ES2251243T3

ES2251243T3 - Pectina para la estabilizacion de proteinas.

Info

Publication number: ES2251243T3
Application number: ES99957468T
Authority: ES
Inventors: Timothy C. Gerrish
Original assignee: CP Kelco ApS
Current assignee: CP Kelco ApS
Priority date: 1998-11-05
Filing date: 1999-11-04
Publication date: 2006-04-16
Anticipated expiration: 2019-11-04
Also published as: ATE308568T1; JP2002529551A; AU1516600A; DE69928124T2; WO2000027888A1; TW502041B; CN1332751A; EP1141031A1; EP1141031B1; CN1153781C; DK1141031T3; DE69928124D1; US6221419B1

Abstract

000 g de la leche acidificada en un vaso de precipitados y luego se añaden 60 g de azúcar y la cantidad apropiada de pectina, mezclando muy bien mediante un mezclador Silverson de alta de velocidad. La cantidad de pectina añadida vería entre 0 y 10 g en intervalos de 0, 5 g, de modo que se mide la viscosidad para un total de 21 concentraciones diferentes de pectina. Se deja reposar la solución por 30 minutos, luego de los cuales es homogenizada a 180-200 kg/cm2 empleando un homogenizador de laboratorio Ranni modelo 12- 50. La solución resultante luego es calentada a 70 °C en un baño maría con agitación, y a continuación se

Description

Pectina para la estabilización de proteínas.

La presente invención se refiere a una pectina para estabilizar las proteínas, en particular para estabilizar proteínas presentes en bebidas ácidas acuosas. La invención además suministra bebidas ácidas estabilizadas así como un proceso para la preparación de la pectina.

Las bebidas lácteas acidificadas están incrementando su popularidad entre los consumidores. Tales bebidas han sido comercialmente exitosas por largo tiempo en Japón y parte del sureste asiático, y ahora están siendo introducidas en mercados occidentales. Tales bebidas pueden ser a base de yogur (caso en el cual son frecuentemente llamadas yogures bebibles), bebidas de Lactobacillus o bebidas refrescantes a base de leche. Estas bebidas difieren unas de otras, por ejemplo en su contenido respectivo de Sólidos Lácteos No Grasos (SLNG), constituidos principalmente por caseína. Las bebidas de yogur típicamente contienen mínimo un 8% en peso de SLNG, las bebidas de Lactobacillus contienen mínimo un 3% en peso de SLNG, mientras las bebidas refrescantes contienen menos del 3% en peso de SLNG.

Las bebidas de yogur son distribuidas frescas y promocionadas por su contenido de Lactobacillus vivos, o también son tratadas térmicamente antes de su distribución para darles una mayor vida útil. Las bebidas de yogur tratadas térmicamente deben ser estabilizadas para prevenir la sedimentación de las partículas de caseína, dado que dicha sedimentación hace que las bebidas desarrollen una indeseable textura arenosa. Aún en las bebidas frescas de leche acidificada con baja viscosidad, los SLNG deben ser estabilizados para prevenir la precipitación de partículas de caseína.

La pectina es el estabilizador más comúnmente usado en las bebidas de leche acidificada. La pectina es un polisacárido estructural comúnmente encontrado en la forma de protopectina en células de las plantas. El esqueleto de la pectina comprende residuos de ácido galacturónico enlazados en posición \alpha1-4, los cuales son interrumpidos con un pequeño número de unidades de \alpha-L-ramnosa enlazadas en posición 1-.2. Además, la pectina comprende regiones altamente ramificadas con una cadena casi alternante de ramno-galacturonano. Estas regiones altamente ramificadas también contienen otras unidades de azúcar unidas por enlaces glicosídicos a las unidades de ramnosa o de ácido galacturónico. Las cadenas largas de residuos de ácido galacturónico enlazados en \alpha 1-4 son comúnmente denominadas regiones "lisas" mientras que las regiones altamente ramificadas son denominadas regiones "erizadas".

Algunos de los grupos carboxilo de los residuos galacturónicos están esterificados, típicamente por grupos metilo. Los restantes están presentes como grupos carboxilo libres. La esterificación de los grupos carboxilo ocurre después de la polimerización de los residuos de ácido galacturónico. Sin embargo, es extremadamente raro que todos los grupos carboxilo estén esterificados. Usualmente, el grado de esterificación varía entre 0 y 90% de los grupos carboxilo disponibles. Si el 50% ó más de los grupos carboxilo de una pectina están esterificados, entonces se le denomina comúnmente como una pectina de alto éster o pectina de alto metoxilo. Si menos del 50% de los grupos carboxilo están esterificados, entonces se le denomina como pectina de bajo éster o pectina de bajo metoxilo. Si la pectina contiene solo unos pocos, o ninguno, grupos esterificados, se le denomina comúnmente como ácido péctico.

La estructura de la pectina, en particular el grado de esterificación, define muchas de sus propiedades físicas y/o químicas. Por ejemplo, la gelificación de la pectina, causada por la presencia de cationes calcio depende en modo especial del grado de esterificación. Se cree que la gelificación es el resultado de la formación de complejos entrecruzados de iones calcio con grupos carboxilo libres de un número de cadenas de pectina causando la formación de una matriz tridimensional gelificada.

Se sabe que la distribución de grupos carboxilo libres a lo largo de la cadena del polímero es importante para determinar si la pectina es adecuada para usarse como estabilizante para bebidas acidificadas de leche. Se ha propuesto que la pectina estabiliza una suspensión de partículas de caseína, adsorbiéndose en la superficie de las partículas de caseína en puntos específicos de la molécula de pectina. El resto de la molécula de pectina forma cadenas que penden y están espiraladas adentrándose en la fase líquida. La repulsión entre las partículas del complejo resultante puede deberse al incremento de la presión osmótica creada cuando interactúan unas con otras las cadenas de pectina complejadas con dos partículas de caseína.

Para que una pectina sea útil como estabilizante de una bebida acidificada de leche, al menos algunos de sus grupos carboxilo libres deben estar dispuestos en bloques (es decir en forma contigua), y no estar distribuidos aleatoriamente en forma discreta a lo largo de la cadena de polímero. La fuerza de enlace entre una molécula de pectina y una partícula de caseína se debe a la interacción de bloques de grupos carboxilo negativamente cargados, con las cargas positivas que existen en la superficie de la partícula. También es importante la longitud de los bloques de grupos carboxilo libres. Los bloque de grupos carboxilo libres que son bien sea muy largos o muy cortos no generan estabilización del sistema. En el primer caso no habrá cadenas que pendan. En el segundo caso, las pectinas no se fijan firmemente a las partículas de caseína y por ello no hay estabilización de las partículas.

Una característica bien conocida de las pectinas de bajo éster o sensibles al calcio, es su habilidad para espesar o formar geles, particularmente cuando están en presencia de cationes de metales alcalinotérreos, como Ca^{++}. Desafortunadamente, las bebidas de leche acidificada contienen de modo natural cantidades significativas de cationes de Calcio. Cuando hay un exceso de pectina, estos cationes tienen el efecto indeseable de causar incrementos significativos en la viscosidad, lo cual puede incluso provocar en casos extremos la gelificación de la bebida de leche acidificada.

La producción de bebidas de suero tratadas térmicamente también presenta problemas. Los tratamientos térmicos por encima de 70ºC producen cantidades variables de partículas de suero, en función de la temperatura exacta alcanzada. Por esa razón, la cantidad de pectina necesaria para estabilizar la bebida de suero tratada térmicamente varía con el tratamiento térmico. Puesto que las partículas de suero que se forman son relativamente pequeñas, la cantidad de pectina requerida para obtener una bebida estable puede ser muy alta debido a la gran área superficial total de estas partículas. Sin embargo, una excesiva adición de pectina también producirá el espesamiento o formación de gel, debido al entrecruzamiento de la pectina en exceso con los cationes de calcio que están presentes de modo natu-
ral.

Por tanto, se entenderá que la inclusión de pectina tiene tanto efectos deseables como indeseables sobre las propiedades de las bebidas acidificadas de leche. Mientras que puede actuar como estabilizante contra la sedimentación de las partículas de caseína o la separación del suero, puede tener la desventaja de incrementar la viscosidad de la bebida debido a su entrecruzamiento con cationes de calcio presentes de manera natural, dando como resultado una bebida inaceptable. Estos dos efectos se ilustran en la Figuras 1 y 2 de ésta especificación. Ellas ilustran los efectos de concentraciones variables de pectina en la sedimentación y en la viscosidad de una bebida de yogur homogenizada no pasteurizada y una bebida de yogur homogenizada pasteurizada, respectivamente. Se verá que en ausencia de pectina hay una sedimentación significativa en el caso de ambas bebidas, causada por la inestabilidad de las partículas de caseína, lo cual también resulta en una viscosidad relativamente alta. Después de que se ha añadido una cierta concentración de pectina, las partículas de caseína se hacen estables contra la sedimentación, luego de lo cual el incremento en la concentración de la pectina tiene poco efecto sobre la sedimentación. Volviendo a la viscosidad de las bebidas, ésta también cae significativamente debido a la estabilización de las partículas de caseína, pero casi inmediatamente comienza a elevarse debido al entrecruzamiento del exceso de pectina añadida, con los cationes de calcio presentes. Dicho incremento en la viscosidad es indeseable pues confiere a la bebida unas propiedades organolépticas pobres. En cada caso hay un rango de trabajo estrecho de concentración de pectina, marcado respectivamente con X y Y en las figuras 1 y 2, en las cuales tanto la sedimentación como la viscosidad de las bebidas caen dentro de niveles aceptablemente bajos. Este rango puede ser tan estrecho como tan sólo 0,06% en peso de la pectina, basado en el peso de la bebida como un todo. Por debajo de éste rango de trabajo, la sedimentación es un problema significativo, mientras que por encima de él la viscosidad de la bebida es indeseablemente alta.

Desde el punto de vista comercial, para los fabricantes de bebidas de leche acidificada es crítico evitar la sedimentación puesto que ella podría arruinar el producto. Por esa razón, normalmente los fabricantes añaden un exceso de pectina para asegurar que la sedimentación no ocurra, pero ese exceso de pectina añadida provoca en la bebida una viscosidad indeseablemente alta. Mientras que a los fabricantes les gustaría mantenerse dentro de ese estrecho rango de trabajo previamente mencionado, ello es comercialmente difícil debido al riesgo de que por una cantidad insuficiente de pectina añadida, falle todo el lote de producto debido a la sedimentación.

Es bien sabido que el contenido de grupos metilo de la pectina se ve modificado en la naturaleza por la acción de las pectin-esterasas presentes en los tejidos vegetales. Estas esterasas, usualmente metil-pectin esterasas (MPE!60!s) desmetilan los grupos carboxilo esterificados que están adyacentes a por lo menos dos radicales ácido carboxílico libres contiguos. De este modo, la desmetilación ocurre formando bloques. Como se mencionó previamente, la disposición de éstos bloques es un factor importante para la acción estabilizante de la pectina en bebidas de leche acidificada. Es sabido que las proteasas de la papaína y bromelaina también desmetilan las pectinas.

En una pectina comercial extraída, con un grado típico de esterificación de 70-74%, la longitud de los bloques de grupos carboxílicos libres puede variar de molécula a molécula, y cada molécula de pectina incluye normalmente varios bloques de diferentes longitudes. La fuerza de enlace entre la molécula de pectina y la superficie de partícula de caseína depende de la longitud de los bloques que interactúan con las cargas positivas y/o con las cargas negativas de la superficie de la caseína, vía puentes salinos de calcio. Para obtener completa estabilidad, una proporción significativa de la superficie de la partícula de caseína debería estar cubierta por la pectina.

Tal como se describió en EP-A-0 664 300, las pectinas extraídas de fuentes comunes tales como cáscaras de frutas cítricas, pueden ser separadas en dos fracciones diferentes de pectina. Una fracción es una pectina sensible al calcio (PSC) y la otra es una fracción no sensible al calcio (PNSC). Estas dos fracciones de pectina poseen sensibilidades al calcio bastante diferentes \DeltaSC). PSC es una pectina de alto éster que contiene un grado de esterificación de al menos 65%, cuyos grupos carboxilo están dispuestos predominantemente en bloques. Esta configuración en bloques de los grupos carboxilo es responsable por la sensibilidad al calcio de las PSC. Por otro lado, PNSC es también una pectina de alto éster que contiene un grado de esterificación de al menos 70% cuyos grupos carboxilo libres están dispuestos aleatoriamente a lo largo de la cadena de polímero, sin un grado significativo de proximi-
dad.

Las pectinas comerciales típicas que son vendidas para la estabilización de bebidas de leche acidificada contienen aproximadamente 60% de PSC y 40% de PNSC. La pectina como un todo puede tener un \DeltaSC (como se define abajo) entre 200 y 600 cP, mientras que la fracción PSC usualmente tiene un \DeltaSC entre 500 y 1500 cP. Dado que la fracción PSC es la responsable de la estabilización de la caseína en las bebidas de leche acidificada, la muy alta sensibilidad al calcio de ésta fracción es contraproducente para la viscosidad de la bebida cuando está presente en exceso la pectina, y por tanto también su fracción PSC. Además, puesto que la fracción PNSC no contribuye de modo significativo al poder estabilizante de la pectina como un todo, su presencia es desperdiciada. Obviamente, sería altamente deseable que toda la pectina añadida a la bebida de leche acidificada contribuyera a la estabilización de la caseína, y por tanto que la pectina tuviese controlada su sensibilidad al calcio de manera que no incrementara de modo significativo la viscosidad de la bebida. cuando está presente en exceso.

En la descripción que sigue y en las Reivindicaciones anexas, las pectinas están caracterizadas por su grado de esterificación (GE), su sensibilidad al Calcio (\DeltaSC) y su relación por peso entre PSC y la suma de PSC y PNSC, expresada como la Relación de Sensibilidad al Calcio de la Pectina (RSCP). Estas tres características de la pectina son determinables como se muestra a continuación:

(i) Determinación del grado de esterificación (GE) de una muestra de pectina:

Pese 5 g de la muestra de pectina, con aproximación a 0,1 mg y transfiéralos a un vaso de precipitados adecuado. Agite por 10 minutos con una mezcla de 5 ml de ácido clorhídrico fumante 37% y 100 ml de IPA al 60%. Transfiéralos a un tubo acoplado con filtro de vidrio (30 a 60 ml de capacidad) y lave con 6 porciones de 15 ml de la mezcla HCl-IPA 60%, seguido de IPA 60% hasta que el filtrado esté libre de cloruros. Finalmente lave con 100 ml de IPA 100%, seque por 2,5 horas en un horno a 105ºC, enfríe en un desecador y pese. Transfiera exactamente un décimo del peso neto total de la muestra desecada (lo cual representa 0,5 g de la muestra sin lavar tomada originalmente) a un frasco erlenmeyer de 250 ml y humedezca la muestra con 2 ml de IPA. Agregue 100 ml de agua destilada recientemente hervida y enfriada, tape y mezcle ocasionalmente hasta lograr la completa disolución. Agregue 5 gotas de fenolftaleína y titule con hidróxido de sodio 0,1 N y registre los resultados como el título inicial (V1).

Agregue exactamente 20 ml de hidróxido de sodio 0,5 N, tape, agite vigorosamente y deje reposar por 15 minutos. Agregue exactamente 20 ml de ácido clorhídrico 0,5 N, y agite hasta que el color rosa desaparezca. Después de añadir tres gotas de fenolftaleína, titule con hidróxido de sodio 0,1 N hasta obtener un tenue color rosa que persiste ante una agitación vigorosa; registre este valor como el título de saponificación (V2).

Transfiera cuantitativamente el contenido del frasco erlemeyer a un balón de destilación de 500 ml, acoplado a una trampa Kjeldahl y a un condensador refrigerado con agua, cuyo tubo de desfogue está bien sumergido (en un frasco receptor) bajo la superficie de una mezcla de agua libre de dióxido de carbono y 20,0 ml de ácido clorhídrico 0,1 N,. Añada al balón de destilación 20 ml de una solución 1 en 10 de hidróxido de sodio, selle las uniones y luego comience a calentar cuidadosamente para evitar excesiva formación de espuma. Continúe destilando hasta que haya recogido 80-120 ml de destilado. Añada unas gotas de rojo de metilo al recipiente receptor y titule el exceso de ácido con hidróxido de sodio 0,1 N registrando el volumen requerido, en ml, como "S". Realice una determinación de blanco de reactivos sobre 20,0 ml de ácido clorhídrico 0,1 N y registre el volumen requerido, en ml, como "B". Registre el título de amida (B-S) como V3. Calcule el grado de esterificación (como porcentaje de los grupos carboxilo totales) mediante la fórmula:

100 x (V2/(V1+V2+V3))

(ii) Determinación de la sensibilidad al calcio (\DeltaSC) de una muestra de pectina.

Se prepara una solución acuosa de la pectina en agua destilada, y se ajusta su pH a 1,5 con HCl 1 M. La concentración empleada debe estar alrededor del 0,60%. Mida porciones de 145 gramos de ésta solución de pectina en vasos de viscosidad.

Agregue 5 ml de una solución que contiene Cloruro de Calcio 250 mM a la solución de 145 gramos de pectina, para dar una concentración 8,3 mM de calcio.

Agregue a la solución de pectina (con buena agitación empleando agitador magnético) 25 ml de una solución tampón de acetato que contiene iones 1 M de acetato y un pH de 4,75, para llevar el pH de la solución a 4,2.

Retire el agitador magnético y deje el vaso a temperatura ambiente (25ºC) hasta el día siguiente, y mida la viscosidad a 25ºC con un viscosímetro Brookfield.

Mientras que el método es el más adecuado para muestras de pectina que tienen una viscosidad no mayor de 100, es posible medir hasta 200 unidades Brookfield con buena reproducibilidad. Las muestras de pectina con viscosidades más altas tienden a gelificar, dando resultados menos reproducibles. Sin embargo, el método da una indicación razonable de la sensibilidad al calcio relativa de las muestras.

El valor \DeltaSC de la pectina se puede calcular midiendo la viscosidad de la misma muestra de pectina, reemplazando la solución de cloruro de calcio por agua destilada, y restando ésta viscosidad (solución libre de calcio) al valor determinado en la solución a la que se añadió cloruro de calcio.

\newpage

(iii) Determinación del RSCP en una muestra de pectina

Pese cerca de 0,2 g de pectina con aproximación al mg (en un tubo de centrífuga de 50 ml pre-tarado y pesado con aproximación al mg) disuélvalos en 10 g de agua desmineralizada, calentando el tubo a 70ºC. Enfríe la solución a aproximadamente 20ºC. Realice esto por duplicado. Ajuste el pH de cada solución a 4,0.

Determine la cantidad total de pectina en la solución, añadiendo a uno de los tubos 20 ml de solución al 80% de alcohol isopropílico (IPA), para precipitar la pectina. Recolecte el precipitado mediante centrifugación a 30.000 G por 30 minutos, lávelo dos veces con IPA 60% centrifugando cada vez luego del lavado, séquelo a 60ºC al vacío durante toda la noche y péselo con aproximación al mg. Divida la cantidad de pectina precipitada por el peso inicial de pectina añadido a ese tubo en particular, para obtener la relación "A" para la pectina.

Añada 10 ml de la siguiente solución (la cual contiene calcio 60 mM e IPA al 16%) a la otra muestra de 10 ml de solución de pectina en un tubo de centrífuga tarado:

: 387 g de agua desmineralizada

: 99 g de IPA 80%

: 4,4 g de CaCl_{2}.2H_{2}O

Luego de mezclar las dos soluciones, se tiene como resultado un contenido de Calcio de 30 mM y 8% de IPA. La suspensión de partículas de gel formada es dejada por 24 horas con agitación ocasional. Se separan las partículas de gel de la fase líquida mediante centrifugación a 30.000 G por 30 minutos. Cuidadosamente se decanta o extrae por sifón la fase líquida, para dejar las partículas de gel en el tubo.

Se lavan la partículas de gel dos veces en iguales cantidades de una solución que contiene Calcio 30 mM y 8% de IPA por agitación en un equipo vortex y dejando que el lavado se equilibre, por un tiempo de 24 horas en cada lavado. Luego de cada lavado, se separan las partículas de gel mediante centrifugación a 30.000 G por 30 minutos. La solución de lavado para éste paso puede prepararse diluyendo una alícuota de la solución 16% IPA- Calcio 60 mM, con un volumen igual de agua.

Después de decantar la fase líquida se pesa la cantidad total de fase de gel lavada. La cantidad de pectina en la fase de gel se determina mezclando ésta, pesada al segundo decimal, con dos veces su valor de IPA al 80% y luego lavada dos veces en IPA 60%. El precipitado se colecta mediante centrifugación a 30.000 G por 30 minutos, después de cada lavado. Luego la muestra se seca por toda la noche a 60ºC bajo vacío y pesada con aproximación al mg. Se determina la cantidad normalizada de pectina sensible al calcio (PSC) dividiendo ésta cantidad de pectina por la cantidad original de pectina pesada en el tubo de centrífuga. Este valor se designa como "B" para la pectina.

El valor RPSC se determina de acuerdo con la fórmula RPSC = B/A

(iv) Determinación de sedimento y viscosidad

En la descripción que sigue también se hace referencia a la determinación de la cantidad de sedimento en una bebida de leche acidificada y la determinación de la viscosidad de dicha bebida. Para determinar la cantidad de sedimento se pesan exactamente tubos de centrífuga y se llenan con la bebida de leche acidificada hasta menos de 1 cm del borde del tubo. Se pesan nuevamente los tubos, para tener el peso de la bebida en cada tubo. Luego el tubo es centrifugado por 20 minutos a 4.500 rpm. Se decanta el sobrenadante y los tubos se colocan invertidos para dejar drenar el líquido remanente. Finalmente se seca el borde del tubo con un papel secante y se pesa el tubo. El sedimento (expresado como porcentaje) se calcula dividiendo el peso del sedimento por el peso de la muestra originalmente tomada, y expresando el resultado como porcentaje.

La viscosidad de una bebida de leche acidificada se mide llenando un vaso de viscosidad con la bebida y dejándola a 5ºC por 18-24 horas. Luego se mide la viscosidad con un viscosímetro Brookfield tipo LVT a 60 rpm después de un minuto de rotación.

Un objetivo de la presente invención es suministrar una pectina modificada capaz de estabilizar una suspensión de partículas de proteína contra la sedimentación, y que no incremente de modo significativo la viscosidad de la solución cuando esté presente un exceso significativo, comparado con la cantidad requerida para estabilizar la bebida contra la sedimentación.

Un objetivo adicional de la presente invención es suministrar una bebida ácida acuosa que contiene una suspensión de partículas de proteína que están estabilizadas contra la sedimentación mediante la incorporación de dicha pectina.

Finalmente, otro objetivo es suministrar varios métodos para preparar dicha pectina.

De acuerdo con un primer aspecto, la presente invención suministra una pectina que tiene:

(i): Un grado de esterificación (GE) de 60 a 95%

(ii): \DeltaSC inferior a 20, y

(iii): Una relación en peso de pectina sensible al calcio (PSC) a la suma de PSC

y Pectina no Sensible al Calcio (PNSC), denominada aquí como Relación de Pectina Sensible al Calcio (RPSC), mayor a 0,7.

Preferiblemente un GE de 70-95%, pero aún mejor si es de 80 a 95%.

Preferiblemente un \DeltaSC de la pectina menor de 20, mejor si es 0,5-15, y mejor aún si está en el rango de 2-12.

Preferiblemente una RPSC de la pectina de 0,85 o más, mejor si es 0,9 ó más.

La pectina más preferida es la que tiene:

(i): Un GE de 70 a 95%

(ii): Un \DeltaSC de menos de 20 y

(iii): Una RPSC de 0,85 ó más.

Más preferible si tiene:

(i): Un GE de 80 a 95%

(ii): Un \DeltaSC de 0,5 a 15 y

(iii): Una RPSC de 0,9 o más.

Las pectinas que tienen las características arriba descritas tienen grupos carboxílicos libres dispuestos en bloques de suficiente longitud y número como para estabilizar proteínas tales como la caseína en un ambiente ácido tal como una bebida de leche acidificada.

Sin embargo, estos bloques tienen insuficiente longitud y están en insuficiente número para hacer que la pectina sea demasiado sensible, así que éstas pectinas no tienen la propiedad de incrementar la viscosidad de una bebida de leche acidificada incluso cuando son añadidas en un exceso significativo comparado con la cantidad necesaria para estabilizar la bebida contra la sedimentación.

De acuerdo con un aspecto adicional, la presente invención suministra una bebida ácida acuosa que contiene una suspensión de partículas de proteína que están estabilizadas contra la sedimentación por una pectina del tipo previamente descrito.

La bebida ácida acuosa puede ser una bebida de yogur o una bebida a base de leche tal como un batido de leche. Las partículas de proteína a estabilizar pueden estar formadas por caseína y/o suero.

Si la pectina esté presente en una cantidad suficiente para estabilizar las partículas de caseína contra la sedimentación, entonces las bebidas resultantes tendrán excelentes características de estabilidad y viscosidad y tendrán muy buenas propiedades organolépticas. Frente a bebidas formuladas con pectinas previamente disponibles, estas bebidas resultantes tienen la ventaja de que la pectina puede ser añadida en un exceso sustancial sobre la cantidad requerida para asegurar la estabilidad de las partículas de proteína contra la sedimentación, sin incrementar de modo significativo la viscosidad de la bebida.

La concentración mínima de pectina requerida para estabilizar una bebida contra la sedimentación perjudicial será denominada en adelante P_{crit}. El valor de P_{crit} para un sistema bebida/pectina se determina sobre una curva donde se ha graficado Grado de Sedimentación de la bebida vs. Concentración variable de Pectina. La figura 3 muestra una gráfica típica en la que los valores de sedimento son medidos para una sucesión de concentraciones de pectina que varían desde 0 hasta 1% en peso, con incrementos de 0,05% en el peso de la pectina. P_{crit} es la concentración mínima de pectina requerida para formar una bebida estable. El valor P_{crit} se define aquí como el primer punto de concentración de pectina que está en exceso del valor de sedimento (S_{1}) que satisface la fórmula:

S_{1} = (S_{max}- S_{min}) 0,15 + S_{min}

Donde S_{max} es el valor máximo de sedimento medido sobre el rango de prueba 0-1% en peso de pectina y S_{min} es el valor mínimo de sedimento medido sobre el mismo rango de prueba.

Tomando la gráfica de la figura 3 como ejemplo, S_{max} es 40 y S_{min} es 2. Por eso S_{1} es 7,7. El primer punto graficado después de S_{1} está en una concentración de pectina de 0,4% en peso y por eso se define que P_{crit} es 0,4% en peso para éste sistema. De acuerdo con ésta invención, se considera que una cantidad de pectina mayor que P_{cri}t constituye una cantidad de pectina en exceso.

Tal como se ilustra en la figura 3, puede establecerse fácilmente la curva Sedimento vs. Concentración de Pectina para la pectina de una bebida de leche acidificada, del modo como se muestra a continuación:

Primero que todo se prepara la bebida de leche acidificada químicamente a la cual se va a determinar el P_{crit}. Por ejemplo, la leche puede ser preparada disolviendo 1,125 kg de leche descremada en polvo en 13,875 kg de agua a 62ºC por 20 minutos. La solución resultante es enfriada a cerca de 22 ºC, y se añaden 0,285 kg de Glucono Delta Lactona en polvo, con agitación. Se deja reposar sin agitación la solución resultante a 22ºC hasta que alcance un pH de 4.0. Luego la solución es enfriada hasta cerca de 5ºC después de lo cual puede ser almacenada. Sin embargo, antes de medir la sedimentación, debe agitarse nuevamente la leche acidificada para asegurar que no quedan grumos.

La curva de sedimentación es generada mediante la medición de los valores de sedimentación a una sucesión de diferentes concentraciones de pectina añadida. En particular, se pesan 1.000 g de la leche acidificada en un vaso de precipitados y luego se añaden 60 g de azúcar y la cantidad apropiada de pectina, mezclando muy bien mediante un mezclador Silverson de alta de velocidad. La cantidad de pectina añadida vería entre 0 y 10 g en intervalos de 0,5 g, de modo que se mide la viscosidad para un total de 21 concentraciones diferentes de pectina. Se deja reposar la solución por 30 minutos, luego de los cuales es homogenizada a 180-200 kg/cm^{2} empleando un homogenizador de laboratorio Ranni modelo 12-50. La solución resultante luego es calentada a 70ºC en un baño maría con agitación, y a continuación se homogeniza de nuevo 180-200 kg/cm^{2}. Se ajusta la temperatura de la solución resultante a 70-75ºC con agitación en un baño maría, y mantenida allí por 10 minutos. Luego la solución es enfriada a temperatura ambiente (por ejemplo 20ºC), y se determina la cantidad de sedimento mediante centrifugación como se describió arriba. Una vez se ha medido el valor de sedimentación para todas las 21 diferentes concentraciones de pectina, es posible construir la gráfica de Sedimentación contra Concentración de Pectina, como e muestra en la gráfica # 3.

Debemos mencionar que es importante la temperatura a la cual se desarrolla la acidificación de la leche descremada en polvo. Si la temperatura está unos pocos grados por debajo, entonces se requerirá mayor cantidad de pectina para alcanzar la estabilidad.

Preferiblemente, la bebida acuosa ácida suministrada por la presente invención debería incluir una concentración de pectina que esté al menos 10% en peso por encima de la concentración mínima (P_{crit}) necesaria para estabilizar la bebida contra la sedimentación. Más preferiblemente, si la bebida ácida acuosa incluye un exceso de por lo menos el 20% en peso; más preferible si el exceso es de 40% en peso ó más, y aún 60% en peso por encima de P_{crit}.

La viscosidad de la bebida acuosa ácida resultante no excede el valor de otra bebida idéntica cuya concentración de pectina es P_{crit}, por más de 50%, preferible si es de 40%, más preferible si es de 30%, más preferible si es por 20% y óptimo si es de 10%.

El contenido de sólidos lácteos no grasos de la bebida acuosa resultante puede ser 0,5 a 10% en peso, y más preferible si está entre 0,5% y 3,0% en peso o entre 3,0% y 6,0% en peso.

Preferiblemente el pH de la bebida acuosa ácida debe estar entre 2,5 y 7,0, más preferible si está entre 3,0 y 6,5, y óptimo entre 3,5 y 5,5.

La pectina de le presente invención puede ser preparada de diferentes formas, a partir de un material inicial como una mezcla típica de pectina extraída de cáscara cítrica, aunque prácticamente cualquier tipo de pectina puede ser sometida a las etapas del proceso que genere una pectina de acuerdo con la presente invención.

Se puede representar una mezcla de pectinas naturales de la siguiente forma

1

En éstas gráficas, la línea recta representa el esqueleto de pectina y cada X representa grupos carboxilo libres. Debe entenderse que para aquellas partes del esqueleto donde no se indican grupos carboxilo libres, corresponde a grupos carboxilo esterificados.

La primera representación ilustra una pectina sensible al calcio que incluye bloques de grupos carboxilo contiguos que son capaces de enlazar firmemente al calcio. Por otro lado, en la segunda representación se muestran grupos carboxilo discreta y aleatoriamente distribuidos, que corresponde a la PNSC.

Con este material de partida, el primer punto es preparar una pectina que no sea sensible al calcio. Una forma de hacerlo es con la tecnología de fraccionamiento de la pectina, descrita en EP-A-0 664 300. Tal fraccionamiento permite la separación de la fracción no sensible al calcio. La pectina resultante separada puede ser representada como:

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Una segunda vía de preparar la PNSC es sometiendo la mezcla de pectina de partida a una esterificación química y/o enzimática, por métodos que sabemos eliminan efectivamente grupos carboxilo libres esterificándolos con alcoholes menores tales como metanol, etanol, propanol ó butanol u otras técnicas que colocan grupos amida ó acetilo en los grupos carboxilo, lo cual reduce de modo efectivo la capacidad que tiene la pectina para enlazarse con el calcio. La mezcla resultante de pectina puede representarse como sigue:

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Como una tercera alternativa, la mezcla de partida de pectinas puede ser tratada con poligalacturonasa o pectato liasa u otras técnicas químicas ó enzimáticas que hidrolizan selectivamente el esqueleto de la molécula de pectina en los bloques de grupos carboxilo libres mientras que mantiene intactas las regiones contiguas de grupos metil éster. Podemos representar los grupos resultantes de tal tratamiento de la siguiente forma:

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Se entiende de los tres métodos descritos que cada uno de ellos elimina bloques de grupos carboxilo libres preparando de ésta forma pectinas que son sustancialmente no sensibles al calcio. Estas, por ejemplo, tienen una RPSC de 0,1 ó menos, preferiblemente 0,01 ó menos y un \DeltaSC de 0-3 preferiblemente 0-1.

Una persona capacitada puede conocer otros métodos de preparar PNSC tales como extracción de fuentes de materia prima especialmente seleccionada, técnicas de extracción suave, aislamiento de pectina de primera extracción o "agua de lavado" o fuentes comerciales de pectinas de alto éster.

La PNSC preparada como se describió, es entonces sometida a un tratamiento suave y controlado de desesterificación, usando una enzima desesterificadora de pectinas tal como la pectin metilesterasa, papaína o bromelaina. Estas enzimas desesterifican una pectina para formar bloques de grupos carboxílicos libres. Más en detalle, se prepara una solución acuosa al 1% de la PNSC empleando la agitación y el calor apropiados para asegurar la disolución completa de la pectina. Luego se añade a la preparación suficiente cloruro de sodio para alcanzar una concentración del 1% p/v de cloruro de sodio tomando como base el volumen original de agua tomado para la preparación de la solución de pectina. Es sabido que el cloruro de sodio mejora la actividad de las enzimas desesterificantes de la pectina. Se ajusta ahora la temperatura de ésta solución a 30-50ºC, dependiendo de la temperatura óptima de desesterificación de la enzima empleada. Luego se ajusta el pH de la solución a aproximadamente 7 usando NaOH 0,5 M. Luego, se añade una cantidad apropiada de la enzima desesterificadora de pectina a la solución de pectina preparada por alguno de los métodos descritos arriba, para alcanzar una desesterificación controlada.

Las pectinmetilesterasas obtenidas de frutas cítricas (por ejemplo la naranja), tomate, papaína, ficina o bromelaina. son enzimas desesterificantes particularmente útiles. Se sabe que ellas desesterifican las pectinas en forma de bloques, en el sentido que se cree que ellas atacan la pectina bien sea en extremos no reductores ó cerca de grupos carboxilo libres y luego siguen a lo largo de las moléculas de pectina en un mecanismo de cadena simple, creando así bloques de grupos carboxilo desesterificados. La presente invención también puede ser llevada a cabo con pectinmetilesterasas producidas por técnicas recombinantes. El pH de la solución de reacción es mantenido en cerca de 7 mediante la adición continua de NaOH 0,5 M. El consumo de NaOH por la solución es usado para hacer seguimiento de la reacción de desesterificación. Una vez que la desesterificación ha evolucionado hasta el nivel requerido para producir una pectina acorde con la invención, se detiene la reacción mediante la adición de ácido para reducir el pH hasta 4 ó menos. La mezcla de reacción es ahora calentada hasta cerca de 75ºC, para desactivar la enzima, y luego es enfriada. La pectina tratada con enzima pude ahora ser recuperada de la solución añadiendo un volumen igual de IPA 60-80%. Se recoge la pectina insoluble, se exprime y lava con volúmenes adicionales de IPA y finalmente se exprime hasta tener 30-50% en peso de materia seca.

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Figurativamente, la pectina desesterificada resultante puede ser representada de la siguiente forma:

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Se verá que la pectina resultante tiene bloques de grupos carboxilo libres bastante cortos y, muy importante, relativamente pocos de tales bloques. Tal disposición de los grupos carboxilo libres habilita a la pectina para estabilizar las partículas de proteína contra la sedimentación, pero hace que la pectina sea sustancialmente no sensible al calcio así que la excesiva adición de tales pectinas a las bebidas de leche acidificada no se traduce en el enlazamiento de los cationes de calcio, naturalmente presentes, con la pectina lo cual a su vez genera espesamiento ó formación de gel.

Por esto, de acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se suministra un método para preparar una pectina como se describió arriba, el cual comprende el paso de tratar una pectina sustancialmente no sensible al calcio que tiene un RPSC de 0,1 ó menos y un \DeltaSC de 0-3 con una enzima desesterificadora de pectina.

Preferiblemente la pectina sustancialmente no sensible al calcio tiene una RPSC de 0,01 ó menos.

La enzima desesterificadora de pectina es preferiblemente una pectinmetilesterasa, papaína, ficina o bromelaina.

La siguiente es una breve descripción de las figuras que acompañan la especificación

Las Figuras 1 y 2 ilustran las curvas de sedimentación y viscosidad para bebidas de yogur no pasteurizado y pasteurizado estabilizadas con una pectina comercialmente disponible

La Figura 3 ilustra cómo se calcula el valor de Pcrit en la curva de sedimentación de una bebida de leche acidificada

Las Figuras 4, 6 y 8 ilustran las curvas de sedimentación y viscosidad para bebidas de leche acidificada estabilizadas con una pectina de la presente invención.

Las Figuras 5, 7 y 9 ilustran las curvas de sedimentación y viscosidad de bebidas de leche acidificada estabilizadas con una pectina comercialmente disponible.

Ahora se describirá en más detalle la presente invención por medio de los siguientes Ejemplos. Se debe entender que ellos son ilustrativos de la invención, pero no limitantes por esa razón.

Ejemplos Ejemplo 1 Preparación de una pectina de acuerdo con ésta invención

Se dispersaron 12,5 g de pectina Hércules GENU ® de alto metoxilo tipo JM, molida y seca, en un litro de solución que contiene 250 ml de IPA al 80%, 750 ml de agua destilada y 4,4 g de CaCl_{2}:2H_{2}O. Se agitó suavemente esta dispersión y se ajustó el pH a aproximadamente 3,8 con carbonato de sodio. Se separó la masa de reacción usando una tela de nylon para separar la fracción deseada de PNSC. El material de partida tenía un GE de 70%, un \DeltaSC de 470 y una RPSC de 0,5. La fracción de PNSC que fue aislada tenía un GE del 77%, un \DeltaSC de 0 y una RPSC de 0.

Se usó la fracción resultante aislada de PNSC para preparar una solución acuosa al 1% calentando a 75 ºC con agitación. Se añadió luego suficiente cloruro de sodio para alcanzar una concentración de 1% p/v. Se ajustó entonces la temperatura de la solución a 40ºC y el pH a 7,0 usando NaOH. Luego se añadió 1 g de papaína a la solución de pectina para desesterificar suavemente la pectina. Se mantuvo el pH de la solución en 7,0 añadiendo continuamente NaOH 0,5 M, y ésta adición fue empleada para hacer seguimiento al progreso de la reacción de desesterificación. Luego de una hora, la reacción fue detenida mediante la adición de HCl para reducir el pH a aproximadamente 4,0. Se calentó la mezcla de reacción a 80ºC para desactivar la papaína luego de lo cual la mezcla de reacción fue enfriada a 40ºC. Finalmente, se recuperó de la solución la pectina resultante mediante la adición de un volumen igual de IPA al 70% en peso. Se recolectó la pectina insoluble resultante, se la exprimió y secó con volúmenes adicionales de IPA. Se halló que ella tenía un GE de 72%, un \DeltaSC de 5 y una RPSC de 0,95.

Ejemplo 2 Preparación de una bebida de leche acidificada de 8,5% de SLNG en peso

Se usaron la pectina preparada en el Ejemplo 1 y una pectina típica para jugo en leche tipo JM Hércules GENU ® separadamente para preparar bebidas de yogur homogenizadas y tratadas térmicamente con un contenido de SLNG de 8,5% en peso. Se prepararon, como se describió arriba, las curvas de sedimentación y viscosidad de tales bebidas con concentraciones variables de pectina y ellas están ilustradas en la Figura 4 (Invención) y Figura 5 (Comparación). Mientras que tanto la pectina de jugo en leche como la pectina del Ejemplo 1 tienen buen efecto estabilizante contra la sedimentación cuando están presentes en una cantidad superior al 0,25%, la pectina de jugo de leche causa una indeseable elevación en la viscosidad del yogur bebible cuando está presente en 0,3% en peso ó más. Por el contrario, cuando estaba en exceso, la pectina producida en el Ejemplo 1 produjo un nulo ó mínimo incremento en la viscosidad del yogur bebible. Ello se traduce en una mejora significativa en el rango de concentración de trabajo de la pectina de la presente invención, haciendo posible el uso de ésta pectina en niveles significativamente por encima de P_{crit} (0,25% en peso), lo cual asegura niveles de sedimentación suficientemente bajos sin el efecto negativo de incrementar la viscosidad del yogur bebible.

Ejemplo 3 Preparación de bebidas de leche acidificada de 1,1% de SLNG en peso

En forma similar al Ejemplo 2, se usaron la pectina para jugo en leche comercialmente disponible usada en el Ejemplo 2 y la pectina preparada en el Ejemplo 1, para preparar bebidas de leche acidificada homogenizadas y tratadas térmicamente, con un contenido de SLNG de 1,1% en peso. En las Figuras 6 (Invención) y 7 (Comparación) se ilustran las curvas de sedimentación y viscosidad de éstas bebidas. De nuevo, se verá que la pectina comercialmente disponible genera un significativo incremento en la viscosidad de la bebida de leche acidificada cuando es usada a concentraciones de P_{crit} (0,2% en peso) o superiores. Por el contrario, la pectina del Ejemplo 1 no conduce a ningún incremento en la viscosidad de la bebida de leche acidificada, incluso cuando se usa en niveles que duplican el valor de P_{crit}.

Ejemplo 4 Preparación de bebidas de leche acidificada con 3% en peso de SLNG

De modo similar al Ejemplo 2, la pectina comercialmente disponible para jugo en leche usada en el Ejemplo 2 y la pectina usada en el Ejemplo 1 fueron usadas separadamente para preparar bebidas de leche acidificada con 3% en peso de SLNG, las cuales fueron homogenizadas y tratadas térmicamente. En la Figura 8 (Invención) y en la Figura 9 (Comparación) se ilustran las curvas de viscosidad y sedimentación de éstas bebidas. De nuevo, se verá que la pectina comercialmente disponible ocasiona un significativo incremento en la viscosidad de le bebida de leche acidificada, cuando es usada en concentraciones de P_{crit} (0,15% en peso) ó mayores. Por el contrario, la pectina del Ejemplo 1 no genera ningún incremento en la viscosidad de la bebida de leche acidificada, incluso cuando se usa en concentraciones que duplican el valor de P_{crit}.

Claims

1. Una pectina que tiene

Un grado de esterificación (GE) de 60-95%

Una sensibilidad al calcio (\DeltaSC) menor de 25 mPa.s y

(i): Una relación en peso de pectina sensible al calcio (PSC) a la suma de PSC y

(ii): pectina no Sensible al Calcio (PNSC), denominada aquí como Relación de Pectina Sensible al Calcio (RPSC), de 0,7 ó más.

2. Una pectina de acuerdo con la Reivindicación 1, que tiene

(i): Un GE de 70-95%

(ii): Un \DeltaSC menor de 20 mPa.s, y

(iii): Una RPSC de 0,85 ó más

3. Una pectina de acuerdo con la Reivindicación 2, que tiene

(i): Un GE de 80-95%

(ii): Un \DeltaSC menor de 0,5-15 mPa.s, y

(iii): Una RPSC de 0,9 ó más

4. Una pectina de acuerdo con la Reivindicación 3 que tiene un \DeltaSC de 2-12 mPa.s

5. Una bebida ácida acuosa que contiene una suspensión de partículas de proteína que están estabilizadas contra la sedimentación mediante una pectina, de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones precedentes.

6. Una bebida ácida acuosa de acuerdo con la Reivindicación 5, en la cual las partículas de proteína consisten en caseína.

7. Una bebida ácida acuosa de acuerdo con las Reivindicaciones 5 o 6 en la cual la concentración de pectina es por lo menos 10% en peso mayor que la concentración mínima de pectina (P_{crit}) requerida para estabilizar la bebida contra la sedimentación perjudicial.

8. Una bebida ácida acuosa de acuerdo con la Reivindicación 7, cuya viscosidad excede en no más de 50% la de una bebida idéntica cuya concentración de pectina es P_{crit}.

9. Una bebida ácida acuosa de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 5 a 8, en la cual la bebida tiene un contenido de Sólidos Lácteos No Grasos de 0,5 a 10% en peso.

10. Una bebida ácida acuosa de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 5 a 9, cuyo pH está entre 2,5 y menos de 7,0

11. Una bebida ácida acuosa de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 5 a 10, en la cual la bebida es un yogur bebible

12. Un método para preparar una pectina de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 4 que incluye el paso de tratamiento de una pectina sustancialmente no sensible al calcio, con una RPSC de 0,1 o menos y un \DeltaSC de 0 a 3 con una enzima desesterificadora de pectina

13. Un método de acuerdo con la Reivindicación 12 en el cual la pectina sustancialmente no sensible al calcio tiene una RPSC de 0,01 ó menos.

14. Un método de acuerdo con las Reivindicaciones 12 o 13, en el cual la enzima desesterificadora de pectina es una pectin metilesterasa, papaína, ficina o bromelaina.