ES2247638T3

ES2247638T3 - Uso de anticuerpos contra el antigeno leucociterio cd45ro para inmunomodulacion.

Info

Publication number: ES2247638T3
Application number: ES97943316T
Authority: ES
Inventors: Andrew I. Lazarovits; Sibrand Poppema
Original assignee: Research Corp Technologies Inc
Current assignee: Research Corp Technologies Inc
Priority date: 1996-09-18
Filing date: 1997-09-17
Publication date: 2006-03-01
Anticipated expiration: 2017-09-17
Also published as: US6379668B1; US20020168362A1; DE69733960D1; EP0939652B1; JP2001501607A; WO1998011918A1; US6106834A; US7160987B2; DE69733960T2; ATE301471T1; EP0939652A1; CA2266684A1

Abstract

ESTA INVENCION SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO QUE PERMITE LA PREVENCION O INVERSION DEL RECHAZO DE UN TRASPLANTE O UN PROCEDIMIENTO DE TERAPIA DE LAS ENFERMEDADES AUTOINMUNES. ESTE PROCEDIMIENTO COMPRENDE LA ADMINISTRACION DE COMPUESTOS, COMO POR EJEMPLO, ANTICUERPOS MONOCLONALES QUE SE UNEN ESPECIFICAMENTE A UNO O VARIOS ANTIGENOS LEUCOCITARIOS CD45R PRESELECCIONADOS.

Description

Uso de anticuerpos contra el antígeno leucocitario CD45RO para inmunomodulación.

Antecedentes de la invención

El rechazo del trasplante de órganos, células y tejidos, y las diversas enfermedades autoinmunes se considera principalmente una consecuencia de una inmunorrespuesta mediada por células T. Esta inmunorrespuesta medida por células T es desencadenada inicialmente por células T colaboradoras, capaces de reconocer antígenos específicos. Estas células T colaboradoras pueden ser células de memoria que hayan quedado de una inmunorrespuesta anterior, o células sencillas liberadas por el timo, que pueden expresar cualquiera de una extremadamente amplia variedad de receptores de antígenos. Cuando una de estas células T colaboradoras reconoce un antígeno presente en la superficie de una célula que presenta un antígeno (APC, en sus siglas en inglés), o un macrófago en forma de un complejo antígeno-MHC, la célula T colaboradora experimenta un estímulo para producir IL-2, a través de señales procedentes del receptor de células T específicas para el antígeno, co-receptores, e IL-1, secretada por la APC o macrófago. A continuación, se produce la proliferación de las células T colaboradoras. La proliferación tiene como consecuencia una gran población de células T seleccionadas por clonación para reconocer un antígeno particular. La activación de células T puede estimular también la activación de células B y las respuestas de macrófagos inespecíficos.

Algunas de estas células en proliferación se diferencian en células T citotóxicas, que destruyan las células que presentan el antígeno seleccionado. Una vez que el antígeno deja de estar presente, las células maduras seleccionadas por clonación permanecerán como células T colaboradoras de memoria y células T citotóxicas de memoria, que circulan por el organismo y reconocen el antígeno si éste vuelve a aparecer. Si el antígeno que desencadena esta respuesta no es un antígeno ajeno, sino un antígeno propio, el resultado es la enfermedad autoinmune; si el antígeno es uno de un órgano trasplantado, el resultado es el rechazo del injerto. En consecuencia, resulta deseable poder regular esta inmunorrespuesta mediada por células T.

El antígeno CD45 (CD45) se expresa en la mayoría de los leucocitos. De hecho, se pensaba anteriormente que un antígeno CD45 común se encontraba presente en todos los leucocitos, motivo por el que el receptor se conoció originalmente como el Antígeno Común de Leucocitos (LCA, en sus siglas en inglés). Se propuso el uso de anticuerpos monoclonales (mAbs, en sus siglas en inglés) contra CD45 como un medio de eliminar eficazmente todos los leucocitos en caso necesario, por ejemplo, purgar un órgano destinado a trasplante de leucocitos pasajeros antes del trasplante, utilizando anticuerpo monoclonal CD45 no específico. Véase, por ejemplo, el documento WO 91/05568.

Recientemente, se ha demostrado que se generan diferentes isoformas de CD45 por el corte y empalme alternativo de un único trascripto primario del gen CD45. Estas isoformas de CD45 incluyen CD45RA, CD45RB, CD45RC, y CD45RO. CD45RA contiene el producto de expresión del exón 4 (designado en ocasiones R_{A}) del gen CD45; CD45C contiene el producto de expresión del exón 6; CD45RB contiene el producto de expresión del exón 5; CD45RO no contiene productos de expresión de ninguno de los tres exones 4, 5 ó 6. Véase Hall et al., "Complete Exon-Intron Organization of the Human Leukocyte Common Antigen (CD45) Gene", J. Immunol., 141, 2781 (1988), y Streuli et al., "Characterization of CD45 and CD45R Monoclonal Antibodies Using Transfected Mouse Cell Lines that Express Individual Human Leukocyte Common Antigens", J. Immunol., 141, 3910 (1988). Sin embargo, no está clara la importancia de esta expresión variable. A.I. Lazarovits et al., (1996), Nature 380, 717-720 describen la prevención y la reversión del rechazo de aloinjertos de riñón mediante anticuerpos contra CD45RB.

El éxito creciente del trasplante clínico de órganos ha sido paralelo a las mejoras de las técnicas para la inmunosupresión. No obstante, los fármacos inmunosupresores cada vez más potentes producen a menudo complicaciones debidas a su ausencia de especificidad. Por ejemplo, los receptores pueden tornarse muy susceptibles a infecciones. Por lo tanto, se desea una inmunosupresión altamente específica.

El método de inmunosupresión específica ideal consistiría en un tratamiento capaz de suprimir la acción de los linfocitos responsables del rechazo del injerto particular que reciba el paciente, sin afectar de ninguna otra forma al sistema inmunológico.

Por consiguiente, existe la necesidad de suprimir de manera duradera y selectiva, o modular de alguna otra forma, la inmunorrespuesta en el ser humano, en particular, en receptores de trasplantes o en los afectados por enfermedades autoinmunes.

Resumen de la invención

La presente invención está dirigida al uso de un anticuerpo que se una específicamente a un epítopo CD45RO del isotipo CD45RO del antígeno leucocitario para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento o la prevención del rechazo del trasplante de células, tejidos u órganos a través de la inhibición de una inmunorrespuesta mediada por células T en el receptor. Los tratamientos incluyen terapias in vivo para prevenir el rechazo de células, tejidos y órganos trasplantados, y terapias in vivo post-trasplante para anular una inmunorrespuesta patológica. Preferentemente, el presente método puede proporcionar al receptor una tolerancia duradera en lugar de retrasar meramente el rechazo. La presente invención está dirigida también al uso de un anticuerpo que se une de manera específica al epítopo CD45RO del isotipo CD45RO del antígeno leucocitario para la preparación de un medicamento para tratar una enfermedad autoinmune a través de la inhibición de una inmunorrespuesta mediada por células T. Por ejemplo, se puede utilizar el anticuerpo definido en las reivindicaciones para preparar un medicamento para tratar a un paciente que esté sufriendo un rechazo de trasplante, incluida la enfermedad de injerto contra hospedador, o afecto de una enfermedad autoinmune.

Adicionalmente, la presente invención está dirigida a una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo que se une específicamente a un epítopo CD45RO del isotipo CD45RO del antígeno leucocitario, en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. El término "compuesto" como se usa en este documento es un anticuerpo como se define en este documento, y también pretende indicar moléculas que tienen funciones similares a las de anticuerpos, por ejemplo, moléculas de cadena sencilla que fijan anticuerpos, péptidos de fijación pequeños, o sus mezclas.

La presente invención es útil en el tratamiento del rechazo de trasplantes. Más específicamente, se le puede utilizar para el tratamiento de un paciente que haya sido sometido al trasplante de células, tejidos u órganos, tanto alógeno como xenógeno. Adicionalmente, la presente invención se puede utilizar antes, después o simultáneamente con el procedimiento de trasplante, o cualquier combinación de los mismos.

Se considera que la presente invención resulta beneficiosa en una diversidad de situaciones de trasplante, incluso en aquellas situaciones en las que un receptor recibe trasplantes secuenciales de las mismas o diferentes células, tejidos u órganos. Por ejemplo, el método de la presente invención se puede utilizar durante un trasplante de corazón, hígado, médula ósea o riñón, o durante el trasplante de islotes pancreáticos o de tejido vascular, por ejemplo, un procedimiento de bypass coronario.

La presente invención puede resultar también de utilidad en el tratamiento o la prevención de enfermedades autoinmunes, trastornos inflamatorios, y enfermedades artríticas o reumatoides. Por ejemplo, la presente invención se puede utilizar para el tratamiento de trastornos hematológicos autoinmunes, lupus eritematoso sistémico, enfermedad intestinal inflamatoria, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, esclerosis múltiple, diabetes mellitus tipo 1, y similares.

Un fármaco antiinflamatorio o inmunosupresor se puede administrar antes, después o simultáneamente con el anticuerpo, como se describe en las reivindicaciones. Por ejemplo, fármacos adecuados para este fin incluyen, pero no están limitados a, ciclosporina, FK-506, rapamicina, corticosteroides, ciclofosfamida, micofenolato, mofetil, leflunomida, globulina anti-linfocitaria, desoxipergualina OKT-3, y similares.

El medicamento de la presente invención se puede administrar al paciente con una cantidad de linfocitos del propio paciente, es decir, en combinación con el o los compuestos que fijan el antígeno leucocitario CD45.

Realizaciones adicionales son como se definen en las reivindicaciones.

Esta invención se basa en el hallazgo de que leucocitos tales como diferentes tipos de linfocitos T, o "células T", pueden expresar de forma predominante una u otra isoforma de CD45. Las células T ingenuas y las células T de memoria expresan de manera predominante CD45RA y CD45RO, respectivamente. La expresión de CD45R\beta también es variable; se expresa en gran medida (brillante) en células T colaboradoras ingenuas (Th0) y en células T que producen, predominantemente, interleuquina 2 y pueden inducir respuestas inflamatorias y citotóxicas (Th1). Las células T que producen de manera predominante interleuquina 4 e inducen inmunorrespuestas humorales (Th2) exhiben una baja expresión (apagada) de CD45RB.

Se ha demostrado ahora que algunos anticuerpos que reaccionan con CD45RB (MB23G2 en ratón, 6G3 en primates) son capaces de inhibir selectivamente las inmunorrespuestas inflamatoria y citotóxica mediada por células T, sin destruir la reserva de células T de memoria. En consecuencia, los supresores de CD45RB poseen una gran ventaja sobre los inmunosupresores actuales al (i) actuar sobre una población particular de células T en lugar de ejercer un efecto inmunosupresor global, evitando de esta forma el riesgo de efectos secundarios asociados con una excesiva supresión del sistema inmunológico; y (ii) son capaces de conferir tolerancia a largo plazo frente a un antígeno particular cuando se les administra simultáneamente con la exposición al antígeno, por ejemplo, inmediatamente antes y después de un trasplante de órgano, o durante una fase aguda de una enfermedad autoinmune.

Como se usa en este documento, la expresión "inmunotolerancia" o, sencillamente, "tolerancia" pretende hacer referencia al estado activo duradero de ausencia de respuesta por parte de las células linfoides a un antígeno o grupo de antígenos preseleccionados o específicos. De este modo, la inmunorrespuesta a otros inmunógenos no resulta afectada, en tanto que se reduce o elimina la necesidad de una inmunoterapia exógena sostenida. Adicionalmente, la tolerancia hace posible el trasplante subsiguiente de material que comprende el mismo antígeno o grupo de antígenos, sin aumentar la necesidad de inmunoterapia exógena.

Por lo general, se considera que los presentes métodos pueden conducir a células T que tengan un receptor para el antígeno que se está anergizando, de manera que los clones de células T resultan funcionales, si no realmente, delecionados. Para una activación completamente funcional de células T se necesitan dos señales. La primera señal requiere el reconocimiento de un antígeno a través del receptor de células T. La segunda señal requiere una interacción entre moléculas co-estimulantes, tales como B7, sobre las células que presentan antígeno, y receptores, tales como CD28, en las células T. Se acepta generalmente que la ausencia de esta segunda señal a través de CD28 conduce a la anergia. Sin embargo, se requiere CD45 para la activación a través del receptor de células T, y la interferencia con este proceso, a través de CD45RB, interrumpe la primera señal y puede conducir también a anergia. De hecho, este enfoque es más fundamental que el bloqueo de la interacción B7-CD28, dado que existe una serie de vías diferentes de co-estimulación, mientras que solamente existe un único complejo de receptores de células T. Puesto que CD45 se expresa de manera diferencial, también resulta posible afectar de forma selectiva a subconjuntos específicos de células T. De este modo, los efectos observados no se deben sólo a la depleción de un subconjunto, o de la población general de células T, sino que implican una combinación de depleción transitoria y un efecto duradero que conduce a que los receptores se hagan tolerantes. Por ejemplo, en un modelo de trasplante de riñón en ratón, la tolerancia al aloinjerto tras el tratamiento inicial con anticuerpos monoclonales anti-CD45RB persiste de forma indefinida, con una supervivencia muy superior a 100 días. En ratones que sobrevivieron más de 100 días tras un aloinjerto renal, el presente método permite la tolerancia de injertos de piel singeneicos con el riñón del donante, en tanto que los injertos de piel alogeneicos tanto con el receptor como con el riñón del donante fueron rechazados.

El término "anticuerpo" incluye mAbs humanos y animales, y preparaciones de anticuerpos monoclonales, así como fragmentos de anticuerpos, anticuerpos sintéticos, incluidos anticuerpos recombinantes, anticuerpos quiméricos, incluidos anticuerpos humanizados, anticuerpos anti-idiotópicos, y sus derivados.

Como se usa en este documento, el término "tratar", con respecto a una enfermedad o trastorno autoinmune, incluye prevenir la aparición o "brotes" de la enfermedad o trastorno, así como reducir o eliminar uno o múltiples síntomas de la enfermedad o trastorno.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1 muestra la supervivencia prolongada de animales tratados con MB23G2 en comparación con un grupo no tratado.

Figura 2 muestra los niveles de creatinina en suero de cada grupo en el momento del sacrificio.

Figuras 3A, 3B y 3C demuestran que MB23G2 induce la depleción de los linfocitos circulantes, y se fija a los linfocitos T y B remanentes.

Figura 4 demuestra la supervivencia de monos Cynomolgus tratados con mAb 6G3 anti-CD45RB, tras la recepción de aloinjertos.

Figura 5 muestra los resultados de la co-incubación de los anticuerpos CD45(R) con células mononucleares de sangre periférica estimuladas con OKT3.

Figura 6 muestra que el reactivo anti-CD45RB 663 tiene mayor efecto inhibidor sobre las células CD8 que sobre las células CD4.

Figura 7 muestra el efecto inhibitorio de los anticuerpos CD45, CD45RB, y CD45RO sobre la expresión de CD25 inducida por OKT3.

Figura 8 exhibe la capacidad proliferativa de las células T de ratones tratados con anti-CD45RB, 5 días después de la inmunización con MBP.

Figura 9 exhibe la capacidad proliferativa de las células T de ratones tratados con anti-CD45RB, 10 días después de la inmunización con MBP.

Descripción detallada de la invención

Los compuestos, anticuerpos y composiciones se preparan, preferentemente, de la forma descrita en los siguientes ejemplos, o por medios equivalentes, como resultará evidente para el experto en la técnica.

Los expertos en la técnica comprenderán que los hibridomas a los que se hace referencia en este documento pueden ser sometidos a mutación genética u otras modificaciones, conservando aún la capacidad de producir anticuerpos monoclonales de la misma especificidad deseada. La presente invención comprende, por consiguiente, mutantes, otros derivados y descendientes de los hibridomas.

Adicionalmente, los expertos en la técnica comprenderán también que un anticuerpo monoclonal se puede someter a las técnicas de la tecnología del ADN recombinante para producir otros anticuerpos derivados, moléculas humanizadas o quiméricas, o fragmentos de anticuerpos que conservan la especificidad del anticuerpo monoclonal original. Estas técnicas pueden comprender combinar ADN que codifica la región variable de inmunoglobulina, o las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, en sus siglas en inglés), del anticuerpo monoclonal que ADN que codifica las regiones constantes, o regiones constantes más regiones marco, de una inmunoglobulina diferente, por ejemplo, para convertir un anticuerpo monoclonal derivado de ratón en uno que posea características de inmunoglobulina básicamente humanas (véanse los documentos EP 184187A, GB 2188638A).

Anticuerpos Contra Isoformas CD45R

S. Poppema et al., J. Immunol., 147, 218 (1991) han descrito anteriormente el anticuerpo monoclonal MT3. No obstante, esta publicación no describe un método detallado para la creación de este anticuerpo, ni describe uso farmacéutico alguno para este anticuerpo y, por consiguiente, omite necesariamente la descripción de la población de células T que reconoce este anticuerpo. A. Lazarovits et al., Transplantation, 54, 724 (1992), han caracterizado el efecto in vitro de este anticuerpo. Lazarovits et al. demostraron, por primera vez, que el mAb MT3 inhibe la proliferación y la generación de células T mediante la interferencia con CD45RB. Además del mAb MT3, Lazarovits et al. comunicaron que los anticuerpos monoclonales contra CD45RB tales como un anticuerpo producido por la línea celular HB220, disponible al público de la ATCC en Rockville, MD (ahora designado mAb anti-CD45RB (MB23G2)), se fija a CD45RB y representa agentes eficaces para inhibir la función inmune tanto in vitro como in vivo (véase la Serie de EE.UU. nº 08/071.009, presentada el 2 de junio, 1993).

Los presentes inventores han encontrado ahora que el anticuerpo monoclonal 6G3 se fija a CD45RB. Se trata de una IgG1 de ratón dirigida contra CD45RB humano. Produce una reacción cruzada con el CD45RB de mono. Los presentes inventores han encontrado asimismo ahora que los anticuerpos monoclonales MB23G2, 6G3 y MT3 se fijan a epítopos sensibles a la neuraminidasa en los leucocitos, incluidas las células T, y que al menos MB23G2 y 6G3 incrementan la fosforilación de tirosina de la fosfolipasa C-\gamma1. Resulta interesante destacar que se ha encontrado que HB223 (ahora designado MB4B4), un anticuerpo anti-CD45RB análogo a los de la invención, no se fija a epítopos sensibles a la neuraminidasa. Se observa también que el mAb MB4B4 se fija a un epitopo insensible a la neuraminidasa y no altera la fosforilación de tirosina de la fosfolipasa C-\gamma1. MB4B4 también fue ineficaz en la prevención del rechazo de aloinjerto renal en el ratón. Los mAbs anti-CD45R específicos que se pueden utilizar en la presente invención se resumen en la Tabla I siguiente; de Streuli et al., J. Immunol., 141, 3910 (1988).

TABLA I Clasificación de mAb Anti-CD45R^{a}

CD45RC	DNL-1.9^{c}, OX22
CD45RA	\begin{minipage}[t]{130mm} Anti-2H4^{b}, 3AC5, F8-11-13, E7, HI 100^{c}, CMRF.11, 73.5.17, G1-15, 10G3, 111-1C5, Leu18, 2A10, 5A9, MMT-1, 5E7, 4F4, HB-11 \end{minipage}
CD45RO	UCHL1^{c}
CD45RB	PD-7/26/16, 6B6^{c}, 6G3, MT3, MEM93^{d}, MB2362, MB4B4
^{a} \begin{minipage}[t]{150mm} Los anticuerpos anti-CD45R se han clasificado en tres grupos: CD45RA, CD45RO, y CD45RB, basándose en su fijación a las líneas celulares 300-19(LCA). \end{minipage}
^{b}Disponible en Coulter, Nialeah, FL.
^{c}Disponible en Pharmingen, San Diego, CA.
^{d}Véase Bazil et al., Immunogenetics, 29, 202 (1989).

Anticuerpos Quiméricos y Reformados

El documento EP-A-0120694 (Boss et al./Celltech) describe la clonación y expresión de anticuerpos quiméricos. En estos derivados, los dominios variables de una inmunoglobulina están fusionados con dominios constantes de otra inmunoglobulina. Habitualmente, los dominios variables se derivan del gen de inmunoglobulina de una especie, por ejemplo, ratón o rata, y los dominios constantes derivan del gen de inmunoglobulina de una especie diferente, tal vez la humana. Esta tecnología ahora es muy bien conocida en la técnica. Una Solicitud de Patente Europea posterior, EP-A-0125023, así como la Patente de EE.UU. Nº 4.816.567, trata, en gran medida, el mismo tema que la solicitud de patente de Boss, pero describe la producción de otras variaciones de moléculas del tipo inmunoglobulina, utilizando tecnología de ADN recombinante.

Otra posibilidad consiste en unir únicamente la región variable del anticuerpo monoclonal a otra molécula diferente de la inmunoglobulina, para producir una molécula quimérica derivada (véase el documento WO 86/01553, Neuberger y Rabbits/Celltech). Una posibilidad adicional sería producir una inmunoglobulina quimérica dotada de diferentes especificidades en sus diferentes regiones variables, por ejemplo, los anticuerpos monoclonales de la presente invención (véase del documento EP 68763A). Todavía una posibilidad más sería producir una mutación del ADN que codifica el anticuerpo monoclonal, de manera que se alteren algunas de sus características, sin modificar su especificidad esencial. Esto se puede llevar a cabo por mutagénesis dirigida al sitio u otras técnicas conocidas en este campo.

La solicitud de patente de Winter EP-A-0239400 describe la forma de preparar un anticuerpo derivado y alterado sustituyendo las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de una región variable de una inmunoglobulina con las CDR de una inmunoglobulina de diferentes especificidad, utilizando técnicas de ADN recombinante, el llamado "injerto de CDR". Esto permite alterar la especificidad de fijación al antígeno de un anticuerpo. (En el presente caso, podrían ser las CDR de MT3, 6G3, MB23G2, un anticuerpo con la misma especificidad de fijación que estos anticuerpos anti-CD45RG, o un anticuerpo capaz de producir una reacción cruzada con MT3, 6G3 o MB23G2, que se transfieren a otro anticuerpo). De esta forma, el injerto de CDR permite la "humanización" de anticuerpos, en combinación con la alteración de las regiones de marco.

También es posible obtener directamente anticuerpos reconstituyendo el sistema inmune humano en ratones carentes de su sistema inmune nativo, y produciendo, seguidamente, anticuerpos humanos en estos "ratones huma- nizados".

Un anticuerpo "humanizado" que contenga las CDR de un anticuerpo de roedor específico para un antígeno tendría muchas menos posibilidades de ser reconocido como ajeno por el sistema inmune humano. De aquí se deduce que un anticuerpo "humanizado" con la misma especificidad de fijación que, por ejemplo, MT3 p 6G3, o un anticuerpo capaz de producir una reacción cruzada con cualquiera de ellos (véase más adelante), bien podría tener una aplicación particular en terapia humana y/o en métodos diagnósticos.

Como se ha indicado, el estado de la técnica es tal que los expertos en este campo saben perfectamente cómo manipular y alterar cualquier anticuerpo determinado, o gen o genes que lo codifican, para generar un derivado adaptado a sus necesidades particulares.

Anticuerpos Anti-Idiotópicos

El suministro de un anticuerpo tal como MT3 o 6G3 permite a los expertos en la técnica obtener parejas de fijación, por ejemplo, antígenos/epítopos o anticuerpo/parátopos que se unen a él. Por lo tanto, la presente invención proporciona también parejas de fijación, por ejemplo, antígenos y/o anticuerpos que se unen con un anticuerpo o derivados del mismo como los que se proponen en este documento, tales como MT3 y 6G3.

Las parejas de fijación obtenidas por el uso del mAb MT3 y el mAb 6G3 se pueden usar también para producir ligandos adicionales, por ejemplo, anticuerpos diferentes de MT3 o 6G3 (o moléculas que tienen función de fijación semejantes a las de los anticuerpos, por ejemplo, fragmentos, derivados y análogos sintéticos de anticuerpos, tales como moléculas de cadena sencilla que fijan antígenos). Por consiguiente, también se proporcionan ligandos, por ejemplo, mAbs que son capaces de unirse con una pareja de fijación que tiene la capacidad de unirse con el mAb MT3 y el mAb 6G3. Estos ligandos ("ligandos reactivos cruzados"), por ejemplo, mAbs, pueden reconocer el mismo epítopo que el que reconoce el mAb MT3 y mAb 6G3 en dicha pareja de fijación.

La presente invención proporciona también derivados, equivalentes funcionales (por ejemplo, una molécula que tenga una especificidad de fijación semejante a la de anticuerpos), y fragmentos de dichos ligandos reactivos cruzados, producidos tal vez usando una o muchas de las técnicas de tecnología de ADN recombinante a las que se ha hecho referencia y se han discutido anteriormente. También se incluyen los ligandos de dominio simple (mAbs) como se describen en el documento WO 90/05144.

Aislamiento de Antígenos

Empleando técnicas convencionales, es posible utilizar un ligando, por ejemplo, los anticuerpos de la presente invención y sus derivados, en la inmuno-purificación de una antígeno de una pareja de fijación. Las técnicas de purificación en columna de inmuno-afinidad son bien conocidas, véase, por ejemplo, "Current Protocols in Immunology", ed. J.E. Coligan et al., John Wiley and Sons, Unidad 8.2. Por ejemplo, ahora se sabe que el epítopo identificado por el mAb MB23G2 para CD45RB está codificado por el exón B del gen del antígeno común de leucocitos. El aislamiento del epítopo y los compuestos que se fijan al mismo están contemplados en esta invención.

De hecho, debería ser posible utilizar una columna de inmuno-afinidad para aislar ligando reactivos cruzados, como se ha indicado anteriormente, sin la necesidad de aislar los propios antígenos. Un primer ciclo de purificación por inmuno-afinidad utiliza un ligando, por ejemplo, mAb MT3, 6G3, etc. para separar de una muestra la pareja de fijación que contiene el antígeno que, a continuación, se puede utilizar en la columna para seleccionar, a partir de una población heterogénea de ligandos, aquéllos que son reactivos cruzados con el mAb MT3, el mAb 6G3, etc. y reconocer las mismas parejas de fijación.

Se puede utilizar una pareja de fijación, tal como un péptido o una pequeña molécula de fijación, aislada usando el ligando, por ejemplo, el mAb MT3, 6G3, etc. para seleccionar ligandos reactivos cruzados a partir de un repertorio o población heterogénea de anticuerpos generados por una extensa variedad de medios. Una forma es la de seleccionar anticuerpos monoclonales y líneas celulares que los producen a través de las técnicas de hibridoma convencionales. La presente invención también proporciona células inmortalizadas, por ejemplo, hibridomas que producen dichos ligandos reactivos cruzados.

Otra manera de seleccionar ligandos que son reactivos cruzados con un ligando tal como el mAb MT3 o mAb 6G3 consiste en usar los métodos para producir miembros de pares de fijación específica descritos en el documento WO 92/01047 (Cambridge Antibody Technology Limited y MRC/McCafferty et al.). Esta publicación describe la expresión de componentes de cadena polipeptídica de una población genéticamente diversa de miembros de pares de fijación específica, tales como anticuerpos, fusionados con un componente de un paquete de exhibición genética replicable (RGDP, en sus siglas en inglés) secretado, tal como un bacteriófago, que, de esta forma, exhibe el polipéptido en la superficie. Se pueden generar repertorios muy extensos de anticuerpos exhibidos, analizándolos por medio de fijación de antígeno para obtener uno o más anticuerpos de interés, junto con el ADN que los codifica. El ADN que codifica un polipéptido exhibido en la superficie de un RGDP está contenido dentro del RGDP y, por lo tanto, puede ser aislado y clonado para expresión de forma sencilla. El análisis del repertorio de anticuerpos puede derivarse, naturalmente, de una fuente humana.

Anticuerpos Recombinantes

Evidentemente, una vez que se ha inmortalizado una línea celular, por ejemplo, un hibridoma, o un RGDP que contiene ADN que codifica al menos un componente polipeptídico de un ligando de fijación, el experto en la técnica se encuentra en situación de obtener (de acuerdo con técnicas bien conocidas, véase el documento EPA 449.769) la secuencia completa de nucleótidos que codifica el ligando, por ejemplo, el mAb secretado por la célula. Por lo tanto, la presente invención comprende también secuencias de nucleótidos primarias que codifican los ligandos, por ejemplo, mAbs como se han definido anteriormente, junto con fragmentos de estas secuencias primarias y secuencias de nucleótidos secundarias que comprenden derivados, mutaciones y parejas de hibridación de dichas secuencias de nucleótidos primarias.

Estas secuencias de nucleótidos se pueden utilizar en un sistema recombinante para generar un producto de expresión de acue4rdo con técnicas convencionales. Por consiguiente, la presente invención incluye vectores (vectores de clonación y expresión) que incorporan dichas secuencias de nucleótidos, células transformadas que incorporan dichos vectores, y productos de expresión generados por el uso de un sistema recombinante, empleando cualquiera de dichos vectores o células transformadas.

También se contempla la producción de proteínas de fusión. Véase, por ejemplo, Stamenkovic et al., "The B Lymphocyte Adhesion Molecule CD22 Interacts with Leukocyte Common Antigen CD45RO on T Cells and \alpha2-6 Sialyltransferase, CD75, on B Cells", CELL, Vol. 66, págs. 11-33-1144 (1991).

La presente invención incluye también métodos para expresar un ligando, por ejemplo, un mAb, derivado, equivalente funcional o fragmento del mismo, que comprende utilizar una secuencia de nucleótidos, vector o célula transformada, según se han definido anteriormente.

De manera más específica, MT3 y 6G3, que son mAbs dirigidos contra el antígeno CD45RB humano, se fijarán a un epítopo en CD45RB en células humanas que expresan CD45RB. A continuación, este epítopo se puede purificar, usando, por ejemplo, una columna de inmuno-afinidad (como ya se ha descrito) y secuenciarlo parcial o totalmente, usando, por ejemplo, ciclos repetidos de degradación de Edman.

Inmunosupresión e Inducción de Inmunotolerancia

Los anticuerpos y composiciones farmacéuticas de la invención son útiles en la inmunomodulación, especialmente la inmunosupresión, por ejemplo, en las siguientes indicaciones:

a) Tratamiento y prevención del rechazo de alo- o xeno-trasplantes de órganos, células o tejidos, por ejemplo, para el tratamiento de receptores humanos de, por ejemplo, corazón, pulmón, islotes, médula ósea, células productoras de cromafín o dopamina, corazón-pulmón combinados, hígado, riñón, páncreas, piel, intestino delgado, injertos de tejido vascular o trasplantes de córnea. También están indicados en la prevención de la enfermedad de injerto-contra-hospedador (GvH, en sus siglas en inglés) tal como ocurre, en ocasiones, tras el trasplante de médula ósea. Los métodos y composiciones de la invención también revierten y previenen el rechazo de trasplantes de órganos en mamíferos tales como roedores y primates. Por ejemplo, los anticuerpos impiden que los ratones rechacen los trasplantes renales e inducen una supervivencia prolongada.

b) Tratamiento y prevención de enfermedades autoinmunes y de trastornos inflamatorios, en particular trastornos inflamatorios con una etiología que incluye un componente autoinmune tal como la artritis (por ejemplo, artritis reumatoide, artritis crónica progresiva y artritis deformante), y enfermedades reumáticas. Las enfermedades autoinmunes específicas en las que se pueden utilizar los métodos de la invención incluyen trastornos hematológicos autoinmunes (incluida, por ejemplo, la anemia hemolítica, anemia aplástica, anemia eritrocítica pura y trombocitopenia idiopática), lupus eritematoso sistémico, policondritis, escleredema, granulomatosis de Wegener, dermatomiositis, hepatitis activa crónica, miastenia grave, psoriasis, síndrome de Stevens-Johnson, esprue idiopático, enfermedad intestinal inflamatoria autoinmune (incluida, por ejemplo, colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn), oftalmopatía endocrina, enfermedad de Graves, sarcoidosis, esclerosis múltiple, cirrosis biliar primaria, diabetes juvenil (diabetes mellitus tipo 1), uveítis (anterior y posterior), queratoconjuntivitis seca y queratoconjuntivitis primaveral, fibrosis pulmonar intersticial, artritis psoriásica, glomerulonefritis (con y sin síndrome nefrótico, por ejemplo, incluyendo el síndrome nefrótico idiopático o nefropatía de cambios mínimos) y dermatomiositis juvenil.

c) Tratamiento de leucemias caracterizadas por la hiperproliferación de linfocitos T, incluidas las leucemias de inducción viral, por ejemplo, leucemia inducida por HTLV-1 y leucemia linfocítica aguda.

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Dosificaciones y Formas de Dosificación

La invención proporciona un kit que contiene uno o múltiples compuestos capaces de fijarse a CD45 para su administración a pacientes que hayan recibido xenoinjertos. El kit puede incluir dichos compuestos en una formulación farmacéutica apropiada tal como una forma de dosificación unitaria, junto con uno o múltiples fármacos usados para suprimir el rechazo inducido por anticuerpos preexistentes. Estos fármacos podrían incluir ciclofosfonamida, desoxipergualina y similares.

Las dosificaciones adecuadas de dichos compuestos variarán, lógicamente, dependiendo, por ejemplo, de la enfermedad a tratar (por ejemplo, el tipo de enfermedad o la naturaleza de la resistencia), el efecto deseado, y el modo de administración. Las dosificaciones eficaces en humanos se pueden derivar de las dosificaciones eficaces en ratones y otros mamíferos a través de métodos conocidos en la técnica, es decir, la Patente de EE.UU. Nº 5.035.878.

Sin embargo, y por lo general, se obtienen resultados satisfactorios con la administración parenteral, por ejemplo, intravenosa, por ejemplo, por goteo o infusión i.v., a dosificaciones del orden de 0,01 hasta 2,5 a 5 mg/kg, por ejemplo, del orden de 0,05 hasta 0,1 a 10 mg/kg. Dosificaciones adecuadas para pacientes humanos se encuentran, por lo tanto, en el intervalo de 0,5 hasta 125 a 250 mg i.v., por ejemplo, en el intervalo de 2,5 hasta 50 mg i.v. Los compuestos se pueden administrar diariamente o en días alternos, o con menor frecuencia a dosificaciones descendentes para mantener un nivel mínimo de compuesto en sangre durante la estimulación antigénica, por ejemplo, después del trasplante del órgano o durante la fase aguda de una enfermedad autoinmune.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden preparar de forma convencional. Una composición según la invención se proporciona, preferentemente, en forma liofilizada. Para su administración inmediata, se disuelve en un vehículo acuoso adecuado, por ejemplo, agua estéril para inyección o solución salina fisiológica tamponada estéril. Si se considera deseable preparar una solución de mayor volumen para su administración por infusión en lugar de inyección de bolo, es conveniente incorporar albúmina de suero humano o sangre heparinizada del propio paciente a la solución salina en el momento de la formulación. La presencia de un exceso de esta proteína fisiológicamente inerte impide la pérdida de anticuerpos por adsorción en las paredes del recipiente y de los conductos que se utilizan con la solución de infusión. Si se emplea albúmina, una concentración adecuada es de 0,5 hasta 4,5% en peso de la solución salina.

En ensayos clínicos, por ejemplo, se seleccionan para terapia de profilaxis pacientes que se van a someter a un trasplante de riñón, hígado o corazón. El día del trasplante, 2 horas antes de la intervención, se administra una primera infusión intravenosa del compuesto, anticuerpo o mezcla de los mismos, a una dosis de 0,2 mg de cada compuesto o anticuerpo por kg de peso corporal. Dos días después de la intervención, se administra una infusión idéntica del compuesto y/o anticuerpo a una dosis de 0,4 mg/kg de peso corporal, repitiéndola a intervalos semanales durante un mes. Las infusiones intravenosas se preparan del modo siguiente: los compuestos y/o anticuerpos liofilizados se mezclan entre sí y se dispersan en 100 ml de solución salina tamponada estéril que contiene 4,51% en peso de albúmina humana. Esta dispersión salina se administra a los pacientes durante un período de 30 minutos.

Los compuestos de la invención son también útiles como ayudas diagnósticas, como reactivos diagnósticos o como componentes de un kit de diagnóstico para identificar sub-poblaciones de leucocitos particulares. Los compuestos se pueden marcar, por ejemplo, con fluorescencia o radiactividad, usando técnicas convencionales. Por ejemplo, 25 microgramos de anticuerpo monoclonal en 0,25 ml de fosfato sódico 0,12 M, a pH 6,8, se yodan usando 2 mCi de I^{125} y 10 microgramos de cloramina T. Después de 5 minutos a 23ºC, la reacción se interrumpe por la adición de 20 microgramos de metabisulfito sódico, 3 mg de KI y 1 mg de BSA. La proteína yodada se separa por cromatografía. Los compuestos marcados se exponen a un corte de tejido congelado que exhibe infiltración de leucocitos, por ejemplo, de un paciente que presenta síntomas de rechazo de injerto o enfermedad autoinmune aguda. Se retira por lavado el exceso de compuesto y se analiza el compuesto fijado. Una fijación sustancial de los compuestos a los leucocitos presentes en el corte de tejido permite suponer que la mayoría de los leucocitos implicados son leucocitos ingenuos y no de memoria, indicando, por tanto, que la terapia con los compuestos y/o inmunosupresores que actúan principalmente sobre la inmunorrespuesta mediada por células T, por ejemplo, Ciclosporina o FK-506, es apropiada.

Agentes Coadyuvantes

También se contempla la posibilidad de administrar un compuesto CD45RB anti-CD45 solo o con inmunosupresores o antiinflamatorios convencionales. Éstos incluirían ciclosporina, FK-506, leflunomida, rapamicina, ciclofosfamida, micofenolato Mofetil, desoxipergualina, corticosteroides, globulina anti-linfocitaria, OKT-3 y similares, y otros. El uso de los compuestos y/o anticuerpos de la invención permite esperar que se pueda reducir los requisitos de dosificación de estos fármacos y, de esta manera, reducir los efectos secundarios indeseados. Los compuestos también se pueden usar en combinación con otros anticuerpos monoclonales u otros compuestos que reconocen, de forma específica, sub-poblaciones de linfocitos particulares, por ejemplo, mAbs CD25, péptido de fusión CTLA4-Ig, etc.

Ex vivo, Acondicionamiento de los Linfocitos del Receptor

En algunos casos, la inmunosupresión y/o tolerización se puede potenciar administrando una cantidad de linfocitos derivados del receptor, que han sido acondicionados in vivo o ex vivo con los anticuerpos anti-CD45R útiles de la presente invención. Los linfocitos acondicionados o anergizados se pueden administrar antes, junto con, o después del trasplante y/o administración de los anticuerpos anti-CD45R, en una cantidad eficaz para inducir o ayudar a inducir inmunotolerancia en el receptor. Preferentemente, los linfocitos se obtienen del receptor antes del trasplante u otro tratamiento, se pre-acondicionan mediante la exposición a los anticuerpos empleados en el presente método, y se exponen a los antígenos del material del donante, antes de su reintroducción en el receptor.

Ejemplo 1 Anticuerpo Monoclonal de Ratón contra CD45RB

El anticuerpo monoclonal de ratón contra CD45RB se produce utilizando técnicas convencionales, básicamente de la forma descrita por Kohler y Milstein en Nature 256:49. Ratones BALB/C hembras (20-25 g) reciben 100 \mug de antígeno que contiene CD45RB humano, por ejemplo, la línea celular de Hodgkin DEV (disponible al público), por inyección i.p. (De forma alternativa, el antígeno puede comprender células de ratón que han sido transformadas para expresar CD45RB humano). Después de 2 semanas, se administra una segunda inyección de refuerzo que comprende 50 \mug del antígeno, también por inyección i.p. La presencia de anticuerpos reactivos contra el antígeno en el suero sanguíneo de los animales se confirma por análisis inmuno-histológico. Los ratones que exhiben los niveles máximos en suero sanguíneo del anticuerpo CD45RB reciben otra inyección de refuerzo que comprende 20 \mug de antígeno. Cuatro días más tarde, son sacrificados y se aíslan sus células esplénicas, fusionándolas con una línea de mieloma adecuada, por ejemplo, mieloma X63 (disponible al público). Los hibridomas resultantes se cultivan y seleccionan de acuerdo con la expresión del anticuerpo que posee una alta afinidad por CD45RB.

Una línea de hibridoma que produce anticuerpo monoclonal de ratón contra CD45RB humano es la línea de hibridoma MT3, depositada el 29 de marzo de 1993, de acuerdo con el Tratado de Budapest, en la American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, EE.UU. con la Designación de ATCC HB 11312.

Una segunda línea celular de hibridoma, que produce un anticuerpo monoclonal de rata contra CD45RB de ratón, es HB220 (designada en la actualidad MB23G2). Esta línea celular ha sido depositada en la ATCC y puede ser adquirida en ATCC.

Una tercera línea celular de hibridoma (depositada en la ATCC como HB 11873), produce anticuerpos de la invención (mAb 6G3). Esta línea celular de hibridoma se produjo por la fusión de la línea celular de mieloma SP2/0 y células esplénicas de un ratón inmunizado con la línea celular de linfoma no-Hodgkin de células B de células grandes VER humana. Los clones resultante se analizaron por un procedimiento de inmuno-peroxidasa sobre cortes de tejido congelado de amígdala humana y bazo de mono Rhesus. Se seleccionó el clon 6G3 debido a su elevada reactividad del mAb 6G3 con subconjuntos de linfocitos T y B en ambos tejidos. La reactividad de anticuerpo de 6G3 se caracterizó como anti-CD45RB por su reactividad selectiva con transfectantes que expresan CD45RB humanos, y por la caracterización del peso molecular del antígeno inmunoprecipitado por 6G3 como tres bandas, con pesos moleculares de 220, 204 y 190 kD. Fue posible abolir la reactividad del anticuerpo mediante el pre-tratamiento de tejidos, células o transferencias con neuraminidasa, lo que indica la dependencia del ácido siálico del antígeno.

Una cuarta línea celular de hibridoma, HB223, produce anticuerpos monoclonales análogos contra MB23G2; también está depositada y disponible a través de la ATCC.

Ejemplo 2 Anticuerpo Monoclonal Quimérico contra CD45RB a) Clonación del gen que codifica el dominio variable de la cadena pesada

Se aísla y digiere con EcoRI el ADN genómico del hibridoma deseado, en este ejemplo, el hibridoma MT3 o 6G3 del Ejemplo 1, y de las líneas celulares de mieloma parental de los hibridomas (mieloma X63 o SP2/0). A continuación, se fracciona cada ADN digerido en el mismo gel de agarosa. Tras la migración, se analiza el gel de agarosa por transferencia de Southern usando como sonda un fragmento de ADN XbaI-EcoRI de 0,7 kb marcado con P^{32} que codifica el potenciador de cadena pesada de ratón E\mu (Heinrich variable deseado, es decir, el fragmento deseado está presente en los hibridomas MT3 y et al., J. of Immunol. (1989) 143:3589), para identificar el fragmento de cadena pesada 6G3, pero no en el mieloma X63 o SP2/0. La purificación adicional de este fragmento se lleva a cabo, entonces, por electroforesis sobre gel de agarosa preparativa.

Se clonan fragmentos de ADN del mismo tamaño que el fragmento deseado en el sitio de restricción EcoRI del bacteriófago ZAP (Stratagene). Usando la sonda anteriormente descrita, se analizan los fagos recombinantes y clones seleccionados que hibridan con la sonda. Los insertos de ADN de los clones seleccionados se amplifican en un lisado de placa de fagos por reacción de cadena de la polimerasa (PCR), utilizando como cebadores un primer oligonucleótido que codifica el gen J_{x} de ratón y un segundo oligonucleótido que codifica el inicio de MT3 o la cadena pesada de 6G3. Los fragmentos de ADN obtenidos de cada uno de los clones seleccionados se analizan por transferencia de Southern utilizando como sonda un oligonucleótido que codifica una porción de la sonda E\mu anteriormente descrita.

b) Construcción de un gen de cadena pesada quimérico

El fragmento EcoRI (que comprende el gen del dominio variable de la cadena pesada de MT3 o 6G3 (incluidos el promotor y el potenciador)) se obtiene por digestión del ADN de uno de los clones de fago seleccionados en la etapa a) y se clona, seguidamente, en el sitio de restricción EcoRI del vector de expresión eucariota pSV2 neo-humano \gamma_{1}, parte constante (Heinrich et al., véase antes). Tras la propagación del plasmidio resultante, se determina nuevamente la secuencia de nucleótidos del gen que codifica el dominio de cadena pesada de MT3 o 6G3, para excluir la posibilidad de que se haya producido una mutación de este gen.

c) Clonación del gen que codifica el dominio variable de la cadena ligera

Se aísla y digiere con EcoRI el ADN genómico del hibridoma MT3 o 6G3 y de la línea celular parental X63 o SP2/0. A continuación, cada ADN digerido se fracciona sobre el mismo gel de agarosa. Tras la migración, se analiza el gel de agarosa por transferencia de Southern, utilizando como sonda un fragmento de ADN marcado con P^{32} que comprende los cinco genes J_{x} de ratón y el gen C_{x} de ratón. Se clonan en el fago EMBL4 (Stratagene) fragmentos EcoRI fraccionados por tamaño correspondientes, en tamaño, al dominio variable de la cadena ligera de MT3 o 6G3 deseado.

Se identifica un clon que contiene el fragmento de ADN que codifica la cadena ligera de MT3 o 6G3 mediante el análisis de los clones de fago recombinantes con la sonda descrita inmediatamente antes. A continuación, el fragmento de ADN deseado se sub-clona en el sitio EcoRI-XbaI de pGEM4 (Promega), y se determina su secuencia.

d) Construcción de un gen de cadena ligera quimérico

Se clonan entre sí un fragmento XbaI-XbaI que contiene la secuencia que codifica el potenciador de cadena pesada de ratón (Heinrich et al., véase antes), y un fragmento de ADN HindIII-SphI que contiene la secuencia para la parte constante \kappa humana (huC\kappa) en el fago mp18 (Stratagene). Se lleva a cabo una mutagénesis dirigida al sitio en el fago recombinante resultante para romper el sitio HindIII en la región codificadora deseada, seguido de digestión con EcoRI y HindIII para generar un fragmento de ADN que contiene las secuencias tanto para (E\mu) como para (huC\kappa). Después de completar los extremos de este fragmento, éste se sub-clona en el sitio EcoRI-BamHI de extremo romo de pSV2-DHFR para generar pSV2-DHFR-E\mu-huC\kappa. El plasmidio pSV2-DHFR se obtiene sustituyendo el fragmento BamHI-HindIII de pSV2-neo con un fragmento de BamHI-HindIII que codifica el gen de dihidrofolato-reductasa.

Por último, se aísla un fragmento de ADN EcoRI-XbaI que contiene la secuencia de cadena ligera de MT3 0 6G3 a partir del plasmidio pGEM4 recombinante de la etapa 3, y se sub-clona en pSV2-DHFR-E\mu-huC\kappa para dar pSV2-DHFR-E\mu-huC\kappa-MT3_{L} o pSV2-DHFR-E\mu-huC\kappa-6G3_{L}.

e) Expresión de un anticuerpo quimérico

Los plasmidios obtenidos en las etapas b) y d) se co-transfieren a la línea celular de mieloma de ratón SP2/0 (ATCC CRL 1581) por electroporación, utilizando un dispositivo pulsador de genes de Biorad. Se sabe que esta técnica crea transfectantes estables a una elevada frecuencia. La línea celular SP2/0 no es capaz de producir cadenas pesada y ligera endógenas y es sensible a Geneticina (G 418) a una concentración de 0,8 mg/l.

Se cultivan células SP2/0 en el medio de crecimiento habitual (RPMI + 10% de sangre bovina fetal (FCS, en sus siglas en inglés) 5x10^{-5} \beta-mercaptoetanol), se cosechan en la fase log de crecimiento y se lavan con tampón de electroporación (Bio-Rad). Se ajusta la concentración celular a 2x10^{7} células/ml. A 0,8 ml de esta suspensión celular se agregan 15-20 \mug de cada plasmidio. La mezcla se coloca sobre hielo y se deja reposar durante 10 min. A continuación, las células se someten a un pulso eléctrico (280 voltios; 4ºC) y nuevamente se dejan reposar durante 15 min. Las células se transfieren al medio de crecimiento habitual y se incuban a 37ºC en un incubador de CO_{2}.

Después de una incubación durante 3 días, se inicia la selección de la resistencia G 418. Las células se resuspenden en medio fresco que contiene 1,4 mg/ml de G 418. Los cultivos proporcionan células en crecimiento después de 10-14 días de incubación en presencia de G 418. Después de 2 semanas de incubación, se analiza en los sobrenadantes de los cultivo confluentes la expresión de IgG humana en un ELISA tipo emparedado (conjugado de cadena ligera \kappa anti-humana/sobrenadante/IgG-fosfatasa alcalina anti-humana).

Este ensayo indica que se secretan moléculas de anticuerpos completos en todos los cultivos a concentraciones variables, en el intervalo de 50-500 ng/ml.

Para seleccionar células en las que el gen DHFR está amplificado y que, por lo tanto, secretan grandes cantidades del anticuerpo deseado, se llevan a cabo dos procedimientos de selección de resistencia contra metotrexate (MTX) de la forma que se describe a continuación. Con este fin, se divide cada uno de los conglomerados de células resistentes a G 418 y se lleva a cabo una amplificación de acuerdo con el procedimiento A (incremento de MTX en un factor de 2 ó 2,5) o el procedimiento B (incremento de MTX en un factor de 5) (Tabla II).

TABLA II

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 Procedimiento A \+  \hskip2cm  \+ Procedimiento B\cr
\+\+\cr  MTX 100 nM \+ \+ MTX 200 nM\cr  MTX 250 nM \+ \+ MTX 1
 \mu M\cr  MTX 500 nM \+ \+ MTX 5  \mu M\cr  MTX 1  \mu M \+ \+ MTX
25  \mu M\cr  MTX 2,5  \mu M \+ \+ MTX 100  \mu M\cr  MTX 5
 \mu M\+\+\cr \+\+\cr  Procedimiento A \+ \+ Procedimiento B\cr
\+\+\cr  MTX 10  \mu M\+\+\cr  MTX 25  \mu M\+\+\cr  MTX 100
 \mu M\+\+\cr}

Cada etapa de amplificación comprende inocular las células a una densidad de 2x10^{5} células/ml en el medio de crecimiento habitual suplementado con G 418 a 1,4 mg/ml y con MTX a la concentración de elección. Después de 72 horas de incubación, se separan las células y el sobrenadante. Se controla la secreción de anticuerpo por ELISA o HPLC, utilizando una columna de proteína A. La mayor parte de los conglomerados alcanzan un nivel máximo de producción de anticuerpos específicos a una determinada concentración de MTX. Se clonan los conglomerados con mejor producción por dilución limitada. De varios centenares de clones analizados, se seleccionan los 15 clones con mejor producción. La productividad de los clones se encuentra en el intervalo de 30 a 50 mg de mAb/10^{9} células en 72 horas.

El anticuerpo se purifica a partir del sobrenadante de un cultivo por elución sobre una columna de afinidad de proteína A.

Ejemplo 3 Prevención In Vivo del Rechazo de Trasplantes Renales en Ratones

En este experimento, se llevó a cabo una nefrectomía derecha en 18 ratones y, al mismo tiempo, se practicó un aloinjerto (trasplante renal de una cepa diferente de ratones). En el séptimo día del postoperatorio (POD 7), se realizó una nefrectomía contralateral, de modo que, a partir de ese momento, los animales dependieron exclusivamente del riñón aloinjertado. Se trataron nueve de los ratones con 50 \mug de una combinación de anticuerpos monoclonales CD45RB anti-ratón de rata, producidos a partir de las líneas celulares HB220 y HB223, por vía i.v., durante los dos primeros días (POD 0 y POD 1), seguidos de 100 \mug de cada anticuerpo por vía intraperitoneal (i.p.) durante 9 días (POD 2 hasta POD 10). De los nueve animales de control, que no recibieron los anticuerpos anti-CD45RB, siete murieron tres días después de la extracción del riñón izquierdo, y los dos restantes mostraron un rechazo importante al cabo de una semana.

De los nueve animales tratados con los anticuerpos anti-CD45RB, hubo tres muertes debidas a complicaciones quirúrgicas no relacionadas con ninguna inmunorrespuesta, pero es destacable que los seis animales remanentes tuvieron una supervivencia prolongada (por ejemplo, más de 100 días) sin ningún tratamiento adicional y sin evidencia alguna de rechazo del aloinjerto. En un tercer grupo de 10 receptores de isoinjertos no tratados, la incidencia de muerte debida a complicaciones quirúrgicas fue idéntica. No hubo diferencias significativas entre los niveles de creatinina en suero del grupo de aloinjerto tratado con anticuerpos monoclonales y el grupo de isoinjerto, lo que indica que los riñones de ambos grupos estaban funcionando normalmente.

Ejemplo 4 Reversión del Rechazo de Trasplantes Renales en Ratones

En este experimento, se llevó a cabo una nefrectomía derecha en 10 ratones y, al mismo tiempo, se practicó un aloinjerto (trasplante de riñón de una cepa diferente de ratones).

Los diez animales se sometieron a observación durante cinco días sin terapia inmunosupresora. Se sabía que estaban experimentando un grave rechazo en esta fase porque los animales de control sacrificados, también sometidos a nefrectomía y trasplante renal en forma de aloinjerto, exhibieron un grave rechazo al quinto día.

En POD 5, cuatro de los animales recibieron tres dosis intraperitoneales diarias de 25 \mug de anticuerpo anti-CD45RB (una combinación de anticuerpos monoclonales de las líneas celulares HB220 (mAb MB23G2 anti-CD45RB) y HB223 (mAb MB4B4 anti-CD45RB)) durante los tres días siguientes. Los cuatro animales mostraron una rápida reversión de sus síntomas de rechazo, incluido el retorno a niveles normales de creatinina, y vivieron durante más de 100 días. Los animales no tratados murieron el noveno día a causa del rechazo del órgano. La Tabla III resume los resultados de este experimento.

TABLA III Reversión del rechazo de trasplantes renales en ratones

Ratón	Terapia	Días Supervivencia	Causa de la muerte
1	Ninguna	8	Rechazo / Uremia
2	Ninguna	9	Rechazo / Uremia
3	Ninguna	8	Rechazo / Uremia
4	Ninguna	9	Rechazo / Uremia
5	Ninguna	9	Rechazo / Uremia
6	Ninguna	9	Rechazo / Uremia
7	CD45RB	>100	-
8	CD45RB	>100	-
9	CD45RB	>100	-
10	CD45RB	>100	-

Estos datos relativos a la reversión son importantes por confirmar que la terapia con anticuerpos es altamente eficaz en la supresión de la inmunorrespuesta. Los tratamientos y curaciones se logran con terapia de anticuerpos.

Ejemplo 5 Resultados de Confirmación Usando MB23G2 y MB4B4 por Separado en Trasplantes Renales en Ratones

En los ratones Balb/c (h-2d) receptores se extrajo el riñón derecho antes de recibir el riñón trasplantado de ratones C57B1 (h-2b) donantes. Posteriormente, el séptimo día se practicó la nefrectomía del riñón izquierdo original. Hubo cuatro grupos de animales. 13 recibieron isoinjertos, 17 aloinjertos sin inmunosupresión (control vehículo), 44 recibieron aloinjertos y se les administraron dos dosis de 1 mg/kg (30 \mug) de mAb MB23G2 anti-CD45RB de ratón de rata, por vía intravenosa en los días 0 y 1, y 16 recibieron aloinjertos, pero se les trató con dos dosis de 1 mg/kg (30 \mug) de mAb MB4B4 anti-CD45RB de ratón de rata, purificado, por vía intravenosa en los días 0 y 1. No se administró ningún anticuerpo adicional.

Como era de esperar, los animales tratados con MB23G2 mostraron una prolongada supervivencia en comparación con el grupo no tratado (p<0,002) (véase la Fig. 1), y fue comparable con el grupo de isoinjertos. Es de destacar que el mAb MB4B4 anti-CD45RB no fue mejor que el vehículo solo en la prevención del rechazo. Tanto MB23G2 como MB4B4 son IgG2a, pero existe una diferencia entre ellos. Ambos mAbs se fijan a los leucocitos Balb/c como se ha analizado por FACS (siglas en inglés de "Fluorescence Activated Cell Sorting"). Sin embargo, la fijación de MB23G2 sufre la inhibición de la neuraminidasa, en tanto que la fijación de MB4B4 no se ve afectada por este tratamiento. La Figura 2 muestra los niveles de creatinina en suero en los animales de cada grupo en el momento del sacrificio, o después del día 100 en los supervivientes a largo plazo. No hubo diferencias entre los grupos de isoinjerto y tratado con MB23G2, mientras que los animales no tratados y tratados con MB4B4 murieron por uremia. Por lo tanto, el epítopo glicosilado para MB23G2 está implicado, o se encuentra próximo a los sitios que intervienen en la actividad bioquímica de CD45RB. El epítopo no glicosilado para MB4B4 no parece ser crítico para la actividad de CD45RB.

Se llevaron a cabo estudios microscópicos de inmuno-peroxidasa en aloinjertos renales a los 7 días en tres grupos de ratones: no tratados, tratados con MB4B4, y tratados con MB23G2. Los cortes se tiñeron con mAb anti-ratón de rata reactivos con CD3, CD4, CD8, CD45RB y Ia de ratón. Los frotis se evaluaron de forma enmascarada con respecto a los agregados e infiltrados difusos, según describen Ibrahim et al., Transplantation Vol. 59, págs. 724-728. Se realizó el recuento del número de células en los infiltrados difusos en 10 campos de alta potencia (HPF en sus siglas en inglés) (x 400) en cada corte de 5 ratones por grupo, y los datos se muestran en la siguiente Tabla IV.

TABLA IV Infiltrados celulares difusos en aloinjertos renales a los 7 días (valores medianos/HPF)

Fenotipo	mAb	No tratados	Tratados con MB4B4	Tratados con MB23G2
CD3	KT3	33	38	22*
CD4	GK1.5	10	11	9
CD8	3.155	27	26	13*
CD45RB	MB23G2	12	10	9
*P<0,05. Diferencias estadísticamente significativas entre grupos tratado con MB23G2
y no tratado, y entre grupos tratado con MB23G2 y tratado con MB4B4.

Es interesante comprobar que las diferencias entre los tres grupos de ratones resultaron evidentes después de contar por separado las células en los agregados e infiltrados difusos. La tinción para Ia fue claramente menor en los aloinjertos tratados con MB23G2 que en los otros grupos, pero debido a la tinción positiva de otros tipos de células intersticiales, no fue posible cuantificar de manera fiable el número de linfocitos. Los agregados contuvieron elevados números de células CD4+ y CD8+ en los tres grupos. Mientras que las cifras de células CD4+ y CD45RB+ en los infiltrados difusos fueron aproximadamente equivalentes en los tres grupos (Tabla III, segunda y cuarta filas), las cifras de células CD3+ y células CD8+ en los infiltrados difusos fueron estadísticamente diferentes entre el grupo tratado con MB23G2 y los otros grupos (Tabla III, primera y tercera filas). De esta forma, los animales tratados con MB23G2 exhibieron una elevada relación CD4:CD8 en comparación con los animales tratados con MB4B4 y los no tratados. Es de destacar que pocas de las células infiltrantes fueron CD45RB-positivas, un hallazgo particularmente notable si se considera que el mAb MB23G2 contra CD45RB pudo revertir el rechazo agudo.

Ejemplo 6 Inmunotolerancia

Con el fin de evaluar la posibilidad de tolerancia específica contra antígenos, se llevaron a cabo trasplantes de piel en 13 animales del Ejemplo 5 que habían conservado un trasplante renal durante más de 100 días, después de haber recibido 2 dosis de mAb MB23G2 en el momento del aloinjerto renal. Cada animal recibió aloinjertos de piel de grosor completo procedente de un ratón C57B1/6 (isogeneico con el donante del aloinjerto renal), y un trasplante de piel de control: 9 recibieron un isoinjerto de Balb/C y 4, un aloinjerto de CBA (donante de una tercera parte). No se administró inmunosupresión adicional. De los 13 animales con tolerancia específica al riñón, hubo un subconjunto de 4 que mostraron tolerancia específica al aloinjerto del donante, puesto que no rechazaron la piel de C57B1/6. Los 4 animales rechazaron la piel de CBA de la tercera parte, en tanto que los 9 isoinjertos de Balb/C sobrevivieron de forma indefinida. Los trasplantes de piel no estimularon rechazo alguno del aloinjerto renal.

Ejemplo 7 Reversión del Rechazo de Aloinjerto

Con el fin de determinar si el mAb MB23G2 era capaz de revertir el rechazo agudo, se practicaron siete aloinjertos de la manera descrita en el Ejemplo 5, pero no se administró inmunoterapia hasta el día 4. Los riñones aloinjertados no tratados exhibieron rechazo en ese momento. Los animales tratados recibieron 1,5 mg/kg (50 \mug) de MB23G2, i.v., diariamente en los días 4, 5 y 6 y, a partir de entonces, ninguna terapia adicional. Tres animales murieron por complicaciones registradas en los uréteres en el grupo tratado con MB23G2; la histología del injerto no reveló rechazo en el momento de la muerte en los días 8, 9 y 25. En todos los animales se produjo la reversión del rechazo y los 4 remanentes sobrevivieron >60 días con valores normales de creatinina en suero.

Ejemplo 8 Efecto de MB23G2 sobre la Composición de la Sangre

Los efectos farmacológicos de MB23G2 sobre la sangre periférica del ratón se evaluaron utilizando un análisis FACS de múltiples parámetros. Los ratones fueron tratados con 30 \mug de mAb MB23G2 por vía intravenosa en dos días consecutivos. Como se ve en la Fig. 3A, MB23G2 indujo una depleción significativa de los linfocitos circulantes, que volvieron a la normalidad una semana después de interrumpir la administración del mAb. MB23G2 se fijó a prácticamente todos los restantes linfocitos T y B circulantes (Fig. 3B y 3C). El análisis FACS no puso de manifiesto ningún exceso de anticuerpo MB23G2 en el plasma en el día 8.

El análisis FACS del bazo demostró que la terapia administrada penetró en el tejido linfoide 24 horas después de la segunda dosis de MB23G2. Un ensayo de inhibición por FACS no reveló sensibilización de ninguno de los ratones frente al mAb MB23G2 hasta 2 semanas después de la terapia.

Dado que CD45 es una proteína tirosina fosfatasa, se diseñaron ensayos para demostrar que la inducción de tolerancia al aloinjerto por el mAb MB23G2 está relacionada con una alteración de la fosforilación de tirosina de los sustratos de células T necesaria para que se produzca la transducción de señales.

Ejemplo 9 Mecanismo de la Inducción de Tolerancia por medio del Anticuerpo Monoclonal CD45RB: Aumento de la Fosforilación de Tirosina de la Fosfolipasa C-\gamma1 y Expresión Reducida de Citoquinas Inflamatorias

Se estimularon células A1.1 del hibridoma de células T de ratón con el mAb CD3 2C11, en presencia o ausencia del mAb MB23G2 p MB4B4. Las células se lisaron en Brij 96 y las proteínas que contenían fosfotirosina se inmuno-precipitaron con mAb anti-fosfotirosina PY72. Las proteínas inmuno-precipitadas se extrajeron y separaron sobre geles de SDS-poliacrilamida al 10%, se transfirieron por electroforesis a membranas PVDF y se sometieron a un procedimiento de inmuno-transferencia (Véase Lazarovits et al., J. Immunol., 153, 3956 (1994)), utilizando el mAb anti-fosfotirosina 4G10.

Se observó un incremento de la fosforilación de tirosina de un sustrato de 145 kD en presencia del mAb contra CD45RB MB23G2. El mAb MB4B4 no alteró la fosforilación de tirosina de este sustrato. Se confirmó la identidad de esta banda de 145 kD como PLC-\gamma1 retirando por destilación el mAb 4G10 de las transferencias y volviendo a sondear con un anticuerpo monoclonal contra la fosfolipasa C-\gamma1 (PLC-\gamma1) (Upstate Biotech, Lake Placid, NY). De este modo, en presencia de MB23G2, se pudo identificar una cantidad sustancialmente mayor de PLC-\gamma1 fosforilada con tirosina que con su ausencia, en tanto que MB4B4 no alteró la cantidad de (PLC-\gamma1) que se pudo inmuno-precipitar. La fosforilación de tirosina aumentada de (PLC-\gamma1) ha sido señalada por Gajewski et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 91, págs. 38-42 (1994)) como propia de las células T anérgicas.

Dado que la activación de genes es una consecuencia de la transducción de señales en células T, se llevaron a cabo experimentos para investigar si el mAb MB23G2 podía alterar la expresión de genes de citoquinas in vivo, de los que se sabe que están aumentados en el rechazo de aloinjertos. Por lo general, se considera que un denominado perfil de citoquinas TH1 (IL-2, \gamma-interferón) se encuentra asociado con el rechazo, en tanto que el fenotipo TH2 (IL-4, IL-5, IL-6, IL-10) podría estar asociado con la ausencia de respuesta (véase T.R. Mosmann et al., J. Immunol., 136, 2348 (1986)).

Con el fin de examinar la expresión de genes en aloinjertos renales de ratón, se evaluaron los niveles en estado constante de trascriptos de ARNm específico por análisis de transferencia de Northern utilizando sondas de ADNc marcadas con P^{32}. Se examinó la expresión génica en cuatro grupos de animales: isoinjertos en el día 7 del postoperatorio, aloinjertos de animales no tratados en el día 7 del postoperatorio, y aloinjertos de animales tratados con MB23G2 en los días 7 y 28 del postoperatorio. No se detectó ningún patrón específico de IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6 o IL-10. Sin embargo, hubo un descenso selectivo, en el día 28, de trascriptos de ARNm para el \gamma-interferón y el factor de necrosis tumoral \alpha en comparación con los aloinjertos no tratados. El día 7 no se registró ninguna diferencia. Es interesante señalar que el ARNm de la molécula de adhesión celular 1 (ICAM) disminuyó también en los animales tratados con MB23G2 en el día 28, sin que se observaran diferencias en el día 7. De esta forma, la terapia con MB23G2 puede inducir tolerancia, en parte, mediante la inhibición de la expresión de citoquinas inflamatorias, debido a la interferencia con la cascada de la transducción de señales.

En todavía otros experimentos, se encontró que el uso de anticuerpos anti-CD45RB fue eficaz al administrarlo a primates.

Ejemplo 10 Prevención del Rechazo de Órganos en Primates y Reversión del Rechazo de Órganos

Se practicaron aloinjertos renales en dos monos Cynomolgus, empleando un anticuerpo monoclonal CD45RB (que se fija a un epítopo sensible a la neuraminidasa) como inmunosupresor. Los detalles de la intervención fueron los siguientes:

Procedimientos Experimentales Detallados 1. Cuidado de los Animales

Los animales se alojaron en las instalaciones para primates de la Universidad de Ontario Occidental. Se les introdujo en jaulas estrechas que permiten administrar las inyecciones de fármacos y la recogida de muestras sin tener que anestesiar a los animales, con lo que se reduce el estrés. Se les administró la dieta convencional para monos, junto con otros alimentos que contribuyeron a la diversidad de la dieta. Se les permitió ejercitarse de manera regular en jaulas de ejercicio. El cuidado de los animales se atuvo a los procedimientos quirúrgicos convencionales para primates no humanos proporcionados por servicios veterinarios.

Se determinaron los tipos de grupo de sangre de los animales. A su llegada, los animales reposaron al menos durante 2 semanas. Se les anestesió con atropina y ketamina para su exploración física, incluida la inspección del virus B oral, ensayos de TB y se desparasitaron con Invernectin 2828. Los animales se sometieron a ayuno la noche previa a la administración de cualquier anestésico.

2. Trasplante renal 1. Procedimiento de donación

Se inyectó ketamina a dos animales donantes, se les llevó al quirófano, se les intubó y fueron anestesiados con isofluorano/óxido nitroso. Se utiliza una preparación quirúrgica de tres etapas. Tras la incisión en la línea media de los dos, se aislaron y dividieron cuidadosamente la arteria y la vena renales y el uréter izquierdos. Los injertos se perfundieron ex vivo y se almacenaron a 4ºC en solución de la Universidad de Wisconsin. Se cerraron las heridas y los animales regresaron a sus jaulas para recuperarse de la anestesia. Durante la intervención, se administraron 200-300 ml de solución salina por vía i.v. continua. Durante la cirugía, los animales se mantuvieron calientes utilizando una lámpara calefactora, solución salina caliente y una almohadilla caliente, etc.

Los cuidados postoperatorios se atuvieron a los Procedimientos Quirúrgicos Convencionales. En resumen, los animales permanecieron sobre una manta de agua caliente y bajo una lámpara calefactora durante 24 horas. Se administró buprenorfina cada 6 h después de la operación, durante 24 horas. Se les controló a diario. Los animales donantes bien recuperados se utilizan como receptores en futuros trasplantes. El intervalo entre las dos intervenciones es de al menos dos semanas.

2. Procedimiento de recepción

El receptor se anestesió y sometió a preparación preoperatoria de la forma descrita para los donantes. Tras la incisión de la línea media, se expusieron la aorta abdominal y la vena cava inferior. Se llevaron a cabo anastomosis extremo-laterales entre la arteria renal del donante y la aorta del receptor, así como entre la vena renal del donante y la vena cava inferior del receptor. El uréter del donante se suturó a la vejiga del receptor. Se extrajo el riñón derecho y se cerró la herida.

3. Cuidados postoperatorios

Los cuidados postoperatorios son los mismos que se han descrito para el donante. Los animales se sometieron a un control continuo postoperatorio durante al menos 24 horas, y más en caso necesario. Se les sometió a una estrecha monitorización (es decir, varias veces al día) hasta que la alimentación y el acicalamiento se normalizaron. A continuación, se les monitorizó al menos una vez al día cuando recibieron su anticuerpo monoclonal.

Los animales recibieron 4 mg de mAb 6G3 anti-CD45RB por vía i.v. al día, durante 7 días. El resultado de los injertos renales se midió por biopsia cutánea semanal y los niveles de creatinina en sangre dos veces por semana. Para estos procedimientos, los animales fueron anestesiados con ketamina. Los criterios para una eutanasia precoz incluyeron letargo, falta de acicalamiento o alimentación, pérdida significativa de peso (>20%) e insuficiencia renal (niveles elevados de creatinina).

Como se ha señalado anteriormente, los animales receptores recibieron 4 mg (1 mg/kg) de mAb 6G3 anti-CD45RB durante 7 días después de la operación. No hubo efectos secundarios asociados con estas infusiones. Ambos animales sobrevivieron normalmente hasta el día 16, cuando experimentaron una aguda crisis de rechazo. El primer animal se sacrificó por eutanasia 2 días más tarde, en el día 18. El segundo animal se volvió a tratar con 4 mg/kg (16 mg) de mAb 6G3 anti-CD45RB. Esta terapia se administró diariamente por vía i.v. durante cuatro días. Es de destacar que las crisis de rechazo cesaron por completo, mientras se observó que el animal recuperó sus actividades normales y los niveles de creatinina disminuyeron desde un nivel de "crisis" de 738 \mumol/l a 366 \mumol/l. El animal se mantuvo bien hasta el día 36, cuando desarrolló otra crisis de rechazo. Se le sacrificó por eutanasia. La histología del aloinjerto reveló que se produjo una profunda endotelitis el día 15 del postoperatorio, inmediatamente antes de la administración de la terapia adicional que condujo a la reversión. Se realizó una biopsia del aloinjerto de este animal el día 23 del postoperatorio, que demostró la eliminación de la endotelitis.

Se sabe que los animales de control morirán el día 10 si no se administra terapia en este tipo de modelo. (Lazarovits et al., Kidney Intern., 25, 344 (1984)).

Los datos permiten llegar a dos conclusiones:

[1] Dado que los dos monos vivieron más allá de la fecha conocida de los controles, se demuestra que la terapia de la invención exhibe una considerable supervivencia del injerto en un primate.

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[2] Resulta todavía más llamativa la observación de que es posible revertir un rechazo agudo con anticuerpos monoclonales anti-CD45RB.

Ejemplo 11 Experimentos Adicionales en Monos

Otros dos monos Cynomolgus adicionales (nº 3 y nº 4) han recibido aloinjertos renales y han sido tratados con el anticuerpo monoclonal 6G3 anti-CD45RB como única forma de inmunosupresión. Se determinó el grupo de sangre para controlar la compatibilidad ABO y se obtuvieron los perfiles complejos de histocompatibilidad principales usando el tipaje de ADN por PCR para confirmar que se estaban realizando trasplantes renales alogeneicos.

El día cero, se practicó una nefrectomía en el animal receptor y se llevó a cabo el aloinjerto renal. El sétimo día, se extrajo el segundo riñón original y desde ese momento el animal dependió de su riñón trasplantado. Los animales que no reciben inmunosupresión o que reciben inmunosupresión ineficaz lo rechazarán en un período medio de 10 días \pm 2 días (Lazarovits et al., Kidney Intern., 25, 344 (1984)).

Mono nº 3

Este animal fue tratado con 2 mg/kg/día (8 mg) de anticuerpo 6G3 durante 7 días y, a continuación, se administraron 6 dosis adicionales los lunes, miércoles y viernes de cada una de las dos semanas siguientes. De esta forma, se programó administrar 8 mg de anticuerpo 6G3 a lo largo de tres semanas. El animal desarrolló un rechazo el día 14 y fue sacrificado por eutanasia.

Mono nº 4

Este animal recibió la misma terapia que el mono nº 3, es decir, 8 mg de anticuerpo 6G3 por vía intravenosa en 13 dosis durante tres semanas. Este animal ha mostrado resultados destacadamente buenos y continúa vivo más allá de 70 días. No se ha diagnosticado rechazo.

Por consiguiente, los animales nº 3 y nº 4, tratados con 6G3, han mostrado una supervivencia significativamente incrementada del aloinjerto, que se ilustra en la Fig. 4. El mono nº 2 del Ejemplo 8 resulta particularmente interesante, porque el anticuerpo revertió eficazmente el rechazo agudo que había sido predicho por los experimentos de trasplante renal en ratones. En la actualidad, se están llevando a cabo experimentos adicionales para intentar determinar la causa del fracaso relativamente prematuro del injerto en los monos nº 1 y nº 3, si bien estos dos animales exhibieron también una supervivencia significativamente prolongada del aloinjerto.

Ejemplo 12 Prevención In Vivo del Rechazo de Trasplantes de Corazón en Ratones Ratones

Se realizaron trasplantes de corazón heterotópicos de ratones C57B1/6 en donantes Balb/C esencialmente de la forma descrita por R.L. Kirkman et al., (1985), Transplantation 40: 719-722. Siete de los ratones recibieron 30 \mug i.v. del mAb MB23G2 anti-CD45RB de ratón los días 0 y 1 después del trasplante de corazón. Otros cuatro ratones recibieron 30 \mug i.v. los días 0 y 1, y 100 \mug i.p. del mAb MB23G2 anti-CD45RB de ratón, diariamente los días 2 a 11 después del trasplante de corazón. 14 ratones de control no recibieron ningún anticuerpo. La supervivencia del injerto heterotópico se determinó estableciendo si el corazón latía y el rechazo se confirmó por análisis histológico.

Todos los ratones de control habían rechazado el corazón hacia el día 14 del postoperatorio, con un tiempo medio de supervivencia de 9 días. El tiempo medio de supervivencia de los corazones en el grupo que recibió el anticuerpo durante dos días solamente fue de 20 días, y el tiempo medio de supervivencia de los corazones en el grupo tratado con el anticuerpo durante 11 días fue de 34 días. La Tabla V resume los resultados de este experimento.

TABLA V Aloinjertos cardiacos en ratón

Grupos	Número	Supervivencia (días)	Media
No tratados	14	8,8,9,9,9,9,9,9,9,10,11,11,11,14	9
mAb CD45RB	7	16,16,17,22,24,23,24	20
30 \mug D0, D1
mAb CD45RB	4	15,30,38,38	34
30 \mug i.v., D0, D1
y 100 \mug i.p. x 9 días

Evidencia adicional de la utilidad del anti-CD45RB se puso de manifiesto en los siguientes estudios.

Ejemplo 13 Prevención In Vivo del Rechazo de Trasplante de Aloinjerto de Islotes Pancreáticos en el Ratón

Se trasplantaron aloinjertos de islotes pancreáticos bajo la cápsula renal de donantes CBA/J en receptores Balb/C tratados con estreptozotocina, esencialmente de la forma descrita por M.C. Fabian et al., Transplantation, 56, 1137 (1993). Cinco ratones de control no recibieron ningún anticuerpo, en tanto que once ratones recibieron 30 \mug i.v. de mAb MB23G2 anti-CD45RB de ratón de rata los días 0 y 1 después de la operación. El rechazo se definió como la aparición de glicosuria. Todos los aloinjertos de islote de los rayones de control habían sido rechazados hacia el día 24, con un tiempo medio de rechazo de 17 días. Los ratones tratados con el anticuerpo mostraron un tiempo medio de rechazo de 34 días, con dos ratones que no mostraron signos de rechazo el día 50, cuando se interrumpió el experimento.

La Tabla IV resume los resultados de este experimento.

TABLA VI Aloinjertos de islotes pancreáticos de ratón

Grupos	Número	Supervivencia (días)	Media
No tratados	5	12,12,15,24,20	17
mAb CD45RB, 30	11	23,32,20,30,30,>50,	34
\mug i.v., D0, D1		>50,21,23,47,50

Ejemplo 14 Inducción de Tolerancia a los Aloinjertos de Modelos de Trasplante de Rata a Ratón

Con el fin de evaluar si el anticuerpo monoclonal anti-CD45RB puede prevenir el rechazo de injertos renales xenogeneicos, se practicaron xenoinjertos renales ortotópicos en ratones Balb/C con ratas Lewis como donantes. Se estudiaron cinco grupos de receptores: sin tratamiento (Controles), tratamiento con ciclosporina (CsA) (5 mg/kg s.c. a diario), esplenectomía (Spl), tratamiento con ciclofosfamida (CyP) (20 mg/kg en POD 0, 2, 4 y 7), tratamiento con mAb MB23G2 (100 \mug diarios x 11 días, i.p.), y tratamiento combinado con mAb MB23G2 (100 \mug x 11 días) y CyP (20 mg/kg, i.v. en POD 0, 2, 4 y 7). Como se muestra a continuación en la Tabla VII, los animales tratados con mAb MB23G2 y CyP tuvieron un tiempo medio de supervivencia significativamente más prolongado que los animales tratados con el mAb solo o CyP solo, lo que demuestra que el mAb contra CD45RB y CyP tienen un efecto sinérgico en la prolongación de xenoinjertos renales en el ratón.

TABLA VII Xenoinjertos renales de rata a ratón

Grupo	n	Tratamiento	Supervivencia (días)	Supervivencia Mediana (días)
Control	6	Ninguno	6(4), 7, 16	6
CsA	3	Ciclosporina	4,6,8	6
Spl	5	Esplenectomía	4,5,6,7,11	6
CyP	8	Ciclofosfamida	10,18,23,24,28,49,58,	26
			>100
mAb	6	MB23G2	4,6,8,8,11,13	8
mAb + CyP	9	CyP + MB23G2	9,11,23,24,70,76,>100	70*
			(3)
*P<0,01, grupo de mAb vs. grupo de control.

El objetivo último del xenotrasplante clínico es inducir tolerancia al xenoinjerto, eliminando de esta forma el uso continuo de inmunosupresión tóxica a dosis elevadas. Recientemente, se ha demostrado en un modelo de xenoinjerto de corazón de hámster a ratón que la combinación de terapia pulsada con CyP y tratamiento continuo con CsA induce una prolongada supervivencia del injerto. Véase Hasan et al., Transplantation, 54, 408 (1992). Sin embargo, al interrumpir la terapia con ciclosporina, los xenoinjertos fueron rechazados en un corto plazo de tiempo, es decir, el tiempo mediano de supervivencia fue menor de tres semanas. Por lo tanto, la terapia con CyP y CsA fue incapaz de inducir tolerancia al xenoinjerto.

Por el contrario, como se muestra en la anterior Tabla VII, los xenoinjertos en animales tratados con mAb contra CD45TB y CyP continuaron sobreviviendo durante varios meses después de interrumpir la terapia inmunosupresora. Adicionalmente, los xenoinjertos renales de supervivencia prolongada, tratados con mAb y CyP, exhibieron una función renal normal y patología normal en el sacrificio en POD 100. Estos resultados demuestran que el tratamiento con mAb contra CD45RB y CyP puede inducir tolerancia funcional al xenoinjerto en un modelo de rata a ratón. Esta terapia se puede aplicar en la prevención del rechazo de trasplantes en el ser humano.

Ejemplo 15 Tratamiento In Vivo de Ratones NOD para Inhibir el Inicio de la Diabetes

Cinco ratones NOD hembras se trataron con 30 \mug i.v. de mAb MB23G2 anti-CD45RB de ratón de rata en los días 28, 29 y 30 después del nacimiento. Cinco ratones de control no recibieron tratamiento con anticuerpos. En la semana 27, todos los ratones de control había muerto como consecuencia de la diabetes. De los ratones tratados con anticuerpo, dos murieron de diabetes, en tanto que los otros 3 permanecieron vivos y en buen estado hasta la semana 35, cuando fueron sacrificados y se examinaron histológicamente sus páncreas. En ninguno de los tres animales supervivientes hubo signos de insulitis.

La Tabla VIII resume los resultados de este experimento.

TABLA VIII Inicio de la diabetes en ratones NOD

Grupos	Número	Supervivencia sin diabetes
No tratado	5	0 (todos muertos a las 27 semanas)
mAb CD45RB, 30 \mug i.v.	5	3 >35 semanas
días 28, 29, 30

Desde que se llevó a cabo este experimento preliminar, se han realizado ensayos adicionales. La terapia en estos experimentos comprendió la administración de 100 \mug de MB23G2 dos veces por semana, desde la semana 2 hasta la 35, momento en que todos los ratones supervivientes se sacrifican por eutanasia. Los resultados se muestra en la siguiente Tabla IX:

TABLA IX Supervivencia de ratones NOD (semanas)

Terapia	Semanas de supervivencia	Puntuación de insulitis* (media)
MB23G2 (n = 9)	35(6), 20(2), 13	0,99
Control (n = 12)	34(2), 30(2), 28, 23, 18, 16,	1,81
	15, 14, 13, 12
*Puntuación de insulitis obtenida de 6 animales adicionales en cada grupo a las 15 semanas

Sobre la base de los datos, un número significativamente mayor de animales sobrevivió de forma indefinida, es decir, hasta el final del experimento de 35 semanas, en comparación con los controles. La mejoría inducida por MB23G2 resulta evidente no sólo en la supervivencia de los animales, sino también en cuanto a la glucemia, ya que ninguno de los animales que sobrevivieron 35 semanas mostró evidencias de hiperglucemia. El efecto beneficioso de MB23G2 se confirmó también por la puntuación de insulitis, que es una cuidadosa evaluación histológica del páncreas. La diferencia entre 1,81 y 0,99 es significativa tanto desde el punto de vista biológico como estadístico.

Ejemplo 16 Prevención del Rechazo de Injerto de Piel

Cuatro grupos de ratones de cepa A (blancos) recibirán injertos de piel de ratones de cepa C57/BL/10 (negros): los grupos I y II recibirán tratamiento previo con mAb anti-CD45RB de ratón de rata y los grupos III y IV no recibirán tratamiento previo con mAb anti-CD45RB de ratón de rata. Después de la operación de injerto de piel, los grupos I y III se tratan con mAb anti-CD45RB de ratón en diversos días, en tanto que los grupos II y IV no reciben tratamiento adicional con anticuerpos. La eficacia del tratamiento con anticuerpos para prevenir el rechazo del injerto de piel se determina comparando la duración de supervivencia del injerto de piel negra en los ratones receptores blancos en los cuatro grupos.

Ejemplo 17 Reacción Localizada de Injerto contra Hospedador (GvH)

La eficacia in vivo de los compuestos se demostrará en un modelo animal adecuado, como se describe, por ejemplo, en Ford et al., Transplantation, 10, 258 (1970). El día 0 se inyectan células esplénicas (1 x 10^{7}) de ratones hembras de 6 semanas de edad, por vía subcutánea, en la pata trasera izquierda de ratones de una cepa diferente, de 100 g de peso, aproximadamente. Los animales son tratados durante 4 días consecutivos, y el día 7 se extraen y pesan los ganglios linfáticos poplíteos. La diferencia de peso entre los dos ganglios linfáticos se toma como parámetro para evaluar la reacción.

Ejemplo 18 Artritis por Adyuvante de Freund

La eficacia sobre la artritis inducida experimentalmente se puede demostrar utilizando el procedimiento descrito, por ejemplo, en Winter y Nuss, Arthritis and Rheumatism 9 (1966), 394; Billingham Davies, Handbook of Experimental Pharmacol. (Vane y Ferreira Eds., Editorial Springer, Berlín) 50/II (1979), 108-144. En ratones (machos o hembras, 150 g de peso corporal) se inyectan en la base del rabo o en la para trasera 0,1 ml de aceite mineral que contienen 0,6 mg de Mycobacterium smegmatis degradado por calor y liofilizado. En el modelo de artritis en desarrollo, el tratamiento se inicia inmediatamente después de la inyección del adyuvante (días 1-18); en el modelo de artritis establecida, el tratamiento se inicia el día 14, cuando la inflamación secundaria está bien desarrollada (días 14-20). AL final del experimento, se mide la inflamación de las articulaciones por medio de un micro-calibre. DE_{50} es la dosis oral en mg/kg que reduce la inflamación (primaria o secundaria) a la mitad de la de los controles.

Ejemplo 19 Tratamiento In Vivo de Ratones NZB para Inhibir el Inicio de la Enfermedad Autoinmune Similar al Lupus

Los ratones de cepa negra de Nueva Zelanda (NZB) mueren con amplios y diversos síntomas de anemia hemolítica, glomerulonefritis y vasculitis, todos ellos muy semejantes al lupus eritematoso sistémico (SLE) humano. En este modelo de ratón se evalúa la eficacia de la presente invención en el tratamiento del SLE, administrando a ratones NZB recién nacidos el mAb MB23G2 anti-CD45RB de ratón de rata en diversos tiempos después del nacimiento y analizando, seguidamente, en los ratones tratados y no tratados la aparición de una enfermedad autoinmune, en particular de glomerulonefritis, que es una característica importante también del SLE humano.

Ejemplo 20 Evaluación In Vitro de la Actividad Inmunomoduladora de los Reactivos CD45

Se ha evaluado in vitro la capacidad de los anticuerpos anti-CD45 humano para suprimir la activación de las células T humanas, utilizando el método siguiente.

Se aislaron células mononucleares de la sangre periférica de voluntarios por centrifugación de gradiente de densidad de Ficoll-Hypaque. Las células se estimularon en RPMI 1640 con sangre bovina fetal al10% con OKT3 o un anticuerpo no reactivo de control, durante períodos de 1-4 días. Por medio del análisis de FACScan se determinaron los porcentajes de células CD3, CD4 y CD8 positivas para CD69 como marcador de la activación precoz, y CD25 como marcador de activación tardía. Poppema et al., Leukemia and Lymphoma, 20, 217 (1996). El efecto de los anticuerpos CD45 y CD45R se midió agregando estos reactivos en solitario o combinados. Transferencias de Western de los lisados celulares se tiñeron con anticuerpo 4G10 anti-tirosina fosforilada para investigar el papel potencial de la desfosforilación como resultado de la actividad tirosina fosfatasa de CD45. June et al., J. Immunol., 144, 1591 (1990).

Como se muestra en la siguiente Tabla XIII, OKT3 determinó la expresión de CD25 en aproximadamente 70% de las células T el día 4, en tanto que la exposición al anticuerpo no reactivo de control dio como resultado una expresión de CD25 de aproximadamente 10%. Ninguno de los anticuerpos CD45(R), por sí solo, condujo a la activación de células T. Los resultados de la co-incubación de los anticuerpos CD45(R) con células mononucleares de sangre periférica, estimuladas con PKT3, se resumen en la Figura 5. Los cuatro reactivos CD45RA analizados o no tuvieron efecto o dieron como resultado una ligera estimulación. De los cuatro reactivos CD45RB analizados, 2 (6B6, 6G3) produjeron una inhibición significativa, mientras que los otros dos (MT3, PD7) sólo tuvieron efectos mínimos. De los tres reactivos CD45RO analizados, uno provocó una inhibición significativa (UCHL1), en tanto que los otros dos (A6, OPD4) mostraron mucho menos inhibición. De los cuatro reactivos CD45 analizados, uno (4C9) careció de efecto, dos (4D11, 2G1) produjeron inhibición, y uno (4F9) dio lugar a una estimulación claramente superior a la del efecto de OKT3 solo.

TABLA X Correlación entre activación y fosforilación de tirosina

Anticuerpos	% de CD25	Fosforilación de Tirosina Banda de 110 kDa
OKT3 más ab de control	70%	sí
OKT3 más 6B6 (RB)	45%	no
OKT3 más 6G3 (RB)	45%	no
OKT3 más MT3 (RB)	65%	sí (ligeramente más débil)
OKT3 más PD7 (RB)	70%	sí

La expresión de CD25 y CD69 se analizó, asimismo, después de excluir las células T CD4+ o CD8+. Los resultados indican que el reactivo 6G3 anti-CD45RB posee un efecto inhibitorio mucho más pronunciado sobre las células CD8 que sobre las células CD4, véase la Figura 6. También se han analizado combinaciones de reactivos y, como se ve en la Figura 7, se encontró una sinergia manifiesta de una mezcla de CD45, CD45RB y CD45RO, que redujo el nivel de expresión de CD25 a uno que no fue significativamente diferente de los controles no estimulados.

Los resultados de este estudio demuestran que los anticuerpos específicos CD45(R) pueden modular in vitro la activación de células T mediada por CD3. Los resultados de combinaciones de anticuerpos indican que diferentes mecanismos pueden contribuir al efecto medido.

El hallazgo de que algunos, pero no otros anticuerpos anti-CD45RB inhiben la activación de células T está de acuerdo con el hallazgo de que un anticuerpo específico CD45RB potencia la supervivencia del aloinjerto renal en un modelo de ratón, mientras que otro no lo hace. Véase el Ejemplo 5. El efecto predominantemente inhibitorio de los anticuerpos CD45RB sobre células CD8 concuerda con el hallazgo de que el principal resultado inmuno-fenotípico en los ratones tratados con éxito es una reducción del número de células CD8 en el aloinjerto.

En conclusión, el análisis de la expresión de CD25 de células T de sangre periférica estimulada in vitro con CD3 demuestra la actividad inmunomoduladora de los anticuerpos anti-CD45(R). Una mezcla de anticuerpos anti-CD45(R) humano es un potente inhibidor de la activación de células T in vitro, y puede ser muy adecuada para la prevención y reversión del rechazo de aloinjertos.

Ejemplo 21 Capacidad del mAb MB23G2 anti-CD45RB para prevenir el desarrollo de EAE (encefalomielitis alérgica experimental) en ratones NZW inmunizados con MBP (proteína básica principal anti-eosinófilos) A. Materiales y Métodos 1. Animales

Ratones NZW (6-8 semanas de edad) y ratones B6.SJL, adquiridos en Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine.

2. Anticuerpo

Se utilizó el anticuerpo monoclonal purificado MB23G2 (HB220) anti-CD45RB (ATCC, Rockville, Maryland). Se adquirió IgG policlonal de rata en Jackson Research Laboratories, Bar Harbor, Maine.

3. Preparación de MBP bovina

Se homogeneizó tejido de médula espinal bovina (Pel-Freeze, Inc., Rogers, AR) y se sometió a eliminación de lípidos en cloroformo:metanol 2:1. El residuo sólido se extrajo a pH 3,0 durante 1 hora y el extracto se cromatografió sobre CM-52 equilibrada con urea 6M, glicina 0,08M, pH 10,4. El eluato se dializó durante la noche utilizando tubos 6000-8000 M en ácido acético 0,1M. A continuación, se liofilizó y se hizo circular sobre gel de SDS-PAGE para comprobar la pureza.

4. Inducción de EAE

Los ratones se sometieron a inmunización subcutánea con MBP bovino emulsionado (100 \mul) en adyuvante de Freund completo (CFA en sus siglas en inglés) más H37 Ra (4 mg/ml). También se les inyectaron por vía i.p. 500 ng de toxina pertussis (List Biological Laboratories, Campbell, CA) en los días 0 y 10 post-inmunización. Los ratones desarrollaron signos de EAE hacia los días 10-14 post-inmunización. La gravedad clínica se basó en una escala de clasificación en la que 0 es normal; 1, tono reducido del rabo; 2, parálisis del rabo; 3, paraparesia; 4, paraplejía; 5, moribundo/muerte. Se desarrolló una puntuación de gravedad basada en el número de animales, multiplicado por la gravedad clínica para cada animal.

5. Tratamiento con anticuerpo anti-CD45RB

Se inyectaron a los ratones 40 \mug de anticuerpo anti-CD45RB o Ig policlonal de rata (Jackson Research Laboratories, Bar Harbor, Maine) como control en los días 0 y 5 post-inmunización, por vía i.p., en un volumen total de
100 \mul.

6. Ensayos de Proliferación

Para las estimulaciones específicas V\beta9 y CD3, se recubrieron placas de microtitulación con 50 \mug/ml de anti-V\beta8 o anti-CD3, respectivamente. Las placas se incubaron durante la noche a 4ºC y se lavaron 3 veces con PBS estéril antes de la adición de las células esplénicas. Las células esplénicas se obtuvieron de ratones EAE-positivos (tratados con control) y EAE-negativos (tratados con anti-CD45RB). Las células se sometieron a 0,84% de cloruro de amonio durante 5 min a temperatura ambiente para la separación de eritrocitos, se lavaron 3 veces con PBS estéril, y se sembraron en las placas en una concentración de 1 x 10^{5} células por pocillo. Las células también se estimularon con PMA/ionomicina a concentraciones óptimas. El día 2 después de la incubación, se pulsaron las células cultivadas con 1\muCi (37 kBq) de [metil-^{3}H]-timidina durante 18 horas, y se cosecharon con un cosechador de células PHD (Cambridge Technology, Cambridge, MA).

7. ELISA de TNF-\alpha

Se recogieron los sobrenadantes de células activadas con PMA/ionomicina, anti-CD3, anti-V\beta8 y Con-A. El kit de ELISA de TNF-\alpha se adquirió en Genzyme Immunologicals, Cambridge, MA. Las concentraciones de TNF-\alpha se determinaron a partir de una curva estándar derivada de diluciones seriadas del control positivo proporcionado. Las muestras se midieron por duplicado.

8. Citometría de Flujo

Se recolectaron ganglios linfáticos de los animales de control y tratados, y se combinaron. Se prepararon suspensiones de células aisladas y cualquier eritrocito presente se lisó con NH_{4}Cl al 0,84%. Las células se lavaron dos veces en PBS, se contaron y se colocaron en placas de microtitulación de 96 pocillos para tinción. Se agregaron cantidades de saturación del anticuerpo apropiado (VLA-4 conjugado directamente con ficoeritrina (PE), LFA-1 biotinilado, e ICAM-1 biotinilado, todos ellos adquiridos en Pharmigen, San Diego, CA). La segunda etapa consistió en incubar con estreptavidina conjugada con PE (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA), en caso necesario. Seguidamente, las células se lavaron tres veces en PBS y se fijaron con un volumen igual de paraformaldehído al 2%. La citometría de flujo se llevó a cabo sobre un flujocitómetro FACScan (Becton Dickinson, Palo Alto, CA), utilizando el software de Lysis PC. Las células muertas se excluyeron por exclusión de dispersión frontal y lateral. Los datos se analizaron usando el software de Lysis II.

9. ELISA para IgE total

La IgE sérica total se determinó utilizando un ELISA emparedado. Para la preparación de la fase sólida, se diluyó EM95.3 (anticuerpo monoclonal anti-IgE de ratón de rata, utilizado para captura) (M. Baniyash et al., Eur. J. Immunol., 14, 799 (1984)) a 3 mg/ml en solución salina tamponada con borato (BBS; Na_{2}B_{4}O_{7} 25 mM x 10 H_{2}O, NaCl 75 mM, H_{3}BO_{3} 100 mM, pH 8,4). Se recubrieron placas de microtitulación Immulon® 2 (Dynatech Laboratories, Inc., Chantilly, VA) con 100 ml de esta solución y se dejaron reposar durante la noche a 4ºC. Entre todas las etapas de incubación, las microplacas se lavaron tres veces con BBS que contuvo Tween 20 al 0,05%. Todas las incubaciones se llevaron a cabo durante una hora a temperatura ambiente, a menos que se indique lo contrario. Los sueros se diluyeron en BBT (BBS suplementado con BSA al 0,5% y Tween 80 al 0,4%) de 1;40 hasta 1:200. Como anticuerpo secundario se agregó B1E3 biotinilado (IgE anti-ratón de rata, usada para detección). El sistema indicador consistió en fosfatasa alcalina ExtrAvidin® y el sustrato Sigma 104® fosfatasa sustrato (fosfato de r-nitrofenilo, disódico, hexahidrato). La evolución del sustrato se determinó por la diferencia entre la DO_{405} y la IgE total en suero se determina en factores de dilución equivalentes de sueros B6.SJL de referencia estandarizados. Esto se define por la fórmula:

EDF = (dilución de sueros de referencia estandarizados que indica la DO equivalente del suero de ensayo) x 10^{4}

10. Inmunofluorescencia Indirecta

La presencia de IgG AnoA en sueros de ratón se analizó por inmunofluorescencia indirecta, usando frotis de riñón congelado de ratón, preparados comercialmente (Sanofi, Chaska, MN). Los frotis se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente con sueros diluidos en PBS. Se retiraron los sueros no fijados con tres lavados adicionales con PBS. A continuación, los frotis se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente con 50\mul de IgG anti-ratón de cabra conjugada con FITC (específica para el fragmento Fc, Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) diluida 1:50 en PBS. El anticuerpo secundario no fijado se retiró lavando cada pocillo tres veces con PBS. Las células se examinaron para iluminación fluorescente invirtiendo la placa de 96 pocillos sobre la platina del microscopio (Carl Zeiss, Inc., Thornwood, NY). La tinción antinucleolar se puso de manifiesto por una tinción intensa homogénea de los nucléolos.

11. Evaluación Estadística

Las evaluaciones estadísticas se llevaron a cabo usando el software estadístico SigmaStat (Jandel Scientific, San Rafael, CA). Para todas las comparaciones emparejadas, se utilizó el test t de Student. Para el análisis de los títulos de ANA, se empleó un test de suma de rangos de Mann-Whitney.

B. Resultados 1. Efecto Clínico del Anticuerpo anti-CD45RB sobre la Evolución de la EAE

Se examinó, en primer lugar, la capacidad del anti-CD45RB para prevenir el desarrollo de la EAE en ratones NZW inmunizados con MBP. Como se muestra en la Tabla XI, los ratones tratados con anti-MB45RB en los días 0 y 5, excepto en un caso, nunca desarrollaron EAE.

TABLA XI

	EAE(+)	EAE(-)	Puntuación

Exp. nº 1
Control	7	0	29/35
Tratados	0	6	0/30

Exp. nº 2
Control	6	3	20/45
Tratados	1	9	2/50

Exp. nº 3
Control	4	2	11/30
Tratados	0	5	0/0

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Solamente uno de los 21 ratones desarrolló la enfermedad en el grupo tratado, comparado con 17/22 en el grupo tratado con el anticuerpo de control. El examen del SNC no reveló infiltrados linfocitarios en los animales tratados (se examinaron dos animales de cada grupo). Sin embargo, el grupo de control evidenció lesiones importantes en el SNC. Por lo tanto, el tratamiento con anti-CD45RB en el momento de la inmunización con MBP bloqueó el desarrollo de la EAE.

2. El Tratamiento con anti-CD45RB altera la Capacidad Proliferativa de las Células T

Al objeto de examinar los mecanismos mediante los cuales el anti-CD45RB previene la EAE, se analizó la capacidad del anti-CD45RB para afectar al número y función de las células. Inicialmente, se determinó el número total de células presentes en los bazos de los animales tratados y de control, así como el número total de células T en los ganglios linfáticos a los 5 y 10 días después del tratamiento. No se observó ninguna reducción consistente del número de células entre los animales tratados y de control.

A continuación, se examinó la capacidad de proliferación de las células T en los ratones tratados. Se aislaron células T de los ganglios linfáticos de animales tratados con CD45RB y de control, examinándose su capacidad para proliferar con la estimulación de PMA/ionomicina, anti-CD3, anti-V\beta8 y Con-A in vitro. Como se ve en la Figura 8, el tratamiento con anti-CD45RB in vivo redujo de manera significativa la capacidad de proliferación de células T aisladas frente a todas las formas de estimulación in vitro en el día 5 tras la administración de MBP (también 5 días después de la primera dosis de anti-CD45RB). Sorprendentemente, el día 10 (10 días después de MBP, pero 5 días después de la segunda dosis de anti-CD45RB), la proliferación de las células T de ganglios linfáticos experimentó una potenciación en los ratones tratados frente a los de control (Figura 9). No obstante, ningún animal enfermó, incluso en el seguimiento de varias semanas. Por lo tanto, aunque la función celular pareció recuperarse hacia el día 10, no se observó prueba alguna de EAE clínica. Aun cuando no parece que las células B desempeñen un papel importante en el desarrollo de la EAE, se encontró también que el tratamiento con anti-CD45RB redujo la capacidad de dichas células B para responder a la activación con LPS (no se muestra). Por consiguiente, el anti-CD45RB parece tener un impacto importante sobre la capacidad de las células T para responder a una serie de señales de activación. Esto concuerda con los efectos comunicados de CD45 sobre la activación de células T. Sin embargo, en este modelo, no se pudo demostrar un efecto consistente del anticuerpo sobre el número de células.

De esta forma, resulta evidente que se han proporcionado, de acuerdo con la presente invención, usos y composiciones farmacéuticas que podrán beneficiar de manera sustancial a los pacientes con enfermedades autoinmunes y a los que reciban trasplantes de órganos.

Claims

1. Uso de un anticuerpo que se fija específicamente a un epítopo CD45RO del isotipo CD45RO del antígeno leucocitario, para la preparación de un medicamento dirigido al tratamiento o prevención del rechazo de trasplantes de células, tejidos u órganos mediante la inhibición de una inmunorrespuesta mediada por células T en el receptor.

2. Uso según la reivindicación 1, en donde dicho trasplante de célula, tejido u órgano es alogénico para el receptor.

3. Uso según la reivindicación 1, en donde dicho trasplante de célula, tejido u órgano es xenogénico para el receptor.

4. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el anticuerpo se utiliza antes del trasplante de la célula, tejido u órgano.

5. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el anticuerpo se utiliza después del trasplante de la célula, tejido u órgano.

6. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el anticuerpo se utiliza simultáneamente con el trasplante de la célula, tejido u órgano.

7. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende, adicionalmente, el uso de al menos un fármaco antiinflamatorio o inmunosupresor.

8. Uso según la reivindicación 7, en donde dicho fármaco antiinflamatorio o inmunosupresor se selecciona del grupo consistente en ciclosporina, ciclofosfamida, FK-506, rapamicina, corticosteroides, micofenolato mofetil, leflunomida, Globulina Anti-Linfocitaria, desoxipergualina, y OKT-3.

9. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el tejido es de islotes pancreáticos, o tejido vascular.

10. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el órgano es un riñón, un corazón o un hígado.

11. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde las células son células hematopoyéticas.

12. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o 9 a 10, en donde el receptor es un ser humano.

13. Uso de un anticuerpo que se fija específicamente a un epítopo CD45RO del isotipo CD45RO del antígeno leucocitario, para la preparación de un medicamento dirigido al tratamiento de una enfermedad autoinmune a través de la inhibición de la inmunorrespuesta mediada por células T.

14. Uso según la reivindicación 13, en donde la enfermedad autoinmune es la enfermedad intestinal inflamatoria, esclerosis múltiple, diabetes Tipo 1, lupus eritematoso sistémico o artritis reumatoide.

15. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, que comprende, adicionalmente, un anticuerpo que se fija específicamente a un epítopo CD45RB del isotipo CD45RB del antígeno leucocitario, un anticuerpo que se fija específicamente a un epítopo CD45RA del isotipo CD45RA del antígeno leucocitario, un anticuerpo que se fija específicamente a un epítopo CD45RC del isotipo CD45RC del antígeno leucocitario, o mezclas de los mismos.

16. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde se induce tolerancia inmunológica en el receptor del trasplante de órgano, tejido o célula alogénico o xenogénico.

17. Uso según la reivindicación 16, en donde el receptor recibe trasplantes secuenciales de célula, tejido u órgano.

18. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un fragmento del mismo que se fija al antígeno, o una mezcla de ambos.

19. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en donde dicho medicamento se prepara para ser administrado con una cantidad de linfocitos de dicho receptor, que han sido expuestos previamente ex vivo a dicho anticuerpo.

20. Uso según la reivindicación 19, en donde los linfocitos se administran en combinación con dicho anticuerpo.

21. Composición farmacéutica que comprende un anticuerpo que se fija específicamente a un epítopo CD45RO del isotipo CD45RO del antígeno leucocitario, en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

22. La composición farmacéutica de la reivindicación 21, que comprende, adicionalmente, una cantidad de linfocitos derivados del receptor mamífero previsto de dichas composiciones.

23. La composición farmacéutica de la reivindicación 21 ó 22, que comprende, adicionalmente, un anticuerpo como se ha definido en la reivindicación 15, o una cantidad de linfocitos, como se ha definido en la reivindicación 19.

24. La composición farmacéutica de la reivindicación 21 ó 22, en la que el anticuerpo es como se ha definido en la reivindicación 18.

25. La composición farmacéutica de las reivindicaciones 21 a 24 para tratar una enfermedad autoinmune, como se ha definido en la reivindicación 13 ó 14, o para tratar o prevenir el rechazo de un trasplante de célula, tejido u órgano, a través de la inhibición de una inmunorrespuesta mediada por células T en el receptor, como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o 9 a 12.