyr Glu Arg Glu Ser Gln Ala Tyr Tyr}

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<210> 3

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<211>13

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<212> PRT

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<213> Bos taurus

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<400> 3

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\sa{Cys Ile Thr Gln Tyr Gln Arg Glu Ser Gln Ala Tyr Tyr}

Claims

1. Un anticuerpo unido exclusivamente a una isoforma PrP^{Sc} de la proteína prion y que reconoce el epitomé que tiene conformación tridimensional proporcionada por la secuencia de proteínas

: -Cys-Ile-Thr-Gln-Tyr-Glu-Arg-Glu-Ser-Gln-Ala-Tyr-Tyr-

de la isoforma PrP^{Sc} de la proteína prion mientras que no se une a la forma PrP^{C}, que se obtiene mediante un método que comprende el paso de inmunización de un animal con un enlace peptídico teniendo la secuencia de amino ácido

: -Cys-Ile-Thr-Gln-Tyr-Glu-Arg-Glu-Ser-Gln-Ala-Tyr-Tyr-

o

: -Cys-Ile-Thr-Gln-Tyr-Gln-Arg-Glu-Ser-Gln-Ala-Tyr-Tyr-.

2. El anticuerpo de acuerdo a la reivindicación 1, que es un anticuerpo policlonal o monoclonal.

3. El anticuerpo de acuerdo a cualquiera de las mencionadas reivindicaciones, que está unido a un indicador.

4. El anticuerpo de acuerdo a la reivindicación 1, producido por la línea celular hibriodoma CNCM 1-2476.

5. Uso del anticuerpo de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 4 para la preparación de un agente para el diagnóstico de la Encefalopatía Espongiforme Bovina o Enfermedad de Creutzfeld-Jacobs o una variante de la Enfermedad Creutzfeld-Jacobs o enfermedades relacionadas con TSE.

6. Un método de producción de un anticuerpo de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 4 que comprende el paso de inmunización de un animal con una cantidad de un peptídico teniendo la secuencia de aminoácido

: -Cys-Ile-Thr-Gln-Tyr-Glu-Arg-Glu-Ser-Gln-Ala-Tyr-Tyr-

o

: -Cys-Ile-Thr-Gln-Tyr-Gln-Arg-Glu-Ser-Gln-Ala-Tyr-Tyr-.

ligado a través de su parte terminal N a la hemocianina de la lapa de la proteína portadora (KLH).

7. Conjunto de diagnósticos de BSE y/o CJD y/o v CJD o enfermedades relacionadas con TSE, que contienen un anticuerpo de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 4.

8. Línea celular hibridoma capaz de producir un anticuerpo de acuerdo a la reivindicación 1.

9. Línea celular hibridoma de acuerdo a la reivindicación 8, que es CNCM 1-2476.