ES2249257T3 - Utilizacion de compuestos de lipoxina para la inhibicion de la respuesta de los neutrofilos inducida por tnf-alfa. - Google Patents
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Abstract
Utilización de un análogo de lipoxina de **fórmula** en la que X es R1, OR1 o SR1, en la que R1 es (i) un átomo de hidrógeno; (ii) un alquilo de entre 1 y 8 átomos de carbono, inclusive, que puede ser de cadena lineal o ramificada; (iii) un cicloalquilo de entre 3 y 10 átomos de carbono; (iv) un alquilo de entre 7 y 12 átomos de carbono; (v) fenilo; (vi) fenilo sustituido en la que Zi, Zii, Ziii, Ziv y Zv están cada uno de ellos independientemente seleccionados de entre el grupo constituido por -NO2, -CN, -C(=O)-R1, -SO3H, un átomo de hidrógeno, halógeno, metilo, -ORx en la que Rx es entre 1 y 8 átomos de carbono, inclusive, que puede ser de cadena lineal o ramificada, e hidróxido.
Description
Utilización de compuestos de lipoxina para la
inhibición de la respuesta de los neutrofilos inducida por
TNF-\alpha.
Los mediadores lipídicos y proteicos de la
inflamación tales como las citocinas y las quimioquinas tienen un
impacto profundo en su propia generación e interacciones [Serhan,
C.N., J.Z. Haeggström and C.C. Leslie, Lipid mediator networks in
cell signalling: update and impact of cytokines. FASEB J.
10:1147-1158 (1996)]. En particular, las
citocinas TNF\alpha e IL-1\beta desempeña una
función principal en la inflamación, choque séptico y daño de los
tejidos. Los PMN realizan una gama de funciones especializadas bien
conocidas, que comprenden la quimiotaxis, la generación de especies
reactivas de oxígeno y la biosíntesis de potentes mediadores
lipídicos [(Weiss, S.J. Tissue destruction by neutrophils, N.
Engl. J. Med. 320:365-376 (1989)]. En relación
con esto, el TNF\alpha estimula en los PMN la transcripción y
liberación de citocinas tales como la IL-1\beta,
incrementa la biosíntesis de leucotrieno y regula positivamente las
moléculas de adhesión [Marucha, P.T., R.A. Zeff y D.L. Kreutzer
(1991) Cytokines-induced IL-1\beta
gene expression in the human polymorphonuclear leukocyte:
transcriptional and post-transcriptional regulation
by tumor necrosis factor and IL-1, J. Immunol.
147:2603-2608 (1991)]. Debido a que los PMN
constituyen aproximadamente el 70% de los leucocitos de la sangre
periférica y son en muchos casos el tipo inicial de célula reclutado
en los lugares intersticiales, en la actualidad se consideran como
una fuente importante de citocinas
"pro-inflamatorias" que comprenden TNF\alpha
e IL-1\beta. Éstas así como también otras
citocinas y quimioquinas derivadas de los PMN, a su vez, influyen en
el proceso de las respuestas inmunes e inflamatorias [Lloyd, A.R., y
J.J. Oppenheim, Poly's lament: the neglected role of the
polymorphonuclear neutrophil in the afferent limb of the immune
response. Immunology Today 13:169-172
(1992)]. En ciertas situaciones clínicas, que comprenden el síndrome
agudo de peligro, el daño por reperfusión del miocardio, la gota y
la artritis reumatoide, los PMN contribuyen al daño continuado del
tejido huésped [Weiss, S.J. Tissue destruction by neutrophils. N.
Engl. J. Med., 320:365-376 (1989); Hachicha, M.,
P.H. Naccache and S.R. McColl. 1995, Inflamatory microcrystals
differentially regulate the secretion of macrophage inflammatory
protein-1 and interleukin-8 by human
neutrophils: A possible mechanism of neutrophil recruitment to sites
of inflammation in synovitis. J. Exp. Med.,
182:2019-2025 (1995); Hansen, P.R., Role of
neutrophils in myocardial ischemia and reperfusion. Circulation
91:1872-1885 (1995)]. Por consiguiente, es
interesante entender las complejas interrelaciones entre los
mediadores lipídicos y la respuesta evocada por el TNF\alpha en
los PMN con el fin de inspirar nuevas estrategias destinadas al
control dichos eventos.
La presente invención se refiere a la utilización
de los análogos de Lipoxina definidos a continuación para la
preparación de un agente farmacológico destinado al tratamiento de
la dermatitis seborreica, la dermatosis pustulosa o la caspa
asociadas a la inflamación de los neutrófilos polimorfos (PMN)
iniciada por el TNF\alpha.
En una forma de realización preferida, la
presente invención se refiere a dicha utilización, en la que el
agente farmacológico está en forma de un champú o producto destinado
a la higiene corporal.
La presente invención se comprenderá mejor a
partir de la siguiente descripción detallada junto con los dibujos
adjuntos, en los que:
La Figura 1 muestra que los análogos estables de
LXA_{4} y ATL inhiben la generación de superóxido por los
neutrófilos humanos estimulados por TNF\alpha. Los PMN humanos se
incubaron con solo el vehículo o con las concentraciones indicadas
de LXA_{4}, 15 R/S-metil-LXA_{4}
o 16-fenoxi-LXA_{4} durante 5
minutos y a continuación con TNF\alpha (50 ng/ml) durante 10
minutos adicionales. Los valores son la media \pm SEM para
LXA_{4} (n = 3), 15
R/S-metil-LXA_{4} (n = 4) o
16-fenoxi-LXA_{4} (n = 3).
LXA_{4} y los análogos, produjeron a todas las concentraciones
ensayadas, una inhibición estadísticamente significativa de la
aparición de IL-1\beta inducida por TNF\alpha
(p<0,01).
La Figura 2 muestra que LXA_{4} y los análogos
estables inhiben la producción de IL-1\beta
inducida por TNF\alpha en los neutrófilos humanos. A) los PMN se
incubaron [TNF\alpha (10 ng/ml) más vehículo o TNF\alpha más
LXA_{4} (100 nM)] tal como se indica durante 20 h a 37ºC y 5% de
CO_{2}. Se recogieron los sobrenadantes y se cuantificó la
IL-1\beta mediante ELISA. Los resultados se
expresan como la media \pm SD de los duplicados y corresponden a
un experimento representativo de n = 3. B) Se incubaron los PMN
durante los períodos de tiempo indicados en presencia de
concentraciones crecientes de 15
R/S-metil-LXA_{4}. Los valores
representan la media \pm SEM, n = 3. En todos los intervalos de
tiempo ensayados, el TNF\alpha indujo una aparición significativa
de IL-1\beta, en comparación con las células
tratadas con vehículo
(*p < 0,01).
(*p < 0,01).
La Figura 3 demuestra que 15
R/S-metil-LXA4 regula negativamente
la expresión génica de IL-1\beta disparada por
TNF\alpha. Los PMN se incubaron con 0,1% de etanol (vehículo) o 15
R/S-metil-LXA4 a 10, 100 y 1000 nM,
en presencia o ausencia de TNF\alpha (10 ng/ml), durante 6 h a
37ºC. Se realizaron transferencias Northern con el fin de detectar
ARN mensajero de IL-1\beta. Se representan los
resultados de un experimento representativo de otros dos realizados
con donantes diferentes.
La Figura 4 describe la implicación del receptor
de LXA_{4}. Se incubaron PMN con IgG purificada a partir de suero
preinmune (50 \mug/ml) o anti-receptor de
LXA_{4} (50 \mug/ml) durante 1 hora a 4ºC, a continuación se
expusieron a agonistas durante 12 h a 37ºC y 5% de CO_{2}. Los
valores se expresan como la media \pm SD de un experimento
realizado por triplicado, representativo de tres experimentos
diferentes cada uno de ellos realizado con donantes diferentes (*p
< 0,01).
La Figura 5 muestra la inhibición de la
infiltración de PMN inducida por TNF\alpha en las bolsas de aire
murinas. Se inoculó en las bolsas un ml de PBS estéril que contenía
o 0,1% de etanol, TNF\alpha, 15
R/S-metil-LXA_{4}, o TNF\alpha
más 15 R/S-metil-LXA_{4} y se
recogieron los exudados después de los períodos de tiempo indicados.
El número total de leucocitos se contó como se indica en Materiales
y Métodos. Los resultados se expresan como la media \pm SEM de
tres ratones diferentes para cada punto. En todos los intervalos de
tiempo, el TNF\alpha indujo una infiltración de leucocitos
significativa en la cavidad de las bolsas de aire (p < 0,05). *
Estadísticamente diferente de las células tratadas con TNF\alpha;
y de las células tratadas con vehículo o 15
R/S-metil-LXA_{4} (p <
0,01).
La Figura 6 muestra que 15
R/S-metil-LXA_{4} redirige el
perfil de citocina/quimioquina inducido in vivo por
TNF\alpha. Los experimentos se realizaron tal como se describe en
la leyenda de la Figura 5. La cuantificación de
IL-1\beta, IL-4,
IL-10, IL-13 y MIP-2
se realizó utilizando ELISA en exudados de bolsa de aire libres de
células de ratón. Los resultados se expresan como la media \pm SEM
de tres ratones diferentes para cada punto de tiempo. Los cambios en
IL-1\beta, MIP-2 e
IL-4 fueron significativos en todos los intervalos
de tiempo ensayados (p < 0,01).
Las características y otros detalles de la
presente invención se describirán más particularmente a continuación
y se indicarán en las reivindicaciones. Se entiende que las formas
de realización particulares de la presente invención se proporcionan
a título ilustrativo y no limitativo de la presente invención. Las
características principales de la presente invención se pueden
utilizar en múltiples formas de realización sin apartarse del
alcance de la presente invención, tal como se define en las
reivindicaciones.
El impacto de la lipoxina A_{4} (LXA_{4}) y
la lipoxina inducida por la aspirina (ATL) se investigó en las
respuestas in vitro e in vivo de los neutrófilos (PMN)
iniciados con factor necrótico tumoral (TNF\alpha) utilizando
análogos de LX metabólicamente estables. A concentraciones tan bajas
como entre 1 y 10 nM, tanto el análogo de LXA_{4} como el de ATL
inhibieron la generación anión de superóxido estimulada por
TNF\alpha y la liberación de IL-1\beta por los
PMN humanos. Dichas acciones por LXA4-ATL fueron
dependientes del tiempo y la concentración y demostraron
selectividad por el TNF\alpha, ya que dichas respuestas no se
alteraron con GM-CSF o con células estimuladas por
zimosano. La expresión génica de IL-1\beta
inducida por TNF\alpha también fue regulada mediante los
anticuerpos antireceptor de LXA_{4} y los análogos
LXA_{4}-ATL. En las bolsas de aires murinas, 15
R/S-metil-LXA_{4} inhibió
dramáticamente el tráfico de leucocitos estimulado por TNF\alpha,
así como también la aparición de tanto el péptido inflamatorio 2 de
los macrófagos como la IL-1\beta, a la vez que
concomitantemente estimuló la IL-4 en los exudados
de las bolsas. En conjunto, dichos resultados indican que tanto
LXA_{4} como ATL regulan las acciones de los neutrófilos dirigidas
por TNF\alpha in vitro e in vivo y estimulan la
IL-4 en los exudados, lo que desempeña una función
fundamental en las respuestas inmunes.
Las abreviaturas utilizadas en la presente
memoria: ATL, lipoxina inducida por la aspirina; análogo de ATL, 15
R/S-metil-LXA_{4}-metil
éster; LX, lipoxina; LXA_{4}, 5S,6R, ácido
15S-trihidroxi-7,9,13-trans-11-cis-eicosatetraenoico;
análogo de LXA_{4}, 16 fenoxi-lipoxina A_{4}
metil éster; 15-epi-LXA4, 5S,6R,
ácido
15R-trihidroxi-7,9,13-trans-11-cis-eicosatetraenoico;
LT, leucotrieno; MIP, péptido estimulador de los macrófagos; RA,
artritis reumatoide. Los procedimientos adecuados destinado a la
preparación de los compuestos de lipoxina se pueden encontrar en,
por ejemplo, las patentes US nº 5.411.951; nº 5.648.512; nº
5.650.435 y nº 5.750.354.
La contribución del leucotrieno
(LT^{1})B_{4} a la inflamación está bien establecida en
vista de su potente capacidad para atraer a los PMN. Otra serie de
mediadores lipídicos bioactivos denominados lipoxinas (LX) y
lipoxinas inducidas por la aspirina (ATL), dentro del rango
nanomolar, inhiben la adhesión y la transmigración de PMN estimulada
por fMLP y LTB4 y por consiguiente se proponen como señales
anti-reguladoras operativas en la resolución de los
lugares de inflamación [Serhan, C.N., J.Z. Haeggström and C.C.
Leslie. Lipid mediator networks in cell signalling: update and
impact of cytokines. FASEB J. 10:1147-1158
(1997); Takano, T., S. Fiore, J.F. Maddox, H.R. Brady, N.A. Petasis
and C.N. Serhan. Aspirin-triggered
15-epi-lipoxin A_{4} and LXA_{4}
stable analogs are potent inhibitors of acute inflammation: Evidence
for anti-inflamatory receptors. J. Exp. Med.
185:1693-1704 (1995); Clária, J. and C.N.
Serhan. Aspirin triggers previously undescribed bioactive
eicosanoids by human endothelium cell-leukocyte
interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
92:9475-9479; Lee, T.H. C.E. Horton, U.
Kyan-Aung, D. Haskard, A.E. Crea and B.W. Spur.
1989. Lipoxin A_{4} and lipoxin B_{4} inhibit chemotactic
responses of human neutrophils stimulated by leukotriene B_{4} and
N-formyl-L-methionyl-L-leucyl-L-phenylalanine.
Clin. Sci. 77:195-203 (1989); Serhan, C.N.
Lipoxin biosynthesis and its impact in inflammatory and vascular
events. Biochim. Biophys. Acta 1212:1-25
(1994)]. En los tejidos humanos, se conocen tres sendas principales
para la generación de LX. Una fuente intraluminal de LX se
ejemplifica mediante las interacciones PMN-plaqueta
que utilizan vías de biosíntesis transcelulares secuenciales con el
producto LTA_{4} de la PMN 5-lipoxigenasa (LO) y
la 12-LO de las plaquetas. La fuente mucosal y/o la
fuente intersticial de dichos eicosanoides implica interacciones
célula-célula con 5-LO y
15-LO de los leucocitos presente en, por ejemplo,
eosinófilos, epitelio gastrointestinal o traqueal que está
controlado por IL-4 e IL-13
(revisado en (Serhan, C.N., J.Z. Haeggström and C.C. Leslie. Lipid
mediator networks in cell signalling: update and impact of
cytokines. FASEB J. 10:1147-1158 (1996)]. La
tercera y más recientemente esclarecida también representa un nuevo
mecanismo de acción de la aspirina que dispara la biosíntesis
endógena de epímeros 15R de LX nativo, denominados lipoxinas
inducidas por aspirina (ATL), generadas por la vía de biosíntesis
transcerlular [Claria, J. and C.N. Serhan. Aspirin triggers
previously undescribed bioactive eicosanoids by human endotelial
cell-leukocyte interactions. Proc.Natl. Acad.
Sci.USA 92:9475-9479 (1995)].
Los LX se generan durante las interacciones
célula-célula por la vía de la biosíntesis
transcelular y se producen in vivo durante la angioplastia y en la
glomerulonefritis de complejo inmune [Serhan, C.N., J.Z. Haeggström
and C.C. Leslie. Lipid mediator networks in cell signaling: update
and impact of cytokines. FASEB J.
10:1147-1158 (1996); Papayianni, A., C.N.
Serhan, M.L. Phillips, H.G. Rennke and H.R. Brady. Transcellular
biosynthesis of lipoxin A_{4} during adhesion of platelets and
neutrophils in experimental immune complex glomerulonephritis.
Kidney Int. 47:1295-1302 (1995)]. LXA_{4}
también se encuentra presente en los fluidos de los lavajes nasales
de los asmáticos sensibles a la aspirina y la generan los leucocitos
de los pacientes con asma y artritis reumatoide [Chavis, C., I.
Vachier, P. Chanez, J. Bousquet and P. Godard 1996.
5(S),15(S),15(S)-Dihidroxyeicoastetraenoic
acid and lipoxin generation in human polymorphonuclear cells: dual
specificity of 5-lipoxygenase towards endogenous and
exogenous precursors. J. Exp. Med.
183:1633-1643; Thomas, E., J.L. Leroux, F.
Blotman and C. Chavis. Conversion of endogenous arachidonic acid to
5,15-diHETE and lipoxins by polymorphonuclear cells
from patients with rheumatoid arthritis. Inflamm. Res.
44:121-124 (1995)]. Tal como la mayoría de los
autocoides y mediadores lipídicos, los LX son biosintetizados
rápidamente, actúan dentro de un microambiente local y son
enzimáticamente inactivados rápidamente. Con el fin de avanzar en el
conocimiento de las funciones del LX y ATL in vivo, se
diseñaron análogos del LX metabólicamente estables que resisten la
desactivación rápida e imitan las acciones in vitro del LX y
ATL natural (Serhan, C.N., J.F. Maddox, N.A. Petasis, I.
Akritopoulou-Zanze, A. Papayianni, H.R. Brady, S.P.
Colgan y J.L. Madara 1995. Design of lipoxin A_{4} stable analogs
that block transmigration and adhesion of human neutrophils.
Biochemistry 34:14609-14615 (1995)]. Se ha
descubierto inesperadamente que dichos compuestos son inhibidores
potentes de los eventos inflamatorios asociados a PMN disparados por
TNF\alpha in vitro e in vivo. Además, el
LXA_{4}-ATL inhibe MIP-2 e
IL-1\beta pero estimula la aparición local de
IL-4 en los exudados.
La presente invención se refiere a la utilización
de un análogo de la lipoxina definido a continuación destinado a la
preparación de un agente farmacéutico con el fin de tratar la
dermatitis seborreica, la dermatosis pustulosa o la caspa asociadas
con la inflamación de los neutrófilos polimorfos (PMN) inducida por
TNF\alpha.
En una forma de realización preferida el agente
farmacológico se utiliza en la forma de un champú o producto de
higiene corporal.
En una forma de realización, los compuestos de
utilidad de la presente invención presentan la fórmula (I)
en la que X es R_{1}, OR_{1}, o
SR_{1};
en la que R_{1} es
- (i)
- un átomo de hidrógeno;
- (ii)
- un alquilo de entre 1 y 8 átomos de carbono, inclusive, que puede ser de cadena lineal o ramificada;
- (iii)
- un cicloalquilo de entre 3 y 10 átomos de carbono;
- (iv)
- un aralquilo de entre 7 y 12 átomos de carbono;
- (v)
- fenilo;
- (vi)
- fenilo sustituido
en la que Z_{i}, Z_{ii},
Z_{iii}, Z_{iv} y Z_{v} están cada uno seleccionados
independientemente de entre -NO_{2}, -CN,
-C(=O)-R_{1}, -SO_{3}H, un átomo de hidrógeno,
alógeno, metilo, -OR_{x}, en el que R_{x} es entre 1 y 8 átomos
de carbono, inclusive, pudiendo ser una cadena lineal o ramificada,
e
hidróxilo;
- (vii)
- una molécula marcadora detectable; o
- (viii)
- un alquenilo de cadena lineal o ramificada de entre 2 y 8 átomos de carbono, inclusive;
en la que Q_{1} es (C=O), SO_{2} o (CN), a
condición de que cuando Q_{1} es CN, X está ausente; en la que
Q_{3} y Q_{4} son cada uno independientemente O, S o NH;
en la que R_{2} y R_{3} es un átomo de
hidrógeno y el otro es
- (a)
- H;
- (b)
- un alquilo de entre 1 y 8 átomos de carbono, inclusive, que puede ser una cadena lineal o ramificada;
- (c)
- un cicloalquilo de entre 3 y 6 átomos de carbono, inclusive;
- (d)
- un alquenilo de entre 2 y 8 átomos de carbono, inclusive, que puede ser de cadena lineal o ramificada;
- (e)
- R_{a}Q_{2}R_{b} en la que Q_{2} es -O- o -S-; en la que R_{a} es un alquenilo de entre 0 y 6 átomos de carbono, inclusive, que puede ser de cadena lineal o ramificada y en la que R_{b} es un alquilo de entre 0 y 8 átomos de carbono, inclusive, que puede ser de cadena lineal o ramificada, si cuando R_{b} es 0, R_{b} es un átomo de hidrógeno;
en la que R_{4} es
- (a)
- H;
- (b)
- un alquilo de entre 1 y 6 átomos de carbono, inclusive, que puede ser de cadena lineal o ramificada;
en la que R_{5} es
en la que Z_{i}, Z_{ii},
Z_{iii}, Z_{iv} y Z_{v} están cada uno independientemente
seleccionados de entre -NO_{2}^{-}, -CN,
-C(=O)-R_{1}, -SO_{3}H, un átomo de hidrógeno,
halógeno, metilo, -OR_{x} en la que R_{x} es entre 1 y 8 átomos
de carbono, inclusive, que puede ser de cadena lineal o ramificada,
un hidroxilo, o un grupo alquilo ramificado o no ramificado
sustituido o no
sustituido;
en el que Y_{1} es -OH, metilo, -SH y alquilo
de entre 2 y 4 átomos de carbono, inclusive, de cadena lineal o
ramificada, un alcoxi de entre 1 y 4 átomos de carbono, inclusive, o
CH_{a}Z_{b} en la que a + b = 3, a = 0 a 3, b = 0 a 3 y Z es
ciano, nitro o halógeno;
en la que R_{6} es
- (a)
- H;
- (b)
- un alquilo de entre 1 y 4 átomos de carbono, inclusive, de cadena lineal o ramificada;
en la que T es O o S y sales farmacéuticamente
aceptables del mismo.
En otra forma de realización, los compuestos de
utilidad de la presente invención presentan la fórmula (II)
en la que X es R_{1}, OR_{1} o
SR_{1};
en la que R_{1}
- (i)
- un átomo de hidrógeno;
- (ii)
- un alquilo de entre 1 y 8 átomos de carbono, inclusive, que puede ser de cadena lineal o ramificada,
- (iii)
- un cicloalquilo de entre 3 y 10 átomos de carbono;
- (iv)
- un aralquilo de entre 7 y 12 átomos de carbono;
- (v)
- fenilo;
- (vi)
- fenilo sustituido;
en la que Z_{i}, Z_{ii},
Z_{iii}, Z_{iv} y Z_{v} están seleccionados independientemente
de entre el grupo constituido por -NO_{2}, -CN,
-C(=O)-R_{1}, -SO_{3}H, un átomo de hidrógeno,
halógeno, metilo, -OR_{x}, en la que R_{x} es entre 1 y 8 átomos
de carbono, inclusive, que puede ser una cadena lineal o ramificada,
e
hidroxilo;
- (vii)
- una molécula marcadora detectable; o
- (viii)
- una cadena lineal o ramificada de alquenilo de entre 2 y 8 átomos de carbono, inclusive;
en la que Q_{1} es (C=O), SO_{2} o (CN),
provisto que cuando Q_{1} es CN, X está ausente; en la que uno de
R_{2} y R_{3} es un átomo de hidrógeno y el otro es
- (a)
- H;
- (b)
- un alquilo de entre 1 y 8 átomos de carbono, inclusive, que puede ser una cadena lineal o ramificada;
- (c)
- un cicloalquilo de entre 3 y 6 átomos de carbono, inclusive;
- (d)
- un alquenilo de entre 2 y 8 átomos de carbono, inclusive, que puede ser una cadena lineal o ramificada; o
- (e)
- R_{a}Q_{2}R_{b} en la que Q_{2} es -O- o -S-; en la que R_{a} es alquileno de entre 0 y 6 átomos de carbono, inclusive, que puede ser una cadena lineal o ramificada y en la que R_{b} es alquilo de entre 0 y 8 átomos de carbono, inclusive, que puede ser una cadena lineal o ramificada, provisto que cuando R_{b} es 0, R_{b} es un átomo de hidrógeno;
en la que R_{4} es
- (a)
- H;
- (b)
- Un alquilo de entre 1 y 6 átomos de carbono, inclusive, que puede ser una cadena lineal o ramificada;
en la que R_{5} es
en la que Z_{i}, Z_{ii},
Z_{iii}, Z_{iv} y Z_{v} están independiente seleccionados de
entre el grupo constituido por -NO_{2}, -CN,
-C(=O)-R_{1}, -SO_{3}H, un átomo de hidrógeno,
halógeno, metilo, -OR_{x}, en la que R_{x} es entre 1 y 8 átomos
de carbono, inclusive, que puede ser una cadena lineal o ramificada,
un grupo hidroxilo o un grupo alquilo sustituido o no sustituido,
lineal o
ramificado;
en la que Y_{1} es -OH, metilo, -SH y alquilo
de entre 2 y 4 átomos de carbono, inclusive, de cadena lineal o
ramificada, y alcoxi de entre 1 y 4 átomos de carbono, inclusive, o
CH_{a}Z_{b} en la que a + b = 3, a = 0 a 3, b = 0 a 3 y Z es
ciano, nitro o halógeno;
en la que R_{6} es
- (a)
- H;
- (b)
- un alquilo de entre 1 a 4 átomos de carbono, inclusive, de cadena lineal o ramificada;
en la que T es O ó S, y las sales
farmacéuticamente aceptables de la misma.
La invención también está dirigida a los
compuestos de lipoxina de fórmula (III)
en la que X es R_{1}, OR_{1} o
SR_{1}
en la que R_{1} es
- (i)
- un átomo de hidrógeno;
- (ii)
- un alquilo de entre 1 y 8 átomos de carbono, inclusive, que puede ser de cadena lineal o ramificada;
- (iii)
- un cicloalquilo de entre 3 y 10 átomos de carbono;
- (iv)
- un aralquilo de entre 7 y 12 átomos de carbono;
- (v)
- fenilo;
- (vi)
- fenilo sustituido
en la que Z_{i}, Z_{ii},
Z_{iii}, Z_{iv} y Z_{v} están cada uno independientemente
seleccionados de entre el grupo constituido por -NO_{2}, -CN,
-C(=O)-R_{1}, -SO_{3}H, un átomo de hidrógeno,
halógeno, metilo, -OR_{x}, en la que R_{x} es entre 1 y 8 átomos
de carbono, inclusive, que puede ser de cadena lineal o ramificada e
hidroxilo;
- (vii)
- una molécula marcadora detectable, o
- (viii)
- un alquenilo de cadena lineal o ramificada de entre 2 y 8 átomos de carbono, inclusive;
en la que Q_{1} es (C=O), SO_{2} o (CN), a
condición de que cuando Q_{1} es CN, X está ausente; en la que uno
de entre R_{2} y R_{3} es un átomo de hidrógeno y el otro es
- (a)
- H;
- (b)
- un alquilo de entre 1 y 8 átomos de carbono, inclusive, que puede ser de cadena lineal o ramificada;
- (c)
- un cicloalquilo de entre 3 y 6 átomos de carbono, inclusive;
- (d)
- un alquenilo de entre 2 y 8 átomos de carbono, inclusive, que puede ser de cadena lineal o ramificada; ó
- (e)
- R_{a}Q_{2}R_{b} en la que Q_{2} es -O- o -S-; en la que R_{a} es un alquileno de entre 0 y 6 átomos de carbono, inclusive, que puede ser de cadena lineal o ramificada y en la que R_{b} es alquilo de entre 0 y 8 átomos de carbono, inclusive, que puede ser de cadena lineal o ramificada, provisto que si R_{b} es 0 R_{b} es un átomo de hidrógeno;
en la que R_{4} es
- (a)
- H;
- (b)
- un alquilo de entre 1 y 6 átomos de carbono, inclusive, que puede ser de cadena lineal o ramificada;
en la que R_{5} es
en la que Z_{i}, Z_{ii},
Z_{iii}, Z_{iv} y Z_{v} están independientemente seleccionados
de entre el grupo constituido por -NO_{2}, -CN,
-C(=O)-R_{1}, -SO_{3}H, un átomo de hidrógeno,
halógeno, metilo, -OR_{x}, en la que R_{x} es entre 1 y 8 átomos
de carbono, inclusivo, que puede ser de cadena lineal o ramificada,
y hidróxilo o un grupo alquilo sustituido o no sustituido, lineal o
ramificado;
en la que R_{6} es
- (a)
- H;
- (b)
- un alquilo de entre 1 y 4 átomos de carbono, inclusive, de cadena lineal o ramificada;
en la que T es O o S, y las sales
farmacéuticamente aceptables de la misma.
La invención también está dirigida a los
compuestos de lipoxina útiles de fórmula (IV)
en la que X es R_{1}, OR_{1} o
SR_{1};
en la que R_{1} es
- (i)
- un átomo de hidrógeno;
- (ii)
- un alquilo de entre 1 y 8 átomos de carbono, inclusive, que puede ser de cadena lineal o ramificada;
- (iii)
- un cicloalquilo de entre 3 y 10 átomos de carbono;
- (iv)
- un aralquilo de entre 7 y 12 átomos de carbono;
- (v)
- fenilo;
- (vi)
- fenilo sustituido
en la que Z_{i}, Z_{ii},
Z_{iii}, Z_{iv} y Z_{v} están cada uno independientemente
seleccionados de entre el grupo constituido por -NO_{2}, -CN,
-C(=O)-R_{1}, -SO_{3}H, un átomo de hidrógeno,
halógeno, metilo, -OR_{x}, en la que R_{x} es entre 1 y 8 átomos
de carbono, inclusive, que pueden ser una cadena lineal o
ramificada, e
hidróxilo;
- (vii)
- una molécula marcadora detectable; o
- (viii)
- una cadena de alquenilo lineal o ramificada de entre 2 y 8 átomos de carbono, inclusive;
en la que Q_{1} es (C=C), SO_{2} o (CN), a
condición de que cuando Q_{1} es CN, X está ausente;
en la que R_{4} es
- (a)
- H;
- (b)
- un alquilo de entre 1 y 6 átomos de carbono, inclusive, que puede ser de cadena lineal o de cadena ramificada;
en la que R_{5} es
en la que Z_{i}, Z_{ii},
Z_{iii}, Z_{iv} y Z_{v} están independientemente seleccionados
de entre el grupo constituido por -NO_{2}, -CN,
-C(=O)-R_{1}, -SO_{3}H, un átomo de hidrógeno,
halógeno, metilo, -OR_{x} en la que R_{x} es entre 1 y 8 átomos
de carbono, inclusive, que pueden estar en una cadena lineal o
ramificada, un hidroxilo o un grupo alquilo sustituido o no
sustituido, lineal o
ramificado;
en el que R_{6} es
- (a)
- H;
- (b)
- un grupo alquilo de entre 1 y 4 átomos de carbono, inclusive, de cadena lineal o ramificada; y
sales farmacéuticamente aceptables de los
mismos.
en la que T es O o S, y sales farmacéuticamente
adecuadas de los mismos.
La invención está además dirigida a los
compuestos de lipoxina de fórmula (v) (fórmula V)
en la que X es R_{1}, OR_{1}, o
SR_{1}
en la que R_{1} es
- (i)
- un átomo de hidrógeno;
- (ii)
- un alquilo de entre 1 y 8 átomos de carbono, inclusive, que puede ser de cadena linea o ramificada
- (iii)
- cicloalquilo de entre 3 y 10 átomos de carbono
- (iv)
- aralquilo de 7 a 12 átomos de carbono
- (v)
- pentilo
- (vi)
- pentilo sustituido
en la que Z_{i}, Z_{ii},
Z_{iii}, Z_{iv} y Z_{v} están independientemente seleccionados
de entre -NO_{2}, -CN, -C(=O)-R_{1}, -SO_{3}H,
un átomo de hidrógeno, alógeno, metilo, -OR_{x}, en la que R_{x}
es 1 a 8 átomos de carbono, inclusive, que puede ser de cadena
lineal o ramificada o
hidroxilo.
- (vii)
- una molécula marcadora o
- (viii)
- un alquenilo de cadena lineal o ramificada de entre 2 y 8 átomos de carbono, inclusive;
en la que Q_{1} es (C=O), SO_{2} o (CN), a
condición de que cuando Q_{1} es CN, entonces X está ausente;
en la que R_{4} es;
- (a)
- H;
- (b)
- un alquilo de entre 1 y 8 átomos de carbono, inclusive, que pueden ser de cadena lineal o ramificada;
en la que R_{5} es
en la que Z_{i}, Z_{ii},
Z_{iii}, Z_{iv} y Z_{v} están independientemente seleccionados
de entre -NO_{2}, -CN, -C(=O), -R_{1}, -SO_{3}H, un átomo de
hidrógeno, halógeno, metilo, -OR_{x} , en la que R_{x} es entre
1 y 8 átomos de carbono, inclusive, que puede ser de cadena lineal o
ramificada e hidroxido o un grupo alquílico sustituido o no
sustituido de cadena lineal o
ramificada;
en la que R_{6} es
- (a)
- H;
- (b)
- un grupo alquilo de entre 1 y 4 átomos de carbono, inclusive, de cadena lineal o ramificada; y
sales farmacéuticamente aceptables de los
mismos.
En una forma de realización preferida, X es
OR_{1} en la que R_{1} es un átomo de hidrógeno, un grupo
alquilo de entre 1 y 4 átomos de carbono o una sal farmacéuticamente
aceptable, Q_{1} es C=O, R_{2} y R_{3}, si se encuentran
presentes son átomos de hidrógeno, R_{4} es un átomo de hidrógeno
o metilo, Q_{3} y Q_{4}, si se encuentran presentes son tanto
uno como el otro O, R_{6} si está presente es un átomo de
hidrógeno, Y_{1} si está presente es OH, T es O y R_{5} es un
fenilo sustituido, por ejemplo,
en el que Z_{i}, Z_{ii},
Z_{iii}, Z_{iv} y Z_{v} están independientemente seleccionados
de entre el grupo constituido por -NO_{2}, -CN,
-C(=O)-R_{1}, -SO_{3}H, un átomo de hidrógeno,
halógeno, metilo, -OR_{x} en la que R_{x} es 1 a 8 átomos de
carbono, inclusive, que pueden ser una cadena lineal o ramificada, e
hidroxilo.
En formas de realización preferidas, Y_{1} es
un hidrógeno y el carbono unido al grupo hidroxilo puede tener una
configuración R o S. En la mayoría de las formas de realización
preferidas, el carbono quiral unido grupo hidroxilo, por ejemplo,
Y_{1}, se designa como
15-epi-lipoxina tal como se conoce
en la materia.
En ciertas formas de realización la quiralidad de
los carbonos unidos a los grupos R_{2}, R_{3}, Q_{3} y Q_{4}
pueden ser cada uno de ellos independientemente R o S. En las formas
de realización preferidas, los grupos Q_{3} y Q_{4} presentan
las quiralidades mostradas en las estructuras II, III, IV o V.
En las formas de realización preferidas, R_{4}
es hidrógeno. En otras formas de realización preferidas, R_{6} es
un hidrógeno.
Además, R_{5} se puede ser un grupo alquilo
sustituido o no sustituido, de cadena lineal o ramificada con entre
1 y aproximadamente 6 átomos de carbono, preferentemente entre 1 y 4
átomos de carbono, más preferentemente entre 1 y 3 átomos de carbono
y preferiblemente entre 1 y 2 átomos de carbono. Los átomos de
carbono pueden tener sustituyentes que comprenden átomos de
halogeno, grupos hidroxilo u otros grupos.
Los compuestos útiles de la presente invención se
pueden preparar según el siguiente esquema sintético:
en la que X, Q_{1}, Q_{3},
Q_{4}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5}, R_{6}, Y_{1} y T
son tal como se definieron anteriormente. Con el fin de producir
cada uno de los fragmentos se pueden utilizar los procedimientos
adecuados conocidos en la materia. Por ejemplo, el fragmento
acetilénico se puede preparar mediante el procedimiento discutido en
Nicolaou, K.C. et al., Angew.Chem. Int. Ed. Engl.
30:1100 (1991); Nicolau, K.C. et al., J. Org. Chem.
54:5527 (1998); Webber, S.E. et al., Adv. Exp. Med.
Biol. 229:61 (1998) y la patente US nº 5.441.951. El segundo
fragmento se puede preparar mediante los procedimientos de Raduchel,
B. y Vorbruggen, H. Adv. Prostaglandin Thomboxane Leukotriene
Res. 14:263
(1985).
El análogo de la lipoxina se puede utilizar según
la presente invención en composiciones farmacéuticas que comprenden
compuestos con las fórmulas anteriormente descritas y un vehículo
farmacéuticamente aceptable. En una forma de realización, un
compuesto preferido es
En una forma de realización preferida, el
vehículo farmacéutico no es una cetona, p.ej., acetona.
En una forma de realización, el agente
farmacéutico está en la forma de un champú o un producto destinado a
la higiene corporal, por ejemplo un jabón, destinado a lavar la
cabeza y/o el cuerpo. La utilización de dichos compuestos en un
champú o producto de jabón se puede utilizar tratar la dermatitis
seborreica, la dermatosis pustulosa y la caspa. Por consiguiente los
compuestos son útiles para modular la inflamación de TNF \alphaPMN
o citocina asociada con dichas enfermedades.
La expresión "análogo de la lipoxina"
significa un compuesto que presenta una "región activa" que
funciona como la región activa de una "lipoxina natural", pero
presenta una "región de transformación metabólica" que difiere
de la lipoxina natural. Los análogos de la lipoxina comprenden
compuestos estructuralmente semejantes a la lipoxina natural,
compuestos que comparte el mismo lugar de reconocimiento del
receptor, compuestos que comparten la misma o semejante región de
transformación metabólica de la lipoxina y compuestos reconocidos en
la materia por ser análogos de la lipoxina. Los análogos de la
lipoxina comprenden los metabolitos de los análogos de la lipoxina.
Los compuestos dados a conocer en la presente memoria pueden
contener uno o más centros de asimetría. Cuando existen átomos de
carbono asimétricos, son posibles más de un estereoisómero y se
pretende que todas las formas isoméricas posibles estén incluidas en
las representaciones estructurales mostradas. Los isómeros (R) y (S)
ópticamente activos se pueden separar utilizando procedimientos
convencionales conocidos por los expertos en la materia. Se pretende
que la presente invención incluya los diastereoisómeros posibles así
como también los isómeros racémicos y los ópticamente separados.
Los términos "lipoxina correspondiente" y
"lipoxina natural" significan una lipoxina natural o a un
metabolito de la lipoxina. Cuando un análogo presenta actividad para
un receptor específico de la lipoxina, la lipoxina correspondiente o
natural es el ligando normal para dicho receptor. Por ejemplo,
cuando un análogo es un receptor específico de LXA_{4} en células
HL-60 diferenciadas, la lipoxina correspondiente es
LXA_{4}. Cuando un análogo presenta actividad como antagonista de
otro compuesto (tal como un leucotrieno), que es antagonizado por
una lipoxina natural , la lipoxina natural es la lipoxina
correspondiente.
La expresión "región activa" significa la
región de una lipoxina natural o análogo de la lipoxina, que está
asociada con las interacciones celulares in vivo. La región
activa puede unirse al "lugar de reconocimiento" de un receptor
de lipoxina natural o a una macromolécula o un complejo de
macromoléculas, lo que comprende un enzima y su cofactor. Los
análogos de lipoxina A_{4} preferidos presentan una región activa
que comprende C_{5}-C_{15} de la lipoxina
A_{4} natural. Los análogos de lipoxina B_{4} presentan una
región activa que comprende C_{5}-C_{14} de la
lipoxina B_{4} natural.
El término "lugar de reconocimiento" o
receptor está reconocido en la materia y se refiere generalmente a
una macromolécula funcional o aun complejo de macromoléculas con las
que ciertos grupos de mensajeros celulares, tales como las hormonas,
leucotrienos y lipoxinas, deben primero interactuar antes de que se
inicien las respuestas bioquímicas y fisiológicas a dichos
mensajeros. Tal como se utiliza en la presente memoria, un receptor
puede estar aislado, en una célula intacta o permeabilizada o en un
tejido, que comprende un órgano. Un receptor puede estar en un
sujeto vivo o ser derivado de un sujeto vivo, o puede ser clonado.
Un receptor puede existir normalmente o puede ser inducido por un
estado de enfermedad, por heridas o por procedimientos artificiales.
Un compuesto de la presente invención puede unirse reversiblemente,
irreversiblemente, competitivamente o no competitivamente con
respecto al sustrato natural de un lugar de reconocimiento.
El término "región de transformación
metabólica" significa generalmente aquella parte de una lipoxina,
un metabolito de la lipoxina o un análogo de la lipoxina que
comprende un metabolito de un análogo de la lipoxina, sobre el que
un enzima o un enzima y su cofactor intenta realizar una o más de
las transformaciones metabólicas que dicho enzima o enzima y
cofactor normalmente realizan en las lipoxinas. La región de
transformación metabólica puede o no ser susceptible a la
transformación. Un ejemplo no limitante de una región de
transformación metabólica de una lipoxina es la parte de LXA4 que
comprende el doble enlace C-13,14 o el grupo
hidroxilo C-15, o
los dos.
los dos.
El término "molécula marcadora detectable"
se pretende que incluya moléculas marcadoras fluorescentes,
fosforescentes o radiomarcadas utilizadas con el fin de marcar,
seguir o identificar el compuesto o el lugar de reconocimiento del
receptor al que se está unida la molécula marcadora detectable. La
molécula marcadora se puede detectar mediante uno de entre los
múltiples procedimientos conocidos en la materia.
El término "análogo marcado de la lipoxina"
se entiende además que comprende compuestos marcados con isótopos
radioactivos, tales como, pero sin limitarse a ellos, el tritio
(^{3}H), deuterio (^{2}H), carbono (^{14}C), o marcados de
otro modo (p.ej. fluorescentemente). Los compuestos de la presente
invención se pueden marcar o derivatizar, por ejemplo, para
experimentos cinéticos de enlace, con el fin de esclarecer las
sendas metabólicas y los mecanismos enzimáticos, o para la
caracterización mediante procedimientos conocidos en la materia de
la química analítica.
El término "inhibe el metabolismo" significa
el bloqueo o reducción de la actividad de un enzima que metaboliza
una lipoxina nativa. El bloqueo o reducción puede ocurrir por enlace
covalente, por enlace irreversible, por un enlace reversible que
tiene el efecto de enlace irreversible, o mediante cualquier otro
mecanismo que evita que el enzima opere de su forma habitual en otro
análogo de la lipoxina, que comprende un metabolito de un análogo de
la lipoxina, una lipoxina o un metabolito de la lipoxina.
El término "resiste el metabolismo"
comprende el fallo en sufrir una o más de las transformaciones
metabólicas degradantes de por al menos uno de los enzimas que
metabolizan lipoxina. Dos ejemplos no limitantes de análogo de
LXA_{4} que resiste el metabolismo son 1) una estructura que no se
puede oxidar a la forma 15-oxo, y 2) una estructura
que se puede oxidar a la forma 15-oxo, pero no es
susceptible de reducción enzimática a la forma
13,14-dihidro.
El término "sufre metabolismo más
lentamente" significa tener una cinética de reacción más lenta, o
necesitar más tiempo para completar una serie de transformaciones
metabólicas por una o más de los enzimas que metabolizan lipoxina.
Un ejemplo no limitante de análogo de LXA_{4} que se metaboliza
más lentamente es una estructura con una energía de estado de
transición más elevada para la deshidrogenación C-15
que la que presenta LXA_{4} debido a que el análogo está
estéricamente impedido en la posición C-16.
El término "tejido" pretende incluir células
intactas, sangre, preparaciones de sangre tales como plasma y suero,
huesos, articulaciones, músculos, músculos lisos y órganos.
El término "halógeno" significa flúor,
cloro, bromo y yodo, o flúor, cloro, bromo y yodo. En ciertos
aspectos, los compuestos de la presente invención no comprenden
compuestos alogenados, p. ej. compuestos fluorados.
El término "sujeto" comprende los organismos
vivos susceptibles de estados o enfermedades provocadas o a las que
contribuye la inflamación, las respuestas inflamatorias, la
vasoconstricción y la supresión mieloide. Los ejemplos de sujetos
comprenden, seres humanos, perros, gatos, bacas, cabras y ratones.
El término sujeto comprende además las especies transgénicas.
Cuando los compuestos de la presente invención se
administran como fármacos, a seres humanos y animales, se pueden
administrar como tales o como composiciones farmacéuticas que
contienen, por ejemplo, entre el 0,1 y 99,5% (más preferiblemente,
entre 0,5 y 90%) del ingrediente activo en combinación con una
vehículo farmacéuticamente aceptable.
La frase "vehículo farmacéuticamente
aceptable" en la presente memoria significa un material
farmacéuticamente aceptable, composición o vehículo, tal como un
relleno líquido o sólido, diluyente, excipiente, disolvente o
material encapsulante, implicado en el llevar o transportar un
compuesto(s) de la presente invención a un sujeto o a su
interior de modo que pueda realizar su función. Típicamente, dichos
compuestos son llevados o transportados desde un órgano, o parte del
cuerpo, hasta otro órgano, o posición del cuerpo. Cada vehículo debe
ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los demás
ingredientes de la formulación y no dañino para el paciente. Algunos
ejemplos de materiales que pueden servir como vehículos
farmacéuticamente aceptables comprenden: azúcares, tales como
lactosa, glucosa y sacarosa; almidones, tales como almidón de maíz y
almidón de patata; celulosa, y sus derivados, tales como
carboximetilcelulosa sódica, etilcelulosa y acetato de celulosa;
tragacanto en polvo; malte; gelatina; talco; excipientes, tales como
manteca de coco y ceras para supositorios; aceites, tales como
aceite de cacahuete, aceite de algodón, aceite de girasol, aceite de
sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja; glicoles,
tales como propilenglicol; polioles, tales como glicerol y sorbitol,
manitol y polietilenglicol; ésteres, tales como oleato de etilo y
laurato de etilo; ágar; agentes tamponantes, tales como hidróxido de
magnesio e hidróxido de aluminio; ácido algínico; agua libre de
pirógenos; disolución salina isotónica; disolución de Ringer;
alcohol etílico; disoluciones de tampón de fosfato y otras
sustancias no tóxicas compatibles utilizadas en las formulaciones
farmacéuticas.
En ciertas formas de realización, los compuestos
utilizados en la presente invención pueden contener uno o más grupos
funcionales ácidos y, por consiguiente, son capaces de formar sales
farmacéuticamente aceptables con bases farmacéuticamente aceptables.
El término "sales farmacéuticamente aceptables" en estos casos
se refiere a las sales de bases de adición orgánicas o inorgánicas
relativamente no tóxicas, de los compuestos de la presente
invención. Dichas sales se pueden preparar in situ durante el
aislamiento y purificación final de los compuestos, o haciendo
reaccionar a parte el compuesto purificado en forma de ácido libre
con una base adecuada, tal como el hidróxido, carbonato o
bircarbonato de un catión metálico farmacéuticamente aceptable, con
amoníaco o con una amina orgánica primaria, secundaria o terciaria
farmacéuticamente aceptable. Los sales de álcalis o alcalinotérreas
representativas comprenden sales de litio, sodio, potasio, calcio,
magnesio, aluminio y semejantes. Las aminas orgánicas
representativas, de utilidad para la formación de sales de bases de
adición comprenden la etilamina, dietilamina, etilendiamina,
etanolamina, dietanolamina, piperacina y semejantes.
El término "ésteres farmacéuticamente
aceptables" se refiere a los productos esterificados
relativamente no tóxicos de los compuestos de la presente invención.
Dichos ésteres se pueden preparar in situ durante el
aislamiento y purificación final de los compuestos, o haciendo
reaccionar por separado los compuestos purificados en forma de ácido
libre o hidroxilo con el agente esterificante adecuado. Los ácidos
carboxílicos se pueden convertir en ésteres mediante el tratamiento
con un alcohol en presencia de un catalizador. El término se
pretende que incluya además grupos de hidrocarburo inferior capaces
de ser solvatados en condiciones fisiológicas, p. ej. alquil
ésteres, metíl, etíl y propil ésteres. En una forma de realización
preferida, el éster no es metil éster (ver, por ejemplo, Berge et
al., supra).
También pueden estar presentes en la composición
agentes humectantes, emulgentes y lubricantes, tales como
laurilsulfato sódico y estearato de magnesio, así como también
agentes colorantes , agentes liberadores, agentes recubrientes,
agentes edulcorantes, sabores y perfumes, conservantes y
antioxidantes.
Los ejemplos de antioxidantes farmacéuticamente
aceptables comprenden: antioxidantes solubles en agua, tales como
ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, bisulfato sódico,
metabisulfito sódico, sulfito sódico y semejantes; antioxidantes
liposolubles, tales como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol
butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, propil
gallato, alfa-tocoferol y semejantes; y agentes
quelantes de los metales, tales como ácido cítrico, ácido
etilendiaminotetracético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido
fosfórico y semejantes.
Las formulaciones de la presente invención
comprenden aquellas adecuadas para la administración intravenosa,
oral, nasal, tópica, transdermal, bucal, sublingual, rectal, vaginal
y/o parenteral. Las formulaciones se pueden convenientemente
presentar en formas de dosificación unitarias y se pueden preparar
mediante cualquier procedimiento conocido en la materia. La cantidad
de ingrediente activo que se combina con un material vehículo con el
fin de producir una forma de dosificación unitaria será generalmente
la cantidad de compuesto que produzca un efecto terapéutico.
Generalmente, dicha cantidad estará comprendida entre
aproximadamente el 1% y el 90% de ingrediente activo,
preferen-
temente entre el aproximadamente el 5% y el 70%, más preferiblemente entre aproximadamente el 10% y el 30%.
temente entre el aproximadamente el 5% y el 70%, más preferiblemente entre aproximadamente el 10% y el 30%.
Los procedimientos para preparar dichas
formulaciones o composiciones comprenden la etapa de asociar
compuestos de la presente invención con el vehículo y,
opcionalmente, uno o más ingredientes accesorios. En general, las
formulaciones se preparan asociando íntimamente un compuesto de la
presente invención con vehículos líquidos, o vehículos sólidos
finamente pulverizados, o ambos y, a continuación, si es necesario,
dando forma al producto.
Las formulaciones de la presente invención
adecuadas para la administración oral pueden estar en forma de
cápsulas, sellos, píldoras, pastillas, grageas (utilizando una base
con sabor, generalmente sacarosa y acacia o tragacanto), polvos,
gránulos o como una disolución o suspensión en un líquido acuoso o
no acuoso, o como una emulsión de aceite en agua o de agua en
aceite, o como un elixir o jarabe, o pastillas (utilizando una base
inerte, tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y acacia) y/o como
enjuagues orales y semejantes, conteniendo cada uno de ellos una
cantidad predeterminada de un compuesto de la presente invención
como ingrediente activo. Un compuesto de la presente invención
también se puede administrar como un bolo, polvo medicinal o
pasta.
En las formas de dosificación sólidas de la
presente invención destinadas a la administración oral (cápsulas,
tabletas, píldoras, grageas, polvos, gránulos y semejantes), el
ingrediente activo se mezcla con uno o más vehículos
farmacéuticamente aceptables, tales como citrato sódico o fosfato
dicálcico y/o cualquiera de los siguientes: rellenos o rellenos
tales como almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol y/o ácido
silícico; aglutinantes tales como, por ejemplo,
carboximetilcelulosa, alginatos gelatina, polivinil pirrolidona,
sacarosa y/o acacia; humectantes tales como glicerol; agentes
desintegrantes tales como ágar-ágar, carbonato cálcico, almidón de
patata o tapioca, ácido algínico, ciertos silicatos y carbonato
sódico; agentes retardantes de la disolución, tales como parafina;
aceleradores de la absorción tales como los compuestos de amonio
cuaternario; agentes humectantes tales como, por ejemplo, alcohol
cetílico y glicerol monoestearato; absorbentes, tales como el caolín
y la arcilla de bentonita; lubricantes, tales como el talco,
estearato cálcico, estearato magnésico, polietilénglicoles sólidos,
lauril sulfato sódico y mezclas de los mismos; y agentes colorantes.
En el caso de las cápsulas, tabletas y píldoras, las composiciones
farmacéuticas también pueden comprender agentes tamponantes. Se
pueden utilizar composiciones sólidas de un tipo semejante como
rellenos en cápsulas de gelatina rellenas duras y blandas utilizando
excipientes tales como lactosa o azúcares de leche, así como también
polietilenglicoles de elevado peso molecular y semejantes.
Una tableta se puede preparar por compresión o
moldeo, opcionalmente con uno o más ingredientes accesorios. Las
tabletas comprimidas se pueden preparar utilizando aglutinantes (por
ejemplo, gelatina o hidroxipropilmetil celulosa), lubricantes,
diluyentes inertes, conservantes, desintegrantes (por ejemplo,
glicolato de almidón sódico o carboximetil celulosa entrelazada),
agentes surfactantes o dispersantes. Las tabletas moldeadas se
pueden fabricar en una máquina adecuada por moldeo de una mezcla
humedecida del compuesto en polvo con un diluyente líquido
inerte.
Las tabletas y otras formas de dosificación
sólidas de las composiciones farmacéuticas de la presente invención,
tales como los sobres, cápsulas, píldoras y gránulos, opcionalmente
se pueden preparar con recubrimientos o envolturas, tales como
recubrimientos entéricos y otros recubrimientos bien conocidos en la
materia de las formulaciones farmacéuticas. También se pueden
formular con el fin de proporcionar una liberación lenta o
controlada del ingrediente activo contenido en esta utilizando, por
ejemplo, hidroxipropilmetil celulosa en diversas proporciones con el
fin de proporcionar el perfil de liberación deseado, otras matrices
poliméricas, liposomas y/o microesferas. Pueden estar esterilizadas
mediante, por ejemplo, filtración a través de un filtro que retiene
las bacterias, o por incorporación de agentes esterilizantes en
forma de composiciones sólidas estériles que se pueden disolver en
agua estéril, o algún otro medio inyectable estéril inmediatamente
antes de su utilización. Dichas composiciones también pueden
opcionalmente contener agentes opacos y pueden tener una composición
que libere el ingrediente(s) activo solamente, o
preferiblemente, en cierta parte del tracto intestinal,
opcionalmente, de modo retardado. Los ejemplos de composiciones
empotrantes que se pueden utilizar comprenden sustancias poliméricas
y ceras. El ingrediente activo también puede estar en forma micro
encapsulada, si es adecuado, con uno o más de los excipientes
anteriormente descritos.
Las formas de dosificación líquidas destinadas a
la administración oral de los compuestos de la presente invención
comprenden emulsiones farmacéuticamente aceptables, microemulsiones,
disoluciones, suspensiones, jarabes y elixires. Además del
ingrediente activo, las formas de dosificación líquidas pueden
contener diluyentes inertes comúnmente utilizados en la materia,
tales como, por ejemplo, agua u otros disolventes, agentes
disolventes, y agentes emulgentes, tales como alcohol etílico,
alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol
bencílico, bencilbenzoato, propilenglicol,
1,3-butilenglicol, aceites (en particular, aceite de
algodón, nueces trituradas, maíz, germen, oliva, ricino y sésamo),
glicerol, tetrahidrofuril alcohol, polietilenglicoles y ésteres de
ácidos grasos de sorbitano y mezclas de los mismos.
Además de los disolventes inertes, las
composiciones orales también pueden incluir adyuvantes tales como
agentes humectantes, suspensionantes y emulgentes, edulcorantes,
saborizantes, colorantes, perfumes y conservantes.
Las suspensiones, además del compuesto activo,
pueden contener agentes suspensionantes tales como por ejemplo,
alcoholes isoestearílicos etoxilados, polioxietilen sorbitol y
ésteres de sorbitano, celulosa microcristalina, metahidróxido de
aluminio, bentonita, ágar-ágar y tragacanto y mezclas de los
mismos.
Las formulaciones de las composiciones
farmacéuticas de la presente invención destinadas a la
administración rectal o vaginal pueden presentarse en forma de
supositorios, que se pueden preparar mediante la mezcla de uno o más
de los compuestos de la invención con uno o más de los excipientes
no irritantes y vehículos adecuados que comprenden, por ejemplo,
manteca de coco, polietilenglicol, una cera para supositorios o
salicilato que es sólida a temperatura ambiente, pero líquida a la
temperatura corporal y que por consiguiente se fundirá en el recto o
la cavidad vaginal y liberará el compuesto activo.
Las formulaciones de la presente invención
adecuadas para la administración vaginal también comprenden
formulaciones para pesarios, tampones, cremas, gelatinas, pastas,
espumas o rociados que contienen dichos vehículos en la forma
adecuada conocida en la materia.
Las formas de dosificación destinadas a la
administración tópica y transdermal de un compuesto de la presente
invención comprenden polvos, rociados, ungüentos, pastas, cremas,
lociones, gelatinas, disoluciones, parches e inhaladores. El
compuesto activo se puede mezclar en condiciones estériles con un
vehículo farmacéuticamente aceptable y con cualquier conservante,
tampón o propelente que sea necesario.
Los ungüentos, pastas, cremas y gelatinas pueden
contener, además de un compuesto activo de la presente invención,
excipientes tales como grasas animales y vegetales, aceites, ceras,
parafinas, almidón, tragacanto, derivados de celulosa,
polietilenglicoles, siliconas, bentonitas, ácido silícico, óxidos de
talco y zinc, o mezclas de los mismos.
Los polvos y rociados pueden contener, además del
compuesto de la presente invención, excipientes tales como lactosa,
talco, ácido silícico, hidróxido de aluminio, silicatos cálcicos y
polvo de poliamida o mezclas de dichas sustancias. Los rociados
pueden contener además los propelentes acostumbrados, tales como
clorfluorohidrocarburos e hidrocarburos volátiles no sustituidos,
tales como butano y propano.
Los parches transdermales presentan la ventaja
añadida de proporcionar una administración controlada en el cuerpo
del compuesto de la presente invención. Dichas formas de
dosificación se pueden preparar disolviendo o dispersando el
compuesto en el medio adecuado. También se pueden utilizar
amplificadores de la absorción con el fin de incrementar el flujo
del compuesto a través de la piel. La velocidad de flujo se puede
controlar mediante una membrana de control de flujo o dispersando el
compuesto activo en una matriz polimérica o gel.
También se contemplan en el ámbito de la presente
invención las formulaciones oftálmicas, los ungüentos para ojos,
polvos, disoluciones y semejantes.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas de la
presente invención destinadas a la administración parenteral
comprenden uno o más compuestos de la presente invención en
combinación con una o más disoluciones, dispersiones, suspensiones o
emulsiones estériles isotónicas acuosas o no acuosas
farmacéuticamente aceptables o polvos estériles que se pueden
reconstituir justo antes de su utilización en una disolución o
dispersión inyectable estéril, que puede contener antioxidantes,
tampones, bacteriostáticos, solutos que hagan a la disolución
isotónica con la sangre o el receptor al que se dirige, o
suspensiones o agentes espesantes.
Los ejemplos de vehículos acuosos y no acuosos
que se pueden utilizar en las composiciones farmacéuticas de la
presente invención comprenden agua, etanol, polioles (tales como
glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y semejantes) y mezclas
adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de
oliva y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo.
La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante la
utilización de materiales de recubrimiento, tales como lecitina,
mediante el mantenimiento del tamaño de partícula necesario en el
caso de las dispersiones y mediante la utilización de
surfactantes.
Dichas composiciones también pueden contener
adyuvantes tales como conservantes, agentes humectantes, agentes
emulgentes y agentes dispersantes. La acción de los microorganismos
se puede evitar mediante la inclusión de diversos agentes
antibacterianos y antifúngicos, tales como por ejemplo, parabeno,
clorobutanol, ácido sórbico fenol y semejantes. También puede ser
deseable incluir en las composiciones agentes isotónicos, tales como
azúcar, cloruro sódico y semejantes. Además, se puede lograr la
absorción prolongada de las formas farmacéuticas inyectables
mediante la inclusión de agentes que retardan la absorción tales
como monoestearato de aluminio y gelatina.
En algunos casos, con el fin de prolongar el
efecto de un fármaco, es deseable retardar la absorción del fármaco
en las inyecciones intramusculares o subcutáneas. Ello se puede
lograr mediante la utilización de una suspensión líquida de material
cristalino o amorfo con poca solubilidad en agua. En dicho caso la
velocidad de absorción del fármaco depende de su velocidad de
disolución que, a su vez, puede depender del tamaño de los cristales
y de la forma cristalina. Por el contrario, la absorción retardada
de una composición farmacéutica administrada parenteralmente se
logra disolviendo o suspendiendo el fármaco en un vehículo de
aceite.
Las formas en depósitos inyectables se producen
generando matrices de microcápsulas de los compuestos sujeto en
polímeros biodegradables tales como
poliláctido-poliglicólido. Dependiendo de la
proporción de fármaco a polímero y de la naturaleza del polímero
utilizado en particular, se puede controlar la velocidad de
liberación del fármaco. Los ejemplos de otros polímeros
biodegradables comprenden poli(ortoésteres) y
poli(anhídridos). Las formulaciones en depósitos inyectables
también se preparan mediante la retención del fármaco en liposomas o
microemulsiones compatibles con los tejidos corporales.
Las preparaciones de la presente invención se
pueden administrar oralmente, parenteralmente, tópicamente
rectalmente. Desde luego se administran mediante formas adecuadas
para cada vía de administración. Por ejemplo, se administran en
forma de tabletas o cápsulas, inyección, inhalación, loción ocular,
ungüento, supositorio, etc. se administran mediante inyección,
infusión o inhalación; de forma tópica mediante loción o ungüento; y
por vía rectal mediante supositorios. La administración por
inyección intravenosa es preferible.
Las frases "administración parenteral" y
"administrado parenteralmente" tal como se utilizan en la
presente memoria significan formas de administración diferentes de
la administración enteral o tópica, generalmente mediante inyección
y comprende, sin limitarse a ellos, la inyección o infusión
intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal,
intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradermál,
intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular,
intraarticular, subcapsular, subaracnoide, intraespinal e
intraesternal.
Las frases "administración sistémica" y
"administrado sistémicamente", "administración periférica"
y "administrado periféricamente" tal como se utilizan en la
presente solicitud significan la administración de un compuesto,
fármaco u otro material de modo diferente a la administración
directa en el sistema nervioso central, de modo que entre el sistema
del paciente y, de tal modo quede sujeta al metabolismo y otros
procesos semejantes, por ejemplo, la administración subcutánea.
Se pueden administrar dichos compuestos a los
seres humanos y a otros animales con fines terapéuticos mediante la
vía de administración adecuada, que comprende la oral, nasal, como
por ejemplo, un pulverizado, retal, intravaginal, parenteral,
intracisterna y tópica, tal como mediante polvos, ungüentos o gotas
que comprenden orales y sublinguales.
Independientemente de la vía de administración
seleccionada, los compuestos utilizados en la presente invención, se
pueden utilizar en una forma adecuadamente hidratada y/o las
composiciones farmacéuticas de la presente invención, se formulan en
formas de dosificación farmacéuticamente aceptables mediante los
procedimientos convencionales conocidos por los expertos en la
materia.
Los niveles de dosificación de los ingredientes
activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención
se pueden modificar con el fin de obtener la cantidad de ingrediente
activo efectiva para lograr la respuesta terapéutica deseada en un
paciente en particular, composición y modo de administración, sin
que sea tóxico para el paciente.
Los niveles de dosificación seleccionados
dependen de una multiplicidad de factores que comprenden la
actividad del compuesto particular de la presente invención, o del
éster, sal o amida del mismo, la vía de administración, el tiempo de
la administración, la velocidad de excreción del compuesto
particular que se utiliza, la duración del tratamiento, otros
fármacos, compuestos y/o materiales utilizados en combinación con el
compuesto particular utilizado, edad, género, peso, afecciones,
salud en general e historial médico previo del paciente que se
trata, y factores semejantes conocidos en la medicina.
Un médico o veterinario con conocimientos
ordinarios en la materia puede determinar y prescribir fácilmente
las cantidades efectivas de las composiciones farmacéuticas
necesarias. Por ejemplo, el médico o veterinario podría iniciar
dosis de los compuestos de la presente invención utilizados en las
composiciones farmacéuticas a niveles inferiores a los necesarios
con el fin de lograr los efectos terapéuticos deseados e incrementar
gradualmente la dosis hasta lograr el efecto deseado.
En general una dosis diaria de un compuesto según
la presente invención será la menor cantidad de compuesto que
produzca un efecto terapéutico. Dicha dosis efectiva generalmente
dependerá de los factores descritos anteriormente. En general, las
dosis intravenosas y subcutáneas de los compuestos según la presente
invención para un paciente, cuando se utilizan con el fin de lograr
los efectos analgésicos indicados, estarán comprendidas entre
aproximadamente 0,0001 y 100 mg por kg de peso corporal por día,
preferentemente entre aproximadamente 0,01 y 50 mg por kg y por día
y todavía más preferiblemente entre aproximadamente 0,1 y
aproximadamente 40 mg por kg y día. Por ejemplo, se administras por
cada 20 gramos de peso del sujeto entre aproximadamente 0,01
microgramos y 20 microgramos, entre aproximadamente 20 microgramos y
100 microgramos y entre aproximadamente 10 microgramos y 200
microgramos del compuesto de la presente invención.
Si se desea, la dosis efectiva diaria de
compuesto activo se puede administrar como dos, tres, cuatro, cinco
o seis o más sub-dosis administradas por separado a
intervalos de tiempo adecuados durante el día, opcionalmente, en
formas de dosificación unitarias.
En la siguiente descripción de los experimentos,
las formas de realización, en caso de que no se encuentren
comprendidas dentro del alcance de las reivindicaciones, se retienen
ya que son útiles para una mejor comprensión de la invención.
TNF\alpha recombinante humano y murino y
GM-CSF humano recombinante fueron obtenidos de
Boehringer Mannheim (Indianápolis, IN). Medio de Dulbeco PBS (libre
de Mg^{++} y Ca^{++}), RPMI-1640 y FCS se
adquirieron de Bio Whitaker Inc. (Walkersville, MD).
Ficoll-Hypaque fue de Organon Teknika Corp. (Durham,
NC) y la disolución equilibrada en sales de Hank se adquirió de
Gibco BRL (Grand Island, NY). La albúmina de suero bovino, dextrano,
antibióticos, L-glutamina, citocromo C, superóxido
dismutasa y zimosano se obtuvieron de Sigma (St. Louis, MO). El
ensayo de IL-1\beta humana en los sobrenadantes se
realizó utilizando un ensayo inmunométrico con acetilcolina esterasa
(Cayman Chemical, Ann Arbor, MI). La IL-1\beta
murina se ensayó utilizando un equipo ELISA de Endogen (Woburn, MA).
Los ELISAs para IL-4 e IL-10 fueron
de Amersham (Arlington Heights, IL); los ELISAS para
MPIP-2 e IL-13 fueron de R&D
Systems (Minneapolis, MN). Los análogos metabólicamente estables de
LXA_{4} y ATL se prepararon y caracterizaron, incluida la
espectroscopia de resonancia magnética nuclear, tal como se indica
en (14). Las concentraciones de cada uno de los análogos de LX se
determinaron utilizando un coeficiente de extinción de 50.000
M^{-1}. cm^{-1} inmediatamente antes de cada experimento. Cuando
se indique, los análisis estadísticos se realizaron utilizando el
ensayo t de Student no-apareado (de dos colas) y se
consideró que se logró significancia (*) cuando P fue <
0,05.
Se recogió sangre venosa de donantes saludables
bajo condiciones de esterilidad utilizando dextrosa citrato ácido
(ACD) como anticoagulante y se aislaron los PMN tal como se describe
en (15). Se suspendieron los PMN en medio de Hank frío (4ºC)
(suplido con 1,6 mM Ca^{++}, 0,1% de FCS, 2 mM
L-glutamina, 1% de penicilina y 2% de
estreptomicina, pH 7,4).
Las preparaciones celulares mostraron > 98% de
PMN tal como se determinó mediante tinción
Giemsa-Wright; la viabilidad celular fue > 98%
tal como se determinó mediante exclusión de azul trypan y
microscopía. Con el fin de examinar la producción de superóxido, se
incubaron PMN (1,0 x 10^{6}/ml) a 37ºC (3 min.) y a continuación
se expusieron a vehículo (0,1% de etanol) o LXA_{4} sintético, 15
R/S-metil LXA_{4}, o
16-fenoxi-LXA_{4} durante 5
minutos a 37ºC. Antes de añadir TNF\alpha (50 ng/ml), los PMN se
incubaron con citocromo C (0,7 mg/ml) durante 10 min. a 37ºC. La
reducción del citocromo C dependiente de la superóxido dismutasa se
determinó poniendo los tubos rápidamente en un baño de hielo. La
cantidad de reducción del citocromo C en cada sobrenadante se
determinó a 550 nm con referencia a valores control obtenidos cuando
la superóxido dismutasa se añadió antes de un estímulo o vehículo
control. La reducción del citocromo C se cuantificó utilizando un
coeficiente de extinción de 21,1/mmol/L.
La extracción total de ARN y los análisis por
transferencia Northern se llevaron a cabo como en (7). El vector
pSM320 que contiene ADNc para IL-1\beta fue
adquirido por ATCC.
Se obtuvieron ratones BALB/c machos de seis a
ocho semanas de edad de Taconic Farms (Germantown, NY). Se generaron
bolsas de aire en el dorso mediante inyección s.c. de 3 ml de aires
estéril los días 0 y 3. Todos los experimentos se realizaron el día
6 (16).
Las bolsas de aire individuales (una por ratón)
se inyectaron con vehículo solamente (0,1% de etanol), TNF\alpha,
15 R/S-metil-LXA_{4} o TNF\alpha
más 15 R/S-metil-LXA_{4}, cada uno
suspendido en 1 ml de PBS libre de endotoxina inmediatamente antes
de la inyección en la cavidad de las bolsas. A intervalos dados, se
sacrificaron los ratones y se lavaron las bolsas de aire
individuales tres veces con PBS estéril (1 ml). Los exudados se
centrifugaron a 2000 rpm (5 minutos) y se extrajeron los
sobrenadantes. Los precipitados de células se suspendieron en PBS
(200 \mul) con el fin de contarlas y valorar su viabilidad. Se
mezclaron cincuenta \mul de cada suspensión de células con 150
\mul de 30% de BSA y a continuación se centrifugaron en
portaobjetos destinados a la microscopía a 500 rmp durante 5 minutos
utilizando una centrífuga Cytospin, se secaron al aire y se tiñeron
con Giemsa-Wright.
El TNF\alpha aunque es un modesto agonista de
la generación de O_{2}^{-} por los PMN humanos, es un estímulo
fisiológicamente relevante para la generación de especies de oxígeno
reactivo (ROS) por los PMN humanos que puede desempeñar una función
crítica en el daño local de los tejidos durante la inflamación y la
reperfusión [Tsujii, M., S. Kawano, S. Tsuji, H. Sawaoka, M. Hori,
and R.N. DuBois 1998. Cyclooxigenase regulates angiogenesis induced
by colon cancer cells, Cell 93:705-716;
Shibuya, H., N. Ohkohchi, S. Tsukamoto, and S. Satomi 1997. Tumor
necrosis factor-induced,
superoxide-mediated neutrophil accumulation in cold
ischemic/reperfused rat liver. Hepatology
26:113-120 (1997); Jaeschke, H., A. Farhood, and
C.W. Smith 1990. Neutrophils contribute to ischemia/reperfusion
injury in rat liver in vivo. FASEB J.
4:3355-3359 (1990)]. En la Figura 1, se valora
la el impacto de LXA_{4} y los análogos bioactivos estables
relacionados con ATL sobre la producción de anión de superóxido
estimulada por TNF\alpha. El LXA_{4} nativo y los análogos (15
R/S-metil-LXA_{4} y 16
fenoxi-LXA_{4}) inhibieron la generación de anión
de superóxido estimulada por TNF\alpha de modo dependiente de la
concentración. Su clasificación por potencia a 10 nM fue 15
R/S-metil-LXA_{4} (81,3 + 14,1% de
inhibición) '' 16 fenoxi-LXA_{4} (93,7 + 3,2%)
> LXA_{4} (34,3 + 2,3%). 15
R/S-metil-LXA_{4} cubre tanto
LXA_{4} como ATL en estructura y
16-fenoxi-LXA_{4} es un análogo de
LXA_{4} (ver Figura 1). Cada análogo compite con el receptor
LXA_{4}. [Takano, T., S. Fiore, J.F. Maddox, H.R. Brady, N.A.
Petasis, and C.N. Serhan. Aspirin-triggered
15-epi-lipoxin A_{4} y LXA_{4}
stable analogs are potent inhibitors of acute inflammation: Evidence
for anti-inflamatory receptors. J. Exp. Med.
185:1693-1704). Ni LXA_{4}, 15
R/S-metil-LXA_{4} ni 16
fenoxi-LXA_{4}, a concentraciones de hasta 1000 nM
añadidos a las células solas, estimuló la generación de ROS. 15
R/S-metil-LXA_{4} y 16
fenoxi-LXA_{4} fueron tres veces más potentes que
el LXA_{4} nativo y demostraron ser inhibidores potentes de la
generación de superóxido por los PMN estimulada por TNF\alpha. Sin
embargo, ni LXA_{4} ni sus análogos inhibieron a los PMN (100 nM;
n = 3; no mostrado) o estimularon la producción de 0_{2}^{-} por
fMLP. La inhibición de ROS por LXA_{4} y sus análogos es de
interés en un contexto de isquemia/rperfusión, en el que ROS se
considera que son los principales mediadores del daño a los tejidos
(15).
Los PMN expresan o liberan
interleucina-1\beta, que es una citocina
proinflamatoria potente [Dinarello, C.A. Biologic basis for
interleukin-1\beta in disease. Blood
87:2095-2147 (1996)]. Por consiguiente, se
investigaron las acciones de la LXA_{4} nativa y sus análogos
sobre la IL-1\beta inducida por TNF\alpha. La
incubación de PMN con concentraciones fisiológicamente relevantes de
TNF\alpha, GM-CSF o partículas fagocíticas
(zimosano) produjo un incremento de los niveles de
IL-1\beta en los sobrenadantes dependiente de la
concentración. Las EC_{50} aproximadas para cada agonista fueron:
TNF\alpha, 10 ng/ml; GM-CSF, 10 U/ml y zimosano,
100 \mug/ml. La LXA_{4} nativa inhibió específicamente la
liberación de IL-1\beta inducida por TNF\alpha
(Fig. 2A), mientras que en presencia o ausencia de LXA_{4} se
liberaron cantidades semejantes de IL-1\beta
cuando se expusieron los PMN a GM-CSF o
zimosano.
Se expusieron los PMN a concentraciones
crecientes de 15
R/S-metil-LXA_{4},
16-fenoxi-LXA_{4} o LXA_{4}
nativa en presencia de TNF\alpha (10 ng/ml) o solamente vehículo.
A una concentración de 100 nM, la 15
R/S-metil-LXA_{4} inhibió
aproximadamente el 60% de la liberación de
IL-1\beta y la
16-fenoxi-LXA_{4} a niveles
equimolares produjo aproximadamente un 40% de inhibición (valores
comparables a los obtenidos con LXA_{4} nativa). La evolución
temporal y la dependencia de la concentración se analizaron con 15
R/S-metil LXA_{4} (Fig. 2B). A 10 nM, la 15
R/S-metil-LXA_{4} produjo una
clara inhibición estadísticamente significativa, evidente en 6 horas
y todavía más prominente a las 24 horas (Fig. 2B). La inhibición de
IL-1\beta por estos análogos de LX fue, por lo
menos parcialmente, consecuencia de una regulación negativa de la
expresión génica, ya que los niveles de RNA mensajero de
IL-1\beta en las células tratadas con TNF\alpha
(10 ng/ml) más 15
R/S-metil-LXA_{4} (100 nM)
disminuyeron en aproximadamente un 60% cuando se compararon con
células tratadas con TNF\alpha solamente (Fig. 3). Por
consiguiente, debido a que la IL-1\beta y el
TNF\alpha son dos citocinas consideradas importantes en la
inflamación, la inhibición de IL-1\beta observada
(Figs. 1 y 2) sugirió que la 15
R/S-metil-LXA_{4} podría ejercer
una potente acción anticitociana in vivo (vide
infra).
Con el fin de investigar si el receptor de
LXA_{4} (LXA_{4}-R) estaba implicado en la
regulación de la liberación de IL-1\beta
estimulada por TNF\alpha, se utilizaron los anticuerpos de conejo
contra una parte del tercer dominio extracelular (ASWGGTPEERLK) de
la LXA_{4}-R preparado anteriormente [Fiore, S.,
and C.N. Serhan. Lipoxin A_{4} receptor activation is distinct
from that of the formyl peptide receptor in myeloid cells:
inhibition of CD11/18 expression by lipoxin
A_{4}-lipoxin A_{4} receptor interactions.
Biochemistry 34:16678-16686 (1995)]. Se
incubaron los PMN con aproximadamente 50 \mug/ml de IgG preinmune
purificada con proteína-A o con IgG contra
LXA_{4}-R durante 1 hora a 4ºC antes de la
exposición a TNF\alpha (10 ng/ml) y 15
R/S-metil-LXA_{4} (100 nM). Los
anticuerpos anti LXA_{4}-R evitaron la liberación
de IL-1\beta por TNF\alpha, lo que sugiere que
el tercer lazo intercelular realiza una función crucial en la
activación de receptor de LXA_{4} (Fig. 4). 15
R/S-metil-LXA_{4} inhibió
aproximadamente el 50% de la liberación de
IL-1\beta. Cuando se añadieron a la vez, los
anticuerpos anti-LXA_{4}-R y 15
R/S-metil-LXA_{4} en presencia de
TNF\alpha no se inhibió más la aparición de
IL-1\beta y ni los anticuerpos
anti-LXA_{4}-R ni la 15
R/S-LXA_{4} por si solos estimularon la aparición
de cantidades significantes de IL-1\beta en los
sobrenadantes. Los resultados de dichos experimentos son dobles:
primero, indican que la acción inhibidora de 15
R/S-metil-LXA_{4} se transduce por
vía del receptor de LXA_{4} y segundo, que los anticuerpos
anti-LXA_{4}-R por si solos
activan el receptor LXA_{4} y producen la inhibición de la
liberación de IL-1\beta.
Debido a que el TNF\alpha evoca la infiltración
de los leucocitos de un modo dependiente de las quimioquinas en las
bolsas de aire murinas de seis días, se evaluó el impacto de la 15
R/S-metil-LXA_{4} en dicho modelo
con el fin de determinar si LXA_{4} o ATL también intersecaban con
el eje citocina-quimioquina in vivo [Tessier,
P.A., P.H. Naccache, I. Clark-Lewis, R.P. Gladue,
K.S. Neote and S.R. McColl. Chemokine networks in vivo:
involvement of C-X-C and
C-C chemokines in neutrophil extravasation in
vivo in response to TNF-\alpha. J. Immunol.
159:3595-3602; Sin, Y.M., A.D. Sedgwick, E.P.
Chea, and D.A. Willoughby 1986. Mast cells in newly formed lining
tissue during acute inflammation: a six day air pouch model in the
mouse. Ann. Rheum. Dis. 45:873-877]. La 15
R/S-metil-LXA_{4} es la
modificación más sutil de la estructura de la LXA_{4} nativa y ATL
con adición de un metilo en le carbono 15. El TNF\alpha murino (10
ng/ml) produjo una infiltración transitoria de leucocitos en las
bolsas de aire de modo dependiente del tiempo y con un máximo de
acumulación a las 4 horas. El 15
R/S-metil-LXA_{4} a 25 nmoles
inhibió en un 62% el reclutamiento de leucocitos estimulado por
TNF\alpha en las bolsas de aire (Fig. 5). La inhibición fue
evidente en 1 h y máxima entre 2 h y 4 h. En estos intervalos, se
observó una inhibición superior al 60% en la infiltración de
leucocitos que permaneció significativamente reducida a las 8 h
(Fig. 5, inserto). La inyección de las bolsas con vehículo o con el
análogo solamente no produjo una infiltración de leucocitos
significativa. También, se recogieron los exudados inflamatorios a
las 4 horas después de la inyección con vehículo solo, TNF\alpha,
15 R/S-metil-LXA_{4} solos o
TNF\alpha más 15
R/S-metil-LXA_{4} y se nombraron
los tipos celulares. En las bolsas administradas con TNF\alpha,
los PMN constituyeron el principal tipo celular presente en los
exudados a las 4 horas y constituyeron entre el 80 y el 85% del
número total de células. La administración tanto de 15
R/S-metil-LXA_{4} como de
TNF\alpha en la cavidad de las bolsas de aire de 6 días inhibió la
migración de los PMN y eosinófilos/basófilos así como también de las
células mononucleares (Tabla 1). Interesantemente, la administración
de 15 R/S-metil-LXA_{4} solamente
evocó un pequeño pero estadísticamente significativo incremento del
influjo celular (Tabla 1), un resultado consistente con
observaciones anteriores in vitro en las que se observó la
estimulación específica de los monocitos y la inhibición de la
quemiotaxis de los PMN [Maddox, J.F., M. Hachica, T. Tacano, N.A.
Petasis, V.V. Fokin, and C.N. Serhan 1997. Lipoxin A_{4} stable
analogs are potent mimetics that stimulate human monocytes and
THP-1 cells via a G-protein linked
lipoxin A_{4} receptor. J. Biol. Chem.
272:6972-6978].
| Número de leucocitos presentes en la bolsa (x10^{6}) | |||
| Inyección | neutrófilos | Eosinófilos/basófilos | Monocitos/macrófagos |
| TNF\alpha | 2,4 \pm 0,1* | 0,30 \pm 0,01* | 0,20 \pm 0,01* |
| 15 R/S-metil LXA_{4} | 0,98 \pm 0,10** | 0,13 \pm 0,01** | 0,10 \pm 0,01** |
| + TNF\alpha | (59,1%) | (56,0%) | (50%) |
| 15 R/S-metil-LXA_{4} | 0,25 \pm 0,01 | 0,03 \pm 0,01 | 0,14 \pm 0,01* |
| Vehículo | 0,30 \pm 0,01 | 0,07 \pm 0,01 | 0,06 \pm 0,01 |
| \begin{minipage}[t]{150mm} \ding{61}Se lavaron las bolsas de aire tal como se describe en Materiales y Métodos. Cada ratón se inyectó con 1 ml de PBS conteniendo vehículo (0,1% de etano), TNF\alpha (10 ng), 15 R/S-metil-LXA_{4} (25 nmoles) o TNF\alpha más 15 R/S-metil-LXA_{4}. Se determinó la infiltración de leucocitos a las 4 horas post inyección. Los resultados representan la media \pm SEM de tres ratones diferentes. El porcentaje de inhibición se indica entre paréntesis. * diferencias estadísticamente significativas con los ratones inoculados con vehículo (p < 0,01) y ** con los ratones inoculados con TNF\alpha (p <0,01).\end{minipage} |
Debido a que MIP-2 es la
principal quimioquina implicada en el reclutamiento de los PMN en la
bolsa de aire después de la inyección de TNF\alpha, se determinó
la acción de 15 R/S-metil-LXA_{4}
en dicho eje citocina-quimioquina inducido por
TNF\alpha. MIP-2 e IL-1\beta son
importantes citocinas proinflamatorias e IL-4,
IL-10 e IL-13 presenta propiedades
inmunoreguladoras [Isomaki, P., y J. Punnonen 1997. Pro- y
anti-inflamatory cytokines in rheumatoid arthritis.
Ann. Med. 29:499-507; Volpert, O.V., T. Fong,
A.E. Koch, J.D. Peterson, C. Waltenbaugh, R.I. Tepper, and N.P.
Bouck. Inhibition of angiogenesis by interleukin 4. J. Exp. Med.
188:1039-1046]. Se recogieron los exudados de
intervalos de tiempo seleccionados y se valoraron los sobrenadantes
libres de células con el fin de determinar la presencia de dichas
citocinas murinas. TNF\alpha indujo las máximas cantidades
detectables de MIP-2 e IL-1\beta
en 90 minutos (no mostrado). La 15
R/S-metil-LXA_{4} (25 nmoles)
inhibió la liberación de MIP-2 e
IL-1\beta inducida por TNF\alpha en un 48% y 30%
respectivamente (Fig. 6). En las bolsas de aire la 15
R/S-metil-LXA_{4} solamente no
estimuló la liberación de MIP-2 o
IL-1\beta. Por el contrario, la 15
R/S-metil-LXA_{4} estimuló la
aparición de IL-4 en los exudados. Dicha
estimulación de IL-4 se observó tanto en ausencia
como en presencia de TNF\alpha. No se detectó ni
IL-10 ni IL-13 en los exudados de
las bolsas. Dichos resultados demuestran que la administración de 15
R/S-metil-LXA_{4} modificó el eje
citocina-quimioquina en la inflamación aguda
iniciada por TNF\alpha e, interesantemente, dicha
re-orientación del eje
citocina-quimioquina tuvo lugar en paralelo con la
reducción de la infiltración de leucocitos.
Se han explorado múltiples estrategias diferentes
en intentos con el fin de atenuar las acciones indeseables del
TNF\alpha en la enfermedad inflamatoria y en el daño por
isquemia/reperfusión, incluido el tratamiento de los pacientes que
sufren de artritis reumatoide con fragmentos Fc específicos de
anticuerpos monoclonales dirigidos contra el receptor de TNF\alpha
(26). Se utilizan extensamente diferentes fármacos esteroideos y
no-esteroideos con el fin de aliviar el dolor y la
gravedad de las respuestas inflamatorias (Marriott, J.B., M. Westby,
and A.G. Dalgleish 1997. Therapeutic potential of TNF\alpha
inhibitors old and new. DDT 2:273-282]. Sin
embargo, ciertas situaciones clínicas, tales como el daño por
reperfusión, todavía no están bien controladas y se necesitan nuevos
agentes terapéuticos. Los resultados presentes indican que LXA_{4}
y ATL, tal como evidencian las acciones de sus análogos metabólicos
estables (16-fenoxi-LXA_{4} y 15
R/S-metil-LXA_{4}), son potentes
mediadores lipídicos reguladores de las citocinas que también pueden
afectar el proceso inflamatorio iniciado por TNF\alpha e
IL-1\beta. Se considera que estas dos citocinas
son componentes clave en la orquestación de los rápidos eventos
semejantes a los inflamatorios en la isquemia/reperfusión (en
minutos a horas) y son las principales citocinas en la artritis
reumatoide y otras muchas enfermedades crónicas. Interesantemente,
en un modelo de exudado y herida cutánea, la 15
R/S-metil-LXA_{4} no solamente
inhibió la aparición de IL-1\beta inducido por
TNF\alpha y MIP-2, sino que también estimuló a la
vez IL-4 (Figs. 5 y 6). Ello representa la primera
observación de que las lipoxinas inducen la regulación positiva de
una citocina "antiinflamatoria" potencial tal como la
IL-4. En consecuencia, es de particular interés que
la IL-4 inhiba el influjo de PMN en la inflamación
aguda mediada por anticuerpos e inhibe la producción de
H_{2}O_{2} por los monocitos humanos tratados con IFN\gamma
[Saleem, S., Z. Dai, S.N. Coelho, B.T. Konieczny, K.J.M. Assmann,
F.K. Baddoura y F.G. Lakkis, 1998. IL-4 is an
endogenous inhibitor of neutrophil influx and subsequent pathology
in acute antibody-mediated inflammation.
J.Immunol. 160:979-984; Lehn, M., W.Y.
Weiser, S. Engelhorn, S. Gillis, and H.G. Remold, 1989.
IL-4 inhibits H_{2}O_{2} production and
antileishmanial capacity of human cultured monocytes mediated by
IFN-\gamma. J. Immuno.
143:3020-3024]. La IL-4 también
es un agente antitumoral activo y muy recientemente se ha demostrado
que es un potente inhibidor de la angiogénesis [Volpert, O.V., T.
Gong, A.E. Koch, J.D. Peterson, C. Waltenbaugh, R.I. Tepper and N.P.
Bouck, 1998. Inhibition of angiogenesis by interleukin 4. J. Exp.
Med. 188:1039-1046]. Por consiguiente es posible
que el incremento en los niveles de IL-4 estimulados
por los análogos de LX metabólicamente estables puedan mediar
parcialmente algunos de los impactos que la LXA_{4} y la
15-epi-LXA_{4} presentan in
vivo, un hallazgo que abre un nuevo conocimiento de la relación
entre las citocinas "antiinflamatorias" y los mediadores
lipídicos.
En conclusión, la LXA_{4} y la LXA_{4}
inducida por la aspirina parecen estar implicadas en el control de
tanto las respuestas inflamatorias agudas como crónicas. Los
resultados presentados en la presente memoria apoyan la noción de
que la aspirina puede ejercer parte de su acción beneficiosa por vía
de la biosíntesis de la LXA_{4} endógena inducida por aspirina que
a su vez actúa directamente sobre las PMN y/o la aparición de
IL-4. Por consiguiente, la LX-ATL
puede proteger los tejidos del huésped por la vía de la regulación a
múltiples niveles de las señales
pro-inflamatorias.
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lipoxin A_{4} receptor, J. Biol. Chem. 272:
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25. Volpert, O.V., T. Fong, A.E.
Koch, J.D. Peterson, C. Waltenbaugh, R.I.
Tepper, and N.P. Bouck. 1998. Inhibition of
angiogenesis by interleukin 4. J. Exp. Med.
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26. Moreland, L.W., S.W.
Baumgartner, M.H. Schiff, E.A. Tindall, R.M.
Fleischmann, A.L. Weaver, R.E. Ettlinger, S.
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27. Marriott, J.B., M. Westby, and
A.G. Dalgleish. 1997. Therapeutic potential of
TNF-\alpha inhibitors old and new. DDT
2:273-282.
28. Saleem, S., Z. Dai, S.N.
Coelho, B.T. Konieczny, K.J.M. Assmann, F.K.
Baddoura, and F.G. Lakkis. 1998.
IL-4 is an endogenous inhibitor of neutrophil influx
and subsequent pathology in acute antibody-mediated
inflammation. J. Immunol. 160:979-984.
29. Lehan, M., W.Y. Wiser, S.
Engelhorn, S. Gillis, and H.G. Remold.
1989. IL-4 inhibits H_{2}0_{2} production
and antileishmanial capacity of human cultured monocytes mediated by
IFN-\gamma. J. Immunol.
143:3020-3024.
Un experto en la materia apreciará otras
características y ventajas de la presente invención con base en las
anteriores formas de realización. En consecuencia, la presente
invención no queda limitada por lo que se ha mostrado y descrito en
particular, excepto tal como se indica mediante las reivindicaciones
adjuntas.
Claims (2)
1. Utilización de un análogo de lipoxina de
fórmula general
en la que X es R_{1}, OR_{1} o
SR_{1},
en la que R_{1} es
- (i)
- un átomo de hidrógeno;
- (ii)
- un alquilo de entre 1 y 8 átomos de carbono, inclusive, que puede ser de cadena lineal o ramificada;
- (iii)
- un cicloalquilo de entre 3 y 10 átomos de carbono;
- (iv)
- un alquilo de entre 7 y 12 átomos de carbono;
- (v)
- fenilo;
- (vi)
- fenilo sustituido
en la que Z_{i}, Z_{ii},
Z_{iii}, Z_{iv}y Z_{v} están cada uno de ellos
independientemente seleccionados de entre el grupo constituido por
-NO_{2}, -CN, -C(=O)-R_{1}, -SO_{3}H, un átomo
de hidrógeno, halógeno, metilo, -OR_{x} en la que R_{x} es entre
1 y 8 átomos de carbono, inclusive, que puede ser de cadena lineal o
ramificada, e
hidróxido;
- (vii)
- una molécula marcadora detectable, o
- (viii)
- un alquenilo de cadena lineal o ramificada de entre 2 y 8 átomos de carbono, inclusive.
en la que Q_{1} es (C=O), SO_{2} o (CN), a
condición de que cuando Q_{1} es CN, entonces X está ausente;
en la que Q_{3} y Q_{4} son cada uno de ellos
independientemente O, S o NH;
en la que uno de entre R_{2} y R_{3} es un
átomos de hidrógeno y el otro es
- (a)
- H;
- (b)
- un alquilo de entre 1 y 8 átomos de carbono, inclusive, que puede ser de cadena lineal o ramificada;
- (c)
- un cicloalquilo de entre 3 y 6 átomos de carbono, inclusive;
- (d)
- un alquenilo de entre 2 y 8 átomos de carbono, inclusive, que puede ser de cadena lineal o ramificada; o
- (e)
- R_{a}Q_{2}R_{b} en la que Q_{2} es -O- ó -S-; en la que R_{a} es un alquileno de entre 0 y 6 átomos de carbono, inclusive, que puede ser de cadena lineal o ramificada y en la que R_{b} es alquilo de entre 0 y 8 átomos de carbono, inclusive, que puede ser de cadena lineal o ramificada, a condición de que cuando R_{b} es 0, entonces R_{b} es un átomo de hidrógeno;
en la que R_{4} es
- (a)
- H;
- (b)
- es un alquilo de entre 1 y 6 átomos de carbono, inclusive, que puede ser cadena lineal o ramificada;
en la que R_{5} es
en la que Z_{i}, Z_{ii},
Z_{iii}, Z_{iv} y Z_{v} están cada uno de ellos
independientemente seleccionados de entre el grupo constituido por
-NO_{2}, -CN, -C(=O)-R_{1}, -SO_{3}H, un átomo
de hidrógeno, halógeno, metilo,
-OR_{x},
en la que R_{x} es de entre 1 y 8 átomos de
carbono, inclusive, que puede ser de cadena lineal o ramificada e
hidroxilo o un grupo sustituido o no sustituido ramificado o
lineal;
en la que Y_{1} es -OH, metilo, -SH, un alquilo
de entre 2 y 4 átomos de carbono, inclusive, de cadena lineal o
ramificada, un alcoxi de entre 1 y 4 átomos de carbono, inclusive, o
CH_{a}Z_{b} en la que a + b = 3, a = 0 a 3, b = 0 a 3 y Z es
ciano, nitro o halógeno.
en la que R_{6} es
- (a)
- H;
- (b)
- un alquilo de entre 1 y 4 átomos de carbono, inclusive, de cadena lineal o ramificada;
en la que T es O ó S y las sales
farmacéuticamente aceptables de las mismas,
con el fin de preparar un agente farmacéutico
destinado al tratamiento de la dermatitis seborreica, la dermatosis
pustulosa o la caspa asociada con la infiltración de neutrófilos
polimórficos (PMN) iniciada por el TNF\alpha.
2. Utilización según la reivindicación 1, en la
que el agente farmacéutico está en forma de un champú o de un
producto destinado a la higiene corporal.
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