TW502041B

TW502041B - Pectin for stabilizing proteins

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Publication number: TW502041B
Application number: TW088119361A
Authority: TW
Inventors: Timothy C Gerrish
Original assignee: Hercules Inc
Priority date: 1998-11-05
Filing date: 1999-11-23
Publication date: 2002-09-11
Also published as: EP1141031B1; CN1332751A; US6221419B1; WO2000027888A1; ATE308568T1; CN1153781C; EP1141031A1; DK1141031T3; DE69928124T2; AU1516600A; DE69928124D1; ES2251243T3; JP2002529551A

Description

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 502041 A7 --------— B7 五、發明說明（i) 本發明係關於能夠安定化蛋白質的果膠，特別是用於安定化水性酸性飲料的蛋白質'本發明更進一步提供以安定酸性飲料當做果膠製備的一種過程' 酸化的牛奶飲料在消費者中越來越流行，酸奶飲料長久以來在日本和部份東南亞地區商品化成功，現在正被引進西方市場。酸奶飲料可以是以酸奶酪為基底的（在此種類型中，其等通常被稱為飲料酸奶絡、乳酸菌飲料或是以牛奶為基底的軟性飲料）。這_婆飲料彼此間的差異舉例而 δ在於它們的乳固體非月旨物（MNSF)的各別含量。MNSF理論上是酪蛋白。典型地酸奶酪飲料含有一最低量為8%(以重量計）的MNSF ’乳酸菌飲料含有一最低量為3%(以重量計）的MNSF，而軟性牛乳飲料含有一低於3%(以重量計）的 MNSF。飲料酸奶酪若非以生鮮運銷強調所含活性乳酸菌，則是以運銷前加熱處理來達到延長架上銷售期限，加熱處理過的酸奶酪飲料必須予以安定化以防止酪蛋白顆粒沉降所造成的不適口感。即使低黏稠乳固體非脂物（MNSF)的生鮮酸化牛奶飲料也必須安定以防止酪蛋白顆粒沉澱。果膠是最常被用作為酸化牛奶飲料之安定劑。果膠是一種結構性多醣，通常備發現係呈果膠原（protopectin)之形式存在植物細胞内。果膠的結構骨架包含有α· 1-4鍵結的半乳糖醛酸殘基且當中參雜有一小部份之1，2鍵結a-L-鼠李糖單位。此外，果膠包含有具一大部分為交替的鼠李糖-半乳糖醛酸鏈之高度分枝區域。這些高度分枝區域也 -4- 鲁 ___ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐) " - " J ΊΙ. I ^-------It· — T-- (請先閱讀臂面之注意事項再填寫本頁) 線丨_ 川 2041

經濟"部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 -----' _B7___ 五、發明說明（2) 含有以醣苷鍵結被附接至鼠李糖和半乳糖醛酸單位上的其他糖單位。由α-1_4鍵結的半乳糖醛酸殘基所構成的長鏈通常被稱為“平滑，，區，而該高度分枝區域通常被稱為 “毛狀”區。某些半乳糖醛酸殘基的羧基會被酯化，典型的是被甲基61化。其餘的件以自由羧基而存在。酯化發生在半乳糖駿酸殘基聚合之後。無論如何，所有的羧基皆被酯化是非 ^ 常罕見的^通常酯化的差異度係在可供酯化的羧基之〇_ 90%之間變化。假設一個果膠分子有5〇%或超過5〇%的緣基被酯化，則此果膠通常被稱為高度酯化果膠或高甲氧基 - 果膠。假設單一果膠分子有低於50%的羧基被酯化，則此果膠通常被稱為低度酯化果膠或低甲氧基果膠。假設一果膠分子無任何或只有一些酯化基團，則此果膠通常被認為果酸。果膠的結構，尤其是酯化的程度，驅導該果膠的物理和化學性質。舉例來說，果膠由鈣離子存在下引發的凝膠化）與酯化程度特別有關。凝膠被認為因為鈣離子和一群果膠分子的自由羧基形成交聯的複合物而導致一個連續性三度空間的凝膠化基質之形成。據知，自由羧基沿著聚合鏈的分佈是決定果膠是否適合當做酸性飲料的安定劑之重要因子。曾有人提議果膠藉由在果膠分子之特定點處吸附至酪蛋白顆粒之表面上而安疋一絡蛋白顆粒懸浮液。果膠之其餘沒有結合的部份形成插入液相内之懸吊鏈和環。所形成的複合顆粒之間的擠斥本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） --I — — — — — — — — — — i — — — — — — ^ « — —II I I I I ^ (請先閲讀臂面之注意事項再填寫本頁) 502041 經濟部智慧財‘ 產局員 X 消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（3 ) 可能是由於當複合至兩個酪蛋白粒子之果膠鏈與另一者相互作用時所產生之增高的滲透壓所致。就要成為可用作為酸化牛奶飲料的安定劑之果膠而言’其至少一部分的自由竣基必須被排列成嵌段（亦即連續地）而非無規地被分散地分布在聚合鏈上。一個果膠分子和一個酪蛋白粒子彼此的結合力量來自羧基群組的負電荷與赂蛋白粒子表面的正電荷作用，自由羧基之嵌段的長度也是重要的。太長和太短的羧基嵌段無法使系統安定。就前者（太長）而言，無懸吊鏈產生。就後者（太短）而言，果膠無法確切黏附上酪蛋白顆粒，因此皆無法導致顆粒的安定化。低酯化或鈣離子敏感果膠之一個詳知的特性是其具有》辰稠化和形成膠體之能力，特別是當有驗性金屬陽離子[如爹弓離子（Ca++)]存在時。不幸的是，酸化牛奶飲料自然含有相當量的鈣離子，這些鈣離子具有不受期望而引起黏稠度顯著增加的效用，假如過多的果膠存在時，某些極端的情形下甚至造成酸化牛奶飲料膠凝。乳漿飲料的熱處理產物亦有存在的問題。7〇艺以上的熱處理視上升溫度產生不等量的乳漿顆粒。因此安定熱處理的乳漿飲料所需果膠量隨不同熱處理而異。當乳漿顆粒形成量相當少時，所需安定飲料的果膠可能因這些顆粒的總表面積大而相當高。無論如何，過量果膠添加將會再次造成展稠或過量果膠與自然存在鈣離子交錯連結的凝膠。因此從以上瞭解果膠的存在對酸化牛奶飲料的質地改 1----?!--..------------------------I_________ (請先閱讀嘴面之注意事項再填寫本頁)

502041 A7 B7 五、發明說明（4 ) ---------------^ —— (請先閱讀嘴面之注意事項再填寫本頁) .線. 變兼具期望和不期望的作用。果勝一方面以防止路蛋白粒子沉降或乳聚分離扮演安定劑，另一方面由其與自然存在的㈣子交錯連結產生黏稠度增加會影響飲用時的不順適感。第1與2圖闡述這兩種作用的專一性。說明不同濃度果膠對無巴斯德低溫加熱滅菌和有巴斯德低溫加熱滅菌質酸奶酪飲料的沉降與濃稠度作用。可以看見沒有果膠時，兩種飲料因酪蛋白顆粒不安定均有顯著的沉降和相當高的濃 I 稠度。當某一濃度的果膠添加後，酪蛋白顆粒因不再沉降而安定，再增加果膠濃度對酪蛋白沉降幾乎沒有影響。就飲料的濃稠度來看，隨蛋白顆粒安定性而顯著下降但隨著共存的鈣離子和過多的果膠交聯而幾近於立即回升。此再度增加的》辰稠度是不被希望的因其導致飲料含較差的器官感覺性質。每一個例子中，果膠的濃度範圍不大在第丨與2 圖中分別以“X”和“Y”標識而飲料的沉降和濃稠度皆落在可接受的低範圍内。此範圍可以小至只有果膠重量佔飲料 I 總重量的萬分之六（0.06%)。低於此濃度範圍沉降的問題顯著而高過此範圍則飲料有不被期望的高濃稠度。經濟"部智慧財產局員工消費合作社印製商業上，酸化牛奶飲料製造商避免破壞飲料的沉降成 .為關鍵。因此製造商一般都添加過量的果膠以確保不產生沉降，但過量的果膠添加使飲料有不被期望的高濃稠度。 _ 製造商當然願意以前述的果膠濃度作為標的，但不足量果膠添加引起整批飲料沉降的失敗風險是商業上的困難點。熟知自然界由植物組織中存在的植物果膠酯酶調節果膠中甲基含量。這些植物果膠酯化酶通常稱為承膠甲基

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） 502041 A7 B7 五、發明說明（5 ) 酯酶(PMEs)，對鄰近在兩相並連自由羧基的甲基自旨化叛基進行去甲基。以此去甲基化會產生嵌段。如前面所提，果膠對酸化飲料的安定能力取決於嵌段的分佈。木瓜酶# 鳳梨蛋白酶皆已知係針對去甲基酸果膠。 • 在商業上，萃取的果膠一般有大約70-74%醋化程度’自由羧基喪段的長度因分子而異，且每一果膠分子— 般含數種不同長度的嵌段。果膠分子和酪蛋白顆粒表面之間的結合能力取決於嵌段長度和酿蛋白表面的正電荷抑或經由4弓離子鹽橋與路蛋白表面的負電荷。欲得到完全的安定度則顯著比例酪蛋白顆粒表面必須被果膠覆蓋。如ΕΡ-Α-0 664 300案所述，由一般來源如柑橘類果，皮萃取得到的果膠可以被分成或層分為兩個不同的部分。一部份為對鈣敏感果膠（CSP)另一部份為非鈣敏感果膠 (NCSP) ^這兩部份果膠具有相當不同的鈣敏感度（ms)。對鈣敏感果膠（CSP)是高度酯化果膠有至少佔總羧基65% 部份是酯化的且主要地排列在嵌段内。對鈣敏感果膠（CSP) 的鈣敏感度取決於羧基嵌段構形《另一方面，對鈣敏感果膠（CSP)也是高度酯化果膠有至少佔總羧基70%部份是酯化而其自由羧基是以無顯著的連續程度被無規地配置在聚合鏈上。一般商業果膠銷售供安定酸化牛奶飲料用含有大約60 %iCSP和40%之NCSP。果膠整體的的鈣敏感度值（ACS)(定義如下）在200-600 cP之間，而鈣敏感果膠（CSP)部份通常鈣敏感度值在500-1500 cP之間。因為要安定酸化牛奶飲本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀脅面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 --------^訂---Μ--I---^ I i^w-------Γ! 502041 經濟·部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 -五、發明說明（6 ) 料係取決於CSP部份，當果膠也就是其CSP部分以過量而存在時，此部分之非常高的對鈣敏感度對飲料的濃稠度是有不利影響的。此外，非鈣敏感果膠（NCSP)並無顯著發 " 揮其對整體安定的功能而浪費其存在。自然而言，高度希 • 望所有加入酸化牛奶飲料的果膠能安定酪蛋白且控制鈣敏感度在過多果膠加入時不致使飲料濃稠度顯著增加。在以下的敘述和增幅的專利案，果膠以其酯化的程度 (DE)來分類。其鈣敏感度（ACS)和其鈣敏感果膠（CSP)佔鈣敏感果膠（CSP)和非鈣敏感果膠（NCSP)總和的重量比例稱為鈣敏感果膠比例（CSPR)。這三項果膠的特性由以下決定： ⑴果膠樣品的醋化程度決定稱取5公克果膠樣品精確至ο·!毫克入適當的燒杯β在 5毫升之37%發煙鹽酸和.1〇〇毫升60%的異丙醇（ΙΡΑ)混合液中攪拌10分鐘。移入適合的玻璃過濾管（體積容量為30_60 ml)，以每次15 ml鹽酸-60%ΙΡΑ混合液予以沖洗六次，再以60 %的異丙醇（ΙΡΑ)洗至無氣存留。最後以2〇 ml 100% 異丙醇（ΙΡΑ)來沖洗，於105°C烘箱内烘乾歷時2·5小時，於乾燥器冷卻稱重。準確移取乾燥樣品總重之十分之一（代表〇·5 g原始未沖洗樣品）至25〇㈤丨錐形瓶内，並以2 mi ΙρΑ 溼潤樣品。加入1 〇〇 ml最近煮沸冷卻的蒸餾水，不時搖晃至完全溶液形成。加入5滴酴醜，以〇·ι n NaOH滴定，滴定量記錄為起始滴定量（VJ。準確加入20 ml 0·5 N NaOH、塞子，劇烈搖晃後靜置 -9- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公髮） (請先閱讀贵面之注意事項再填寫本頁) 502041 A7 B7 五、發明說明（7 ) 15分鐘。準確加入20 ml 〇·5 N HC1搖晃至粉紅色消失為止。加入3滴沖洗後以0.1N NaOH滴定至劇烈搖晃下粉紅色不會消失；滴定量記錄為皂化滴定量（v2)。將錐形瓶内含物定量移入500 ml蒸餾瓶裝置有 Kjeldahl阱和水冷凝管，蒸餾瓶的傳送管必須深入接收瓶内裝有150 ml不含二氧化碳之水和2〇 mi 〇·ιν HC1混合液的液面下。於蒸餾瓶内加入2〇 ml的十分之一氫氧化納 >谷41 ’封緊連接處然後開始加熱注意避免過度起泡。持續加熱至搜集到80-120 ml蒸顧液。加入少許甲基紅滴液至搜集瓶，然後以〇·1Ν NaOH滴定過多的酸，記錄所需體積’’S”，以ml為單位。以20 ml 0· IN HC1當做空白對照組記錄所需體積“B，，，以ml為單位。記錄醯胺滴定量B-S 為V3 〇以函數來計算酯化程度（也是所有羧基百分比） 100 X _V2_ VI + V2 +V3 (ii)決定果膠樣品的鈣敏感度一果膠均勻溶液以蒸餾水置備並以1M HC1將pH調至 1·5 °使用濃度必須在〇 6%左右❶稱取145 g之果膠溶液至黏滯玻璃器皿）。添加5 ml溶液含250 mM氣化鈣至145 g果膠溶液形成鈣最終濃度為8.3 mM。 , 磁石充分攪拌下25 ml醋酸緩衝液1M醋酸根離子和酸驗值4·75 (pH 4.75)加入果膠溶液調其酸鹼值至pH 4.2。磁石取出，玻璃器皿於室溫25°C下放置隔日，以布魯 • -10- 本紙張尺度週用τ國國豕標準（CNS)A4規格（21G x 297公爱） (請先閱讀臂面之注意事項再填寫本頁) ··------ I I « — ill — I%— I I 一經濟部智慧財產局員工消費合作社印製經濟郎智慧时產局員X消費合作fi印製 502041 A7 • .· B7 五、發明說明（8 ) 克非德濃稠測量儀（Brookfield viscometer)25°C測量其濃稠度。此方法最適合濃稠度不高於100的果膠樣品，當濃稠度高達200布魯克非德單位也能得到很好的再現性。高濃稠度果膠樣品易生成膠狀產生較無再現性結果。本方法，無論如何，給予樣品相對鈣敏感度一個很公正的指標。當相同果膠樣品無添加氯化鈣改以蒸餾水稀釋取代去 I 測量濃稠度時，果膠的鈣敏感度值（ACS)計算是以含鈣溶液的濃稠度值除以不含鈣溶液的濃稠度值。 (iii)果膠樣品CSPR決定稱取0·2 g果膠樣品精準至mg於一預備好稱重準確至 mg的50 ml離心管，且以加熱離心管至70。〇溶解於10 g去礦物質水中'。溶液冷卻至20°C。做兩次重覆。每一溶液調整至pH 4.0。溶液總果膠含量由加入20 ml的異丙醇（IPA)至每一離 _ 心管沉澱的果膠決定。以30,000g離心30分鐘收集沉澱，再以60% IPA沖洗離心兩次，60°C抽氣烘乾至隔夜後稱重精確至mg。將沉澱的果膠量除以原來加入離心管的果膠 _ 重量得到果膠的比值“A”。 10 ml下列溶液（含60 mMi弓和16% IPA)添加至離心管剩餘的10 m 1果膠溶液樣品：

387 g 去礦物質水 99 g 80% IPA 4.4 g CaCl2, 2H20 -11 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -------------裝--------—訂·--------線 (請先閱讀贵面之注意事項再填寫本頁) 五、發明說明（9) 將兩溶液混合之後，會產生3〇 mM#弓含量和8% IPA ^ 膠狀粒子懸浮液形成置放24小時並不時攪拌。以3〇,〇〇〇g 30分鐘離心將膠狀顆粒和液態分離。將液相小心傾倒或虹吸而留下膠狀顆粒於離心管内。膠狀顆粒以等量含30 mM鈣和8% IPA溶液以旋轉震蘯 (votexing)和平衡沖洗兩次。每一次沖洗的平衡時間是24 小時。每一次沖洗後以30,000g 3〇分鐘離心分離膠狀顆粒。此操作步驟的沖洗溶液可以將16% IPA_6〇 mM鈣溶液與等體積水稀釋製備。傾倒液態後沖洗膠態總量稱重。膠態果膠量的決定是由展合稱重至小數第二位的膠態和兩倍量的⑼％ ip A然後以60% IPA沖洗兩次。沉澱以每次沖洗後3〇,〇〇〇g 3〇分鐘離心收集。樣品以60°C抽氣烘乾至隔夜稱重精確至mg。標準量的辦敏.感果膠CSP決定是以此果膠量除以原來加入離心管的果膠重量。以果膠“B”值表示。 CSPR係根據公式CSPR=B/A來計算。 (iv)沉降和濃稠度的決定經濟部智慧財產局員工消費合作社印製在接下來的敘述中，參考文獻也是用來決定一酸化牛奶飲料的沉降量和濃稠度。為了決定沉降量，經過精確稱重的離心管裝滿酸化牛奶飲料至離心管邊緣丨公分内。將裝滿的離新管再次稱重得到管内所裝飲料樣品的重量。離心4,500 rPm(每分鐘4,500轉），20分鐘。上清液倒掉並倒置離心管30分鐘排乾殘留的液體。最後，以衛生紙擦乾離心管邊緣後稱重。沉降（以百分比表示）的計算是以沉降的 •12- 502041 A7 五、發明說明（10) 重量除以原來使用樣品重量且以百分比當做結果表示。酸化飲料的濃稠纟測量是將飲料填裝濃稠玻璃後放置 5 C，18-24小時。濃稠度以布魯克非德濃稠測量儀 (Brookfield viSC0meter)型號LVT每分鐘6〇轉，轉動丨分鐘後測量。本發明呈現的一個主題是提供一種改良果膠能夠安定懸浮液中蛋白質顆粒避免沉降且當比安定飲料避免沉降所需量更顯著的多時不會顯著增加溶液的濃稍度。本發明更進一步的主題是提供一種水性酸性飲料含有蛋白質顆粒懸浮其與上述主題果膠結合而安定不沉降。最後’本發明更進一步主題是提供數種製備上述主題果膠的方法。依據第一個方向，本發明提供一果膠具有： ⑴60-95%之酯化程度（DE) (ii)少於25 cP之妈敏感度（ACS)，以及 (出）鈣敏感果膠（CSP)相對於鈣敏感果膠（CSP)與非鈣敏感果膠（NCSP)之總和的重量比（此後稱之為鈣敏感果膠比值（CSPR)係為0.7或更高。齊· 皆讨 ί % ------------裝 i I (請先閱讀嘴面之注意事項再填寫本頁) i線· 理想的酯化程度是70-95%，如果80-95 %是更理想。理想的鈣敏感度（ACS)是少於25 cP，如果在0.5-1之間是更理想，最理想的範圍是在2-12之間。理想上，0.85或更高的鈣敏感果膠比值（CSPR)，更理想的是0.9或更高。一果膠理想上具有： -13 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 502041 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7__ 五、發明說明（11) ⑴70-95%之酯化程度（DE> (ii) 少於20 cP之鈣敏感度（ACS) (iii) 0.85或更高的鈣敏感果膠比值（CSPR) 〇一果膠更理想上具有： ⑴80-95 %之酯化程度（DE) (ii) 0.5-15 cP 之鈣敏感度（ACS) (iii) 0·9或更高的舞敏感果膠比值(CSPR)。符合上述特質的果膠其自由羧基排列在足夠長度和數量的嵌段内所以該果膠安定在酸性環境如酸化牛奶飲料的蛋白質如酪蛋白。無論如何，此嵌段沒有足夠的長度和存有足夠的數量來使果膠對鈣過度敏感因此果膠並不具增加酸化牛奶飲料濃稠度的性質即使添加比安定飲料避免沉降所需量更顯著的多。依據更進一步的方向，本發明提供一種水性酸性飲料含有被上述型果膠安定不沉降的懸浮蛋白質顆粒。液態的酸化飲料可以是酸奶酪飲料或牛奶為基底的飲料如奶昔。被安定的蛋白質顆粒可以由酪蛋白或/且乳清來源所形成的。當提供果膠具有安定蛋白質顆粒不致沉降的足夠量時，所製造的飲料有優良的安定性和濃稠度特質且具有優良有機月曰質特質。以前述果膠製造的飲料可以因確保安定蛋白質顆粒不致沉降本質上添加所需較多的果膠量而飲料無顯著濃稍度增加。安定蛋白質顆粒不致沉降所需最少的果膠濃度此後稱 -14- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） --—................................-丨丨丨丨丨丨丨丨丨丨丨丨丨丨丨丨丨丨丨丨丨丨丨丨丨 -n I n n n n 1 n l n ti · n ϋ n n «ϋ n I J,J» I n n n n ft_— n n —1 n < -言矣 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 502041 A7 B7 經濟· 部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（^)

為Perit。一飲料/果膠系統的PeHt值是從飲料的沉降程度對不同果膠濃度作圖的圖形曲線上決定的。第3圖為一典型的圖例其中果膠濃度以重量百分比由〇到1 %每增加〇〇5 % 對應測量一沉降值。Perit是形成一安定飲料所需最小的果膠/辰度。在此疋義Perit為第一個果膠濃度測試點，該點超越滿足公式：Si = (smax - Smin)(M5 + Smin的Si沉降值。S 1 μ：»- ^max 是在果膠濃度以重量百分比由〇到1。/〇的測試範圍下最大的沉降值而smin果膠濃度以同一測試範圍下最小的沉降值0 以第3圖為例，smax為40而smin為2。因此8丨為7.7。在 Si之後第一個圖點對應的果膠濃度重量百分比〇.4 %因此系統的Pcrit定義為重量百分比〇 4 %。如第3圖沉降對果膠濃度曲線可由以下敘述來建立給一果膠和酸化牛奶飲料。第一 ’準備要決定出所具PcHt的化學酸化牛奶飲料。舉例而言，化學酸化牛奶飲料可以用2〇分鐘溶解125 Kg 脫脂奶粉於62°C的13·875 kg水中來製備。產生的溶液冷卻至22°C後攪拌加入0.285 Kg的葡萄糠-D内酯粉末。產生的溶液置放221不攪拌直至酸鹼值達到4.0。再將溶液冷卻至5°C後保存。測量沉降度前，無論如何都再度攪拌酸化牛奶飲料確保無團塊殘留。在連續加入不同果膠濃度下測量沉降值產生沉降曲線°特別的是，用燒杯稱量丨000 g酸化牛奶飲料然後以西維森混合器（Silvers0I1 mixer)將60 g糖和適量的果膠完全 -15- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21Q χ 29<7公髮 -------------裝--------訂ί §1 I I »ϋ ΛΜ§ ί I 線 (請先閱讀嘴面之注意事項再填寫本頁) 502041 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（I3) 混合。加入果膠量是由0至10 g每次增加0·5 g所以共測得21 個果膠濃度對應沉降值。溶液置放30分鐘後以Ranni Model LAB-type 12-50型均質機用180-200 Kg/cm2壓力研磨。產生的研磨均勻溶液以授拌水浴加熱至70°C後再次用180-200 Kg/cm2壓力研磨。產生的研磨均勻溶液以攪拌水浴加熱至70-75 °C下停置10分鐘。溶液冷卻至室溫（舉例來說 2 0°C)後以前述離心法決定沉降量。當所有21個不同果膠濃度的沉降值都測量好，即可繪製如第3圖所闡釋的沉降對果膠濃度圖。值得一提的是，脫脂奶粉被酸化的溫度是很重要的。當溫度略低幾度時，會需要較多的果膠來達到安定。由本發明提供製造的水性酸性飲料最好含有比安定飲料無多餘沉降所需最低果膠濃度（Pcrit)高至少重量百分比10%的果膠濃度。水性酸性飲料如含以重量計比Pcrit至少高過20%、 40%甚至60%的果膠濃度則更為理想。所產生的水性酸性飲料的濃稠度不會比以PeHt為果膠濃度的相同製作飲料高過50%，較佳為不高過40%、30%、 20%、而最佳為不高過10%。產生水性酸性飲料的乳固體非脂物含量也許為重量百分比0.5-10%，若重量百分比為0.5-3.0%或3.0-6.0%則更為理想。水性酸性飲料的酸鹼值理想為2.5-7, 3-6.5為較理想， 3.5-5.5則更為理想。雖然任何型態的果膠皆可進入處理步驟產生本發明的 -16- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公" 一 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -1 I n —4- i I丨— !丨訂ie!丨丨— •線1♦————i i------------- 502041 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

A7 __ B7 _ _ *五、發明說明（14) 果膠’但是本發明的果膠可以從一起始原料如從甘橘類果皮萃取的一般果膠混合物經數種途徑來製做。自然產生的果膠混合物可以下列圖例來表示：

_XXXX-;一^X--JCXXX-CSP

—X4丨一丨,__V X x NCSP 此表示圖例中，直線代表果勝的架構，而每一個《X，，代表一自由羧基。可以明瞭的是架構有些部份沒有自由幾基，這些部份是酯化的羧基。第一條線是對鈣敏感果膠其具有羧基並列的嵌段可以與鈣離子緊密結合。另一方面，代表NCSP的第二條線其羧基散亂且分開分佈。 ^ 由這些材料開始，第一步是製備絕對非鈣敏感的果膠。依據ΕΡ-Α-0 664 300專利案所述的果膠分部分離技術是一個方法。此成份分類技術能夠分離NCSP成份。產生的分離出果膠以下列圖例表示 —3WC-X--X XXX- 第二個製備NCSP的方法是將起始果膠混合物經由化學或/且酵素果膠酯化法，該酯化法以低分子量醇類如甲醇、已醇、丙醇或丁醇來酯化並有效除去自由羧基，或其他技術以錢基（amide)或乙酿基（acetyl groups)置換竣基有效減低果膠與鈣離子交聯的能力。產生的果膠混合物表示如下： _«XX--X---—XX 一 -X-X-X--X-X- • 17- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1ΙΙΙΙΙΙΙ — i—— — — — — -----II (請先閱讀臂面之注意事項再填寫本頁) 观041

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（I5) 第二個製備法是，起始果膠混合物可以聚半乳醣酶或果酸溶解酶或其他化學或酵素技術來選擇性水解果膠分子骨架上自由羧基嵌段而不改變甲基酯基團並列嵌段的完整性。如此處理產生的產物表示如下： -* *--X- X X_

—X X 由以上的三種方法可以瞭解每一種方法都會除去自由鼓基嵌段因而製備本質為非鈣敏感的果膠。舉例而言此果膠具有一般為0.1或更小的CSRP，較理想為0·01或更小·，且ACS在0-3之間，更理想在〇_ι之間。一熟練技術人員可以察覺其他製備非鈣敏感果膠 NCSP中間產物的方法如由特殊選定原料來源萃取，溫和的萃取技術，分離第一個萃取物或”水洗“果膠或商業來源的高酯，快速設定果膠。由上述製備的非鈣敏感果膠NCSP再使用一果膠去酯酵素如果膠甲基画曰酶、木瓜酶、無花果蛋白酶（ficin)或鳳梨蛋白酶（bromelain)進行一溫和控制去醋化處理。這些酵素將果膠去酯化形成自由羧基基嵌段。再更仔細而言，一 1 %非鈣敏感果膠NCSP液態溶液的製備是以適當加熱和搜拌來確保果膠完全溶解。然後以原來製備果膠溶液的水體積為基準添加足量氣化鈉來達成一 1 % w/v(重量/體積）濃度。熟知氯化鈉可以提升果膠去酯化酵素的作用。此時視所使用去酯化酵素的適用溫度提高溶液溫度至30-50°C。 -18 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ----·--------訂---Γ (請先閱讀臂面之注意事項再填寫本頁) -線-#! 502041 經濟·部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（16) 再以〇·5 M NaOH調整融液酸鹼值大約至7。然後於上述方法產生的任一果膠溶液加入適量果膠去酯化酵素來達到控制性去酯化。特別有用的去酯化酵素是由甘橘類水果（如柳橙）或番获得來的果膠甲基酯酶、木瓜酶、無花果蛋白酶或鳳梨蛋白酶。據知這些酵素以嵌段地方式對果膠去酯化，感覺上相信這些酵素若非攻擊非還原端則是緊鄰的自由羧基群然 > 後以單鏈機制沿襲整個果膠分子，因此而產生去酯化羧基群的嵌段。本發明也可以用重組技術產生的果膠去酯化酵素來實行。以連續加入〇.5M NaOH維持反應溶液酸鹼值在大約7。溶液的NaOH加入量用來監控去酯化反應的進展。當去S旨化反應進展至產生與本發明相符合的果膠所需的程度，去酯化反應以加入酸降低溶液酸鹼值至4或小於4來終止反應。反應混合物此時加熱至75。(：左右來去活化酵素活性後冷卻。酵素處理過的果膠可以添加等體積的60-80% IP A異丙

F 醇回收。搜集不溶果膠，擠壓後以另外一體積的IPA清洗，最後擠壓至乾物重量百分比30-50%。產生的去酯化果膠圖示如下： -XXXX--X---XX- -^-XXXX-X X x____x 可以看見產生的果膠大致上是一具有相當短的自由羧基嵌段，且重點是數量相當少的此種區間。自由羧基群如此的排列使果膠能安定蛋白質顆粒不致沉降，但此種果膠 -19- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） — — — — 1!! — !— ·應 I I — I ^^1! (請先閱讀-f面之注意事項再填寫本頁) A7

五、發明說明（17) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製基本上是鈣不敏感因此於酸化牛奶飲料過量添加此種果膠不致引起自然存在的鈣離子與果膠交聯產生濃稠或形成凝膠。因此依據本發明進一步延伸中，提供上述一製備果膠的方法，其步驟包含以去酯化酵素處理一本質上非鈣敏感果膠具有CSPR值為〇·ι或更小和△€8在〇_3之間。理想上本質上非鈣敏感果膠具有CSpR值為〇〇1或更 /J\ 〇理想上果膠去酯酵素為一果膠甲基酯酶、木瓜酶、無花果蛋白酶或鳳梨蛋白酶。下列為與專一圖示一起的概要敘述。第1圖和第2圖闡釋無巴斯德低溫加熱滅菌和經巴斯德低溫加熱滅菌的酸奶酪飲料以商業販賣的果膠安定的沉降和濃稠度曲線。第3圖闡釋如何一酸化牛奶飲料的沉降曲線計算值。第4' 6、8圖闡釋以本發明果膠安定的酸化牛奶飲料其沉降和濃稠度曲線。第5、7、9圖闡釋以商業販售果膠安定的酸化牛奶飲料其沉降和濃稠度曲線。本發明現在將以下列範例做更仔細的描述。這些描述將闡釋但不限制發明。範例範例1 -依據本發明#徭罢腺 -20- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） — — — — — — —III — — — - — — If — — — — — — — — » I — — — — — —w J — — — — — — — (請先閱讀脅面之注意事項再填寫本頁) 502041 經濟*部智慧財產局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明說明（18) 12.5 g研磨，乾燥高甲氧基果膠大力士 GENU牌型號JM 果膠（Hercules GENU ⑧ pectin type JM)撒入 1 公升含 250 ml 80 % IPA，750 ml 蒸餾水和 4.4 g 氯化鈣（CaCl2.2H20)溶液中，輕缓攪拌且以碳酸鈉調整其酸鹼值在3·8左右。以尼 ; 龍布分離反應物中所要的非鈣敏感果膠NCSP部份。起始：材料的酯化程度DE為70%，鈣敏感度ACS為470而鈣敏感果膠比值為0.5。分離的非鈣敏感果膠NCSP部份隻酯化程 | 度DE為77%，鈣敏感度ACS為0，而鈣敏感果膠比值為0。以分離產生的非鈣敏感果膠NCSP部份加熱至75°C並攪拌來製備1%液態溶液。加入足量的氣化鈉達到重量/ 體積濃度1 %。溶液溫度調整至40°C而其酸鹼值以NaOH 調整至7·0。然後添加0·1 g的木瓜酶（購自Enzyme Development Corporation，New York，New York)至果膠溶液中對果膠溫和去酯化。以連續加入0.5N NaOH維持反應溶液酸鹼值在7.0並監測去酯化反應進行的程度。一小時 | 後加入HC1降低酸鹼值在4左右終止反應。將反應混合物加熱至80°C去除木瓜酵素的活性然後反應混合物冷卻至40 °C。最後，加入等體積重量百分比濃度為70%的異丙醇IPA 自溶液中將產生的果膠回收。產生的果膠其酯化程度DE 為72%，鈣敏感度ACS為5而鈣敏感果膠比值為0.95。參範例2-製備重量百分比比澧唐8.5 %乳固體非脂物MSNF酸性牛奶飲料分別以範例1製備的果膠和一般習知技藝的果汁牛奶果膠大力士（Hercules GENU牌果膠型號JM)來製備8·5 %乳 -21- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -----!-裝— II訂！ I!線 (請先閱讀脅面之注意事項再填寫本頁) 502041 Α7Β7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（19) 固體非脂物均質化（homogenised)和熱處理的酸奶絡飲料°此飲料的不同果膠濃度下沉降和濃稠度曲線以上述法製備並闡釋在第4圖（本發明）和第5圖（比較）。當果汁牛奶果膠和範例1的存在量超過重量百分比〇·25時兩者皆有安定不沉降作用，但果汁牛奶果膠存在量在重量達〇·3 %或更高時不被期望的產生飲料酸奶酪濃稠度增高。相對的，當過量存在時範例1產生的果膠引起飲料酸奶酪濃稠度無或最低量增加。本發明果膠在作用濃度範圍顯著改善的這個結果使該果膠能夠在顯著超過Perit(重量百分比〇·25)的程度下被使用其確保相當低沉降而無增加飲料酸奶酪濃稍度增加的顧慮影響。範例3-製備重量百分比比濃度1 · 1 %乳固體非脂物MSMF舱性牛奶飲料類似範例2的方法，分別使用範例2使用的商業販售果汁牛奶果膠和範例1產生的果膠製備重量百分比比濃度 1.1 %均質化和加熱處理的乳固體非脂物MSNF酸性牛奶飲料。此飲料沉降和濃稠度曲線闡釋在第6圖（本發明）和第7 圖（比較）。再一次，將會看見當商業販售果膠重量濃度達 0.2%或更高時引起酸化牛奶飲料顯著濃稠度增加。相對的，範例1果膠不會導致任何酸化牛奶飲料濃稠度增加甚至當使用的重量濃度為PcHt的兩倍。範-例4-製備-重量百分比比濃度3·〇 %乳固體非腊物MSNF酴性牛奶飲料類似範例2的方法，分別使用範例2使用的商業販售果 -22- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公髮） (請先閱讀嘴面之注意事項再填寫本頁) ·· 訂·！線丨參丨 )U2041 A7 --^-------- B7 五、發明說明（2〇) 汁牛奶果膠和範例1產生的果膠製備重量百分比比濃度 3.0%均質化和加熱處理的乳固體非脂物msnf酸性牛奶飲料。此飲料沉降和濃稠度曲線闡釋在第8圖（本發明）和第9 • 圖（比較）。再一次，將會看見當商業販售果膠重量濃度達〇· 15%或更高時引起酸化牛奶飲料顯著濃稠度增加。相對的，範例1果膠不會導致任何酸化牛奶飲料濃稠度增加甚至當使用的重量濃度為Pcrii的兩倍。 !!111 I i I (請先閱讀贵面之注意事項再填寫本頁) 訂

•經和部智慧財產局員工消費合作社印製 -23- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）

Claims

申請專利範圍修正本 91年6月1〇日 502041 六、申請專利範圍第881 19361號專利申請案 1. 一種果膠’其具有： (i) 60-95%之酯化程度（DE)， (ii) 少於25 cP之鈣敏感度（ACS)，以及 (iii) 鈣敏感果膠（CSP)相對於鈣敏感果膠（CSP)與非飼敏感果膠（NCSP)之總和的重量比（此後稱之為飼敏感果膠比值（CSPR))係為〇·7或更高。 2·如申請專利範圍第1項之果膠，其具有： (i) 70-95%之酯化程度（DE) (ii) 少於20cP之鈣敏感度（ACS)，以及 (iii) 0.85或更高的鈣敗感果膠比值（CSPR)。 3·如申請專利範圍第2項之果膠，其具有： ⑴ 80-95%之酯化程度（DE) (ii) 0.5-15 cP之鈣敏感度（ACS)，且 (iii) 0.9或更高的鈣敏感果膠比值（CSPR)。 4·如申請專利範.圍第1項之果膠，其具有一為2-12 cp之鈣敏感度（ACS)。 5· —種水性酸性飲料，其包含有一依據申請專利範圍第 1、2、3或4項之果膠所安定以對抗沉降之蛋白質顆粒懸浮液。 6 ·如申請專利範圍第5項的水性酸性飲料，其中該蛋白質顆粒包含酪蛋白。 7·如申請專利範圍第5或6項的水性酸性飲料，其中果膠 __ -24- 本紙張尺度適用中國國家標準（哪）A4規格（210X297公釐） :…”...............蜂·：.................……，·丨緣 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) A8 B8 C8 D8 、申請專利範圍濃度以重量計係為比要安定化飲料以對抗不利的沉降所需之最低果膠濃度（PcHt)至少高10 %者。 8·如申請專利範圍第7項的水性酸性飲料，其濃稠度較諸於一由果膠濃度為PcHt的其他相同飲料係不超過50 % 者。 9·如申請專利範圍第5或6項的水性酸性飲料，其中該飲料具有一乳固體非脂物含量以重量計係為0:5至10%。 1〇·如申請專利範圍第5或6項的水性酸性飲料，其pH值在2.5至小於7之間。 11 ·如申請專利範·圍第5或6項的水性酸性飲料，其係為一種飲料簸奶酪。 12·—種用於製備如，申請專利範圍第i至4項中任一項之果膠的方法，其包含之步驟係以果膠去酯化酵素來處理一貫貝非4弓敏感果膠，該果膠具有〇·丨或更小之CgjpR以及〇至3之ACS。 13·如申清專利範圍第12項的方法，其中該實質非鈣敏感果膠具有0·01或更小之CSPR。 14·如申請專利範圍帛12或13項的方法，其中該果膠去醋化酵素係為一果膠甲基醋峰、木瓜崎、鳳梨蛋白酶（⑽) 或無花果蛋白酶（bromelain)。 -25- 本紙張尺度適用中國國家標準（⑽）A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填窝本頁) 訂丨 :線丨