PL208292B1 - Przeciwciało, zastosowanie przeciwciała, sposób jego wytwarzania, zestaw do diagnozowania i linia komórkowa hybrydoma - Google Patents
Przeciwciało, zastosowanie przeciwciała, sposób jego wytwarzania, zestaw do diagnozowania i linia komórkowa hybrydomaInfo
- Publication number
- PL208292B1 PL208292B1 PL360139A PL36013901A PL208292B1 PL 208292 B1 PL208292 B1 PL 208292B1 PL 360139 A PL360139 A PL 360139A PL 36013901 A PL36013901 A PL 36013901A PL 208292 B1 PL208292 B1 PL 208292B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- tyr
- gln
- antibody
- glu
- prp
- Prior art date
Links
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 title claims abstract description 28
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 title claims abstract description 28
- 208000018756 Variant Creutzfeldt-Jakob disease Diseases 0.000 claims abstract description 41
- 208000005881 bovine spongiform encephalopathy Diseases 0.000 claims abstract description 40
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 31
- 208000010859 Creutzfeldt-Jakob disease Diseases 0.000 claims abstract description 25
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 claims abstract description 22
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 22
- 208000020406 Creutzfeldt Jacob disease Diseases 0.000 claims abstract description 21
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims abstract description 17
- 208000010544 human prion disease Diseases 0.000 claims abstract description 12
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims abstract description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 18
- LWGJTAZLEJHCPA-UHFFFAOYSA-N n-(2-chloroethyl)-n-nitrosomorpholine-4-carboxamide Chemical compound ClCCN(N=O)C(=O)N1CCOCC1 LWGJTAZLEJHCPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 claims description 14
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 7
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 claims description 5
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 claims description 5
- KLKARCOHVHLAJP-UWJYBYFXSA-N Ala-Tyr-Cys Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1ccc(O)cc1)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O KLKARCOHVHLAJP-UWJYBYFXSA-N 0.000 claims description 3
- 102100034452 Alternative prion protein Human genes 0.000 claims 1
- VBIIZCXWOZDIHS-ACZMJKKPSA-N Cys-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CS VBIIZCXWOZDIHS-ACZMJKKPSA-N 0.000 claims 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 abstract description 9
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 abstract description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 4
- 208000003407 Creutzfeldt-Jakob Syndrome Diseases 0.000 description 19
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 15
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 14
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 12
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 12
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 11
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 11
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 11
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 10
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 9
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 9
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 8
- 208000002704 Sporadic Creutzfeldt-Jakob disease Diseases 0.000 description 7
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 6
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 208000008864 scrapie Diseases 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 4
- 230000003302 anti-idiotype Effects 0.000 description 4
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 4
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 4
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 4
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 4
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 3
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 101000573901 Homo sapiens Major prion protein Proteins 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 208000024777 Prion disease Diseases 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine Chemical compound C1=CC(NN)=CC=C1C1=CC=C(NN)C=C1 SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 2
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 2
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 2
- 238000003307 slaughter Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 206010003591 Ataxia Diseases 0.000 description 1
- 101001068592 Bos taurus Major prion protein Proteins 0.000 description 1
- 208000010711 Cattle disease Diseases 0.000 description 1
- 206010010947 Coordination abnormal Diseases 0.000 description 1
- MRVSLWQRNWEROS-SVSWQMSJSA-N Cys-Ile-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N MRVSLWQRNWEROS-SVSWQMSJSA-N 0.000 description 1
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N Formic acid Chemical compound OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000003736 Gerstmann-Straussler-Scheinker Disease Diseases 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 229920001410 Microfiber Polymers 0.000 description 1
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 1
- 206010029216 Nervousness Diseases 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 208000028752 abnormal posture Diseases 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000016571 aggressive behavior Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 230000036528 appetite Effects 0.000 description 1
- 235000019789 appetite Nutrition 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 230000006931 brain damage Effects 0.000 description 1
- 231100000874 brain damage Toxicity 0.000 description 1
- 208000029028 brain injury Diseases 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 239000011545 carbonate/bicarbonate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000001364 causal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010411 cooking Methods 0.000 description 1
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 201000006061 fatal familial insomnia Diseases 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000003405 ileum Anatomy 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 208000016290 incoordination Diseases 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 1
- 206010023497 kuru Diseases 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 206010025482 malaise Diseases 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000003658 microfiber Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 238000009928 pasteurization Methods 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000000863 peptide conjugate Substances 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 239000003507 refrigerant Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 210000003594 spinal ganglia Anatomy 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001103 thalamus Anatomy 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 210000000427 trigeminal ganglion Anatomy 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Neurology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest przeciwciało, zastosowanie przeciwciała, sposób jego wytwarzania, zestaw do diagnozowania i linia komórkowa hybrydoma.
Niniejszy wynalazek dotyczy nowych przeciwciał skierowanych przeciwko C-końcowej części Sc izoformy PrPSc prionów. Niniejszy wynalazek dotyczy też zastosowania takich przeciwciał w diagnostyce encefalopatii gąbczastej bydła (BSE) i nowego wariantu choroby Creutzfeldta-Jacoba (vCJD), sporadycznej choroby CJD i choroby scrapie.
Od 1986 roku diagnozowano w Wielkiej Brytanii przewlekłą chorobę degeneracyjną. Bydło dotknięte tą chorobą doznawało postępującej degeneracji układu nerwowego, przejawiającej się zmianami temperamentu, takimi jak nerwowość lub agresja, nienormalną postawą, brakiem koordynacji i trudnościami w podnoszeniu się, obniżeniem produkcji mleka lub spadkiem wagi ciała mimo nieprzerwanie trwającego apetytu i ostatecznie chore bydło padało.
Choroba otrzymała nazwę encefalopatii gąbczastej bydła (BSE) i jest obecnie powszechnie znana jako „choroba szalonych krów”. W ciągu następnych dziesięciu lat potwierdzono w Wielkiej Brytanii około 160000 przypadków tej nowo rozpoznanej choroby bydła, a również z innych krajów Europy, a nawet z krajów poza Europą, jak np. Kanada, Falklandy i Sułtanat Omanu, doniesiono o zwierzętach cierpiących na tę chorobę.
Choroba BSE jest związana z możliwym do przeniesienia czynnikiem, którego naturę nie w pełni jeszcze zrozumiano. Czynnik ten działa na mózg i rdzeń kręgowy bydła. Uszkodzenia charakteryzują się gąbczasto-podobnymi zmianami, widocznymi przy pomocy mikroskopu. Czynnik ten jest wysoce stabilny, wytrzymuje ogrzewanie do normalnej temperatury gotowania, a nawet w wyższych temperaturach, takich jak te stosowane przy pasteryzacji, sterylizacji w zwykłych temperaturach i czasie, jak również wytrzymuje zamrażanie i suszenie.
U bydła naturalnie zainfekowanego chorobą BSE czynnik BSE odnaleziono tylko w tkance mózgu, w rdzeniu kręgowym i w siatkówce. Dodatkowe badania zidentyfikowały zakażalność BSE w dystalnej krętnicy, szpiku kostnym, zwoju korzeni grzbietowych nerwu rdzeniowego i zwojach nerwu trójdzielnego u cielaków, które karmiono paszą z mózgu zwierząt zainfekowanych BSE.
U ludzi znany jest podobny zespół degeneracyjny, nazywany chorobą Creutzfeldta-Jacoba (CJD). CJD jest powolną, ludzką chorobą degeneracyjną odśrodkowego układu nerwowego z widocznymi dysfunkcjami, postępującą demencją i wakuolarną degeneracją mózgu. CJD występuje sporadycznie na całym świecie z częstością jednego przypadku na milion osób na rok. Rzadsze są choroby pokrewne z TSE (pasażowalna encefalopatia gąbczasta), takie jak zespół Gerstmanna-Strausslera, kuru i śmiertelna bezsenność rodzinna.
W 1996 roku Brytyjski Komitet Doradczy ds. Encefalopatii Gąbczastej (SEAC) doniósł o zidentyfikowaniu 10 przypadków nowego wariantu choroby Creutzfeldta-Jacoba (vCJD). U wszystkich pacjentów początek choroby nastąpił w 1994 lub 1995 roku. Jednak 10 opisanych przypadków niezmiernie różniło się od sporadycznej formy CJD. Zaatakowane osoby były dużo młodsze niż klasyczni pacjenci z CJD. Zazwyczaj pacjenci z CJD mają ponad 63 lata. W przeciwieństwie do tego, przeciętny wiek pacjentów z początkiem wariantowej formy CJD, wynosił około 28 lat. W przypadku vCJD przebieg choroby trwał średnio 13 miesięcy, co różni się od klasycznych przypadków CJD, które trwały średnio 6 miesięcy. Dla przypadków wariantowych aktywność elektro-encefalograficzna mózgu (EEG) nie była typowa dla sporadycznej choroby CJD. Chociaż patologia mózgu była rozpoznawalna jako CJD, wzór był inny od sporadycznej choroby CJD, z dużymi agregatami prionowych płytek białkowych.
Zgodnie z SEAC, o wszystkich ofiarach doniesiono, że jadły wołowinę lub produkty z wołowiny w ostatnich 10 latach, wskazując na przyczynową zależność między vCJD i BSE. Dwa badania opublikowane w 1997 roku potwierdziły przypuszczenie, że czynnik BSE jest z wysokim prawdopodobieństwem przyczyną vCJD. W tym celu grupa badaczy zainfekowała trzy grupy wsobnych myszy i jedną grupę mieszańców myszy z odpowiednio BSE, vCJD i sporadycznym CJD. Tymczasowe wyniki wskazywały, że myszy zaszczepione BSE wykazywały taki sam wzór czasu inkubacji, objawów klinicznych i uszkodzeń mózgu, jak myszy zaszczepione tkankami pacjentów z vCJD. Wyciągnięto z tego wniosek, że BSE i vCJD mają tą sama sygnaturę lub są tym samym „szczepem”. Ponadto, sporadyczne CJD i znane szczepy choroby scrapie nie były podobne do vCJD i BSE. Wyniki te zostały potwierdzone przez innych badaczy i obecnie uważa się, że BSE może zostać przeniesione na ludzi powodując rozwój vCJD.
PL 208 292 B1
Z powodu wzrastającej obawy społeczeństwa i naukowców o możliwość przeniesienia BSE na populację ludzką w wyniku spożywania produktów pochodzących od zainfekowanego bydła, zasugerowano, że bydło cierpiące na BSE należy zabić i ich tusza nie powinna być włączona do łańcucha pokarmowego człowieka. Jednak, ponieważ wiadomo, że BSE ujawnia się w zachowaniu zarażonych zwierząt zazwyczaj po pięciu lub więcej latach i nie było żadnej szybkiej metody stwierdzenia prawdopodobieństwa, czy dana krowa jest czy nie jest zakażona BSE, innej niż zbadanie mózgu zabitego zwierzęcia, zasugerowano, że jedynym bezpiecznym sposobem do zastosowania, który dodatkowo uspokoi obawy społeczeństwa dotyczące bezpieczeństwa spożywania produktów wołowych, jest rozszerzenie uboju. Jest prawie nieuniknione, że takie podejście spowoduje ubój wielu tysięcy sztuk bydła, które nie jest zainfekowane BSE. W konsekwencji, istnieje w tej dziedzinie potrzeba sposobu szybkiego określania BSE.
Jedną z dostępnych obecnie metod określania obecności czynnika BSE w tkankach, jest szczepienie zwierząt, zazwyczaj myszy, materiałem, który uważa się, za zainfekowany przez BSE. Jednak badania ze szczepieniem myszy zabierają wiele czasu, do 700 dni i niemożność zidentyfikowania BSE w tkankach może wskazywać albo na prawdziwy brak czynnika, albo po prostu na ograniczoną czułość tego podejścia.
Czynnik odpowiedzialny za rozwój BSE i innych chorób TSE, takich jak vCJD, jest mniejszy niż najmniejszy znany wirus i nie został jeszcze w pełni scharakteryzowany. Istnieją trzy główne teorie dotyczące natury tego czynnika:
(1) czynnik jest wirusem o niezwykłych właściwościach, (2) czynnik jest wyłącznie białkiem kodowanym przez gospodarza („prion”), po infekcji zmodyfikowanym do formy częściowo odpornej na proteazy i (3) czynnik jest małym, nie kodującym, regulatorowym kwasem nukleinowym pokrytym ochronnym białkiem pochodzącym od gospodarza.
Czynnik BSE jest wyjątkowo odporny na ciepło i normalne procesy sterylizacyjne. Nie wywołuje on żadnej wykrywalnej odpowiedzi odpornościowej lub reakcji zapalnej u zwierząt gospodarza.
Ostatnio stwierdzono, że czynnik odpowiedzialny za chorobę różni się od wirusów. Czynnik może występować w wielorakich formach molekularnych, podczas gdy wirusy występują w jednej formie o różnej ultrastrukturalnej morfologii. Po drugie, czynniki te nie są immunogenne, w przeciwieństwie do wirusów, które prawie zawsze wywołują odpowiedź odpornościową. Po trzecie, nie ma dowodu na istnienie istotnego kwasu nukleinowego wewnątrz cząstki infekcyjnej, podczas gdy wirusy mają genom w postaci kwasu nukleinowego, który służy jako matryca do syntezy wirusów potomnych. Zatem, wysunięto ostateczny wniosek, że priony są przyczyną choroby degeneracyjnej i jedynym znanym składnikiem jest prion, który jest kodowany przez chromosomalny gen samego osobnika.
Priony infekcyjne składają się zasadniczo z białka określanego jako „izoforma scrapie” białka Sc prionu, w skrócie PrPSc. Dotąd jeszcze nie zidentyfikowany proces posttranslacyjny, generuje oczywiSc C Sc C ście formę PrpSc z wszechobecnego komórkowego białka prionu, PrPC. Obydwa białka PrPSc i PrPC są kodowane przez jednokopiowy gen chromosomalny. Wykazano, że zaszczepiony prion inicjuje wytwaSc C rzanie formy PrPSc z prawidłowego polipeptydu PrPC gospodarza. W przeciwieństwie do formy prawidłowej, która jest głównie znajdowana na powierzchni komórki, izoformy są gromadzone wewnątrz komórek w pęcherzykach. Izoformy również różnią się swoją strukturą konformacyjną wykazując większą zawartość kartek-β, co może być przyczyną zwiększonej odporności na proteazy izoformy Sc C
PrPSc, w porównaniu do normalnej formy PrPC.
Obecnie nie ma żadnego dostępnego sposobu leczenia ani żadnej szczepionki zapobiegającej
Sc chorobie. Może to być głównie spowodowane oczywistą niską immunogennością izoformy PrPSc, co
Sc uniemożliwia wytworzenie przeciwciał specyficznie rozpoznających izoformę PrPSc, przy jednoczeC snym uniknięciu reakcji krzyżowej z „normalną” izoformą, PrPC.
Co więcej, nie ma również żadnego odpowiedniego testu do wykrywania choroby u żywych zwierząt. Weterynarze - patolodzy mogą potwierdzić BSE przez mikroskopowe badanie tkanki mózgu post mortem. Dotychczas, gdy dochodzi do wykrywania obecności czynnika BSE w tkankach, jest to określane przez szczepienie zwierząt, zazwyczaj myszy, materiałem uważanym za zainfekowany przez BSE. Zatem, istnieje w tej dziedzinie potrzeba dostarczenia środków, które są odpowiednie przeciwko czynnikom odpowiedzialnym za rozwój chorób degeneracyjnych układu nerwowego, takich jak BSE, CJD, vCJD lub chorób pokrewnych z TSE, jak scrapie i inne.
PL 208 292 B1
Dlatego problem niniejszego wynalazku leży w dostarczeniu środków, które umożliwią weterynarzom i/lub lekarzom specyficzne wykrywanie obecności czynnika powodującego BSE, CJD, vCJD i/lub chorób pokrewnych do TSE.
W trakcie rozległych badań prowadzących do niniejszego wynalazku, wynalazcy stwierdzili, że C SC zmiany konformacyjne, którym podlega PrPC w czasie swojej transformacji do PrPSC, tkwią w modyfiC kacji trzeciorzędowej struktury regionu C-końcowego PrPC.
Opis figur
Figura 1 przedstawia obraz (10 razy powiększony) próbki tkanki ludzkiego mózgu pochodzącej od osobnika chorującego na sporadyczną chorobę CJD, traktowanej przeciwciałem CNCM I-2476.
Figura 2 przedstawia obraz (60 razy powiększony) próbki tkanki ludzkiego mózgu, pochodzącej od osobnika chorującego na sporadyczną chorobę CJD, traktowanej przeciwciałem CNCM I-2476.
Figura 3 przedstawia obraz (60 razy powiększony) próbki tkanki ludzkiego mózgu, pochodzącej od osobnika chorującego na nowy wariant choroby CJD, traktowanej przeciwciałem CNCM I-2476.
Figura 4 przedstawia obraz (20 razy powiększony) próbki tkanki ludzkiego mózgu, pochodzącej od osobnika chorującego na nowy wariant choroby CJD, traktowanej przeciwciałem CNCM I-2476.
Figura 5 przestawia obraz (20 razy powiększony) próbki tkanki mózgu wołowego, pochodzącej od osobnika wykazującego objawy choroby BSE, traktowanej przeciwciałem CNCM I-2476.
Figura 6 przedstawia obraz (10 razy powiększony) próbki tkanki mózgu, pochodzącej od kozy chorującej na scrapie, traktowanej przeciwciałem CNCM I-2476.
Figura 7 przedstawia wyniki doświadczenia typu Dot Blot, w którym różne próbki tkanek zdrowego mózgu traktowano przeciwciałem CNCM I-2476. Jako kontrolę zastosowano peptyd o Id. Sekw. Nr 2 oraz koniugat omawianego przeciwciała i KLH.
Sc
Niniejszy wynalazek dotyczy przeciwciała, które wiąże się wyłącznie z izoformą PrPSc białka prionu i rozpoznaje epitop o trójwymiarowej konformacji dostarczonej przez sekwencję białkową Sc
-Cys-Ile-Thr-Gln-Tyr-Glu-Arg-Glu-Ser-Gln-Ala-Tyr-Tyr- izoformy PrPSc białka prionu, a nie wiąże się z C formą PrPC i jest możliwe do otrzymania sposobem obejmującym etap immunizowania zwierzęcia peptydem składającym się z Cys-Ile-Thr-Gln-Tyr-Glu-Arg-Glu-Ser-Gln-Ala-Tyr-Tyr lub Cys-Ile-Thr-GlnTyr-Gln-Arg-Glu-Ser-Gln-Ala-Tyr-Tyr związanym przez część N-końcową z białkiem nośnikowym, którym jest hemocyjanina skałoczepa (KLH).
Korzystnie, przeciwciało według wynalazku jest przeciwciałem poliklonalnym lub monoklonalnym.
Korzystnie, jest przeciwciałem połączonym ze znacznikiem.
Korzystnie, przeciwciało jest wytwarzane przez linię komórkową hybrydoma CNCM I-2476.
Niniejszy wynalazek dotyczy również zastosowania przeciwciała według wynalazku do wytwarzania czynnika do diagnozowania encefalopatii gąbczastej bydła lub choroby Creutzfelda Jacoba lub wariantowej formy choroby Creutzfelda Jacoba, lub chorób pokrewnych z TSE.
W zakres wynalazku wchodzi też sposób wytwarzania przeciwciała według wynalazku obejmujący etap immunizowania zwierząt peptydem składającym się z: Cys-Ile-Thr-Gln-Tyr-Glu-Arg-Glu-Ser-Gln-Ala-Tyr-Tyr lub Cys-Ile-Thr-Gln-Tyr-Gln-Arg-Glu-Ser-Gln-Ala-Tyr-Tyr związanym przez część N-końcową z białkiem nośnikowym, którym jest hemocyjanina skałoczepa (KLH).
Ponadto, wynalazek dotyczy zestawu do diagnozowania chorób spokrewnionych z BSE i/lub CJD, i/lub vCJD, lub TSE, który zawiera przeciwciało według wynalazku.
W zakres wynalazku wchodzi ponadto linia komórkowa hybrydoma zdolna do wytwarzania przeciwciała według wynalazku.
Korzystnie jest to linia zdeponowana pod numerem CNCM I-2476.
Sc
Zatem, niniejszy wynalazek dotyczy przeciwciała skierowanego przeciwko izoformie PrPSc lub jej części, to znaczy przeciwko trójwymiarowej konformacji omawianej części polipeptydu prionu wykazującej „błędnie sfałdowaną” postać.
C
Ponieważ postać PrPC wykazuje w tej części polipeptydu prionu trójwymiarową konformację wySc raźnie różniącą się od PrPSc, przeciwciała według niniejszego wynalazku są zdolne do selektywnego Sc C wiązania się z izoformą PrPSc, natomiast nie wiążą się z formą PrPC. Dlatego potrafią one rozróżniać te dwie izoformy.
Przeciwciało według wynalazku może być poliklonalne lub monoklonalne, chociaż z powodu krzyżowej reaktywności korzystne są przeciwciała monoklonalne. Przeciwciała według niniejszego Sc wynalazku rozpoznają epitop o sekwencji obejmującej aminokwasy od około 202 do około 214 PrPSc Sc wchodzącej w skład regionu obejmującego aminokwasy nr 190 do 214 PrPSc lub jego części, pod waPL 208 292 B1 runkiem, że jest zasadniczo zachowana konformacyjna dokładność omawianego regionu, tak jak wySc kazuje to izoforma PrPSc.
Id. Sekw. Nr 1 przedstawiona poniżej pokazuje część regionu C-końcowego sekwencji aminokwasowej polipeptydu prionu wołowego, tj. od aminokwasu nr 180 do aminokwasu nr 219.
Thr-Thr-Lys-Gly-Glu-Asn-Phe-Thr-Glu-Thr-Asp-Ile-Lys-Met-Met180 185 190
Glu-Arg-yal-Yal-Glu-Gln-Met-Cys-Ile-Thr-Gln-Tyr-Gln-Arg-Glu 195 200 205
-Ser-Gln-Ala-Tyr-Tyr-Gln-Arg-Gly-Ala-Ser
210 215
Termin „przeciwciało” w swoim znaczeniu obejmuje również przeciwciała chimeryczne, takie jak przeciwciała humanizowane, w których region stały jest pochodzenia ludzkiego, podczas gdy region zmienny pochodzi ze źródła zwierzęcego, takiego jak mysz, w ten sposób zmniejszając odpowiedź traktowanego osobnika na czynnik.
Termin ten obejmuje również przeciwciała o podwójnej specyficzności. Przeciwciała o podwójnej specyficzności są immunoglobulinami lub ich fragmentami, w których każdy z dwóch fragmentów Fab jest skierowany przeciwko innej strukturze docelowej.
Sc
Tak więc, jeden fragment Fab będzie skierowany przeciwko C-końcowej części PrPSc, podczas gdy drugi fragment Fab może być skierowany przeciwko dowolnej strukturze docelowej, takiej jak struktura docelowa stosowana w teście.
Przeciwciało może być połączone ze znacznikami powszechnie stosowanymi do wykrywania struktur docelowych, takimi jak znacznik radioaktywny, znacznik fluorescencyjny lub barwnik. Zgodnie z korzystnym wykonaniem, przeciwciało jest przeciwciałem wytwarzanym przez linie komórkowe hybrydoma CNCM I-2476, zdeponowane zgodnie z Porozumieniem Budapeszteńskim w Instytucie Pasteura w Paryżu, Francja, 10-go maja 2000 r.
Powyższe przeciwciała mogą być stosowane w diagnostyce i/lub leczeniu encefalopatii gąbczastej bydła lub choroby Creutzfeldta-Jacoba lub jej wariantowej formy, lub chorób pokrewnych z TSE u ssaków, takich jak np. kopytne lub ludzie, w ten sposób, że wykorzystuje się selektywne wiązanie Sc się przeciwciała z izoformą PrPSc. Ta cecha możliwości zastosowania niniejszych przeciwciał dla różnych gatunków, np. ludzi, krów, owiec itp., jest nową i ciekawą cechą przeciwciał według niniejszego wynalazku i upraszcza sposoby określania tak, że wymagane jest tylko jedno przeciwciało do badania wszystkich poszczególnych osobników.
W celu określenia, czy osobnik jest dotknięty daną chorobą, pobiera się próbki od testowanego osobnika, takie jak tkanki (homogenizowane lub skrawki) lub płyny ciała, np. krew, ślinę, mocz lub płyn Sc mózgowo-rdzeniowy i bada się obecność izoformy PrPSc przez połączenie próbki z przeciwciałem w odpowiednich warunkach.
Metoda skontaktowania próbki z przeciwciałem nie podlega żadnym szczególnym ograniczeniom i będzie zależeć tylko od dostępnych środków i od samej próbki. Zatem, przeciwciała mogą być stosowane np. w metodach takich jak ELISA, Dot Blot, Western Blot, metody immunohistochemiczne i inne, dobrze znane specjalistom.
W celu umożliwienia szybkiego przetestowania osobnika na obecność prionów towarzyszących chorobie, niniejszy wynalazek dostarcza również zestawu, zawierającego przynajmniej jedno przeciwciało według niniejszego wynalazku.
Dodatkowo zestaw zawiera również bufory, materiały pomocnicze i czynniki markerowe odpowiednie dla wykonywanego testu.
Dalej, przeciwciała według niniejszego wynalazku mogą być również stosowane w terapii chorób związanych z prionami przez podawanie osobnikowi dotkniętemu chorobą skutecznych ilości przeciwciała według wynalazku, ewentualnie razem z odpowiednimi substancjami pomocniczymi i nośnikami. Z przeciwciała według wynalazku można wytwarzać kompozycję farmaceutyczną.
Sc
W etapie immunizacji osobnika przeciwko izoformie PrPSc w sposobie wytwarzania przeciwciała w celu wywołania u osobnika odpowiedzi odpornościowej stosuje się sekwencję polipeptydu
PL 208 292 B1 od około 202 do około 214 pochodzącą z sekwencji prionu obejmującej aminokwasy nr 190 do 215 Sc
PrPSc lub jej części, albo warianty otrzymane przez podstawienie jednego aminokwasu, z zastrzeżeniem, że jest zasadniczo zachowana konformacyjna dokładność omawianego regionu, tak jak
Sc wykazuje to izoforma PrPSc.
Zgodnie z wykonaniem według wynalazku sekwencja aminokwasów epitopu jest następująca: -Cys-Ile-Thr-Gln-Tyr-Glu-Arg-Glu-Ser-Gln-Ala-Tyr-Tyr- lub -Cys-Ile-Thr-Gln-Tyr-Gln-Arg-Glu-Ser-Gln-Ala-Tyr-Tyr-.
Ponadto, przeciwciała, jako takie, mogą być wykorzystane do wytwarzania przeciwciał antyidiotypowych, które mogą być stosowane do immunizacji. Do immunizacji specjalista wybierze odpowiedni przedział czasowy, między etapami pobudzania i dobierze odpowiedni adiuwant, jeżeli będzie uważać to za konieczne. Przeciwciała według wynalazku mogą być również przeciwciałami skierowanymi przeciwko regionowi wiążącemu przeciwciał z niniejszego wynalazku. Te przeciwciała antyidiotypowe reprezentują zwierciadlane odbicie przeciwciał według niniejszego wynalazku i mogą być stosowane w zapobieganiu i terapii wymienionych wyżej chorób. Przeciwciała antyidiotypowe mogą być wytwarzane zgodnie z metodami dobrze znanymi w tej dziedzinie, tj. przez immunizację zwierząt, np. hiperzmiennym regionem przeciwciał według niniejszego wynalazku i wytwarzanie przeciwko niemu przeciwciał poliklonalnych lub monoklonalnych. W następnym etapie otrzymane przeciwciała selekcjonuje się na podstawie wiązania przeciwciał według niniejszego wynalazku z przeciwciałami antyidiotypowymi.
Sposób wytwarzania przeciwciała według niniejszego wynalazku obejmuje etap immunizacji zwierząt, takich jak np. mysz lub królik, immunizującymi ilościami peptydu obejmującego następującą sekwencję: -Cys-Ile-Thr-Gln-Tyr-Gln-Arg-Glu-Ser-Gln-Ala-Tyr-Tyr- lub na etapie immunizacji stosuje się peptyd, który uzyskuje się z powyższej sekwencji przez zamianę reszty Gin w pozycji nr 207 polipeptydu prionu na Glu tak, aby otrzymać następującą sekwencję aminokwasów: -Cys-Ile-Thr-Gln-Tyr-Glu-Arg-Glu-Ser-Gln-Ala-Tyr-Tyr-.
Nieoczekiwanie dowiedziono, że ta sekwencja wywołuje wystarczająco silną odpowiedź odporSc nościową, aby było możliwe łatwe wytworzenie przeciwciał swoistych przeciwko PrPSc. Bez powiązania się z jakąkolwiek teorią, zaskakujący wynik otrzymany dla tego polipeptydu może wynikać z tego, że natywna reszta Gin może tworzyć wiązania wodorowe i w ten sposób może powodować nierozpuszczalność peptydu, co nie jest pożądane, gdy jest on częścią epitopu. Z drugiej strony Glu, która jest w sekwencji ludzkiego PrP, podczas gdy w tej samej pozycji struktury pierwszorzędowej PrP wołowego jest Gin, pozornie nie tworzy takich wiązań.
Zastosowanie któregokolwiek z powyższych peptydów do etapu immunizacji niesie ze sobą tę korzyść, że nie trzeba przygotowywać wcześniej żadnej myszy typu knock out, jak w przypadku całego polipeptydu prionu. Do immunizacji można też stosować koniugat peptydu i nośnika, w którym peptyd jest związany z nośnikiem przez swój N-koniec. Można wykazać, że w ten sposób wywołuje się wyraźnie lepszą odpowiedź odpornościową w porównaniu ze związaniem peptydu z nośnikiem przez C-koniec.
Po immunizacji zwierząt antygenem, izoluje się splenocyty i tworzy fuzje z komórkami szpiczaka, zgodnie ze sposobami i technikami dobrze znanymi w tej dziedzinie. Selekcję fuzji komórkowych przeprowadza się stosując odpowiednią pożywkę, która nie umożliwia wzrostu komórkom, które nie uległy fuzji, taką jak pożywka HAT. Fuzje komórek szpiczaka rosnące na pożywce selekcyjnej są przeszukiwane pod względem wytwarzania przeciwciał zdolnych do wiązania peptydu zastosowanego na etapie immunizacji.
Niniejszy wynalazek dotyczy również linii komórkowych hybrydoma zdolnych do wytwarzania przeciwciał według niniejszego wynalazku.
Stwierdzono, że otrzymane linie rosną wyjątkowo szybko, z czasem okresu podwojenia około 8 godzin.
Stwierdzono również, że wydzielanie przeciwciał jest bardzo wysokie w porównaniu z normalnym wydzielaniem przeciwciał przez komórki hybrydoma. Zgodnie z korzystnym wykonaniem hybrydoma jest CNCM 1-2476, zdeponowana zgodnie z Porozumieniem Budapeszteńskim w Instytucie Pasteura w Paryżu, Francja, 10-go maja, 2000 r.
Peptydy, z którymi wiążą się przeciwciała według wynalazku w sposób oczywisty dostarczają Sc C trzeciorzędowej konformacji wykazywanej wyłącznie przez izoformę PrPSc, a nie przez formę PrPC. Tak więc, jak podkreślono powyżej, peptyd ten może być stosowany do immunizacji ludzi lub zwierząt tak, że immunizowany osobnik może wytworzyć odpowiedź odpornościową przeciwko „błędnie sfałPL 208 292 B1 dowanej formie” polipeptydu prionu i może usunąć ją z organizmu w naturalny sposób. Dodatkowo, omawiany polipeptyd może również być zastosowany do wytworzenia leków przeciwko wspomnianym powyżej chorobom związanym z prionami.
Poniższe przykłady ilustrują niniejszy wynalazek w sposób nie ograniczający.
P r z y k ł a d 1. Wytworzenie syntetycznego peptydu
Do immunizacji wybrano peptyd o długości 13 aminokwasów z pierwszorzędowej struktury ludzkiego PrP (ludzkie białko prionu). Peptyd jest umiejscowiony blisko C-końcowej części białka prionu od aminokwasu 202 do 214. Peptyd został zmodyfikowany przez zamianę reszty Gln w pozycji 207 na resztę Glu, w wyniku czego powstała następująca sekwencja H-Cys-Ile-Thr-Gln-Tyr-Glu-Arg-Glu-Ser-Gln-Ala-Tyr-Tyr-OH.
Peptyd ten został związany przez część N-końcową z białkiem nośnikowym KLH, hemocyjanina skałoczepa, co stanowi nową cechę wiązania potencjalnie immunogennego peptydu do nośnika, ponieważ normalnie peptyd wiąże się z nośnikiem przez C-koniec.
P r z y k ł a d 2. Immunizacja zwierząt
Myszy BALB/c immunizowano 0,2 mg koniugatu peptydu i KLH (przygotowanego zgodnie z przykładem 1) na jedną mysz, podskórnie w kompletnym adiuwancie Freunda (CFA) (200 μΐ/mysz). Po 14 dniach myszy immunizowano ponownie 0,1 mg KLH-peptydu na mysz, dootrzewnowo w niekompletnym adiuwancie Freunda (IFA) (200 μl/mysz). Po dwóch tygodniach szczepiono je dootrzewnowo jeszcze raz 0,2 mg KLH-peptydu na mysz, dootrzewnowo w niekompletnym adiuwancie Freunda. Krew pobierano z żyły ogonowej po 10 dniach od ostatniego szczepienia, a obecność przeciwciał przeciwko koniugatowi określano pośrednim testem ELISA. Płytki opłaszczano KLH, KLH-peptydem i wolnym peptydem. Wiązanie przeciwciał mysich wykrywano przez kozie przeciwciała anty-mysie, skoniugowane z HRP. U wszystkich myszy odpowiedź odpornościowa była zadziwiająco wysoka.
Ostatnią dawkę przypominającą podawano dożylnie w roztworze fizjologicznym (0,1 mg/mysz w 100 μθ.
P r z y k ł a d 3. Wytwarzanie hybrydoma
Czwartego dnia po szczepieniu, dawką przypominającą, myszy uśmiercano i usuwano ich śledzionę. Izolowano splenocyty i przeprowadzano fuzję z komórkami mysiego szpiczaka NSl (w stosunku 10:4), przy użyciu 50% PEG przez 3 minuty, zgodnie ze standardowymi technikami (Liddel, J. E., Cryer, A. A., A practical guide to monoclonal antybodies, John Wiley & Sons, New York, 1991). Komórki płukano i zawieszano w 96-studzienkowych płytkach mikrotitracyjnych w DMEM (Flow, UK), uzupełnionym 13% FCS (HyClone, USA) (dalej po prostu określonym DMEM) i odżywczą warstwą mysich tymocytów. Następnego dnia dodawano do wszystkich studzienek HAT DMEM. Supernatanty testowano na obecność specyficznych przeciwciał po 10-14 dniach pośrednim testem ELISA.
W tym celu, płytki mikrofitracyjne (Nunc, Dania) opłaszczano peptydem, koniugatem peptydu i KLH lub samym KLH (Bachem, Szwajcaria) o stężeniu 5 μg/ml w 50 mM buforze węglanowo/wodorowęglanowym, pH 9,6, przez noc w temperaturze 4°C. Płytki płukano trzy razy PBS/Tween (Sigma, USA) i blokowano przez 30 minut 1% BSA (Sigma, USA). Po płukaniu PBS/Tween 20 supernatanty dodawano do studzienek i inkubowano przez 2 godziny w 37°C. Płytki płukano trzy razy PBS/Tween 20 (Sigma, USA) i do studzienek dodawano kozie immunoglobuliny antymysie, sprzężone z HRP (Sigma, USA) w rozcieńczeniu 1:5000, w 1% BSA. Po dwóch godzinach inkubacji w 37°C płytki płukano PBS/Tween 20 i do studzienek dodawano substrat (ABTS/H2O2; Sigma, USA). Płytki odczytywano przy 410 nm. Wszystkie objętości wynosiły 50 pi.
Komórki hybrydoma z pozytywnych studzienek przenoszono do większych objętości (płytki 24-studzienkowe) w pożywce HT DMEM. Obecność specyficznych przeciwciał określano ponownie pośrednim testem ELISA, a wyselekcjonowane linie przenoszono do pożywki DMEM w butelkach do hodowli tkankowych. Ostatecznie, wyselekcjonowane komórki hybrydoma klonowano dwa razy stosując metodę ograniczonych rozcieńczeń i zamrażano w ciekłym azocie.
Wyselekcjonowane linie rosły wyjątkowo szybko w DMEM, tzn. z czasem okresu podwojenia około 8 godzin, bez potrzeby dodawania HT. Stwierdzono również, że wydzielanie przeciwciał było bardzo wysokie. Jeden z otrzymanych klonów został zgłoszony do Instytutu Pasteura i otrzymał numer depozytu CNCM I-2476.
P r z y k ł a d 4. Testowanie przeciwciał
Reaktywność monoklonalnych przeciwciał z PrP testowano stosując supernatanty z przechowywanych klonów. Monoklonalne przeciwciała testowano przez immunohistochemię na tkance mózgu od pacjentów z CJD, pacjentów z vCJD i mózgach bydła BSE pozytywnego oraz mózgach owiec zain8
PL 208 292 B1 fekowanych chorobą scrapie. Jako kontrolę stosowano zdrowe mózgi ludzkie, wołowe i owcze. Przeszukiwanie wykonywano również przy pomocy metod Western Blot i Dot Blot.
Preparatyka próbek do histochemii
Skrawki parafinowe tkanek mózgu pochodzące z różnych źródeł (ludzkie, wołowe lub kozie) przygotowywano zgodnie ze standardowymi technikami (urządzenie: Ventana), w których otrzymywano skrawki o grubości w granicach 6-8 μΜ. Próbki traktowano HCOOH (fig. 1, 5, 6) lub w ogóle nie stosowano traktowania wstępnego (fig. 2-4). Następnie blokowano endogenną peroksydazę stosując zestaw dostarczany przez (Ventana, USA), nanoszono przeciwciała w stężeniu 4 μg/ml, rozcieńczone w Dako S-2022 (Dako, USA) i inkubowano przez 20 minut w 42°C. Następnie, stosowano biotynylowane przeciwciała kozie antymysie + królicze (Ventana, USA) i inkubowano przez 20 minut w 42°C, z późniejszą inkubacją ze streptawidyną HRP (Ventana) przez 20 minut w 42°C, DAB (diaminobenzydyna) z Cu przez 4 minuty.
Wyniki
Wzór reakcji histochemicznych pokazuje, że mAb CNCM I-2476 reaguje ze wszystkimi znanymi formami TSE od różnych gatunków (człowiek, krowa, owca) i że reaguje tylko z patologicznym białkiem. Nie ma żadnej reakcji na tkankach mózgu zdrowych osobników i pacjentów z chorobą Alzheimera.
Preparatyka homogenatów mózgu
Tkanki mózgu (wzgórze wzrokowe lub rdzeń lub rdzeń kręgowy) homogenizowano w 10% sacharozie, 20 mM HEPES pH 7,5, 2% sarkozylu i 5 mM EDTA przy użyciu homogenizatora (Potter) (5 razy, 0,1 g w 1 ml). Homogenaty wirowano przez 45 minut w 4°C i 14000 obr./min. Supernatant mrożono w -20°C, podczas gdy osad rozpuszczano w 1M NaOH. Stężenie białka w próbkach określano przez pomiar absorpcji przy 280 i 260 nm.
Metoda Dot Blot
Jako próbki stosowano 10-krotnie rozcieńczone supernatanty lub osady. Stosowano je w formie natywnej lub trawione proteinazą K (10 μg/ml i 100 μg/ml). Elektroforezę prowadzono w aparacie BioRad w 25 mM Tris, 0,32 M glicynie, 0,16% SDS (wag./obj.), pH 8,3. Transfer przeprowadzono w 25 mM Tris,192 mM glicynie, 20% metanolu (wag./obj.), pH 8,3 na 0,2 mm błonie PVDF. Transfer był skuteczny po 50 minutach w 100 V. Następnie, blokowano błony 5% mlekiem i inkubowano z monoklonalnymi przeciwciałami (dla CNCM I-2476 40 ng/ml) w 1% mleku przez 1-2 godziny (delikatnie mieszając). Po płukaniu błon, inkubowano je z przeciwciałami drugorzędowymi skoniugowanymi z HRP (kozie, antymysie. Sigma, USA), rozcieńczonymi 1:5000 w 1% mleku przez 1-2 godziny (delikatnie mieszając). Błony płukano i wykrywano reakcję immunologiczną stosując zestaw do chemiluminescencji (ECL, Amersham, USA).
Wyniki
Nie wystąpiła żadna reakcja próbek zdrowych mózgów z przeciwciałami V5B2 (CNCM 1 -2476). Jako pozytywną kontrolę stosowano KLH-peptyd. Monoklonalne przeciwciała dostarczone przez niniejszy wynalazek wykazują wysoką specyficzność w stosunku do PrP. Do rozpoznania nie było koSc nieczne zastosowanie trawienia PrPSc proteinazą K przed metodą przesiewową. Nie było żadnej reakcji między zdrowymi tkankami mózgu i mAb w tych samych warunkach, co wskazuje, że wytworzone
Sc przeciwciała są bardzo specyficzne i rozpoznają wyłącznie PrPSc.
Claims (9)
1. Przeciwciało, znamienne tym, że wiąże się wyłącznie z izoformą PrPSc białka prionu i rozpoznaje epitop o trójwymiarowej konformacji dostarczonej przez sekwencję białkową -Cys-Ile-Thr-GlnSc C
-Tyr-Glu-Arg-Glu-Ser-Gln-Ala-Tyr-Tyr- izoformy PrPSc białka prionu, a nie wiąże się z formą PrPC, jest możliwe do otrzymania sposobem obejmującym etap immunizowania zwierzęcia peptydem składającym się z Cys-Ile-Thr-Gln-Tyr-Glu-Arg-Glu-Ser-Gln-Ala-Tyr-Tyr lub Cys-Ile-Thr-Gln-Tyr-Gln-Arg-Glu-Ser-Gln-Ala-Tyr-Tyr związanym przez część N-końcową z białkiem nośnikowym, którym jest hemocyjanina skałoczepa (KLH).
2. Przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że jest przeciwciałem poliklonalnym lub monoklonalnym.
3. Przeciwciało według zastrz. 1-2, znamienne tym, że jest połączone ze znacznikiem.
PL 208 292 B1
4. Przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że jest wytwarzane przez linię komórkową hybrydoma CNCM I-2476.
5. Zastosowanie przeciwciała określonego w zastrz. 1 do 4 do wytwarzania czynnika do diagnozowania encefalopatii gąbczastej bydła lub choroby Creutzfelda Jacoba, lub wariantowej formy choroby Creutzfelda Jacoba, lub chorób pokrewnych z TSE.
6. Sposób wytwarzania przeciwciała określonego w zastrz. od 1 do 4, znamienny tym, że obejmuje etap immunizowania zwierząt peptydem składającym się z: Cys-Ile-Thr-Gln-Tyr-Glu-Arg-GluSer-Gln-Ala-Tyr-Tyr lub Cys-Ile-Thr-Gln-Tyr-Gln-Arg-Glu-Ser-Gln-Ala-Tyr-Tyr związanym przez część N-końcową z białkiem nośnikowym, którym jest hemocyjanina skałoczepa (KLH).
7. Zestaw do diagnozowania chorób spokrewnionych z BSE i/lub CJD, i/lub vCJD lub TSE, znamienny tym, że zawiera przeciwciało określone w zastrz. 1 do 4.
8. Linia komórkowa hybrydoma zdolna do wytwarzania przeciwciała określonego w zastrz. 1.
9. Linia komórkowa hybrydoma według zastrz. 8, znamienna tym, że jest zdeponowana pod numerem CNCM I-2476.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP00111108A EP1158003B2 (en) | 2000-05-23 | 2000-05-23 | Antibodies capable to selectively detect prion PrP Sc isoforms |
| PCT/IB2001/001666 WO2001090191A2 (en) | 2000-05-23 | 2001-05-15 | ANTIBODIES CAPABLE TO SELECTIVELY DETECT PRION PrPSc ISOFORMS |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL360139A1 PL360139A1 (pl) | 2004-09-06 |
| PL208292B1 true PL208292B1 (pl) | 2011-04-29 |
Family
ID=8168816
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL360139A PL208292B1 (pl) | 2000-05-23 | 2001-05-15 | Przeciwciało, zastosowanie przeciwciała, sposób jego wytwarzania, zestaw do diagnozowania i linia komórkowa hybrydoma |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1158003B2 (pl) |
| JP (1) | JP5042430B2 (pl) |
| KR (1) | KR100829447B1 (pl) |
| CN (1) | CN1250572C (pl) |
| AR (1) | AR029098A1 (pl) |
| AT (1) | ATE312848T1 (pl) |
| AU (2) | AU8435501A (pl) |
| CA (1) | CA2407905C (pl) |
| DE (1) | DE60024787T3 (pl) |
| DK (1) | DK1158003T4 (pl) |
| ES (1) | ES2253156T5 (pl) |
| HU (1) | HU229454B1 (pl) |
| PL (1) | PL208292B1 (pl) |
| WO (1) | WO2001090191A2 (pl) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003059386A2 (en) * | 2002-01-18 | 2003-07-24 | Cytos Biotechnology Ag | Prion protein carrier-conjugates |
| EP1596199A1 (en) * | 2004-05-14 | 2005-11-16 | Prionics AG | Method for the detection of disease-related prion |
| JP4246777B1 (ja) * | 2007-11-20 | 2009-04-02 | 森永乳業株式会社 | 異常型プリオン蛋白質結合剤および異常型プリオン蛋白質の検出方法 |
| EP2135880A1 (en) * | 2008-06-17 | 2009-12-23 | Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf | Anti-prion protein antibody fragment |
| WO2010040209A1 (en) | 2008-10-06 | 2010-04-15 | The University Of British Columbia | Methods and systems for predicting misfolded protein epitopes |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0616613B1 (en) * | 1991-12-03 | 1999-03-17 | Proteus Molecular Design Limited | Fragments of prion proteins |
| NZ318689A (en) * | 1995-09-14 | 1999-02-25 | Univ California | Prion antibodies specific for native prpsc and use for detecting human prpsc in a source |
| EP0861900A1 (en) † | 1997-02-21 | 1998-09-02 | Erziehungsdirektion Of The Canton Zurich | Immunological detection of prions |
| DE19741607A1 (de) † | 1997-09-20 | 1999-03-25 | Prionics Ag | Synthetische Polypeptide zur Diagnose und Therapie von Prionerkrankungen |
-
2000
- 2000-05-23 EP EP00111108A patent/EP1158003B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-23 DE DE60024787T patent/DE60024787T3/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-23 AT AT00111108T patent/ATE312848T1/de active
- 2000-05-23 ES ES00111108T patent/ES2253156T5/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-23 DK DK00111108.7T patent/DK1158003T4/da active
-
2001
- 2001-05-15 CA CA2407905A patent/CA2407905C/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-05-15 KR KR1020027015692A patent/KR100829447B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 2001-05-15 HU HU0302413A patent/HU229454B1/hu not_active IP Right Cessation
- 2001-05-15 CN CNB01809936XA patent/CN1250572C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2001-05-15 PL PL360139A patent/PL208292B1/pl unknown
- 2001-05-15 AU AU8435501A patent/AU8435501A/xx active Pending
- 2001-05-15 WO PCT/IB2001/001666 patent/WO2001090191A2/en active Search and Examination
- 2001-05-15 AU AU2001284355A patent/AU2001284355B2/en not_active Ceased
- 2001-05-15 JP JP2001587002A patent/JP5042430B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2001-05-23 AR ARP010102453A patent/AR029098A1/es active IP Right Grant
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1441811A (zh) | 2003-09-10 |
| AR029098A1 (es) | 2003-06-04 |
| KR100829447B1 (ko) | 2008-05-15 |
| DE60024787D1 (de) | 2006-01-19 |
| DK1158003T3 (da) | 2006-05-01 |
| WO2001090191A2 (en) | 2001-11-29 |
| CA2407905C (en) | 2012-08-14 |
| DE60024787T2 (de) | 2006-09-07 |
| WO2001090191A3 (en) | 2002-06-20 |
| JP5042430B2 (ja) | 2012-10-03 |
| AU8435501A (en) | 2001-12-03 |
| DK1158003T4 (da) | 2013-04-08 |
| EP1158003B2 (en) | 2012-12-26 |
| HU229454B1 (en) | 2013-12-30 |
| CA2407905A1 (en) | 2001-11-29 |
| EP1158003B1 (en) | 2005-12-14 |
| KR20030014234A (ko) | 2003-02-15 |
| ES2253156T5 (es) | 2013-04-30 |
| PL360139A1 (pl) | 2004-09-06 |
| DE60024787T3 (de) | 2013-06-06 |
| ES2253156T3 (es) | 2006-06-01 |
| ATE312848T1 (de) | 2005-12-15 |
| EP1158003A1 (en) | 2001-11-28 |
| CN1250572C (zh) | 2006-04-12 |
| AU2001284355B2 (en) | 2005-11-10 |
| JP2003534000A (ja) | 2003-11-18 |
| HUP0302413A2 (hu) | 2003-10-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1194164B1 (en) | Prion protein peptides and uses thereof | |
| KR101434935B1 (ko) | 아밀로이드 베타 단백질에 대한 모노클로날 항체 및 이의용도 | |
| EP0809656B1 (en) | MONOCLONAL ANTIBODY SPECIFIC FOR beta-A4 PEPTIDE | |
| US20120107321A1 (en) | Antibodies And Epitopes Specific To Misfolded Prion Protein | |
| AU6492794A (en) | Contraceptive vaccine based on alloimmunization with zona pellucida polypeptides | |
| US7041807B1 (en) | Antibodies to a YYX epitope of a mammalian prion protein | |
| US20050163776A1 (en) | Treatment of tse infection | |
| PL208292B1 (pl) | Przeciwciało, zastosowanie przeciwciała, sposób jego wytwarzania, zestaw do diagnozowania i linia komórkowa hybrydoma | |
| US20070281318A1 (en) | Use of monoclonal antibodies to distinguish protein conformational isoforms | |
| US7098317B1 (en) | Antibodies capable to selectively detect prion PrPSc isoforms | |
| WO2002046236A1 (fr) | Anticorps monoclonal dirigé contre un prion anormal, procédé de production correspondant, et procédé d'essai immunologique l'utilisant | |
| Xiao et al. | Preparation of monoclonal antibodies against prion proteins with full-length hamster prp | |
| AU2019246844A1 (en) | Monoclonal antibodies against amyloid beta protein and uses thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| RECP | Rectifications of patent specification |