ES2237852T3 - Uso de la flunaricina para el tratamiento topico de la hipertension ocular. - Google Patents

Abstract

Utilización de la flunaricina, o de una de sus sales farmacéuticamente aceptables, como un agente activo en la fabricación de un medicamento oftálmico tópico para disminuir la hipertensión ocular.

Description

Uso de la flunaricina para el tratamiento tópico de la hipertensión ocular.

La presente invención tiene que ver con el uso de la flunaricina para el tratamiento tópico del glaucoma. Más específicamente, esta invención hace referencia al uso de la flunaricina, un agente bloqueador de los canales de calcio conocido y utilizado como vasodilatador cerebral y periférico, como un agente activo en la fabricación de un medicamento tópico para disminuir la hipertensión ocular.

Como es conocido, el glaucoma es una condición oftálmica patológica las causas fundamentales de la cual no se conocen actualmente. Esta condición normalmente se muestra por un incremento progresivo de la presión intraocular, que conduce a un deterioro severo de las estructuras oculares en particular al daño del disco del nervio óptico y a la disminución del campo visual, resultando finalmente en una atrofia óptica. La enfermedad se relaciona generalmente con una secreción insuficiente de humor acuoso del ojo, a pesar de otras causas como, por ejemplo, la producción de humor acuoso y la presión de venas episclerales participan en la regulación de la presión intraocular.

La razón fundamental de la terapia farmacológica utilizada actualmente es disminuir la presión intracocular. Las drogas utilizadas actualmente con este propósito, divididas en clases de acuerdo con su mecanismo de acción, son bloqueadores beta (tales como el timolol, el betaxolol, el levobunolol), simpatomiméticas (tales como la epinefrina i la dipevefrina), parasintomiméticas o mióticas (tales como la pilocarpina i la acetilcolina) e inhibidores de la anihidrasa carbónica (tales como la acetazolamida i la diclorofenamida). Aparte de las drogas anteriores bien establecidas en el uso, la investigación de agentes que tienen menos efectos secundarios y duración de la actividad más larga ha conducido a evaluar, más recientemente, la posibilidad de utilizar para el tratamiento del glaucoma otra clase de drogas, es decir, los agentes bloqueadores de calcio. Éstos, también conocido como "bloqueadores de la entrada de calcio" o "antagonistas de calcio", se utilizan actualmente como vasodilatadores y en el tratamiento de afecciones cardiacas. Para dichas indicaciones, los antagonistas de calcio más extendidos son, por ejemplo, la nifedipina, el diltiacem y el verapamilo.

El papel del calcio en la dinámica del humor acuoso y en el control de la presión intraocular no se ha clarificado completamente, aunque se conoce que la producción y el flujo de humor acuoso se modulan también por calcio. Con lo que respecta a la formación de humor acuoso, se ha observado, en primer lugar, que el compuesto hidrostático, a causa de su presión arterial y la presión de los vasos que alimentan el cuerpo ciliar es dependiente del calcio, como se confirma por la acción vascular sistémica conocida de los antagonistas de calcio. Además, la presión osmótica a causa de la secreción iónica en el nivel del epitelio ciliar no pigmentado es probable que sea modulado por calcio, como hipotetiza Abelson et al. (Abelson M. B., Gilbert C. M., Smith L. M., Reducción sostenida de la presión intraocular en seres humanos con el bloqueador del canal de calcio verapamilo, Am. J. Ophtalmol. 105; 155 (1988)).

Por lo que concierne al flujo del humor acuoso, los iones de calcio juegan un papel directo en la modulación de la presión de las venas episcerales, y algunos estudios sugieren que el calcio influye en la capacidad de flujo, manteniendo la integridad estructural de la trabécula y de la pared exterior del canal Schlemm.

A pesar de las sugerencias anteriores de varios trabajos experimentales, ambos modelos animales y clínicos, e incluyendo las administraciones sistémicas y tópicas, se publicaron resultados contradictorios sobre la actividad de los bloqueadores de canales de calcio en la terapia del glaucoma. Por ejemplo, Monica et al. (Monica M. L., Hesse R. J., Messerli F. H., El efecto de los agentes de bloqueo de los canales de calcio en la presión intraocular, Am. J. Ophtalmol. 96, 814 (1983)) publica que la administración oral de nitrendipina a pacientes con hipertensión moderada pero con presión intraocular normal disminuía ligeramente, mientras Beatty y sus colaboradores (Beatty J. F., Krupin T., Nichols P. F., Elevación de la presión intraocular por bloqueadores de canales de calcio, Arch. Ophtalmol. 102; 1072, (1884)) no evidencian ningún efecto con la administración oral de verapamilo en conejos, e incluso publicaron un incremento en la presión intraocular con la administración tópica. Más recientemente, por ejemplo, Payene y sus colaboradores (Payene L. J., Slagle T. M., Cheeks L. T., Efecto de los bloqueadores de los canales de calcio en la presión intraocular, Ophtlamic Res. 22, 337, (1990)) obtuvieron una reducción de la presión intraocular con la administración sistémica del verapamilo o la nifedipina en conejos, pero no detectaron ningún efecto significativo con la administración tópica de los mismos agentes o de diltiacem por vía tópica.

En general, sin embargo, al menos en lo que respecta al verapamilo, se puede decir que la administración de esta droga en humanos reduce normalmente la presión intraocular. Una reducción más consistente se ha explicado con la administración tópica, en particular, por un trabajo de Ettl et al. (Ettl A., Daxer A., Hoffmann U. Bloqueadores de canales de calcio en el tratamiento del glaucoma de ángulo abierto y baja tensión, Am. J. Ophtalmol. 116; 778, (1993). Estos autores han detectado, en el ojo del conejo, niveles de verapamilo 200 veces mayores que los niveles que se podían obtener por administración sistémica.

De acuerdo con esto, el uso del verapamilo en el tratamiento de la hipertensión ocular es el objeto de la solicitud PCT internacional número WO 92/07563, registrada por Abelson (es decir, el primer autor citado anteriormente) et al. Una publicación posterior con el nombre del mismo autor es la solicitud internacional número WO.96/03986, que tiene que ver con el tratamiento de una forma particular de glaucoma, referido como glaucoma de baja tensión. Esta patología se caracteriza por una presión intraocular que es casi normal, a pesar de que están presentes todos los otros síntomas del glaucoma. En el documento posterior la propuesta terapéutica se extiende genéricamente a todos los antagonistas del calcio, algunos representantes de los cuales se mencionan en una lista preliminar. Sin embargo, el único ejemplo de agente activo dado a conocer en el documento y apoyado por datos experimentales es el
verapamilo.

Otro agente bloqueador de calcio que se proponía específicamente para el uso, en un documento de patente, en el tratamiento de la hipertensión intraocular es el diltiacem (patente francesa número 2593395, publicada en 1987), mientras una lista de más de un centenar de antagonistas de calcio se presenta en la solicitud PCT internacional número WO 93/23082. Esto se refiere, para el uso en el tratamiento del glaucoma, a una combinación de un compuesto que disminuye la presión intraocular (es decir, un agente antiglaucoma convencional) y un agente bloqueador de los canales de calcio. El descubrimiento no contiene ninguna combinación preferida como ejemplo específico, ni ningún detalle experimental considerando la actividad de cualquier combinación.

Algunos ensayos experimentales en el verapamilo también permitieron averiguar que el uso oftálmico del dicho agente causa una inflamación no deseable de la córnea (Green K., Cheeks L., Hull D. S., Efectos de los bloqueadores de los canales de calcio en la función endotelial de la córnea de conejo, Curr. Eye Res. 13; 401-408, (1994)). Esto es particularmente crítico si uno considera el uso para el tratamiento de una condición crónica como es, actualmente, el glaucoma.

En Jpn. J. Clin. Ophtalm., 43(5), 1989, páginas 865-868 y Acta Ophtalm. Scand. 1997, 224, páginas 57-58, se utilizó sistemáticamente flunaricina administrada en el tratamiento de por ejemplo, el glaucoma de baja tensión; ni la no reducción de la hipertensión ocular se publicó en esas referencias, ni publicaron formulaciones oftálmicas
tópicas.

A pesar de que la clase de antagonistas de calcio entera ya se ha considerado para su uso potencial en el tratamiento del glaucoma, no parece haberse evidenciado la actividad particular, contra este tipo de patologías, de un agente específico que pertenece a dicha clase, es decir, la flunaricina. Ahora se ha encontrado, y es el objetivo principal de esta invención, que el antagonista de calcio específico flunaricina, cuando se administra a través de la vía ocular tópica, es capaz de disminuir la presión intraocular de una forma sorprendentemente más acusada que otros antagonistas de calcio hasta ahora propuestos y probados para la terapia del glaucoma.

Dentro de los estudios relacionados con esta invención, también se ha encontrado que algunos receptores conocidos, conocidos como receptores \sigma, se localizan en la región ocular, en particular en el cuerpo ciliar y en el iris, y que algunos "ligandos" específicos, que tienen actividad \sigma-agonista, disminuyen significativamente la presión ocular. Desde que se ha encontrado experimentalmente que la flunaricina muestra una actividad \sigma-agonista que es mucho mayor que la actividad de otros antagonistas de calcio, esta propiedad puede explicar la actividad inesperadamente mayor de la flunaricina al disminuir la presión intraocular, si se ha hipotetizado que esta actividad se ejerce de acuerdo con mecanismos de acción que son al menos parcialmente diferentes de los otros agentes bloqueadores de
calcio.

Con el fin de identificar la presencia de sitios receptores \sigma en el ojo se ha utilizado la técnica de "unión de receptor". Dicha técnica se ha llevado a cabo en las membranas celulares obtenidas del complejo de cuerpo iridociliar. El complejo de cuerpo iridociliar se ha extraído, después del sacrificio, de conejos albinos de raza de Nueva Zelanda El tejido se homogeneizó en tampón y una fracción rica en proteínas de membrana se aisló, obtenida por centrifugación. La concentración de proteínas totales se evaluó por el método Lowry (Lowry, J. Biol. Chem. 193, 265 (1951)). Las alícuotas de dicha fracción de homogenizado que contenían 300 \mug de proteínas totales se incubaron con cantidades escalares de [^{3}H](+)-pentazocina (que se utiliza, sólo con propósitos experimentales, como un ligando \sigma). La reacción se llevó a cabo a 37ºC durante 150 minutos y luego, después del filtrado, la radioactividad que quedó en los filtros se mesuró por centelleo líquido. La constante de disociación aparente (Kd) y el número total de receptores se determinó, y se averiguó que [^{3}H](+)-pentazocina se une selectivamente a los sitios receptores presentes en la región del cuerpo iridociliar del conejo. Según los conocimientos científicos actuales, dichos receptores son del tipo \sigma-1.

Además, los ensayos de "unión competitiva" llevados a cabo con una cantidad constante de [^{3}H](+)-pentazocina y cantidades escalares de (+)-N-alilnormetazocina (NANM) (que se utiliza, sólo con finalidades experimentales, como ligando \sigma), mostró los cambios posteriores de los ligandos radiactivos de los sitios receptores. También se ha observado, analizando el coeficiente de Hill, que el NANM interactúa con una sola clase de sitios receptores \sigma.

Dentro de la misma investigación se ha encontrado que los agentes \sigma-agonistas muestran una actividad antihipertensa. Una preparación del 1% de NANM se administró (50 \mul) en el fórnix conjuntival del ojo derecho de los conejos albinos machos de raza de Nueva Zelanda, después de medir la presión intraocular (línea de partida). Midiendo otra vez la presión intraocular 60, 120, 180 y 240 minutos después de la aplicación, se constató que la presión intraocular se redujo significativamente (p < 0,01) 60 minutos después de la instilación, en comparación con la formulación que contiene sólo el medio.

Por último, como se indicó antes, los estudios de unión de receptores llevados a cabo con flunaricia (algunos de los cuales se presentan a continuación) han mostrado que la flunaricina tiene una afinidad para los receptores \sigma-1 que no es ni siquiera comparable a la afinidad mostrada por los otros agentes bloqueadores de canales de calcio proba-
dos.

Otros aspectos ventajosos que distinguen la flunaricina de los otros agentes bloqueadores de canales de calcio propuestos para el tratamiento tópico del glaucoma es, como ahora se ha visto, que la flunaricina no muestra ningún efecto secundario con la inflamación de la córnea.

Por lo tanto, la presente invención promociona de forma especial el uso de la flunaricina, como una opción en la forma de una sal farmacéuticamente aceptable, para el tratamiento tópico del glaucoma, es decir, el uso de la flunaricina, o de su sal farmacéuticamente aceptable, en la fabricación de un medicamento tópico oftálmico para el tratamiento y/o la profilaxis del glaucoma. En general, la administración tópica de la flunaricina puede hacerse usando una preparación en la forma de solución acuosa o suspensión, o en la forma de gel, un ungüento o una crema en un medio oftálmico farmacéuticamente aceptable, o en forma de un inserto ocular de desgate o de un sistema de "reservorio" con una membrana de polímero, para situarse en el saco conjuntival.

La concentración de flunaricina en un medio oftálmico puede oscilar entre 10 \mug/ml y 5 mg/ml, es decir entre 0,001 y 0,500% en peso. La concentración óptima se escoge en primer lugar según a la dosis que debe ser administrada: en el caso de utilizarse en forma de gotas oculares, por ejemplo, una gota debería contener una cantidad suficiente de flunaricina para que la gota fuera efectiva como tal o cuando se aplicara dos veces (es decir, dos gotas). Otros criterios para escoger la concentración son los de la tolerancia ocular (se debería considerar que el saco conjuntival, en el cual la preparación oftálmica se tiene que aplicar, tiene una capacidad limitada) y la estabilidad del ingrediente activo. La concentración preferida para una formulación de solución acuosa (gotas oculares) es de 0,050% en peso, y preferiblemente el producto debe presentarse en la forma de la sal del hidrocloruro correspondiente (concentración óptima de hidrocloruro de flunaricina: 0,052%).

Un medio que se puede utilizar en una preparación de gotas oculares de acuerdo con la invención es la solución salina fisiológica simple que contiene un 0,9% en peso de cloruro de sodio. Dicha solución es isotónica respecto al fluido lacrimal, y por esto el ojo la tolera. Sin embargo, también se pueden emplear las soluciones hipotónicas o suspensiones, ya que es sabido que los tejidos oculares toleran bien estas preparaciones.

Otros excipientes se pueden añadir al compuesto de la invención para ajustar la tonicidad de las soluciones o suspensiones, para estabilizar el ingrediente activo o ingredientes activos y para incrementar la tolerabilidad de la preparación. Especialmente, algún tampón debería mantener el pH entre 4 y 8. Por ejemplo, la solución salina anterior se puede tamponar con cualquier tampón bien conocido en el campo farmacéutico para uso oftálmico, como, por ejemplo, el tampón de fosfato, o el tampón de trizma (es decir, trihidroximetilaminometano), para obtener un pH fisiológico, de 7,0-7,4. Además, la solución también puede tener una osmolaridad fisiológica (295-305 mOsm/l). Esto permite obtener una mejor tolerabilidad ocular. Además, la formulación puede contener ventajosamente un antioxidante, como, por ejemplo, galatos, ácido ascórbico, superóxido dismutasa (SOD), BHT, metabisulfito de sodio, tocoferoles, BHA, ácido nordihidroguaiarético, ésteres de ácido ascórbico, dimetiltiourea y sus similares.

Además, la tolerabilidad se puede aumentar mediante otros excipientes como las ciclodextrinas, el polisorbato 80 (o Tween 80), dextrano (por ejemplo, dextrano 70), glicol de polietileno (por ejemplo, PEG 400), poloxámeros y otros agentes similares. La formulación puede incluir agentes de viscosidad/espesor como la metilcelulosa, el alcohol de polivinilo, los glucanos de glucosamina, la pirrolidona de polivinilo y sus similares, para incrementar la biodisponiblidad ocular, la estabilidad y la tolerabilidad del ingrediente activo (o ingredientes activos).

La biodisponibilidad ocular de la flunaricina puede ser además mejorada mediante la adición de sustancias que incrementan la permeabilidad de la córnea a la droga, como, por ejemplo, el dimetilsulfóxido, los taurocolatos, los fosfolípidos de membrana, el cloruro de benzalconio y otros agentes activos de superficie para uso oftálmico (como un laurilsulfosuccinato de disodio).

Por último, en las preparaciones que se van a empaquetar en compuestos de botellas multidosis se tendrá que añadir un conservante con actividad antimicrobiana, para evitar la contaminación del producto. Dicho agente se puede escoger de entre los agentes conservantes bien conocidos que se utilizan en el campo farmacéutico.

Los productos que se administrarán en la forma de suspensiones deberían contener agentes adecuados como celulosa y el carboximetil y similares. En el caso de la preparación que se utilizará en forma de ungüento, de gel o de crema para uso oftálmico, la flunaricina se mezcla con transportadores como los glicoles de polietileno, poliacrilatos, óxidos de polietileno, ácidos grasos y alcoholes o lanolina, parafina y otros productos similares. Se pueden escoger los ingredientes adecuados para la producción de emulsiones o microemulsiones entre los siguientes: dietilen glicol monobutil éter, di(etilenglicol) butil éter, etil éster de ácido caprílico, etil éster de ácido oleico, aceite de soja, hexadecano, tributirino, etilenglicolmonobutil éter, 1-hexadeceno, n-heptano, 1-hepteno, Tween 80, PEG, poloxámeros, éters de polioxietileno.

La dosis del ingrediente activo principal de la invención, que se administrará por vía tópica, puede oscilar entre unos 20 \mug hasta unos 200 \mug por día para cada ojo. La dosis de prescripción para las preparaciones oftálmicas basadas en flunaricina dependerá de la dosis diaria necesaria para alcanza el efecto terapéutico y, obviamente, de la formulación específica empleada. Las soluciones oftálmicas o suspensiones requerirán de 1 a 4 instalaciones por día; ungüentos, geles y cremas requerirá de 1 a 2 aplicaciones; los insertos sólidos con matriz polimérica, sean biodegradable o no, requerirá sólo una administración por día.

La presente invención incluye además compuestos que permiten la administración de flunaricina por la vía oftálmica tópica, y los compuestos oftálmicos específicos para uso en el tratamiento y/o en la profilaxis de la hipertensión ocular, comprendiendo, como ingrediente activo, una cantidad terapéuticamente efectiva de flunaricina. Un grupo de compuestos preferidos tiene la formulación siguiente (donde todos los porcentajes son por peso):

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comprendiendo además opcionalmente ingredientes farmacéuticamente aceptables.

En una forma de realización particularmente preferida de esta invención, los compuestos para uso en el tratamiento y/o en la profilaxis de la hipertensión ocular además contienen de 0,1 a 2,5% por peso de un agente beta-bloqueador, siendo preferentemente el último el timolol o su sal aceptable farmacéuticamente, como el maleato de timolol.

Algunas formas de realización de esta invención se describen con finalidades meramente ilustrativas, juntamente con los resultados de los estudios experimentales llevados a cabo con flunaricina incluyendo pruebas comparativas con otros agentes bloqueadores de calcio.

Ejemplo 1 Solución oftálmica basada en la flunaricina

Un compuesto de acuerdo con la invención que resulta ser particularmente efectiva (la realización del cual se evaluó experimentalmente como además se publica en parte) tenía el compuesto siguiente (los porcentajes se dan por peso):

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El compuesto anterior es adecuado para ser empaquetado en contenedores de dosis simple; en el caso que se desee un empaquetado multidosis, se tendrá que añadir un conservante (como, por ejemplo, el cloruro de benzalconio) para mantener la esterilidad del producto durante todo el período de uso.

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Ejemplo 2 Microemulsión oftálmica basada en la flunaricina

Un compuesto adecuado para usarlo como un ungüento oftálmico se preparó de acuerdo con la formulación que se da a continuación (porcentajes de peso):

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Como agente de ajuste de la tonicidad, se pueden usar 455 mg de cloruro de sodio en 100 ml (es decir 0,455% en peso) en lugar de la cantidad anterior de sorbitol.

Ejemplo 3 Emulsión oftálmica basada en la flunaricina

Se obtuvo un producto oftálmico similar al que se ha mostrado en el ejemplo anterior, pero que tiene un tamaño más grosero que las gotas de la fase dispersa, excluyendo el aceite de soja del compuesto, de acuerdo con la formulación siguiente (peso en porcentajes):

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Como alternativa al sorbitol como agente ajustador de la tonicidad el compuesto puede incluir 433 mg de cloruro de sodio por 100 ml (es decir, 0,433% en peso).

Ejemplo 4 Solución oftálmica basada en una combinación de flunaricina y timolol

Un compuesto particularmente preferido de acuerdo con la invención se obtuvo añadiendo a la formulación del Ejemplo 1 una cantidad suficiente de maleato de timolol para alcanzar una concentración de 0,5% en peso de timolol en el compuesto total (correspondiente a aproximadamente un 0,68% por peso de maleato de timolol). Las concentraciones de los otros ingredientes eran los mismos que se ha especificado anteriormente en el Ejemplo 1.

De una forma similar, también las formulaciones dadas en los Ejemplos 2 y 3 se pueden modificar con la adición de una cantidad adecuada de maleato de tiomolol. También en este caso, se prefiere obtener una concentración de 0,5% por peso de timolol en el compuesto total.

Resultados experimentales

Una solución isotónica, tamponada y viscosificada de acuerdo con la formulación del Ejemplo 1, pero que tiene concentraciones variables de flunaricina (que van desde un 0,01% hasta un 0,1% en peso), es conocida generalmente como MEG 01 en el trabajo experimental cuyos resultados se detallan más adelante. El experimento también consideró combinaciones de flunaricina y agentes beta-bloqueadores formulados como se muestra para el timolol en el Ejemplo 4. A la combinación de flunaricina y timolol se la conoce como MEG 02. Algunos de los dichos resultados experimentales también se muestran en los gráficos de los dibujos adjuntos, donde:

La Figura 1 muestra el porcentaje de la reducción de la presión intraocular obtenida sobre la instilación de flunaricina en los ojos de conejos con hipertensión, en comparación con la reducción correspondiente obtenida con la aplicación del placebo y con la instilación de otros antagonistas de calcio;

La Figura 2 muestra el porcentaje de la reducción de la presión intraocular obtenida sobre la instilación, en los ojos de conejos con hipertensión ocular, de flunaricina a varias concentraciones; y

Estudios farmacodinámicos a. Estudio en conejos con presión intraocular normal

Los efectos del agente de la invención en la presión intraocular de los conejos que muestran una línea base normal en la presión intraocular se evaluaron en comparación con la acción de un placebo, y con varios otros agentes bloqueadores de los canales de calcio. Se usaron los conejos pigmentados hembras de la raza Viena Blue (sustituido por Charles River Italiana, de Calco (CO)). La edad de los animales al empezar el experimento era de 9 semanas, y su peso era de 2,0-2,5 kg.

La elección de una especie con iris pigmentado se debe a que este último representa un modelo fiable para la evaluación de posibles modificaciones de la presión intraocular causada por los productos de la prueba. La raza escogida se define genéticamente, para limitar al mínimo la variabilidad de las características biológicas entre un animal y otro.

Los animales se dejaron en habitaciones mantenidas bajo condiciones de humedad y temperatura constantes y controladas, iluminadas durante 12 horas al día con luz artificial y con renovación continua del aire. La alimentación consistió en una dieta estándar que tenía una composición constante y conocida, y tanto la comida como el agua estaban disponibles ad libitum durante todo el tiempo que duró la prueba. Los conejos se estabularon durante 21 días antes de empezar la prueba, para permitir una aclimatación suficiente y para evaluar adecuadamente las condiciones de salud de los conejos. Cada grupo experimental consistió en 4 animales, que se adjudicaron para los grupos de tratamiento en forma aleatoria.

Cada grupo diferente de animales recibió, por aplicación en el fórnix conjuntival derecho, 50 \mul de los productos siguientes:

a) gotas oculares de MEG 01, que contenían 0,050% en peso de flunaricina (0,052% en peso de hidrocloruro de flunaricina);

b) solución placebo (es decir, el medio de MEG 01);

c) gotas oculares que contenían 0,056% en peso de verapamilo en el medio de MEG 01;

d) gotas oculares que contenían 0,051% en peso de diltiacem en el medio de MEG 01;

e) gotas oculares que contenían 0,043% en peso de nifedipina en el medio de MEG 01.

La concentraciones de peso de varios agentes de la prueba se escogieron para corresponder a la misma concentración molar.

La presión en el ojo tratado se mesuró mediante un tonómetro de aplanamiento (TonopenXL®, Mentor), 15 minutos antes de la instilación de las gotas oculares (tiempo 0) y luego 30, 60, 90, 120, 180 y 240 minutos después. Como anestésico local, 5 minutos antes de llevar a cabo cada medida se aplicaron 25 \mul de una solución oftálmica comercial que contenía 0,4% de hidroxicloruro de oxibuprocaína (Novesine®, Sandoz). Para llevar a cabo las medidas, los conejos se introdujeron en una caja diseñada adecuadamente para evitar cualquier movimiento súbito del animal durante la prueba.

Para cada animal y en cada uno de los tiempos listados anteriormente la media de las tres medidas subsiguientes se calculó y registró, realizándose cada una de dichas medidas después de un minuto de la medida precedente. Los valores de la presión intraocular en tiempos diversos se compararon con los valores obtenidos antes del tratamiento, mediante la prueba "t" de Student. Las comparaciones entre los grupos diferentes se hicieron procesando los datos mediante el análisis de la varianza (ANOVA) y, cuando fue posible, mediante la prueba "t" de Student para la comparación de dos grupos experimentales distintos. Los valores de p < 0,05 se consideraron significativos estadísticamente.

La tabla siguiente muestra los valores de la presión intraocular determinada en cada uno de los animales tratados así como la media de los valores para cada grupo de la prueba (\pm desviación estándar).

TABLA 1 Presión intraocular en conejos con presión normal tratados con agentes probados

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Como se muestra en la tabla anterior, las gotas oculares MEG 01 (que contienen un 0,050% en peso de flunaricina) produjeron una reducción significativa de la presión intraocular después de una hora de su administración, mientras que un producto consistente en el medio correspondiente sin flunaricina no causó ninguna modificación importante en la presión intraocular. En el último caso, los valores de la presión medidos sobre administración de las gotas oculares no son estadísticamente diferentes de los valores registrados antes de la aplicación (tiempo 0: 15 minutos antes de la administración).

Además, ni la formulación de verapimilo ni la formulación de diltiacem, ambos usando el mismo medio como MEG 01, no produjeron ningún descenso de la presión intraocular con respecto al placebo. Se pudo detectar alguna reducción menor con la administración de nifedipina, pero su efecto parece ser negligible en comparación con la respuesta obtenida con el MEG 01 que contiene un 0,050% en peso de flunaricina.

Otra serie de pruebas se llevó a cabo en conejos con una presión intraocular de línea base normal para comparar la actividad de la flunaricina con la combinación propuesta de flunaricina con un agente beta-bloqueador, y con la actividad del agente beta-bloqueador solo.

Se probaron los beta-bloqueadores bien conocidos: el timolol (que es un beta-bloqueador no selectivo, siendo ambos activos en receptores adrenérgicos \beta_{1} y \beta_{2}), el betaxolol (un beta-bloqueador cardioselectivo, activo sólo en receptores adrenérgicos \beta_{1}) y el carteolol (que no es selectivo, pero se dota de una actividad simpatomimética intrínseca). Las pruebas se llevaron a cabo de acuerdo con el mismo protocolo experimental descrito anteriormente, tratando cada grupo de animales diferente con los compuestos siguientes:

f) gotas oculares de MEG 02, que contenían 0,050% en peso de flunaricina (0,052% en peso de hidrocloruro de flunaricina) en combinación con 0,5% en peso de timolol (0,68% en peso de maleato de timolol);

g) gotas oculares que contenían 0,050% en peso de flunaricina y 0,5% en peso de betaxolol en el medio de
MEG 02;

h) gotas oculares que contenían 0,050% en peso de flunaricina y 2,0% en peso de carteolol en el medio de
MEG 02.

Los resultados de esta serie de pruebas, obtenidos y procesados de la misma forma que la que se muestra en la Tabla 1, se presentan en la Tabla siguiente. Para hacer la comparación más fácil, se vuelven a mostrar en la tabla siguiente los datos obtenidos con la flunaricina sola y con el placebo, es decir, con los grupos de animales a) y b) del experimento previo.

TABLA 2 Presión intraocular en conejos con presión normal tratados con agentes probados

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De los resultados experimentales de la tabla anterior se constata por un lado que, en las condiciones de la prueba, la flunaricina sola era mejor para disminuir la presión intraocular que el timolol sólo. Por otro lado, los datos muestran que la actividad de la flunaricina mejoraba con la adición de timolol en la formulación, así como que los resultados de la combinación eran mejores que con la flunaricina sola.

b. Estudio en conejos con hipertensión ocular

Los conejos del mismo tipo que los descritos en la sección previa se utilizaron para las pruebas siguientes. Los conejos se habían tratado en la misma forma, y las condiciones establecidas eran las mismas.

El incremento experimental en la presión intraocular se indujo por la administración de \alpha-quimotripsina. En el conejo, la inyección de este enzima en la cámara posterior causa, después de un mes de la administración, un efecto de hipertensión ocular. Este modelo experimental se usó ampliamente, y se ha utilizado a menudo para evaluar la actividad de varios agentes antiglaucoma.

Al final del período de la cuarentena los conejos se anestesiaron por administración intramuscular de hidrocloruro de quetamina e hidrocloruro de xilacina (RBI). El ojo derecho se empujó de forma suave superficialmente un poco después de instilar 25 \mul de gotas oculares Novesine®, que contienen oxibucaína como un anestésico; a continuación, una solución estéril de \alpha-quimotripsina (SIGMA, Milan; 150 unidades en 100 \mul de solución estéril fisiológica) se inyectó en la cámara posterior del ojo derecho mediante una aguja estéril 30G. Después de la administración del enzima, se lavó todo el ojo con solución fisiológica estéril para eliminar cualquier traza de \alpha-quimotripsina que pudiera dañar los tejidos oculares. Seguidamente, se aplicaron 2 gotas de una solución antibiótica oftálmica comercial (Colbiocin®, SIFI S. p. A., conteniendo cloramfenicol, rolitetraciclina, colistina metanosulfonato). El tratamiento se llevó a cabo 3 veces al día (a las 8.00 a. m., a las 12.00 a. m. y a las 6.00 p. m.) durante una semana después de la administración de \alpha-quimotripsina. Los conejos se utilizaron en la prueba un mes después de la inducción de la hipertensión ocular mediante el encima.

Los conejos, también divididos en este caso en grupos de 4 animales, se trataron mediante la aplicación de 50 \mul del producto de la prueba en el fórnix conjuntival derecho. En un primer experimento, los agentes empleados eran los mismos que en la primera prueba mencionada anteriormente (gotas oculares MEG 01 con 0,050% en peso de flunaricina, placebo, y gotas oculares con 0,056% en peso de verapimilo, 0,051% en peso de diltiacem y 0,043% en peso de nifedipina respectivamente).

La presión intraocular en el ojo tratado se mesuró, de acuerdo con el mismo procedimiento que en las pruebas previas, 15 minutos antes de la instilación de las gotas oculares y 30, 60, 90, 120, 180 y 240 minutos después. Los valores obtenidos se analizaron estadísticamente de acuerdo con los criterios mencionados anteriormente.

La tabla siguiente muestra, para cada grupo de la prueba, las respuestas de la presión intraocular individual y sus valores medios (\pm desviación estándar). Los valores medios de la reducción de la presión intraocular, expresados en porcentaje, también se representan diagramaticalmente en el gráfico de la Figura 1.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 3 Presión intraocular en conejos con hipertensión ocular tratados con los agentes probados

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La Tabla 3 muestra que la administración del medio solo no produce ninguna variación significativa en la presión intraocular, mientras que MEG 01 con 0,050% en peso de flunaricina causó una reducción en la presión intraocular marcadamente mayor que la que se obtenía con la administración de otros antagonistas de calcio probados. Como se puede observar, los valores de la presión intraocular en conejos con hipertensión ocular después del tratamiento con soluciones oftálmicas que contienen cantidades equivalentes de verapimilo, diltiacem o nifedipina, en el mismo medio con MEG 01, no muestran ninguna reducción significativa.

En una segunda serie de pruebas, utilizando las etapas de procedimiento idénticas, la solución oftálmica de acuerdo con la invención se probó con diferentes concentraciones de flunaricina, es decir, con un 0,1% y un 0,01% en peso de ingrediente activo. La finalidad era comparar la respuesta obtenida con la respuesta observada con las gotas oculares MEG 01 que contienen 0,05% en peso de flunaricina. Los resultados se presentan en la tabla siguiente, y se ilustran también (como cantidades porcentuales medias de la reducción de la presión intraocular detectada) en el gráfico de la Figura 2.

TABLA 4 Presión intraocular en conejos con hipertensión ocular tratados con flunaricina

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De la tabla anterior se puede apreciar que la reducción porcentual mayor en la presión intraocular se obtuvo con la preparación de MEG 01 con el 0,05% de flunaricina, mientras que la preparación con la concentración mayor (0,1%) mostró una actividad comparable con la de la preparación del 0,05%. Esto se aprecia más claramente en el gráfico de la Figura 2.

Estudios de la toxicidad a. Evaluación de la inflamación de la córnea

La evaluación del grosor de la córnea se llevó a cabo ecográficamente mediante un Sistema UBM 840 (Humphrey Instruments, San Leandro, CA, EE. UU.). El aparato incluye una sonda de 50 MHz y permite visualizar imágenes en un monitor con una resolución de aprox. 504 y un campo de visualización de 5 \times 5 mm. El software incorporado permite modificar la profundidad de focalización del rayo de ultrasonido, y capturar la imagen mientras se varía su ampliación.

Los animales utilizados en esta prueba eran del mismo tipo que los descritos anteriormente, y se trataron de la misma forma. La prueba se llevó a cabo, después de tener el animal anestesiado (con el hidrocloruro de quetamina y el hidrocloruro de xilazina), poniendo en contacto el vaso pequeño del glóbulo ocular lleno con un par de medios (gel de ultrasonido). Los conejos recibieron en el ojo derecho una instilación simple (50 \mul) de cada uno de los mismos agentes usados en los estudios farmacodinámicos: a) las gotas oculares MEG 01 con un 0,050% de flunaricina, b) las gotas oculares que contienen un 0,056% en peso de verapamilo; c) las gotas oculares que contienen 0,051% en peso de diltiacem; d) las gotas oculares que contienen un 0,043% en peso de nifedipina. En el ojo izquierdo los conejos recibieron una aplicación de una cantidad igual de placebo (medio de MEG 01 sin ningún ingrediente
activo).

La tabla siguiente muestra el grosor de la córnea tal como se detectó en varios grupos de 4 conejos cada uno, antes de la instilación y en intervalos de tiempo fijados después de la instilación.

TABLA 6 Grosor de la córnea en conejos tratados tópicamente con antagonistas de calcio

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Como se puede observar a partir de los datos precedentes, con el uso del producto de acuerdo con la invención no se ha detectado ninguna alteración en el grosor de la córnea durante todo el período que ha durado la prueba. Por el contrario, la solución oftálmica que contiene un 0,056% de verapamilo produjo inflamación de la córnea, con incrementos en el grosor de unos 15-20 \mum/hora. No se notó ningún efecto significativo para gotas oculares que contenían diltiacem (sólo una ligera inflamación) o nifedipina.

b. Tolerabilidad aguda

Para evaluar la tolerabilidad del agente bloqueador del canal de calcio de acuerdo con la invención cuando se aplica tópicamente al ojo, los conejos (del mismo tipo que los que se utilizaron en el experimento previo) se trataron como sigue, después del período de aclimatación inicial. En el primer día, se hicieron 12 instilaciones de MEG 01 (0,05%) en el fórnix conjuntival derecho, de 0,05 ml cada uno, a intervalos de 30 minutos. El ojo contralateral se trató con placebo y sirvió como control.

La condición de los tejidos oculares se observó de acuerdo con la prueba modificada Draize (Spampinato S., Marino A., Bucolo C., Canossa M., Bachetti T., Mangiafico S., Efecto de las gotas oculares de naproxeno de sodio en la inflamación ocular del conejo inducida por el araquidonato de sodio, J. Ocular Pharm., 7(2); 125-133, (1991)). El examen se llevó a cabo cada hora empezando desde la primera administración durante 7 horas, y luego 24, 48 y 72 horas después del último tratamiento, dando valores arbitrarios a varios aspectos de la conjuntiva palpebral y bulbar, del iris y de la córnea.

No se observó ningún enrojecimiento significativo durante todo el período de la prueba, tanto en los ojos tratados con las gotas oculares de MEG 01 (0,05% en peso de flunaricina) como en los ojos tratados con placebo. No se detectó edema en ninguno de los ojos tratados. Además, no se notó ninguna alteración en el iris en ninguno de los ojos tratados, y la presencia de material de drenaje se mantuvo a un nivel normal. Tampoco no se detectó ningún daño en los tejidos de la córnea; sólo dos ojos mostraron una desepitelización ligera.

Los resultados obtenidos muestran que la solución oftálmica de MEG 01 basada en un 0,050% en peso de flunaricina se tolera bien en el ojo del conejo después de la aplicación repetida en la fórnix conjuntival.

Estudios de enlace

La técnica de enlace de receptores se llevó a cabo en membranas celulares obtenida del complejo del cuerpo iridociliar extraído, después del sacrificio, de los conejos albinos machos de la raza de Nueva Zelanda (Charles River Italiana, de Calco (CO)). El tejido se homogenizó en un tampón y se aisló la fracción P_{2}, rica en proteínas de membrana celular. Dicha fracción se obtuvo por centrifugación de acuerdo con lo descrito en la bibliografía (Mach R. H., Smith C. R., Childers S. R.. La ibogaína posee una afinidad selectiva para los receptores sigma 2, Life Sci. 57 (4); 57,62). La concentración de proteína La total se determinó con el método Lowry.

Las alícuotas de la fracción P_{2} del homogenato que contienen respectivamente 300 \mug de las proteínas totales se incubaron en tubos de pruebas de polipropileno conteniendo cantidades escalares de los antagonistas de calcio de la prueba (es decir, flunaricina, verapamilo, nifedipina y nimodipina), y una cantidad conocida de ^{3}H(+)-N-alilnormetazocina (SKF) (experimentalmente utilizada como un \sigma-ligando). La unión no específica se evaluó en presencia de haloperidol.

Todas las pruebas se llevaron a cabo por duplicado. La reacción se mantuvo a 37ºC durante 105 minutos, seguida por filtración en filtros WhatmannGF/B. La radioactividad dejada en los filtros se midió por espectrometría líquida de centelleo. La IC_{50} se determinó, y los resultados obtenidos se muestran en la tabla siguiente.

TABLA 7

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Los datos precedentes confirman los descubrimientos de la investigación que conducen a la presente invención, que se han expuesto en la introducción. A saber, los datos muestran que la flunaricina tiene una afinidad con los receptores \sigma-1, en oposición a los otros más conocidos y estudiados agentes bloqueadores de los canales de calcio, como el verapamilo, la nifedipina y el diltiacem. Este descubrimiento sugiere que los receptores \sigma-1 están involucrados en el mecanismo responsable del decrecimiento de la presión intraocular a causa de la flunaricina, y que este particular rasgo es responsable de la sorprendentemente actividad mayor de la flunaricina en disminuir la hipertensión ocular.

Claims (8)

1. Utilización de la flunaricina, o de una de sus sales farmacéuticamente aceptables, como un agente activo en la fabricación de un medicamento oftálmico tópico para disminuir la hipertensión ocular.

2. Utilización según la reivindicación 1, en la que dicho medicamento oftálmico tópico se presenta en forma de una solución acuosa o suspensión, o en forma de gel, de ungüento o de crema en un medio oftálmico farmacéuticamente aceptable, o en forma de un inserto ocular erosionable o de un sistema "reservorio" con una membrana de polímero, para situarse en el saco conjuntival.

3. Utilización según las reivindicaciones 1 ó 2, en la que la concentración de flunaricina en dicho medicamento oftálmico es de 0,001 a 0,500% en peso.

4. Utilización según la reivindicación 3, donde la concentración de flunaricina es de 0,050% en peso.

5. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la flunaricina está presente en dicho medicamento oftálmico en la forma de su sal de hidrocloruro.

6. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicho médicamento oftálmico tópico está en la forma de una solución acuosa y además contiene uno o más agentes de ajuste de la tonicidad, uno o más tampones y uno o más antioxidantes.

7. Utilización según la reivindicación 6, en la que dicho medicamento oftálmico tópico contiene además uno o más agentes que mejoran la tolerabilidad ocular, escogida entre las ciclodextrinas, el polisorbato 80 (o Tween 80), el dextrano, el polietilenglico y los poloxámeros.

8. Utilización según la reivindicación 7, en la que dicho medicamento oftálmico tópico contiene además uno o más agentes conservantes o antimicrobianos.