ES2242309T3 - Composiciones farmaceuticas que contienen pentraxina larga ptx3. - Google Patents
Composiciones farmaceuticas que contienen pentraxina larga ptx3.Info
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Abstract
Composición farmacéutica administrable oralmente, parenteralmente, transdérmicamente o subcutáneamente, que contiene como ingrediente activo la secuencia de aminoácidos de la pentraxina larga PTX3, y un excipiente farmacoló- gicamente aceptable, para emplear como agente terapéutico.
Description
Composiciones farmacéuticas que contienen
pentraxina larga PTX3.
La presente invención se refiere a composiciones
farmacéuticas que contienen la pentraxina larga PTX3 (PTX3) ó uno de
sus derivados funcionales. En particular, la invención se refiere a
dichas composiciones para la terapia de enfermedades infecciosas e
inflamatorias o tumores.
La invención se refiere también a vectores de
expresión que contienen la secuencia ADNc completa que codifica la
PTX3 ó uno de sus derivados funcionales, células anfitrionas
recombinantes transfectadas con dichos vectores de expresión y un
método para producir PTX3 ó uno de sus derivados funcionales.
Además, la invención se refiere a métodos de terapia génica para el
tratamiento de tumores, basados en el empleo de los vectores de
expresión antes mencionados.
Hasta la fecha, tenemos que comprender todavía la
función biológica de la PTX3, una proteína que se expresa en varios
tipos de células, la mayor parte principalmente en fagocitos
mononucleares y células endoteliales, después de una exposición a
las citocinas inflamatorias interleucina 1beta
(IL-1beta) y el factor alfa de necrosis tumoral
(TNF-alfa).
Hasta la fecha, no existe ninguna descripción de
ningún empleo terapéutico de la PTX3 ó de sus derivados
funcionales.
La PTX3 consta de dos dominios estructurales, un
N-terminal sin relación con ninguna molécula
conocida, y un C-terminal similar al de las
pentraxinas cortas tal como la proteína C-reactiva
(CRP). Se ha encontrado un substancial grado de similitud entre la
PTX3 humana (hPTX3) y las PTX3s animales.
El gen de la PTX3 está localizado en el cromosoma
3 del ratón en una región similar a la región 3q humana
(q24-28) de acuerdo con la situación documentada de
la hPTX3 en la región 3q 25. Además, la PTX3 de ratón (mPTX3)
(Introna M., Vidal Alles V., Castellano M., Picardi G., De Gioia L.,
Bottazzi B., Peri G., Breviario F., Salmona M., De Gregorio L.,
Dragani T.A., Srinivasan N., Blundell T.L., Hamilton T.A. y
Mantovani A.: "Cloning of mouse PTX3 a new member of the pentraxin
gene family expressed at extrahepatic sites" ("clonación del
ratón PTX3, un nuevo miembro de la familia génica de la pentraxina
expresada en sitios extrahepáticos"). Blood ("Sangre") 87
(1996) 1862-1872) es muy similar a la hPTX3 en
términos de organización, localización y secuencia (Breviario F.,
d'Aniello E.M., Golay J., Peri G., Bottazzi B., Bairoch A., Saccone
S., Marzella R., Predazzi V., Rocchi M., Della Valle G., Dejana E.,
Mantovani A., Introna M.:
"Interleukin-1-inducible genes in
endothelial cells. Cloning of a new gene related to
C-reactive protein and serum amyloid P
component". ("Genes de interleucina 1 inducibles en células
endoteliales. Clonación de un nuevo gen relacionado con la proteína
C-reactiva y el componente P amiloide del
suero"). J.Biol.. Chem 267:22190, 1992).
En particular, el grado de identidad entre las
secuencias es del 82% entre el gen humano y el del ratón, y alcanza
el 90% si se toman en consideración substituciones
conservadoras.
El alto grado de similitud entre las secuencias
de hPTX3 y mPTX3 es un signo del alto grado de conservación de la
pentraxina durante la evolución (Pepys M.B., Baltz M.L.: "Acute
phase proteins with special reference to C-reactive
protein and related proteins (pentraxins) and serum amyloid A
protein" ("Proteínas de fase aguda con especial referencia a la
proteína C-reactiva y proteínas afines (pentraxinas)
y proteína A amiloide del suero"). Immunol. 34: 141, 1983).
La CRP es un marcador para la enfermedad
inmuno-inflamatoria e infecciosa. Después de un
trauma, una lesión o la infección de un tejido, se dispara en el
sujeto afectado, una compleja serie de reacciones que aspiran a
prevenir la extensión del daño, a destruir el organismo infeccioso y
a activar el proceso de reparación con el fin de restaurar la
función normal. Este proceso constituye la llamada respuesta a la
fase aguda, y el marcador principal corrientemente empleado para la
respuesta a la fase aguda es la CRP. En el suero humano normal ya
está presente de hecho en concentraciones de menos de 10 \mug/ml,
pero puede aumentar más de 1000 veces en respuesta a un trauma o a
una inflamación (Koj A.: "Acute phase reactants" ("Reactantes
de fase aguda") en "Structure and Function of Plasma
Proteins" ("Estructura y función de las proteínas del
plasma"). Allison A., ed. Plenum Press, Nueva York, 1074, pp
73-131).
Los anteriores usos terapéuticos de la CRP son ya
conocidos. Por ejemplo la patente US 4.857.314 de fecha 15.08.1989
describe el empleo de la CRP en combinación con el TNF para el
tratamiento de tumores.
La solicitud de la patente internacional
PCT/US94/02181 de fecha 24.02.1994 describe mutantes de la CRP que
son útiles para la preparación de kits de diagnóstico para la
determinación de inmunocomplejos en fluidos biológicos y para el
tratamiento de enfermedades víricas y microbianas, tumores y shock
endotóxico.
La solicitud de la patente internacional
PCT/US94/09729 de fecha 26.08.1994 describe también mutantes de la
CRP que son útiles para la preparación de kits de diagnóstico y para
el tratamiento de enfermedades víricas y microbianas y tumores.
La capacidad de la PTX3 para reconocer y unirse
específicamente a ligandos que son también reconocidos por las
pentraxinas cortas, ha sido evaluada in vitro empleando PTX3
recombinante purificada. La pentraxinas cortas tales como la CRP y
SAP (componente P amiloide del suero) se caracterizan por su
capacidad de reconocer y unirse de una manera
calcio-dependiente a un amplio espectro de ligandos,
incluyendo la fosfocolina, fosfoetanolamina, muchos azúcares, el más
caracterizado de los mismos es un derivado de la agarosa rico en
piruvato [metil
4-6-O-(1-carboxietiliden)-beta-D-galacto-piranoside]
ó MO\betaDG, fragmentos complementarios y proteínas de la matriz
extracelular, particularmente fibronectina y colágeno tipo IV. A
diferencia de las pentraxinas cortas, la PTX3 es incapaz de unirse o
al calcio (dictaminado mediante espectroscopia de emisión acoplada
plasma/atómica inductiva) o a la fosfocolina, fosfoetanolamina ó
MO\betaDG. Además, la PTX3 es incapaz de unirse a las proteínas de
la matriz extracelular tales como la fibronectina o el colágeno tipo
IV. Por otra parte, la PTX3 es capaz de unirse al fragmento
complementario C1q que también es reconocido por las pentraxinas
cortas (Tabla 1). Debería ponerse de relieve sin embargo que,
mientras la CRP y el SAP han de estar reticulados para unirse al
C1q, la PTX3 es capaz de reconocer y unirse a este fragmento
complementario en la forma que se encuentra en la naturaleza.
Sorprendentemente, se ha descubierto ahora que la
pentraxina larga PTX3 ó sus derivados funcionales son útiles agentes
terapéuticos, particularmente para la terapia de enfermedades
infecciosas e inflamatorias o tumores.
Lo que se entiende por "pentraxina larga
PTX3" es una pentraxina larga cualquiera, es decir,
independientemente de su origen natural (humano o animal) o
sintético. La pentraxina larga humana PTX3 (ver secuencia 1 y figura
5) es la forma preferida.
Un método conveniente de producir cantidades
substanciales de pentraxina larga PTX3 ó uno de sus derivados
funcionales consiste en la preparación de vectores de expresión (p.
ej., plásmidos) que contienen la secuencia completa de ADNc que
codifica la PTX3 ó uno de sus derivados funcionales y el empleo de
éstos para transferir células eucarióticas en cultivo (p. ej.,
células de ovario de hamster chino, CHO). Después del clonado de las
células anfitrionas recombinantes así transfectadas se selecciona el
clon celular capaz de producir los niveles más altos de PTX3.
De acuerdo con la presente invención, los
vectores de expresión mencionados más arriba, que contienen la
secuencia de ADNc que codifica la pentraxina PTX3 se utilizan
también en métodos de terapia génica para el tratamiento de
condiciones tumorales.
Un primer método de terapia génica consiste
en:
- a)
- toma de muestras de células de un paciente aquejado de un tumor;
- b)
- transfección de dichas células con un vector de expresión que contiene la secuencia completa de ADNc que codifica la pentraxina larga PTX3 ó uno de sus derivados funcionales; y
- c)
- inoculación del paciente del tumor con estas células transfectadas
Un segundo método de terapia génica para el
tratamiento de tumores consiste en:
- a)
- preparación de un vector de expresión de origen vírico (como p. ej., un adenovirus o retrovirus) que contiene la secuencia completa de ADNc que codifica la pentraxina PTX3 o uno de sus derivados funcionales;
- b)
- inyección del paciente aquejado por el tumor con el vector de expresión así obtenido.
Aunque el mecanismo de acción de la PTX3 ó de sus
derivados funcionales no ha sido todavía definitivamente aclarado,
su actividad anticancerígena en cualquier circunstancia no es
atribuible a un efecto directo citolítico o citostático sobre las
células tumorales, sino más bien al mecanismo mediado por el
anfitrión y relacionado con la capacidad de repoblación de los
leucocitos ejercida por estos compuestos, como se describe a
continuación.
A continuación figura una descripción de los
procedimientos experimentales, y los resultados que se registran
demuestran la inesperada actividad de los compuestos de acuerdo con
la invención descrita en la presente.
Producción del PTX3 recombinante: un
fragmento que contiene la secuencia completa de ADNc de la PTX3
humana (secuencia 2 y figura 6), se subclonó en el sitio Bam H1 del
vector de expresión pSG5 (figura 1) (Stratagene, La Jolla, CA, USA)
y se transfectó en células CHO empleando el procedimiento del calcio
precipitado. Se empleó un clon seleccionado en G418, capaz de
producir grandes cantidades de PTX3, como una fuente de la cual se
purificó la proteína mediante cromatografía por medio de un
intercambio iónico y gel filtración.
Unión de la PTX3 al C1q: la unión de la
PTX3 al C1q se dictaminó mediante un sistema ELISA. Una placa de 96
pocillos se cubrió con 250-500 ng de C1q por pocillo
(una noche a 4ºC) y a continuación se lavó con PBS con Ca^{++} y
Mg^{++} conteniendo 0,05% de Tween 20 (PBS). Los pocillos se
bloquearon a continuación con 5% de leche en PBS (2 horas a
temperatura ambiente) y a continuación se incubaron con
concentraciones variables de PTX3 (30 minutos a 37ºC). Después de
otras series de lavados, la placa se incubó con un anticuerpo
monoclonal de rata a la PTX3 (1 hora a temperatura ambiente) y a
continuación con un segundo anticuerpo, un anticuerpo
anti-IgC de rata conjugado con peroxidasa (1 hora a
temperatura ambiente). Después de lavar, se añadió un cromógeno y se
leyó la absorbancia a 405 nm empleando un lector automático de
placas. En un número de experimentos, los pocillos se cubrieron con
PTX3 y se evaluó la unión con C1q empleando un anticuerpo
anti-C1q.
Se empleó proteína biotinada para determinar la
afinidad de la unión a C1q. La PTX3 se biotinó de acuerdo con
procedimientos estándar empleando una biotina activada modificada
mediante la adición de un "spacer arm" ("brazo separador")
(SPA-Societá Prodotti Antibiotici).
Las figuras 2(A) y 2(B) dan la
unión al C1q y los resultados de la afinidad a la unión. Estos
resultados demuestran el grado muy substancial de unión al C1q y la
afinidad a la unión de la PTX23.
Repoblación de leucocitos: Se estudió
in vivo la repoblación de leucocitos inducida por la PTX3 en
el sistema de la bolsa subcutánea. La bolsa subcutánea se indujo en
el animal experimental mediante dos inyecciones subcutáneas de 5 ml
de aire en la espalda del animal con un intervalo de intervención de
tres días. Al día 6, se administró 1 \mug de PTX3 en 0,5% de
carboximetilcelulosa dentro de la bolsa. Después de 4 horas se
anestesiaron los animales y la bolsa se lavó con 1 ml de solución
salina. El líquido de lavado se recuperó y se sometió a un contaje
total y a un contaje diferencial de las células presentes.
Los resultados obtenidos están registrados en la
figura 3 y demuestran la capacidad substancial de repoblación de
leucocitos, de la PTX3 en animales normales, mientras que la figura
4 muestra los resultados obtenidos con animales genéticamente
modificados, sin el C1q, en los cuales la repoblación de leucocitos
es significativamente más pequeña.
Actividad anticacerígena: línea de
mastocitomas de ratón P815 se cotransfectó mediante electroporación
con el vector de expresión pSG5 conteniendo el ADNc humano de PTX3 ó
su gen antisentido y el vector pSV2 que dota a las células
transfectadas de resistencia a la neomicina. Después de la selección
con neomicina 0,5 mg/ml, las células fueron clonadas mediante
dilución límite.
Para dictaminar la producción de PTX3, se
cultivaron 2,5x10^{5} células en 200 \mul de RPMI + 3% de FCS
durante 24 horas y el sobrenadante se analizó mediante ELISA. Los
clones obtenidos produjeron niveles de proteína que oscilaban de 1 a
35 ng/ml, mientras que los clones que contenían el gen antisentido
no produjeron ningún nivel apreciable de PTX3. Los clones
considerados mostraron la misma proporción de crecimiento in
vivo.
Ratones macho DBA/2N Cr1BR de
8-10 semanas de edad fueron inyectados
subcutáneamente con 1x10^{5} células de P815 produciendo clones de
PTX3, ó con clones conteniendo el gen antisentido. Los ratones
fueron controlados 3 veces diariamente para detectar la presencia de
tumores y una vez al día para controlar la supervivencia.
Los resultados obtenidos están registrados en la
tabla 2 y demuestran la eficacia del PTX3 en este modelo
experimental de terapia génica produciendo la curación de los
animales y el completo rechazo del tumor después de la toma de las
células tumorales inoculadas.
Estos resultados son estadísticamente importantes
con p<0,01 (análisis de Fischer) si se comparan con los controles
y con el grupo tratado con el gen antisentido.
A la luz de estos resultados está claro que la
actividad anticancerosa registrada más arriba se correlaciona con
precisión con la repoblación de leucocitos la cual tiene lugar en el
ratón como resultado del reconocimiento del C1q por la PTX3. En
ratones genéticamente modificados no tiene lugar ninguna repoblación
de los leucocitos. La capacidad de repoblación de los leucocitos
sobre la base de la actividad anticancerosa de los compuestos según
la invención señala que estos compuestos pueden tener también una
aplicación útil en el tratamiento de enfermedades causadas por
patógenos tales como las bacterias, hongos, protozoos o virus.
| CRP | SAP | PTX3 | |
| Ca^{2+} | + | + | - |
| Fosfocolina | + | - | - |
| Fosfoetanolamina | + | + | - |
| Mo\betaDG | - | + | - |
| C1q | + | + | + |
| Colágeno tipo IV | ND | + | - |
| Fibronectina | ND | + | - |
| ND: análisis no realizado |
| Clon^{1} | Rechazo^{2} |
| Progenitor P815 | 4/25 |
| (control) | |
| P815-AS(antisentido) | 3/8 |
| P815-PTX3 | |
| (sentido) | 14/14^{+} |
| 1: 1x10^{5} células del clon indicado fueron inyectadas subcutáneamente. | |
| 2: \begin{minipage}[t]{135mm} Número de animales que definitivamente rechazaron el tumor del número total de animales que participaron.\end{minipage} | |
| *: \begin{minipage}[t]{135mm} p<0,01 comparados ambos a los ratones tratado con células progenitoras y con ratones tratados con células de los clones antisentido (análisis de Fischer).\end{minipage} |
Figura 2: Unión de la PTX3 al C1q. El panel A
muestra la unión del sobrenadante del cultivo que contiene PTX3
(sentido) y de la proteína purificada a los C1q y C1s inmovilizados
en la placa. La unión está dictaminada como densidad óptica (O.D.) a
405 nm. El panel B muestra la curva de saturación obtenida con la
proteína biotinada. Los parámetros cinéticos fueron calculados
empleando el método estadístico adecuado no lineal.
Figura 3: Repoblación de leucocitos inducida por
PTX3: 1 \mug de PTX3 se inyecta en una bolsa subcutánea inducida
en la espalda de ratones CD1 mediante la inoculación de 5 ml de
aire.
Figura 4: Repoblación de leucocitos inducida por
PTX3 en animales normales y animales genéticamente modificados sin
C1q. Se inyecta PTX3 en una bolsa subcutánea inducida en la espalda
de los animales.
Secuencia SEQ.ID.NO 1: Secuencia de
aminoácidos de la PTX3 humana.
Los aminoácidos subrayados constituyen el péptido
señal.
La hPTX3 madura consta de 364 aminoácidos.
Secuencia SEQ.ID. NO 2: Secuencia de
nucleótidos del fragmento de ADNc de la PTX3 humana. Las letras de
la caja superior representan el código de nucleótidos para la
proteína, mientras que las letras de la caja inferior representan
las regiones en 3' y 5' no traducidas pero presentes en la
construcción génica.
<110> SIGMA TAU Industrie Farmaceutiche
Riunite S.p.A.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Composiciones farmacéuticas que
contiene la pentraxina larga PTX3 para la terapia de enfermedades
infecciosas e inflamatorias o tumores, vectores de expresión que
contienen el ADNc que codifica la PTX3, y el empleo de dicho v
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> Pentraxina larga humana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> RM97A000796
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1997-12-19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 381
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pentraxina larga humana PTX3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1404
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pentraxina larga humana PTX3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
Claims (11)
1. Composición farmacéutica administrable
oralmente, parenteralmente, transdérmicamente o subcutáneamente, que
contiene como ingrediente activo la secuencia de aminoácidos de la
pentraxina larga PTX3, y un excipiente farmacológicamente aceptable,
para emplear como agente terapéutico.
2. Composición de acuerdo con la reivindicación
1, en la cual la secuencia de la pentraxina larga PTX3 es la
secuencia de la PTX3 que se encuentra en la naturaleza.
3. Composición de acuerdo con la reivindicación
2, en la cual la secuencia de la pentraxina larga PTX3 es la
secuencia de la PTX3 humana.
4. Composición de acuerdo con las
reivindicaciones 1-3, para el tratamiento de
enfermedades infecciosas o tumores.
5. Composición de acuerdo con la reivindicación
4, para el tratamiento de enfermedades causadas por bacterias,
hongos, protozoos o virus.
6. Empleo de células de un paciente aquejado de
un cáncer, en el cual dichas células fueron transfectadas con un
vector de expresión conteniendo la secuencia completa de ADNc que
codifica la pentraxina larga PTX3 ó uno de sus derivados
funcionales, para la preparación de un medicamento para la terapia
génica de un tumor en dicho paciente.
7. Empleo de un vector de expresión de origen
vírico que contiene la secuencia completa de ADNc que codifica la
pentraxina larga PTX3 ó uno de sus derivados funcionales, para la
preparación de un medicamento para la terapia génica de las
condiciones de un tumor.
8. Empleo de acuerdo con la reivindicación 7, en
la cual el vector de expresión de origen vírico es un adenovirus o
retrovirus.
9. Empleo de la pentraxina larga PTX3 para la
preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades
infecciosas o tumorales.
10. Empleo de acuerdo con la reivindicación 9, en
la cual la pentraxina larga PTX3 es la pentraxina humana que tiene
la secuencia SEQ: ID. NO: 1.
11. Empleo de acuerdo con la reivindicación 10,
para la preparación de un medicamento para el tratamiento de
enfermedades causadas por bacterias, hongos, protozoos o virus.
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