ES2248851T3 - Produccion y uso de genotecas normalizadas de dna. - Google Patents
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO PARA FORMAR UNA BIBLIOTECA NORMALIZADA DE ADN GENOMICO, A PARTIR DE UNA MUESTRA DEL MEDIO. DICHO PROCEDIMIENTO CONSISTE EN: (A) AISLAR UNA POBLACION DE ADN GENOMICO A PARTIR DE LA MUESTRA DEL MEDIO; (B) ANALIZAR LA COMPLEJIDAD DE LA POBLACION DE ADN GENOMICO ASI AISLADA; (C) (I) AMPLIFICAR EL NUMERO DE COPIAS DE LA POBLACION DE ADN ASI AISLADA Y/O (II) RECUPERAR UNA FRACCION DEL ADN GENOMICO AISLADO QUE PRESENTE UNA CARACTERISTICA DESEADA; Y (D) NORMALIZAR LA REPRESENTACION DE DIVERSOS ADNS DENTRO DE LA POBLACION DE ADN GENOMICO, PARA FORMAR UNA BIBLIOTECA NORMALIZADA DE ADN GENOMICO PROCEDENTE DE LA MUESTRA DEL MEDIO. ASIMISMO SE DESCRIBE UNA BIBLIOTECA DE ADN GENOMICO NORMALIZADA, FORMADA A PARTIR DE UNA MUESTRA DEL MEDIO POR MEDIO DEL PROCEDIMIENTO DESCRITO.
Description
Producción y uso de genotecas normalizadas de
DNA.
La presente invención se refiere al campo de la
producción y cribado de genotecas, y más particularmente a la
generación y cribado de las genotecas normalizadas de DNA genómico
procedentes de mezclas de poblaciones de microbios y/o otros
organismos.
En las industrias de reactivos de investigación,
de reactivos de diagnóstico y de procesos químicos, ha ido
creciendo la demanda de catalizadores basados en proteínas que
tienen nuevas capacidades. Actualmente, esta necesidad se resuelve
en gran medida usando enzimas purificadas procedentes de una
variedad de bacterias u hongos cultivados. Sin embargo, debido a
que sólo puede crecer en cultivo puro menos del 1% de los microbios
naturales (Amann, 1995), se deben desarrollar técnicas alternativas
para explotar toda la amplitud de la diversidad microbiana para
nuevos productos potencialmente valiosos.
Virtualmente todas las enzimas comerciales ahora
en uso, proceden de organismos cultivados. La mayor parte de estos
organismos son bacterias u hongos. Amann et al. (Amann,
1995), han estimado los microorganismos ambientales cultivados como
sigue:
| Hábitat | Cultivabilidad (%) |
| Agua de mar | 0,001-0,1 |
| Agua dulce | 0,25 |
| Lago mesotrófico | 0,01-1,0 |
| Aguas esturinas no contaminadas | 0,1-3,0 |
| Lodos activados | 1,0-15,0 |
| Sedimentos | 0,25 |
| Suelo | 0,3 |
Estos datos fueron determinados a partir de
información publicada en relación con el número de microorganismos
cultivados derivados de los diferentes hábitats indicados.
Otros estudios han demostrado también que los
organismos cultivados comprenden solamente una pequeña fracción de
la biomasa presente en el ambiente. Por ejemplo, un grupo de
investigadores ha comunicado recientemente la recogida de muestras
de agua y sedimento de la charca "Obsidian Pool" del Parque
Nacional de Yellowstone (Barns, 1994) en las que han encontrado
células que se hibridan con sondas específicas de archaea en
el 55% de 75 cultivos de enriquecimiento. La amplificación y
clonación de secuencias que codifican 16S rRNA revelaron secuencias
casi únicas con poca o ninguna representación de los organismos que
habían sido cultivados previamente desde esta charca (pool), lo que
da a entender la existencia de una diversidad sustancial de
archaea con características morfológicas, fisiológicas y
bioquímicas desconocidas hasta ahora. Otro grupo realizó estudios
similares sobre la mat cianobacterial de Octopus Spring del parque
de Yellowstone y llegó a la misma conclusión: esto es, existe una
enorme diversidad no cultivada (Ward, 1990). Giovannoni et
al. (1990) y Toravik et al. (1990a) han publicado
resultados similares usando bacterioplancton recogido en el mar de
los Sargazos y en muestras de suelo, respectivamente. Estos
resultados indican que el uso exclusivo de organismos cultivados en
el cribado para la búsqueda de actividades enzimáticas u otras
bioactividades limita en gran manera el muestreo de la diversidad
potencial en existencia.
Stein (1996), J. Bacteriology 178,
591-599 describe la producción de una genoteca a
partir de una muestra de plancton y el aislamiento y análisis de un
fragmento de genoma de 40 kb de un archaeon de plancton marino de
dicha genoteca.
Soares (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. 91,
9228-9232 y Patanjali (1991), Proc. Natl. Acad.
Sci. 88, 1943-1947 describen la producción de una
genoteca normalizada de cDNA procedente del cerebro de niños y del
timo de adultos, respectivamente.
El cribado de las genotecas procedentes de
muestras cultivadas se ha comprobado ya que es valioso. Sin embargo,
recientemente ha quedado claro que el uso de organismos cultivados
solamente para la generación de la genoteca limita el acceso a la
diversidad de la naturaleza. Los organismos no cultivados presentes
en el ambiente, y/o las enzimas u otras bioactividades derivadas de
ellos, pueden ser útiles en procesos industriales. El cultivo de
cada organismo representado en cualquier muestra ambiental dada,
requiere tiempo y esfuerzo significativos. Se ha estimado que en
una muestra de suelo rica, pueden estar presentes más de 10.000
especies diferentes. Es obvio que el intentar cultivar
individualmente cada una de estas especies sería una tarea muy
pesada. Por tanto, es altamente deseable disponer de nuevos métodos
para acceder de forma eficiente a la diversidad presente en el
ambiente.
La presente invención resuelve esta necesidad
proporcionando métodos para aislar el DNA de una variedad de
fuentes, incluyendo organismos aislados, consorcios de
microorganismos, enriquecimientos primarios y muestras ambientales,
para preparar genotecas que han sido "normalizadas" en su
representación de las poblaciones genómicas de las muestras
originales, y para cribar estas genotecas en cuanto a las enzimas y
otras bioactividades.
La presente invención representa un nuevo método
recombinante para generar y cribar las genotecas de DNA construidas
a partir de mezclas de poblaciones microbianas de muestras no
cultivadas (o "ambientales"). De acuerdo con la presente
invención, se generan y criban genotecas con una representación
equivalente de los genomas de los microbios que pueden diferir
ampliamente en abundancia en las poblaciones naturales. Este método
de "normalización" reduce la redundancia de clones de las
especies abundantes y aumenta la representación de clones de las
especies raras. Estas genotecas normalizadas permiten una mayor
eficiencia del cribado dando como resultado el aislamiento de genes
que codifican nuevos catalizadores biológicos.
El cribado de mezclas de poblaciones de
organismos se ha convertido en un método racional a causa de la
disponibilidad de las técnicas descritas en esta memoria, mientras
que los intentos anteriores de cribado de mezclas de poblaciones no
fueron factibles y fueron evitados a causa de los farragosos
procedimientos que requieren.
Por tanto, la invención proporciona un
procedimiento para producir una genoteca normalizada de DNA genómico
a partir de una muestra ambiental que contiene una mezcla de
poblaciones de organismos, que comprende las etapas de:
- (a)
- aislar una población de DNA genómico a partir de la mezcla de poblaciones de organismos de la muestra ambiental;
- (b)
- fraccionar la población de DNA genómico aislada antes de la normalización, con lo que se aumentan las posibilidades de clonar el DNA de especies menores del fondo común de organismos muestreados, comprendiendo el fraccionamiento una técnica de centrifugación por densidad, en la que se separan de cada pico cantidades iguales de unidades A_{260} y se amplifica el ácido nucleico;
- (c)
- preparar una genoteca normalizada de DNA genómico a partir de la muestra ambiental.
En una realización preferida de este aspecto, el
procedimiento comprende la etapa de recuperar una fracción del DNA
genómico aislado que tiene una característica deseada.
La amplificación del ácido nucleico en la etapa
(b) del procedimiento comprende la etapa de amplificar el número de
copias de la población de DNA aislada de este modo.
En otra realización preferida de este aspecto, la
etapa de amplificar el DNA genómico precede a la etapa de
normalización.
En otra realización preferida de este aspecto, el
procedimiento comprende tanto la etapa (i) amplificar el número de
copias de la población de DNA aisladas de este modo como la etapa
(ii) recuperar una fracción del DNA genómico aislado que tiene una
característica deseada.
Otro aspecto de la descripción proporciona una
genoteca normalizada de DNA genómico formada a partir de una muestra
ambiental mediante un procedimiento que comprende las etapas de (a)
aislar una población de DNA genómico a partir de la muestra
ambiental; (b) analizar la complejidad de la población de DNA
genómico aislada de este modo; (c) al menos una de las etapas (i)
amplificar el número de copias de la población de DNA aislada de
este modo y (ii) recuperar una fracción del DNA genómico aislado que
tiene una característica deseada; y (d) normalizar la
representación de diferentes DNAs dentro de la población de DNA
genómico para formar de este modo una genoteca normalizada de DNA
genómico a partir de la muestra ambiental. Las diferentes
realizaciones preferidas descritas con respecto al aspecto anterior
del método de la invención son igualmente aplicables con respecto a
este aspecto de la descripción.
La descripción proporciona también un
procedimiento para formar una genoteca normalizada de DNA genómico a
partir de una muestra ambiental mediante (a) aislar una población
de DNA genómico a partir de la muestra ambiental; (b) analizar la
complejidad de la población de DNA genómico aislada de este modo;
(c) al menos una de las etapas (i) amplificar el número de copias
de la población de DNA aislada de este modo y (ii) recuperar una
fracción del DNA genómico aislado que tiene una característica
deseada; y (d) normalizar la representación de diferentes DNAs
dentro de la población de DNA genómico para formar de este modo una
genoteca normalizada de DNA genómico a partir de la muestra
ambiental.
Una genoteca normalizada de DNA genómico formada
a partir de una muestra ambiental mediante un procedimiento que
comprende las etapas de (a) aislar una población de DNA genómico a
partir de la muestra ambiental; (b) analizar la complejidad de la
población de DNA genómico aislada de este modo; (c) al menos una de
las etapas (i) amplificar el número de copias de la población de
DNA aislada de este modo y (ii) recuperar una fracción del DNA
genómico aislado que tiene una característica deseada; y (d)
normalizar la representación de diferentes DNAs dentro de la
población de DNA genómico para formar de este modo una genoteca
normalizada de DNA genómico a partir de la muestra ambiental. Las
diferentes realizaciones preferidas descritas con respecto al
aspecto anterior del método de la invención son igualmente
aplicables con respecto a la genoteca normalizada de DNA genómico,
preferiblemente se puede
obtener una genoteca normalizada de DNA genómico por el procedimiento que se caracteriza en las reivindicaciones.
obtener una genoteca normalizada de DNA genómico por el procedimiento que se caracteriza en las reivindicaciones.
La Figura 1 es un gráfico que muestra el
porcentaje del contenido total de DNA representado por G + C en los
diferentes aislados de DNA genómico ensayado como se describe en el
Ejemplo 2.
Una etapa importante en la generación de una
genoteca normalizada de DNA a partir de una muestra ambiental es la
preparación de ácido nucleico de la muestra. Se puede aislar el DNA
de las muestras utilizando diferentes métodos bien conocidos en la
técnica (Nucleic Acids in the Environment Methods &
Applications, J. T. Trevors, D.D. van Elsas, Springer
Laboratory, 1995). Preferiblemente, el DNA obtenido será de gran
tamaño y estará libre de inhibidores enzimáticos y otros
contaminantes. Se puede aislar el DNA directamente de la muestra
ambiental (lisis directa) o se pueden recoger las células de la
muestra antes de la recuperación del DNA (separación de células).
Los procedimientos de lisis directa tienen varias ventajas sobre
los protocolos basados en la separación de células. La técnica de
la lisis directa proporciona más DNA con una representación de la
comunidad microbiana generalmente más alta, sin embargo, a veces
tiene un tamaño más pequeño probablemente y contiene más
inhibidores enzimáticos que el DNA recuperado usando la técnica de
la separación de células. Recientemente se han descrito técnicas de
lisis directa muy útiles que proporcionan DNA de alto peso molecular
y alta pureza (Barns, 1994; Holben, 1994). Si están presentes los
inhibidores, existen varios protocolos que utilizan el aislamiento
de células, que se pueden emplear (Holben, 1994). Adicionalmente,
para mejorar la pureza del DNA se puede usar una técnica de
fraccionamiento, tal como la separación con
bis-benzimida (aislamiento con cloruro de cesio)
descrita más adelante.
El análisis de la complejidad del ácido nucleico
recuperado de las muestras ambientales puede ser importante de
monitorizar durante los procedimientos de aislamiento y
normalización. El análisis de 16S rRNA es una técnica que se puede
usar para analizar la complejidad del DNA recuperado de las muestras
ambientales (Reysenbach, 1992; DeLong, 1992; Barns, 1994). Se han
descrito cebadores para la amplificación específica de los genes de
16S rRNA de cada uno de los tres dominios descritos.
El fraccionamiento de las muestras de DNA previo
a la normalización aumenta las posibilidades de clonar el DNA de
especies menores del fondo común de los organismos muestreados. En
la presente invención, preferiblemente se fracciona el DNA usando
una técnica de centrifugación por densidad. Un ejemplo de dicha
técnica es un gradiente de cloruro de cesio. Preferiblemente, la
técnica se lleva a cabo en presencia de un agente intercalante del
ácido nucleico que se unirá a las regiones del DNA y causará un
cambio en la densidad creciente del ácido nucleico. Más
preferiblemente, el agente intercalante del ácido nucleico es un
colorante, tal como bis-benzimida que de forma
preferente se unirá a las regiones de DNA (AT en el caso de la
bis-benzimida) (Muller, 1975; Manuelidis, 1977).
Cuando el ácido nucleico complejado con un agente intercalante, tal
como bis-benzimida, se separa en un gradiente
apropiado de cloruro de cesio, se fracciona el ácido nucleico. Si
el agente intercalante se une de forma preferente a regiones de
DNA, tales como las regiones GC o AT, se separa el ácido nucleico
basándose en el contenido básico relativo del DNA. De esta manera
se puede separar el ácido nucleico de múltiples organismos.
Los gradientes de densidad se emplean actualmente
para fraccionar los ácidos nucleicos. Por ejemplo, se ha descrito
el uso de gradientes de densidad con bis-benzimida
para la separación de ácidos nucleicos microbianos para uso en la
tipificación y biorrecuperación del suelo. En estos experimentos,
se evalúa la abundancia relativa de los picos A_{260} dentro de
los gradientes de benzimida fijados antes y después del tratamiento
de recuperación para ver cómo han sido afectadas las poblaciones
bacterianas. La técnica se basa en la premisa de que el contenido
medio de GC de una especie es relativamente consistente. Esta
técnica se aplica en la presente invención para fraccionar mezclas
complejas de genomas. Los ácidos nucleicos derivados de una muestra
se someten a ultracentrifugación y se fraccionan mientras se mide la
A_{260} como en los procedimientos publicados.
En la presente invención, se separan de cada pico
unidades A_{260} iguales, se amplifica el ácido nucleico usando
una variedad de protocolos de amplificación conocidos en la técnica,
incluyendo los que se describen más adelante en esta memoria, y se
preparan las genotecas. Alternativamente, se separan de cada pico
unidades A_{260} iguales, y se preparan las genotecas
directamente desde este ácido nucleico. De este modo, se preparan
las genotecas a partir de una combinación de cantidades iguales de
DNA de cada pico. Esta estrategia posibilita el acceso a genes de
los organismos minoritarios, dentro de las muestras y
enriquecimientos ambientales, cuyos genomas pueden no estar
representados o pueden incluso faltar, debido al hecho de que los
organismos están presentes en dichas cantidades minoritarias, si se
construye una genoteca de la muestra total de DNA sin fraccionar.
Alternativamente, se puede normalizar el DNA posteriormente al
fraccionamiento, usando las técnicas que se describen más adelante.
Las genotecas de DNA se pueden generar entonces a partir de este DNA
fraccionado/normalizado.
La composición de las fracciones múltiples del
ácido nucleico fraccionado se puede determinar usando métodos de
clasificación por amplificación relacionados con la PCR bien
conocidos en la técnica.
Los protocolos de normalización anteriores han
sido diseñados para construir genotecas normalizadas de cDNA (WO
95/08647, WO 95/11986). Estos protocolos se desarrollaron
originalmente para la clonación y aislamiento de los cDNA raros
derivados de mRNA. La presente invención se refiere a la generación
de genotecas normalizadas de DNA genómico a partir de muestras no
cultivadas o ambientales.
Las muestras de ácido nucleico aisladas
directamente de muestras ambientales o de cultivos de
enriquecimientos primarios, contendrán típicamente genomas de un
gran número de microorganismos. Estas comunidades complejas de
organismos se pueden describir por el número absoluto de especies
presentes dentro de una población y por la abundancia relativa de
cada organismo dentro de la muestra. La normalización total de cada
organismo dentro de una muestra es muy difícil de conseguir. Se
pueden usar técnicas de separación tales como pinzas ópticas para
escoger miembros morfológicamente distintos de una muestra. Las
células de cada miembro se pueden combinar entonces en números
iguales o se pueden preparar cultivos puros de cada miembro dentro
de una muestra y combinar números iguales de células de cada cultivo
puro para alcanzar la normalización. En la práctica, esto es muy
difícil de realizar, especialmente de una manera con alto
rendimiento.
La presente invención implica el uso de técnicas
para conseguir la normalización de los genomas presentes dentro de
una muestra ambiental, generando una genoteca de DNA a partir de
ácido nucleico normalizado, y cribando la genoteca para buscar una
actividad de interés.
En un aspecto de la presente invención, se aísla
el DNA de la muestra y se fracciona. Las cadenas de ácido nucleico
se funden entonces y se deja que sufran nuevo alineamiento selectivo
en condiciones fijadas (hibridación dirigida por C_{0}t).
Alternativamente, el DNA no se fracciona antes de este proceso de
fusión. Cuando una mezcla de fragmentos de ácido nucleico se funde
y se deja realinear en condiciones rigurosas, las secuencias comunes
encuentran sus cadenas complementarias más rápidamente que las
secuencias raras. Después de una etapa opcional de aislamiento de
ácido nucleico de una sola cadena, el ácido nucleico de una sola
cadena que representa un enriquecimiento de las secuencias raras, se
amplifica y se usa para generar genotecas. Este procedimiento lleva
a la amplificación de moléculas de ácido nucleico raro o poco
abundante. Estas moléculas se usan después para generar una
genoteca. Aunque todos los DNA serán recuperados, la identificación
del organismo que contiene originalmente el DNA se puede perder.
Este método ofrece la capacidad de recuperar el DNA de "fuentes no
clonables".
Las muestras de ácido nucleico obtenidas usando
la técnica descrita anteriormente se amplifican para completar el
proceso de normalización. Por ejemplo, se pueden amplificar las
muestras usando protocolos de amplificación por PCR tales como los
descritos por Ko et al. (Ko, 1990b; Ko, 1990a, Takahasi,
1994), o más preferiblemente, protocolos de PCR larga tales como
los descritos por Barnes (1994) o Cheng (1994).
La normalización se puede realizar directamente,
o se pueden realizar también etapas para reducir la complejidad de
los fondos comunes de ácido nucleico antes del proceso de
normalización. Tal reducción de la complejidad puede ser
beneficiosa para recuperar el ácido nucleico a partir de organismos
poco representados.
Los microorganismos de los que se pueden preparar
las genotecas incluyen microorganismos procarióticos, tales como
eubacteria y archaebacteria, y microorganismos
eucarióticos inferiores tales como hongos, algunas algas y
protozoos. Los microorganismos pueden ser microorganismos
cultivados o microorganismos no cultivados obtenidos de las muestras
ambientales y tales microorganismos pueden ser extremófilos, tales
como termófilos, hipertermófilos, psicrófilos, psicrotrofos,
etc.
Como se ha indicado antes, se puede producir la
genoteca a partir de las muestras ambientales en cuyo caso el DNA
puede ser recuperado sin el cultivo de un organismo o el DNA puede
ser recuperado de un organismo cultivado.
Las fuentes de DNA de microorganismos como un
material de partida de la genoteca de la que se obtiene el DNA
objetivo se contemplan particularmente para incluir muestras
ambientales, tales como las muestras microbianas obtenidas de los
hielos árticos y antárticos, agua o fuentes acuosas congeladas
permanentemente, materiales de origen volcánico, materiales
procedentes de suelo o plantas de áreas tropicales, etc. De este
modo, por ejemplo, el DNA genómico se puede recuperar de un
organismo cultivable o no cultivable y se puede emplear para
producir una genoteca apropiada de expresión recombinante para la
determinación subsiguiente de la actividad enzimática.
Las bacterias y muchas eucariotas tienen un
mecanismo coordinado para regular los genes cuyos productos están
implicados en procedimientos relacionados. Los genes se agregan, en
estructuras denominadas "agregados de genes", en un único
cromosoma y se transcriben juntos bajo el control de una única
secuencia reguladora, incluyendo un único promotor que inicia la
transcripción del agregado completo. El agregado génico, el
promotor, y las secuencias adicionales que funcionan conjuntamente
en la regulación se denominan "operon" y pueden incluir hasta
20 o más genes, usualmente de 2 a 6 genes. Por tanto, un agregado
génico es un grupo de genes adyacentes que son idénticos o
relacionados, usualmente en cuanto a su función.
Algunas familias de genes consisten en miembros
idénticos. La agregación es un prerrequisito para mantener la
identidad entre genes, aunque los genes agregados no son
necesariamente idénticos. Los agregados génicos varían desde
extremos en los que se genera una duplicación de genes adyacentes
relacionados, hasta casos en los que cientos de genes idénticos
están situados en un ordenamiento en tandem. A veces no se percibe
ninguna significación en la repetición de un gen particular. Un
ejemplo principal de esto son los genes de insulina duplicados
expresados en algunas especies, mientras que un gen de insulina
único es adecuado en otras especies de mamíferos.
Es importante investigar adicionalmente los
agregados génicos y la medida en que la longitud total del agregado
es necesaria para la expresión de las proteínas que resultan de los
mismos. Además, los agregados génicos sufren una reorganización
continua y por tanto, la capacidad de crear genotecas heterogéneas
de agregados génicos, por ejemplo, a partir de fuentes bacterianas
o de otras procariotas, es valiosa para determinar fuentes de nuevas
proteínas, incluyendo particularmente enzimas tales como, por
ejemplo, las policetida-sintasas que son
responsables de la síntesis de policetidas que tienen un vasto
conjunto de actividades útiles. Se contemplan también otros tipos de
proteínas que son los productos de los agregados génicos,
incluyendo, por ejemplo, antibióticos, antivirales, agentes
antitumorales y proteínas reguladoras, tales como insulina.
Las policetidas son moléculas que son una fuente
extremadamente rica de bioactividades, incluyendo antibióticos
(tales como tetraciclinas y eritromicina), agentes
anti-cáncer (daunomicina), inmunodepresores (FK506
y rapamicina), y productos veterinarios (monensina). Muchas
policetidas (producidas por las policetida-sintasas)
son valiosas como agentes terapéuticas. Las
policetida-sintasas son enzimas multifuncionales que
catalizan la biosíntesis de una gran variedad de cadenas carbonadas
que difieren en longitud y patrones de funcionalidad y ciclización.
Los genes de las policetida-sintasas están dentro de
los agregados génicos y al menos un tipo (denominado tipo I) de
policetida-sintasas tiene genes y enzimas de gran
tamaño, que complican la manipulación genética y los estudios in
vitro de estos genes/proteínas.
Para la generación de nuevas policetidas para
estudio, se precisa capacidad para seleccionar y combinar los
componentes deseados de una genoteca de los genes de la biosíntesis
de policetidas y postpolicetidas. Los métodos de la presente
invención lo hacen posible y facilitan la clonación de nuevas
policetida-sintasas, puesto que se pueden generar
bancos génicos con clones que contienen insertos grandes
(especialmente cuando se usan vectores basados en el factor f), lo
que facilita la clonación de los agregados génicos.
Preferiblemente, el DNA de los agregados génicos
está ligado a un vector, comprendiendo además particularmente el
vector secuencias reguladoras de la expresión que pueden controlar y
regular la producción de una proteína detectable o la actividad de
un ordenamiento relacionado con proteínas de los agregados génicos
ligados. Los vectores que tienen una capacidad excepcionalmente
grande para la introducción de DNA exógeno son particularmente
apropiados para utilización con tales agregados génicos y se
describen en esta memoria a modo de ejemplo para incluir el factor
f (o factor de fertilidad) de E. coli. Este factor f de
E. coli es un plásmido que afecta a la transferencia con alta
frecuencia del mismo durante la conjugación y es ideal para
alcanzar y propagar de forma estable grandes fragmentos de DNA,
tales como los agregados génicos de mezclas de muestras
microbianas.
Una vez que han sido generadas genotecas
normalizadas, se pueden descubrir actividades enzimáticas únicas
usando una variedad de ensayos de cribado en fase sólida o líquida
en una variedad de formatos, incluyendo un formato robótico de alto
rendimiento descrito en esta memoria. La normalización del DNA
usado para construir las genotecas es un componente clave en el
procedimiento. La normalización aumentará la representación del DNA
de importantes organismos, incluyendo los representados en
cantidades menores en la muestra.
1. Se resuspenden las muestras directamente en el
siguiente tampón:
- Tris-HCl 500 mM, pH 8,0
- NaCl 100 mM
- Citrato de sodio 1 mM
- Poliadenosina 100 \mug/ml
- Lisozima 5 mg/ml
2. Se incuban a 37ºC durante 1 hora con agitación
ocasional.
3. Se digieren con 2 mg/ml de la enzima
proteinasa K (Boehringer Mannheim) a 37ºC durante 30 min.
4. Se añaden 8 ml de tampón de lisis
[Tris-HCl 200 mM, pH 8,0/NaCl 100 mM/SDS al 4%
(p/v)/4-aminosalicilato al 10% (p/v)] y se mezcla
suavemente por inversión.
5. Se realizan tres ciclos de congelación en un
baño de hielo seco-etanol y se descongelan en un
baño de agua a 65ºC para liberar los ácidos nucleicos.
6. Se extrae la mezcla con fenol y después con
fenol/cloroformo/alcohol isoamílico.
7. Se añaden a la fase acuosa 4 gramos de
polivinilpolipirrolidona (PVPP) lavada con ácido y se incuban
durante 30 minutos a 37ºC para eliminar la contaminación
orgánica.
8. Se sedimenta la PVPP y se filtra el
sobrenadante a través de una membrana de 0,45 \mum para separar la
PVPP residual.
9. Se precipitan los ácidos nucleicos con alcohol
isopropílico.
10. Se resuspende el sedimento en 500 \mul de
TE (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0/EDTA 1,0 mM).
11. Se añade 0,1 g de acetato de amonio y se
centrifuga la mezcla a 4ºC durante 30 minutos.
12. Se precipitan los ácidos nucleicos con
isopropanol.
La muestra compuesta de DNA genómico procedente
de Clostridium perfringens (27% de G+C), Escherichia
coli (49% de G+C) y Micrococcus lysodiclium (72% de G+C)
se purificó sobre un gradiente de cloruro de cesio. La solución de
cloruro de cesio (Rf = 1,3980) se filtró a través de un filtro de
0,2 \mum y se cargaron 15 ml a un tubo OptiSeal (Beckman) de 35
ml. Se añadió el DNA y se mezcló concienzudamente. Se añadieron 10
microgramos de bis-benzimida (Sigma; Hoechst 33258)
y se mezclaron concienzudamente. Se llenó entonces el tubo con la
solución de cloruro de cesio filtrada y se hizo rotar en un rotor
VTI50 en una ultracentrífuga LB-70 de Beckman a
33.000 rpm durante 72 horas. Después de la centrifugación, se
utilizaron una bomba de jeringa y un fraccionador (Brandel Model
186) para dirigir el gradiente a través de un detector de
absorbancia en UV, ISCO UA-5, fijado a 280 nm. Se
obtuvieron tres picos que representan el DNA de los tres
organismos. La amplificación por la PCR del rRNA que codifica DNA a
partir de una dilución del pico de E. coli se realizó con los
siguientes cebadores para ampliar las secuencias eubacterianas:
- Cebador directo: (27F)
- 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'
- Cebador inverso: (1492R)
- 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'
1. Se purifica el DNA en gradiente de cloruro de
cesio de acuerdo con los protocolos publicados (Sambrock, 1989).
2. Se prepara una segunda solución de cloruro de
cesio; (Rf = 1,3980), se filtra a través de un filtro de 0,2 \mum
y se cargan 15 ml a un tubo OptiSeal (Beckman) de 35 ml.
3. Se añaden 10 \mug de
bis-benzimida (Sigma; Hoechst 33258) y se
mezcla.
4. Se añaden 50 \mug de DNA purificado y se
mezcla concienzudamente.
5. Se hace rotar en un rotor VTI50 en una
ultracentrífuga LB-70 de Beckman a 33.000 rpm
durante 72 horas.
6. Se utiliza una bomba de jeringa y un
fraccionador (Brandel Model 186) para dirigir el gradiente a través
de un detector de absorbancia en UV, ISCO UA-5,
fijado a 280 nm.
1. Se utiliza el análisis de 16S rRNA para
analizar la complejidad del DNA recuperado de las muestras
ambientales (Reysenbach, 1992; DeLong, 1992; Barns, 1994) según el
protocolo indicado en el Ejemplo 1.
2. Se amplifican las secuencias eubacterianas
usando los siguientes cebadores:
- Directo:
- 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'
- Inverso:
- 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'
Las secuencias de las archaeas se
amplifican usando los siguientes cebadores:
- Directo:
- 5'-GCGGATCCGCGGCCGCTGCACAYCTGGTYGATYCTGCC-3'
- Inverso:
- 5'-GACGGGCGGTGTGTRCA-3' (R = purina; Y = pirimidina).
3. Las reacciones de amplificación se llevan a
cabo según se ha publicado. El tampón de reacción usado en la
amplificación de las secuencias de las archaeas incluye
acetamida al 5% (Barns, 1994).
4. Los productos de las reacciones de
amplificación se convierten en productos con extremos romos por
incubación con DNA-polimerasa Pfu.
5. El ligamiento del extremo romo con el plásmido
pCR-Script en presencia de la endonucleasa de
restricción Sfl, se realiza según el protocolo del fabricante
(Stratagene Cloning Systems).
6. Se realiza la secuenciación de las muestras
usando protocolos estándar (referencia) de secuenciación y se
determina el número de secuencias diferentes presentes en la
muestra.
El DNA purificado se fracciona de acuerdo con el
protocolo de la bis-benzimida del Ejemplo 2, y el
DNA recuperado se divide o se digiere enzimáticamente en fragmentos
de 3-6 kb. Se ligan los cebadores ligantes
solitarios y el DNA se selecciona por tamaño. El DNA seleccionado
por tamaño se amplifica por la PCR, si fuera necesario.
Se realiza entonces la normalización como
sigue:
1. Se resuspende la muestra de DNA de doble
cadena en tampón de hibridación (NaH_{2}PO_{4} 0,12 M, pH
6,8/NaCl 0,82 M/EDTA 1 mM/SDS al 0,1%).
2. Se cubre la muestra con aceite mineral y se
desnaturaliza hirviendo durante 10 minutos.
3. Se incuba la muestra a 68ºC durante
12-36 horas.
4. Se separa el DNA de doble cadena del DNA de
cadena sencilla de acuerdo con protocolos estándar (Sambrook, 1989)
sobre hidroxiapatita a 60ºC.
5. La fracción de DNA de cadena sencilla se
desaliniza y se amplifica por PCR.
6. Se repite el procedimiento durante varias
rondas más (hasta 5 o más).
1. El DNA genómico disuelto en tampón TE, se pasa
vigorosamente a través de una aguja de doble eje de calibre 25
hasta que los fragmentos rotos estén dentro del intervalo de tamaño
deseado.
2. Los extremos del DNA se "pulen" o se
hacen romos con nucleasa Mung Bean.
3. Los sitios de restricción EcoRI del DNA
objetivo se protegen con EcoRI-metilasa.
4. Los ligantes de EcoRI [GGAATTCC] se
ligan al DNA con extremos romos/protegido usando una relación molar
muy alta de ligantes frente al DNA objetivo.
6. El DNA objetivo se liga al vector
\lambdaZAPII, se empaqueta usando extractos de empaquetado lamba
in vitro, y se cultiva en la apropiada célula del hopedante
E. coli XLI Blue.
Lo que sigue es un ejemplo representativo de un
procedimiento para cribar una genoteca de expresión preparada de
acuerdo con el Ejemplo 6.
Los procedimientos generales para ensayar
diferentes características químicas generalmente son aplicables a
otros sustratos aparte de los específicamente mencionados en este
ejemplo.
Cribado para detectar actividad. Se
utilizan placas de la genoteca preparada como se ha descrito en el
Ejemplo 6 para inocular de forma múltiple una única placa que
contiene 200 \mul de LB Amp/Meth, glicerol en cada pocillo. Esta
etapa se realiza utilizando el dispositivo de replicación de alta
densidad (HDRT) Biomek de Beckman con un blanqueador al 1%, agua,
isopropanol, ciclo de esterilización y secado por aire entre cada
inoculación. La placa única se cultiva durante 2 horas a 37ºC y se
usa después para inocular dos placas hijas de microtitulación
Dynatech blancas de 96 pocillos que contienen 200 \mul de LB
Amp/Meth, glicerol en cada pocillo. La placa única original se
incuba a 37ºC durante 18 h y después se conserva a -80ºC. Las dos
placas hijas condensadas se incuban también a 37ºC durante 18 h. Las
placas hijas condensadas se calientan después a 70ºC durante 45 min
para matar las células e inactivar las enzimas del E. coli
hospedante. Se diluye una solución stock de 5 mg/ml de
morfourea-fenilalanil-7-amino-4-trifluorometil-cumarina
(MuPheAFC, el "sustrato") en DMSO hasta una concentración 600
\muM con tampón Hepes 50 mM pH 7,5 que contiene 0,6 mg/ml del
detergente maltósido de dodecilo.
MuPheAFC
Se añaden cincuenta \mul de la solución de
MuPheAFC 600 \muM a cada uno de los pocillos de las placas blancas
condensadas con un ciclo de mezcla de 100 \mul utilizando el
Biomek para dar una concentración final de sustrato de \sim100
\muM. Se registran los valores de fluorescencia (excitación = 400
nm, emisión = 505 nm) sobre un fluorímetro medidor de placas
inmediatamente después de la adición del sustrato (t = 0). Se incuba
la placa a 70ºC durante 100 min, y después se deja enfriar a
temperatura ambiente durante 15 minutos adicionales. Se registran
de nuevo los valores de fluorescencia (t = 100). Los valores a t =
0 se restan de los valores a t = 100 para determinar si está
presente un clon activo.
Los datos indicarán si uno de los clones en un
pocillo particular está hidrolizando el sustrato. Con el fin de
determinar el clon individual que realiza la actividad, se
descongelan las placas de la genoteca fuente y se utilizan los
clones individuales para inocular individualmente una nueva placa
que contiene LB Amp/Meth, glicerol. Como antes, se incuba la placa a
37ºC para cultivar las células, se calienta a 70ºC para inactivar
las enzimas del hospedante, y se añaden 50 \mul de MuPheAFC 600
\muM utilizando el Biomek. Adicionalmente se ensayan otros tres
sustratos. Estos son heptanoato de
metil-umbeliferona, el derivado de
CBZ-arginina-rodamina, y caseína
conjugada con fluoresceína
(\sim 3,2 mol de fluoresceína por mol de caseína).
(\sim 3,2 mol de fluoresceína por mol de caseína).
Se añaden la umbeliferona y rodamina cono
soluciones stock 600 \muM en 50 \mul de tampón Hepes. Se añade
también la caseína conjugada con fluoresceína en 50 \mul a una
concentración stock de 20 y 200 mg/ml. Después de la adición de los
sustratos se registran los valores de fluorescencia a t = 0, se
incuba la placa a 70ºC, y se registran los valores
a t=100 min como antes.
a t=100 min como antes.
Estos datos indican en qué placa está el clon
activo, en la que también el derivado de
arginina-rodamina ha sido invertido por esta
actividad, pero el sustrato de lipasa, heptanoato de
metil-umbeliferona, y proteína, caseína conjugada
con fluoresceína, no funcionan como sustratos.
Se pueden determinar los aminoésteres quirales
utilizando al menos los siguientes sustratos: Para cada sustrato que
ha sido invertido, se determina el valor de enantioselectividad, E,
según la siguiente ecuación:
E =
\frac{In[(1-c(1+ee_{p})]}{In[(1-c(1-ee_{p})]}
en la que ee_{p} = el exceso
enantiomérico (ee) del producto hidrolizado y c = el porcentaje de
conversión de la reacción. Véase Wong and Whitesides, Enzymes in
Synthetic Organic Chemistry, 1994, Elsevier, Tarrytown, N.Y., pp.
9-12.
El exceso enantiomérico se determina o bien por
cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) quiral o bien
por electroforesis capilar quiral (CE). Los ensayos se realizan
como sigue: se añaden doscientos \mul del tampón apropiado a cada
pocillo de una placa de microtitulación blanca de 96 pocillos,
seguidos por 50 \mul de la solución enzimática parcialmente o
completamente purificada; se añaden 50 \mul de sustrato y se
monitoriza el aumento de la fluorescencia frente al tiempo hasta
que se consume el 50% del sustrato o termina la reacción, cualquiera
de las dos cosas que ocurra primero.
Recogida de células y preparación de DNA.
Se prepararon bloques de agarosa que contienen células de
picoplancton concentradas, a partir de muestras recogidas en un
crucero oceanográfico, desde Newport, Oregón hasta Honolulu, Hawaii.
Se recogió agua marina (30 litros) en botellas Niskin, se tamizó a
través de Nitex 10 \mum, y se concentró mediante filtración por
fibra hueca (Amicon DC10) a través de filtros de polisulfona con
corte de 30.000 MW. Se recogieron las células de bacterioplancton
concentradas sobre un filtro Durapore 0,22 \mum de 47 mm, y se
resuspendieron en 1 ml de tampón 2X STE (NaCl 1 M, EDTA 0,1M, Tris
10 mM, pH 8,0) hasta una densidad final de aproximadamente 1 x
10^{10} células por ml. Se mezcló la suspensión de células con un
volumen de agarosa (FMC) Seaplaque LMP fundida al 1% enfriada a
40ºC, y después se pasó inmediatamente a una jeringa de 1 ml. Se
selló la jeringa con parafilm y se puso sobre hielo durante 10 min.
El bloque de agarosa que contiene las células fue extruído en 10 ml
de tampón de lisis (Tris 10 M pH 8,0, NaCl 50 mM, EDTA 0,1,M,
Sarkosyl al 1%, desoxicolato de sodio al 0,2%, lisozima a 1 mg/ml) y
se incubó a 37ºC durante una hora. Se transfirió entonces el bloque
de agarosa a 40 ml de tampón ESP (Sarkosyl al 1%, proteinasa K a 1
mg/ml, en EDTA 0,5 M), y se incubó a 55ºC durante 16 horas. Se
decantó la solución y se reemplazó con tampón ESP fresco, y se
incubó a 55ºC durante una hora adicional. Se pusieron entonces los
bloques de agarosa en EDTA 50 mM y se conservaron a 4ºC en el barco
durante la duración del crucero oceanográfico.
Una porción de un bloque de agarosa (72 \mul)
preparado a partir de una muestra recogida de la costa de Oregón se
dializó durante la noche a 4ºC frente a 1 ml de tampón A (NaCl 100
mM, Bis Tris Propano10 mM-HCl, BSA acetilado a 100
\mug/ml: pH 7,0 a 25ºC) en un tubo de microcentrífuga de 2 ml. Se
reemplazó la solución con 250 \mul de tampón A fresco que contiene
MgCl_{2} 10 mM y DTT 1 mM y se incubó en una plataforma con
balanceo durante 1 hora a temperatura ambiente. Se cambió después la
solución por 250 \mul del mismo tampón que contenía 4 U de Sau3A1
(NEB), se equilibró a 37ºC en un baño de agua, y después se incubó
en una plataforma con balanceo en un incubador a 37ºC durante 45
min. Se transfirió el bloque a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml
y se incubó a 68ºC durante 30 min para inactivar la enzima y para
fundir la agarosa. Se digirió la agarosa y se desfosforiló el DNA
utilizando Gelasa y HK-fosfatasa (Epicentre),
respectivamente, de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
Se separó la proteína por extracción suave con fenol/cloroformo y
se precipitó el DNA con etanol, se sedimentó, y después se lavó con
etanol al 70%. Este DNA parcialmente digerido se resuspendió en
H_{2}O estéril hasta una concentración de 2,5 ng/\mul para
ligación con el vector pFOS1.
Los resultados de la amplificación por PCR de
varios de los bloques de agarosa (no se muestran los datos)
indicaron la presencia de cantidades significativas de DNA
archaeal. Los experimentos de hibridación cuantitativa
utilizando rRNA extraído de una muestra, recogida a 200 m de
distancia de la costa de Oregón, indicaron que la archaea
planctónica en este conjunto representaba aproximadamente el 4,7% de
la biomasa total del picoplancton (esta muestra corresponde a
"PACI"-200 m en la Tabla 1 de DeLong et al., high
abundance of Archaea in Antarctic marine picoplankton,
Nature, 371:695-698, 1994). Los resultados de la
amplificación por PCR del rDNA sesgada por la archaea
realizada sobre lisados de bloques de agarosa confirmaron la
presencia de cantidades relativamente grandes de DNA archaeal
en esta muestra. Para la subsiguiente preparación de la genoteca de
fósmidos se eligieron bloques de agarosa preparados de esta muestra
de picoplancton. Cada bloque de agarosa de 1 ml de este sitio
contenía aproximadamente 7,5 x 10^{5} células, por tanto
aproximadamente 5,4 x 10^{5} células estaban presentes en la
porción de 72 \mul usada en la preparación del DNA parcialmente
digerido.
Se prepararon brazos vectores a partir de pFOS1
como se ha descrito (Kim et al., Stable propagación of
casmid sized human DNA inserts in an F factor based vector,
Nucl. Acids Res., 20:10832-10835, 1992). En
resumen, se digirió completamente el plásmido con AstII, se
desfosforiló con HK-fosfatasa, y después se digirió
con BamHI para generar dos brazos, cada uno de los cuales contenía
un sitio cos en la orientación apropiada para la clonación y
empaquetado del DNA ligado entre 35-45 kbp. El DNA
del picoplancton parcialmente digerido se ligó durante la noche a
los brazos de PFOS1 en una reacción de ligamiento de 15 \mul
conteniendo 25 ng de cada vector e inserto y 1 U de T4
DNA-ligasa (Boehringer-Mannheim). El
DNA ligado en cuatro microlitros de esta reacción fue empaquetado
in vitro utilizando el sistema de empaquetado Gigapack XL
(Stratagene), las partículas de fósmido se transfectaron a E.
coli cepa DH10B (BRL), y las células se dispersaron sobre
placas LB_{cm15}. Los clones de fósmido resultantes se recogieron
en placas de microtitulación de 96 pocillos conteniendo LB_{cm15}
suplementado con glicerol al 7%. Los fósmidos recombinantes, que
contienen cada uno aproximadamente 40 kb de inserto DNA de
picoplancton, dieron una genoteca de 3,552 clones de fósmidos, que
contenían aproximadamente 1,4 x 10^{8} pares de bases de DNA
clonado. Todos los clones examinados contenían insertos que variaban
de 38 a 42 kbp. Esta genoteca se conservó congelada a -80ºC para
posterior análisis.
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\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\newpage
\newpage
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Recombinant Biocatalysis, Inc.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PRODUCCIÓN Y USO DE GENOTECAS DE DNA NORMALIZADAS
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 10
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN POSTAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: FISH & RICHARDON
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 4225 EXECUTIVE SQUARE, STE, 1400
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: LA JOLLA
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: CA
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: USA
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 92037
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA DE LECTURA EN ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: DISKETTE 3,5 INCH
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PS/2
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: WORD PERFECT 6.0
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: No asignado
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE SOLICITUD: 18 junio 1997
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN: No asignada
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: 08/665,565
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE SOLICITUD: 18 junio 1996
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL AGENTE/APODERADO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: LISA A. HAILE, Ph. D.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 38,347
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 09010/019WO1
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN SOBRE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 619-678-5070
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: 619-678-5099
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 52 NUCLEÓTIDOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: SENCILLA
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCGAGAATTC ATTAAAGAGG AGAAATTAAC TATGATTGAA GACCCTATGG AC
\hfill52
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 NUCLEÓTIDOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: SENCILLA
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGGAAGATCT TTAAGCACTT CTCTCAGGTT C
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 52 NUCLEÓTIDOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: SENCILLA
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCGAGAATTC ATTAAAGAGG AGAAATTAAC TATGGACAGG CTTGAAAAAG TA
\hfill52
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 NUCLEÓTIDOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: SENCILLA
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGGAAGATCT TCAGCTAAGC TTCTCTAAGA A
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 52 NUCLEÓTIDOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: SENCILLA
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCGACAATTG ATTAAAGAGG AGAAATTAAC TATGTGGGAA TTAGACCCTA AA
\hfill52
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 NUCLEÓTIDOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: SENCILLA
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGGAGGATCC CTACACCTGT TTTTCAAGCT C
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 52 NUCLEÓTIDOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: SENCILLA
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCGACAATTG ATTAAAGAGG AGAAATTAAC TATGACATAC TTAATGAACA AT
\hfill52
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 NUCLEÓTIDOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: SENCILLA
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGGAAGATCT TTATGAGAAG TCCCTTTCAA G
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 52 NUCLEÓTIDOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: SENCILLA
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCGAGAATTC ATTAAAGAGG AGAAATTAAC TATGCGGAAA CTGGCCGAGC GG
\hfill52
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 NUCLEÓTIDOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: SENCILLA
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGGAGGATCC TTAAAGTGCC GCTTCGATCA A
\hfill31
Claims (17)
1. Un procedimiento para producir una genoteca
normalizada de DNA genómico a partir de una muestra ambiental que
contiene una mezcla de poblaciones de organismos, que comprende las
etapas de:
- (a)
- aislar una población de DNA genómico a partir de la mezcla de poblaciones de organismos de la muestra ambiental;
- (b)
- fraccionar la población de DNA genómico aislada antes de la normalización, con lo que se aumentan las posibilidades de clonar el DNA de especies menores del fondo común de organismos muestreados, comprendiendo el fraccionamiento una técnica de centrifugación por densidad, en la que se separan de cada pico cantidades iguales de unidades A_{260} y se amplifica el ácido nucleico;
- (c)
- preparar una genoteca normalizada de DNA genómico a partir de la muestra ambiental.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el
que la población de DNA genómico contiene agregados de
genes.
genes.
3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el
que la etapa de aislamiento comprende la lisis directa de las
células de la muestra.
4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el
que la etapa de aislamiento comprende la recogida de las células de
la muestra.
5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el
que la técnica de centrifugación por densidad comprende un
gradiente de cloruro de cesio y un agente intercalante, con lo que
se pueden separar los ácidos nucleicos de múltiples especies.
6. El procedimiento de la reivindicación 1, en el
que la etapa (c) comprende fundir las cadenas de ácido nucleico y
dejar que las cadenas se sometan a realineamiento selectivo en
condiciones fijadas.
7. El procedimiento de la reivindicación 1, en el
que la etapa (c) comprende:
(a) fundir una mezcla de fragmentos de ácido
nucleico;
(b) dejar que los fragmentos se sometan a
realineamiento en condiciones rigurosas;
(c) recuperar los ácidos nucleicos de una sola
cadena de la etapa (b);
(d) amplificar los ácidos nucleicos de una sola
cadena recuperados en la etapa (c); y
(e) generar una genoteca a partir de los ácidos
nucleicos amplificados.
8. El procedimiento de la reivindicación 1, en el
que la etapa (c) aumenta la representación de las especies raras
dentro de la muestra.
9. El procedimiento de la reivindicación 1, en el
que la etapa (c) reduce la representación de las especies
abundantes dentro de la muestra.
10. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que los organismos comprenden microorganismos
procarióti-
cos.
cos.
11. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que los organismos son microorganismos no cultivados.
12. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que los organismos comprenden extremófilos.
13. El procedimiento de la reivindicación 12, en
el que los extremófilos comprenden termófilos, hipertermófilos,
psicrófilos, y psicrotrofos.
14. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que la muestra ambiental procede del hielo ártico, hielo
antártico, agua o fuentes acuosas congeladas permanentemente,
materiales de origen volcánico, materiales procedentes de suelo o
plantas de áreas tropicales.
15. El procedimiento de la reivindicación 1, que
comprende además analizar la complejidad del ácido nucleico
recuperado de la muestra ambiental antes de preparar una genoteca
normalizada.
\newpage
16. El procedimiento de la reivindicación 15, en
el que el análisis comprende el análisis de 16s rRNA.
17. El procedimiento de la reivindicación 1, que
comprende además crear una genoteca de expresión a partir del DNA
genómico normalizado.
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