ES2245720T3 - Composiciones biopesticidas. - Google Patents
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Abstract
Composición adecuada para su uso frente a uno o más patógenos, que comprende al menos un microorganismo antagonista y al menos un agente estimulante elegido del grupo que consiste en uno o más ácidos urónicos, mananos, sales e hidratos de los mismos y mezclas de dichos agentes.
Description
Composiciones biopesticidas.
La presente invención se refiere a composiciones
biopesticidas que contienen microorganismos antagonistas y agentes
estimulantes. Dichas composiciones tienen una eficacia mejorada y/o
más larga frente a enfermedades producidas por patógenos en material
vegetal, por ejemplo, enfermedades producidas por mohos que
colonizan las partes de las plantes, bien después de la cosecha o
durante el ciclo de vida de la planta, tales como Penicillium
o Botrytis spp.
En la técnica se conocen bien un gran número de
pesticidas y se han utilizado intensamente durante muchos años. En
la actualidad hay una tendencia a contemplar la posibilidad de usar
métodos alternativos que implican productos más respetables con el
medioambiente.
En la técnica se conoce bien el uso, como agentes
de control biológicos, de microorganismos que son antagonistas
frente a patógenos vegetales. Tales microorganismos pueden ser
eficaces agentes de biocontrol para el control biológico de
enfermedades de las plantas, en particular, enfermedades posteriores
a la cosecha.
Las especies Penicillium y Botrytis
son responsables de importantes pérdidas económicas. Botrytis
puede producir importantes daños en las plantas, por ejemplo, en la
producción del tomate, en la parra y las fresas antes de la cosecha,
y enfermedades posteriores a la cosecha en Malus y
Pyrus spp. La incidencia común de las especies de
Penicillium en los alimentos es un problema particular.
Algunas especies producen toxinas y pueden hacer que los alimentos
se vuelvan no comestibles o incluso peligrosos. Las especies de
Penicillium pueden producir una grave podredumbre de la
fruta, por ejemplo, en Malus, Pyrus y Citrus spp.
En la técnica es bien conocido el biocontrol de
enfermedades en las plantas. Se han publicado documentos de patente
que se refieren al uso de composiciones que comprenden levaduras u
otros microorganismos frente a patógenos vegetales, entre los cuales
pueden citarse como ejemplos los documentos WO99/62340, WO99/62341,
US-A-5.525.132,
US-A-5.741.699,
US-A-6.060.429, WO 00/44230,
US-A-5.288.488 y
US-A-5.780.023.
Se han utilizado satisfactoriamente varios
microorganismos de entre bacterias, hongos y levaduras contra
enfermedades de las plantas producidas por patógenos.
Según una publicación de 1998 de S. Frey y N.
Magan, el grupo de Microbiología aplicada del Centro de
Biotecnología de la Universidad de Cranfield y titulado
"Ecophysiology, Growth and spore germination of Ulocladium
atrum, a biological control agent of Botrytis cinerea"
(7º Congreso Internacional de Patología vegetal), el hongo U.
atrum ha mostrado ser un agente de biocontrol muy eficaz frente
a B. cinerea en la filosfera de varias cosechas mediante
exclusión preventiva del patógeno y supresión de la
esporulación.
En la bibliografía se han notificado numerosas
cepas de levadura que presentan antagonismo frente a Botrytis
y/o Penicillium spp. y algunas cepas de levadura han
mostrado interesantes propiedades protectoras.
Los productos comerciales de biocontrol, tales
como Biosave^{MR} (Pseudomonas syringae van Hall,
Esc-11) y Aspire^{MR} (Candida oleophila
Montrocher, I-182), ya están disponibles
respectivamente de Ecoscience Corp. (Worcester, MA) y Ecogen Inc.
(Longhorn, PA) y se utilizan, entre otras, en manzanas después de
recolectadas frente a enfermedades por daños.
Sin embargo, se ha criticado esta primera
generación de productos de biocontrol, basándose en el uso de
antagonistas individuales, por no proporcionar una actividad estable
y protectora fidedigna cuando se utilizan en condiciones
comerciales. La protección frente a patógenos que proporciona la
técnica anterior a temperatura ambiente no supera normalmente una
semana en condiciones de infección graves.
Los presentes inventores aislaron de entre 329
microorganismos epifíticos dos cepas de levadura, descritas por
primera vez en Jijakli, M. H y Lepoivre P.
1993, Biological control of postharvest Botrytis cinerea
and Penicillium on apples, boletín IOBC/WPRS:
Biological Control of Foliar and Postharvest diseases 16,
páginas 106-110, que han probado ser particularmente
eficaces frente a enfermedades producidas por Botrytis y
Penicillium spp. en manzanas y peras.
Estas cepas se aislaron de la superficie de
manzanas. La cepa K, que se ha depositado con el número 40563 en la
Colección de cultivos BBCM^{MR}/MUCL de la micoteca de la
Universidad Católica de Lovaina, se ha identificado como Pichia
anomala (Hansen) Kurtzman. La cepa O se ha depositado con
el número 40564 en la colección de Cultivos BBCM^{MR}/MUCL de la
micoteca de la Universidad Católica de Lovaina. En primer lugar se
supuso que la cepa O era una cepa de Candida sake. Análisis
adicionales parecieron indicar que pertenecía a Debaryomyces
hansenii var. hansenii; sin embargo, finalmente se reveló que la
cepa O era una cepa de C. oleophila Montrocher. El origen
geográfico y el perfil molecular de la cepa O (revelado por técnica
RAPD (ADN polimórfico amplificado al azar) son bastante diferentes
de los de la cepa I-182 anteriormente mencionada,
comercializada bajo el nombre Aspire^{MR}.
El interés por el control biológico sobre el
control químico está creciendo rápidamente debido a razones tales
como preocupaciones medioambientales, aparición de cepas patógenas
resistentes a pesticidas químicos o limitación del uso de pesticidas
químicos.
Aunque hasta el momento se han obtenido
resultados prometedores, existe una gran necesidad de mejorar la
eficacia de las composiciones biopesticidas.
Se desea disminuir los costes de utilización
usando composiciones más eficaces que permitan usar cantidades
menores de microorganismos antagonistas por tratamiento, sin
disminuir la eficacia de la composición frente a patógenos y sin
restringir la duración de la eficacia de la composición frente a
patógenos, y conseguir el umbral económico de rentabilidad.
La invención se propone proporcionar
composiciones novedosas que contienen microorganismos antagonistas
que son adecuados para su uso frente a enfermedades producidas en
materiales vegetales por patógenos, especialmente enfermedades
inducidas por mohos, y a un nuevo método para el biocontrol de
enfermedades mediante tales composiciones, producidas por patógenos
en material vegetal usando tales composiciones.
Otro objetivo de la invención es proporcionar
tales composiciones que son al menos tan eficaces como las del
estado de la técnica.
La invención también se propone proporcionar
tales composiciones que comprenden concentraciones inferiores de
microorganismos antagonistas, a la vez que tienen eficacia similar
frente a los patógenos.
Un propósito adicional de la invención es
proporcionar tales composiciones que comprenden concentraciones
inferiores de microorganismos antagonistas a la vez que se prologa
la duración de la eficacia de las composiciones frente a los
patógenos.
Por "agente estimulante" se quiere decir,
según la presente invención, un agente que tiene tendencia a
estimular propiedades biológicas de un microorganismo. Por ejemplo,
puede estimular las propiedades biológicas de microorganismos
antagonistas frente a patógenos que pueden producir enfermedades en
el material vegetal.
Por "microorganismo antagonista" se quiere
decir, según la presente invención, un microorganismo que es
antagonista frente a un patógeno, en particular un patógeno que
tiene tendencia a producir enfermedades en material vegetal.
La invención se refiere a una composición
adecuada para su uso frente a uno o más patógenos que comprenden al
menos un microorganismo antagonista y al menos un agente estimulante
elegido del grupo que consiste en uno o más de ácidos urónicos,
mananos y/o sales e hidratos de los mismos, y mezclas de dichos
agentes.
En una realización preferida, la invención se
refiere a una composición que comprende además un
beta-1,3-glucano.
Preferiblemente, los ácidos urónicos se eligen
del grupo que consiste en ácido galacturónico y ácido glucurónico.
La cantidad preferida de al menos un agente estimulante está
comprendida entre el 0,001 y el 0,2% p/v.
Según una realización preferida de la invención,
dicho al menos un microorganismo antagonista se selecciona del grupo
que consiste en hongos y levaduras. Dicho hongo es ventajosamente
una cepa de U. atrum (denominada en lo sucesivo U.
atrum 385).
Esta cepa 385 se corresponde con una cepa
depositada por Plant Research International, anteriormente Research
Institute for Plant Protection (Wageningen)
(IPO-DLO) en el CBS (Centraalbureau voor
Schimmelcultures, Upsalalaan 8, NL - 3584 CT Utrecht, los Países
Bajos) bajo el número 700.95.
Dicha levadura se elige ventajosamente del grupo
que consiste en Pichia anomala y Candida
oleophila.
En una realización particularmente preferida de
la invención, la levadura está en forma de una cepa seleccionada del
grupo que consiste en la cepa K de Pichia anomala (Hansen)
Kurtzman depositada bajo MUCL-40563, la cepa O
de Candida oleophila Montrocher depositada bajo
MUCL-40564, ambas depositadas el 17 de junio de 1997
en la Colección de cultivos BBCM^{MR}/MUCL de la micoteca de la
Universidad Católica de Lovaina, y la cepa I-182
comercial de Candida oleophila Montrocher.
Dicho microorganismo antagonista se aplica
preferiblemente a una concentración que oscila desde 10^{5} hasta
10^{8} ufc/ml.
Uno o más patógenos pueden producir enfermedades
en material vegetal. Éstas últimas puede seleccionarse del grupo que
consiste en frutas, particularmente las especies Malus spp.,
Pyrus spp., Citrus spp., de cosechas particularmente a partir de
las especies de tomatera, parra y fresas, y de flores y otros
cultivos ornamentales.
Los patógenos pueden seleccionarse del grupo que
consiste en Botrytis cinerea, Penicillium expansum, P. digitatum,
P. italicum, Rhizopus spp.
Las composiciones de la invención pueden
comprender adicionalmente al menos una sal elegida de entre sal
cálcica, sal sódica y sal potásica, de entre las que la sal cálcica
se selecciona del grupo que consiste en cloruro de calcio,
bicarbonato de calcio y propionato de calcio. La cantidad de sales
puede estar en el intervalo del 0,01% al 2% p/v.
La invención también se refiere a un método para
el biocontrol de enfermedades producidas por patógenos a material
vegetal, que comprende la etapa de aplicar una composición según la
invención a dicho material vegetal.
El agente estimulante según la invención puede
estimular propiedades biológicas de un microorganismo, en particular
en una composición biopesticida.
El agente estimulante puede utilizarse para
disminuir la concentración de un microorganismo antagonista sin
disminuir la eficacia de la composición frente a patógenos, y para
disminuir la concentración de un microorganismo antagonista a la vez
que se prolonga la duración de la eficacia de la composición frente
a patógenos.
La invención se ilustrará adicionalmente a
continuación mediante la descripción de algunas formas de llevarla a
cabo.
El ejemplo 1 ilustra el hecho de que puede
obtenerse un buen efecto protector usando las composiciones de la
invención, que comprenden agentes estimulantes que consisten en
ácidos urónicos y levaduras antagonistas activas frente a
enfermedades después de la cosecha producidas por hongos en frutas
de las especies Malus.
Se recolectaron manzanas (Malus domestica
Borkh cv. Golden) de huertos comerciales que se mantenían con
prácticas de cultivo habituales en Bélgica y se colocaron en
almacenamiento regular a largo plazo. Se utilizaron las frutas de
clase I comerciales. Fueron compradas por mayoristas y se
almacenaron en una cámara frigorífica a 4 \pm 1ºC durante un
máximo de 15 días antes de su uso.
Se aislaron inicialmente cepas de B.
cinerea (hongo gris) y Penicillium expansum (hongo azul)
a partir de fresas y manzanas, respectivamente, en Gembloux.
Se pusieron en suspensión los conidios de las dos
cepas patógenas en una disolución de glicerol (25%) y se almacenaron
a -70ºC. Otro método de almacenamiento consistió en hacer crecer el
patógeno en agar de patata y dextrosa (APD) en tubos, cubriéndolos
con aceite de parafina y manteniendo los tubos a 25ºC. Partiendo de
este material almacenado, las dos cepas fúngicas se transfirieron a
medio de avena a 25ºC. Las suspensiones conidiales se prepararon en
una disolución acuosa estéril de Tweed 20 (0,05%) y se ajustaron a
la concentración requerida (10^{6} esporas/ml) usando una cámara
de Bürker.
Las cepas de levadura antagonista
- Pichia anomala (Hansen)
Kurtzman, depositada bajo el número 40563 en la Colección de
cultivos BBCM^{MR}/
MUCL de la micoteca de la Universidad Católica de Lovaina, denominada en lo sucesivo "cepa K", y
MUCL de la micoteca de la Universidad Católica de Lovaina, denominada en lo sucesivo "cepa K", y
- Candida oleophila Montrocher depositada
bajo el número 40564 en la colección de cultivos BBCM^{MR}/MUCL de
la micoteca de la Universidad Católica de Lovaina, denominada en lo
sucesivo "cepa O"
se han aislado a partir de la superficie de
manzanas y se han almacenado a -70ºC en un disolución de glicerol
(25%) o bajo aceite de parafina en PDA en tubos mantenidos a
25ºC.
Antes de su uso, los microorganismos se
subcultivaron tres veces sucesivamente a intervalos de 24 horas en
APD (agar de patata y dextrosa). En la tercera generación, las
células de levadura se eliminaron del medio de cultivo y se
suspendieron en agua isotónica (0,85% de NaCl). Las concentraciones
de suspensión se ajustaron a los valores requeridos después del
establecimiento de una recta de regresión en relación con la
absorbancia (a 595 nm) de la suspensión de microorganismos y el
número de unidades formadoras de colonia (ufc) de la misma
suspensión diseminadas en APD.
Las frutas se desinfectaron metiéndolas durante 2
minutos en hipoclorito sódico (10% del producto comercial). Se
enjuagaron en agua estéril y se secaron en flujo laminar antes de
producirles daños eliminando secciones de 6 mm de diámetro y 3 mm de
profundidad de tejido de dos partes separadas 4 - 5 cm de la línea
ecuatorial de las frutas.
Los daños se trataron mediante la aplicación de
50 \mul de composiciones del estado de la técnica o composiciones
de la invención.
Tras un periodo de incubación de 24 h a 20ºC en
cajas de plástico, los daños se inoculan con 50 \mul de las
suspensiones conidiales respectivas de los patógenos. Las frutas se
incubaron durante de una a tres semanas a 25ºC.
Los diámetros de las lesiones que se
desarrollaron alrededor de los daños se midieron tras 7, 10, 14 y
hasta 20 días después del tratamiento. Se utilizaron cuatro frutas
(8 daños) por tratamiento.
El porcentaje de protección proporcionado por los
diferentes tratamientos se calcula a partir del diámetro de lesión
producida por la podredumbre de la fruta tras la incubación usando
la siguiente fórmula:
\frac{D_{T} -
D_{X}}{D_{T}} \times 100 = Y
%
en la que Y es el porcentaje de
protección; D_{T} es el diámetro medio de la lesiones para el
control no tratado y D_{X} es el diámetro medio de las lesiones
para las frutas
tratadas.
Se ha evaluado en condiciones controladas el
efecto de las composiciones de la invención frente a podredumbre de
manzanas después de recolectadas producidas por los patógenos (B.
cinerea, respectivamente P. expansum).
En las partes restantes de este texto, GA
representa ácido galacturónico (monohidratado) al 98%, Sigma G2125,
PGA representa ácido poligalacturónico al 95%, Fluka 81325, mientras
que GU representa ácido glucurónico (sal sódica), Sigma G8645. Estos
productos se conocen en sí y están comercialmente disponibles.
| % de protección frente a B. cinerea tras | ||||||
| Cepa K (ufc/ml) | GA (% p/v) | GU (% p/v) | 7 días | 10 días | 14 días | 20 días |
| 10^{7} | - | - | 98 | 94 | 72 | 36 |
| 10^{5} | - | - | 94 | 73 | 57 | 27 |
| - | 0,01 | - | 49 | 42 | 22 | 2 |
| - | - | 0,001 | 75 | 46 | 46 | 21 |
| 10^{5} | 0,01 | - | 100 | 100 | 65 | 29 |
| 10^{5} | - | 0,001 | 100 | 100 | 94 | 66 |
En una primera serie de experimentos se han
utilizado composiciones patrón de la cepa K como control. La
proporción habitual para el uso de la cepa K es 10^{7} unidades
formadoras de colonia por mililitro (ufc/ml), mientras que la
proporción de 10^{5} ufc/ml se considera por debajo de la óptima.
De hecho, en la tabla 1 puede observarse que los resultados
obtenidos (que se expresan en términos de porcentaje de protección
calculada total como se definió anteriormente) con esta proporción,
cuando se utiliza la cepa K sola, no son satisfactorios.
Se ha encontrado de manera sorprendente que,
según la invención, se obtiene un efecto significativo en la
protección frente a B. cinerea cuando se utilizan,
respectivamente, el 0,01% p/v de GA y el 0,001% p/v de GU.
Además, según la invención, se ha encontrado de
manera sorprendente que una composición que comprende la proporción
por debajo de la óptima de 10^{5} ufc/ml de la cepa K y el 0,01%
p/v de ácido galacturónico monohidratado (GA) permite, sin embargo,
una protección total (100%) incluso tras 10 días.
De manera similar, se ha encontrado
sorprendentemente que una composición que comprende la proporción
por debajo de la óptima de 10^{5} ufc/ml de la cepa K y el 0,001%
p/v de GU también permite una protección total (100%) incluso tras
10 días. Esta composición permite además un porcentaje de protección
excepcionalmente alto tras 14 días. Incluso tras 20 días, el
porcentaje de protección obtenida usando esta composición es
extraordinariamente superior que los porcentajes proporcionados por
composiciones del estado de la técnica.
Parece que, según la invención, la adición de GA
o GU permite reducir la proporción de la cepa K cien veces (por
debajo de 10^{5} ufc/ml), a la vez que se obtiene una mejor
eficacia frente a B. cinerea que con la proporción habitual
de composiciones del estado de la técnica. Este resultado es
sorprendente.
En una segunda serie de experimentos en manzanas,
cuyos resultados se facilitan en la tabla 2, se han utilizado como
control las composiciones patrón de la cepa O.
| % de protección frente a B. cinerea tras | ||||||
| Cepa O (ufc/ml) | GA (% p/v) | GU (% p/v) | 7 días | 10 días | 14 días | 20 días |
| 10^{7} | - | - | 100 | 82 | 84 | 74 |
| 10^{5} | - | - | 69 | 75 | 65 | 40 |
| - | 0,001 | - | 87 | 47 | 33 | 0 |
| - | - | 0,001 | 75 | 46 | 46 | 21 |
| 10^{5} | 0,001 | - | 100 | 90 | 84 | 66 |
| 10^{5} | - | 0,001 | 100 | 100 | 90 | 53 |
En la primera composición, la proporción de la
cepa O es la proporción habitual de 10^{7} ufc/ml, mientras que en
la segunda, la proporción es la proporción por debajo de la óptima
de 10^{5} ufc/ml.
Aquí se ha encontrado de nuevo de manera
sorprendente que, según la invención, se obtiene un efecto
significativo en la protección frente a B. cinerea cuando se
utilizan, respectivamente, el 0,01% p/v de GA y el 0,001% p/v de GU.
En ambos casos, no merece la pena observar que el resultado obtenido
es incluso mejor que el obtenido con las composiciones que contienen
sólo la cepa O a 10^{5} ufc/ml.
Además, el 0,001% p/v de GA tiene una eficacia
mayor frente a B. cinerea tras 10 días que la levadura
utilizada sola, incluso si se utiliza a la proporción habitual
(10^{7} ufc/ml).
La composición de la invención que comprende
10^{5} ufc/ml de la cepa O y el 0,001% p/v de GU también ofrece
una protección que es extraordinariamente mejor que la proporcionada
por cualquier composición del estado de la técnica que no comprende
GA o GU.
Esta última composición según la invención hace
posible obtener una protección total tras 10 días y todavía el 90%
de protección tras 14 días.
En una tercera serie de experimentos en manzanas,
se ha demostrado que, según la invención, las composiciones que
contienen el 0,01% p/v de GA tienen un efecto protector, no sólo
frente a B. cinerea sino también frente a P.
expansum.
También se ha encontrado que una combinación de
la cepa O y el 0,01% p/v de GA tiene una eficacia mejorada sobre las
composiciones del estado de la técnica tras 7 días, no sólo frente a
B. cinerea sino también frente a P. expansum.
| % de protección frente a | % de protección frente a | ||
| Cepa O (ufc/ml) | GA (% p/v) | B. cinerea tras 7 días | P. expansum detrás 7 días |
| 10^{7} | - | 95 | 49 |
| 10^{5} | - | 48 | 47 |
| - | 0,01 | 12 | 18 |
| 10^{5} | 0,01 | 77 | 73 |
Las composiciones en las que la cepa O se utiliza
en la proporción por debajo de la óptima de 10^{5} ufc/ml (cien
veces inferior a la proporción habitual) en combinación con el 0,01%
p/v de GA tiene, frente a cada uno de los dos patógenos, una
eficacia mejorada comparada con el uso de la cepa O sola. Además, la
comparación con los efectos protectores del 0,01% p/v de GA usado
solo muestra efectos sinérgicos. Como puede observarse en la tabla
3, el nivel de protección proporcionado por esta composición frente
a P. expansum casi alcanza el obtenido por la aplicación de
la cepa O en la proporción normal.
En una cuarta serie de experimentos, se ha
comparado el efecto estimulante del ácido galacturónico (GA) en la
actividad antagonista de la cepa O de C. oleophila (usada en
la proporción por debajo de la óptima de 10^{5} ufc/ml) con el del
ácido poligalacturónico (PGA) (tabla 4).
| % de protección frente a P. expansum tras | |||||
| Cepa O (ufc/ml) | GA (% p/v) | GU (% p/v) | 6 días | 8 días | 10 días |
| 10^{7} | - | - | 71 | 59 | 37 |
| 10^{5} | - | - | 66 | 27 | 19 |
| - | 0,001 | - | 15 | 9 | 7 |
| - | - | 0,001 | 19 | 12 | 10 |
| 10^{5} | 0,001 | - | 87 | 62 | 43 |
| 10^{5} | - | 0,001 | 55 | 36 | 24 |
Este experimento ilustra que la estimulación de
la actividad antagonista de la capa O se obtuvo con ácido
galacturónico, mientras que este efecto no se observó con ácido
poligalacturónico en la proporción del 0,001%.
En una quinta serie de experimentos en manzanas,
se ha añadido un 2% p/v de cloruro de calcio dihidratado
(CaCl_{2} \cdot 2H_{2}O, Merck) a algunas composiciones según la invención. Excepcionalmente, se han obtenido buenos resultados en la protección de manzanas frente a B. cinerea.
(CaCl_{2} \cdot 2H_{2}O, Merck) a algunas composiciones según la invención. Excepcionalmente, se han obtenido buenos resultados en la protección de manzanas frente a B. cinerea.
De hecho, una composición que comprende 10^{5}
ufc/ml de la cepa O, el 0,001% p/v de ácido galacturónico
mohohidratado (GA) y un 2% p/v de CaCl_{2}\cdot2H_{2}O conduce
a una protección total (100%) hasta 14 días, que es
sorprendente.
El ejemplo 2 ilustra el hecho de que también
puede obtenerse buen efecto protector usando composiciones de la
invención que comprenden agentes estimulantes que consisten en
ácidos urónicos y levaduras antagonistas activas frente a
enfermedades tras la cosecha producidas por mohos en frutas de las
especies Pyrus.
Se recolectaron peras (Pyrus communis L.
cv. Conference) de huertos no tratados en las 6 semanas precedentes
a la recolección en Melveren (Bélgica) y se almacenaron en un
almacenamiento ultrabajo a 1 \pm 1ºC durante 2 meses antes de su
uso.
Se aislaron inicialmente cepas de B.
cinerea (hongo gris) a partir de fresas en Gembloux.
La cepa patógena se almacenó en PDA cubierta por
aceite de parafina en tubos a 25ºC. Partiendo de este material
almacenado, la cepa fúngica se transfirió a PDA a 25ºC. La
suspensión conidial se preparó en una disolución acuosa estéril de
Tweed 20 (0,05%) y se ajustó a la concentración requerida (10^{6}
esporas/ml para B. cinerea) usando una cámara de Bürker. La
inoculación del patógeno se llevó a cabo usando una tabla de
aspersión a presión constante (2 bar) hasta cubrir bien las
frutas.
Las cepas de levadura antagonista "cepa K"
de P. anomala y "cepa O" de C. oleophila se
produjeron en birreactores. Tras la centrifugación, la pasta
resultante se secó por liofilización en el caso de la cepa K y se
utilizó como tal para la cepa O. Ambas producciones se hidrataron de
nuevo en agua de peptona (5g/l de NaCl, 1g/l de peptona y 0,5ml/l de
Tween 20) 1 hora antes de la aplicación, antes de diluir con agua
hasta la concentración requerida.
Las frutas se dañaron usando clavos de 1 mm de
profundidad y 1 mm de diámetro (4 daños localizados en la línea
ecuatorial de las frutas) antes de la aplicación. Las frutas se
metieron en agua (control), en la suspensiones de levadura a la
concentración requerida durante 2 minutos o en el patrón Sumico WP
(25,5% de carbendazima
+ 25,5% de dietofencarb) de Aventis CropScience a 1 g/l durante 30 segundos y después se dejaron a 20-25ºC antes de la inoculación con los patógenos 24 horas después. Sumico WP es un fungicida comercialmente disponible que ha recibido una autorización de comercialización en Bélgica para el tratamiento posterior a la cosecha de manzanas y peras. Tras la inoculación, las frutas se almacenaron en canastas de plástico humificadas en condiciones de oscuridad (25ºC y 90% de HR).
+ 25,5% de dietofencarb) de Aventis CropScience a 1 g/l durante 30 segundos y después se dejaron a 20-25ºC antes de la inoculación con los patógenos 24 horas después. Sumico WP es un fungicida comercialmente disponible que ha recibido una autorización de comercialización en Bélgica para el tratamiento posterior a la cosecha de manzanas y peras. Tras la inoculación, las frutas se almacenaron en canastas de plástico humificadas en condiciones de oscuridad (25ºC y 90% de HR).
| Cepa K (ufc/ml) | Sumico (g/l) | GU (% p/v) | CaCl_{2} (% p/v) | % de protección frente a B. cinerea tras 15 días |
| 10^{7} | - | - | 34 | |
| 10^{6} | - | - | 25 | |
| 10^{6} | - | 2 | 66 | |
| 10^{6} | 0,001 | 2 | 76 | |
| - | 1 | - | - | 88 |
Se encontró de manera sorprendente que el uso de
GU en una proporción del 0,001% p/v estaba estimulando la actividad
antagonista de la levadura no sólo en frutas de manzana como se
muestra en el ejemplo 1, sino también en frutas de pera.
Además, la adición del 0,001% p/v de GU a la cepa
K de P. anomala (a 10^{6} ufc/ml en lugar de a la
proporción habitual de 10^{7} ufc/ml) y del 2% p/v de cloruro de
calcio dihidratado conduce a un nivel de protección más próximo al
obtenido con patrón Sumico en la proporción recomendada frente al
moho gris en peras 15 días después del tratamiento (tabla 5).
Como puede observarse en la tabla 6, la adición
de GA o GU en la proporción del 0,001% a la cepa O de C.
oleophila (en 10^{6} ufc/ml) y del 2% p/v de cloruro de calcio
dihidratado tiene un efecto de aumentar el porcentaje de protección
hasta un nivel similar o incluso superior al de los patrones
químicos frente al moho gris en peras 9 días después del
tratamiento.
| Cepa O | Sumico | GA | GU | CaCl_{2} | % de protección frente |
| (ufc/ml) | (g/l) | (% p/v) | (% p/v) | (% p/v) | a B. cinerea tras 9 días |
| 10^{7} | - | - | - | 60 | |
| 10^{6} | - | - | - | 30 | |
| 10^{6} | - | - | 2 | 69 | |
| 10^{6} | 0,001 | - | 2 | 74 | |
| 10^{6} | - | 0,001 | 2 | 91 | |
| 10^{7} | 0,001 | - | 2 | 84 | |
| - | 1 | - | - | - | 70 |
El efecto de la cepa O de C. oleophila a
10^{6} ufc/ml junto con GU en la proporción del 0,001% es
significativamente superior al obtenido con patrón Sumico a la
proporción recomendada.
El ejemplo 3 ilustra el hecho de que también
puede obtenerse buen efecto protector usando composiciones de la
invención que comprenden agentes estimulantes que consisten en
ácidos urónicos y levaduras antagonistas activas frente a
enfermedades tras la cosecha producidas por mohos en frutas de una
tercera especie, concretamente especies Cytrus.
Se compraron naranjas (Citrus sinensis
(L.) Ohl. cv. Valencia) de mayoristas y se almacenaron en una cámara
frigorífica a 4 \pm 1ºC durante un máximo de 15 días antes de su
uso.
Se obtuvo la cepa CBS31948 de Penicillium
digitatum (moho verde de las naranjas) de la CentraalBureau
Schimmelcultures, colección de Los Países Bajos y se aisló
inicialmente de frutas Citrus. Se pusieron en suspensión los
conidios de la cepa patógena en una disolución de glicerol (25%) y
se almacenaron a -70ºC. Partiendo de este material almacenado, la
cepa fúngica se transfirió a medio de avena a 25ºC. Las suspensiones
conidiales se prepararon en una disolución acuosa estéril de Tweed
20 (0,05%). Antes de su uso, las suspensiones tienen que ajustarse a
la concentración requerida (10^{5} esporas/ml) usando una cámara
de Bürker.
La cepa antagonista de levadura "cepa K" de
P. anomala se obtuvo como en el ejemplo 1. La cepa
1-182 de C. oleophila comercializada bajo el
nombre Aspire^{MR} se obtuvo de Ecogen Inc. Ambos microorganismos
se subcultivaron como en el ejemplo 1.
Las frutas se desinfectaron y se les produjeron
daños como en el ejemplo 1. Los daños se trataron mediante la
aplicación de 20 \mul de las composiciones y se inocularon tras
una hora con 20 \mul de la suspensión conidial patógena. El
porcentaje de protección se calcula como en el ejemplo 1.
| % de protección frente a P. digitatum tras | |||
| Cepa K (ufc/ml) | GA (% p/v) | 7 días | 10 días |
| 10^{8} | - | 92 | 67 |
| 10^{7} | - | 74 | 45 |
| - | 0,01 | 58 | 36 |
| 10^{7} | 0,01 | 84 | 70 |
Se ha encontrado de manera sorprendentemente que
el uso del 0,01% p/v de GA es eficaz frente a la enfermedad tras la
cosecha, no sólo en manzanas, sino también en especies
Citrus.
Además, la adición del 0,01% p/v de GA permite
utilizar una concentración diez veces inferior de cepa K de P.
anomala (10^{7} en lugar de 10^{8} ufc/ml) en naranjas, a la
vez que se mantiene una actividad de nivel protector frente al moho
verde de naranjas cv. Valencia hasta 10 días después del tratamiento
(tabla 7).
Como puede observarse en la tabla 8, la adición
de GA en la proporción del 0,01% permite utilizar una concentración
diez veces inferior (10^{7} en lugar de 10^{8} ufc/ml) de la
cepa I-182 (Aspire^{MR}) en naranjas, a la vez que
se mantiene un nivel protector similar frente al moho verde de
naranjas cv. Valencia hasta 12 días después del tratamiento.
| % de protección frente a P. digitatum tras | |||
| Cepa I-182 (ufc/ml) | GA (% p/v) | 7 días | 12 días |
| 10^{8} | - | 34 | 18 |
| 10^{7} | - | 26 | 15 |
| 10^{7} | 0,01 | 30 | 19 |
Estos experimentos muestran que la adición de GA
puede conducir a combinaciones interesantes en la actividad
protectora para una variedad de cepas de levadura antagonistas en
grutas Citrus.
El ejemplo 4 ilustra el hecho de que también
puede obtenerse buen efecto protector usando composiciones de la
invención que comprenden agentes estimulantes que consisten en
ácidos urónicos en combinación con hongos antagonistas activos
frente a enfermedades producidas por mohos en hojas de fresas, parra
y tomatera.
De plantas de fresa (cv. Elsenta), parra (cv.
Müller Thurgau) y tomatera (cv. Raïssa) de invernadero de 4 semanas
se recolectaron foliolos verdes y sanos crecidos a 25ºC con un
fotoperiodo de 16 horas. Los foliolos se esterilizaron entonces
usando rayos gamma, se secaron a temperatura ambiente bajo atmósfera
estéril durante tres semanas y se almacenaron en bolsas de plástico
selladas. Se hidrataron de nuevo durante la noche con agua estéril y
se lavaron meticulosamente para eliminar los nutrientes solubles
antes de su uso en los bioensayos.
La cepa 700 patógena de B. cinerea y la
cepa 385 de U. atrum de microorganismo antagonista se
obtuvieron de Plant Research International, anteriormente Research
Institute for Plant Protection (Wageningen)
(IPO-DLO) y se asilaron inicialmente de una flor de
gerbera y de la punta de una hoja de cebolla, respectivamente. La
cepa denominada en lo sucesivo "cepa 385" se corresponde con la
cepa 700.95 depositada en CBS, Centraalbureau voor Schimmelcultures,
tal como se indicó anteriormente. Las cepas antagonistas 18558 y
18559 de U. atrum se obtuvieron de BBCM/MUCL (micoteca de la
Universidad Católica de Lovaina). Las cepas fúngicas se hicieron
crecer en medio de avena a 20ºC durante 14 días. Las suspensiones
conidiales se prepararon en una disolución acuosa estéril de Tweed
80 (0,01%) y se ajustaron a las concentraciones requeridas usando
una cámara de Bürker.
Se pulverizaron hojas sanas muertas de fresa,
tomatera y parra con B. cinerea (10^{4} esporas/ml o sp/ml)
sola o simultáneamente con cepas de U. atrum. Se utilizaron
cuatro proporciones de U. atrum: la proporción habitual de
2.10^{6} sp/ml y las proporciones de 4.10^{5}, 10^{5} y
2.10^{4} sp/ml, con o sin ácido galacturónico monohidratado
(GA).
Se colocaron cuatro foliolos lavados en 0,75% de
agua-agar (p/v) en una placa de Petri y se
pulverizaron con B. cinerea (5 \mul/cm^{2}). Los conidios
de los U. atrum antagonistas también se aplicaron mediante
pulverización justo después de la inoculación con el patógeno.
Se colocaron cuatro foliolos lavados en 0,75% de
agua-agar (p/v) en una placa de Petri y se
pulverizaron con B. cinerea (5 \mul/cm^{2}). Los conidios
de los U. atrum antagonistas también se aplicaron mediante
pulverización justo después de la inoculación con el patógeno.
Tras 6 días de incubación a 20ºC bajo una
exposición a la luz diaria de 16 horas, la cobertura de las esporas
de B. cinerea se evaluó en los tres sustratos de hoja. La
proporción de área de hoja cubierta con conidióforos de B.
cinerea (que oscilaban desde >0 hasta 100% a intervalos del
10%) se evaluó mediante microscopía óptica para cada foliolo de
vegetal.
Cuanto más pequeño sea el porcentaje de
cubrimiento de esporas de B. cinerea, mejor será la actividad
protectora de la composición.
En una primera serie de experimentos, cuyos
resultados se facilitan en la tabla 9, la evaluación de la actividad
protectora de la cepa 385 de U. atrum se llevó a cabo en tres
materiales vegetales diferentes.
| % de cubrimiento de esporas de B. cinerea tras 6 días en | ||||
| Cepa 385 de U. atrum (sp/ml) | GA (% p/v) | Fresa | Tomatera | Parra |
| - | - | 99 | 91 | 94 |
| 2.10^{6} | - | 16 | 7 | 27 |
| 4.10^{5} | - | 14 | 17 | 60 |
| 10^{5} | - | 38 | 44 | 77 |
| 2.10^{6} | 0,01 | 7 | 1 | 19 |
| 4.10^{5} | 0,01 | 5 | 3 | 26 |
| 10^{5} | 0,01 | 14 | 34 | 66 |
Independientemente del sustrato de la hoja
(fresa, tomatera, parra), los ensayos in situ mostraron que
la composición que contenía el 0,01% p/v de GA estimularon la
reducción de la esporulación de B. cinerea tras 6 días de
colonización cuando se aplicó 385 de U. atrum a 4.10^{5}
sp/ml. Los resultados fueron equivalentes a, o mejores que el nivel
protector observado con la aplicación de U. atrum 385 solo a
2.10^{6} sp/ml.
La adición de GA permite usar una proporción
cinco veces inferior de esporas de la cepa 385 de U. atrum
(4.10^{5} en lugar de 2.10^{6} sp/ml) en tomatera y parra sin
ninguna reducción significativa del nivel protector. Esta proporción
puede reducirse hasta 20 veces (10^{5} sp/ml) en la fresa, a la
vez que mantiene buenos resultados.
En una segunda serie de experimentos, la
evaluación de la actividad protectora de composiciones que incluyen
U. atrum y GA se llevó a cabo con tres cepas de U.
atrum (tabla 10).
| Tratamiento | ||||
| 385 de U. atrum | 18558 de U. atrum | 18559 de U. atrum | GA | % de cubrimiento de esporas |
| (sp/ml) | (sp/ml) | (sp/ml) | (% p/v) | de B. cinerea en foliolos de fresa |
| - | - | - | - | 100 |
| 2.10^{6} | - | - | - | 13 |
| 2.10^{6} | - | - | 0,01 | 7 |
| - | 2.10^{6} | - | - | 52 |
| - | 2.10^{6} | - | 0,01 | 20 |
| 2.10^{6} | - | 42 | ||
| 2.10^{6} | 0,01 | 7 |
\vskip1.000000\baselineskip
Las composiciones de la invención contienen
cualquiera de las 3 cepas y un 0,01% p/v de GA mostró un aumento del
efecto protector.
En una tercera serie de experimentos se evaluó la
actividad protectora de una composición que incluye U. atrum
y GA usando diferentes proporciones de GA (tabla 11).
| Tratamiento | % de cubrimiento de esporas de B. cinerea tras 6 días | |||
| 385 de U. atrum (sp/ml) | GA (% p/v) | Fresa | Tomatera | Parra |
| - | - | 97 | 90 | 92 |
| 2.10^{6} | - | 12 | 1 | 25 |
| 2.10^{5} | - | 25 | 10 | 38 |
| 2.10^{5} | 0,001 | 13 | 3 | 30 |
| 2.10^{5} | 0,01 | 12 | 12 | 32 |
| 2.10^{5} | 0,1 | 28 | 17 | 38 |
\vskip1.000000\baselineskip
En foliolos de fresa, la aplicación de
composiciones de la invención que contienen respectivamente el
0,001% p/v y el 0,01% p/v de GA y 385 de U. atrum en la
proporción por debajo de la óptima de 2.10^{5} sp/ml permitió
alcanzar un nivel de protección similar al obtenido con la cepa
antagonista usada sola en la proporción habitual de
2.10^{6}
sp/ml.
sp/ml.
En foliolos de tomatera se obtuvo una reducción
equivalente de la esporulación de B. cinerea a la
proporcionada por 385 de U. atrum utilizada sola (a
2.10^{6} sp/ml) en la composición de la invención que contenían
385 de U. atrum (2.10^{5} sp/ml) con el 0,01% p/v de
GA.
En foliolos de parra, las composiciones de la
invención que contenían el 0,01% p/v de GA también dieron los
mejores resultados para hacer posible la estimulación de la
actividad antagonista de U. atrum, aunque el nivel de
protección era ligeramente inferior que el obtenido por el uso de
U. atrum sola a la proporción habitual (2.10^{6}
sp/ml).
La proporción óptima de ácido galacturónico en
las composiciones de la invención debe ser por lo tanto adaptada
dependiendo del cultivo a tratar.
El ejemplo 5 ilustra el hecho de que puede
obtenerse un buen efecto protector usando las composiciones según la
invención y agentes estimulantes que consisten en polisacáridos
derivados de glucanos y mananos y mezclas de los mismos y levaduras
antagonistas activas frente a enfermedades tras la cosecha
producidas por hongos en frutas de las especies Malus.
En particular, las composiciones de la invención
que contienen o bien un microorganismo antagonista y un agente
estimulante que consiste en polisacáridos o bien un microorganismo
antagonista y dos agentes estimulantes también demostraron ser
eficaces.
Los materiales vegetales, patógenos,
microorganismos antagonistas y el método de tratamiento fueron
iguales que en el ejemplo 1. Los daños se trataron mediante la
aplicación de 50 \mul de composiciones del estado de la técnica o
composiciones de la invención. Se ha evaluado en condiciones
controladas el efecto de las composiciones frente a podredumbre de
manzanas después de recolectadas producidas por B.
cinerea.
Se utilizaron los siguientes productos:
- -
- M, que representa mananos (Sigma M7504)
- -
- YGT, que representa 70-80% p/v de beta-1,3-glucanos de Ohly DHW Deutsche Hefewerke GmbH & Co KG,
- -
- HCT, que representa un producto que contiene el 25% p/v de beta-1,3-glucanos y el 23% p/v de mananos, igualmente de Ohly DHW Deutsche Hefewerke GmbH & Co KG.
En una primera serie de experimentos se han
utilizado las composiciones patrón de la cepa K como control.
| % de protección frente a B. cinerea tras | |||||||
| Cepa K | M (mananos) | YGT | HCT | 7 | 10 | 14 | 20 |
| (ufc/ml) | (% p/v) | (beta-1,3-glucanos) | (beta-1,3-glucanos | días | días | días | días |
| (% p/v) | + mananos) (% p/v) | ||||||
| 10^{7} | - | - | - | 100 | 97 | 79 | 48 |
| 10^{5} | - | - | - | 88 | 79 | 64 | 21 |
| - | 0,02 | - | - | 100 | 78 | 55 | 16 |
| - | 0,2 | - | - | 100 | 93 | 68 | 26 |
| - | - | - | 0,02 | 100 | 81 | 63 | 23 |
| - | - | - | 0,2 | 97 | 88 | 63 | 37 |
| - | - | 0,02 | - | 45 | 19 | 9 | 0 |
| - | - | 0,2 | - | 46 | 23 | 26 | 0 |
| 10^{5} | 0,02 | - | - | 100 | 100 | 99 | 61 |
| 10^{5} | 0,2 | - | - | 100 | 100 | 93 | 57 |
| 10^{5} | - | - | 0,2 | 100 | 95 | 83 | 37 |
| 10^{5} | - | 0,02 | - | 98 | 91 | 79 | 35 |
| 10^{5} | - | 0,2 | - | 100 | 98 | 84 | 40 |
Según la invención, se ha encontrado de manera
sorprendente que M, YGT y HCT son agentes estimulantes que tienen un
efecto en la protección frente a B. cinerea.
Las composiciones de la invención que contienen
cepa K (a 10^{5} ufc/ml) y mananos (al 0,02% p/v o 0,2% p/v)
permiten obtener una protección total frente a B. cinerea
tras 10 días. Incluso tras 14 días, el nivel de protección es
extremadamente alto (del 99 y 93%, respectivamente) y todavía mejor
que el resultado obtenido con la aplicación de capa K sola en la
proporción normal. La actividad protectora obtenida tras 20 días
también mejora.
Las composiciones de la invención que contienen
cepa K a 10^{5} ufc/ml y
beta-1,3-glucanos (YGT) también dan
resultados que indican una mejora de la actividad protectora en
comparación con el uso de la cepa K sola.
La actividad protectora de una composición de la
invención que contiene una mezcla de mananos y
beta-1,3-glucano (HCT) al 0,2% p/v y
la cepa K a 10^{5} ufc/ml tras 14 días es superior a la
proporcionada por la cepa K a 10^{7} ufc/ml.
En una segunda serie de experimentos, cuyos
resultados se facilitan en la tabla 13, se han utilizado las
composiciones patrón del estado de la técnica que contienen la cepa
O como control.
| % de protección frente a B. cinerea tras | ||||||||
| Cepa O | M | YGT | HCT | GA | 7 | 10 | 14 | 20 |
| (ufc/ml) | (% p/v) | (% p/v) | (% p/v) | (% p/v) | días | días | días | días |
| 10^{7} | - | - | - | - | 100 | 100 | 93 | 64 |
| 10^{5} | - | - | - | - | 91 | 60 | 30 | 0 |
| - | 0,02 | - | - | - | 100 | 78 | 55 | 16 |
| - | 0,2 | - | - | - | 100 | 93 | 68 | 28 |
| - | - | - | 0,02 | - | 100 | 81 | 63 | 23 |
| - | - | - | 0,2 | - | 97 | 88 | 63 | 37 |
| - | - | 0,02 | - | - | 45 | 19 | 9 | 0 |
| - | - | 0,2 | - | - | 46 | 23 | 26 | 0 |
| - | - | - | - | 0,001 | 87 | 47 | 33 | 0 |
| 10^{5} | 0,02 | - | - | - | 96 | 88 | 82 | 44 |
| 10^{5} | 0,2 | - | - | - | 97 | 89 | 81 | 58 |
| 10^{5} | - | - | 0,2 | - | 95 | 87 | 67 | 37 |
| 10^{5} | - | 0,02 | - | - | 94 | 86 | 72 | 33 |
| 10^{5} | - | 0,2 | - | - | 91 | 83 | 57 | 20 |
| 10^{5} | - | - | 0,2 | 0,001 | 100 | 88 | 75 | 70 |
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados obtenidos con la cepa O a 10^{5}
ufc/ml no son satisfactorios. La actividad protectora frente al
patógeno tras 20 días está incluso absolutamente ausente.
La aplicación de composiciones de la invención
que contienen 10^{5} ufc/ml de la cepa O y mananos M (al 0,02% p/v
y al 0,2% p/v, respectivamente) muestra una mejora de la actividad
protectora en comparación con el uso de la cepa O sola a esta
proporción por debajo de la óptima. Se obtuvieron resultados
similares con las composiciones de la invención que contenían
beta-1,3-glucanos (YGT) o una mezcla
de mananos y beta-1,3-glucanos
(HCT).
La última composición de la invención ilustrada
en la tabla 13 contiene la cepa O a 10^{5} ufc/ml, además de tanto
una mezcla de mananos y
beta-1,3-glucanos (HCT) y el 0,01%
p/v de ácido galacturónico monohidratado (GA). El nivel de
protección obtenido tras 20 días pareció ser particularmente
alto.
En una tercera serie de experimentos, se ha
añadido el 2% p/v de cloruro de calcio dihidratado
(CaCl_{2}\cdot2H_{2}O, Merck) a algunas composiciones de la
invención. Se han obtenido resultados muy buenos en la protección de
manzanas frente a B. cinerea. De hecho, una composición que
comprende 10^{5} ufc/ml de la cepa O, el 0,02% p/v de mananos M
conduce a una protección del 90% hasta 14 días.
En una cuarta serie de experimentos, cuyos
resultados se facilitan en la tabla 14, se ha demostrado que las
composiciones de la invención que contienen una combinación de la
cepa K y el 0,2% p/v de HCT o el 0,2% p/v de YGT tienen una eficacia
mejorada tras 7 días con respecto a la cepa K utilizada sola, no
sólo frente a B. cinerea, sino también frente a P.
expansum.
| % de protección frente a | % de protección frente a | |||
| Cepa K (ufc/ml) | HCT % p/v | YGT % p/v | B. cinerea tras 7 días | P. expansum tras 7 días |
| 10^{7} | - | - | 92 | 90 |
| 10^{5} | - | - | 66 | 77 |
| 10^{5} | 0,2 | - | 79 | 83 |
| 10^{5} | - | 0,2 | 87 | 65 |
En una quinta serie de experimentos, cuyos
resultados se facilitan en la tabla 15, las composiciones de la
invención que contienen una combinación de la cepa O y el 0,2% p/v
de HCT o YCT también mostraron una eficacia mejorada tras 7 días con
respecto al uso de la cepa O sola, no sólo frente a B.
cinerea, sino también frente a P. expansum.
| % de protección frente a | % de protección frente a | |||
| Cepa O (ufc/ml) | HCT % p/v | YGT % p/v | B. cinerea tras 7 días | P. expansum tras 7 días |
| 10^{7} | - | - | 95 | 79 |
| 10^{5} | - | - | 48 | 34 |
| 10^{5} | 0,2 | - | 85 | 90 |
| 10^{5} | - | 0,2 | 74 | 93 |
Es particularmente sorprendente que las
composiciones de la invención que contienen cepa O a 10^{5} ufc/ml
y el 0,2% p/v de HCT o YGT son incluso más eficaces frente a P.
expansum tras 7 días que las composiciones del estado de la
técnica que contienen una proporción cien veces superior de la
cepa.
El ejemplo 6 ilustra la mejora del efecto
protector de composiciones de la invención que comprende agentes
estimulantes que consisten en mananos y
beta-1,3-glucanos y mezclas de los
mismos y levaduras antagonistas activas frente a enfermedades
después de la recolección producidas por mohos en frutas de las
especies Citrus.
El material vegetal, patógenos, agentes
antagonistas y el método de tratamiento fueron iguales que en el
ejemplo 3. Los daños se trataron mediante la aplicación de 20 \mul
de composiciones del estado de la técnica o composiciones de la
invención. Se ha evaluado en condiciones controladas el efecto de
las composiciones frente a podredumbre de manzanas después de
recolectadas producidas por P. digitatum.
En una primera serie de experimentos, cuyos
resultados se facilitan en la tabla 16, se ha probado la eficacia de
una composición de la invención que contienen 10^{7} ufc/ml de la
cepa K y una mezcla de mananos y
beta-1,3-glucanos como eficaz frente
a P. digitatum tras 10 días como cepa K aplicada a una
proporción diez veces superior.
| % de protección frente a P. digitatum tras | |||
| Cepa K (ufc/ml) | YGT (% p/v) | 7 días | 10 días |
| 10^{8} | - | 92 | 67 |
| 10^{7} | - | 74 | 45 |
| 10^{7} | 0,2 | 83 | 68 |
En una segunda serie de experimentos (tabla 7),
se ha demostrado que las composiciones de la invención que contienen
10^{7} ufc/ml de la cepa I-182 comercializada bajo
el nombre Aspire^{MR} y el 0,2% p/v de YGT tienen una eficacia
drásticamente mejorada.
| % de protección frente a P. digitatum tras | |||
| Cepa I-182 (ufc/ml) | YGT (% p/v) | 7 días | 12 días |
| 10^{8} | - | 34 | 18 |
| 10^{7} | - | 26 | 15 |
| 10^{7} | 0,2 | 70 | 31 |
De hecho, dicha composición tiene una actividad
protectora frente a P. digitatum tras 7 días que es dos veces
superior a la de una composición del estado de la técnica que
contienen diez veces la proporción de una levadura.
Todos los resultados facilitados en los ejemplos
muestran que las composiciones de la invención presentan una
estabilidad más larga en el tiempo y/o una eficacia superior que las
proporcionadas por composiciones del estado de la técnica que
contienen cepas de microorganismos utilizados en la misma proporción
de aplicación.
Los agentes estimulantes de la presente invención
permiten disminuir la concentración de un microorganismo antagonista
sin disminuir la eficacia de la composición frente a patógenos.
También disminuyen la concentración de un microorganismo
antagonista, a la vez que prolongan la duración de la eficacia de la
composición frente a patógenos.
Claims (17)
1. Composición adecuada para su uso frente a uno
o más patógenos, que comprende al menos un microorganismo
antagonista y al menos un agente estimulante elegido del grupo que
consiste en uno o más ácidos urónicos, mananos, sales e hidratos de
los mismos y mezclas de dichos agentes.
2. Composición según la reivindicación 1, que
comprende además un
beta-1,3-glucano.
3. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que la cantidad de al menos un
agente estimulante está comprendida entre el 0,001 y 0,2% p/v.
4. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que dicho al menos un
microorganismo antagonista se selecciona del grupo que consiste en
hongo y levadura.
5. Composición según la reivindicación 4, en la
que dicho hongo es una cepa depositada por Plant Research
International, anteriormente Research Institute for Plant Protection
(Wageningen) (IPO-DLO) 385 depositada en CBS
(Centraalbureau voor Schimmelcultures, Fungal Biodiversity Center -
Utrecht, Los Países Bajos) bajo el número 700.95, MUCL.
6. Composición según la reivindicación 4, en la
que dicha levadura se selecciona del grupo que consiste en Pichia
anomala y Candida oleophila.
7. Composición según la reivindicación 6, en la
que la levadura está en forma de una cepa seleccionada del grupo que
consiste en la cepa K de Pichia anomala (Hansen)
Kurtzman depositada bajo MUCL-40563, la cepa
O de Candida oleophila Montrocher depositada bajo
MUCL-40564, ambas depositadas el 17 de junio de 1997
en la Colección de cultivos BBCM^{MR}/MUCL de la micoteca de la
Universidad Católica de Lovaina, y la cepa I-182
comercial de Candida oleophila Montrocher.
8. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que dicho microorganismo
antagonista se aplica a una concentración que oscila desde 10^{5}
hasta 10^{8} ufc/ml.
9. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que el uno o más patógenos pueden
producir enfermedades en material vegetal.
10. Composición según la reivindicación 9, en la
que dicho material vegetal se selecciona del grupo que consiste en
frutas, particularmente las especies Malus spp., Pyrus spp.,
Citrus spp., de cosechas particularmente de las especies de
tomate, parra y fresa, y de flores y otros cultivos
ornamentales.
11. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que los patógenos se seleccionan
del grupo que consiste en Botrytis cinerea, Penicillium expansum,
P. digitatum, P. italicum, Rhizopus spp.
12. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que comprende además al menos una sal
elegida de entre sal cálcica, sal sódica y sal potásica.
13. Composición según la reivindicación 12, en la
que la sal cálcica se selecciona del grupo que consiste en cloruro
de calcio, bicarbonato de calcio y propionato de calcio.
14. Composición según la reivindicación 13, en la
que la cantidad de sal esta en el intervalo del 0,01% al 2% p/v.
15. Método para el biocontrol de enfermedades
causadas por patógenos en material vegetal, que comprende la etapa
de aplicar una composición según cualquiera de las reivindicaciones
anteriores a dicho material vegetal.
16. Uso de una composición según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 14 como un biopesticida.
17. Método para fabricar un biopesticida que
comprende una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1
a 14.
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