ES2249494T3 - Metodo gradual destinado a recuperar o eliminar sustancias biologicas por flotacion a partir de un medio coloidal de baja densidad. - Google Patents
Metodo gradual destinado a recuperar o eliminar sustancias biologicas por flotacion a partir de un medio coloidal de baja densidad.Info
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Abstract
Un método de centrifugación en gradiente de densidad discontinuo para separar al menos dos substancias entre sí en una muestra, cuyo método consiste en las etapas consecutivas de: (i) mezclar la muestra con un medio de alta densidad para obtener una densidad específica de la mezcla; (ii) poner a) la mezcla de un medio de centrifugación de alta densidad y dicha muestra que contiene dichas substancias en el fondo de un tubo de centrífuga, en cuya mezcla se define la densidad y ésta es mayor que la de la(s) substancia(s) deseada(s) que ha(n) de ser separada(s), y b) una solución de baja densidad encima de la mezcla de a): iii) centrifugar dicho tubo bajo una fuerza g específicamente definida para que la(s) substancia(s) o soluto(s) de dicha muestra pueda(n) flotar hacia la solución de baja densidad mientras que la(s) otra(s) substancia(s) de dicha muestra permanecerán en el medio más denso del fondo; y (iv) recoger por separado la(s) substancia(s) deseada(s), donde el medio de centrifugación es un medio de gradiente de densidad coloidal.
Description
Método gradual destinado a recuperar o eliminar
sustancias biológicas por flotación a partir de un medio coloidal de
baja densidad.
La presente invención se relaciona con un método
para la centrifugación en gradiente de densidad discontinuo para
separar un mínimo de dos substancias en una muestra. En el método,
se hace uso de medios de densidad coloidal y de soluciones de baja
densidad.
La separación de células y de componentes
celulares es una importante herramienta dentro de la investigación
básica, así como en aplicaciones diagnósticas y clínicas. Por
ejemplo, las células y los microorganismos necesitan con frecuencia
ser separados entre sí y de diferentes tipos de muestras (por
ejemplo, muestras clínicas, industriales, alimenticias, ambientales
y forenses) de tal forma que pueden usarse, por ejemplo, para
cultivo, inoculación, fusión celular, terapia clínica y análisis
bioquímico sin interferencia con las actividades inhibitorias de la
muestra o con actividades inhibitorias añadidas durante el proceso
de separación. Estas actividades inhibitorias pueden ser, por
ejemplo, anticuerpos endógenos, proteasas, nucleasas, endotoxinas y
antibióticos. Los microorganismos, tales como las bacterias y los
virus, contienen secuencias génicas análogas a secuencias génicas
eucarióticas y esto puede dar lugar a un resultado erróneo si ambas
están presentes simultáneamente en una muestra.
Para resolver los problemas de separación antes
mencionados, se ha hecho uso de centrifugación diferencial,
filtración, purificación por afinidad y medios de cultivo
selectivos. Se han empleado medios de densidad, tanto del tipo de
peso molecular (Nycodenz, etc.) como del coloidal
(BactX-tractor, Percoll, PureSperm). En la mayoría
de los procedimientos conocidos, la separación se basa en la
densidad de los componentes inherentes en los medios de densidad
empleados tras centrifugación en un gradiente de densidad continuo.
Estos procedimientos tienen el inconveniente de que se distribuyen
substancias no deseadas por todo el gradiente y de este modo también
en la fracción deseada.
En la centrifugación en gradiente de densidad
discontinuo convencional, se carga la muestra en el medio de
densidad y se recupera la fracción deseada de la parte del fondo de
la fase inferior resultante. Se realiza la centrifugación en una
centrífuga angular y esto significa que las bacterias, u otras
células o fracciones deseadas, pueden resultar dañadas cuando
golpean la pared del tubo de centrífuga durante la sedimentación
hasta su nivel de densidad y esto puede dar lugar a muerte
bacteriana y a pérdida de su contenido en ADN/ARN. Cuando se carga
la muestra en el medio coloidal, existe el riesgo de contaminación
de las fases subyacentes. Esta contaminación se debe en parte a los
efectos de la pared, es decir, que la muestra fluye hacia abajo a lo
largo de la pared del tubo y puede mezclarse con las fases
subyacentes, y se debe en parte a una carga demasiado rápida,
especialmente al inicio, de la muestra, dando lugar a mezcla con las
fases subyacentes. Independientemente de si se recupera la fracción
buscada tras la centrifugación aspirándola a través de la fase
superior (mediante una pipeta Pasteur o una cánula) o si se recupera
después de haber aspirado la fase superior, este procedimiento da
lugar a una recontaminación de la fracción deseada. En el primer
caso, se lleva una cantidad microscópica de material desde la fase
superior hasta la fase inferior mediante la pipeta Pasteur/cánula.
En el último caso, se produce la contaminación porque el material de
la fase superior no puede ser eliminado por completo, ya que existe
en el líquido que queda retenido en las paredes internas del tubo.
Este líquido se deslizará hacia abajo cuando se aspire la fase
superior y, cuando se extraiga la fase superior, este líquido
contaminará la fase inferior. Otro inconveniente de este tipo de
separación por sedimentación es que el rendimiento de muestras que
contienen material formador de un tapón (barrera física) en la
interfase entre las fases superior e inferior resulta afectado de
forma adversa, ya que se evita que las células/bacterias sedimenten
hacia abajo. Otro inconveniente de diversos medios de gradiente de
densidad es su toxicidad inherente, que resulta altamente indeseable
en muchas aplicaciones.
FR 2.561.256 describe un método de purificación
de partículas biológicas, tales como partículas de núcleos de
antígenos, usando flotación, ultracentrifugación o un gradiente de
densidad. Más específicamente, se pone la muestra encima de un
gradiente de densidad preformado, que se centrifuga entonces para
permitir la recogida de la muestra en la capa superior, mientras que
los contaminantes, etc. han migrado a las capas inferiores del
gradiente. Antes de este proceso de purificación, la muestra
necesita ser concentrada y prepurificada. Se consigue el gradiente
de densidad gracias a un compuesto de bajo peso molecular, a saber,
el cloruro de cesio. La fuerza g requerida durante la centrifugación
en este proceso es de al menos 20.000 x g. Esta alta fuerza g
resulta de la naturaleza del gradiente, donde la sedimentación de la
solución del gradiente es equilibrada por difusión de moléculas de
soluto en la dirección opuesta a la de sedimentación, que se forma
por difusión de sal. Los gradientes salinos han mostrado ser menos
fáciles de establecer a valores exactos que otros gradientes, tales
como la sílice coloidal. Así, el gradiente sugerido en FR 2.561.256
no será estable con el tiempo. Más aún, la presión osmótica causada
por pequeñas moléculas, como CsCl, puede resultar perjudicial para
ciertos materiales y también interaccionar con materiales biológicos
y afectar a las características nativas de la muestra. Por
consiguiente, este tipo de método no será adecuado para la
separación de estructuras biológicas más delicadas, tales como las
células.
US A 5.437.987 se relaciona con un procedimiento
de triple gradiente con panorámica de anticuerpos para recuperar
células fetales nucleadas de la sangre materna. Este documento
enseña el uso de múltiples capas de medio de gradiente de
densidad.
US A 4.927.750 se relaciona con un procedimiento
de separación de células que conlleva centrifugación. Este documento
describe la separación de células a partir de diversos especímenes
biológicos y no guarda relación con la flotación de una o más
substancias deseadas a una solución más alta de baja densidad.
US A 5.962.237 se relaciona con un método de
enriquecimiento de células raras usando centrifugación. Las etapas
de centrifugación pueden ser repetidas con fines de enriquecimiento,
es decir, durante el mismo tiempo y con la misma fuerza g. Este
documento no habla de la flotación de diferentes substancias
deseadas.
WO 91 04318A se relaciona con la separación de
diferentes células vivas usando soluciones de baja molecularidad,
que se difundirán entre sí y formarán un gradiente continuo o
discontinuo.
US A 4.971.801 se relaciona con un modificador de
la respuesta biológica consistente en vesículas de membranas
naturales y ribosomas en un tampón suspensor. Se describe el
aislamiento del producto usando centrifugación en gradiente. Se
obtiene una pella de la fracción deseada, es decir, que se recoge en
el fondo del tubo de centrífuga.
Finalmente, también se han sugerido medios de
gradientes no iónicos, por ejemplo gradientes de sacarosa, para la
separación. Sin embargo, la naturaleza de azúcares tales como la
sacarosa es similar a las sales antes discutidas y, en consecuencia,
estos métodos conllevarán el mismo tipo de inconvenientes que los
antes mencionados, es decir, gradientes inestables donde los límites
se hacen cada vez más difusos con el tiempo, una presión osmótica
que puede dañar microorganismos y células, etc.
Un objeto de la presente invención es evitar uno
o más de los inconvenientes anteriores disponiendo de un nuevo
método para la centrifugación en gradiente de densidad discontinuo
que se basa en un nuevo principio, a saber, dejando que las
substancias deseadas floten después de una o más etapas de
centrifugación.
Otro objeto de la invención es disponer de un
método de centrifugación en gradiente de densidad discontinuo que
conlleva un menor riesgo de contaminación de la(s)
substancia(s) deseada(s) que los métodos de la técnica
anterior. Se consigue esto mediante un método por etapas, donde se
pasa una parte inferior de una muestra centrifugada a una o más
etapas consecutivas, repitiendo la misma secuencia de mezcla y
centrifugación que como se define en la reivindicación 1, pero a
diferentes densidades y a diferentes fuerzas g. Como la parte
inferior sigue siendo procesada, la muestra real no requiere
pipeteado entre etapas, lo que elimina una forma común de
contaminación. Además, el nuevo método por etapas proporciona una
superior flexibilidad en comparación con la técnica anterior, ya que
se puede diseñar una serie de ciclos de ejecución, siendo realizado
cada ciclo de ejecución en condiciones que separan específicamente
substancias que se sabe o sospecha que están presentes en la
muestra.
La Fig. 1 representa una vista esquemática del
principio operativo del método según la presente invención usando
cuatro etapas de centrifugación.
Así, en un primer aspecto, la invención
proporciona un método de centrifugación en gradiente de densidad
discontinuo para separar un mínimo de dos substancias entre sí en
una muestra. El método se caracteriza por las etapas consecutivas
de
- (i)
- mezclar la muestra con un medio de alta densidad para obtener una densidad específica de la mezcla;
- (ii)
- poner
- a)
- una primera mezcla de un medio de centrifugación coloidal de alta densidad y dicha muestra que contiene dichas substancias en el fondo de un tubo de centrífuga, en cuya mezcla se define la densidad, y
- b)
- una solución de baja densidad encima de la mezcla de a):
- (iii)
- centrifugar dicho tubo bajo una fuerza g específicamente definida para que la(s) substancia(s) o soluto(s) de dicha muestra pueda(n) flotar hacia la solución de baja densidad mientras que la(s) otra(s) substancia(s) de dicha muestra permanecen en el medio más denso del fondo; y
- (iv)
- recoger por separado la(s) substancia(s) deseada(s).
donde el medio de centrifugación es
un medio de gradiente de densidad coloidal y se crean los gradientes
discontinuos por las diferentes
capas.
Como se ha mencionado anteriormente, se puede
repetir el ciclo de etapas (i)-(iv) antes descrito, tal como una,
dos, tres o cualquier número de veces, incluyendo una segunda,
tercera, cuarta, etc. mezcla de una densidad definida, y se puede
centrifugar a una segunda, tercera, cuarta, etc. fuerza g. El
experto en este campo puede seleccionar las combinaciones apropiadas
de fuerzas g y densidades en base a las densidades de la(s)
substancia(s) que se ha(n) de separar de la muestra.
Dicha variación sistemática de fuerzas g no ha sido sugerida en el
contexto de la centrifugación en gradiente de densidad en la técnica
anterior. Además, las ventajas de usar un medio de centrifugación
coloidal con este fin eran bastante inesperadas, ya que un método
diseñado según la presente invención puede proporcionar purezas
superiores a los resultados de los métodos de la técnica anterior
aplicado a la gran variedad de muestras con las que resulta útil la
presente invención.
En una realización, se pone un medio de
centrifugación en gradiente de densidad coloidal de una densidad
inferior a la mezcla de a) entre la mezcla de a) y la solución de
baja densidad de b). Esto da una barrera extra entre la muestra
mixta y la solución de baja densidad y mejora y facilita la
recuperación tras la separación. En el presente contexto, el término
"discontinuo" se refiere a una deposición sucesiva de capas de
soluciones de diferente densidad, por ejemplo, en un tubo de
centrífuga.
La naturaleza coloidal del medio de
centrifugación es una característica esencial de la invención y
proporcionará ventajas tales como una mucho mayor estabilidad del
gradiente de densidad. El medio de centrifugación usado según la
invención debe ser un medio pesado, tal como un material basado en
sílice coloidal. El medio debe ser inerte, ser autoclavable en
presencia de sal y tener un bajo o nulo nivel de endotoxinas, una
presión osmótica tan baja como sea posible, preferiblemente por
debajo de 20 mOsm/kg, una baja viscosidad en sal (< 5cP) y una
alta densidad (> 1,3 g/ml; RG). Un ejemplo representativo de un
medio adecuado es ReadyGrade® (en general, representado como RG y
disponible de Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia).
Alternativamente, se pueden comprar partículas de sílice de fuentes
comerciales, tales como Nyacol, y silanizarlas según técnicas bien
conocidas por parte del usuario. Las propiedades únicas del medio
hacen posible retener las características nativas de las substancias
tras la separación. A continuación, se darán más detalles
concernientes al medio. En consecuencia, el presente método es
ventajoso en comparación con la técnica anterior, ya que puede
reducir los costes en un grado substancial.
La solución de b) es preferiblemente una solución
acuosa, tal como una solución tampón.
La densidad de a) es mayor que la de la(s)
substancia(s) deseada(s) que se ha(n) de
separar. En el presente contexto, la persona experta entenderá que
los términos "baja densidad" y "alta densidad" son
utilizados el uno en relación al otro y no pretenden ser comparados
con ninguna otra densidad. A continuación, se darán densidades
ilustrativas.
En el método de la invención, se repiten las
etapas (i)-(iv) una o más veces dependiendo de qué substancia se
busque o de qué contaminantes se han de eliminar. La fuerza g en
la(s) etapa(s) de centrifugación y la densidad del
medio coloidal son variadas según la(s) substancia(s)
que se ha(n) de separar.
La(s) substancia(s)
deseada(s) que se ha(n) de separar es/son células,
microorganismos, virus y sus fracciones, ácidos nucleicos y
cualquier proteína. Antes de la centrifugación, se procesa la
muestra a una mezcla con el medio para obtener una densidad
apropiada de la misma. La muestra puede tener prácticamente
cualquier origen, tal como una muestra biológica, por ejemplo,
células, sangre, etc., heces, por ejemplo para estudiar el
envenenamiento por alimentos, tal como bacterias Salmonella,
alimentos, muestras útiles para analizar el ambiente, por ejemplo,
poluciones sospechadas u organismos manipulados genéticamente, etc.
En consecuencia, una gran ventaja del presente método es que es
aplicable a muestras mucho más complejas que en la técnica anterior.
La invención puede ser aplicada en una amplia gama de campos, tal
como para análisis clínicos, medicina forense, pruebas de rutina y
muchos más. En el último párrafo de la presente descripción se
describirán unos cuantos campos específicos en los que el presente
método es especialmente ventajoso.
Según una realización alternativa del método,
la(s) substancia(s) deseada(s) es/son
derivatizada(s) antes de la centrifugación para mejorar la
separación de dos substancias de densidad similar. Un ejemplo de
ello es tratar la(s) substancia(s) deseada(s)
con un reactivo de afinidad unido a una partícula de alta o baja
densidad, tal como perlas revestidas de mAb de densidad
adecuada.
En una realización específica, el método antes
descrito es específicamente adaptado para separar diferentes tipos
celulares, tales como células X e Y del esperma, los unos de los
otros en una muestra en base a su densidad de flotación, a la forma,
a la permeabilidad, al movimiento y/o a la viscosidad en un medio de
gradiente de densidad por centrifugación. El método consiste en las
etapas consecutivas según la reivindicación 1, siendo la muestra una
muestra de semen y siendo las substancias deseadas las células
separadas.
Incluso aunque se pudiera usar, en principio,
cualquier medio de densidad capaz de formar los tipos antes
mencionados de gradiente para la separación de esperma X e Y, el
medio de densidad de esta realización es el tipo de medio de
densidad coloidal discutido anteriormente.
Se mezcla la muestra con medio de alta densidad
y, eventualmente, se centrifuga dicho medio en la etapa A) para
formar un gradiente de densidad antes de añadir dicha muestra a
dicho tubo de centrífuga. El gradiente es preferiblemente muy plano
o esencialmente planar, es decir, que comprende una diferencia de
densidad muy pequeña en el tubo de centrífuga, al menos en el centro
del gradiente.
En esta realización, el gradiente es discontinuo.
Es importante que el gradiente proporcione la separación necesaria,
lo que significa que tendría que ser posible recuperar fracciones en
las que los espermas X e Y, respectivamente, están enriquecidos a al
menos un 70% o más, preferiblemente un 100%.
Eventualmente, se purifica la muestra de semen
antes de la separación. Esta purificación puede ser realizada en
cualquier forma deseada, tal como por centrifugación
discontinua.
Cuando la muestra es bovina, la densidad a la que
se ha hecho referencia anteriormente está próxima a la de las
células de esperma X e Y, es decir, aproximadamente 1,120 g/ml. Los
valores correspondientes para células humanas son substancialmente
los mismos. Estas densidades son aplicables en las condiciones
experimentales mencionadas a continuación en la parte experimental.
La presente invención no se relaciona con centrifugaciones durante
las cuales las células del esperma X e Y humano, respectivamente,
tienen densidades centradas alrededor de 1,185 g/ml.
En el método anterior, se puede mejorar la
separación manipulando la densidad de las células espermáticas X e
Y, por ejemplo alterando el pH, la conductividad de la muestra y/o
el medio. La manipulación puede incluir el hinchamiento de las
células espermáticas X e Y.
Todas las centrifugaciones antes mencionadas para
la separación de células X e Y entre sí en un gradiente de densidad
según se ha definido anteriormente serán realizadas dependiendo de
la elección de la solución del gradiente, de la forma del gradiente,
del rotor de la centrífuga, del tiempo de centrifugación, de la
fuerza g a viscosidad conocida, de la osmolaridad y de los niveles
de concentración.
La invención se relaciona también con un método
de separación como antes, donde dicha muestra es mezclada con dicho
medio para conseguir una densidad de dichos
muestra-medio mezclados que esté próxima a la
densidad de las células espermáticas X e Y. En este caso, se
consigue principalmente la separación por centrifugación isopícnica.
El patrón de separación obtenido en esta variante de la invención
estará, por lo tanto, preferentemente basado en las diferentes
densidades de flotación de las células del esperma.
El medio del gradiente de densidad coloidal
consiste en una suspensión de partículas que tienen un tamaño medio
de partícula de 2-40 nm, preferiblemente una
partícula hidratada de 10-30 nm.
Preferiblemente, las partículas son partículas de
sílice derivatizadas y más preferiblemente partículas de sílice
silanizadas.
La Fig. 1 representa una vista esquemática del
principio operativo del método según la presente invención. En el
ejemplo mostrado en el dibujo, se han realizado cuatro etapas de
centrifugación. El número de tapas de centrifugación y la fuerza g
varían según la naturaleza de las substancias que se han de
separar.
La invención será ahora descrita en asociación
con los ejemplos que siguen, los cuales no han de ser interpretados
como limitantes del alcance de la presente invención, según queda
definida por las reivindicaciones adjuntas.
Se pone la mezcla, mezclada con RG (un ejemplo de
un medio coloidal según la invención) a una densidad de 1,057 g/ml,
en el fondo de un tubo de centrífuga, se cubre eventualmente con RG
que tiene una densidad de 1,030 g/ml y sobre esto se aplica una
solución de NaCl 0,150 M. A continuación, se centrifuga el tubo
durante 1 a 5 minutos a 10.000 x g_{av} (1, Figura 1). Se pone la
fase inferior resultante, resuspendida y mezclada con RG a una
densidad de 1,200 g/ml, en el fondo de un nuevo tubo de centrífuga,
se cubre eventualmente con RG que tiene una densidad de 1,090 g/ml y
encima de esta solución se aplica NaCl 0,150 M. Se centrifuga
entonces el tubo durante 1 a 5 minutos a 1.000 x g_{av}. Se
recupera cualquier célula y protozoo de la muestra en la capa de la
fase superior (2, Figura 1). Se resuspende la fase inferior
resultante y se transfiere a un nuevo tubo de centrífuga, se cubre
eventualmente con RG que tiene una densidad de 1,130 g/ml y encima
de esta solución se aplica NaCl 0,150 M. Se centrifuga entonces el
tubo durante 1 a 5 minutos a 10.000 x g_{av}. Se recupera ahora
cualquier bacteria de la muestra en la capa de la fase superior (3,
Figura 1). Se resuspende la fase inferior resultante y se transfiere
a un nuevo tubo de centrífuga, se cubre eventualmente con RG que
tiene una densidad de 1,130 g/ml y encima de esta solución se aplica
NaCl 0,150 M. Se centrifuga entonces el tubo durante 1 a 5 minutos a
50.000 x g_{av}. Se recupera ahora cualquier virus de la muestra
en la capa de la fase superior (4, Figura 1).
Poniendo la muestra, mezclada con RG, en el fondo
del tubo de centrífuga, contrariamente a las técnicas conocidas, se
evitan todos los problemas de contaminación asociados a la
aplicación de una solución de muestra heterogénea encima de otra
solución.
Según el nuevo método de la invención, el
material de ligera densidad de la matriz de la muestra flota en la
etapa 1 (Figura 1). Esto significa que las células/microorganismos
ya no tienen que sedimentar a través de un tapón posiblemente
formado, sino que en esta etapa permanecerán en la fase inferior
debido a su densidad (\rho > 1,057). Así, la presión
hidrostática media resultante de la centrifugación será mayor que en
las técnicas anteriores. Esto es debido a que la distancia al centro
rotacional es mayor cuando la muestra está en el fondo del tubo en
comparación con cuando se carga la muestra en la parte superior.
Este hecho contribuye a un mayor rendimiento cuando se emplea el
presente método en comparación con la técnica anterior.
En las etapas 2, 3 y 4 (Figura 1), las células,
bacterias y virus deseables flotan sobre la muestra subyacente y son
convenientemente recuperados de la capa de la fase superior. De este
modo, se evitan todas las manipulaciones con la fase de la muestra
y, por lo tanto, se elimina la recontaminación con, por ejemplo,
actividades inhibitorias de la solución de la muestra.
Como la muestra que contiene
células/microorganismos se localiza en la parte inferior del tubo de
centrífuga en cada etapa de centrifugación, se evita la
sedimentación hacia la pared o el fondo del tubo de las
células/microorganismos. Esto reduce la frecuencia de daños
celulares y aumenta el rendimiento en comparación con las técnicas
anteriores.
Con este nuevo método, ha sido también posible
purificar virus por centrifugación por densidad discontinua. Las
técnicas anteriores han utilizado partículas coloidales demasiado
grandes en los medios de densidad. Las partículas han sedimentado
tan rápidamente como las partículas víricas a las mayores fuerzas g
necesarias para la sedimentación/flotación de virus y han disuelto
así los límites de la fase. Además, la densidad de los medios de
densidad conocidos ha sido demasiado baja como para permitir la
mezcla de la muestra y del medio a una densidad de 1,200 g/ml, lo
cual es un requerimiento para esta separación.
Se facilitan los siguientes ejemplos para
ilustrar, pero no limitar, la invención.
Se añadieron a 10 g de carne troceada comprada
localmente 90 ml de NaCl 0,15 M y se homogeneizó entonces la
muestra. Se mezclaron cantidades variables de E. coli
(10^{4}, 10^{3}, 10^{2}, 10^{1}) en 50 \mul de NaCl 0,15 M
con 0,5 g de muestra homogeneizada (= muestras contaminadas) y 0,45
ml de NaCl 0,15 M (= control), respectivamente. Se dejó que las
muestras contaminadas reposaran durante 30 minutos antes de su uso,
de tal forma que se pudiera producir cualquier unión de las
bacterias a la matriz del alimento. Se suspendieron y mezclaron las
muestras contaminadas y los controles correspondientes con 85 \mul
de RG a una densidad final de 1,057 g/ml. Se transfirió la mezcla al
fondo de un tubo de centrífuga (1,5 ml), se cubrió con 0,5 ml de una
solución de RG con una densidad de 1,030 g/ml y encima de esto con
0,2 ml de una solución de NaCl 0,15 M. Se llevó a cabo entonces la
centrifugación en una centrífuga de mesa a 10.000 x g_{av} durante
1 minuto. Se aspiró entonces la fase inferior en una jeringa,
mediante lo cual la cánula penetró primeramente en el tapón no
pipeteable formado por la matriz de la carne troceada, y se
transfirió a un nuevo tubo. No se observó pella visible, pero, para
obtener cualquier cantidad microscópica de material en forma de
pella (con bacterias unidas), se resuspendieron los 100 \mul
restantes antes de ser dirigidos a la jeringa. Se mezcló la fase
inferior así obtenida con 585 \mul de RG para obtener una densidad
de 1,200 g/ml, se cubrió entonces con 0,2 ml de una solución de RG
con una densidad de 1,090 g/ml y encima de esto se añadió 0,1 ml de
una solución de NaCl 0,15 M. Se centrifugó esto a 1.000 x g_{av}
durante 1 minuto. Se aspiraron las fases superiores con una pipeta
Pasteur y se desecharon y se resuspendió entonces la fase inferior,
se transfirió a un nuevo tubo y se cubrió con 0,2 ml de una solución
de RG con una densidad de 1,130 g/ml y 0,1 ml de una solución de
NaCl 0,15 M. Se llevó a cabo entonces la centrifugación a 10.000 x
g_{av} durante 1 minuto. Se fraccionaron las fases superiores con
una pipeta automática en tres porciones de 75 \mul y se analizaron
después.
Para comparar con las técnicas anteriores, se
cargaron muestras contaminadas y controles encima de 0,6 ml de una
solución de Percoll® en NaCl 0,15 M, pH 7,40, con una densidad de
1,057 y encima de 0,6 ml de BacXtractor (\rho = 1,057, NaCl 0,15
M, pH 7,40), respectivamente. Se centrifugaron entonces las muestras
a 10.000 x g_{av}. Se aspiraron los 100 \mul inferiores de la
fase inferior de cada muestra y del control con una jeringa y se
analizaron. Para la determinación de la cantidad de E. coli
por cultivo, se extendieron 2 x 10 \mul de diluciones variables de
las diferentes muestras en placas. Se realizó un recuento manual de
las colonias y se calculó la cantidad tras incubación durante la
noche. Para la detección de E. coli por una técnica de ADN,
se usaron 10 \mul de cada muestra en una prueba de PCR.
Según el método de la invención, el rendimiento
con las muestras contaminadas era del 80-100%, en
comparación con el 50-80% con las dos técnicas más
antiguas. El rendimiento en los controles era algo inferior en cada
caso en comparación con las muestras. Este fenómeno ha sido descrito
con anterioridad y se debe muy probablemente al efecto protector que
tiene la flora endógena de la carne troceada sobre las bacterias
añadidas a las muestras.
Mediante la técnica de PCR, se pudieron detectar
hasta incluso 1,3 ufc de E. coli por tubo de reacción (10
ufc/0,5 g de muestra homogeneizada; 200 ufc/g de carne troceada)
usando el método de la invención, mientras que se pudieron detectar
hasta 10 ufc E. coli por análisis (100 ufc/0,5 g de muestra
homogeneizada; 2.000 ufc/g de carne troceada) usando los métodos de
la técnica anterior para la centrifugación en gradiente de densidad.
El análisis directo no dio ninguna reacción positiva. En los
controles, se pudieron detector 1,3 ufc de E. coli por tubo
de reacción usando cualquiera de las técnicas.
A 10 g de heces humanas, se añadieron 90 ml de
NaCl 0,15 M y se homogeneizó la muestra. Se mezclaron cantidades
variables de E. coli (10^{4}, 10^{3}, 10^{2}, 10^{1})
en 50 \mul de NaCl 0,15 M con 0,5 g de muestra homogeneizada (=
muestras contaminadas) y con 0,45 ml de NaCl 0,15 M (= control),
respectivamente. Se dejó que las muestras contaminadas reposaran
durante 30 minutos antes de su uso, de tal forma que se pudiera
producir cualquier unión de las bacterias a la matriz del alimento.
Se suspendieron y mezclaron las muestras contaminadas y los
controles correspondientes con 85 \mul de RG a una densidad final
de 1,057 g/ml. Se transfirió la mezcla al fondo de un tubo de
centrífuga (1,5 ml), se cubrió con 0,5 ml de una solución de RG con
una densidad de 1,030 g/ml y encima con 0,2 ml de una solución de
NaCl 0,15 M. Se llevó a cabo entonces la centrifugación en una
centrífuga de mesa a 10.000 x g_{av} durante 1 minuto. Se aspiró a
continuación la fase inferior en una jeringa, mediante lo cual la
cánula penetró primeramente en el tapón no pipeteable formado por la
matriz de muestra, y se transfirió a un nuevo tubo. Se observó una
pequeña pella y, para obtener el material en forma de pella (con
bacterias unidas), se resuspendieron los 100 \mul restantes antes
de ser dirigidos a la jeringa. Se mezcló la fase inferior así
obtenida con 585 \mul de RG para obtener una densidad de 1,200
g/ml, se cubrió entonces con 0,2 ml de una solución de RG con una
densidad de 1,090 g/ml y encima de esto se añadió 0,1 ml de una
solución de NaCl 0,15 M. Se llevó entonces a cabo la centrifugación
a 1.000 x g_{av} durante 1 minuto. Se aspiraron las fases
superiores con una pipeta Pasteur y se desecharon y se resuspendió
entonces la fase inferior, se transfirió a un nuevo tubo y se cubrió
con 0,2 ml de una solución de RG con una densidad de 1,130 g/ml y
con 0,1 ml de una solución de NaCl 0,15 M. Se llevó a cabo entonces
la centrifugación a 10.000 x g_{av} durante 1 minuto. Se
fraccionaron las fases superiores con una pipeta automática en tres
porciones de 75 \mul y se analizaron después.
Para comparar con las técnicas anteriores, se
cargaron muestras contaminadas y controles encima de 0,6 ml de una
solución de Percoll® en NaCl 0,15 M, pH 7,40, con una densidad de
1,057 y encima de 0,6 ml de BacXtractor (\rho = 1,057, NaCl 0,15
M, pH 7,40), respectivamente. Se centrifugaron entonces las muestras
a 10.000 x g_{av}. Se aspiraron los 100 \mul inferiores de la
fase inferior de cada muestra y del control con una jeringa y se
analizaron.
Para la determinación de la cantidad de E.
coli por cultivo, se extendieron 2 x 10 \mul de diluciones
variables de las diferentes muestras en placas. Se realizó un
recuento manual de las colonias y se calculó la cantidad tras
incubación durante la noche. Para la detección de E. coli por
una técnica de ADN, se usaron 10 \mul de cada muestra en una
prueba de PCR.
Según el método de la invención, el rendimiento
con las muestras contaminadas era del 80-100%, en
comparación con el 50-80% con las dos técnicas más
antiguas. El rendimiento en los controles era algo inferior en cada
caso en comparación con las muestras. Este fenómeno ha sido descrito
con anterioridad y se debe muy probablemente al efecto protector que
tiene la flora endógena de la muestra de heces sobre las bacterias
añadidas a las muestras.
Mediante la técnica de PCR, se pudieron detectar
hasta incluso 1,3 ufc de E. coli por tubo de reacción (10
ufc/0,5 g de muestra homogeneizada; 200 ufc/g de heces) usando el
método de la invención, mientras que se pudieron detectar hasta 10
ufc E. coli por análisis (100 ufc/0,5 g de muestra
homogeneizada; 2.000 ufc/g de heces) usando los métodos de la
técnica anterior para la centrifugación en gradiente de densidad. El
análisis directo no dio ninguna reacción positiva. En los controles,
se pudieron detector 1,3 ufc de E. coli por tubo de reacción
usando cualquiera de las técnicas.
A 10 g de suelo compostado, se añadieron 90 ml de
NaCl 0,15 M y se homogeneizó luego la muestra. Se mezclaron
cantidades variables de E. coli (10^{4}, 10^{3},
10^{2}, 10^{1}) en 50 \mul de NaCl 0,15 M con 0,5 g de muestra
homogeneizada (= muestras contaminadas) y con 0,45 ml de NaCl 0,15 M
(= control), respectivamente, para análisis mediante la nueva
técnica. Para obtener muestras útiles para comparación con las
técnicas anteriores, primeramente se dejó luego que la muestra
homogeneizada sedimente por sí sola durante 60 minutos y se usó
luego el líquido superior para producir muestras contaminadas según
se ha descrito anteriormente.
Se dejó que las muestras contaminadas reposaran
durante 30 minutos antes de su uso, de tal forma que se pudiera
producir cualquier unión de las bacterias a la matriz de la muestra.
Se suspendieron y mezclaron las muestras contaminadas y los
controles correspondientes con 85 \mul de RG a una densidad final
de 1,057 g/ml. Se transfirió la mezcla al fondo de un tubo de
centrífuga (1,5 ml), se cubrió con 0,5 ml de una solución de RG con
una densidad de 1,030 g/ml y encima de esto con 0,2 ml de una
solución de NaCl 0,15 M. Se llevó a cabo entonces la centrifugación
en una centrífuga de mesa a 10.000 x g_{av} durante 1 minuto. Se
aspiraron las fases superiores con una pipeta Pasteur y se
desecharon. Se formó una gran pella y, para obtener todo el material
en forma de pella (con bacterias unidas), se resuspendió la fase
inferior antes de transferirla a un nuevo tubo. Así, se mezcló la
fase inferior obtenida con 585 \mul de RG para obtener una
densidad de 1,200 g/ml, se cubrió entonces con 0,2 ml de una
solución de RG con una densidad de 1,090 g/ml y encima se añadió 0,1
ml de una solución de NaCl 0,15 M. Se llevó entonces a cabo la
centrifugación a 1.000 x g_{av} durante 1 minuto. Se aspiraron las
fases superiores con una pipeta Pasteur y se desecharon y se
resuspendió entonces la fase inferior que incluía la pella, se
transfirió a un nuevo tubo y se cubrió con 0,2 ml de una solución de
RG con una densidad de 1,130 g/ml y 0,1 ml de una solución de NaCl
0,15 M. Se llevó a cabo entonces la centrifugación a 10.000 x
g_{av} durante 1 minuto. Se fraccionaron las fases superiores con
una pipeta automática en tres porciones de 75 \mul y se analizaron
después.
Para comparar con las técnicas anteriores, se
cargaron muestras contaminadas especialmente preparadas y controles
encima de 0,6 ml de una solución de Percoll® en NaCl 0,15 M, pH
7,40, con una densidad de 1,057 y encima de 0,6 ml de BacXtractor
(\rho = 1,057, NaCl 0,15 M, pH 7,40), respectivamente. Se
centrifugaron entonces las muestras a 10.000 x g_{av}. Se
aspiraron las fases superiores y se desecharon y se aspiró entonces
la fase inferior hasta quedar 100 \mul. Se aspiró y analizó el
líquido que quedaba por encima de la pella formada (60 \mul).
Para la determinación de la cantidad de E.
coli por cultivo, se extendieron 2 x 10 \mul de diluciones
variables de las diferentes muestras en placas. Se realizó un
recuento manual de las colonias y se calculó la cantidad tras
incubación durante la noche. Para la detección de E. coli por
una técnica de ADN, se usaron 10 \mul de cada muestra en una
prueba de PCR.
Según el método de la invención, el rendimiento
con las muestras contaminadas era del 80-100%, en
comparación con el 10-20% con las dos técnicas más
antiguas. El rendimiento en los controles era algo inferior en cada
caso en comparación con las muestras. Este fenómeno ha sido descrito
con anterioridad y se debe muy probablemente al efecto protector que
tiene la flora endógena de la muestra de suelo sobre las bacterias
añadidas a las muestras.
Mediante la técnica de PCR, se pudieron detectar
hasta incluso 1,3 ufc de E. coli por tubo de reacción (10
ufc/0,5 g de muestra homogeneizada; 200 ufc/g de suelo) usando el
método de la invención, mientras que se pudieron detectar hasta 10
ufc E. coli por análisis (1.000 ufc/0,5 g de muestra
homogeneizada; 20.000 ufc/g de suelo) usando los métodos de la
técnica anterior para la centrifugación en gradiente de densidad. El
análisis directo no dio ninguna reacción positiva. En los controles,
se pudieron detector 1,3 ufc de E. coli por tubo de reacción
usando cualquiera de las técnicas.
Se dividió una muestra fresca de semen de un toro
sano después de diluirla 1:10 con NaCl 0,15 M en 16 fracciones de
0,45 ml cada una que contenían aproximadamente 10^{7}
espermatozoides. Se añadieron cantidades variables de BVDV (virus de
la diarrea vírica bovina; 10^{6}, 10^{5}, 10^{4}) y
Campylobacter fetus (10^{6}, 10^{5}, 10^{4}),
respectivamente, en 50 \mul de NaCl 0,15 M a 12 de los tubos y se
añadieron a cuatro de los tubos 50 \mul de NaCl 0,15 M con
control.
Se mezclaron muestras contaminadas (6 tubos) y
controles (2 tubos)con 85 \mul de RG a una densidad final
de 1,057 g/ml. Se transfirió la mezcla al fondo de un tubo de
centrífuga (3,0 ml), se cubrió con 0,5 ml de una solución de RG con
una densidad de 1,030 g/ml y encima con 0,5 ml de una solución de
NaCl 0,15 M. Se llevó a cabo entonces la centrifugación en un rotor
oscilante a 10.000 x g_{av} durante 1 minuto. Se aspiraron las
fases superiores con una pipeta Pasteur y se desecharon. Se
resuspendió la fase, se transfirió a un nuevo tubo y se mezcló con
585 \mul de RG para obtener una densidad de 1,200 g/ml, se cubrió
con 0,5 ml de una solución de RG con una densidad de 1,090 g/ml y
encima con 0,5 ml de una solución de NaCl 0,15 M. Se llevó entonces
a cabo la centrifugación a 1.000 x g_{av} durante 1 minuto. Se
aspiraron las fases superiores con una pipeta Pasteur y se
desecharon y se resuspendió entonces la fase inferior, se transfirió
a un nuevo tubo y se cubrió con 0,5 ml de una solución de RG con una
densidad de 1,130 g/ml y con 0,5 ml de una solución de NaCl 0,15 M.
Se llevó a cabo entonces la centrifugación a 1.000 x g_{av}
durante 1 minuto. Se recogieron las fracciones de los tubos desde
arriba con una pipeta automática en cuatro porciones de 300 \mul y
dos fracciones de 0,5 ml. Se analizaron las fracciones en cuanto a
espermatozoides, BVDV y Campylobacter fetus.
Para comparar con la técnica anterior, se
guardaron muestras (6 tubos) y controles (2 tubos), respectivamente,
encima de un gradiente discontinuo consistente en 0,5 ml de
SpermXtractor al 80% y 0,5 ml al 40%, respectivamente. Se
centrifugaron entonces las muestras a 400 x g_{av} durante 10
minutos. Se fraccionaron los gradientes desde arriba mediante una
pipeta Pasteur en 6 fracciones (la fase superior, la primera
interfase, la segunda fase, la segunda interfase, la tercera fase y
la pella). Se analizaron las fracciones en cuanto a espermatozoides,
BVDV y Campylobacter fetus.
Para la detección de la cantidad de
Campylobacter fetus por cultivo, se extendieron 2 x 10 \mul
de diluciones variables de las diferentes muestras en placas. Se
realizó un recuento manual de las colonias y se calculó el nivel
tras incubación durante la noche. Para la detección del BVDV por una
técnica inmunológica, se usaron 10 \mul de cada muestra en una
prueba ELISA.
Mediante la nueva técnica, no se detectaron ni
Campylobacter fetus ni BVDV en las tres fracciones superiores
que contenían espermatozoides de las muestras contaminadas. Por el
contrario, se detectaron BVDV y Campylobacter fetus en las
fracciones inferiores libres de espermatozoides. Los controles eran
negativos para estos agentes.
Usando técnicas anteriores, había presencia de
cantidades detectables tanto de BVDV como de Campylobacter
fetus en todas las fracciones de las muestras contaminadas,
incluyendo las fracciones con espermatozoides intactos enriquecidos,
incluso aunque la mayor parte de los organismos permanecieran en la
fracción superior. Los controles eran negativos para estos
agentes.
El método de la invención puede ser también
utilizado para, por ejemplo, estudiar el contenido de bacterias en
una fracción enzimática de un proceso de fermentación. Otro ejemplo
es la purificación de substancias disueltas (toxinas, antibióticos,
hormonas) a partir de alimentos. Tras la aspiración de la capa
adecuada, se lleva a cabo el análisis por GC-MS,
ELISA, Dip-Stick, etc.
Otro ejemplo es la purificación de substancias
disueltas (toxinas, antibióticos, hormonas) a partir de alimentos
mezclando la muestra antes de la centrifugación con perlas
revestidas de mAb de densidad adecuada y analizando después de
soltarlas por GC-MS, ELISA,
Dip-Stick, etc. La invención puede ser también
empleada en investigación criminal/medicina forense, por ejemplo,
purificación de ADN a partir de manchas de sangre o purificación de
células/ADN a partir de muestras sometidas a vacío. Otro ejemplo es
la purificación de espermatozoides/ADN de manchas/muestras clínicas.
La invención es también útil para la purificación de ácidos
nucleicos y proteínas con fines analíticos y/o preparatorios.
La extraordinaria pureza de una substancia
separada obtenida mediante la presente invención la hace
especialmente ventajosa para todas las aplicaciones en las que una
elevada pureza constituye un requerimiento, como en la mayoría de
las purificaciones de ADN y ARN. Incluso se pueden obtener ribosomas
y otros componentes celulares como soluciones verdaderas mediante un
diseño apropiado del presente método. Es también ventajoso en la
manipulación posterior de dichas muestras, ya que normalmente son
sometidas a PCR, en cuyo caso una primera etapa es la lisis.
La presente invención puede ser también usada
para separar células vivas de células muertas, en cuyo caso el tipo
celular puede ser el mismo, ya que las propiedades cambian cuando la
célula deja de vivir. Más específicamente, el presente método puede
ser usado para diferenciar entre células activas y no activas. En
algunos casos, las células son viables, pero aún no cultivables, y
tales células pueden ser separadas ahora de las células muertas. En
este contexto, es esencial que la densidad de una célula viva no sea
un valor absoluto, sino que varíe dependiendo de su ambiente, tal
como la osmolalidad (nivel de sal). Así, mediante una manipulación
apropiada del ambiente, se puede cambiar la densidad de las células
vivas, pero la célula muerta mantendrá su densidad y, por
consiguiente, el presente método será fácilmente aplicable.
Un uso inesperado del presente método es en el
análisis de pruebas de torundas usadas, comúnmente utilizadas en
mataderos. Se ha visto que el presente método es aplicable a una
torunda de este tipo, sin etapa previa de enriquecimiento. Esto hace
posible detectar patógenos en dichas muestras de un modo rápido y
efectivo en cuanto a costes.
Claims (8)
1. Un método de centrifugación en gradiente de
densidad discontinuo para separar al menos dos substancias entre sí
en una muestra, cuyo método consiste en las etapas consecutivas
de
- (i)
- mezclar la muestra con un medio de alta densidad para obtener una densidad específica de la mezcla;
- (ii)
- poner
- a)
- la mezcla de un medio de centrifugación de alta densidad y dicha muestra que contiene dichas substancias en el fondo de un tubo de centrífuga, en cuya mezcla se define la densidad y ésta es mayor que la de la(s) substancia(s) deseada(s) que ha(n) de ser separada(s), y
- b)
- una solución de baja densidad encima de la mezcla de a):
- iii)
- centrifugar dicho tubo bajo una fuerza g específicamente definida para que la(s) substancia(s) o soluto(s) de dicha muestra pueda(n) flotar hacia la solución de baja densidad mientras que la(s) otra(s) substancia(s) de dicha muestra permanecerán en el medio más denso del fondo; y
- (iv)
- recoger por separado la(s) substancia(s) deseada(s).
donde el medio de centrifugación es
un medio de gradiente de densidad
coloidal.
2. Un método según la reivindicación 1, donde se
pone un medio de centrifugación en gradiente de densidad coloidal de
una densidad inferior a la densidad de la mezcla de a) entre la
mezcla de a) y la solución de baja densidad de b).
3. Un método según la reivindicación 1 ó 2, donde
la solución de b) es una solución acuosa.
4. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde el medio de gradiente de densidad
coloidal consiste en una suspensión de partículas que tienen un
tamaño medio de partícula de 2-40 nm,
preferiblemente un diámetro hidratado de 10-30
nm.
5. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde se recoge la fase inferior
después de la etapa (iv) y se resuspende para obtener una segunda
mezcla de una densidad definida, con cuya segunda mezcla se repiten
las etapas (i)-(iv), donde la densidad de la segunda mezcla y/o la
fuerza g son diferentes durante la repetición de las etapas (i)-(iv)
en comparación con el ciclo previo de etapas (i)-(iv).
6. Un método según la reivindicación 5, donde se
repiten al menos las etapas (ii)-(iv) cualquier número de veces
dependiendo de la naturaleza de la substancia deseada.
7. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 5 ó 6, donde se seleccionan cualquier combinación
de una fuerza g durante la etapa de centrifugación y una densidad
definida del medio coloidal para cada ciclo de etapas (i)-(iv) para
permitir la separación de una o más substancias deseadas.
8. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde la(s) substancia(s)
deseada(s) que se ha(n)
de separar es/son células, microorganismos, virus y sus fracciones, ácidos nucleicos y proteínas.
de separar es/son células, microorganismos, virus y sus fracciones, ácidos nucleicos y proteínas.
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